ポリ−γ―グルタミン酸高生産性納豆菌株および該株を用いて製造したポリ−γ−グルタミン酸および納豆
【課題】ポリ−γ−グルタミン酸生産能が向上した納豆菌の提供、および、該菌株を使用した効率的なポリ−γ−グルタミン酸の生産およびポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆の製造。
【解決手段】ポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有する細胞壁溶解酵素の活性を低下させることにより、納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸生産能を向上させ、効率的なポリ−γ−グルタミン酸の生産およびポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆の製造を可能とする。
【解決手段】ポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有する細胞壁溶解酵素の活性を低下させることにより、納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸生産能を向上させ、効率的なポリ−γ−グルタミン酸の生産およびポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆の製造を可能とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、納豆菌によるポリ−γ−グルタミン酸の製造、およびポリ−γ−グルタミン酸を多く含む納豆の製造に関するものである。より詳しくは、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株の取得に関するものである。さらには、該納豆菌変異株を用いた、ポリ−γ−グルタミン酸の効率的な生産およびポリ−γ−グルタミン酸の多い納豆の提供に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本の伝統食品である納豆は、蒸した大豆に納豆菌（Ｂａｓｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ））を繁殖させて作られる大豆発酵食品である。納豆は、大豆たんぱく質が分解されてできたアミノ酸由来の旨みと、独特の粘りが最大の特徴である。この粘り物質は、ポリ−γ−グルタミン酸とレバンであることがわかっている。ポリ−γ−グルタミン酸は、普通のタンパク質がアミノ酸のα結合によってできているのとは異なり、グルタミン酸のみがγ結合してできており、納豆の品質を左右するばかりでなく、健康増進効果や、環境改善効果などへの応用も期待されている物質である。
具体的には、ポリ−γ−グルタミン酸によるカルシウム吸収促進効果（谷本浩之ら，"ポリグルタミン酸配合カルシウムサプリメントのヒトカルシウム吸収促進効果"，日本農芸化学会誌７７ ５０４−５０７ （２００３））や、化粧品への応用（山田記丘美，"γ−ポリグルタミン酸の開発と化粧品への応用"，Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２ ４５−５０ （２００４））、砂漠の緑化（原敏夫，"２１世紀の食糧問題を考える 砂漠の緑化 高分子を利用した緑化"，高分子 ４９ ３６７‐３７０ （２０００））、汚濁水の清澄化効果（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍａｋｏｔｏ，"Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ： Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｆｏｒ ｐｏｌｌｕｔｅｄ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ"，Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ ５９ ８３−９３（２００９））などがある。これらの技術のためには、ポリ−γ−グルタミン酸が安価に大量に供給されることが望まれている。また、化粧品や汚泥水浄化技術にはより高分子量のポリ−γ−グルタミン酸が望まれている。
【０００３】
納豆菌にポリ−γ−グルタミン酸を作らせる技術としては、ＹｗｔＤタンパク質，ＰｇｈＡタンパク質，Ｇｇｔタンパク質などのポリ−γ−グルタミン酸分解酵素の活性を低下もしくは消失させることで安定的に生産する方法（特許文献１及び２参照）、グルタミン酸合成酵素の活性を低下もしくは消失させる方法（特許文献３参照）などが知られている。また、ＹｗｔＤタンパク質と相同性のある、Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素もポリ−γ−グルタミン酸を分解するため、この活性を阻害するＹｏｅＢタンパク質を利用した高分子ポリグルタミン酸の製造方法が考案されている（特許文献４参照）。Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素としては、ＬｙｔＥタンパク質、ＬｙｔＦタンパク質、ＣｗｌＯタンパク質、ＣｗｌＳタンパク質などがある。
【０００４】
より効率的なポリ−γ−グルタミン酸生産を行うためには、ＹｗｔＤタンパク質、ＰｇｈＡタンパク質およびＧｇｔタンパク質等の分解酵素の活性の低下と、細胞壁分解酵素によるポリ−γ−グルタミン酸分解活性の低下を組み合わせることが考えられる。しかしながら、納豆菌によるポリ−γ−グルタミン酸の生産において、ＹｏｅＢタンパク質によるポリグルタミン酸分解活性の抑制は、納豆菌の生育に必要な細胞壁溶解活性も広範囲に抑制してしまうことが考えられることから非効率的であるうえ、ポリ−γ−グルタミン酸の分解を抑制することはわかっているが、生産量に与える影響についてはわかっていない。また、納豆菌の中で、どの細胞壁溶解酵素がどの程度ポリ−γ−グルタミン酸分解を行っているのかも不明である。さらに、ＹｗｔＤタンパク質、ＰｇｈＡタンパク質およびＧｇｔタンパク質などの活性低下を利用したポリ−γ−グルタミン酸生産は培養期間が比較的長いという問題があるが、生育にも必要とされる細胞壁溶解酵素はより早い段階でポリ−γ−グルタミン酸生産に係わっている可能性がある。また、ポリ−γ−グルタミン酸の分解活性を低下させることができれば、より高分子のポリ−γ−グルタミン酸を製造することができる可能性がある。よって、納豆に応用すれば粘りの強い納豆を生産できる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許３６８２４３５号公報
【特許文献２】特開２００３―２３５５６６号公報
【特許文献３】特開２０００−３３３６９０号公報
【特許文献４】特開２００８−１１８９８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明では納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸生産能を向上させるため、ＹｗｔＤタンパク質、Ｇｇｔタンパク質およびＰｇｈＡタンパク質以外のポリ−γ−グルタミン酸分解酵素の活性を低下または欠失させ、ポリ−γ−グルタミン酸の生産性を向上させることを目的とする。具体的には、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有する、細胞壁溶解酵素の活性を低下または欠失させることでポリ−γ−グルタミン酸の生産量を上げ、かつ、分子量の大きなポリ−γ−グルタミン酸を生産する納豆菌を提供することを目的とし、更に、該納豆菌を用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造と、ポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達するために鋭意研究を重ねた結果、細胞壁溶解酵素であるＬｙｔＥタンパク質、ＬｙｔＦタンパク質、ＣｗｌＯタンパク質、ＣｗｌＳタンパク質の少なくとも１つの活性を低下させることにより、納豆菌において、ポリ−γ−グルタミン酸の生産量および該酸の分子量を増加させうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
納豆のねばねばの成分は、グルタミン酸がγ位で結合してできたポリ−γ−グルタミン酸と、フルクトースが結合してできたレバンである。このうちポリ−γ−グルタミン酸は納豆の品質を左右するばかりでなく、カルシウム吸収促進効果などの健康増進効果や、汚濁水の清澄化効果などの環境改善効果などへの応用も期待されている物質である。
【０００９】
