ペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キット
【課題】
高精度に生体中の超微量物質を測定するための化学発光試薬キットを提供することである。
【解決手段】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）を必須構成成分としてなる第１液と、
酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）を必須構成成分としてなる第２液とを含んでなることを特徴とするペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットを用いる。フッ素原子含有界面活性剤（ａ）は、パーフルオロアルキルアミンオキシド、パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物及びパーフルオロアルキルカルボン酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
高精度に生体中の超微量物質を測定するための化学発光試薬キットを提供することである。
【解決手段】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）を必須構成成分としてなる第１液と、
酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）を必須構成成分としてなる第２液とを含んでなることを特徴とするペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットを用いる。フッ素原子含有界面活性剤（ａ）は、パーフルオロアルキルアミンオキシド、パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物及びパーフルオロアルキルカルボン酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生じる発光をより増強するために、界面活性剤を添加したペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（特許文献１）、卵白アルブミンを添加したペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（特許文献２）、フラーレンを添加したペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（特許文献３）が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開平０８−２６１９４３号公報
【特許文献２】特開２００２−３２３４９５号公報
【特許文献３】特開２００３−２５４９７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットでは、近年益々超微量化する生体中の分析対象物質を正確に測定することが困難となってきている。すなわち本発明の目的は、高精度に生体中の超微量物質を測定するための化学発光試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットの特徴は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）を必須構成成分としてなる第１液と、
酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）を必須構成成分としてなる第２液とを含んでなることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットを用いると、高精度に生体中の超微量物質を測定することができる。特に近年益々高感度が要求される前立腺摘出後患者血清中のＰＳＡ（ヒト前立腺特異抗原）の測定を高感度に行うことができ、たとえば、術後のＰＳＡ値のモニタリングに貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）としては、フッ素原子を含む界面活性剤であれば制限なく使用できる。
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）に含まれるフッ素原子の個数としては、７〜４３が好ましく、さらに好ましくは１１〜３９、特に好ましくは１５〜３５である。
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）としては、パーフルオロアルキル基を持つ界面活性剤等が含まれ、フッ素原子含有界ノニオン面活性剤（ａ１）及びフッ素原子含有アニオン界面活性剤（ａ２）及びこれらの混合物等が使用できる。
【０００８】
フッ素原子含有ノニオン界面活性剤（ａ１）としては、パーフルオロアルキルアミンオキシド及びパーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物等が含まれる。
アルキル基としては、直鎖、分岐又は環状の何れでもよいが、直鎖アルキル及び分岐アルキルが好ましく、さらに好ましくは直鎖アルキルである（以下、同様である。）。
【０００９】
パーフルオロアルキルアミンオキシドとしては、式（１）で表される化合物が含まれる。
【化１】
ｅは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｆは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。また、Ｒは炭素数１〜６のアルキルを表し、メチル、エチル及びプロピルが好ましく、さらに好ましくはメチルである（２つのＲは同じでも異なってもよい）。Ｃは炭素原子、Ｆはフッ素原子、Ｈは水素原子、Ｎは窒素原子、Ｏは酸素原子を表す（以下同様である。）。
【００１０】
パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物としては、式（２）で表される化合物が含まれる。
【化２】
ｇは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｈは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。また、ｉは１〜１２の整数を表し、２〜１０の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜８の整数である。
【００１１】
フッ素原子含有アニオン界面活性剤（ａ２）としては、パーフルオロアルキルカルボン酸塩及びパーフルオロアルキルリン酸エステル等が含まれる。
パーフルオロアルキルカルボン酸塩としては、式（３）で表される化合物が含まれる。
【化３】
ｊは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｋは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。また、Ｍはアルカリ金属（リチウム、カリウム及びナトリウム等）イオン、アンモニウムイオン、炭素数１〜８のアルキルアンモニウムイオン（メチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、メチルトリエチルアンモニウム等）を表し、アルカリ金属イオンが好ましく、さらに好ましくはナトリウムイオンである（以下、同様である。）。
【００１２】
パーフルオロアルキルリン酸エステルとしては、式（４）で表される化合物が含まれる。
【化４】
ｍは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｎは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。
【００１３】
これらのフッ素原子含有界面活性剤のうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、パーフルオロアルキルアミンオキシド、パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物及びパーフルオロアルキルカルボン酸塩が好ましく、さらに好ましくはパーフルオロアルキルアミンオキシド及びパーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物、特に好ましくはパーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物である。
