ポリヌクレオチドプライマー
下記プライマー配列の一つの少なくとも最後の６ヌクレオチド、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドプライマー：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むキット及び遺伝子における変異の存在又は不存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞成長因子（Epidermal Growth Factor）（ＥＧＦ）及びその対応するレセプター（ＥＧＦＲ）は、多くの種類の細胞の増殖を調節する役割を果たす。ＥＧＦＲの変異は、制御されていない細胞増殖及び腫瘍増殖に関係している。
【０００３】
腫瘍マーカーとして可能性をもつ核酸の変化についての多くの例があるが、癌診断、ステージング（staging）又はスクリーニングにおける臨床ツール（clinical tool）としてのそれらの価値が示され、かつ二つの重要な条件が満たされなければならない。第一に、適当な収率及び質の核酸が、臨床材料から抽出されなければならない；第二に、頑強でありかつ正確な分析方法が要求される。疾患のステージングにおいて有用となりうる信頼できる腫瘍のジェノタイピング（genotyping）のため、全ての試験は十分確認されていなければならず、現在の方法以上の利益を示すことができなければならない。
【０００４】
肺癌及びそのゲフィニチブ（gefinitib）（アストラゼネカ（AstraZeneca）のイレッサ（IRESSA））に対する応答と、オンコジーンである、ＥＧＦＲにおける変異との関連を検討している多数の研究がある。しかしながら、スペクトル（有効範囲）と、報告されているＥＧＦＲ変異の頻度に差がある。一つの重大な問題は、可能性のある変異が広範であるためＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインのヌクレオチドの配列決定が、切除された腫瘍について試みられるということである。このアプローチの利用は、多数の要因、主として下記により制限される：
１．バイオプシーサンプルの全てが腫瘍とは限らない
２．全ての腫瘍が変異を伴うとは限らない
【０００５】
例えば、検体のうち１０％程度が腫瘍であり、残りは辺縁の非腫瘍細胞であるかもしれない。腫瘍は、それらの遺伝子構造において異質であることはよく知られ、腫瘍細胞の１０％ほどには、いくつかの特定の遺伝的な変化が含まれるであろう。したがって、全体で遺伝子分析の腫瘍サンプルの１％ほどには、対象の特定のバリエーションが含まれるであろう。
【０００６】
配列決定の検出限界は、１５〜２５％程度である；即ち、配列決定により希少な対立遺伝子（rarer allele）が４分の１から６分の１よりも悪くないレベルで検出されうる。上述したように、一定の腫瘍サンプルにおける変異の割合は、そのようなレベルよりも有意に低いことがある。現在のアプローチでは、ある程度のサンプル濃縮を行うことが必要とされる、即ちパラフィン包埋した腫瘍切片から腫瘍材料を選択的に切除する試みがなされる。これは、費用がかかり、時間を消費し、感度に欠ける。
【０００７】
本願において、本発明者らは、例えば、特許文献１に開示されているようなＡＲＭＳ（amplification refractory mutation system）法に基づきＥＧＦＲ変異を検出するための新規診断方法を発明した。４つのＥＧＦＲ点変異体及び４つの欠失について確認されるテストが開発されており、そのテストは患者からの腫瘍における変異の発生率の検討に利用されている。ＡＲＭＳ技術は、特定の配列の変異体を別の配列のバックグラウンドにおいて選択的に増幅することができる。
【０００８】
ＡＲＭＳ法は、簡単かつ正確な方法であり、これには他のＰＣＲベースの変異検出システムを超える利点がいくつかある。具体的に、前記技術では、放射性同位元素の使用も固定化されたＰＣＲ単位複製配列の多重プロービングもＰＣＲ単位複製配列のクローニングも必要とされない。
【０００９】
ＡＲＭＳ法では、１本鎖高次構造多型産物のＤＮＡ配列決定、即ち上述したような配列の代表不足によって制約されうると予想されうる処置が必要とされない。同様に、標本として不十分である変異配列は、ＰＣＲを制限断片長多型と組み合わせて用いる場合には偽陽性の結果をなくすためＰＣＲについては低サイクル数に制限されるので、検出されないであろう。したがって、先に産生した単位複製配列においては、ＰＣＲを再び続けると、持ち越し汚染（carry over contamination）が引き起こされる可能性がある。ＡＲＭＳ法では、高いＰＣＲサイクル数を用いることができ、かつ非常に高い検出感度で結果を生じるので、持ち越し汚染がない条件下で行うことができる
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３３２４３５号（EP-A-0332435）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、大まかに言えば、本発明は、ＡＲＭＳ法を用いて癌、特に肺癌におけるＥＧＦＲ変異を検出するための診断方法に関する。本発明はまた、前記方法において使用するのに適した変異特異的なプライマー及びこれらのプライマーを含む診断キットに関する。
【００１１】
本発明の一つの視点によれば、下記プライマー配列の一つの少なくとも最後の６ヌクレオチド、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するポリヌクレオチドが提供される：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
「最後の６ヌクレオチド（final six nucleotides）」は、ポリヌクレオチドの３’末端の６つのヌクレオチドを意味する。
【００１２】
好都合なことには、前記ポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長よりも小さい、好ましくは８０ヌクレオチド長よりも小さい、より好ましくは６０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは４０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは３０ヌクレオチド長よりも小さい。
【００１３】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、下記プライマー配列の一つの最後の８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２０ヌクレオチド、又はその全部の少なくとも７５％、より好ましくは１００％、又はこれと相補的な配列を含む：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【００１４】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、更に、消光基（quencher group）及び蛍光基（fluorophore group）を含む。「蛍光基（fluorophore group）」は、第一の波長の光を吸収し、これに対して第二の波長の光を発することができる基である。「消光基（quencher group）」は、蛍光基の十分近傍にあるときに、その蛍光基からの発光を防ぐ、又は「消す（quenching）」ことができる基である。典型的には、ある特定の消光基は、ある一定の蛍光基に関してのみ作用するであろう。
【００１５】
好都合なことには、前記消光基と前記蛍光基とは、第一及び第二領域を含むヌクレオチド尾部配列によって隔てられ、前記第一領域のヌクレオチドは、前記第二領域のヌクレオチドと相補的であるが前記第二領域のヌクレオチドとは逆向きの配列であり、前記第一領域の前記第二領域へのハイブリダイゼーションによって前記消光基は、前記蛍光基を消光できる前記蛍光基の十分近くにあるようになされる。
【００１６】
好ましくは、前記尾部配列は、更にＥＧＦＲ遺伝子の領域に相補的な配列を有する第三の領域を含む。
【００１７】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３又は１０の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号１９を含む。
【００１８】
これに代えて、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６又は１２の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号２０を含む。
【００１９】
これに代えて、前記ポリヌクレオチドは、少なくとも配列番号７６の最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号７７を含む。
【００２０】
好都合なことには、前記消光基は、ブラックホールクエンチャー１（Black Hole Quencher 1）（ＢＨＱ１）を含み、前記蛍光基は、ＦＡＭを含む。
【００２１】
これに代えて、前記消光基は、ブラックホールクエンチャー２（Black Hole Quencher 2）（ＢＨＱ２）を含み、前記蛍光基は、Ｃａｌ Ｒｅｄを含む。
【００２２】
好ましくは、前記プライマー配列と前記尾部配列との間にブロッキング成分（blocking moiety）を設けて、前記尾部配列のポリメラーゼ媒介の鎖伸長（polymerase mediated chain extension）を防止する。好ましいブロッキング成分は、ヘキサエチレングリコール（hexethylene glycol）（ＨＥＧ）モノマーである。
【００２３】
本発明の別の視点によれば、少なくとも一組のポリヌクレオチドを含むキットであって、前記一組のポリヌクレオチドは、下記組のプライマー配列の一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するキットが提供される：
配列番号１と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１８、又は配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２４、又は配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４５、又は配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号３７と配列番号４２、又は配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７６、又は配列番号７５と配列番号７６。例えば、前記一組のポリヌクレオチドは、配列番号１の最後の６ヌクレオチドからなる第一のポリヌクレオチド及び配列番号１５の最後の６ヌクレオチドからなる第二のポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
本発明の更なる視点によれば、少なくとも三つのポリヌクレオチドのセットを含むキットであって、前記三つのポリヌクレオチドのセットは、下記三つのプライマー配列のセットの一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するキットが提供される：
配列番号１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号３２と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７５と配列番号７６。例えば、前記三つのポリヌクレオチドのセットは、配列番号１の最後の６ヌクレオチドからなる第一のポリヌクレオチド、配列番号１０の最後の６ヌクレオチドからなる第二のポリヌクレオチド及び配列番号１５の最後の６ヌクレオチドからなる第三のポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
好都合なことには、前記キット中のポリヌクレオチドは、前記したのと同様である。
【００２６】
好ましくは、前記キットは、更に、ヌクレオチド三リン酸、重合酵素及び／又はバッファ溶液を含む。
【００２７】
本発明の別の視点によれば、少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルにおける変異を検出するための、前記したポリヌクレオチド或いは前記したキット；又は配列番号１〜１８、２１〜４５若しくは７４〜７７の最後の６ヌクレオチドの４又は５、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２８】
有利には、前記核酸サンプル中のＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、更に好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長である。
【００２９】
本発明の更なる視点によれば、下記工程を含むことに特徴を有するＥＧＦＲ遺伝子における変異の存在又は不存在を検出する方法が提供される：
ａ）少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルを、前記ＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントの１つの領域と相補的なポリヌクレオチドと混合する工程；及び
ｂ）変異の存在又は不存在を示す前記ポリヌクレオチドの前記核酸サンプルへのハイブリダイゼーションを検出し、ハイブリダイゼーションによって変異の存在又は不存在が示される工程。
【００３０】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、前記したポリヌクレオチドであり、かつ配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み、そして工程ｂ）は変異の存在を示す。
【００３１】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、前記したポリヌクレオチドであり、配列番号１０〜１４、２３、３５〜４０若しくは７４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み；そして工程ｂ）は変異の不存在を示す。
【００３２】
