ペプチドの酸化
ジスルフィド架橋ペプチドを形成するための還元されたペプチド又は部分的に還元されたペプチドの折り畳み／酸化は、それを、酸化用有機溶媒単独又は水との混合物中に溶解させ、その溶液に水性アルカリ性緩衝液を添加し、そして結果物であるジスルフィド架橋ペプチドを回収することによって達成される。好ましい酸化用有機溶媒は、ジメチルスルホキシドであり、そしてそれは、望ましくは１０〜５０％水溶液として使用される。好ましくは０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液である水性アルカリ性緩衝液の添加は、好ましくは、酸化用有機溶媒中に還元されたペプチドを溶解させた後５〜９０分間に添加される。その方法は、アルカリ性条件下で不溶性である還元されたペプチドが、酸化されるのを可能にし、そしてジメチルスルホキシド単独で処理される場合には安定ではあるが不活性な酸化種を形成しうる還元されたペプチドが、完全に酸化されることを可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド架橋ペプチドの折り畳み／酸化の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロの折り畳み／酸化は、インビボのタンパク質の折り畳み／酸化に対する実験的アプローチとして数種のタンパク質について集約的に分析されてきた。インビトロとインビボとの折り畳みにおいて観察される、例えば両方の過程における時間的規模、分泌細胞の小胞体における天然の半シスチンの対形成酵素の関与、及びタンパク質生合成過程における新生鎖の細胞下の相互作用のような差異は、この「自発的事象」が、実際には非常に複雑な現象であることを示唆する。とは言うものの、還元された化合物が、折り畳まって／酸化してそれの天然構造になる過程の直接的な説明はないが、インビトロでの研究から得られた充分な証拠により、いくつかの一般化を可能にする：（i）還元されたペプチドの折り畳みは、チモーゲン形態（例えば、α−キモトリプシン、インスリン）のプロセッシングによって得られるタンパク分解で活性化されるいくつかのタンパク質を除いて、所定の環境（例えば、ｐＨ、温度、及びイオン強度）で自発的に起こる、（ii）安定な天然構造を導出する情報は、主に、一連の短い、中程度の、及び長い範囲の原子間相互作用を通じて、ペプチド鎖のアミノ酸配列によって決定される、及び（iii）ペプチドの折り畳みは、熱力学的に制御された過程であり、その過程における律速段階は、理論的に、天然様の種の形成（全ての自由度に関して天然ペプチドの最低ギブズ自由エネルギー）であるように思われる。
【０００３】
多様なジスルフィド架橋ポリペプチドの固相合成において、最も決定的でかつ融通の利く段階の１つに、還元された生成物の折り畳み／酸化がある。使用される標準的な酸化媒体は、一般に、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ又はリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０−８．５）である。酸化の反応速度論並びに折り畳み過程は、分析用Ｃ8／Ｃ18逆相ＨＰＬＣでの反応混合物の一連の分析によって直接的に観察されうる。一般に、ペプチドの疎水性還元型形態に対応する主要なピークは、徐々に（可変の速度で）消え、そして部分的に折り畳まれた／酸化されたペプチド中間体に対応する新たなピークが検出される。いくつかの例外はあるが、一般的に、これらの不安定な中間体は、還元されたペプチドよりも一層親水性である。ペプチド媒体の内容物は、ペプチド構造／半シスチン残基の数に依存して数日にわたって徐々に発達するが、しかし、しばしば、室温で４０時間未満で、平衡に達しうる。平衡時に、酸化過程は完了し、そして完全に折り畳まれた／酸化された目的のペプチドに対応する主要な親水性ピークが、観察される。ペプチドの総酸化は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、すなわち、エルマン試薬を用いた酸化還元能力を観察することによって確認されうる。おそらく分子間ジスルフィド架橋形成に関連して、ペプチド凝集が頻繁に観察されるので、酸化媒体は、次いで精製前に濾過されうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
いくつかの特定の問題が、折り畳み／酸化の進行の間に生じうる。それらの問題としては、（i）酸化の通常の条件における還元されたペプチドの不溶性、例えば、ペプチドの沈殿／凝集を生じる中性又は塩基性ｐＨ値、及び（ii）安定ではあるが不活性な酸化された種の形成が挙げられる。これらの問題を解決する方法は、主に、個々のペプチドの構造及び物理化学的特性によるが、いくつかの化学的添加剤又は実験手法の修飾が助けになる可能性がある。例えば、０．１ｍＭの還元型と１ｍＭの酸化型のグルタチオンの酸化還元混合物を媒体に包含することは、チオール−チオール交換及びジスルフォド結合の入れ替えによる酸化を促進し、しかも、折り畳まれた活性ペプチドの回収を増強する場合もある。還元型／酸化型グルタチオン系は、以下のとおり酸化中間体の安定性に作用すると評価されてきた。即ち、還元形態は、チオール基を安定化するのに対して、酸化形態は、グルタチオンとの混成結合で半シスチン残基を安定化させる。