【００１４】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の含有量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の含有量（モル％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）のモル数に基づいて、３〜５４が好ましく、さらに好ましくは５〜５１、特に好ましくは７〜４８である。
【００１５】
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）としては、公知｛たとえば、特開平２−２９１２９９号、特開平１０−３１９０１５号、特開２０００−２７９１９６号の各公報等｝の化合物及びこれらの混合物等が使用できる。これらのうち、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩が好ましく、さらに好ましくはルミノール及びルミノールの金属塩、特に好ましくはルミノールのナトリウム塩である。
【００１６】
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）の含有量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）の含有量（モル％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）のモル数に基づいて、１４〜９５が好ましく、さらに好ましくは２０〜９２、特に好ましくは２６〜８９である。
【００１７】
化学発光増強剤（ｃ）としては、公知｛例えば、特開昭５９−５００２５２号、特開昭５９−１７１８３９号、特開平２−２９１２９９号の各公報等｝の化合物及びこれらの混合物等が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、さらに好ましくはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、特に好ましくは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。
【００１８】
化学発光増強剤（ｃ）の含有量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、化学発光増強剤（ｃ）の含有量（モル％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）のモル数に基づいて、２〜３２が好ましく、さらに好ましくは３〜２９、特に好ましくは４〜２６である。
【００１９】
第１液には、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）以外に、緩衝液及び／又はキレート剤等を含むことができる。
【００２０】
緩衝液としては、公知（たとえば、特開平１０−３１９０１５号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）の緩衝液等が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液が好ましく、さらに好ましくは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液、特に好ましくは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度（ｍＭ：ミリモル／リットル）としては、１〜５００が好ましく、さらに好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。
【００２１】
緩衝液を含有する場合、この含有量（重量％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の重量に基づいて、２０〜１００００が好ましく、さらに好ましくは１００〜２０００、特に好ましくは２００〜１０００である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
【００２２】
キレート剤としては、公知（たとえば、特開平９−７５０９９号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）のキレート剤が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、さらに好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム等）、並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、特に好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩である。
【００２３】
キレート剤を含有する場合、この含有量（重量％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の重量に基づいて、０．００１〜４が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜２、特に好ましくは０．０５〜１である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
【００２４】
第１液は、アルカリ性であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ（２０℃）７〜１１であること、特に好ましくはｐＨ（２０℃）８〜１０であることである。
なお、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される。
【００２５】
第１液は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）、化学発光増強剤（ｃ）、並びに必要により、緩衝液及び／又はキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
【００２６】
酸化剤（ｄ）としては、公知（たとえば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報に記載）の酸化剤及びこれらの混合物等が使用できる。これらのうち、保存安定性等の観点から、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウムが好ましく、さらに好ましくは過酸化水素である。
【００２７】
酸化剤（ｄ）の濃度は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、第２液中の酸化剤（ｄ）の濃度（ｍＭ；ミリモル／リットル）は、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０、特に好ましくは１〜１０である。
【００２８】
水（ｅ）としては、蒸留水、逆浸透水及び脱イオン水等が挙げられる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、蒸留水及び脱イオン水が好ましく、さらに好ましくは脱イオン水である。
【００２９】
第２液には、酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）以外に、キレート剤等を含むことができる。
キレート剤を含有する場合、この含有量（重量％）は、酸化剤（ｄ）の重量に基づいて、０．２〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０、特に好ましくは１〜１０である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
第２液は、酸化剤（ｄ）をそのまま用いるか、水で濃度調整することにより、また必要によりキレート剤を加えて均一混合することにより容易に得られる。