好都合なことには、前記方法は、更に、工程ａ）より前に、熱サイクリング核酸増幅（thermal cycling nucleic acid amplification）、好ましくはＰＣＲを用いてＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を増幅する工程を含む。
【００３３】
好ましくは、工程ｂ）は、前記ポリヌクレオチドを第一のプライマーとして用いてＤＮＡ重合を行うこと及び重合の伸長産物を検出することを含む。
【００３４】
有利には、工程ｂ）は、前記核酸サンプル及びポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドが相補的である領域の下流のＥＧＦＲ配列のフラグメントの領域に対応する第二のプライマーと混合する工程並びに前記混合物についてＰＣＲを行う工程を含む。
【００３５】
好都合なことには、前記第二のプライマーは：
配列番号１５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号１〜５、１０、１１若しくは２１の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号６若しくは１２の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１７を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７若しくは１３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１８を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号８、９若しくは１４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号２４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２２若しくは２３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４１を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２５〜２８、３３、３５若しくは３６の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４２を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２９若しくは３７の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４３を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３０〜３８の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３１、３２若しくは３９の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３４若しくは４０の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；或いは
配列番号７６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含む。
【００３６】
好ましくは、工程ａ）は、核酸サンプルを、変異特異的なポリヌクレオチドと野生型特異的なポリヌクレオチドとのペアと混合する工程を含み、前記ペアは、下記配列の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５の中から選択される：
配列番号１と配列番号１０、又は配列番号２と配列番号１０、又は配列番号３と配列番号１０、又は配列番号４と配列番号１１、又は配列番号５と配列番号１１、又は配列番号６と配列番号１２、又は配列番号７と配列番号１３、又は配列番号８と配列番号１４、又は配列番号９と配列番号１４、又は配列番号２１と配列番号１０、又は配列番号２２と配列番号２３、又は配列番号２５と配列番号３５、又は配列番号２６と配列番号３５、又は配列番号２７と配列番号３６、又は配列番号２８と配列番号３６、又は配列番号２９と配列番号３７、又は配列番号３０と配列番号３８、又は配列番号３１と配列番号３９、又は配列番号３２と配列番号３９、又は配列番号３３と配列番号３５、又は配列番号３４と配列番号４０、又は配列番号７４と配列番号７５。
【００３７】
有利には、前記核酸サンプルは、野生型の配列と変異した配列を含み、前記方法は、更に、前記野生型の配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数を、前記変異した配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数と比較し、それによってサンプル中の野生型の配列と変異した配列の比を示す工程ｃ）を含む。
【００３８】
好都合なことには、前記核酸サンプルは、腫瘍組織の一部及び非腫瘍組織の一部を含み、工程ｃ）は、更に、サンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を決定する工程を含む。
【００３９】
好ましくは、前記方法は、更に、工程ａ）より前に、前記核酸サンプルを濃縮してサンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を増加させる工程を含む。
【００４０】
好ましくは、工程ｂ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも一部の増幅が起こるかどうかを検出することを含む。
【００４１】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、消光基及び蛍光基を含み、工程ｂ）は、混合物に対して、蛍光体が消光基の不存在の際に応答する波長の光を当てること及び消光基の不存在の際に蛍光基によって発せられる波長の光を検出することを含む。
【００４２】
本明細書において、参照配列の「最後の６ヌクレオチド（at four or five of the final six sequences）の少なくとも４又は５」について言及している場合には、これは、参照配列の６つのヌクレオチドのうち１つ又は２つのヌクレオチドが欠落しているか又は異なるヌクレオチドと置換されていてもよいという意味である。当然、いくつかの形態では、配列は、前記参照配列の６つのヌクレオチド全てを含む。
【００４３】
本発明の好ましい形態では、「ＥＧＦＲ」についての言及は、２００６年３月３０日付ヒト染色体７（Homo sapiens chromosome 7）、領域５５０５４２１９..５５２４２５２５で受入番号ＮＣ＿０００００７として入手できるヒトＥＧＦＲ遺伝子についてなされうる。いくつかの他の形態では、言及は、２００５年３月４日付のものについてなされうる。配列は、両方とも参照により本願に組み入れられる。いくつかの形態では、前記ＥＧＦＲ遺伝子は、これらの配列と同一ではないが、それらの配列のいずれか又は両方と少なくとも９０％同一である。
【００４４】
本明細書において、参照ポリヌクレオチドと比較したポリヌクレオチドの割合が言及されるが、これは公知のアルゴリズムによって測定されうる。
【００４５】
例えば、二つの配列間における同一性の割合を、既定パラメータを用いるＢＬＡＳＴＰアルゴリズム バージョン２．２．２（Altschul、Stephen F.、Thomas L. Madden、Alejandro A. Schaeffer、Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller、及びDavid J. Lipman（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代の蛋白質データベース検索プログラム（Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２））を用いて測定することができる。
【詳細な説明】
【００４６】
ここで、本発明がより容易に理解され、その結果その更なる特徴が理解されるように、本発明の実施形態が、実施例により、添付した図を参照して記載される。
【００４７】
大まかに言えば、本発明は、癌におけるＥＧＦＲ変異の検出の診断方法であって、核酸のテストサンプルをＥＧＦＲ変異の診断用プライマーと適当なヌクレオチド三リン酸及び重合剤の存在下において、ＥＧＦＲ変異体が前記サンプル中に存在するときにのみ前記診断用プライマーが有効に伸長されるように、接触させること；並びに診断用プライマーの伸長産物の存在又は不存在を基準にしてＥＧＦＲ変異体の存在又は不存在を検出することを含む方法を提供する。
【００４８】
本願には、本発明の方法において使用することができるプライマー（配列番号１〜９、２１、２２、及び７５）が開示されている。
【００４９】
診断用プライマーのそれぞれによって、下記ＥＧＦＲ変異体の一つの存在又は不存在が検出される：
１）ｄｅｌ Ｅ７４６−Ａ７５０（二つの異なる変異体が存在）
２）ｄｅｌ Ｌ７４７−Ｔ７５１ ｉｎｓＳ
３）ｄｅｌ Ｌ７４７−Ｐ７５３ ｉｎｓＳ
４）ｄｅｌ Ｓ７５２−Ｉ７５９
５）Ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８５８Ｒ
６）Ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８６１Ｑ
７）Ｅｘｏｎ １８ Ｇ７１９Ｃ
８）Ｅｘｏｎ １８ Ｇ７１９Ｓ
９）Ｅｘｏｎ ２０ Ｔ７９０Ｍ
【００５０】
変異体１）〜８）は、個体のゲフィニチブに対する感受性を与えるのに対して、変異体９）は、ゲフィニチブに対する抵抗性を与える。
【００５１】
いくつかの形態において、逆ＤＮＡ鎖（opposite DNA strand）に対応する変異体に特異的な診断用プライマーが使用される（配列番号２５〜３４）。
【００５２】
前記核酸のテストサンプルは、簡便には、血液、糞便、痰、結腸洗浄（colonic lavage）、気管支洗浄（bronchial lavage）又はその他の体液、或いは個体から得られる組織のサンプルである。前記個体は、簡便には、ヒト、好ましくは学術的なヒト（Homo sapiens）である。前記テストサンプルは、そのテストサンプルにおける配列に対応する核酸配列と同等であってもよいと理解されるであろう。即ち、核酸サンプルにおける領域の全部又は一部は、本発明の方法において使用される前に、先ず、ＰＣＲや全ゲノム増幅法（whole genome amplification）（ＷＧＡ）等のいくつかの簡便な技術を用いて増幅されてもよい。
【００５３】
ＤＮＡポリメラーゼが正常鋳型（テンプレート）配列と変異鋳型配列とを識別する能力にある程度までは影響を与えないという条件で、重合のためいくつかの適切な酵素が使用されてもよい。適切な酵素の例には、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を全く有しない熱安定性の酵素、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、特に「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ」（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、又はその他のＴａｑ若しくはＴｔｈ（高度好熱菌（Thermus thermophilus））ＤＮＡポリメラーゼの適当にＮ末端除去した修飾体（appropriately N-terminal deleted modification）が含まれる。
【００５４】
本書において、特定の変異体を確実に、かつ頑強に検出するため示されている上記ＥＧＦＲ点変異体のためのプライマーが開示されている。したがって、本発明の更なる視点では、本発明者らは、配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４又は７５及びその誘導体を含み、３’末端で６〜８のヌクレオチドが前記配列と同一であり、８、６、４、２、１まで等、１０までの残りのヌクレオチドが、診断用プライマーの特性に著しく影響を与えることなしに任意に変更される診断用プライマーを提供する。好都合なことには、前記診断用プライマーの配列は、ちょうど配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４又は７５の何れかで示されるようなものである。
【００５５】
上記した診断方法の代わりのバージョンは、前記診断用プライマーの伸長によってＥＧＦＲ変異体の非存在が示されるように構成されると理解されるであろう。例えば、特定の形態では、前記プライマーは、配列番号１０〜１４、２３又は７４の何れかの３’末端から６〜８ヌクレオチドを含む。いくつかの形態では、相補ＤＮＡ鎖の対応する切片を示す野生型配列に特異的なプライマーが使用される（配列番号３５〜４０）。
【００５６】
多くの形態では、１以上のサイクルのＰＣＲ増幅において本発明の診断用プライマーを更に増幅プライマーと併用することが適切である。この視点の適切な例が、欧州特許出願公開第０３３２４３５号（EP-A-0332435）に記載されている。更なる増幅プライマーは、順方向共通プライマー又は逆方向共通プライマーである。そのような共通プライマーの例は、相補鎖用プライマーと併用されうる配列番号１５〜１８、２４及び７６、並びに配列番号４１〜４５である。
【００５７】
任意の適切なコントロールプライマー対が使用されてもよい。ゲノムの無関係の領域からのコントロールプライマー、即ちヒトアルブミン遺伝子の一部が本願において使用される。
【００５８】
先に概説した本発明の診断方法は、いくつかの形態において１以上の反応容器中で簡便に実施される。１を超える診断用変異体が測定されうる場合には、前記診断用プライマー（及び対応する増幅プライマー）は、個々の管、即ちある一定の形態では変異体毎に一つの管に供給される。これに代えて、これらの反応液は、複合化される、即ち他の形態では全ての診断用プライマー及び増幅プライマーが一つの管の中にある（欧州特許出願公開第０３３２４３５号参照）。
【００５９】
