ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法
【課題】保存安定性の向上した、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法を提供する。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法である。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させうるポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法およびそれにより得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物に関する。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。
【０００３】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）もしくはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑である。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００６】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようなＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた方法が知られている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかし、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた場合、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと同様、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００９】
これに対して、より安価で簡便なグリセロールの定量方法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を用いる方法がある。この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１０】
【化３】
【００１１】
しかし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。このような安定性が低い酵素を用いた測定試薬では、保存中に酵素の失活が起こり測定対象物質の濃度を正確に定量することができないという問題があった。したがって、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となっている。
【００１２】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させる方法として、２価性架橋試薬により酵素を化学修飾する方法が知られている（特許文献１など）。
【００１３】
これに加えて、特許文献２には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として用いることにより保存安定性の向上した酵素組成物が得られることが開示されている。特許文献３には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、２価の金属イオンを有する化合物、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、界面活性剤とを安定化剤として使用することにより、安定なポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。また、特許文献４には、界面活性剤濃度を一定量以下とすることにより保存安定性を向上したポリオール脱水素酵素組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００６−２７１２５７号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８１４号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５５３３号公報
【特許文献４】特開２０１０−２３３５３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記特許文献１に記載の方法は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、かような酵素の化学修飾工程は煩雑であり、酵素の製造コストが増大するという問題がある。
【００１６】
また、特許文献２や特許文献３に記載の方法では、金属化合物や界面活性剤などの安定化剤を添加することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、特許文献２および特許文献３に記載の方法においても化学修飾された酵素を使用しており、化学修飾した酵素を用いた場合には酵素の安定性が向上するものの、化学修飾されていない酵素を使用する場合には依然として酵素の残存活性が低下するという問題があった。特許文献４に記載の酵素組成物では、化学修飾されていない酵素についても保存安定性の向上がみられているが、さらなる保存安定性の改善が求められている。
【００１７】
そこで本発明は、安価かつ簡便な方法で、さらに保存安定性が向上したポリオール脱水素酵素を提供できる、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法を提供することを目的とする。さらには、そのような方法により得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記問題点を解決するため、鋭意研究を積み重ねた結果、以下の製造方法により保存安定性が向上した、ポリオール脱水素酵素を提供できることを見出した。すなわち、本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法が提供される。
【００１９】
また、本発明の他の態様では、本発明の製造方法により得られたポリオール脱水素酵素を含む固形物が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ポリオール脱水素酵素を含む溶液中に含まれる界面活性剤である、ショ糖脂肪酸エステルの量を限外ろ過により効果的に低減することができる。それにより、経時的な酵素活性の低下を抑制・防止しうる、ポリオール脱水素酵素を含む固形物を得ることができる。本発明の方法は、限外ろ過による酵素（蛋白質）の濃縮と共に界面活性剤の低減ができるため、安価かつ簡便な方法である。特に、本発明の製造方法によれば、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止し、酵素の保存安定性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一態様によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法が提供される。
【００２２】
ポリオール脱水素酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定である。このため、溶液中におけるポリオール脱水素酵素の凝集を防ぎ、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上させる目的で、酵素の安定化剤として界面活性剤を使用することが知られていた。従来の酵素組成物においては、界面活性剤、例えばポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）］）による酵素の安定化効果が十分に得られるように、ポリオール脱水素酵素組成物中には高濃度の界面活性剤が含まれていた。
【００２３】
しかしながら、本発明者らは界面活性剤とポリオール脱水素酵素の安定性との関係を詳細に検討した結果、高濃度の界面活性剤がポリオール脱水素酵素の失活を招いていることを見出した。高濃度の界面活性剤による酵素の失活は、化学修飾されていないポリオール脱水素酵素の場合に顕著であった。また、このような界面活性剤によるポリオール脱水素酵素の失活は、界面活性剤を含んだポリオール脱水素酵素溶液を凍結乾燥した場合にも、経時的な変化として発生していることが分かった。
【００２４】
これに対して本発明では、界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルを使用する。ショ糖脂肪酸エステルを使用することにより、水溶液中のポリオール脱水素酵素を安定化させ得る高い濃度で界面活性剤が含有されていても、限外ろ過により酵素を濃縮する工程によって界面活性剤の濃度を低減できる。その結果、得られるポリオール脱水素酵素濃縮物中の酵素の失活を有意に抑制することができる。したがって、高コストな酵素の化学修飾工程を行わなくても、また、濃縮物を凍結乾燥した場合にも、保存安定性の向上したポリオール脱水素酵素が提供される。
【００２５】
最終的なポリオール脱水素酵素濃縮物中で界面活性剤の濃度が低減される理由は、以下のように考えられる。通常、ポリオール脱水素酵素を含む溶液は、精製を経ることにより、界面活性剤を含んだ比較的希薄な水溶液の形態で得られるため、濃縮工程が実施される。このような水溶液を濃縮する方法には数種あるが、本発明では限外ろ過法を実施する。通常は、このような水溶液中には、得られた酵素を可溶化し水溶液中で安定に存在させるため、臨界ミセル濃度以上の界面活性剤が含まれている。限外ろ過によってポリオール脱水素酵素の水溶液を濃縮する場合には、本発明で使用する界面活性剤のショ糖脂肪酸エステルは、例えば、従来界面活性剤としてポリオール脱水素酵素の製造に使用されていたポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と比較すると、ミセルの大きさが小さく、限外ろ過膜をより容易に透過する。したがって本発明では、限外ろ過を繰り返すことで酵素が濃縮されると共に界面活性剤が除去され、得られた濃縮物中の界面活性剤の量は非常に小さくなり得ると考えられる。一方、同様の条件で界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した場合には、ミセルが大きいために限外ろ過膜を通過しにくく、最終的な濃縮物中にも界面活性剤が残ってしまうと考えられる。本発明においては、限外ろ過の前に、酵素の水溶液を界面活性剤の臨界ミセル濃度未満に希釈するが、限外ろ過を行ううちに水溶液中に濃度むら等ができ、局所的に界面活性剤が濃縮されてミセルが形成されていると考えられる。そのため、上記のようなミセルサイズの相違が界面活性剤濃度の低減に影響すると推察される。しかしながら、このようなメカニズムは推測であり、本発明を限定するものではない。本発明においては、ポリオール脱水素酵素の水溶液の濃縮と共に、溶解している界面活性剤のショ糖脂肪酸エステルを限外ろ過によって除くことができ、最終的には、ポリオール脱水素酵素とミセルを構成している以外の界面活性剤をほとんど除くことができていると推測される。本発明者らの実験によれば、臨界ミセル濃度未満のショ糖脂肪酸エステルを含むポリオール脱水素酵素の溶液は、限外ろ過によって検出限界以下の量にまで低減することが可能であることが分かった。
【００２６】
本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法の主要な特徴は、上記のように界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルを使用し、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度以上であるポリオール脱水素酵素を含む溶液を、臨界ミセル濃度未満に希釈し、次いで限外ろ過することにより濃縮する工程にある。したがって、それ以外の工程については特に制限はなく、従来公知の工程を適宜適用できる。以下、本発明の第一工程、第二工程および第三工程を含む好ましい実施形態を詳細に説明する。
【００２７】
＜ポリオール脱水素酵素の生成工程＞
本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法の好ましい実施形態では、始めに、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を有する細胞（特には、細胞膜）から、界面活性剤を含む溶液を用いて、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化することによって、可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび界面活性剤を含む溶液を得る。
【００２８】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。かかる菌は、いずれの菌も好ましく使用することができるが、これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができ、ポリオール脱水素酵素の生産量および精製のしやすさの観点で、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を好ましく使用することができる。
【００２９】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法と同様にしてもしくは当業者に周知の方法を適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）が使用され、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が好ましく使用される。
【００３０】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生する細菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、かかる細菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出して得る方法が挙げられる。以下、具体的に説明する。