したがって、中間体中のジスルフィド結合は、還元型及び酸化型のグルタチオンの両方によって不安定化される。さらに、塩酸グアニジン濃度及び温度は、還元されたペプチド又は酸化中間体の溶解性に影響し、そして折り畳み経路に影響を及ぼしうることが報告された。開発され、そして不溶性で還元型のＡａＨトキシンＩＩの折り畳み／酸化に首尾よく使用された別の方法は、透析酸化系に基づく（サバティエ（Ｓａｂａｔｉｅｒ）ら、イント・ジェイ・ペプト・プロット・レス（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．）３０巻、１２５−１３４頁（１９８７年））。還元分子は、最初に、１０％（ｖ／ｖ）酢酸で可溶化され、そしてその後２．２から８までのゆっくりしたｐＨ勾配を示す一連の緩衝液に対する通気透析によって酸化される。この手法は、特に、中性又はアルカリ性緩衝液に完全に不溶である還元されたポリペプチドを酸化するのに好都合である。金属イオン（例えば、微量の銅）、化学的酸化剤（例えば、フェリシアン化カリウム）、及び天然のジスルフィド交換酵素（例えば、チオレドキシン、グルタレドキシン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）のような他の添加剤は、ペプチドの酸化を助ける可能性がある。
【０００５】
米国特許番号第５１４４００６号は、ジメチルスルホキシドを用いたペプチドの酸化的折り畳みを記述する。緩衝液の使用は、任意であるが、しかし、ジメチルスルホキシド中に溶解した後、添加されるべき緩衝液の説明はない。任意の緩衝液が使用される場合、それは、始めから終わりまで存在する。我々は、この提案が全ての場合に有効であるわけはないということを見出した。ペプチドが、中性又は塩基性のｐＨ値で不溶性である場合、ジメチルスルホキシド及びアルカリ性緩衝液中にそれを溶解しようとすると、ペプチドは沈殿する。しかしながら、ジメチルスルホキシドは、単独では、完全には全てのペプチドを酸化せず、そして安定ではあるが不活性の酸化種を形成する場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、還元された又は部分的に還元されたペプチドを酸化させることにより、ジスルフィド架橋ペプチドを製造する方法であって、
還元された上記ペプチド又は部分的に還元された上記ペプチドを酸化用有機溶媒単独又はその水との混合物中に溶解させ、その溶液に水性アルカリ性緩衝液を添加し、結果物である上記ジスルフィド架橋ペプチドを回収することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
還元された又は部分的に還元された上記ペプチドは、化学的合成又は組換え技術によって生成されるものでありうる。ジエチルエーテルのような他の酸化用有機溶媒が代わりに使用されうるが、好ましい上記酸化用有機溶媒はジメチルスルホキシドである。ジメチルスルホキシドは、好ましくは、水との混合物として、特に１０〜５０体積％のジメチルスルホキシドを含有する混合物で使用される。ペプチドがトリプトファン残基を含有する場合には、ジメチルスルホキシド：水混合物は、２０体積％未満のジメチルスルホキシドを含有することが好ましい。
【０００８】
適切な上記緩衝液は、生理食塩緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液であり、特に適切な緩衝液は、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液である。溶液のｐＨは、ペプチドの酸化を可能にするもの、例えば６〜１２のものであるべきであるが、８〜８．５の範囲が好ましい。
【０００９】
上記酸化用有機溶媒単独又は水との混合物中に上記ペプチド又は部分的に還元された上記ペプチドを溶解させた後に、上記アルカリ性緩衝液を添加することが重要である。上記ペプチドが上記酸化用有機溶媒に溶解されるときに上記緩衝液が存在する場合には、沈殿が生じうる。還元された上記ペプチドは、好ましくは上記アルカリ性緩衝液を添加する前に少なくとも５分、そしてさらに好ましくは１０分間、上記酸化用有機溶媒中で酸化させておく。上記アルカリ性緩衝液は後に添加されうるが、およそ１０〜９０分間内に上記アルカリ性緩衝液に添加することが、通常最適である。しかしながら、１日又は２日以上後に添加することは、なんら大きな利益を生じそうにない。緩衝液の添加の前に過剰に長く放置した場合には、安定ではあるが不活性な酸化種が形成する可能性がある。
【００１０】
我々は、ペプチド溶液の希釈（＜１ｍＭ）は、一般に信じられているのと比べて、分子内の半シスチン対形成に極めて有利に作用するわけではないことも見出した。０．５〜５ｍＭの高濃度のペプチド溶液の使用すると、取り扱いが容易になり、そして分取用のＣ8／Ｃ18逆相ＨＰＬＣ及び／又はイオン交換クロマトグラフィーによる標的ペプチド精製の作業が容易になる。
【００１１】
本発明の方法は、リポペプチド及びグリコペプチドのように、付着部分を有するペプチドについて実行されうる。本発明の方法は、後に切断されて所望のペプチドを提供する未分断のペプチドを折り畳む／酸化するためにも実行されうる。
【００１２】
本発明の方法は、上述の添加剤のいずれをも使用することなく、すなわち、グルタチオン、塩酸グアニジン、金属イオン、ジスルフィド交換酵素及び無機酸化剤の不在下で行われうる。
【００１３】