各種の方法は、診断用プライマー伸長産物及び／又は増幅産物の存在或いは不存在を検出するために使用されてもよい。これらは、核酸検出処理の技術分野において通常の知識を有する者に明確に理解できるであろう。好ましい方法は、放射標識試薬を必要としない。特定の検出方法は、例えば米国特許第５４８７９７２号及び米国特許第５２１００１５号；Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（国際公開第９９／０６６０７１号（WO-A-99/066071））に記載されたような、特定の診断用プライマーは、ゲノムの同一の領域から多数の変異体の標的を検出することを可能にするとき、特定のディテクター蛍光体（detector fluorophore）に結合されうるため、特定の利点がある「ＴａｑＭａｎ」（登録商標）産物の検出を含む。
【００６０】
好都合なことには、サンプル中の変異体（又は複数の変異体）の定量を可能にするリアルタイム検出が用いられる。より具体的には、野生型の配列に特異的なプライマーを用いて所定のレベルまでＤＮＡサンプルを増幅するのに必要とされるサイクル数が、変異体の配列に特異的なプライマーを用いて必要とされるサイクル数と比較される。この比較を使用して、更に標準化された割合の変異体の標的を含むコントロールの増幅物を基準として、野生型ＤＮＡの量に対する変異体を含むサンプル中のＤＮＡの量の比が定量される。当然、これは与えられているサンプルとの関連を示すだけであり、サンプル中の腫瘍の提示が低いことを補償しない。このため、この定量対立遺伝子特異的アプローチ（quantitative allele specific approach）を、サンプル中の腫瘍のレベルを測定する方法と組み合わせることが好ましい。これに代えて、定量対立遺伝子特異的アプローチが、全サンプルから腫瘍材料を特異的に切除することによりサンプルを濃縮する方法と組み合わされる。
【００６１】
いくつかの形態において、本発明の診断用プライマーは、本発明の方法について使用するための指示書及び適当な梱包材料と共に適切に包装され、キットとして販売される。前記キットは、下記のうち１以上を含む：適当なヌクレオチド三リン酸、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、先に記載したようなポリメラーゼ、及びバッファ溶液。
【００６２】
ここで、本発明を、下記の実施例を参照して、詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００６３】
材料及び方法
【００６４】
合成テンプレートの構築
変異体のそれぞれを保有する確認された均一のゲノム材料がないので、合成テンプレートを構築することが必要であった。ＥＧＦＲ欠失テストのため、それぞれが約半分の目的単位複製配列を含む長い合成重複オリゴヌクレオチド（long synthetic overlapping oligonucleotide）を用いて合成テンプレートを構築した。これらの長いオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。
【００６５】
表１
【００６６】
標的を作成するため、二つの重複１／２単位複製配列を、等モル濃度で、ポリメラーゼ、バッファ及びｄＮＴＰｓの存在下、混合した。その後プライマーミックスを添加し、５０℃〜７５℃まで１サイクル毎に１℃上昇させてそれぞれ１分間の２５サイクルとしてインキュベーションした。ＰＣＲ反応においてコントロールとして使用するため、合成テンプレートをゲノムＤＮＡ中に百万分の一希釈した。
【００６７】
ＳＮＰテストのために、合成カセット（synthetic cassette）を、ＰＣＲを用いて作成して、必要とされる変異を二つのハーフカセット（half cassette）に組み入れた。その後ハーフカセットを、等モル濃度で混合し、必要とされるＳＮＰ標的変異体を含む完全長カセットの作成用テンプレートとして使用した。カセット作成用の特定のプライマー配列を、図２に示す。
【００６８】
表２
【００６９】
変異体特異的ＰＣＲ（Variant Specific PCR）
各ＡＲＭＳ反応及びコントロール用の特定のプライマー配列を、表３及び４に示す。
【００７０】
反応を、０．２ｍｌ容器中で行った（単一チューブ、条片（strip）又はプレート）。反応液（２５μｌ）は、典型的に以下のものを含有していた：
・２５０ｎＭ 診断用プライマー
・２５０ｎＭ 逆方向プライマー
・２５０ｎＭ それぞれのコントロールプライマー（使用される場合）
・２００μＭ 各ｄＮＴＰ
・１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
・５０ｍＭ ＫＣｌ
・２．５〜４ｍＭ ＭｇＣｌ２
【００７１】
いくつかの反応を、硫酸アンモニウム、ＭｇＣｌ２、並びにポリ（エチレングリコール）分子量８０００、及び／又はデキストラン（分子量５０，０００）体積防除剤（volume excluder）の独自の混合物を含むＱｉａｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファの存在下で良好に行った；米国特許２００４−０１１５７１２号を参照されたい。
【００７２】
リアルタイム定量ＰＣＲ（Real Time Quantitative PCR）のために、ＹＯ−ＰＲＯ−１（モレキュラー・プローブ（Molecular Probes））を、１μＭの最終濃度で含有させた。この色素は、二本鎖ＤＮＡに結合し、高効率で蛍光を発し、その結果、この色素によって、反応においてＰＣＲ産物の大まかな検出が可能となる。これに代えて、より好ましくは、発明者らは、標的単位複製配列を特異的に検出することを可能にするＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（プライマーと蛍光プローブを結合させる分子）を用いた。
【００７３】
表３
【００７４】
表４
【００７５】
ＰＣＲを、下記条件を用いてリアルタイムＰＣＲサイクル（ストラタジーン（Stratagene）製のＭｘ４０００及びＭｘ３０００Ｐ）で行った：
ホットスタート用酵素（hot-start emzyme）を活性化させるため９５℃１０〜１５分間、次いで９５℃、６０秒、６５℃、６０秒−欠失テスト５０サイクルまで。
ＳＮＰテストのため、アニーリング／伸長ステップを、６０℃、６０秒間に変更した。
【００７６】
抽出したＤＮＡの測定
各腫瘍サンプルから抽出したＤＮＡの量を、コントロール部位（control locus）のリアルタイム増幅によって測定した。この反応の標準曲線を、既知濃度の株化細胞（ＥＣＡＣＣ、ウィルトシア、ＵＫ）から抽出した高品質ＤＮＡを用いて作成した。
【００７７】
コントロール及び陽性サンプルの配列決定
エクソン特異的プライマーから生成した単位複製配列について、配列決定を、ｂｉｇ−ｄｙｅターミネーターを用いて標準サイクル配列決定（standard cycle sequencing）によって行った。反応液を、ＡＢＩキャピラリー配列決定装置を用いてメーカーの指示書に従って分離した。
【００７８】
結果及び考察
【００７９】
ＡＲＭＳ試験の改良及び変更
欠失及びＳＮＰのそれぞれに特異的なＡＲＭＳ試験を、下記に対してテストした：
１．「正常」ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）
２．ミスマッチ合成標的
３．バッファで希釈した合成標的
４．ｇＤＮＡで希釈した合成標的（腫瘍の状態を模倣するため）
５．テンプレートなし（テンプレートの代わりに水）
【００８０】
反応液に、蛍光ＤＮＡ結合色素ＹＯ−ＰＲＯ−１を含有させ、これを、リアルタイムでモニターした。そのような反応液において、ベースライン上に増幅が現れる点（Ｃｔとして知られている）は、標的の量の指標である。
【００８１】
同一の変異体に特異的であるが相補ＤＮＡ鎖の一つであるプライマーも開発されており、これらを、表５及び６に示す。
【００８２】
表５
【００８３】
表６
【実施例】
【００８４】
実施例１
変異特異的プライマーＥＧＦＲ Ｄｅｌ １２を、適正合成標的（matched synthetic target）及び三つのミスマッチ変異合成標的（mismatched mutant synthetic target）（ｄｅｌ １５（１）、ｄｅｌ １８及びｄｅｌ ２４）についてテストし、加えて、正常ＤＮＡ及び水コントロールをテストした。それらの結果を、図１に示す。
【００８５】
この反応においてプライマーは、独自の標的に対する絶対的な特異性を示し、そのプライマーによって野生型配列もその遺伝子領域で見出される如何なる他の欠失変異体も検出されないということは明らかである。
【００８６】
実施例２ 腫瘍サンプルへのＡＲＭＳ試験の使用
非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer）及び株化細胞からの４２のＤＮＡサンプルを、変異特異的プライマー配列１〜９のそれぞれを用いて分析した。腫瘍ＤＮＡは、スライド上のパラフィン包理組織から採取した。
【００８７】
多数のサンプルは、この方法を用いて陽性であることが分かった：Ｌ８５８Ｒ ＳＮＰについて９つ及び１５の塩基対欠失ｄｅｌ ７４６−Ａ７５０について１つ。
【００８８】
推定変異の周辺領域について、確認的な配列決定を行った。
【００８９】
図２は、ｄｅｌ Ｓ７５２−Ｉ７５９特異的プライマーについてテストした８つのサンプル群の典型的な陰性の結果を示す。変異特異的プライマー（配列番号５）は増幅しないのでこれらのサンプル中にこの変異体が存在しないことを示すが、野生型の特異的反応は遂行するということは明らかである。
【００９０】
図３は、８つの陽性サンプルのＬ８５８Ｒ分析を示す。それぞれの場合において、変異プライマー（配列番号６）を用いる反応は、野生型の反応と同様、陽性であった。変異の反応は対応する野生型の反応よりも遅い数サイクルで生じるという事実によって、変異体がサンプルにおいて大部分の配列ではないということが示される。
【００９１】
図４は、このサンプルからの同一のエクソンの配列決定と組み合わせた対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析のより詳細な分析を示す。このサンプルにおいて、配列決定アプローチによっては、ＡＲＭＳアプローチにより明らかに同定される変異体を検出できないであろう（丸で囲んだ部分にはピークは全く認められない）。
【００９２】
図５は、このサンプルからの同一のエクソンの配列決定と組み合わせた対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析のより詳細な分析を示す。このサンプルにおいて、配列決定アプローチよって、ＡＲＭＳアプローチにより明らかに同定される変異体を検出することができた（丸で囲んだ部分に、かなり弱いピークが認められる）。分析が図４において示されているサンプルにおいて、変異が比較的に、より蔓延していることを示したので、このサンプルにおいて、野生型の特異的反応と変異の特異的反応との差（ΔＣｔ）は、より小さかった。
【００９３】
実施例３
図６は、Ｔ７９０Ｍ変異を有するＤＮＡを含むサンプル、及びＴ７９０Ｍ変異を有しないＤＮＡを含むサンプルのＰＣＲ増幅の結果を示す。Ｔ７９０Ｍ変異を有するＤＮＡを０％、１％、１０％、５０％又は１００％含む５つのサンプルを用意した。サンプルを、配列番号７５の変異プライマー及び配列番号７６及び７７のリバースＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーを用いて増幅した。結果として、変異を有するＤＮＡを全く含まないサンプルは全く増幅を示さなかったことから、変異プライマーはＴ７８０Ｍ変異を有するＤＮＡに特異的であったということが示される。更に、検出は、過剰なミスマッチ標的の存在下であっても、Ｃｔ（閾サイクル（threshold cycle））は適正標的の相対量に直接関係するという点で定量的であることが示された。
【００９４】
図７は、図６においてテスト・報告したサンプルについて行われたコントロールアッセイの結果を示す。ＰＣＲ増幅を、コントロールプライマーを用いて行った。図７によって、各サンプルについての閾サイクルがこのコントロール増幅において同一であったことから、各サンプルは同一総量の標的を含むことが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、本発明のプライマー及びコントロールのプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２】図２は、ｄｅｌ Ｓ７５２−１７５９（配列番号５）に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図３】図３は、Ｌ８５８Ｒ変異体（配列番号６）に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図４】図４は、変異体に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図（上部）、並びにそのサンプルの配列決定の結果を示す図（下部）である。
【図５】図５は、変異体に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図（上部）、並びにそのサンプルの配列決定の結果を示す図（下部）である。
【図６】図６は、変異体に特異的なプライマーの存在下において、サンプルのセットについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図７】図７は、図６において示した結果について分析されたサンプルの、コントロールのプライマーを用いるＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むキット及び遺伝子における変異の存在又は不存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞成長因子（Epidermal Growth Factor）（ＥＧＦ）及びその対応するレセプター（ＥＧＦＲ）は、多くの種類の細胞の増殖を調節する役割を果たす。ＥＧＦＲの変異は、制御されていない細胞増殖及び腫瘍増殖に関係している。
【０００３】
腫瘍マーカーとして可能性をもつ核酸の変化についての多くの例があるが、癌診断、ステージング（staging）又はスクリーニングにおける臨床ツール（clinical tool）としてのそれらの価値が示され、かつ二つの重要な条件が満たされなければならない。第一に、適当な収率及び質の核酸が、臨床材料から抽出されなければならない；第二に、頑強でありかつ正確な分析方法が要求される。疾患のステージングにおいて有用となりうる信頼できる腫瘍のジェノタイピング（genotyping）のため、全ての試験は十分確認されていなければならず、現在の方法以上の利益を示すことができなければならない。