【００３１】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生する細菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含むものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、コーンスティーブリカー、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、尿素、ペプトン類（ポリペプトン）、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム（２水和物）、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。なお、かかる培地は、１００〜１４０℃程度で１０分〜６０分、オートクレーブ処理を行うことが好ましい。
【００３２】
培養は、振とう培養（例えば、１２０〜１６０ｍｉｎ−１）あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２２〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９の範囲、好ましくは５〜８である。ｐＨの調製は、例えば塩酸などで行えばよい。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。かかる培養は、２度〜５度繰り返して行ってもよい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３３】
次いで、培養により得られた液を遠心分離（５００〜２０，０００×ｇ、５〜３０分、０〜１０℃）で集菌する。具体的には、集菌されたものを緩衝剤に懸濁して、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。典型的には、フレンチプレス法、超音波破砕法を用い、菌体を破砕する。続いて、得られた破砕液をさらに遠心分離（５００〜２０，０００×ｇ、５〜３０分、０〜１０℃）する。得られた上清を超遠心分離（２００００を超えて１００００００×ｇ、３０〜１２０分、０〜１０℃）をすることによって、膜画分を沈殿物として得ることができる。
【００３４】
かかる膜画分の沈殿物から、界面活性剤を含む溶液を用いて、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する。まず、膜画分の沈殿物を、緩衝剤（例えば、濃度２〜２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）で懸濁する。次に終濃度が０．１〜５ｇ／１００ｍＬ程度になるように、界面活性剤を加えて、界面活性剤を含む溶液を調製し、一定条件下（例えば、０〜１０℃で、１０分〜４８時間）で攪拌を行うことによって、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化し、可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび界面活性剤を含む溶液を得る。この溶液中では、酵素を界面活性剤が内包するミセルのような状態となっていることが好ましい。すなわち、この段階では、酵素を可溶化するために、酵素を含む水溶液は臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含んでいる。
【００３５】
可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび界面活性剤を含む溶液は、超遠心分離を施すことが好ましい。かかる超遠心分離の条件にも特に制限はないが、例えば、２００００を超えて１００００００×ｇ、３０〜１２０分、０〜１０℃で行う。
【００３６】
（界面活性剤）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する界面活性剤としては、使用するポリオール脱水素酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されない。例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することができ、後述する本発明で使用するショ糖脂肪酸エステルをこの段階から使用してもよい。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくはポリオール脱水素酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
【００３７】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、ポリオール脱水素酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
【００３８】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ８０）などが好ましい。
【００３９】
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。
【００４０】
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい
上記のうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する界面活性剤としては、工業的な観点からしても酵素の可溶化に適しているという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ショ糖脂肪酸エステルなどが好適である。特に、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）は、細胞膜から抽出されたＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化させ、それを抽出するために、工業的な観点からしても好適である。
【００４１】
（ショ糖脂肪酸エステル）
上記した界面活性剤に代えて、本発明ではショ糖脂肪酸エステルを界面活性剤として使用してもよい。ショ糖脂肪酸エステルとしては、特に制限はないが、本発明の保存安定性向上の目的を効果的に達成するとの観点から、ＨＬＢ値が、好ましくは８〜２０であり、より好ましくは９〜１９であり、さらに好ましくは１０〜１８であり、特に好ましくは１１〜１８である。なお、本明細書においては、ＨＬＢ値は、グリフィン法によって算出された値を意味する。
【００４２】
また、ショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸の炭素数も特には制限ないが、５〜３０であると好ましく、好ましくは７〜２５であり、より好ましくは８〜２２であり、さらに好ましくは１０〜２０である。アルキル基の炭素数がいくつであっても、ＨＬＢ値が８〜２０となるように選択することが好ましい。
【００４３】
また、かかるショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸としても特に制限はないが、市販品を購入する場合の入手性を考慮すると、ベヘニン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、エルカ酸およびオレイン酸からなる群から選択されると好ましい。この場合も、ＨＬＢ値が８〜２０となるように選択することが好ましい。
【００４４】
これらのショ糖脂肪酸エステルは、従来公知の方法を適宜参照し、あるいは組み合わせて合成して準備することができる。また、市販品を購入して準備してもよい。市販品としては、三菱化学フーズ株式会社のサーフホープＳＥ ＰＨＡＲＭＡ（登録商標）のショ糖ベヘニン酸エステル（Ｊ−２２０３、Ｊ−２２０３）、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｊ−１８０１、Ｊ−１８０２、Ｊ−１８０３Ｆ、Ｊ−１８０５、Ｊ−１８０７、Ｊ−１８０９、Ｊ−１８１１、Ｊ−１８１１Ｆ、Ｊ−１８１５、Ｊ−１８１６）、ショ糖パルミチン酸エステル（Ｊ−１６１５、Ｊ−１６１６）、ショ糖ミリスチン酸エステル（Ｊ−１４１６）、ショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２０１、Ｊ−１２０５、Ｊ−１２１６）、ショ糖エルカ酸エステル（Ｊ−２１０１、Ｊ−２１０２）、ショ糖オレイン酸エステル（Ｊ−１７０１、Ｊ−１７１５）などが例示できる。
【００４５】
中でも、ＨＬＢ値が８〜２０であり、本発明の保存安定性向上の目的を効果的に達成するとの観点から、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｊ−１８１１（ＨＬＢ値１１）、Ｊ−１８１１Ｆ（ＨＬＢ値１１）、Ｊ−１８１５（ＨＬＢ値１５）、Ｊ−１８１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖パルミチン酸エステル（Ｊ−１６１５（ＨＬＢ値１５）、Ｊ−１６１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖ミリスチン酸エステル（Ｊ−１４１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖オレイン酸エステル（Ｊ−１７１５（ＨＬＢ値１５））などが好ましく、特にショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２１６（ＨＬＢ値１６））が好ましい。
【００４６】
＜精製工程＞
上記のように抽出した、可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨは、精製工程を経ることが好ましい。しかしながら、上記のように抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨに、ショ糖脂肪酸エステルを含有させて、後述する限外ろ過による濃縮工程を実施してもよいし、これらの精製する工程の途中で、ショ糖脂肪酸エステルを用いてＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製し、限外ろ過による濃縮する工程を実施してもよい。
【００４７】
上記で得られた可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００４８】
好ましくは、精製工程ではカラムクロマトグラフィを使用する。すなわち、前記可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液をカラムにアプライした後、前記ショ糖脂肪酸エステルを含む溶離液を送液することによって、可溶化時に使用した遊離している界面活性剤を除去することが好ましい。
【００４９】
本発明で用いられるクロマトグラフィとしては、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト、アフィニティークロマトグラフィなどが好適である。
【００５０】
イオン交換クロマトグラフィとしては、界面活性剤の種類に応じて適宜選択することができ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィなどがあるが、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィである。
【００５１】
クロマトグラフィに用いられるカラムにも特に制限はないが、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ（例えば、ＧＥヘルスケア製のものが好適である）などが好適である。
【００５２】
前記可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液をカラムにアプライする前に、カラムの平衡化を行っておくことが好ましい。カラムの平衡化を行うための溶液は、緩衝剤（例えば、濃度５〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）と、０．００５〜１ｇ／１００ｍＬ、より好ましくは０．０２〜１ｇ／１００ｍＬの前記ショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液であることが好ましい。ショ糖脂肪酸エステルは、上記説明したものを使用することができる。また、かかる溶液には、濃度１〜２０ｍＭの２価の金属イオン（例えば、硫酸マグネシウム）をさらに添加してもよい。２価の金属イオンは、本工程で添加せずに、他の工程で必要に応じ添加してもよい。
【００５３】
前記可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液を上記カラムにアプライし、カラムの平衡化を行った溶液を、カラムの体積の、好ましくは２倍〜３０倍、より好ましくは３倍〜２０倍の量を送液することによって、少なくとも遊離している、可溶化する際に用いた界面活性剤を除去することができる。このように遊離している界面活性剤が除去されることにより、最終的に得られる酵素の保存安定性が向上する。
【００５４】
なお、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する際に、界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルを用いた場合は、上記した精製工程を経ずに、限外ろ過によって濃縮する工程に進んでもよい。精製工程は、従来酵素の可溶化のために使用されていた界面活性剤（特に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００））の過剰分（つまり、遊離している界面活性剤）を除去することであるため、かかる界面活性剤を使用していなければ、精製工程は不要となる。
【００５５】
次に、前記カラムからＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液を溶出することによって、ポリオール脱水素酵素画分を得る。このように酵素が溶出された溶出液も、臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含んでいる。溶出の方法にも特に制限されないが、グラジエント法、ステップワイズ法などが挙げられる。
【００５６】