納豆菌の作るポリ−γ−グルタミン酸は、Ｄ―グルタミン酸とＬ−グルタミン酸の両方を含んでいる。ポリ−γ−グルタミン酸はＹｗｔＤタンパク質、ＰｇｈＡタンパク質およびＧｇｔタンパク質などにより分解されるが、細胞壁溶解酵素もポリ−γ−グルタミン酸の分解活性をもっている。特にＤ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する、ＬｙｔＥタンパク質、ＬｙｔＦタンパク質、ＣｗｌＯタンパク質およびＣｗｌＳタンパク質の細胞壁溶解酵素はポリ−γ−グルタミン酸を分解することが納豆菌の近縁種である枯草菌では既にわかっている（前記特許文献４参照）。しかし、これらタンパク質が納豆菌に与える影響、特にポリ−γ−グルタミン酸の生産量に与える影響についてはわかっていない。そこで、納豆菌におけるこれら酵素の遺伝子、即ち、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子の破壊株を構築し、ポリ−γ−グルタミン酸生産への影響を調べてみたところ、いずれの遺伝子破壊株もポリ−γ−グルタミン酸の生産量が増加した。特にｃｗｌＯ遺伝子の破壊株ではポリ−γ−グルタミン酸の生産量が増加したこと、また該納豆菌株で製造した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量を親株で製造した納豆と比較してみたところ、親株よりも多いポリ−γ−グルタミン酸が製造されていたことから、ここに本発明を完成するに至った。また、ｃｗｌＯ遺伝子の破壊株によって生産されたポリ−γ−グルタミン酸の分子量は親株の生産するポリ−γ−グルタミン酸の分子量よりも大きく、より大きな分子量のポリ−γ−グルタミン酸を生産できた。更に、該株を納豆に応用してみたところ、粘りの強い納豆を製造することができた。
【００１０】
以上のように本発明は、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸を高生産する納豆菌を提供するものである。具体的には、細胞壁溶解酵素の遺伝子が欠損されており、該欠損が、薬剤耐性遺伝子での置換によるものである納豆菌変異株を提供するものである。更に、具体的には、破壊の対象となる細胞壁溶解酵素遺伝子が、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子の少なくとも１つからなる納豆菌変異株を提供するものである。また、本発明はｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換された、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株 ＭＩＡ０６０５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５２）を提供するものである。更にまた、本発明は、上記の納豆菌変異株を用いて製造されるポリ−γ−グルタミン酸および納豆を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による納豆菌変異株によれば、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸を効率良く生産することが可能である。また、該納豆菌変異株を用いて納豆を製造すれば、ポリ−γ−グルタミン酸を多く含む粘りの強い納豆を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）とのポリ−γ−グルタミン酸分解活性を比較するために後述の実施例２で行ったザイモグラムの写真である。レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１はＮＡＦＭ５（親株）、レーン２はＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）から取得したタンパクを泳動したものである。
【図２】後述の実施例３においてＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）の生産したポリ−γ−グルタミン酸を分析したＨＰＬＣのチャート（ＵＶ２１０ｎｍ）を示したものである。縦軸は検出強度、横軸は保持時間を表しており、保持時間が短いほど分子量が大きい。右上の数値は、分子量標準物質の溶出位置を表す。
【発明の具体的な説明】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明において親株として利用する納豆菌としては、特に限定されるものではないが、ごく一般的に納豆製造に利用されている市販の納豆菌や、自然界などから分離された納豆菌、および、これらの納豆菌をもとに育種された納豆菌などを用いることが好ましい。
【００１５】
具体的には市販納豆菌である、宮城野菌（宮城野納豆製作所）、高橋菌（高橋祐蔵研究所）、成瀬菌（成瀬化学研究所）、宮城野納豆菌からの分離株ＮＡＦＭ５などが挙げられる。
【００１６】
ポリ−γ−グルタミン酸の生産量を評価するための、ポリグルタミン酸の生産培地としては、ポリ−γ−グルタミン酸を生産しうるものであれば何であってもよく、特に限定されるものではないが、具体的には１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１％グルタミン酸ナトリウム、０．５％スクロースを含んでなる培地（以下、ＬＧＳ培地という）などが挙げられる。
【００１７】
納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸生産能は、ＬＧＳ培地などのポリ−γ−グルタミン酸生産培地で培養した培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸量を測定することによって評価することができる。ポリ−γ−グルタミン酸を測定する方法としては、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いたＣＥＴ法（菅野彰重，“セチルトリメチルアンモニウムブロミドを用いた納豆のγ−ポリグルタミン酸の定量”，日本食品科学工学会誌 ４２ ８７８−８８６（１９９５））などがある。
納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下または欠失しているかどうかの判定方法は特に限定されるものではないが、ポリ−γ−グルタミン酸を基質としたザイモグラムで判別することができる。すなわち、納豆菌を適当な培地で培養した後、菌体または上清からタンパク質を取得し、基質となるポリ−γ−グルタミン酸を含んだポリアクリルアミドゲルで電泳泳動後、適当な温度でポリ−γ−グルタミン酸分解反応を行わせ、メチレンブルーで染色する。分解活性を有するタンパク質が存在するところでは、ポリ−γ−グルタミン酸が分解されてメチレンブルーで染色されないため、バンドとして確認することができる。すなわち、コントロールとする納豆菌よりも、検出されるバンドの数や太さが減少した場合に、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下または欠失していると判断することが出来る。
【００１８】
ポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下し、ポリ−γ−グルタミン酸の生産量が増加した納豆菌は、上記のようなポリ−γ−グルタミン酸分解活性の評価、およびポリグルタミン酸の生産量の評価によって自然界からスクリーニングすることができる。また、人為的に変異を導入することによっても得ることが出来る。人為的に変異を導入する方法としては、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の化学的な方法や紫外線やＸ線照射等の物理的な処理、遺伝子工学的手法等を用いることも可能であり、特に限定されるものではない。
【００１９】
遺伝工学的手法として、ターゲットとなる遺伝子としては、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有する細胞壁分解酵素の遺伝子であれば何であってもよく、単独または複数同時に係わらず、特に限定されるものではない。好ましくは、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子および、ｃｗｌＳ遺伝子などが挙げられる。特にｃｗｌＯ遺伝子が有用である。
【００２０】
遺伝子工学的手法として、ターゲット遺伝子に変異を導入する方法としては、ポイントミューテーションや欠失、置換、挿入失活など遺伝子産物の活性を低下させうるものであれば何であってもよく、特に限定されるものではない。
【００２１】