【０００４】
肺癌及びそのゲフィニチブ（gefinitib）（アストラゼネカ（AstraZeneca）のイレッサ（IRESSA））に対する応答と、オンコジーンである、ＥＧＦＲにおける変異との関連を検討している多数の研究がある。しかしながら、スペクトル（有効範囲）と、報告されているＥＧＦＲ変異の頻度に差がある。一つの重大な問題は、可能性のある変異が広範であるためＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインのヌクレオチドの配列決定が、切除された腫瘍について試みられるということである。このアプローチの利用は、多数の要因、主として下記により制限される：
１．バイオプシーサンプルの全てが腫瘍とは限らない
２．全ての腫瘍が変異を伴うとは限らない
【０００５】
例えば、検体のうち１０％程度が腫瘍であり、残りは辺縁の非腫瘍細胞であるかもしれない。腫瘍は、それらの遺伝子構造において異質であることはよく知られ、腫瘍細胞の１０％ほどには、いくつかの特定の遺伝的な変化が含まれるであろう。したがって、全体で遺伝子分析の腫瘍サンプルの１％ほどには、対象の特定のバリエーションが含まれるであろう。
【０００６】
配列決定の検出限界は、１５〜２５％程度である；即ち、配列決定により希少な対立遺伝子（rarer allele）が４分の１から６分の１よりも悪くないレベルで検出されうる。上述したように、一定の腫瘍サンプルにおける変異の割合は、そのようなレベルよりも有意に低いことがある。現在のアプローチでは、ある程度のサンプル濃縮を行うことが必要とされる、即ちパラフィン包埋した腫瘍切片から腫瘍材料を選択的に切除する試みがなされる。これは、費用がかかり、時間を消費し、感度に欠ける。
【０００７】
本願において、本発明者らは、例えば、特許文献１に開示されているようなＡＲＭＳ（amplification refractory mutation system）法に基づきＥＧＦＲ変異を検出するための新規診断方法を発明した。４つのＥＧＦＲ点変異体及び４つの欠失について確認されるテストが開発されており、そのテストは患者からの腫瘍における変異の発生率の検討に利用されている。ＡＲＭＳ技術は、特定の配列の変異体を別の配列のバックグラウンドにおいて選択的に増幅することができる。
【０００８】
ＡＲＭＳ法は、簡単かつ正確な方法であり、これには他のＰＣＲベースの変異検出システムを超える利点がいくつかある。具体的に、前記技術では、放射性同位元素の使用も固定化されたＰＣＲ単位複製配列の多重プロービングもＰＣＲ単位複製配列のクローニングも必要とされない。
【０００９】
ＡＲＭＳ法では、１本鎖高次構造多型産物のＤＮＡ配列決定、即ち上述したような配列の代表不足によって制約されうると予想されうる処置が必要とされない。同様に、標本として不十分である変異配列は、ＰＣＲを制限断片長多型と組み合わせて用いる場合には偽陽性の結果をなくすためＰＣＲについては低サイクル数に制限されるので、検出されないであろう。したがって、先に産生した単位複製配列においては、ＰＣＲを再び続けると、持ち越し汚染（carry over contamination）が引き起こされる可能性がある。ＡＲＭＳ法では、高いＰＣＲサイクル数を用いることができ、かつ非常に高い検出感度で結果を生じるので、持ち越し汚染がない条件下で行うことができる
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３３２４３５号（EP-A-0332435）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、大まかに言えば、本発明は、ＡＲＭＳ法を用いて癌、特に肺癌におけるＥＧＦＲ変異を検出するための診断方法に関する。本発明はまた、前記方法において使用するのに適した変異特異的なプライマー及びこれらのプライマーを含む診断キットに関する。
【００１１】
本発明の一つの視点によれば、下記プライマー配列の一つの少なくとも最後の６ヌクレオチド、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するポリヌクレオチドが提供される：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
「最後の６ヌクレオチド（final six nucleotides）」は、ポリヌクレオチドの３’末端の６つのヌクレオチドを意味する。
【００１２】
好都合なことには、前記ポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長よりも小さい、好ましくは８０ヌクレオチド長よりも小さい、より好ましくは６０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは４０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは３０ヌクレオチド長よりも小さい。
【００１３】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、下記プライマー配列の一つの最後の８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２０ヌクレオチド、又はその全部の少なくとも７５％、より好ましくは１００％、又はこれと相補的な配列を含む：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【００１４】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、更に、消光基（quencher group）及び蛍光基（fluorophore group）を含む。「蛍光基（fluorophore group）」は、第一の波長の光を吸収し、これに対して第二の波長の光を発することができる基である。「消光基（quencher group）」は、蛍光基の十分近傍にあるときに、その蛍光基からの発光を防ぐ、又は「消す（quenching）」ことができる基である。典型的には、ある特定の消光基は、ある一定の蛍光基に関してのみ作用するであろう。
【００１５】
好都合なことには、前記消光基と前記蛍光基とは、第一及び第二領域を含むヌクレオチド尾部配列によって隔てられ、前記第一領域のヌクレオチドは、前記第二領域のヌクレオチドと相補的であるが前記第二領域のヌクレオチドとは逆向きの配列であり、前記第一領域の前記第二領域へのハイブリダイゼーションによって前記消光基は、前記蛍光基を消光できる前記蛍光基の十分近くにあるようになされる。
【００１６】
好ましくは、前記尾部配列は、更にＥＧＦＲ遺伝子の領域に相補的な配列を有する第三の領域を含む。
【００１７】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３又は１０の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号１９を含む。
【００１８】
これに代えて、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６又は１２の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号２０を含む。
【００１９】
これに代えて、前記ポリヌクレオチドは、少なくとも配列番号７６の最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号７７を含む。
【００２０】
好都合なことには、前記消光基は、ブラックホールクエンチャー１（Black Hole Quencher 1）（ＢＨＱ１）を含み、前記蛍光基は、ＦＡＭを含む。
【００２１】
これに代えて、前記消光基は、ブラックホールクエンチャー２（Black Hole Quencher 2）（ＢＨＱ２）を含み、前記蛍光基は、Ｃａｌ Ｒｅｄを含む。
【００２２】
好ましくは、前記プライマー配列と前記尾部配列との間にブロッキング成分（blocking moiety）を設けて、前記尾部配列のポリメラーゼ媒介の鎖伸長（polymerase mediated chain extension）を防止する。好ましいブロッキング成分は、ヘキサエチレングリコール（hexethylene glycol）（ＨＥＧ）モノマーである。
【００２３】
本発明の別の視点によれば、少なくとも一組のポリヌクレオチドを含むキットであって、前記一組のポリヌクレオチドは、下記組のプライマー配列の一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するキットが提供される：
配列番号１と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１８、又は配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２４、又は配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４５、又は配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号３７と配列番号４２、又は配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７６、又は配列番号７５と配列番号７６。例えば、前記一組のポリヌクレオチドは、配列番号１の最後の６ヌクレオチドからなる第一のポリヌクレオチド及び配列番号１５の最後の６ヌクレオチドからなる第二のポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
本発明の更なる視点によれば、少なくとも三つのポリヌクレオチドのセットを含むキットであって、前記三つのポリヌクレオチドのセットは、下記三つのプライマー配列のセットの一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するキットが提供される：
配列番号１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号３２と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７５と配列番号７６。例えば、前記三つのポリヌクレオチドのセットは、配列番号１の最後の６ヌクレオチドからなる第一のポリヌクレオチド、配列番号１０の最後の６ヌクレオチドからなる第二のポリヌクレオチド及び配列番号１５の最後の６ヌクレオチドからなる第三のポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
好都合なことには、前記キット中のポリヌクレオチドは、前記したのと同様である。
【００２６】
好ましくは、前記キットは、更に、ヌクレオチド三リン酸、重合酵素及び／又はバッファ溶液を含む。
【００２７】
本発明の別の視点によれば、少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルにおける変異を検出するための、前記したポリヌクレオチド或いは前記したキット；又は配列番号１〜１８、２１〜４５若しくは７４〜７７の最後の６ヌクレオチドの４又は５、又はこれと相補的な配列を含むことに特徴を有するポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２８】
有利には、前記核酸サンプル中のＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、更に好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長である。
【００２９】
本発明の更なる視点によれば、下記工程を含むことに特徴を有するＥＧＦＲ遺伝子における変異の存在又は不存在を検出する方法が提供される：
ａ）少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルを、前記ＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントの１つの領域と相補的なポリヌクレオチドと混合する工程；及び
ｂ）変異の存在又は不存在を示す前記ポリヌクレオチドの前記核酸サンプルへのハイブリダイゼーションを検出し、ハイブリダイゼーションによって変異の存在又は不存在が示される工程。
【００３０】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、前記したポリヌクレオチドであり、かつ配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み、そして工程ｂ）は変異の存在を示す。
【００３１】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、前記したポリヌクレオチドであり、配列番号１０〜１４、２３、３５〜４０若しくは７４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み；そして工程ｂ）は変異の不存在を示す。
【００３２】
好都合なことには、前記方法は、更に、工程ａ）より前に、熱サイクリング核酸増幅（thermal cycling nucleic acid amplification）、好ましくはＰＣＲを用いてＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を増幅する工程を含む。
【００３３】
好ましくは、工程ｂ）は、前記ポリヌクレオチドを第一のプライマーとして用いてＤＮＡ重合を行うこと及び重合の伸長産物を検出することを含む。
【００３４】
有利には、工程ｂ）は、前記核酸サンプル及びポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドが相補的である領域の下流のＥＧＦＲ配列のフラグメントの領域に対応する第二のプライマーと混合する工程並びに前記混合物についてＰＣＲを行う工程を含む。
【００３５】
好都合なことには、前記第二のプライマーは：