本発明は、酸化用有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）、水及びｐＨ６〜１２、好ましくは８〜８．５の水性アルカリ性緩衝液を含有するペプチド酸化媒体も提供する。
【実施例】
【００１４】
本発明は、以下の実施例によって示される。
実施例：ヘプシジンの化学的合成への適用
ヒト・ヘプシジンのアミノ酸配列：ＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ−OH
マウス・ヘプシジンのアミノ酸配列：ＤＴＮＦＰＩＣＩＦＣＣＫＣＣＮＮＳＱＣＧＩＣＣＫＴ−OH
【００１５】
ヘプシジンのような還元されたポリペプチドを折り畳む／酸化するために使用される実験的手法は、以下のとおりである。
最初にジメチルスルホキシド／水のみ（１０〜５０％、ｖ／ｖ）を含有する酸化力のある水性の／有機の溶液中に粗還元ペプチドを溶解させる。約１０分〜１時間後、アルカリ性のｐＨ値の緩衝液（たとえば、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）を数滴添加する。最終的なペプチド濃度は、０．５〜５ｍＭの範囲になりうる。
酸化を完了させるために、室温（２０−２５℃）で、２４〜１５０時間、ペプチド混合物を攪拌し、その後、濾過し（必要な場合）、そして折り畳まれた／酸化されたペプチド溶液を精製する。
【００１６】
ヒト（２５マー）及びマウス（２５マー）のヘプシジンを折り畳む／酸化するために首尾よく使用された酸化用溶媒は、ｐＨ８．３で、相対的な溶液体積２／２／１のジメチルスルホキシド／水／０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液であった。
【００１７】
上記緩衝液が、添加されない場合又はあまりに遅くに添加された場合には、ペプチドが不完全に酸化されるので、ヘプシジンは得られない。ジメチルスルホキシド／水に粗還元ペプチドを溶解しようとするときに上記緩衝液が存在する場合には、沈殿が起こる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド架橋ペプチドの折り畳み／酸化の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロの折り畳み／酸化は、インビボのタンパク質の折り畳み／酸化に対する実験的アプローチとして数種のタンパク質について集約的に分析されてきた。インビトロとインビボとの折り畳みにおいて観察される、例えば両方の過程における時間的規模、分泌細胞の小胞体における天然の半シスチンの対形成酵素の関与、及びタンパク質生合成過程における新生鎖の細胞下の相互作用のような差異は、この「自発的事象」が、実際には非常に複雑な現象であることを示唆する。とは言うものの、還元された化合物が、折り畳まって／酸化してそれの天然構造になる過程の直接的な説明はないが、インビトロでの研究から得られた充分な証拠により、いくつかの一般化を可能にする：（i）還元されたペプチドの折り畳みは、チモーゲン形態（例えば、α−キモトリプシン、インスリン）のプロセッシングによって得られるタンパク分解で活性化されるいくつかのタンパク質を除いて、所定の環境（例えば、ｐＨ、温度、及びイオン強度）で自発的に起こる、（ii）安定な天然構造を導出する情報は、主に、一連の短い、中程度の、及び長い範囲の原子間相互作用を通じて、ペプチド鎖のアミノ酸配列によって決定される、及び（iii）ペプチドの折り畳みは、熱力学的に制御された過程であり、その過程における律速段階は、理論的に、天然様の種の形成（全ての自由度に関して天然ペプチドの最低ギブズ自由エネルギー）であるように思われる。
【０００３】
多様なジスルフィド架橋ポリペプチドの固相合成において、最も決定的でかつ融通の利く段階の１つに、還元された生成物の折り畳み／酸化がある。使用される標準的な酸化媒体は、一般に、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ又はリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０−８．５）である。酸化の反応速度論並びに折り畳み過程は、分析用Ｃ8／Ｃ18逆相ＨＰＬＣでの反応混合物の一連の分析によって直接的に観察されうる。一般に、ペプチドの疎水性還元型形態に対応する主要なピークは、徐々に（可変の速度で）消え、そして部分的に折り畳まれた／酸化されたペプチド中間体に対応する新たなピークが検出される。いくつかの例外はあるが、一般的に、これらの不安定な中間体は、還元されたペプチドよりも一層親水性である。ペプチド媒体の内容物は、ペプチド構造／半シスチン残基の数に依存して数日にわたって徐々に発達するが、しかし、しばしば、室温で４０時間未満で、平衡に達しうる。平衡時に、酸化過程は完了し、そして完全に折り畳まれた／酸化された目的のペプチドに対応する主要な親水性ピークが、観察される。ペプチドの総酸化は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、すなわち、エルマン試薬を用いた酸化還元能力を観察することによって確認されうる。おそらく分子間ジスルフィド架橋形成に関連して、ペプチド凝集が頻繁に観察されるので、酸化媒体は、次いで精製前に濾過されうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