また、遺伝子工学的手法を納豆菌に利用するためには、納豆菌への遺伝子の導入が必要であるが、そのような方法としては、自然形質転換能を利用したコンピテンス法や、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ファージを利用した形質導入法などがあるが、遺伝子を導入することが出来れば何であってもよく、特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明者らは、コンピテンス法を利用して、後述する実施例に準じて、納豆菌ＮＡＦＭ５のｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換されたポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）ＭＩＡ０６０５を創製し、平成２１年９月２８日 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。該菌株はＦＥＲＭ Ｐ−２１８５２として寄託されている。
【００２３】
なお、この菌株は、ｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換されていること、および、ポリ−γ−グルタミン酸生産能が増加していること以外の菌学的性質は、市販の納豆菌のもの〔食総研報（Ｒｅｐ．Ｎａｔｌ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．）Ｎｏ．５０，１８〜２１（１９８７）および大豆月報、１２月号、２１〜２９（１９８５）参照〕と大差はなかった。即ち、この変異株ＭＩＡ０６０５は、好気性、グラム染色陽性の桿菌であり、生育適温（３５〜４５℃）、各種の糖の発酵性、ＤＮＡのＧＣ含量等の性質がＢｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ８版の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の性質と一致しており、かつ粘質物を生成し、ビオチン要求性であることから、いわゆる納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ））に属しているものである。
【００２４】
本発明による納豆菌変異株は、ポリ−γ−グルタミン酸の生産能が増加しており、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸生産を効率的に行うことができる。更に、該納豆菌変異株を用いて納豆を製造することにより、ポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆であり、かつ粘りの強い納豆を製造することができる。該納豆は本発明の納豆菌変異株を用いて製造されるものであれば、納豆の大豆原材料、納豆の製造条件および製造工程等に関しては、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明において、％は重量％を意味する。
【実施例１】
【００２６】
育種親株としては、宮城野納豆菌より分離されたＮＡＦＭ５を用いた。また、納豆菌の形質転換はＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ．、Ｓｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ．， “ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．” Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８１：７４１−７４６（１９６１）に記載の方法により行った。
【００２７】
また、細胞壁溶解活性を有するポリ−γ−グルタミン酸分解酵素のターゲット遺伝子として、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子を選び各遺伝子の破壊株を構築した。
【００２８】
遺伝子破壊用のＤＮＡの構築は、まず、定法に従い調製したＮＡＦＭ５ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、後述の配列表に記載のプライマーを使用してターゲット遺伝子の上流および下流の約１ＫｂをＰＣＲにより増幅し、また、ｐＤＧ７８３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）由来のカナマイシン耐性遺伝子をｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ、ｐＵＣ１１９−Ｋｍをテンプレートとして、後述の配列表に記載のプライマーを使用してカナマイシン耐性遺伝子を増幅し、次いで、ターゲット遺伝子の代わりとして、カナマイシン耐性遺伝子を挟むように、それぞれ増幅したターゲット遺伝子の上流、カナマイシン耐性遺伝子およびターゲット遺伝子の下流をＰＣＲライゲーションにより連結して行った。なお、ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して添付のマニュアルに従って行った。
【００２９】
具体的には、ｌｙｔＥ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｌｙｔＥ：：Ｋｍを以下の通り構築した。まず、ｌｙｔＥ遺伝子上流部を後述の配列表の配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて、また、ｌｙｔＥ遺伝子下流部を配列番号３および配列番号４に記載のプライマーを用いてそれぞれＮＡＦＭ５のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲにより増幅した。また、カナマイシン耐性遺伝子を、配列表の配列番号５および配列番号６に記載のプライマー用いて、ｐＵＣ１１９−ＫｍをテンプレートにしてＰＣＲにより増幅した。次いで、これら増幅産物と、配列番号１および配列番号４に記載のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、３つの増幅産物が結合されたΔｌｙｔＥ：：Ｋｍを構築した。
【００３０】
同様の手順で、ｌｙｔＦ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｌｙｔＦ：：Ｋｍ、ｃｗｌＯ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｃｗｌＯ：：ＫｍおよびｃｗｌＳ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｃｗｌＳ：：Ｓｐを構築した。なお、ΔｌｙｔＦ：：Ｋｍの構築には配列番号１〜４の代わりに配列番号７〜１０に記載のプライマーを、ΔｃｗｌＯ：：Ｋｍの構築には配列番号１〜４の代わりに配列番号１１〜１４に記載のプライマーを使用した。ΔｃｗｌＳ：：Ｓｐの構築には配列番号１〜４の代わりに配列番号１５〜１８に記載のプライマーを使用し、カナマイシン耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン耐性遺伝子を使用した。スペクチノマイシン遺伝子は、ｐＤＧ１７２７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）のスペクチノマイシン耐性遺伝子をｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ、ｐＵＣ１１９−Ｓｐをテンプレートにして配列番号５および配列番号６に記載のプライマーを使用して増幅した。
【００３１】
次いで、各遺伝子の破壊用ＤＮＡを、それぞれＮＡＦＭ５に形質転換し、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子の破壊株、ＮＡＦＭ５（ΔｌｙｔＥ）、ＮＡＦＭ５（ΔｌｙｔＦ）、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）およびＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＳ）を構築した。なお、形質転換体の選抜は、いずれもカナマイシン２０μｇ／ｍｌまたはスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地を用いて行った。また、ターゲット遺伝子がマーカー遺伝子で置換されているかはＰＣＲ法によって確認した。
【００３２】
得られた形質転換体のポリ−γ−グルタミン酸生産能を確認するため、親株、および各破壊株をそれぞれ５０ｍｌのＬＧＳ培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養を行い、培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸をＣＥＴ法にて測定した。