配列番号１５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号１〜５、１０、１１若しくは２１の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号６若しくは１２の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１７を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７若しくは１３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１８を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号８、９若しくは１４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号２４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２２若しくは２３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４１を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２５〜２８、３３、３５若しくは３６の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４２を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２９若しくは３７の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４３を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３０〜３８の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３１、３２若しくは３９の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３４若しくは４０の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；或いは
配列番号７６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含む。
【００３６】
好ましくは、工程ａ）は、核酸サンプルを、変異特異的なポリヌクレオチドと野生型特異的なポリヌクレオチドとのペアと混合する工程を含み、前記ペアは、下記配列の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５の中から選択される：
配列番号１と配列番号１０、又は配列番号２と配列番号１０、又は配列番号３と配列番号１０、又は配列番号４と配列番号１１、又は配列番号５と配列番号１１、又は配列番号６と配列番号１２、又は配列番号７と配列番号１３、又は配列番号８と配列番号１４、又は配列番号９と配列番号１４、又は配列番号２１と配列番号１０、又は配列番号２２と配列番号２３、又は配列番号２５と配列番号３５、又は配列番号２６と配列番号３５、又は配列番号２７と配列番号３６、又は配列番号２８と配列番号３６、又は配列番号２９と配列番号３７、又は配列番号３０と配列番号３８、又は配列番号３１と配列番号３９、又は配列番号３２と配列番号３９、又は配列番号３３と配列番号３５、又は配列番号３４と配列番号４０、又は配列番号７４と配列番号７５。
【００３７】
有利には、前記核酸サンプルは、野生型の配列と変異した配列を含み、前記方法は、更に、前記野生型の配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数を、前記変異した配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数と比較し、それによってサンプル中の野生型の配列と変異した配列の比を示す工程ｃ）を含む。
【００３８】
好都合なことには、前記核酸サンプルは、腫瘍組織の一部及び非腫瘍組織の一部を含み、工程ｃ）は、更に、サンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を決定する工程を含む。
【００３９】
好ましくは、前記方法は、更に、工程ａ）より前に、前記核酸サンプルを濃縮してサンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を増加させる工程を含む。
【００４０】
好ましくは、工程ｂ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも一部の増幅が起こるかどうかを検出することを含む。
【００４１】
有利には、前記ポリヌクレオチドは、消光基及び蛍光基を含み、工程ｂ）は、混合物に対して、蛍光体が消光基の不存在の際に応答する波長の光を当てること及び消光基の不存在の際に蛍光基によって発せられる波長の光を検出することを含む。
【００４２】
本明細書において、参照配列の「最後の６ヌクレオチド（at four or five of the final six sequences）の少なくとも４又は５」について言及している場合には、これは、参照配列の６つのヌクレオチドのうち１つ又は２つのヌクレオチドが欠落しているか又は異なるヌクレオチドと置換されていてもよいという意味である。当然、いくつかの形態では、配列は、前記参照配列の６つのヌクレオチド全てを含む。
【００４３】
本発明の好ましい形態では、「ＥＧＦＲ」についての言及は、２００６年３月３０日付ヒト染色体７（Homo sapiens chromosome 7）、領域５５０５４２１９..５５２４２５２５で受入番号ＮＣ＿０００００７として入手できるヒトＥＧＦＲ遺伝子についてなされうる。いくつかの他の形態では、言及は、２００５年３月４日付のものについてなされうる。配列は、両方とも参照により本願に組み入れられる。いくつかの形態では、前記ＥＧＦＲ遺伝子は、これらの配列と同一ではないが、それらの配列のいずれか又は両方と少なくとも９０％同一である。
【００４４】
本明細書において、参照ポリヌクレオチドと比較したポリヌクレオチドの割合が言及されるが、これは公知のアルゴリズムによって測定されうる。
【００４５】
例えば、二つの配列間における同一性の割合を、既定パラメータを用いるＢＬＡＳＴＰアルゴリズム バージョン２．２．２（Altschul、Stephen F.、Thomas L. Madden、Alejandro A. Schaeffer、Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller、及びDavid J. Lipman（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代の蛋白質データベース検索プログラム（Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２））を用いて測定することができる。
【詳細な説明】
【００４６】
ここで、本発明がより容易に理解され、その結果その更なる特徴が理解されるように、本発明の実施形態が、実施例により、添付した図を参照して記載される。
【００４７】
大まかに言えば、本発明は、癌におけるＥＧＦＲ変異の検出の診断方法であって、核酸のテストサンプルをＥＧＦＲ変異の診断用プライマーと適当なヌクレオチド三リン酸及び重合剤の存在下において、ＥＧＦＲ変異体が前記サンプル中に存在するときにのみ前記診断用プライマーが有効に伸長されるように、接触させること；並びに診断用プライマーの伸長産物の存在又は不存在を基準にしてＥＧＦＲ変異体の存在又は不存在を検出することを含む方法を提供する。
【００４８】
本願には、本発明の方法において使用することができるプライマー（配列番号１〜９、２１、２２、及び７５）が開示されている。
【００４９】
診断用プライマーのそれぞれによって、下記ＥＧＦＲ変異体の一つの存在又は不存在が検出される：
１）ｄｅｌ Ｅ７４６−Ａ７５０（二つの異なる変異体が存在）
２）ｄｅｌ Ｌ７４７−Ｔ７５１ ｉｎｓＳ
３）ｄｅｌ Ｌ７４７−Ｐ７５３ ｉｎｓＳ
４）ｄｅｌ Ｓ７５２−Ｉ７５９
５）Ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８５８Ｒ
６）Ｅｘｏｎ ２１ Ｌ８６１Ｑ
７）Ｅｘｏｎ １８ Ｇ７１９Ｃ
８）Ｅｘｏｎ １８ Ｇ７１９Ｓ
９）Ｅｘｏｎ ２０ Ｔ７９０Ｍ
【００５０】
変異体１）〜８）は、個体のゲフィニチブに対する感受性を与えるのに対して、変異体９）は、ゲフィニチブに対する抵抗性を与える。
【００５１】
いくつかの形態において、逆ＤＮＡ鎖（opposite DNA strand）に対応する変異体に特異的な診断用プライマーが使用される（配列番号２５〜３４）。
【００５２】
前記核酸のテストサンプルは、簡便には、血液、糞便、痰、結腸洗浄（colonic lavage）、気管支洗浄（bronchial lavage）又はその他の体液、或いは個体から得られる組織のサンプルである。前記個体は、簡便には、ヒト、好ましくは学術的なヒト（Homo sapiens）である。前記テストサンプルは、そのテストサンプルにおける配列に対応する核酸配列と同等であってもよいと理解されるであろう。即ち、核酸サンプルにおける領域の全部又は一部は、本発明の方法において使用される前に、先ず、ＰＣＲや全ゲノム増幅法（whole genome amplification）（ＷＧＡ）等のいくつかの簡便な技術を用いて増幅されてもよい。
【００５３】
ＤＮＡポリメラーゼが正常鋳型（テンプレート）配列と変異鋳型配列とを識別する能力にある程度までは影響を与えないという条件で、重合のためいくつかの適切な酵素が使用されてもよい。適切な酵素の例には、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を全く有しない熱安定性の酵素、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、特に「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ」（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、又はその他のＴａｑ若しくはＴｔｈ（高度好熱菌（Thermus thermophilus））ＤＮＡポリメラーゼの適当にＮ末端除去した修飾体（appropriately N-terminal deleted modification）が含まれる。
【００５４】
本書において、特定の変異体を確実に、かつ頑強に検出するため示されている上記ＥＧＦＲ点変異体のためのプライマーが開示されている。したがって、本発明の更なる視点では、本発明者らは、配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４又は７５及びその誘導体を含み、３’末端で６〜８のヌクレオチドが前記配列と同一であり、８、６、４、２、１まで等、１０までの残りのヌクレオチドが、診断用プライマーの特性に著しく影響を与えることなしに任意に変更される診断用プライマーを提供する。好都合なことには、前記診断用プライマーの配列は、ちょうど配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４又は７５の何れかで示されるようなものである。
【００５５】
上記した診断方法の代わりのバージョンは、前記診断用プライマーの伸長によってＥＧＦＲ変異体の非存在が示されるように構成されると理解されるであろう。例えば、特定の形態では、前記プライマーは、配列番号１０〜１４、２３又は７４の何れかの３’末端から６〜８ヌクレオチドを含む。いくつかの形態では、相補ＤＮＡ鎖の対応する切片を示す野生型配列に特異的なプライマーが使用される（配列番号３５〜４０）。
【００５６】
多くの形態では、１以上のサイクルのＰＣＲ増幅において本発明の診断用プライマーを更に増幅プライマーと併用することが適切である。この視点の適切な例が、欧州特許出願公開第０３３２４３５号（EP-A-0332435）に記載されている。更なる増幅プライマーは、順方向共通プライマー又は逆方向共通プライマーである。そのような共通プライマーの例は、相補鎖用プライマーと併用されうる配列番号１５〜１８、２４及び７６、並びに配列番号４１〜４５である。
【００５７】
任意の適切なコントロールプライマー対が使用されてもよい。ゲノムの無関係の領域からのコントロールプライマー、即ちヒトアルブミン遺伝子の一部が本願において使用される。
【００５８】
先に概説した本発明の診断方法は、いくつかの形態において１以上の反応容器中で簡便に実施される。１を超える診断用変異体が測定されうる場合には、前記診断用プライマー（及び対応する増幅プライマー）は、個々の管、即ちある一定の形態では変異体毎に一つの管に供給される。これに代えて、これらの反応液は、複合化される、即ち他の形態では全ての診断用プライマー及び増幅プライマーが一つの管の中にある（欧州特許出願公開第０３３２４３５号参照）。
【００５９】
各種の方法は、診断用プライマー伸長産物及び／又は増幅産物の存在或いは不存在を検出するために使用されてもよい。これらは、核酸検出処理の技術分野において通常の知識を有する者に明確に理解できるであろう。好ましい方法は、放射標識試薬を必要としない。特定の検出方法は、例えば米国特許第５４８７９７２号及び米国特許第５２１００１５号；Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（国際公開第９９／０６６０７１号（WO-A-99/066071））に記載されたような、特定の診断用プライマーは、ゲノムの同一の領域から多数の変異体の標的を検出することを可能にするとき、特定のディテクター蛍光体（detector fluorophore）に結合されうるため、特定の利点がある「ＴａｑＭａｎ」（登録商標）産物の検出を含む。
【００６０】
好都合なことには、サンプル中の変異体（又は複数の変異体）の定量を可能にするリアルタイム検出が用いられる。より具体的には、野生型の配列に特異的なプライマーを用いて所定のレベルまでＤＮＡサンプルを増幅するのに必要とされるサイクル数が、変異体の配列に特異的なプライマーを用いて必要とされるサイクル数と比較される。この比較を使用して、更に標準化された割合の変異体の標的を含むコントロールの増幅物を基準として、野生型ＤＮＡの量に対する変異体を含むサンプル中のＤＮＡの量の比が定量される。当然、これは与えられているサンプルとの関連を示すだけであり、サンプル中の腫瘍の提示が低いことを補償しない。このため、この定量対立遺伝子特異的アプローチ（quantitative allele specific approach）を、サンプル中の腫瘍のレベルを測定する方法と組み合わせることが好ましい。これに代えて、定量対立遺伝子特異的アプローチが、全サンプルから腫瘍材料を特異的に切除することによりサンプルを濃縮する方法と組み合わされる。