【００３０】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットは、公知｛たとえば、特開平２−２９１２９９号、特開平１０−３１９０１５号、特開２０００−２７９１９６号の各公報等｝の化学発光試薬キットと同様にして使用できる。発光反応は、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液及び第２液を添加・混合することにより進行する。添加方法としては、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液を添加し、続いて第２液を添加する方法（１）、ペルオキシダーゼを含む検体に、第２液を添加し、続いて第１液を添加する方法（２）、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液及び第２液を同時に添加する方法（３）、第１液及び第２液を混合した後、この混合液を、ペルオキシダーゼを含む検体に添加する方法（４）が挙げられる。これらのうち、操作性及び化学発光増強効果等の観点から、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液及び第２液を同時に添加する方法（３）が好ましい。
第１液と第２液との液量比は、適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、操作性等の観点から、同じ体積量とすることが好ましい。
【００３１】
本発明の化学発光試薬キットは、ペルオキシダーゼを利用した測定法；酵素免疫測定法；核酸プローブを用いてゲノム中の標的核酸を化学発光で検出する方法；サザンブロット法及びノーザンブロット法に使用でき、これらのうち、酵素免疫測定法；サザンブロット法及びノーザンブロット法に好適であり、酵素免疫測定法に最適である。
【００３２】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットには、第１液及び第２液以外に、標識抗体試薬や抗体結合固相試薬等を含むことができる。例えば、ペルオキシダーゼを利用した酵素免疫測定法（特開２００４−２６４２９４号、特開２００４−２０８６９３号等）に使用される試薬等を含むことができる。
【００３３】
ペルオキシターゼ測定に用いるペルオキシダーゼとしては、通常のもの｛西洋ワサビ、微生物、牛乳、白血球等から抽出したペルオキシダーゼ｝等が使用できる。これらのうち、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼである。
なお、ペルオキシダーゼは、遊離の状態であっても、免疫測定において用いられるような配位子（例えば、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン及びビオチン等）と結合した複合体の状態であってもよい。
【００３４】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットを用いると、高精度に生体中の超微量物質（数ｐｇ／ｍＬ〜数十ｐｇ／ｍＬ）を測定することができる。超微量物質としては、たとえば、ＰＳＡ（ヒト前立腺特異抗原）、ＰｒｏＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド前駆体）及びＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）等含まれる。特に、ＰＳＡに関しては、前立腺摘出後患者のＰＳＡ値が術後の経過観察（モニタリング）に使用されており、近年益々高感度が要求されている。本発明の化学発光試薬キットを用いることにより、高精度なモニタリングができ、術後患者のケアに貢献できる。
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部、％は重量％を意味する。
＜合成例１＞
ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロブチル）エタノール｝１００部及び水酸化カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝０．５部及びエチレンオキシド４００部を用いて、常法により、１６０℃、３時間反応させた後、水酸化カリウムを吸着除去（キョーワード処理）して、パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）を得た。
【００３６】
＜合成例２＞
ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロブチル）エタノール｝１００部及び水９００部及び水酸化カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１０部を混合し、次いで過マンガン酸カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝５部を用いて、常法により、１２０℃、５時間反応させた後、水酸化カリウム及び二酸化マンガン等を吸着除去（キョーワード処理）して、パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２１）を得た。
【００３７】
＜合成例３＞
合成例２で得られたパーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２１）１００部及びエタノール２０部及び硫酸｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１部及びシクロヘキサン５０部を用いて、常法により、７５℃、６時間反応させ、蒸留操作によりパーフルオロアルキルカルボン酸エステルを得た。
次に、得られたパーフルオロアルキルカルボン酸エステル１００部及びジメチルアミン塩酸塩｛和光純薬工業（株）製、純度９８％｝２０部を用いて、常法により、３０℃、１時間反応させ、パーフルオロアルキルアミドを得た。
更に、得られたパーフルオロアルキルアミド１００部及び水１００部及び過酸化水素水｛和光純薬工業（株）製、試薬特級、純度３０％｝１０部を用いて、常法により、５０℃、１０時間反応させ、パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１２）を得た。
【００３８】
＜合成例４＞
ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロブチル）エタノール｝１００部及びオキシ塩化リン｛ナカライテスク（株）製、試薬１級、純度９８％｝７０部を混合し、常法により、２０℃、１時間反応させた後、水１００部を加え、パーフルオロアルキルリン酸を得た。次いで、水酸化ナトリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１００部を加え、２０℃、１時間反応させた後、パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２２）を得た。
【００３９】
＜合成例５＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと以外、合成例１と同様にして、パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１３）を得た。
【００４０】
＜合成例６＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと以外、合成例２と同様にして、パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２３）を得た。
【００４１】
＜合成例７＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと、「エタノール２０部」を「エタノール８部」に変更したこと、及び「ジメチルアミン２０部」を「ジメチルアミン８部」に変更したこと以外、合成例３と同様にして、パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１４）を得た。
【００４２】
＜合成例８＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと、及び「オキシ塩化リン７０部」を「オキシ塩化リン２８部」に変更したこと以外、合成例４と同様にして、パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２４）を得た。
【００４３】
＜実施例１＞
以下のようにして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
１）第１液の調製
ルミノールのナトリウム塩（ｂ１）２．８部、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｃ１）０．５６部、パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）３部、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（３６．２ｍＭ、ｐＨ８．６）１０００部を均一混合して、第１液（Ａ１）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４４】