【００３３】
それぞれのポリ−γ−グルタミン酸量測定結果を表１に示す。
【表１】
【００３４】
その結果、培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸は、どの株も親株より高く、特にｃｗｌＯ遺伝子の破壊株ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）では２倍近く生産量が上がった。
【実施例２】
【００３５】
ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）のポリ−γ−グルタミン酸分解活性を親株と比較するため、ＮＡＦＭ５（親株）および、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）をＬＧＳ培地で培養し、培養上清中のタンパク質を取得してポリ−γ−グルタミン酸を基質とするザイモグラムを行った。すなわち、１５ｍｌの培養上清に、０．６ｍｌの５０％トリクロロ酢酸水溶液を加えた後、遠心分離によってタンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、６０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ サンプルバッファーに溶解した。得られた溶解液をボイルし、平均分子量１５０万〜２５０万のポリ−γ−グルタミン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）０．０２％を含む１４％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後のゲルを、活性染色液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．２）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で２回洗浄後、同溶液中にて一晩３７℃で反応させた。その後活性染色液を捨て、染色液（０．０１％メチレンブルー、０．０１％水酸化カリウム）で染色した。図１はその結果を示す。ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）ではＮＡＦＭ５（親株）で見られるような、バンドが観察されず、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下していた。ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）では複数のバンドが消失していた。これらのバンドは全てＣｗｌＯタンパク質と関係するものである。枯草菌では、培養上清中の分解したＣｗｌＯタンパク質の細胞壁溶解活性が、複数のバンドとして検出されていることから（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ， Ｆｕｒｕｈａｔａ Ｋ， Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｔ， Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ， Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｊ．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｇｅｎｅ， ｙｖｃＥ （ｎａｍｅｄ ｃｗｌＯ）， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．” Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９８：１７４−１８１ （２００４））、同様のことがポリ−γ−グルタミン酸の分解活性でも起こっているものと考えられる。培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸分解酵素の活性はＣｗｌＯタンパク質によるものがほとんどであり、よって、本実施例の条件に基づいてポリ−γ−グルタミン酸の分解活性が低下している株をスクリーニングすれば、該株のＣｗｌＯタンパク質の活性が低下していることがわかる。
【実施例３】
【００３６】
ＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）の生産するポリ−γ−グルタミン酸の分子量を比較するため、実施例１と同様の培養法で調製したサンプルを、ＨＰＬＣにて分析した。分析条件は、カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦ−７Ｍ ＨＱ （７．５ｘ３００ｍｍ） ＋ ＧＦ−１Ｇ ７Ｂ
（昭和電工社製）、移動相：５０ｍＭ リン酸Ｎａ， ０．１Ｍ Ｎａ２ＳＯ４ （ｐＨ６．８）、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、温度：５０℃、検出器：ＵＶ２１０ｎｍ＋ＲＩ、分子量標準物質： Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２（昭和電工社製、物質名 ：プルラン、分子量範囲：１０，０００−８００,０００）。
【００３７】
ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）が生産したポリ−γ−グルタミン酸は、ＮＡＦＭ５（親株）の生産したポリ−γ−グルタミン酸よりも高分子領域のポリ−γ−グルタミン酸の割合が多かった。図２はその結果を示す。
【実施例４】
【００３８】
ＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）を用いて常法に従い納豆を試作し、ポリ−γ−グルタミン酸含量を測定した。すなわち、一晩水につけた丸大豆をざるに入れ、１２１℃で５０分間オートクレーブして煮豆とした。この煮豆に、スラントで調製した胞子を懸濁した種菌液を、５０ｇあたり１ｍｌの割合で接種し、４０℃で１７時間発酵させた。試作した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量をＣＥＴ法にて測定した。その結果、ＮＡＦＭ５（親株）で試作した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量は１２５ｍｇ／１００ｇであったのに対し、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）で試作した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量は、１６４ｍｇ／１００ｇと増加していた。また、納豆５０ｇに１５０ｍｌの水を加えて撹拌し、得られた抽出液の粘度をＢ型粘度で測定したところ、野生株で試作した納豆の粘度が２２ｃＰであったのに対し、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）で試作した納豆の粘度は２９ｃＰと増加していた。よって、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）をＭＩＡ０６０５株と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、納豆菌によるポリ−γ−グルタミン酸の製造、およびポリ−γ−グルタミン酸を多く含む納豆の製造に関するものである。より詳しくは、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株の取得に関するものである。さらには、該納豆菌変異株を用いた、ポリ−γ−グルタミン酸の効率的な生産およびポリ−γ−グルタミン酸の多い納豆の提供に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本の伝統食品である納豆は、蒸した大豆に納豆菌（Ｂａｓｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ））を繁殖させて作られる大豆発酵食品である。納豆は、大豆たんぱく質が分解されてできたアミノ酸由来の旨みと、独特の粘りが最大の特徴である。この粘り物質は、ポリ−γ−グルタミン酸とレバンであることがわかっている。ポリ−γ−グルタミン酸は、普通のタンパク質がアミノ酸のα結合によってできているのとは異なり、グルタミン酸のみがγ結合してできており、納豆の品質を左右するばかりでなく、健康増進効果や、環境改善効果などへの応用も期待されている物質である。