【００６１】
いくつかの形態において、本発明の診断用プライマーは、本発明の方法について使用するための指示書及び適当な梱包材料と共に適切に包装され、キットとして販売される。前記キットは、下記のうち１以上を含む：適当なヌクレオチド三リン酸、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、先に記載したようなポリメラーゼ、及びバッファ溶液。
【００６２】
ここで、本発明を、下記の実施例を参照して、詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００６３】
材料及び方法
【００６４】
合成テンプレートの構築
変異体のそれぞれを保有する確認された均一のゲノム材料がないので、合成テンプレートを構築することが必要であった。ＥＧＦＲ欠失テストのため、それぞれが約半分の目的単位複製配列を含む長い合成重複オリゴヌクレオチド（long synthetic overlapping oligonucleotide）を用いて合成テンプレートを構築した。これらの長いオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。
【００６５】
表１
【００６６】
標的を作成するため、二つの重複１／２単位複製配列を、等モル濃度で、ポリメラーゼ、バッファ及びｄＮＴＰｓの存在下、混合した。その後プライマーミックスを添加し、５０℃〜７５℃まで１サイクル毎に１℃上昇させてそれぞれ１分間の２５サイクルとしてインキュベーションした。ＰＣＲ反応においてコントロールとして使用するため、合成テンプレートをゲノムＤＮＡ中に百万分の一希釈した。
【００６７】
ＳＮＰテストのために、合成カセット（synthetic cassette）を、ＰＣＲを用いて作成して、必要とされる変異を二つのハーフカセット（half cassette）に組み入れた。その後ハーフカセットを、等モル濃度で混合し、必要とされるＳＮＰ標的変異体を含む完全長カセットの作成用テンプレートとして使用した。カセット作成用の特定のプライマー配列を、図２に示す。
【００６８】
表２
【００６９】
変異体特異的ＰＣＲ（Variant Specific PCR）
各ＡＲＭＳ反応及びコントロール用の特定のプライマー配列を、表３及び４に示す。
【００７０】
反応を、０．２ｍｌ容器中で行った（単一チューブ、条片（strip）又はプレート）。反応液（２５μｌ）は、典型的に以下のものを含有していた：
・２５０ｎＭ 診断用プライマー
・２５０ｎＭ 逆方向プライマー
・２５０ｎＭ それぞれのコントロールプライマー（使用される場合）
・２００μＭ 各ｄＮＴＰ
・１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
・５０ｍＭ ＫＣｌ
・２．５〜４ｍＭ ＭｇＣｌ２
【００７１】
いくつかの反応を、硫酸アンモニウム、ＭｇＣｌ２、並びにポリ（エチレングリコール）分子量８０００、及び／又はデキストラン（分子量５０，０００）体積防除剤（volume excluder）の独自の混合物を含むＱｉａｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファの存在下で良好に行った；米国特許２００４−０１１５７１２号を参照されたい。
【００７２】
リアルタイム定量ＰＣＲ（Real Time Quantitative PCR）のために、ＹＯ−ＰＲＯ−１（モレキュラー・プローブ（Molecular Probes））を、１μＭの最終濃度で含有させた。この色素は、二本鎖ＤＮＡに結合し、高効率で蛍光を発し、その結果、この色素によって、反応においてＰＣＲ産物の大まかな検出が可能となる。これに代えて、より好ましくは、発明者らは、標的単位複製配列を特異的に検出することを可能にするＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（プライマーと蛍光プローブを結合させる分子）を用いた。
【００７３】
表３
【００７４】
表４
【００７５】
ＰＣＲを、下記条件を用いてリアルタイムＰＣＲサイクル（ストラタジーン（Stratagene）製のＭｘ４０００及びＭｘ３０００Ｐ）で行った：
ホットスタート用酵素（hot-start emzyme）を活性化させるため９５℃１０〜１５分間、次いで９５℃、６０秒、６５℃、６０秒−欠失テスト５０サイクルまで。
ＳＮＰテストのため、アニーリング／伸長ステップを、６０℃、６０秒間に変更した。
【００７６】
抽出したＤＮＡの測定
各腫瘍サンプルから抽出したＤＮＡの量を、コントロール部位（control locus）のリアルタイム増幅によって測定した。この反応の標準曲線を、既知濃度の株化細胞（ＥＣＡＣＣ、ウィルトシア、ＵＫ）から抽出した高品質ＤＮＡを用いて作成した。
【００７７】
コントロール及び陽性サンプルの配列決定
エクソン特異的プライマーから生成した単位複製配列について、配列決定を、ｂｉｇ−ｄｙｅターミネーターを用いて標準サイクル配列決定（standard cycle sequencing）によって行った。反応液を、ＡＢＩキャピラリー配列決定装置を用いてメーカーの指示書に従って分離した。
【００７８】
結果及び考察
【００７９】
ＡＲＭＳ試験の改良及び変更
欠失及びＳＮＰのそれぞれに特異的なＡＲＭＳ試験を、下記に対してテストした：
１．「正常」ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）
２．ミスマッチ合成標的
３．バッファで希釈した合成標的
４．ｇＤＮＡで希釈した合成標的（腫瘍の状態を模倣するため）
５．テンプレートなし（テンプレートの代わりに水）
【００８０】
反応液に、蛍光ＤＮＡ結合色素ＹＯ−ＰＲＯ−１を含有させ、これを、リアルタイムでモニターした。そのような反応液において、ベースライン上に増幅が現れる点（Ｃｔとして知られている）は、標的の量の指標である。
【００８１】
同一の変異体に特異的であるが相補ＤＮＡ鎖の一つであるプライマーも開発されており、これらを、表５及び６に示す。
【００８２】
表５
【００８３】
表６
【実施例】
【００８４】
実施例１
変異特異的プライマーＥＧＦＲ Ｄｅｌ １２を、適正合成標的（matched synthetic target）及び三つのミスマッチ変異合成標的（mismatched mutant synthetic target）（ｄｅｌ １５（１）、ｄｅｌ １８及びｄｅｌ ２４）についてテストし、加えて、正常ＤＮＡ及び水コントロールをテストした。それらの結果を、図１に示す。
【００８５】
この反応においてプライマーは、独自の標的に対する絶対的な特異性を示し、そのプライマーによって野生型配列もその遺伝子領域で見出される如何なる他の欠失変異体も検出されないということは明らかである。
【００８６】
実施例２ 腫瘍サンプルへのＡＲＭＳ試験の使用
非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer）及び株化細胞からの４２のＤＮＡサンプルを、変異特異的プライマー配列１〜９のそれぞれを用いて分析した。腫瘍ＤＮＡは、スライド上のパラフィン包理組織から採取した。
【００８７】
多数のサンプルは、この方法を用いて陽性であることが分かった：Ｌ８５８Ｒ ＳＮＰについて９つ及び１５の塩基対欠失ｄｅｌ ７４６−Ａ７５０について１つ。
【００８８】
推定変異の周辺領域について、確認的な配列決定を行った。
【００８９】
図２は、ｄｅｌ Ｓ７５２−Ｉ７５９特異的プライマーについてテストした８つのサンプル群の典型的な陰性の結果を示す。変異特異的プライマー（配列番号５）は増幅しないのでこれらのサンプル中にこの変異体が存在しないことを示すが、野生型の特異的反応は遂行するということは明らかである。
【００９０】
図３は、８つの陽性サンプルのＬ８５８Ｒ分析を示す。それぞれの場合において、変異プライマー（配列番号６）を用いる反応は、野生型の反応と同様、陽性であった。変異の反応は対応する野生型の反応よりも遅い数サイクルで生じるという事実によって、変異体がサンプルにおいて大部分の配列ではないということが示される。
【００９１】
図４は、このサンプルからの同一のエクソンの配列決定と組み合わせた対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析のより詳細な分析を示す。このサンプルにおいて、配列決定アプローチによっては、ＡＲＭＳアプローチにより明らかに同定される変異体を検出できないであろう（丸で囲んだ部分にはピークは全く認められない）。
【００９２】
図５は、このサンプルからの同一のエクソンの配列決定と組み合わせた対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析のより詳細な分析を示す。このサンプルにおいて、配列決定アプローチよって、ＡＲＭＳアプローチにより明らかに同定される変異体を検出することができた（丸で囲んだ部分に、かなり弱いピークが認められる）。分析が図４において示されているサンプルにおいて、変異が比較的に、より蔓延していることを示したので、このサンプルにおいて、野生型の特異的反応と変異の特異的反応との差（ΔＣｔ）は、より小さかった。
【００９３】
実施例３
図６は、Ｔ７９０Ｍ変異を有するＤＮＡを含むサンプル、及びＴ７９０Ｍ変異を有しないＤＮＡを含むサンプルのＰＣＲ増幅の結果を示す。Ｔ７９０Ｍ変異を有するＤＮＡを０％、１％、１０％、５０％又は１００％含む５つのサンプルを用意した。サンプルを、配列番号７５の変異プライマー及び配列番号７６及び７７のリバースＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーを用いて増幅した。結果として、変異を有するＤＮＡを全く含まないサンプルは全く増幅を示さなかったことから、変異プライマーはＴ７８０Ｍ変異を有するＤＮＡに特異的であったということが示される。更に、検出は、過剰なミスマッチ標的の存在下であっても、Ｃｔ（閾サイクル（threshold cycle））は適正標的の相対量に直接関係するという点で定量的であることが示された。
【００９４】
図７は、図６においてテスト・報告したサンプルについて行われたコントロールアッセイの結果を示す。ＰＣＲ増幅を、コントロールプライマーを用いて行った。図７によって、各サンプルについての閾サイクルがこのコントロール増幅において同一であったことから、各サンプルは同一総量の標的を含むことが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、本発明のプライマー及びコントロールのプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２】図２は、ｄｅｌ Ｓ７５２−１７５９（配列番号５）に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図３】図３は、Ｌ８５８Ｒ変異体（配列番号６）に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図４】図４は、変異体に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図（上部）、並びにそのサンプルの配列決定の結果を示す図（下部）である。
【図５】図５は、変異体に特異的なプライマー及び対応する野生型特異的なプライマーの存在下においてサンプルについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図（上部）、並びにそのサンプルの配列決定の結果を示す図（下部）である。
【図６】図６は、変異体に特異的なプライマーの存在下において、サンプルのセットについて行われたＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図７】図７は、図６において示した結果について分析されたサンプルの、コントロールのプライマーを用いるＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記プライマー配列の一つの少なくとも最後の６ヌクレオチド、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長よりも小さい、好ましくは８０ヌクレオチド長よりも小さい、より好ましくは６０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは４０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは３０ヌクレオチド長よりも小さい請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記プライマー配列の一つの最後の８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２０ヌクレオチド又はその全部の少なくとも７５％、又はこれと相補的な配列を含む請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【請求項４】
更に、消光基及び蛍光基を含む請求項１〜３の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記消光基と前記蛍光基とは、第一及び第二領域を含むヌクレオチド尾部配列によって隔てられ、前記第一領域のヌクレオチドは、前記第二領域のヌクレオチドと相補的であるが前記第二領域のヌクレオチドとは逆向きの配列であり、前記第一領域の前記第二領域とのハイブリダイゼーションによって前記消光基は、前記蛍光基を消光できる前記蛍光基の十分近くにあるようになされる請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記尾部配列は、更にＥＧＦＲ遺伝子の領域に相補的な配列を有する第三の領域を含む請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号３又は１０の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号１９を含む請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号６又は１２の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号２０を含む請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号７６の最後の６ヌクレオチドを少なくとも含み、前記尾部配列が、配列番号７７を含む請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記消光基は、ブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）を含み、前記蛍光基は、ＦＡＭを含む請求項４〜９の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記消光基は、ブラックホールクエンチャー２（ＢＨＱ２）を含み、前記蛍光基は、Ｃａｌ Ｒｅｄを含む請求項４〜９の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