例えば、カラムとして陰イオン交換体（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ）を用い、グラジエント法を採用する場合は、開始緩衝液として、０．００５〜１ｇ／１００ｍＬ、より好ましくは０．０２〜１ｇ／１００ｍＬの前記ショ糖脂肪酸エステルを含む１〜１００ｍＭ緩衝液（ｐＨ７〜１２）が使用できる。溶出緩衝液は、開始緩衝液にさらに、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２等）を含む。塩の濃度は、用いる塩にもよるが、０．０５〜２Ｍがよい。なお、前記開始もしくは溶出緩衝液には、必要に応じて０．０１〜２０ｍＭの２価の金属イオン（ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２）や還元剤（２−メルカプトエタノールやジチオスレイトール）を加えてもよい。グラジエント溶出は、カラム体積の１〜５０倍量で行うことが好ましい。
【００５７】
本発明で使用し得る緩衝液は、ｐＨが７〜１２のものであれば特に制限はないが、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。このうち、ｐＨを酵素に好適な範囲に調節することができ、酵素の保存安定性を向上に寄与することから、特にグリシルグリシンが好ましい。
【００５８】
上記のように精製したポリオール脱水素酵素を含む溶液は、溶出の際に使用した塩を含んでいるため、脱塩処理を行ってもよい。脱塩処理の方法としては特に制限はないが、透析、限外ろ過、脱塩カラムを使用する方法などが挙げられる。典型的には、透析を行うことができる。例えば、透析は、上記のように得られた精製したポリオール脱水素酵素を含む溶液を、緩衝剤で、一晩透析する。緩衝剤は、０．１〜１ｇ／１００ｍＬ程度界面活性剤を含んでいてもよい。より具体的には、緩衝剤としては、濃度２〜１００ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液（ｐＨ７〜９．５）および濃度０．００５〜１ｇ／１００ｍＬの界面活性剤（ｐＨ７〜９．５）を含む液を好ましく用いることができる。
【００５９】
＜第一工程＞
本発明の製造方法では、第一工程として、上記のように得られたポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含む水溶液を、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満になるように希釈する。
【００６０】
上記のようにポリオール脱水素酵素の水溶液を得る工程後および得られたポリオール脱水素酵素の精製工程後の溶液には、ポリオール脱水素酵素を溶解させておくために、臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含んでいる。そこで、得られたポリオール脱水素酵素を含む水溶液を、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満に希釈することにより、後述する限外ろ過によって、酵素を濃縮すると共に効果的に界面活性剤濃度を低減できる。臨界ミセル濃度以上の界面活性剤の濃度の上限値は、特に制限はないが、酵素を可溶化させるために十分な濃度があればよく、使用する界面活性剤にもよるが、５ｇ／１００ｍＬ程度である。
【００６１】
また、例えば上記の精製工程によって得られる、希釈を行うポリオール脱水素酵素を含む水溶液中の蛋白濃度は、０．０１〜３０ｍｇ／ｍＬとなっていることが好ましく、より好ましくは０．０５〜２５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍＬである。また、希釈を行うポリオール脱水素酵素を含む水溶液中の酵素の比活性は、０．１〜１００Ｕ／ｍｇとなっていることが好ましく、より好ましくは０．５〜７５Ｕ／ｍｇであり、さらに好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｇである。
【００６２】
臨界ミセル濃度は、本発明においては、界面活性剤のみの水溶液について得られる値を使用する。したがって、臨界ミセル濃度はショ糖脂肪酸エステルの種類によって異なるが、通常、本発明の技術分野においては公知の値である。例えば、臨界ミセル濃度は、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４７（２），３１９〜３２６， １９８３に記載の方法で測定することができ、ショ糖ラウリン酸エステルは０．４ｍＭ（０．０２１％ｗ／ｖ）であることが知られている。ポリオール脱水素酵素を含む水溶液中の臨界ミセル濃度は、上記のように界面活性剤以外にも酵素や緩衝剤などの物質が含まれているため、厳密には界面活性剤のみの水溶液について得られる値とは異なると思われるが、本発明では、最終的に得られる酵素の保存安定性向上という本発明の効果を実現できるという点から、界面活性剤のみの水溶液について知られている臨界ミセル濃度を採用して何ら差し支えない。また、希釈によって臨界ミセル濃度未満となる界面活性剤の濃度の下限値は、特に制限はないが、０．００１％ｗ／ｖ（０．００１ｇ／１００ｍＬ）以上が好ましい。
【００６３】
ショ糖脂肪酸エステルを臨界ミセル濃度未満に希釈する方法は、特に制限はないが、緩衝液を添加し混合する方法が好ましい。この他、限外ろ過法、各種クロマトグラフィ法、界面活性剤を吸着する樹脂等を使用することができる。
【００６４】
第一工程で使用できる緩衝剤は、ｐＨが７〜１２のものであれば特に制限はないが、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。このうち、ｐＨを酵素に好適な範囲に調節することができ、酵素の保存安定性を向上に寄与することから、特にグリシルグリシンが好ましい。
【００６５】
具体的な緩衝液としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液やグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。これらの中でも、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液またはグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液のようなグリシルグリシン緩衝液が好ましい。また、上記緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは０．５〜５００ｍＭ、より好ましくは０．７５〜４００ｍＭ、最も好ましくは１〜３００ｍＭである。なお、本発明において緩衝液の濃度とは、緩衝液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。また、上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは４．０〜１１．０、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。このような緩衝液を、ポリオール脱水素酵素を含む溶液に、例えば、１０〜５００ｍＬ添加することができる。
【００６６】
＜第二工程＞
本発明の製造方法においては、前記希釈したポリオール脱水素酵素を含む溶液（希釈液）を、限外ろ過することによって、濃縮物を得る第二工程を実施する。
【００６７】
上記の希釈した溶液には、界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルが含まれている。本発明の方法では、この界面活性剤を限界ろ過によって効果的に取り除くことができるため、最終的に得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物の保存安定性が大きく向上する。例えば、従来使用されていた界面活性剤のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の場合には、臨界ミセル濃度未満にした溶液から、限外ろ過のみによっては十分に界面活性剤を除くことができず、酵素とともに濃縮されて残存していた。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を全血を試料とする測定試薬に用いた場合には、従来は残存する界面活性剤によって溶血が起きる場合があったが、本発明の方法によれば、限外ろ過によってショ糖脂肪酸エステルをできるだけ除くことにより、溶血を防止することもできる。
【００６８】
その上、濃縮することにより、溶液中の酵素濃度が濃くなるため、酵素の失活が抑えられる場合がある。また、濃縮することにより、その後の工程において、液量が減少するため小スケールで処理することができる。また、限外ろ過は、酵素の失活が少なく、且つ簡便であるという利点がある。
【００６９】
限外ろ過の方法には特に制限はないが、前記脱塩したポリオール脱水素酵素溶液をそのまま、あるいは、緩衝剤（例えば、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液ｐＨ７〜９．５程度）を加えた後、従来公知の方法によって行って、濃縮液を得る。限外ろ過の回数にも特に制限はないが、好ましくは１〜１５回、より好ましくは２〜１０回、さらに好ましくは２〜６回である。なお、かかる工程を経ることによって、本発明のポリオール脱水素酵素組成物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として（対蛋白量あたり）、ショ糖脂肪酸エステルが、１０質量％以下となることが好ましい。１０質量％以下であることによって、得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物の保存安定性を確実に向上することができる。また、下限としては、特に制限はないが、０．１質量％以上が好ましい。０．１質量％以上とすることによって、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを保護しつつ、酵素の保存安定性を向上することができる。上記のようにして、本発明の方法によりポリオール脱水素酵素を含む濃縮物が得られる。
【００７０】
限外ろ過膜の分画分子量は、酵素のロスがなく、ショ糖脂肪酸エステルが効率よく減量できるとの観点から、好ましくは１０,０００〜６０，０００であり、より好ましくは２０，０００〜５５，０００であり、さらに好ましくは２５，０００〜５０，０００である。１０，０００未満では濃縮速度が遅すぎる場合があり、６０，０００より大きいと、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが限外ろ過膜を通過してしまい、酵素の回収率が低下する場合があるためである。限外ろ過後に最終的に得られる濃縮物の蛋白濃度（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ濃度）は、０．１〜１５０ｍｇ／ｍＬとなるようにすることが好ましく、より好ましくは０．３〜１２５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｍＬである。
【００７１】
また、得られたポリオール脱水素酵素を含む濃縮物には、緩衝剤をさらに添加してもよい。緩衝剤を添加することにより、ｐＨを酵素に好適な範囲に調節することができ、酵素の保存安定性をより向上させることができる。緩衝剤としては、上記した緩衝剤と同様のものが使用できる。上記した中でも、低濃度でＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる点で、グリシルグリシンが好ましい。グリシルグリシンはアミノ酸系緩衝剤の一種であるが、グリシンなどの他のアミノ酸系緩衝剤やＭＯＰＳなどの他のよく知られている緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素の残存活性を向上させることができる。
【００７２】
添加する緩衝剤の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性をより向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは２〜２５０質量％、より好ましくは３〜２００質量％である。さらに好ましくは５〜１５０質量％である。上記の範囲であれば、保存安定性をより向上できる。
【００７３】
緩衝剤を添加する方法は特に制限されず、緩衝剤をそのまま添加してもよいが、緩衝剤を予め水に溶解させた緩衝液の形態で添加することが好ましい。緩衝液としても、上記と同様のものが使用できる。なお、添加された緩衝液は後述する凍結乾燥の処理により緩衝液中の水分が除去され、かような場合には緩衝剤として固形物中に存在する。
【００７４】
また、得られたポリオール脱水素酵素の濃縮物には、酸またはアルカリなどのｐＨ調整剤を含むことができる。これにより、ポリオール脱水素酵素濃縮物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。かようなｐＨ調整剤としては、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが挙げられる。ｐＨ調整剤の含有量は特に制限されず、所望のｐＨが実現される量を用いればよい。
【００７５】
また、ポリオール脱水素酵素組濃縮物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などの付加成分を所望に応じて含有することができる。
【００７６】
＜第三工程＞
上記のように、限外ろ過により濃縮する工程後に得られた液体形態のポリオール脱水素酵素濃縮物を、第三工程として凍結乾燥し、ポリオール脱水素酵素を含む固形物が得られる。凍結乾燥することにより、本発明により得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物の形態は特に制限されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体形態であり得る。中でも、本発明の効果が顕著に発揮されることから、粉末の形態であることが好ましい。
【００７７】
凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。典型的には、−１０〜−８０℃で濃縮物を凍結し、凍結物を６．１２ｈＰａ以下の真空状態にし、水分を昇華させる。この工程により、ポリオール脱水素酵素を含む粉末が得られる。本発明により得られた凍結乾燥されたポリオール脱水素酵素を含む固形物は、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活が抑制されるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が有意に向上する。