具体的には、ポリ−γ−グルタミン酸によるカルシウム吸収促進効果（谷本浩之ら，"ポリグルタミン酸配合カルシウムサプリメントのヒトカルシウム吸収促進効果"，日本農芸化学会誌７７ ５０４−５０７ （２００３））や、化粧品への応用（山田記丘美，"γ−ポリグルタミン酸の開発と化粧品への応用"，Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２ ４５−５０ （２００４））、砂漠の緑化（原敏夫，"２１世紀の食糧問題を考える 砂漠の緑化 高分子を利用した緑化"，高分子 ４９ ３６７‐３７０ （２０００））、汚濁水の清澄化効果（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍａｋｏｔｏ，"Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ： Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｆｏｒ ｐｏｌｌｕｔｅｄ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ"，Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ ５９ ８３−９３（２００９））などがある。これらの技術のためには、ポリ−γ−グルタミン酸が安価に大量に供給されることが望まれている。また、化粧品や汚泥水浄化技術にはより高分子量のポリ−γ−グルタミン酸が望まれている。
【０００３】
納豆菌にポリ−γ−グルタミン酸を作らせる技術としては、ＹｗｔＤタンパク質，ＰｇｈＡタンパク質，Ｇｇｔタンパク質などのポリ−γ−グルタミン酸分解酵素の活性を低下もしくは消失させることで安定的に生産する方法（特許文献１及び２参照）、グルタミン酸合成酵素の活性を低下もしくは消失させる方法（特許文献３参照）などが知られている。また、ＹｗｔＤタンパク質と相同性のある、Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素もポリ−γ−グルタミン酸を分解するため、この活性を阻害するＹｏｅＢタンパク質を利用した高分子ポリグルタミン酸の製造方法が考案されている（特許文献４参照）。Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素としては、ＬｙｔＥタンパク質、ＬｙｔＦタンパク質、ＣｗｌＯタンパク質、ＣｗｌＳタンパク質などがある。
【０００４】
より効率的なポリ−γ−グルタミン酸生産を行うためには、ＹｗｔＤタンパク質、ＰｇｈＡタンパク質およびＧｇｔタンパク質等の分解酵素の活性の低下と、細胞壁分解酵素によるポリ−γ−グルタミン酸分解活性の低下を組み合わせることが考えられる。しかしながら、納豆菌によるポリ−γ−グルタミン酸の生産において、ＹｏｅＢタンパク質によるポリグルタミン酸分解活性の抑制は、納豆菌の生育に必要な細胞壁溶解活性も広範囲に抑制してしまうことが考えられることから非効率的であるうえ、ポリ−γ−グルタミン酸の分解を抑制することはわかっているが、生産量に与える影響についてはわかっていない。また、納豆菌の中で、どの細胞壁溶解酵素がどの程度ポリ−γ−グルタミン酸分解を行っているのかも不明である。さらに、ＹｗｔＤタンパク質、ＰｇｈＡタンパク質およびＧｇｔタンパク質などの活性低下を利用したポリ−γ−グルタミン酸生産は培養期間が比較的長いという問題があるが、生育にも必要とされる細胞壁溶解酵素はより早い段階でポリ−γ−グルタミン酸生産に係わっている可能性がある。また、ポリ−γ−グルタミン酸の分解活性を低下させることができれば、より高分子のポリ−γ−グルタミン酸を製造することができる可能性がある。よって、納豆に応用すれば粘りの強い納豆を生産できる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許３６８２４３５号公報
【特許文献２】特開２００３―２３５５６６号公報
【特許文献３】特開２０００−３３３６９０号公報
【特許文献４】特開２００８−１１８９８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明では納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸生産能を向上させるため、ＹｗｔＤタンパク質、Ｇｇｔタンパク質およびＰｇｈＡタンパク質以外のポリ−γ−グルタミン酸分解酵素の活性を低下または欠失させ、ポリ−γ−グルタミン酸の生産性を向上させることを目的とする。具体的には、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有する、細胞壁溶解酵素の活性を低下または欠失させることでポリ−γ−グルタミン酸の生産量を上げ、かつ、分子量の大きなポリ−γ−グルタミン酸を生産する納豆菌を提供することを目的とし、更に、該納豆菌を用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造と、ポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達するために鋭意研究を重ねた結果、細胞壁溶解酵素であるＬｙｔＥタンパク質、ＬｙｔＦタンパク質、ＣｗｌＯタンパク質、ＣｗｌＳタンパク質の少なくとも１つの活性を低下させることにより、納豆菌において、ポリ−γ−グルタミン酸の生産量および該酸の分子量を増加させうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
納豆のねばねばの成分は、グルタミン酸がγ位で結合してできたポリ−γ−グルタミン酸と、フルクトースが結合してできたレバンである。このうちポリ−γ−グルタミン酸は納豆の品質を左右するばかりでなく、カルシウム吸収促進効果などの健康増進効果や、汚濁水の清澄化効果などの環境改善効果などへの応用も期待されている物質である。
【０００９】
納豆菌の作るポリ−γ−グルタミン酸は、Ｄ―グルタミン酸とＬ−グルタミン酸の両方を含んでいる。ポリ−γ−グルタミン酸はＹｗｔＤタンパク質、ＰｇｈＡタンパク質およびＧｇｔタンパク質などにより分解されるが、細胞壁溶解酵素もポリ−γ−グルタミン酸の分解活性をもっている。特にＤ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する、ＬｙｔＥタンパク質、ＬｙｔＦタンパク質、ＣｗｌＯタンパク質およびＣｗｌＳタンパク質の細胞壁溶解酵素はポリ−γ−グルタミン酸を分解することが納豆菌の近縁種である枯草菌では既にわかっている（前記特許文献４参照）。しかし、これらタンパク質が納豆菌に与える影響、特にポリ−γ−グルタミン酸の生産量に与える影響についてはわかっていない。そこで、納豆菌におけるこれら酵素の遺伝子、即ち、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子の破壊株を構築し、ポリ−γ−グルタミン酸生産への影響を調べてみたところ、いずれの遺伝子破壊株もポリ−γ−グルタミン酸の生産量が増加した。特にｃｗｌＯ遺伝子の破壊株ではポリ−γ−グルタミン酸の生産量が増加したこと、また該納豆菌株で製造した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量を親株で製造した納豆と比較してみたところ、親株よりも多いポリ−γ−グルタミン酸が製造されていたことから、ここに本発明を完成するに至った。また、ｃｗｌＯ遺伝子の破壊株によって生産されたポリ−γ−グルタミン酸の分子量は親株の生産するポリ−γ−グルタミン酸の分子量よりも大きく、より大きな分子量のポリ−γ−グルタミン酸を生産できた。更に、該株を納豆に応用してみたところ、粘りの強い納豆を製造することができた。
【００１０】