少なくとも一組のポリヌクレオチドを含むキットであって、前記一組のポリヌクレオチドは、下記組のプライマー配列の一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするキット：
配列番号１と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１８、又は配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２４、又は配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４５、又は配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号３７と配列番号４２、又は配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７６、又は配列番号７５と配列番号７６。
【請求項１３】
前記一組のポリヌクレオチドは、請求項１〜１１の何れかに記載のそれぞれのポリヌクレオチドからなる請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
少なくとも三つのポリヌクレオチドのセットを含むキットであって、前記三つのポリヌクレオチドのセットは、下記三つのプライマー配列のセットの一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするキット：
配列番号１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号３２と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７５と配列番号７６。
【請求項１５】
前記三つのポリヌクレオチドのセットは、請求項１〜１１の何れかに記載のそれぞれのポリヌクレオチドからなる請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
更に、ヌクレオチド三リン酸、重合酵素及び／又はバッファ溶液を含む請求項１２〜１５の何れかに記載のキット。
【請求項１７】
少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルにおける変異を検出するための、請求項１〜１１の何れかに記載のポリヌクレオチド或いは請求項１２〜１５の何れかに記載のキット；又は配列番号１〜１８、２１〜４５若しくは７４〜７７の最後の６ヌクレオチドの４又は５、又はこれと相補的な配列を含むポリヌクレオチドの使用。
【請求項１８】
前記核酸サンプル中のＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、更に好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
下記工程を含むことを特徴とするＥＧＦＲ遺伝子における変異の存在又は不存在を検出する方法：
ａ）少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルを、前記ＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントの１つの領域と相補的なポリヌクレオチドと混合する工程；及び
ｂ）前記ポリヌクレオチドの前記核酸サンプルとのハイブリダイゼーションを検出し、ハイブリダイゼーションによって変異の存在又は不存在が示される工程。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドは、請求項１〜１０の何れかに記載のポリヌクレオチドであり、かつ配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み、そして工程ｂ）は変異の存在を示す請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドは、請求項１〜１０の何れかに記載のポリヌクレオチドであり、配列番号１０〜１４、２３、３５〜４０若しくは７４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み；そして工程ｂ）は変異の不存在を示す請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
更に、工程ａ）より前に、熱サイクリング核酸増幅、好ましくはＰＣＲを用いてＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を増幅する工程を含む請求項１９〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
工程ｂ）は、前記ポリヌクレオチドを第一のプライマーとして用いてＤＮＡ重合を行うこと、及び重合の伸長産物を検出することを含む請求項１９〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
工程ｂ）は、前記核酸サンプル及びポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドが相補的である領域の下流のＥＧＦＲ配列のフラグメントの領域に対応する第二のプライマーと混合する工程並びに前記混合物についてＰＣＲを行う工程を含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第二のプライマーは：
配列番号１５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号１〜５、１０、１１若しくは２１の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号６若しくは１２の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１７を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７若しくは１３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１８を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号８、９若しくは１４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号２４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２２若しくは２３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４１を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２５〜２８、３３、３５若しくは３６の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４２を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２９若しくは３７の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４３を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３０〜３８の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３１、３２若しくは３９の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３４若しくは４０の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；或いは
配列番号７６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含む
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）は、核酸サンプルを、変異特異的なポリヌクレオチドと野生型特異的なポリヌクレオチドとのペアと混合する工程を含み、前記ペアは、下記配列の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５から選択される請求項２３に記載の方法：
配列番号１と配列番号１０、又は配列番号２と配列番号１０、又は配列番号３と配列番号１０、又は配列番号４と配列番号１１、又は配列番号５と配列番号１１、又は配列番号６と配列番号１２、又は配列番号７と配列番号１３、又は配列番号８と配列番号１４、又は配列番号９と配列番号１４、又は配列番号２１と配列番号１０、又は配列番号２２と配列番号２３、又は配列番号２５と配列番号３５、又は配列番号２６と配列番号３５、又は配列番号２７と配列番号３６、又は配列番号２８と配列番号３６、又は配列番号２９と配列番号３７、又は配列番号３０と配列番号３８、又は配列番号３１と配列番号３９、又は配列番号３２と配列番号３９、又は配列番号３３と配列番号３５、又は配列番号３４と配列番号４０、又は配列番号７４と配列番号７５。
【請求項２７】
前記核酸サンプルは、野生型の配列と変異した配列を含み、前記方法は、更に、前記野生型の配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数を、前記変異した配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数と比較し、それによってサンプル中の野生型の配列と変異した配列の比を規定する工程ｃ）を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸サンプルは、腫瘍組織の一部及び非腫瘍組織の一部を含み、工程ｃ）は、更に、サンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を決定する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
更に、工程ａ）より前に、前記核酸サンプルを濃縮してサンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を増加させる工程を含む請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｂ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも一部の増幅が起こるかどうかを検出することを含む請求項２４〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドは、消光基及び蛍光基を含み、工程ｂ）は、混合物に対して、蛍光体が消光基の不存在の際に応答する波長の光を当てること及び消光基の不存在の際に蛍光基によって発せられる波長の光を検出することを含む請求項１９〜３０の何れかに記載の方法。
【請求項１】
下記プライマー配列の一つの少なくとも最後の６ヌクレオチド、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長よりも小さい、好ましくは８０ヌクレオチド長よりも小さい、より好ましくは６０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは４０ヌクレオチド長よりも小さい、更に好ましくは３０ヌクレオチド長よりも小さい請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記プライマー配列の一つの最後の８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２０ヌクレオチド又はその全部の少なくとも７５％、又はこれと相補的な配列を含む請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド：
配列番号１〜１８、２１〜４５又は７４〜７７。
【請求項４】
更に、消光基及び蛍光基を含む請求項１〜３の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記消光基と前記蛍光基とは、第一及び第二領域を含むヌクレオチド尾部配列によって隔てられ、前記第一領域のヌクレオチドは、前記第二領域のヌクレオチドと相補的であるが前記第二領域のヌクレオチドとは逆向きの配列であり、前記第一領域の前記第二領域とのハイブリダイゼーションによって前記消光基は、前記蛍光基を消光できる前記蛍光基の十分近くにあるようになされる請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記尾部配列は、更にＥＧＦＲ遺伝子の領域に相補的な配列を有する第三の領域を含む請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号３又は１０の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号１９を含む請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号６又は１２の少なくとも最後の６ヌクレオチドを含み、前記尾部配列が、配列番号２０を含む請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号７６の最後の６ヌクレオチドを少なくとも含み、前記尾部配列が、配列番号７７を含む請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記消光基は、ブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）を含み、前記蛍光基は、ＦＡＭを含む請求項４〜９の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記消光基は、ブラックホールクエンチャー２（ＢＨＱ２）を含み、前記蛍光基は、Ｃａｌ Ｒｅｄを含む請求項４〜９の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