【００７８】
したがって、本発明の他の一態様では、ポリオール脱水素酵素を含む固形物が提供される。
【００７９】
また、本発明の方法により得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、化学修飾しなくても、保存安定性が有意に向上した酵素となる。そのため、上記の方法で得られる酵素を特に化学修飾せず使用できる。もちろん化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨとして使用してもよく、その場合には、上記の方法で得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特許文献１に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾すればよい。
【００８０】
（ポリオール脱水素酵素組成物を使用した測定試薬およびポリオールの定量方法）
上記のようにして得られた本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物を使用して、ポリオール測定試薬を提供することもできる。また、本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物をポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法を提供することもできる。本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量に優れるため、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは補欠分子族としてＰＱＱを有するため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００８１】
本発明において「ポリオール」とは、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）を意味する。本発明の製造方法を適用し得るＰＱＱ依存性ＰＤＨは、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とする。
【００８２】
ポリオール測定試薬は、ポリオールを定量するための試薬であり、本発明によって得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む粉末を使用する。ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。したがって、還元型電子受容体による電流を測定することにより、ポリオールを定量できる。本発明により得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェナジニウムメチルサルフェートおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げられる。例えば、特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として、本発明の酵素濃縮物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００８３】
本発明の定量方法に用いられるポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿または全血などが挙げられる。また、本発明の酵素濃縮物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清、血漿、または全血などの中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、グリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことにより、真の中性脂肪値を求めることが可能となる。なお、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００８４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００８５】
（酵素活性）
５０μＭ ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、０．２ｍＭ ＰＭＳ（５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、および４５０ｍＭグリセロールを含んだ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
【００８６】
［調製例１：ポリオール脱水素酵素を含む可溶化膜画分の調製例］
ソルビトール１．５ｇ／１００ｍＬ、グルコン酸ナトリウム０．５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン１ｇ／１００ｍＬ、尿素０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、塩酸でｐＨを５．５に調整した培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００８７】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００８８】
次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。
【００８９】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００９０】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が０．５ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００９１】
［実施例１〜３ ポリオール脱水素酵素の調製例］
得られた可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＥヘルスケア製）にて精製した。カラムはＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬ（ＧＥヘルスケア製）を使用した。カラムの平衡化は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８ ＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社）） ＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４で行った。ここで、ショ糖ラウリン酸エステルの濃度０．０５％は、０．０５ｇ／１００ｍＬを意味する。
【００９２】
可溶化膜画分をアプライ後、非吸着画分（つまり、蛋白と結合していない遊離している可溶化に用いた界面活性剤および非吸着の蛋白）を、カラムの平衡化に用いた溶液にてカラム体積の１０倍量で洗浄した。溶出緩衝液（溶離液）には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社））＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４＋０．４Ｍ ＮａＣｌを用い、カラム体積の１０倍量でグラジエント溶出を行った。ポリオール脱水素酵素活性画分は、０．２Ｍ ＮａＣｌ前後で溶出した。可溶化膜画分からの回収率は、８５％であった。得られたポリオール脱水素酵素活性画分を１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）およびｐＨ８＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社）で一晩透析することにより、蛋白濃度２ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。
【００９３】
得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度２ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白）について、ショ糖ラウリン酸エステルを、このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液２０ｍＬに１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬを加え、ショ糖ラウリン酸エステルの臨界ミセル濃度未満となる０．００４５％に希釈後、限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。濃縮後、さらに、２００ｍＬの１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、濃縮するという作業を、下記表に記載の回数繰り返した。最後の回の濃縮においては、濃縮後、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。調整後、−８０℃にて凍結させた。凍結後、凍結乾燥を行い、粉末状の酵素固形物を得た。酵素固形物重量あたりの酵素活性は、１０Ｕ／ｍｇ・粉末であった。
【００９４】
上記のようにして得られた粉末状の酵素固形物を、３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素固形物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素固形物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００９５】
［比較例１〜３ ポリオール脱水素酵素の調製例（従来法；界面活性剤にＴｒｉｔｏｎＸ−１００使用）］
得られた可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＥヘルスケア製）にて精製した。カラムはＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬ（ＧＥヘルスケア製）を使用した。カラムの平衡化は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．１％ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）(ＴｒｉｔｏｎＸ−１００)＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４で行った。可溶化膜画分をアプライ後、非吸着画分を前記緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４）にてカラム体積の１０倍量で洗浄した。溶出緩衝液（溶離液）には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４＋０．２Ｍ ＮａＣｌを用い、カラム体積の１０倍量でグラジエント溶出を行った。ポリオール脱水素酵素活性画分は、０．１Ｍ ＮａＣｌ前後で溶出した。可溶化膜画分からの回収率は６２％であった。得られたポリオール脱水素酵素活性画分を１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。
【００９６】
得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白）について、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（臨界ミセル濃度：０．０２ｗ／ｖ％）を、ＰＤＨ溶液２０ｍＬに１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬを加え、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の臨界ミセル濃度未満となる０．００９％に希釈後、限外ろ過（分画分子量：５０，０００）した。濃縮後、さらに、２００ｍＬの１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、濃縮するという作業を下記表に示す回数繰り返した。濃縮後、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。調整後、−８０℃にて凍結させた。凍結後、凍結乾燥を行い、粉末状の酵素組成物を得た。酵素組成物重量あたりの酵素活性は、１０Ｕ／ｍｇ・粉末であった。
【００９７】
上記のようにして得られた粉末状の酵素組成物を、３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００９８】
【表１】
【００９９】
上記表１に示される結果から、比較例の従来使用されているポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に比べて、少ない限外ろ過回数で本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、残存活性すなわち保存安定性が優れていることが分かる。本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、限外ろ過を２回程度行えば十分な残存活性が得られるが、比較例のＴｒｉｔｏｎＸ−１００では、同程度の残存活性を得ようとすると６回以上の限外ろ過が必要であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能である。そのため、本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物は、正確にポリオールを定量することにおいて好適に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させうるポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法およびそれにより得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物に関する。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。