２）第２液の調製
脱イオン水１Ｌに、過酸化水素｛和光純薬工業（株）製、試薬特級、３０％｝を０．１４部溶解して、第２液を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４５】
３）抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬の調製
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体｛ダコ・サイトメーション（株）製｝をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液５０ｍＬに直径３．２ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル（株）製）２，０００個を加え、４８時間静置して、ポリスチレンビーズに抗ＰＳＡポリクロナールウサギ抗体を物理吸着させた。
その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、５０ｍＬの０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でビーズを２回洗浄し、抗ＰＳＡポリクロナールウサギ抗体結合ビーズを調製した。この抗ＰＳＡポリクロナールウサギ抗体結合ビーズを再度５０ｍＬの０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液に浸漬し、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬を調製して、冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４６】
４）ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬の調製
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体｛ダコ・サイトメーション（株）製｝、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡（株）製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬を調製し、冷凍（−２５〜−３５℃）保存した。
【００４７】
次いで、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを用いて、以下のようにして、化学発光量を測定し、その結果を表１に示した｛以下、同様にして測定し、結果を表１に示した。｝。
標準ＰＳＡ溶液１μＬ（ＰＳＡ濃度１００ｎｇ／ｍＬ）｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡキャリブレーターセット｝と、１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液９９９μＬとを混合し、測定用試料を調整した。この測定用試料３００μＬと、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬からピンセットを用いて取り出したビーズ１個とを、試験管（１２×７５ｍｍ）内で１時間反応（３７℃）させた。
引き続き、試験管内から反応液をアスピレータで除去した後、生理食塩水１ｍＬを加えてビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、反応ビーズを得た。
次に、ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬を１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で抗体濃度として１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、標識抗体液を調製した。この標識抗体液３００μＬを、反応ビーズの入った試験管に加え、３７℃、１時間反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水１ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、洗浄ビーズを得た。
洗浄ビーズが入った試験管をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、試験管内に第１液２００μＬ及び第２液２００μＬを同時に加え化学発光反応を開始した。
化学発光反応の開始４０秒後から１０秒間の発光量（積算量）を計測し、この積算量を酵素活性を示す発光量（Ｃ）とした。
なお、標準ＰＳＡ溶液１μＬの代わりに１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液１μＬを用いて同様に測定した場合の発光量を、ブランクの発光量（Ｄ）とした。また、酵素活性を示す発光量（Ｃ）を、ブランクの発光量（Ｄ）で除した比（Ｃ／Ｄ）を測定感度とした。
【００４８】
＜実施例２＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１２）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００４９】
＜実施例３＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２１）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５０】
＜実施例４＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２２）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、
本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５１】
＜実施例５＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５２】
＜実施例６＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１４）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５３】
＜実施例７＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５４】
＜実施例８＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２４）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５５】
＜比較例＞
ルミノールのナトリウム塩２．８部、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．５６部、及び３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（３６．２ｍＭ、ｐＨ８．６）１０００部を均一混合して、第１液（Ｈ１）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
この第１液を、実施例１の第１液と変更した以外、実施例１と同様にして、比較用のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５６】
【表１】
【００５７】
本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを用いると、比較用の化学発光試薬キットを用いた場合に比べて著しく発光量が高かった（高感度であった。）。特に実施例５〜６において、極めて高い感度を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生じる発光をより増強するために、界面活性剤を添加したペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（特許文献１）、卵白アルブミンを添加したペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（特許文献２）、フラーレンを添加したペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（特許文献３）が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開平０８−２６１９４３号公報