以上のように本発明は、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸を高生産する納豆菌を提供するものである。具体的には、細胞壁溶解酵素の遺伝子が欠損されており、該欠損が、薬剤耐性遺伝子での置換によるものである納豆菌変異株を提供するものである。更に、具体的には、破壊の対象となる細胞壁溶解酵素遺伝子が、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子の少なくとも１つからなる納豆菌変異株を提供するものである。また、本発明はｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換された、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株 ＭＩＡ０６０５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５２）を提供するものである。更にまた、本発明は、上記の納豆菌変異株を用いて製造されるポリ−γ−グルタミン酸および納豆を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による納豆菌変異株によれば、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸を効率良く生産することが可能である。また、該納豆菌変異株を用いて納豆を製造すれば、ポリ−γ−グルタミン酸を多く含む粘りの強い納豆を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）とのポリ−γ−グルタミン酸分解活性を比較するために後述の実施例２で行ったザイモグラムの写真である。レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１はＮＡＦＭ５（親株）、レーン２はＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）から取得したタンパクを泳動したものである。
【図２】後述の実施例３においてＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）の生産したポリ−γ−グルタミン酸を分析したＨＰＬＣのチャート（ＵＶ２１０ｎｍ）を示したものである。縦軸は検出強度、横軸は保持時間を表しており、保持時間が短いほど分子量が大きい。右上の数値は、分子量標準物質の溶出位置を表す。
【発明の具体的な説明】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明において親株として利用する納豆菌としては、特に限定されるものではないが、ごく一般的に納豆製造に利用されている市販の納豆菌や、自然界などから分離された納豆菌、および、これらの納豆菌をもとに育種された納豆菌などを用いることが好ましい。
【００１５】
具体的には市販納豆菌である、宮城野菌（宮城野納豆製作所）、高橋菌（高橋祐蔵研究所）、成瀬菌（成瀬化学研究所）、宮城野納豆菌からの分離株ＮＡＦＭ５などが挙げられる。
【００１６】
ポリ−γ−グルタミン酸の生産量を評価するための、ポリグルタミン酸の生産培地としては、ポリ−γ−グルタミン酸を生産しうるものであれば何であってもよく、特に限定されるものではないが、具体的には１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１％グルタミン酸ナトリウム、０．５％スクロースを含んでなる培地（以下、ＬＧＳ培地という）などが挙げられる。
【００１７】
納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸生産能は、ＬＧＳ培地などのポリ−γ−グルタミン酸生産培地で培養した培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸量を測定することによって評価することができる。ポリ−γ−グルタミン酸を測定する方法としては、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いたＣＥＴ法（菅野彰重，“セチルトリメチルアンモニウムブロミドを用いた納豆のγ−ポリグルタミン酸の定量”，日本食品科学工学会誌 ４２ ８７８−８８６（１９９５））などがある。
納豆菌のポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下または欠失しているかどうかの判定方法は特に限定されるものではないが、ポリ−γ−グルタミン酸を基質としたザイモグラムで判別することができる。すなわち、納豆菌を適当な培地で培養した後、菌体または上清からタンパク質を取得し、基質となるポリ−γ−グルタミン酸を含んだポリアクリルアミドゲルで電泳泳動後、適当な温度でポリ−γ−グルタミン酸分解反応を行わせ、メチレンブルーで染色する。分解活性を有するタンパク質が存在するところでは、ポリ−γ−グルタミン酸が分解されてメチレンブルーで染色されないため、バンドとして確認することができる。すなわち、コントロールとする納豆菌よりも、検出されるバンドの数や太さが減少した場合に、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下または欠失していると判断することが出来る。
【００１８】
ポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下し、ポリ−γ−グルタミン酸の生産量が増加した納豆菌は、上記のようなポリ−γ−グルタミン酸分解活性の評価、およびポリグルタミン酸の生産量の評価によって自然界からスクリーニングすることができる。また、人為的に変異を導入することによっても得ることが出来る。人為的に変異を導入する方法としては、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の化学的な方法や紫外線やＸ線照射等の物理的な処理、遺伝子工学的手法等を用いることも可能であり、特に限定されるものではない。
【００１９】
遺伝工学的手法として、ターゲットとなる遺伝子としては、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有する細胞壁分解酵素の遺伝子であれば何であってもよく、単独または複数同時に係わらず、特に限定されるものではない。好ましくは、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子および、ｃｗｌＳ遺伝子などが挙げられる。特にｃｗｌＯ遺伝子が有用である。
【００２０】
遺伝子工学的手法として、ターゲット遺伝子に変異を導入する方法としては、ポイントミューテーションや欠失、置換、挿入失活など遺伝子産物の活性を低下させうるものであれば何であってもよく、特に限定されるものではない。
【００２１】
また、遺伝子工学的手法を納豆菌に利用するためには、納豆菌への遺伝子の導入が必要であるが、そのような方法としては、自然形質転換能を利用したコンピテンス法や、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ファージを利用した形質導入法などがあるが、遺伝子を導入することが出来れば何であってもよく、特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明者らは、コンピテンス法を利用して、後述する実施例に準じて、納豆菌ＮＡＦＭ５のｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換されたポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）ＭＩＡ０６０５を創製し、平成２１年９月２８日 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。該菌株はＦＥＲＭ Ｐ−２１８５２として寄託されている。
【００２３】
なお、この菌株は、ｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換されていること、および、ポリ−γ−グルタミン酸生産能が増加していること以外の菌学的性質は、市販の納豆菌のもの〔食総研報（Ｒｅｐ．Ｎａｔｌ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．）Ｎｏ．５０，１８〜２１（１９８７）および大豆月報、１２月号、２１〜２９（１９８５）参照〕と大差はなかった。即ち、この変異株ＭＩＡ０６０５は、好気性、グラム染色陽性の桿菌であり、生育適温（３５〜４５℃）、各種の糖の発酵性、ＤＮＡのＧＣ含量等の性質がＢｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ８版の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の性質と一致しており、かつ粘質物を生成し、ビオチン要求性であることから、いわゆる納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ））に属しているものである。
【００２４】
本発明による納豆菌変異株は、ポリ−γ−グルタミン酸の生産能が増加しており、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸生産を効率的に行うことができる。更に、該納豆菌変異株を用いて納豆を製造することにより、ポリ−γ−グルタミン酸含量の多い納豆であり、かつ粘りの強い納豆を製造することができる。該納豆は本発明の納豆菌変異株を用いて製造されるものであれば、納豆の大豆原材料、納豆の製造条件および製造工程等に関しては、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明において、％は重量％を意味する。