【０００３】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）もしくはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑である。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００６】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようなＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた方法が知られている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかし、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた場合、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと同様、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００９】
これに対して、より安価で簡便なグリセロールの定量方法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を用いる方法がある。この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１０】
【化３】
【００１１】
しかし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。このような安定性が低い酵素を用いた測定試薬では、保存中に酵素の失活が起こり測定対象物質の濃度を正確に定量することができないという問題があった。したがって、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となっている。
【００１２】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させる方法として、２価性架橋試薬により酵素を化学修飾する方法が知られている（特許文献１など）。
【００１３】
これに加えて、特許文献２には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として用いることにより保存安定性の向上した酵素組成物が得られることが開示されている。特許文献３には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、２価の金属イオンを有する化合物、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、界面活性剤とを安定化剤として使用することにより、安定なポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。また、特許文献４には、界面活性剤濃度を一定量以下とすることにより保存安定性を向上したポリオール脱水素酵素組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００６−２７１２５７号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８１４号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５５３３号公報
【特許文献４】特開２０１０−２３３５３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記特許文献１に記載の方法は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、かような酵素の化学修飾工程は煩雑であり、酵素の製造コストが増大するという問題がある。
【００１６】
また、特許文献２や特許文献３に記載の方法では、金属化合物や界面活性剤などの安定化剤を添加することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、特許文献２および特許文献３に記載の方法においても化学修飾された酵素を使用しており、化学修飾した酵素を用いた場合には酵素の安定性が向上するものの、化学修飾されていない酵素を使用する場合には依然として酵素の残存活性が低下するという問題があった。特許文献４に記載の酵素組成物では、化学修飾されていない酵素についても保存安定性の向上がみられているが、さらなる保存安定性の改善が求められている。
【００１７】
そこで本発明は、安価かつ簡便な方法で、さらに保存安定性が向上したポリオール脱水素酵素を提供できる、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法を提供することを目的とする。さらには、そのような方法により得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記問題点を解決するため、鋭意研究を積み重ねた結果、以下の製造方法により保存安定性が向上した、ポリオール脱水素酵素を提供できることを見出した。すなわち、本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法が提供される。
【００１９】
また、本発明の他の態様では、本発明の製造方法により得られたポリオール脱水素酵素を含む固形物が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ポリオール脱水素酵素を含む溶液中に含まれる界面活性剤である、ショ糖脂肪酸エステルの量を限外ろ過により効果的に低減することができる。それにより、経時的な酵素活性の低下を抑制・防止しうる、ポリオール脱水素酵素を含む固形物を得ることができる。本発明の方法は、限外ろ過による酵素（蛋白質）の濃縮と共に界面活性剤の低減ができるため、安価かつ簡便な方法である。特に、本発明の製造方法によれば、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止し、酵素の保存安定性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一態様によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法が提供される。
【００２２】
ポリオール脱水素酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定である。このため、溶液中におけるポリオール脱水素酵素の凝集を防ぎ、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上させる目的で、酵素の安定化剤として界面活性剤を使用することが知られていた。従来の酵素組成物においては、界面活性剤、例えばポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）］）による酵素の安定化効果が十分に得られるように、ポリオール脱水素酵素組成物中には高濃度の界面活性剤が含まれていた。
【００２３】
しかしながら、本発明者らは界面活性剤とポリオール脱水素酵素の安定性との関係を詳細に検討した結果、高濃度の界面活性剤がポリオール脱水素酵素の失活を招いていることを見出した。高濃度の界面活性剤による酵素の失活は、化学修飾されていないポリオール脱水素酵素の場合に顕著であった。また、このような界面活性剤によるポリオール脱水素酵素の失活は、界面活性剤を含んだポリオール脱水素酵素溶液を凍結乾燥した場合にも、経時的な変化として発生していることが分かった。
【００２４】
これに対して本発明では、界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルを使用する。ショ糖脂肪酸エステルを使用することにより、水溶液中のポリオール脱水素酵素を安定化させ得る高い濃度で界面活性剤が含有されていても、限外ろ過により酵素を濃縮する工程によって界面活性剤の濃度を低減できる。その結果、得られるポリオール脱水素酵素濃縮物中の酵素の失活を有意に抑制することができる。したがって、高コストな酵素の化学修飾工程を行わなくても、また、濃縮物を凍結乾燥した場合にも、保存安定性の向上したポリオール脱水素酵素が提供される。
【００２５】
最終的なポリオール脱水素酵素濃縮物中で界面活性剤の濃度が低減される理由は、以下のように考えられる。通常、ポリオール脱水素酵素を含む溶液は、精製を経ることにより、界面活性剤を含んだ比較的希薄な水溶液の形態で得られるため、濃縮工程が実施される。このような水溶液を濃縮する方法には数種あるが、本発明では限外ろ過法を実施する。通常は、このような水溶液中には、得られた酵素を可溶化し水溶液中で安定に存在させるため、臨界ミセル濃度以上の界面活性剤が含まれている。限外ろ過によってポリオール脱水素酵素の水溶液を濃縮する場合には、本発明で使用する界面活性剤のショ糖脂肪酸エステルは、例えば、従来界面活性剤としてポリオール脱水素酵素の製造に使用されていたポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と比較すると、ミセルの大きさが小さく、限外ろ過膜をより容易に透過する。したがって本発明では、限外ろ過を繰り返すことで酵素が濃縮されると共に界面活性剤が除去され、得られた濃縮物中の界面活性剤の量は非常に小さくなり得ると考えられる。一方、同様の条件で界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した場合には、ミセルが大きいために限外ろ過膜を通過しにくく、最終的な濃縮物中にも界面活性剤が残ってしまうと考えられる。本発明においては、限外ろ過の前に、酵素の水溶液を界面活性剤の臨界ミセル濃度未満に希釈するが、限外ろ過を行ううちに水溶液中に濃度むら等ができ、局所的に界面活性剤が濃縮されてミセルが形成されていると考えられる。そのため、上記のようなミセルサイズの相違が界面活性剤濃度の低減に影響すると推察される。しかしながら、このようなメカニズムは推測であり、本発明を限定するものではない。本発明においては、ポリオール脱水素酵素の水溶液の濃縮と共に、溶解している界面活性剤のショ糖脂肪酸エステルを限外ろ過によって除くことができ、最終的には、ポリオール脱水素酵素とミセルを構成している以外の界面活性剤をほとんど除くことができていると推測される。本発明者らの実験によれば、臨界ミセル濃度未満のショ糖脂肪酸エステルを含むポリオール脱水素酵素の溶液は、限外ろ過によって検出限界以下の量にまで低減することが可能であることが分かった。
【００２６】
本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法の主要な特徴は、上記のように界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルを使用し、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度以上であるポリオール脱水素酵素を含む溶液を、臨界ミセル濃度未満に希釈し、次いで限外ろ過することにより濃縮する工程にある。したがって、それ以外の工程については特に制限はなく、従来公知の工程を適宜適用できる。以下、本発明の第一工程、第二工程および第三工程を含む好ましい実施形態を詳細に説明する。
【００２７】
＜ポリオール脱水素酵素の生成工程＞
本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法の好ましい実施形態では、始めに、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を有する細胞（特には、細胞膜）から、界面活性剤を含む溶液を用いて、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化することによって、可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび界面活性剤を含む溶液を得る。
【００２８】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。かかる菌は、いずれの菌も好ましく使用することができるが、これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができ、ポリオール脱水素酵素の生産量および精製のしやすさの観点で、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を好ましく使用することができる。
【００２９】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法と同様にしてもしくは当業者に周知の方法を適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）が使用され、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が好ましく使用される。
【００３０】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生する細菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、かかる細菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出して得る方法が挙げられる。以下、具体的に説明する。
【００３１】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生する細菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含むものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、コーンスティーブリカー、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、尿素、ペプトン類（ポリペプトン）、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム（２水和物）、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。なお、かかる培地は、１００〜１４０℃程度で１０分〜６０分、オートクレーブ処理を行うことが好ましい。
【００３２】