【特許文献２】特開２００２−３２３４９５号公報
【特許文献３】特開２００３−２５４９７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットでは、近年益々超微量化する生体中の分析対象物質を正確に測定することが困難となってきている。すなわち本発明の目的は、高精度に生体中の超微量物質を測定するための化学発光試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットの特徴は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）を必須構成成分としてなる第１液と、
酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）を必須構成成分としてなる第２液とを含んでなることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットを用いると、高精度に生体中の超微量物質を測定することができる。特に近年益々高感度が要求される前立腺摘出後患者血清中のＰＳＡ（ヒト前立腺特異抗原）の測定を高感度に行うことができ、たとえば、術後のＰＳＡ値のモニタリングに貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）としては、フッ素原子を含む界面活性剤であれば制限なく使用できる。
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）に含まれるフッ素原子の個数としては、７〜４３が好ましく、さらに好ましくは１１〜３９、特に好ましくは１５〜３５である。
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）としては、パーフルオロアルキル基を持つ界面活性剤等が含まれ、フッ素原子含有界ノニオン面活性剤（ａ１）及びフッ素原子含有アニオン界面活性剤（ａ２）及びこれらの混合物等が使用できる。
【０００８】
フッ素原子含有ノニオン界面活性剤（ａ１）としては、パーフルオロアルキルアミンオキシド及びパーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物等が含まれる。
アルキル基としては、直鎖、分岐又は環状の何れでもよいが、直鎖アルキル及び分岐アルキルが好ましく、さらに好ましくは直鎖アルキルである（以下、同様である。）。
【０００９】
パーフルオロアルキルアミンオキシドとしては、式（１）で表される化合物が含まれる。
【化１】
ｅは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｆは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。また、Ｒは炭素数１〜６のアルキルを表し、メチル、エチル及びプロピルが好ましく、さらに好ましくはメチルである（２つのＲは同じでも異なってもよい）。Ｃは炭素原子、Ｆはフッ素原子、Ｈは水素原子、Ｎは窒素原子、Ｏは酸素原子を表す（以下同様である。）。
【００１０】
パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物としては、式（２）で表される化合物が含まれる。
【化２】
ｇは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｈは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。また、ｉは１〜１２の整数を表し、２〜１０の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜８の整数である。
【００１１】
フッ素原子含有アニオン界面活性剤（ａ２）としては、パーフルオロアルキルカルボン酸塩及びパーフルオロアルキルリン酸エステル等が含まれる。
パーフルオロアルキルカルボン酸塩としては、式（３）で表される化合物が含まれる。
【化３】
ｊは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｋは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。また、Ｍはアルカリ金属（リチウム、カリウム及びナトリウム等）イオン、アンモニウムイオン、炭素数１〜８のアルキルアンモニウムイオン（メチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、メチルトリエチルアンモニウム等）を表し、アルカリ金属イオンが好ましく、さらに好ましくはナトリウムイオンである（以下、同様である。）。
【００１２】
パーフルオロアルキルリン酸エステルとしては、式（４）で表される化合物が含まれる。
【化４】
ｍは０〜２０の整数を表し、１〜１８の整数が好ましく、さらに好ましくは２〜１２の整数である。また、ｎは０〜５の整数を表し、１〜４の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜２の整数である。
【００１３】
これらのフッ素原子含有界面活性剤のうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、パーフルオロアルキルアミンオキシド、パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物及びパーフルオロアルキルカルボン酸塩が好ましく、さらに好ましくはパーフルオロアルキルアミンオキシド及びパーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物、特に好ましくはパーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物である。
【００１４】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の含有量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の含有量（モル％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）のモル数に基づいて、３〜５４が好ましく、さらに好ましくは５〜５１、特に好ましくは７〜４８である。
【００１５】
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）としては、公知｛たとえば、特開平２−２９１２９９号、特開平１０−３１９０１５号、特開２０００−２７９１９６号の各公報等｝の化合物及びこれらの混合物等が使用できる。これらのうち、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩が好ましく、さらに好ましくはルミノール及びルミノールの金属塩、特に好ましくはルミノールのナトリウム塩である。
【００１６】
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）の含有量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）の含有量（モル％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）のモル数に基づいて、１４〜９５が好ましく、さらに好ましくは２０〜９２、特に好ましくは２６〜８９である。
【００１７】
化学発光増強剤（ｃ）としては、公知｛例えば、特開昭５９−５００２５２号、特開昭５９−１７１８３９号、特開平２−２９１２９９号の各公報等｝の化合物及びこれらの混合物等が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、さらに好ましくはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、特に好ましくは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。
【００１８】