いくつかの特定の問題が、折り畳み／酸化の進行の間に生じうる。それらの問題としては、（i）酸化の通常の条件における還元されたペプチドの不溶性、例えば、ペプチドの沈殿／凝集を生じる中性又は塩基性ｐＨ値、及び（ii）安定ではあるが不活性な酸化された種の形成が挙げられる。これらの問題を解決する方法は、主に、個々のペプチドの構造及び物理化学的特性によるが、いくつかの化学的添加剤又は実験手法の修飾が助けになる可能性がある。例えば、０．１ｍＭの還元型と１ｍＭの酸化型のグルタチオンの酸化還元混合物を媒体に包含することは、チオール−チオール交換及びジスルフォド結合の入れ替えによる酸化を促進し、しかも、折り畳まれた活性ペプチドの回収を増強する場合もある。還元型／酸化型グルタチオン系は、以下のとおり酸化中間体の安定性に作用すると評価されてきた。即ち、還元形態は、チオール基を安定化するのに対して、酸化形態は、グルタチオンとの混成結合で半シスチン残基を安定化させる。したがって、中間体中のジスルフィド結合は、還元型及び酸化型のグルタチオンの両方によって不安定化される。さらに、塩酸グアニジン濃度及び温度は、還元されたペプチド又は酸化中間体の溶解性に影響し、そして折り畳み経路に影響を及ぼしうることが報告された。開発され、そして不溶性で還元型のＡａＨトキシンＩＩの折り畳み／酸化に首尾よく使用された別の方法は、透析酸化系に基づく（サバティエ（Ｓａｂａｔｉｅｒ）ら、イント・ジェイ・ペプト・プロット・レス（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．）３０巻、１２５−１３４頁（１９８７年））。還元分子は、最初に、１０％（ｖ／ｖ）酢酸で可溶化され、そしてその後２．２から８までのゆっくりしたｐＨ勾配を示す一連の緩衝液に対する通気透析によって酸化される。この手法は、特に、中性又はアルカリ性緩衝液に完全に不溶である還元されたポリペプチドを酸化するのに好都合である。金属イオン（例えば、微量の銅）、化学的酸化剤（例えば、フェリシアン化カリウム）、及び天然のジスルフィド交換酵素（例えば、チオレドキシン、グルタレドキシン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）のような他の添加剤は、ペプチドの酸化を助ける可能性がある。
【０００５】
米国特許番号第５１４４００６号は、ジメチルスルホキシドを用いたペプチドの酸化的折り畳みを記述する。緩衝液の使用は、任意であるが、しかし、ジメチルスルホキシド中に溶解した後、添加されるべき緩衝液の説明はない。任意の緩衝液が使用される場合、それは、始めから終わりまで存在する。我々は、この提案が全ての場合に有効であるわけはないということを見出した。ペプチドが、中性又は塩基性のｐＨ値で不溶性である場合、ジメチルスルホキシド及びアルカリ性緩衝液中にそれを溶解しようとすると、ペプチドは沈殿する。しかしながら、ジメチルスルホキシドは、単独では、完全には全てのペプチドを酸化せず、そして安定ではあるが不活性の酸化種を形成する場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、還元された又は部分的に還元されたペプチドを酸化させることにより、ジスルフィド架橋ペプチドを製造する方法であって、
還元された上記ペプチド又は部分的に還元された上記ペプチドを酸化用有機溶媒単独又はその水との混合物中に溶解させ、その溶液に水性アルカリ性緩衝液を添加し、結果物である上記ジスルフィド架橋ペプチドを回収することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
還元された又は部分的に還元された上記ペプチドは、化学的合成又は組換え技術によって生成されるものでありうる。ジエチルエーテルのような他の酸化用有機溶媒が代わりに使用されうるが、好ましい上記酸化用有機溶媒はジメチルスルホキシドである。ジメチルスルホキシドは、好ましくは、水との混合物として、特に１０〜５０体積％のジメチルスルホキシドを含有する混合物で使用される。ペプチドがトリプトファン残基を含有する場合には、ジメチルスルホキシド：水混合物は、２０体積％未満のジメチルスルホキシドを含有することが好ましい。
【０００８】
適切な上記緩衝液は、生理食塩緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液であり、特に適切な緩衝液は、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液である。溶液のｐＨは、ペプチドの酸化を可能にするもの、例えば６〜１２のものであるべきであるが、８〜８．５の範囲が好ましい。
【０００９】
上記酸化用有機溶媒単独又は水との混合物中に上記ペプチド又は部分的に還元された上記ペプチドを溶解させた後に、上記アルカリ性緩衝液を添加することが重要である。上記ペプチドが上記酸化用有機溶媒に溶解されるときに上記緩衝液が存在する場合には、沈殿が生じうる。還元された上記ペプチドは、好ましくは上記アルカリ性緩衝液を添加する前に少なくとも５分、そしてさらに好ましくは１０分間、上記酸化用有機溶媒中で酸化させておく。上記アルカリ性緩衝液は後に添加されうるが、およそ１０〜９０分間内に上記アルカリ性緩衝液に添加することが、通常最適である。しかしながら、１日又は２日以上後に添加することは、なんら大きな利益を生じそうにない。緩衝液の添加の前に過剰に長く放置した場合には、安定ではあるが不活性な酸化種が形成する可能性がある。