培養は、振とう培養（例えば、１２０〜１６０ｍｉｎ−１）あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２２〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９の範囲、好ましくは５〜８である。ｐＨの調製は、例えば塩酸などで行えばよい。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。かかる培養は、２度〜５度繰り返して行ってもよい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３３】
次いで、培養により得られた液を遠心分離（５００〜２０，０００×ｇ、５〜３０分、０〜１０℃）で集菌する。具体的には、集菌されたものを緩衝剤に懸濁して、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。典型的には、フレンチプレス法、超音波破砕法を用い、菌体を破砕する。続いて、得られた破砕液をさらに遠心分離（５００〜２０，０００×ｇ、５〜３０分、０〜１０℃）する。得られた上清を超遠心分離（２００００を超えて１００００００×ｇ、３０〜１２０分、０〜１０℃）をすることによって、膜画分を沈殿物として得ることができる。
【００３４】
かかる膜画分の沈殿物から、界面活性剤を含む溶液を用いて、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する。まず、膜画分の沈殿物を、緩衝剤（例えば、濃度２〜２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）で懸濁する。次に終濃度が０．１〜５ｇ／１００ｍＬ程度になるように、界面活性剤を加えて、界面活性剤を含む溶液を調製し、一定条件下（例えば、０〜１０℃で、１０分〜４８時間）で攪拌を行うことによって、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化し、可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび界面活性剤を含む溶液を得る。この溶液中では、酵素を界面活性剤が内包するミセルのような状態となっていることが好ましい。すなわち、この段階では、酵素を可溶化するために、酵素を含む水溶液は臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含んでいる。
【００３５】
可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび界面活性剤を含む溶液は、超遠心分離を施すことが好ましい。かかる超遠心分離の条件にも特に制限はないが、例えば、２００００を超えて１００００００×ｇ、３０〜１２０分、０〜１０℃で行う。
【００３６】
（界面活性剤）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する界面活性剤としては、使用するポリオール脱水素酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されない。例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することができ、後述する本発明で使用するショ糖脂肪酸エステルをこの段階から使用してもよい。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくはポリオール脱水素酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
【００３７】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、ポリオール脱水素酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
【００３８】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ ８０）などが好ましい。
【００３９】
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。
【００４０】
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい
上記のうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する界面活性剤としては、工業的な観点からしても酵素の可溶化に適しているという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ショ糖脂肪酸エステルなどが好適である。特に、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）は、細胞膜から抽出されたＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化させ、それを抽出するために、工業的な観点からしても好適である。
【００４１】
（ショ糖脂肪酸エステル）
上記した界面活性剤に代えて、本発明ではショ糖脂肪酸エステルを界面活性剤として使用してもよい。ショ糖脂肪酸エステルとしては、特に制限はないが、本発明の保存安定性向上の目的を効果的に達成するとの観点から、ＨＬＢ値が、好ましくは８〜２０であり、より好ましくは９〜１９であり、さらに好ましくは１０〜１８であり、特に好ましくは１１〜１８である。なお、本明細書においては、ＨＬＢ値は、グリフィン法によって算出された値を意味する。
【００４２】
また、ショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸の炭素数も特には制限ないが、５〜３０であると好ましく、好ましくは７〜２５であり、より好ましくは８〜２２であり、さらに好ましくは１０〜２０である。アルキル基の炭素数がいくつであっても、ＨＬＢ値が８〜２０となるように選択することが好ましい。
【００４３】
また、かかるショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸としても特に制限はないが、市販品を購入する場合の入手性を考慮すると、ベヘニン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、エルカ酸およびオレイン酸からなる群から選択されると好ましい。この場合も、ＨＬＢ値が８〜２０となるように選択することが好ましい。
【００４４】
これらのショ糖脂肪酸エステルは、従来公知の方法を適宜参照し、あるいは組み合わせて合成して準備することができる。また、市販品を購入して準備してもよい。市販品としては、三菱化学フーズ株式会社のサーフホープＳＥ ＰＨＡＲＭＡ（登録商標）のショ糖ベヘニン酸エステル（Ｊ−２２０３、Ｊ−２２０３）、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｊ−１８０１、Ｊ−１８０２、Ｊ−１８０３Ｆ、Ｊ−１８０５、Ｊ−１８０７、Ｊ−１８０９、Ｊ−１８１１、Ｊ−１８１１Ｆ、Ｊ−１８１５、Ｊ−１８１６）、ショ糖パルミチン酸エステル（Ｊ−１６１５、Ｊ−１６１６）、ショ糖ミリスチン酸エステル（Ｊ−１４１６）、ショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２０１、Ｊ−１２０５、Ｊ−１２１６）、ショ糖エルカ酸エステル（Ｊ−２１０１、Ｊ−２１０２）、ショ糖オレイン酸エステル（Ｊ−１７０１、Ｊ−１７１５）などが例示できる。
【００４５】
中でも、ＨＬＢ値が８〜２０であり、本発明の保存安定性向上の目的を効果的に達成するとの観点から、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｊ−１８１１（ＨＬＢ値１１）、Ｊ−１８１１Ｆ（ＨＬＢ値１１）、Ｊ−１８１５（ＨＬＢ値１５）、Ｊ−１８１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖パルミチン酸エステル（Ｊ−１６１５（ＨＬＢ値１５）、Ｊ−１６１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖ミリスチン酸エステル（Ｊ−１４１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖オレイン酸エステル（Ｊ−１７１５（ＨＬＢ値１５））などが好ましく、特にショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２１６（ＨＬＢ値１６））が好ましい。
【００４６】
＜精製工程＞
上記のように抽出した、可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨは、精製工程を経ることが好ましい。しかしながら、上記のように抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨに、ショ糖脂肪酸エステルを含有させて、後述する限外ろ過による濃縮工程を実施してもよいし、これらの精製する工程の途中で、ショ糖脂肪酸エステルを用いてＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製し、限外ろ過による濃縮する工程を実施してもよい。
【００４７】
上記で得られた可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００４８】
好ましくは、精製工程ではカラムクロマトグラフィを使用する。すなわち、前記可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液をカラムにアプライした後、前記ショ糖脂肪酸エステルを含む溶離液を送液することによって、可溶化時に使用した遊離している界面活性剤を除去することが好ましい。
【００４９】
本発明で用いられるクロマトグラフィとしては、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト、アフィニティークロマトグラフィなどが好適である。
【００５０】
イオン交換クロマトグラフィとしては、界面活性剤の種類に応じて適宜選択することができ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィなどがあるが、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィである。
【００５１】
クロマトグラフィに用いられるカラムにも特に制限はないが、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ（例えば、ＧＥヘルスケア製のものが好適である）などが好適である。
【００５２】
前記可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液をカラムにアプライする前に、カラムの平衡化を行っておくことが好ましい。カラムの平衡化を行うための溶液は、緩衝剤（例えば、濃度５〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）と、０．００５〜１ｇ／１００ｍＬ、より好ましくは０．０２〜１ｇ／１００ｍＬの前記ショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液であることが好ましい。ショ糖脂肪酸エステルは、上記説明したものを使用することができる。また、かかる溶液には、濃度１〜２０ｍＭの２価の金属イオン（例えば、硫酸マグネシウム）をさらに添加してもよい。２価の金属イオンは、本工程で添加せずに、他の工程で必要に応じ添加してもよい。
【００５３】
前記可溶化したＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液を上記カラムにアプライし、カラムの平衡化を行った溶液を、カラムの体積の、好ましくは２倍〜３０倍、より好ましくは３倍〜２０倍の量を送液することによって、少なくとも遊離している、可溶化する際に用いた界面活性剤を除去することができる。このように遊離している界面活性剤が除去されることにより、最終的に得られる酵素の保存安定性が向上する。
【００５４】
なお、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する際に、界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルを用いた場合は、上記した精製工程を経ずに、限外ろ過によって濃縮する工程に進んでもよい。精製工程は、従来酵素の可溶化のために使用されていた界面活性剤（特に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００））の過剰分（つまり、遊離している界面活性剤）を除去することであるため、かかる界面活性剤を使用していなければ、精製工程は不要となる。
【００５５】
次に、前記カラムからＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液を溶出することによって、ポリオール脱水素酵素画分を得る。このように酵素が溶出された溶出液も、臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含んでいる。溶出の方法にも特に制限されないが、グラジエント法、ステップワイズ法などが挙げられる。
【００５６】
例えば、カラムとして陰イオン交換体（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ）を用い、グラジエント法を採用する場合は、開始緩衝液として、０．００５〜１ｇ／１００ｍＬ、より好ましくは０．０２〜１ｇ／１００ｍＬの前記ショ糖脂肪酸エステルを含む１〜１００ｍＭ緩衝液（ｐＨ７〜１２）が使用できる。溶出緩衝液は、開始緩衝液にさらに、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２等）を含む。塩の濃度は、用いる塩にもよるが、０．０５〜２Ｍがよい。なお、前記開始もしくは溶出緩衝液には、必要に応じて０．０１〜２０ｍＭの２価の金属イオン（ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２）や還元剤（２−メルカプトエタノールやジチオスレイトール）を加えてもよい。グラジエント溶出は、カラム体積の１〜５０倍量で行うことが好ましい。
【００５７】
本発明で使用し得る緩衝液は、ｐＨが７〜１２のものであれば特に制限はないが、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。このうち、ｐＨを酵素に好適な範囲に調節することができ、酵素の保存安定性を向上に寄与することから、特にグリシルグリシンが好ましい。