化学発光増強剤（ｃ）の含有量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、化学発光増強剤（ｃ）の含有量（モル％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）のモル数に基づいて、２〜３２が好ましく、さらに好ましくは３〜２９、特に好ましくは４〜２６である。
【００１９】
第１液には、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）以外に、緩衝液及び／又はキレート剤等を含むことができる。
【００２０】
緩衝液としては、公知（たとえば、特開平１０−３１９０１５号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）の緩衝液等が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液が好ましく、さらに好ましくは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液、特に好ましくは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度（ｍＭ：ミリモル／リットル）としては、１〜５００が好ましく、さらに好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。
【００２１】
緩衝液を含有する場合、この含有量（重量％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の重量に基づいて、２０〜１００００が好ましく、さらに好ましくは１００〜２０００、特に好ましくは２００〜１０００である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
【００２２】
キレート剤としては、公知（たとえば、特開平９−７５０９９号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）のキレート剤が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、さらに好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム等）、並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、特に好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩である。
【００２３】
キレート剤を含有する場合、この含有量（重量％）は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）の重量に基づいて、０．００１〜４が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜２、特に好ましくは０．０５〜１である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
【００２４】
第１液は、アルカリ性であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ（２０℃）７〜１１であること、特に好ましくはｐＨ（２０℃）８〜１０であることである。
なお、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される。
【００２５】
第１液は、フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）、化学発光増強剤（ｃ）、並びに必要により、緩衝液及び／又はキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
【００２６】
酸化剤（ｄ）としては、公知（たとえば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報に記載）の酸化剤及びこれらの混合物等が使用できる。これらのうち、保存安定性等の観点から、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウムが好ましく、さらに好ましくは過酸化水素である。
【００２７】
酸化剤（ｄ）の濃度は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、以下の範囲が好ましい。
すなわち、第２液中の酸化剤（ｄ）の濃度（ｍＭ；ミリモル／リットル）は、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０、特に好ましくは１〜１０である。
【００２８】
水（ｅ）としては、蒸留水、逆浸透水及び脱イオン水等が挙げられる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、蒸留水及び脱イオン水が好ましく、さらに好ましくは脱イオン水である。
【００２９】
第２液には、酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）以外に、キレート剤等を含むことができる。
キレート剤を含有する場合、この含有量（重量％）は、酸化剤（ｄ）の重量に基づいて、０．２〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０、特に好ましくは１〜１０である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
第２液は、酸化剤（ｄ）をそのまま用いるか、水で濃度調整することにより、また必要によりキレート剤を加えて均一混合することにより容易に得られる。
【００３０】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットは、公知｛たとえば、特開平２−２９１２９９号、特開平１０−３１９０１５号、特開２０００−２７９１９６号の各公報等｝の化学発光試薬キットと同様にして使用できる。発光反応は、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液及び第２液を添加・混合することにより進行する。添加方法としては、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液を添加し、続いて第２液を添加する方法（１）、ペルオキシダーゼを含む検体に、第２液を添加し、続いて第１液を添加する方法（２）、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液及び第２液を同時に添加する方法（３）、第１液及び第２液を混合した後、この混合液を、ペルオキシダーゼを含む検体に添加する方法（４）が挙げられる。これらのうち、操作性及び化学発光増強効果等の観点から、ペルオキシダーゼを含む検体に、第１液及び第２液を同時に添加する方法（３）が好ましい。
第１液と第２液との液量比は、適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、操作性等の観点から、同じ体積量とすることが好ましい。
【００３１】
本発明の化学発光試薬キットは、ペルオキシダーゼを利用した測定法；酵素免疫測定法；核酸プローブを用いてゲノム中の標的核酸を化学発光で検出する方法；サザンブロット法及びノーザンブロット法に使用でき、これらのうち、酵素免疫測定法；サザンブロット法及びノーザンブロット法に好適であり、酵素免疫測定法に最適である。
【００３２】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットには、第１液及び第２液以外に、標識抗体試薬や抗体結合固相試薬等を含むことができる。例えば、ペルオキシダーゼを利用した酵素免疫測定法（特開２００４−２６４２９４号、特開２００４−２０８６９３号等）に使用される試薬等を含むことができる。
【００３３】
ペルオキシターゼ測定に用いるペルオキシダーゼとしては、通常のもの｛西洋ワサビ、微生物、牛乳、白血球等から抽出したペルオキシダーゼ｝等が使用できる。これらのうち、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼである。
なお、ペルオキシダーゼは、遊離の状態であっても、免疫測定において用いられるような配位子（例えば、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン及びビオチン等）と結合した複合体の状態であってもよい。
【００３４】