少なくとも一組のポリヌクレオチドを含むキットであって、前記一組のポリヌクレオチドは、下記組のプライマー配列の一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするキット：
配列番号１と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１８、又は配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２４、又は配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４５、又は配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号３７と配列番号４２、又は配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７６、又は配列番号７５と配列番号７６。
【請求項１３】
前記一組のポリヌクレオチドは、請求項１〜１１の何れかに記載のそれぞれのポリヌクレオチドからなる請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
少なくとも三つのポリヌクレオチドのセットを含むキットであって、前記三つのポリヌクレオチドのセットは、下記三つのプライマー配列のセットの一つの最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５のそれぞれ、又はこれと相補的な配列を含むことを特徴とするキット：
配列番号１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号３と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号４と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号５と配列番号１１と配列番号１５、又は配列番号６と配列番号１２と配列番号１６、又は配列番号７と配列番号１３と配列番号１７、又は配列番号８と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号９と配列番号１４と配列番号１８、又は配列番号２１と配列番号１０と配列番号１５、又は配列番号２２と配列番号２３と配列番号２４、又は配列番号２５と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２６と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号２７と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２８と配列番号３６と配列番号４１、又は配列番号２９と配列番号３２と配列番号４２、又は配列番号３０と配列番号３８と配列番号４３、又は配列番号３１と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３２と配列番号３９と配列番号４４、又は配列番号３３と配列番号３５と配列番号４１、又は配列番号３４と配列番号４０と配列番号４５、又は配列番号７４と配列番号７５と配列番号７６。
【請求項１５】
前記三つのポリヌクレオチドのセットは、請求項１〜１１の何れかに記載のそれぞれのポリヌクレオチドからなる請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
更に、ヌクレオチド三リン酸、重合酵素及び／又はバッファ溶液を含む請求項１２〜１５の何れかに記載のキット。
【請求項１７】
少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルにおける変異を検出するための、請求項１〜１１の何れかに記載のポリヌクレオチド或いは請求項１２〜１５の何れかに記載のキット；又は配列番号１〜１８、２１〜４５若しくは７４〜７７の最後の６ヌクレオチドの４又は５、又はこれと相補的な配列を含むポリヌクレオチドの使用。
【請求項１８】
前記核酸サンプル中のＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、更に好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
下記工程を含むことを特徴とするＥＧＦＲ遺伝子における変異の存在又は不存在を検出する方法：
ａ）少なくともＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントを含む核酸サンプルを、前記ＥＧＦＲ遺伝子のフラグメントの１つの領域と相補的なポリヌクレオチドと混合する工程；及び
ｂ）前記ポリヌクレオチドの前記核酸サンプルとのハイブリダイゼーションを検出し、ハイブリダイゼーションによって変異の存在又は不存在が示される工程。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドは、請求項１〜１０の何れかに記載のポリヌクレオチドであり、かつ配列番号１〜９、２１、２２、２５〜３４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み、そして工程ｂ）は変異の存在を示す請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドは、請求項１〜１０の何れかに記載のポリヌクレオチドであり、配列番号１０〜１４、２３、３５〜４０若しくは７４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５、又はこれと相補的な配列を含み；そして工程ｂ）は変異の不存在を示す請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
更に、工程ａ）より前に、熱サイクリング核酸増幅、好ましくはＰＣＲを用いてＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を増幅する工程を含む請求項１９〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
工程ｂ）は、前記ポリヌクレオチドを第一のプライマーとして用いてＤＮＡ重合を行うこと、及び重合の伸長産物を検出することを含む請求項１９〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
工程ｂ）は、前記核酸サンプル及びポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドが相補的である領域の下流のＥＧＦＲ配列のフラグメントの領域に対応する第二のプライマーと混合する工程並びに前記混合物についてＰＣＲを行う工程を含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第二のプライマーは：
配列番号１５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号１〜５、１０、１１若しくは２１の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号６若しくは１２の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１７を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７若しくは１３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号１８を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号８、９若しくは１４の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号２４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２２若しくは２３の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４１を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２５〜２８、３３、３５若しくは３６の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４２を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号２９若しくは３７の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４３を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３０〜３８の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４４を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３１、３２若しくは３９の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；
配列番号４５を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号３４若しくは４０の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含むか；或いは
配列番号７６を含み、かつポリヌクレオチドは配列番号７４若しくは７５の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５を含む
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）は、核酸サンプルを、変異特異的なポリヌクレオチドと野生型特異的なポリヌクレオチドとのペアと混合する工程を含み、前記ペアは、下記配列の最後の６ヌクレオチドの少なくとも４又は５から選択される請求項２３に記載の方法：
配列番号１と配列番号１０、又は配列番号２と配列番号１０、又は配列番号３と配列番号１０、又は配列番号４と配列番号１１、又は配列番号５と配列番号１１、又は配列番号６と配列番号１２、又は配列番号７と配列番号１３、又は配列番号８と配列番号１４、又は配列番号９と配列番号１４、又は配列番号２１と配列番号１０、又は配列番号２２と配列番号２３、又は配列番号２５と配列番号３５、又は配列番号２６と配列番号３５、又は配列番号２７と配列番号３６、又は配列番号２８と配列番号３６、又は配列番号２９と配列番号３７、又は配列番号３０と配列番号３８、又は配列番号３１と配列番号３９、又は配列番号３２と配列番号３９、又は配列番号３３と配列番号３５、又は配列番号３４と配列番号４０、又は配列番号７４と配列番号７５。
【請求項２７】
前記核酸サンプルは、野生型の配列と変異した配列を含み、前記方法は、更に、前記野生型の配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数を、前記変異した配列を所定量まで増幅するのに必要とされる増幅サイクル数と比較し、それによってサンプル中の野生型の配列と変異した配列の比を規定する工程ｃ）を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸サンプルは、腫瘍組織の一部及び非腫瘍組織の一部を含み、工程ｃ）は、更に、サンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を決定する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
更に、工程ａ）より前に、前記核酸サンプルを濃縮してサンプル中の非腫瘍組織に対する腫瘍組織の比を増加させる工程を含む請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｂ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも一部の増幅が起こるかどうかを検出することを含む請求項２４〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドは、消光基及び蛍光基を含み、工程ｂ）は、混合物に対して、蛍光体が消光基の不存在の際に応答する波長の光を当てること及び消光基の不存在の際に蛍光基によって発せられる波長の光を検出することを含む請求項１９〜３０の何れかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５３４０２５（Ｐ２００８−５３４０２５Ａ）
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０４８３８（Ｐ２００８−５０４８３８）
【出願日】平成１８年４月４日（２００６．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０６３１６
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０２３１０８５２）ディー・エックス・エス・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月４日（２００６．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０６３１６
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０２３１０８５２）ディー・エックス・エス・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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