【００５８】
上記のように精製したポリオール脱水素酵素を含む溶液は、溶出の際に使用した塩を含んでいるため、脱塩処理を行ってもよい。脱塩処理の方法としては特に制限はないが、透析、限外ろ過、脱塩カラムを使用する方法などが挙げられる。典型的には、透析を行うことができる。例えば、透析は、上記のように得られた精製したポリオール脱水素酵素を含む溶液を、緩衝剤で、一晩透析する。緩衝剤は、０．１〜１ｇ／１００ｍＬ程度界面活性剤を含んでいてもよい。より具体的には、緩衝剤としては、濃度２〜１００ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液（ｐＨ７〜９．５）および濃度０．００５〜１ｇ／１００ｍＬの界面活性剤（ｐＨ７〜９．５）を含む液を好ましく用いることができる。
【００５９】
＜第一工程＞
本発明の製造方法では、第一工程として、上記のように得られたポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含む水溶液を、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満になるように希釈する。
【００６０】
上記のようにポリオール脱水素酵素の水溶液を得る工程後および得られたポリオール脱水素酵素の精製工程後の溶液には、ポリオール脱水素酵素を溶解させておくために、臨界ミセル濃度以上の界面活性剤を含んでいる。そこで、得られたポリオール脱水素酵素を含む水溶液を、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満に希釈することにより、後述する限外ろ過によって、酵素を濃縮すると共に効果的に界面活性剤濃度を低減できる。臨界ミセル濃度以上の界面活性剤の濃度の上限値は、特に制限はないが、酵素を可溶化させるために十分な濃度があればよく、使用する界面活性剤にもよるが、５ｇ／１００ｍＬ程度である。
【００６１】
また、例えば上記の精製工程によって得られる、希釈を行うポリオール脱水素酵素を含む水溶液中の蛋白濃度は、０．０１〜３０ｍｇ／ｍＬとなっていることが好ましく、より好ましくは０．０５〜２５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍＬである。また、希釈を行うポリオール脱水素酵素を含む水溶液中の酵素の比活性は、０．１〜１００Ｕ／ｍｇとなっていることが好ましく、より好ましくは０．５〜７５Ｕ／ｍｇであり、さらに好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｇである。
【００６２】
臨界ミセル濃度は、本発明においては、界面活性剤のみの水溶液について得られる値を使用する。したがって、臨界ミセル濃度はショ糖脂肪酸エステルの種類によって異なるが、通常、本発明の技術分野においては公知の値である。例えば、臨界ミセル濃度は、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４７（２），３１９〜３２６， １９８３に記載の方法で測定することができ、ショ糖ラウリン酸エステルは０．４ｍＭ（０．０２１％ｗ／ｖ）であることが知られている。ポリオール脱水素酵素を含む水溶液中の臨界ミセル濃度は、上記のように界面活性剤以外にも酵素や緩衝剤などの物質が含まれているため、厳密には界面活性剤のみの水溶液について得られる値とは異なると思われるが、本発明では、最終的に得られる酵素の保存安定性向上という本発明の効果を実現できるという点から、界面活性剤のみの水溶液について知られている臨界ミセル濃度を採用して何ら差し支えない。また、希釈によって臨界ミセル濃度未満となる界面活性剤の濃度の下限値は、特に制限はないが、０．００１％ｗ／ｖ（０．００１ｇ／１００ｍＬ）以上が好ましい。
【００６３】
ショ糖脂肪酸エステルを臨界ミセル濃度未満に希釈する方法は、特に制限はないが、緩衝液を添加し混合する方法が好ましい。この他、限外ろ過法、各種クロマトグラフィ法、界面活性剤を吸着する樹脂等を使用することができる。
【００６４】
第一工程で使用できる緩衝剤は、ｐＨが７〜１２のものであれば特に制限はないが、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。このうち、ｐＨを酵素に好適な範囲に調節することができ、酵素の保存安定性を向上に寄与することから、特にグリシルグリシンが好ましい。
【００６５】
具体的な緩衝液としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液やグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。これらの中でも、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液またはグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液のようなグリシルグリシン緩衝液が好ましい。また、上記緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは０．５〜５００ｍＭ、より好ましくは０．７５〜４００ｍＭ、最も好ましくは１〜３００ｍＭである。なお、本発明において緩衝液の濃度とは、緩衝液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。また、上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは４．０〜１１．０、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。このような緩衝液を、ポリオール脱水素酵素を含む溶液に、例えば、１０〜５００ｍＬ添加することができる。
【００６６】
＜第二工程＞
本発明の製造方法においては、前記希釈したポリオール脱水素酵素を含む溶液（希釈液）を、限外ろ過することによって、濃縮物を得る第二工程を実施する。
【００６７】
上記の希釈した溶液には、界面活性剤としてショ糖脂肪酸エステルが含まれている。本発明の方法では、この界面活性剤を限界ろ過によって効果的に取り除くことができるため、最終的に得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物の保存安定性が大きく向上する。例えば、従来使用されていた界面活性剤のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の場合には、臨界ミセル濃度未満にした溶液から、限外ろ過のみによっては十分に界面活性剤を除くことができず、酵素とともに濃縮されて残存していた。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を全血を試料とする測定試薬に用いた場合には、従来は残存する界面活性剤によって溶血が起きる場合があったが、本発明の方法によれば、限外ろ過によってショ糖脂肪酸エステルをできるだけ除くことにより、溶血を防止することもできる。
【００６８】
その上、濃縮することにより、溶液中の酵素濃度が濃くなるため、酵素の失活が抑えられる場合がある。また、濃縮することにより、その後の工程において、液量が減少するため小スケールで処理することができる。また、限外ろ過は、酵素の失活が少なく、且つ簡便であるという利点がある。
【００６９】
限外ろ過の方法には特に制限はないが、前記脱塩したポリオール脱水素酵素溶液をそのまま、あるいは、緩衝剤（例えば、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液ｐＨ７〜９．５程度）を加えた後、従来公知の方法によって行って、濃縮液を得る。限外ろ過の回数にも特に制限はないが、好ましくは１〜１５回、より好ましくは２〜１０回、さらに好ましくは２〜６回である。なお、かかる工程を経ることによって、本発明のポリオール脱水素酵素組成物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として（対蛋白量あたり）、ショ糖脂肪酸エステルが、１０質量％以下となることが好ましい。１０質量％以下であることによって、得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物の保存安定性を確実に向上することができる。また、下限としては、特に制限はないが、０．１質量％以上が好ましい。０．１質量％以上とすることによって、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを保護しつつ、酵素の保存安定性を向上することができる。上記のようにして、本発明の方法によりポリオール脱水素酵素を含む濃縮物が得られる。
【００７０】
限外ろ過膜の分画分子量は、酵素のロスがなく、ショ糖脂肪酸エステルが効率よく減量できるとの観点から、好ましくは１０,０００〜６０，０００であり、より好ましくは２０，０００〜５５，０００であり、さらに好ましくは２５，０００〜５０，０００である。１０，０００未満では濃縮速度が遅すぎる場合があり、６０，０００より大きいと、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが限外ろ過膜を通過してしまい、酵素の回収率が低下する場合があるためである。限外ろ過後に最終的に得られる濃縮物の蛋白濃度（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ濃度）は、０．１〜１５０ｍｇ／ｍＬとなるようにすることが好ましく、より好ましくは０．３〜１２５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｍＬである。
【００７１】
また、得られたポリオール脱水素酵素を含む濃縮物には、緩衝剤をさらに添加してもよい。緩衝剤を添加することにより、ｐＨを酵素に好適な範囲に調節することができ、酵素の保存安定性をより向上させることができる。緩衝剤としては、上記した緩衝剤と同様のものが使用できる。上記した中でも、低濃度でＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる点で、グリシルグリシンが好ましい。グリシルグリシンはアミノ酸系緩衝剤の一種であるが、グリシンなどの他のアミノ酸系緩衝剤やＭＯＰＳなどの他のよく知られている緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素の残存活性を向上させることができる。
【００７２】
添加する緩衝剤の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性をより向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは２〜２５０質量％、より好ましくは３〜２００質量％である。さらに好ましくは５〜１５０質量％である。上記の範囲であれば、保存安定性をより向上できる。
【００７３】
緩衝剤を添加する方法は特に制限されず、緩衝剤をそのまま添加してもよいが、緩衝剤を予め水に溶解させた緩衝液の形態で添加することが好ましい。緩衝液としても、上記と同様のものが使用できる。なお、添加された緩衝液は後述する凍結乾燥の処理により緩衝液中の水分が除去され、かような場合には緩衝剤として固形物中に存在する。
【００７４】
また、得られたポリオール脱水素酵素の濃縮物には、酸またはアルカリなどのｐＨ調整剤を含むことができる。これにより、ポリオール脱水素酵素濃縮物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。かようなｐＨ調整剤としては、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが挙げられる。ｐＨ調整剤の含有量は特に制限されず、所望のｐＨが実現される量を用いればよい。
【００７５】
また、ポリオール脱水素酵素組濃縮物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などの付加成分を所望に応じて含有することができる。
【００７６】
＜第三工程＞
上記のように、限外ろ過により濃縮する工程後に得られた液体形態のポリオール脱水素酵素濃縮物を、第三工程として凍結乾燥し、ポリオール脱水素酵素を含む固形物が得られる。凍結乾燥することにより、本発明により得られるポリオール脱水素酵素を含む固形物の形態は特に制限されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体形態であり得る。中でも、本発明の効果が顕著に発揮されることから、粉末の形態であることが好ましい。
【００７７】
凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。典型的には、−１０〜−８０℃で濃縮物を凍結し、凍結物を６．１２ｈＰａ以下の真空状態にし、水分を昇華させる。この工程により、ポリオール脱水素酵素を含む粉末が得られる。本発明により得られた凍結乾燥されたポリオール脱水素酵素を含む固形物は、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活が抑制されるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が有意に向上する。
【００７８】
したがって、本発明の他の一態様では、ポリオール脱水素酵素を含む固形物が提供される。
【００７９】
また、本発明の方法により得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、化学修飾しなくても、保存安定性が有意に向上した酵素となる。そのため、上記の方法で得られる酵素を特に化学修飾せず使用できる。もちろん化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨとして使用してもよく、その場合には、上記の方法で得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特許文献１に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾すればよい。
【００８０】
（ポリオール脱水素酵素組成物を使用した測定試薬およびポリオールの定量方法）