本発明のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キットを用いると、高精度に生体中の超微量物質（数ｐｇ／ｍＬ〜数十ｐｇ／ｍＬ）を測定することができる。超微量物質としては、たとえば、ＰＳＡ（ヒト前立腺特異抗原）、ＰｒｏＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド前駆体）及びＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）等含まれる。特に、ＰＳＡに関しては、前立腺摘出後患者のＰＳＡ値が術後の経過観察（モニタリング）に使用されており、近年益々高感度が要求されている。本発明の化学発光試薬キットを用いることにより、高精度なモニタリングができ、術後患者のケアに貢献できる。
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部、％は重量％を意味する。
＜合成例１＞
ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロブチル）エタノール｝１００部及び水酸化カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝０．５部及びエチレンオキシド４００部を用いて、常法により、１６０℃、３時間反応させた後、水酸化カリウムを吸着除去（キョーワード処理）して、パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）を得た。
【００３６】
＜合成例２＞
ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロブチル）エタノール｝１００部及び水９００部及び水酸化カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１０部を混合し、次いで過マンガン酸カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝５部を用いて、常法により、１２０℃、５時間反応させた後、水酸化カリウム及び二酸化マンガン等を吸着除去（キョーワード処理）して、パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２１）を得た。
【００３７】
＜合成例３＞
合成例２で得られたパーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２１）１００部及びエタノール２０部及び硫酸｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１部及びシクロヘキサン５０部を用いて、常法により、７５℃、６時間反応させ、蒸留操作によりパーフルオロアルキルカルボン酸エステルを得た。
次に、得られたパーフルオロアルキルカルボン酸エステル１００部及びジメチルアミン塩酸塩｛和光純薬工業（株）製、純度９８％｝２０部を用いて、常法により、３０℃、１時間反応させ、パーフルオロアルキルアミドを得た。
更に、得られたパーフルオロアルキルアミド１００部及び水１００部及び過酸化水素水｛和光純薬工業（株）製、試薬特級、純度３０％｝１０部を用いて、常法により、５０℃、１０時間反応させ、パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１２）を得た。
【００３８】
＜合成例４＞
ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロブチル）エタノール｝１００部及びオキシ塩化リン｛ナカライテスク（株）製、試薬１級、純度９８％｝７０部を混合し、常法により、２０℃、１時間反応させた後、水１００部を加え、パーフルオロアルキルリン酸を得た。次いで、水酸化ナトリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１００部を加え、２０℃、１時間反応させた後、パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２２）を得た。
【００３９】
＜合成例５＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと以外、合成例１と同様にして、パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１３）を得た。
【００４０】
＜合成例６＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと以外、合成例２と同様にして、パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２３）を得た。
【００４１】
＜合成例７＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと、「エタノール２０部」を「エタノール８部」に変更したこと、及び「ジメチルアミン２０部」を「ジメチルアミン８部」に変更したこと以外、合成例３と同様にして、パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１４）を得た。
【００４２】
＜合成例８＞
「ＣＦ3−（ＣＦ2）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ」を「ＣＦ3−（ＣＦ2）9−（ＣＨ2）2−ＯＨ｛ダイキン化成品販売（株）製、２−（パーフルオロデシル）エタノール｝」に変更したこと、及び「オキシ塩化リン７０部」を「オキシ塩化リン２８部」に変更したこと以外、合成例４と同様にして、パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２４）を得た。
【００４３】
＜実施例１＞
以下のようにして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
１）第１液の調製
ルミノールのナトリウム塩（ｂ１）２．８部、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｃ１）０．５６部、パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）３部、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（３６．２ｍＭ、ｐＨ８．６）１０００部を均一混合して、第１液（Ａ１）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４４】
２）第２液の調製
脱イオン水１Ｌに、過酸化水素｛和光純薬工業（株）製、試薬特級、３０％｝を０．１４部溶解して、第２液を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４５】
３）抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬の調製
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体｛ダコ・サイトメーション（株）製｝をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液５０ｍＬに直径３．２ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル（株）製）２，０００個を加え、４８時間静置して、ポリスチレンビーズに抗ＰＳＡポリクロナールウサギ抗体を物理吸着させた。
その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、５０ｍＬの０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でビーズを２回洗浄し、抗ＰＳＡポリクロナールウサギ抗体結合ビーズを調製した。この抗ＰＳＡポリクロナールウサギ抗体結合ビーズを再度５０ｍＬの０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液に浸漬し、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬を調製して、冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４６】
４）ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬の調製