【実施例１】
【００２６】
育種親株としては、宮城野納豆菌より分離されたＮＡＦＭ５を用いた。また、納豆菌の形質転換はＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ．、Ｓｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ．， “ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．” Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８１：７４１−７４６（１９６１）に記載の方法により行った。
【００２７】
また、細胞壁溶解活性を有するポリ−γ−グルタミン酸分解酵素のターゲット遺伝子として、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子を選び各遺伝子の破壊株を構築した。
【００２８】
遺伝子破壊用のＤＮＡの構築は、まず、定法に従い調製したＮＡＦＭ５ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、後述の配列表に記載のプライマーを使用してターゲット遺伝子の上流および下流の約１ＫｂをＰＣＲにより増幅し、また、ｐＤＧ７８３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）由来のカナマイシン耐性遺伝子をｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ、ｐＵＣ１１９−Ｋｍをテンプレートとして、後述の配列表に記載のプライマーを使用してカナマイシン耐性遺伝子を増幅し、次いで、ターゲット遺伝子の代わりとして、カナマイシン耐性遺伝子を挟むように、それぞれ増幅したターゲット遺伝子の上流、カナマイシン耐性遺伝子およびターゲット遺伝子の下流をＰＣＲライゲーションにより連結して行った。なお、ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して添付のマニュアルに従って行った。
【００２９】
具体的には、ｌｙｔＥ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｌｙｔＥ：：Ｋｍを以下の通り構築した。まず、ｌｙｔＥ遺伝子上流部を後述の配列表の配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて、また、ｌｙｔＥ遺伝子下流部を配列番号３および配列番号４に記載のプライマーを用いてそれぞれＮＡＦＭ５のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲにより増幅した。また、カナマイシン耐性遺伝子を、配列表の配列番号５および配列番号６に記載のプライマー用いて、ｐＵＣ１１９−ＫｍをテンプレートにしてＰＣＲにより増幅した。次いで、これら増幅産物と、配列番号１および配列番号４に記載のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、３つの増幅産物が結合されたΔｌｙｔＥ：：Ｋｍを構築した。
【００３０】
同様の手順で、ｌｙｔＦ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｌｙｔＦ：：Ｋｍ、ｃｗｌＯ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｃｗｌＯ：：ＫｍおよびｃｗｌＳ遺伝子破壊用のＤＮＡとしてΔｃｗｌＳ：：Ｓｐを構築した。なお、ΔｌｙｔＦ：：Ｋｍの構築には配列番号１〜４の代わりに配列番号７〜１０に記載のプライマーを、ΔｃｗｌＯ：：Ｋｍの構築には配列番号１〜４の代わりに配列番号１１〜１４に記載のプライマーを使用した。ΔｃｗｌＳ：：Ｓｐの構築には配列番号１〜４の代わりに配列番号１５〜１８に記載のプライマーを使用し、カナマイシン耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン耐性遺伝子を使用した。スペクチノマイシン遺伝子は、ｐＤＧ１７２７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）のスペクチノマイシン耐性遺伝子をｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ、ｐＵＣ１１９−Ｓｐをテンプレートにして配列番号５および配列番号６に記載のプライマーを使用して増幅した。
【００３１】
次いで、各遺伝子の破壊用ＤＮＡを、それぞれＮＡＦＭ５に形質転換し、ｌｙｔＥ遺伝子、ｌｙｔＦ遺伝子、ｃｗｌＯ遺伝子およびｃｗｌＳ遺伝子の破壊株、ＮＡＦＭ５（ΔｌｙｔＥ）、ＮＡＦＭ５（ΔｌｙｔＦ）、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）およびＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＳ）を構築した。なお、形質転換体の選抜は、いずれもカナマイシン２０μｇ／ｍｌまたはスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地を用いて行った。また、ターゲット遺伝子がマーカー遺伝子で置換されているかはＰＣＲ法によって確認した。
【００３２】
得られた形質転換体のポリ−γ−グルタミン酸生産能を確認するため、親株、および各破壊株をそれぞれ５０ｍｌのＬＧＳ培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養を行い、培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸をＣＥＴ法にて測定した。
【００３３】
それぞれのポリ−γ−グルタミン酸量測定結果を表１に示す。
【表１】
【００３４】
その結果、培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸は、どの株も親株より高く、特にｃｗｌＯ遺伝子の破壊株ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）では２倍近く生産量が上がった。
【実施例２】
【００３５】
ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）のポリ−γ−グルタミン酸分解活性を親株と比較するため、ＮＡＦＭ５（親株）および、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）をＬＧＳ培地で培養し、培養上清中のタンパク質を取得してポリ−γ−グルタミン酸を基質とするザイモグラムを行った。すなわち、１５ｍｌの培養上清に、０．６ｍｌの５０％トリクロロ酢酸水溶液を加えた後、遠心分離によってタンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、６０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ サンプルバッファーに溶解した。得られた溶解液をボイルし、平均分子量１５０万〜２５０万のポリ−γ−グルタミン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）０．０２％を含む１４％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後のゲルを、活性染色液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．２）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で２回洗浄後、同溶液中にて一晩３７℃で反応させた。その後活性染色液を捨て、染色液（０．０１％メチレンブルー、０．０１％水酸化カリウム）で染色した。図１はその結果を示す。ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）ではＮＡＦＭ５（親株）で見られるような、バンドが観察されず、ポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下していた。ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）では複数のバンドが消失していた。これらのバンドは全てＣｗｌＯタンパク質と関係するものである。