【００１０】
我々は、ペプチド溶液の希釈（＜１ｍＭ）は、一般に信じられているのと比べて、分子内の半シスチン対形成に極めて有利に作用するわけではないことも見出した。０．５〜５ｍＭの高濃度のペプチド溶液の使用すると、取り扱いが容易になり、そして分取用のＣ8／Ｃ18逆相ＨＰＬＣ及び／又はイオン交換クロマトグラフィーによる標的ペプチド精製の作業が容易になる。
【００１１】
本発明の方法は、リポペプチド及びグリコペプチドのように、付着部分を有するペプチドについて実行されうる。本発明の方法は、後に切断されて所望のペプチドを提供する未分断のペプチドを折り畳む／酸化するためにも実行されうる。
【００１２】
本発明の方法は、上述の添加剤のいずれをも使用することなく、すなわち、グルタチオン、塩酸グアニジン、金属イオン、ジスルフィド交換酵素及び無機酸化剤の不在下で行われうる。
【００１３】
本発明は、酸化用有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）、水及びｐＨ６〜１２、好ましくは８〜８．５の水性アルカリ性緩衝液を含有するペプチド酸化媒体も提供する。
【実施例】
【００１４】
本発明は、以下の実施例によって示される。
実施例：ヘプシジンの化学的合成への適用
ヒト・ヘプシジンのアミノ酸配列：ＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ−OH
マウス・ヘプシジンのアミノ酸配列：ＤＴＮＦＰＩＣＩＦＣＣＫＣＣＮＮＳＱＣＧＩＣＣＫＴ−OH
【００１５】
ヘプシジンのような還元されたポリペプチドを折り畳む／酸化するために使用される実験的手法は、以下のとおりである。
最初にジメチルスルホキシド／水のみ（１０〜５０％、ｖ／ｖ）を含有する酸化力のある水性の／有機の溶液中に粗還元ペプチドを溶解させる。約１０分〜１時間後、アルカリ性のｐＨ値の緩衝液（たとえば、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）を数滴添加する。最終的なペプチド濃度は、０．５〜５ｍＭの範囲になりうる。
酸化を完了させるために、室温（２０−２５℃）で、２４〜１５０時間、ペプチド混合物を攪拌し、その後、濾過し（必要な場合）、そして折り畳まれた／酸化されたペプチド溶液を精製する。
【００１６】
ヒト（２５マー）及びマウス（２５マー）のヘプシジンを折り畳む／酸化するために首尾よく使用された酸化用溶媒は、ｐＨ８．３で、相対的な溶液体積２／２／１のジメチルスルホキシド／水／０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液であった。
【００１７】
上記緩衝液が、添加されない場合又はあまりに遅くに添加された場合には、ペプチドが不完全に酸化されるので、ヘプシジンは得られない。ジメチルスルホキシド／水に粗還元ペプチドを溶解しようとするときに上記緩衝液が存在する場合には、沈殿が起こる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元された又は部分的に還元されたペプチドを酸化させることにより、ジスルフィド架橋ペプチドを製造する方法であって、
還元された上記ペプチド又は部分的に還元された上記ペプチドを酸化用有機溶媒単独又はその水との混合物中に溶解させ、その溶液に水性アルカリ性緩衝液を添加し、結果物である上記ジスルフィド架橋ペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２】
上記酸化用有機溶媒は、ジメチルスルホキシドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１０〜５０体積％のジメチルスルホキシドを含有するジメチルスルホキシド：水混合物を使用して、還元された上記ペプチドを溶解させる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記酸化用有機溶媒は、ジエチルエーテルである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記溶液中における還元された又は部分的に還元された上記ペプチドの濃度は、０．５〜５ｍＭである先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
上記酸化用有機溶媒中での上記ペプチドの溶解後５〜９０分の間に、上記緩衝液を添加する先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
上記水性アルカリ性緩衝液は、生理食塩緩衝液である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上記水性アルカリ性緩衝液は、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
上記水性アルカリ性緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
上記緩衝液のｐＨは、８．０〜８．５である先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
