ポリフェノール含有植物材料の修飾方法および修飾型ポリフェノール含有植物材料の医療向け使用
本発明は、１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を修飾するための方法であって、少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒を混合して混合物を提供するステップと；混合物を加熱して、存在する細菌種を除去し、加熱混合物を提供するステップと；少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株および任意には少なくとも１つのタンパク質源を、加熱混合物に対し任意の順序でまたは同時に添加して発酵混合物を提供するステップと；発酵混合物の発酵に適した条件に発酵混合物を付して１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと；ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を任意に除去して、生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップとを含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料の修飾方法および、１つまたは複数の異なる修飾型ポリフェノール含有植物材料の新規医療向け使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
世界保健機構（ＷＨＯ）は、２型糖尿病患者が２０２５年には３億人（現在の人口の約５％）になると予測している。これはすなわち、人口のかなりの部分がメタボリック症候群などのさまざまな代謝障害に罹患することを意味している。「メタボリック症候群」という用語は、臨床診断および定義の両面で大いに議論されてきた。とはいえこの用語は、２型糖尿病および心臓血管疾患を発生させるリスクの高い対象を特定する一群の警告的代謝性危険因子を表わしている。
【０００３】
現在、国際糖尿病連合（ＩＤＦ）および世界保健機構（ＷＨＯ）によって一般的に認められている主要な基準が３つあり、それらは、肥満、異常脂質血症およびインスリン耐性という尺度である。これらの危険因子のそれぞれは、心臓血管疾患の有効な予測因子である。しかしながら、インスリン耐性は、２型糖尿病および心臓血管疾患の両方を予測することから、メタボリック症候群の主要構成要素とみなされている。インスリンの分泌は、グルコース代謝を維持するためのみならず、脂質代謝および血管緊張を制御するためにも必要である。インスリン耐性の結果、正常血糖を維持するベータ細胞の調節が不精確になり、高インスリン血症を導き、それが今度は、筋肉、脂肪組織および肝臓といったような主要代謝組織および臓器におけるインスリン耐性を断つことになり、インスリン耐性と高インスリン血症の間の悪循環が発生する。インスリン耐性の原因は、充分に理解されておらず、複数の遺伝性素因（遺伝的形質、多型）、酸化的ストレスなどの分子的因子、およびインスリンシグナリングと干渉し得るさまざまな炎症マーカーが存在する。
【０００４】
重要なのは、集中的なライフスタイルの修正がもつ大きな影響であり、これによって２型糖尿病の発生の４０〜５８％を遅延または予防できることが介入研究において発見された。これらの介入研究における食事療法は、脂肪、とりわけ飽和脂肪（部分的に一価不飽和脂肪によって置換されているもの）からのエネルギー摂取を削減することによる体重削減を目指し、さらに繊維、全粒粉、野菜および果物が豊富なものであった。食事制限には、一日３０分の身体活動が伴っていた。集中的なライフスタイルの修正がもつ生理学的メリットは、体重および血圧の低下そして、インスリン感受性および血中脂質の改善である。これは、危険性構成要素の全領域に影響を及ぼすものであり、メタボリック症候群に関係する疾患の発生を遅延させるかまたは予防することが発見されている。
【０００５】
以上のことを考えると、上述の疾患の背後にある機序の調査において、ならびにこれらの疾患を予防、緩和または治療する新たな方法を見出すために多大な努力が払われてきたことは、意外ではない。
【０００６】
食後の高インスリンレベル（高インスリン血症）が、メタボリック症候群の疾患（心臓血管疾患、２型糖尿病および肥満症）の発生の危険因子であることから、低インスリン応答をひき起こす食物が好ましいと考えられている。したがって、人体内でインスリンレベルを低下させる食物は、２型糖尿病、肥満症およびメタボリック症候群などの心臓血管疾患に伴う問題が増大しつつある先進工業国において、ヒトにとって有益なものになると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明に関連して、かかる疾患を治療し予防するための新規の方法が発見された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、１つの態様において、１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を修飾するための方法であって、
ａ） 少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒を混合して混合物を提供するステップと；
ｂ） 混合物を加熱して、存在する細菌種を除去し、加熱混合物を提供するステップと；
ｃ） 少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株および任意には少なくとも１つのタンパク質源を、加熱混合物に対し任意の順序でまたは同時に添加して発酵混合物を提供するステップと；
ｄ） 発酵混合物の発酵に適した条件に発酵混合物を付して１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと；