枯草菌では、培養上清中の分解したＣｗｌＯタンパク質の細胞壁溶解活性が、複数のバンドとして検出されていることから（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ， Ｆｕｒｕｈａｔａ Ｋ， Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｔ， Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ， Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｊ．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｇｅｎｅ， ｙｖｃＥ （ｎａｍｅｄ ｃｗｌＯ）， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．” Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９８：１７４−１８１ （２００４））、同様のことがポリ−γ−グルタミン酸の分解活性でも起こっているものと考えられる。培養上清中のポリ−γ−グルタミン酸分解酵素の活性はＣｗｌＯタンパク質によるものがほとんどであり、よって、本実施例の条件に基づいてポリ−γ−グルタミン酸の分解活性が低下している株をスクリーニングすれば、該株のＣｗｌＯタンパク質の活性が低下していることがわかる。
【実施例３】
【００３６】
ＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）の生産するポリ−γ−グルタミン酸の分子量を比較するため、実施例１と同様の培養法で調製したサンプルを、ＨＰＬＣにて分析した。分析条件は、カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦ−７Ｍ ＨＱ （７．５ｘ３００ｍｍ） ＋ ＧＦ−１Ｇ ７Ｂ
（昭和電工社製）、移動相：５０ｍＭ リン酸Ｎａ， ０．１Ｍ Ｎａ２ＳＯ４ （ｐＨ６．８）、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、温度：５０℃、検出器：ＵＶ２１０ｎｍ＋ＲＩ、分子量標準物質： Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２（昭和電工社製、物質名 ：プルラン、分子量範囲：１０，０００−８００,０００）。
【００３７】
ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）が生産したポリ−γ−グルタミン酸は、ＮＡＦＭ５（親株）の生産したポリ−γ−グルタミン酸よりも高分子領域のポリ−γ−グルタミン酸の割合が多かった。図２はその結果を示す。
【実施例４】
【００３８】
ＮＡＦＭ５（親株）とＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）を用いて常法に従い納豆を試作し、ポリ−γ−グルタミン酸含量を測定した。すなわち、一晩水につけた丸大豆をざるに入れ、１２１℃で５０分間オートクレーブして煮豆とした。この煮豆に、スラントで調製した胞子を懸濁した種菌液を、５０ｇあたり１ｍｌの割合で接種し、４０℃で１７時間発酵させた。試作した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量をＣＥＴ法にて測定した。その結果、ＮＡＦＭ５（親株）で試作した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量は１２５ｍｇ／１００ｇであったのに対し、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）で試作した納豆中のポリ−γ−グルタミン酸量は、１６４ｍｇ／１００ｇと増加していた。また、納豆５０ｇに１５０ｍｌの水を加えて撹拌し、得られた抽出液の粘度をＢ型粘度で測定したところ、野生株で試作した納豆の粘度が２２ｃＰであったのに対し、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）で試作した納豆の粘度は２９ｃＰと増加していた。よって、ＮＡＦＭ５（ΔｃｗｌＯ）をＭＩＡ０６０５株と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素のポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下した、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株。
【請求項２】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素の遺伝子が欠損されている、請求項１に記載の納豆菌変異株。
【請求項３】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素の遺伝子の欠損が、該遺伝子の薬剤耐性遺伝子での置換によるものである、請求項２に記載の納豆菌変異株。
【請求項４】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素が、ＬｙｔＥタンパク質，ＬｙｔＦタンパク質，ＣｗｌＯタンパク質およびＣｗｌＳタンパク質の少なくとも１つからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の納豆菌変異株。
【請求項５】
ｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換されている、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株 ＭＩＡ０６０５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５２）。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とするポリ−γ−グルタミン酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項１】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素のポリ−γ−グルタミン酸分解活性が低下した、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株。
【請求項２】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素の遺伝子が欠損されている、請求項１に記載の納豆菌変異株。
【請求項３】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素の遺伝子の欠損が、該遺伝子の薬剤耐性遺伝子での置換によるものである、請求項２に記載の納豆菌変異株。
【請求項４】
Ｄ，Ｌ−エンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁溶解酵素が、ＬｙｔＥタンパク質，ＬｙｔＦタンパク質，ＣｗｌＯタンパク質およびＣｗｌＳタンパク質の少なくとも１つからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の納豆菌変異株。
【請求項５】
ｃｗｌＯ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で置換されている、ポリ−γ−グルタミン酸高生産性納豆菌変異株 ＭＩＡ０６０５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５２）。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とするポリ−γ−グルタミン酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２３４６３２（Ｐ２０１１−２３４６３２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０６３８９（Ｐ２０１０−１０６３８９）
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（０００１１６９４３）旭松食品株式会社 (22)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（０００１１６９４３）旭松食品株式会社 (22)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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