上記のようにして得られた本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物を使用して、ポリオール測定試薬を提供することもできる。また、本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物をポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法を提供することもできる。本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量に優れるため、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは補欠分子族としてＰＱＱを有するため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００８１】
本発明において「ポリオール」とは、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）を意味する。本発明の製造方法を適用し得るＰＱＱ依存性ＰＤＨは、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とする。
【００８２】
ポリオール測定試薬は、ポリオールを定量するための試薬であり、本発明によって得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む粉末を使用する。ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。したがって、還元型電子受容体による電流を測定することにより、ポリオールを定量できる。本発明により得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェナジニウムメチルサルフェートおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げられる。例えば、特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として、本発明の酵素濃縮物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００８３】
本発明の定量方法に用いられるポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿または全血などが挙げられる。また、本発明の酵素濃縮物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清、血漿、または全血などの中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、グリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことにより、真の中性脂肪値を求めることが可能となる。なお、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００８４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００８５】
（酵素活性）
５０μＭ ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、０．２ｍＭ ＰＭＳ（５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、および４５０ｍＭグリセロールを含んだ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
【００８６】
［調製例１：ポリオール脱水素酵素を含む可溶化膜画分の調製例］
ソルビトール１．５ｇ／１００ｍＬ、グルコン酸ナトリウム０．５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン１ｇ／１００ｍＬ、尿素０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、塩酸でｐＨを５．５に調整した培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００８７】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００８８】
次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。
【００８９】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００９０】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が０．５ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００９１】
［実施例１〜３ ポリオール脱水素酵素の調製例］
得られた可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＥヘルスケア製）にて精製した。カラムはＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬ（ＧＥヘルスケア製）を使用した。カラムの平衡化は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８ ＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社）） ＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４で行った。ここで、ショ糖ラウリン酸エステルの濃度０．０５％は、０．０５ｇ／１００ｍＬを意味する。
【００９２】
可溶化膜画分をアプライ後、非吸着画分（つまり、蛋白と結合していない遊離している可溶化に用いた界面活性剤および非吸着の蛋白）を、カラムの平衡化に用いた溶液にてカラム体積の１０倍量で洗浄した。溶出緩衝液（溶離液）には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社））＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４＋０．４Ｍ ＮａＣｌを用い、カラム体積の１０倍量でグラジエント溶出を行った。ポリオール脱水素酵素活性画分は、０．２Ｍ ＮａＣｌ前後で溶出した。可溶化膜画分からの回収率は、８５％であった。得られたポリオール脱水素酵素活性画分を１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）およびｐＨ８＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社）で一晩透析することにより、蛋白濃度２ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。
【００９３】
得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度２ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白）について、ショ糖ラウリン酸エステルを、このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液２０ｍＬに１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬを加え、ショ糖ラウリン酸エステルの臨界ミセル濃度未満となる０．００４５％に希釈後、限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。濃縮後、さらに、２００ｍＬの１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、濃縮するという作業を、下記表に記載の回数繰り返した。最後の回の濃縮においては、濃縮後、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。調整後、−８０℃にて凍結させた。凍結後、凍結乾燥を行い、粉末状の酵素固形物を得た。酵素固形物重量あたりの酵素活性は、１０Ｕ／ｍｇ・粉末であった。
【００９４】
上記のようにして得られた粉末状の酵素固形物を、３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素固形物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素固形物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００９５】
［比較例１〜３ ポリオール脱水素酵素の調製例（従来法；界面活性剤にＴｒｉｔｏｎＸ−１００使用）］
得られた可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＥヘルスケア製）にて精製した。カラムはＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬ（ＧＥヘルスケア製）を使用した。カラムの平衡化は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．１％ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）(ＴｒｉｔｏｎＸ−１００)＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４で行った。可溶化膜画分をアプライ後、非吸着画分を前記緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４）にてカラム体積の１０倍量で洗浄した。溶出緩衝液（溶離液）には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ４＋０．２Ｍ ＮａＣｌを用い、カラム体積の１０倍量でグラジエント溶出を行った。ポリオール脱水素酵素活性画分は、０．１Ｍ ＮａＣｌ前後で溶出した。可溶化膜画分からの回収率は６２％であった。得られたポリオール脱水素酵素活性画分を１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。
【００９６】
得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白）について、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（臨界ミセル濃度：０．０２ｗ／ｖ％）を、ＰＤＨ溶液２０ｍＬに１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬを加え、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の臨界ミセル濃度未満となる０．００９％に希釈後、限外ろ過（分画分子量：５０，０００）した。濃縮後、さらに、２００ｍＬの１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、濃縮するという作業を下記表に示す回数繰り返した。濃縮後、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。調整後、−８０℃にて凍結させた。凍結後、凍結乾燥を行い、粉末状の酵素組成物を得た。酵素組成物重量あたりの酵素活性は、１０Ｕ／ｍｇ・粉末であった。
【００９７】
上記のようにして得られた粉末状の酵素組成物を、３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００９８】
【表１】
【００９９】
上記表１に示される結果から、比較例の従来使用されているポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に比べて、少ない限外ろ過回数で本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、残存活性すなわち保存安定性が優れていることが分かる。本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、限外ろ過を２回程度行えば十分な残存活性が得られるが、比較例のＴｒｉｔｏｎＸ−１００では、同程度の残存活性を得ようとすると６回以上の限外ろ過が必要であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能である。そのため、本発明のポリオール脱水素酵素を含む固形物は、正確にポリオールを定量することにおいて好適に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、
第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、
第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、
を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法。
【請求項２】
前記ショ糖脂肪酸エステルは、ショ糖ラウリン酸エステルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法により得られたポリオール脱水素酵素を含む固形物。
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素および臨界ミセル濃度以上のショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液を、ショ糖脂肪酸エステルの濃度が臨界ミセル濃度未満となるように希釈する第一工程と、
第一工程によって得られた希釈液を限外ろ過する第二工程と、
第二工程によって得られた濃縮物を凍結乾燥する第三工程と、
を含む、ポリオール脱水素酵素を含む固形物の製造方法。
【請求項２】
前記ショ糖脂肪酸エステルは、ショ糖ラウリン酸エステルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法により得られたポリオール脱水素酵素を含む固形物。
【公開番号】特開２０１２−２１０１７３（Ｐ２０１２−２１０１７３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７６７９１（Ｐ２０１１−７６７９１）
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【Ｆターム（参考）】
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