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体｛ダコ・サイトメーション（株）製｝、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡（株）製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬を調製し、冷凍（−２５〜−３５℃）保存した。
【００４７】
次いで、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを用いて、以下のようにして、化学発光量を測定し、その結果を表１に示した｛以下、同様にして測定し、結果を表１に示した。｝。
標準ＰＳＡ溶液１μＬ（ＰＳＡ濃度１００ｎｇ／ｍＬ）｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡキャリブレーターセット｝と、１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液９９９μＬとを混合し、測定用試料を調整した。この測定用試料３００μＬと、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬からピンセットを用いて取り出したビーズ１個とを、試験管（１２×７５ｍｍ）内で１時間反応（３７℃）させた。
引き続き、試験管内から反応液をアスピレータで除去した後、生理食塩水１ｍＬを加えてビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、反応ビーズを得た。
次に、ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬を１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で抗体濃度として１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、標識抗体液を調製した。この標識抗体液３００μＬを、反応ビーズの入った試験管に加え、３７℃、１時間反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水１ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、洗浄ビーズを得た。
洗浄ビーズが入った試験管をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、試験管内に第１液２００μＬ及び第２液２００μＬを同時に加え化学発光反応を開始した。
化学発光反応の開始４０秒後から１０秒間の発光量（積算量）を計測し、この積算量を酵素活性を示す発光量（Ｃ）とした。
なお、標準ＰＳＡ溶液１μＬの代わりに１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液１μＬを用いて同様に測定した場合の発光量を、ブランクの発光量（Ｄ）とした。また、酵素活性を示す発光量（Ｃ）を、ブランクの発光量（Ｄ）で除した比（Ｃ／Ｄ）を測定感度とした。
【００４８】
＜実施例２＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１２）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００４９】
＜実施例３＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２１）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５０】
＜実施例４＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２２）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、
本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５１】
＜実施例５＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５２】
＜実施例６＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルアミンオキシド化合物（ａ１４）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５３】
＜実施例７＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルカルボン酸カリウム塩（ａ２３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５４】
＜実施例８＞
「パーフルオロアルキルエチレンオキシド８モル付加物（ａ１１）」を「パーフルオロアルキルリン酸ナトリウム塩（ａ２４）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５５】
＜比較例＞
ルミノールのナトリウム塩２．８部、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．５６部、及び３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（３６．２ｍＭ、ｐＨ８．６）１０００部を均一混合して、第１液（Ｈ１）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
この第１液を、実施例１の第１液と変更した以外、実施例１と同様にして、比較用のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た｛第１液、第２液、抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体結合ビーズ試薬及びペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬から構成される。｝。
【００５６】
【表１】
【００５７】
本発明のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを用いると、比較用の化学発光試薬キットを用いた場合に比べて著しく発光量が高かった（高感度であった。）。特に実施例５〜６において、極めて高い感度を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）を必須構成成分としてなる第１液と、
酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）を必須構成成分としてなる第２液とを含んでなることを特徴とするペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キット。
【請求項２】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）が、パーフルオロアルキルアミンオキシド、パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物及びパーフルオロアルキルカルボン酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キット。
【請求項１】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）及び化学発光増強剤（ｃ）を必須構成成分としてなる第１液と、
酸化剤（ｄ）及び水（ｅ）を必須構成成分としてなる第２液とを含んでなることを特徴とするペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キット。
【請求項２】
フッ素原子含有界面活性剤（ａ）が、パーフルオロアルキルアミンオキシド、パーフルオロアルキルエチレンオキシド付加物及びパーフルオロアルキルカルボン酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬キット。
【公開番号】特開２００８−５４５８５（Ｐ２００８−５４５８５Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３５６０３（Ｐ２００６−２３５６０３）
【出願日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]