ヘプシジンの製造のための先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト・ヘプシジンの製造のための先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
リポペプチド、グリコペプチド又は別の付着部分を有するペプチドを製造するための請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオン、塩酸グアニジン、金属イオン、ジスルフィド交換酵素又は無機酸化剤の不在下で行われる、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１】
還元された又は部分的に還元されたペプチドを酸化させることにより、ジスルフィド架橋ペプチドを製造する方法であって、
還元された上記ペプチド又は部分的に還元された上記ペプチドを酸化用有機溶媒単独又はその水との混合物中に溶解させ、その溶液に水性アルカリ性緩衝液を添加し、結果物である上記ジスルフィド架橋ペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２】
上記酸化用有機溶媒は、ジメチルスルホキシドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１０〜５０体積％のジメチルスルホキシドを含有するジメチルスルホキシド：水混合物を使用して、還元された上記ペプチドを溶解させる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記酸化用有機溶媒は、ジエチルエーテルである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記溶液中における還元された又は部分的に還元された上記ペプチドの濃度は、０．５〜５ｍＭである先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
上記酸化用有機溶媒中での上記ペプチドの溶解後５〜９０分の間に、上記緩衝液を添加する先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
上記水性アルカリ性緩衝液は、生理食塩緩衝液である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上記水性アルカリ性緩衝液は、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
上記水性アルカリ性緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
上記緩衝液のｐＨは、８．０〜８．５である先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
ヘプシジンの製造のための先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト・ヘプシジンの製造のための先のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
リポペプチド、グリコペプチド又は別の付着部分を有するペプチドを製造するための請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオン、塩酸グアニジン、金属イオン、ジスルフィド交換酵素又は無機酸化剤の不在下で行われる、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２７３７１（Ｐ２００７−５２７３７１Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８２５３（Ｐ２００６−５０８２５３）
【出願日】平成１６年５月２８日（２００４．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５９５３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６３６２
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０５４２８９１６）セルペップ ソシエテ アノニム (3)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＰＥＰ Ｓ． Ａ．
【住所又は居所原語表記】１６，Ｒｕｅ ｄｅ ｌａ Ｂａｎｑｕｅ， Ｆ−７５００２ Ｐａｒｉｓ （ＦＲ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２８日（２００４．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５９５３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６３６２
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０５４２８９１６）セルペップ ソシエテ アノニム (3)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＰＥＰ Ｓ． Ａ．
【住所又は居所原語表記】１６，Ｒｕｅ ｄｅ ｌａ Ｂａｎｑｕｅ， Ｆ−７５００２ Ｐａｒｉｓ （ＦＲ）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]