ｅ） 任意に、ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を除去して、生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと、
を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、さらなる態様において、糖尿病、メタボリック症候群および血管心臓疾患の予防または治療向けの組成物の製造を目的とする、生菌乳酸菌を含む１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図面の簡単な説明
【図１】グルコース基準飲料との関係における、被験個体による異なるブルーベリー飲料の摂取後に得られた食後血漿グルコース曲線を示す。
【図２】グルコース基準に比べた、異なるプロセス／添加剤に付された、異なるブルーベリー製品の摂取後の血清インスリン応答を示す。
【図３】未処理の対照（B-untreated）に比べた、異なるプロセス／添加剤に付された、異なるブルーベリー製品の摂取後のインスリン応答を示す。３０分後、B-fermは、対照（B-untreated）に比べて有意なインスリン応答の低下を提供している（Ｐ＜０．０５、B-untreatedを対照としたダネット検定）。
【図４】生菌を含む発酵ブルーベリー飲料およびその後の低温殺菌によって殺菌される発酵ブルーベリー飲料を摂取した後に得られる食後血漿グルコース曲線を示す。
【図５】生菌を含む発酵ブルーベリー飲料およびその後の低温殺菌によって殺菌される発酵ブルーベリー飲料を摂取した後のインスリン応答を示す。
【図６】ローズヒップピューレ、ブルーベリー、ブルーベリーピールおよびコケモモピール内のカテキン、エピカテキン、プロアントシアニジンダイマーアグリコン、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの、発酵前後の含有量を示す。
【図７】ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum） HEAL 19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）による発酵前および発酵後のブルーベリー中のカテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの含有量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の実施形態の詳細な説明
本発明の方法の一実施形態においては、少なくとも１つのポリフェノール含有植物材料と少なくとも１つの溶媒の混合物は均質化によって得られる。溶媒は好ましくは、水、水道水または蒸留水であるが、ミネラルウオータなどの別の水性食用溶媒、フルーツジュースおよび野菜ジュースなどのジュース、牛乳およびその他の飲料であってよい。
【００１２】
少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒との調製混合物の中に存在する細菌および／または微生物などのあらゆる細菌種を除去するために、それらの成長をことごとく防止する目的で、ステップｂ）における加熱は、６０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜１００℃、より好ましくは９０℃〜１００℃の温度、すなわち細菌および微生物を殺すのに充分な温度で、例えば９４℃で２秒間の低温殺菌または存在する細菌を除去するための従来のオートクレーブを用いて行なわれる。ステップｄ）において提供されている発酵は、混合物に添加される特定の乳酸菌菌株についてのみ起こらなければならない。したがって、発酵の前に加熱ステップｂ）において存在し得るその他のあらゆる細菌種を除去することが必要である。加熱温度および加熱持続時間は、存在するあらゆる細菌および微生物を殺すためという所望の結果を考慮して決定される。
【００１３】
加熱ステップｂ）の後、ポリフェノール含有材料は酸性であり得ることから、ＫＯＨを添加することなどによって、加熱済み混合物のｐＨを約４．５〜９、好ましくは５〜７の範囲内のｐＨ値に調整することができ得る。これは、添加された乳酸菌菌株が、このｐＨ間隔で良好に成長するからである。少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株は、混合物１ｍｌあたり約１０５〜１０９ｃｆｕの量で添加される。好ましくは、発酵は、少なくとも１つのタンパク質源例えばアミノ酸源の存在下で起こり、このタンパク質源はペプトン、トリプトン（ミルクブロス）、酵母抽出物およびこれらの組合せを含む群から選択されるが、これらに限定されるわけではない。別の例は、ミートブロスまたはオートミールであり、これらは細菌のための必要な構成要素も含んでいる。発酵をタンパク質源の添加無しで、すなわち添加された１つまたは複数ポリフェノール含有植物材料の構成要素すなわちこれらの植物材料中に存在するタンパク質および炭水化物のみの存在下で行なうことも同様に可能である。少なくとも１つのタンパク質は、全混合物の０．０００１〜０．１重量％の量で添加されるかまたは存在する。
【００１４】
本発明の実施形態においては、この少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株は、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ウィッセラ属（Weissella）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）および系統発生学的に関係する属を含む群から選択される。本発明の別の実施形態においては、このポリフェノール修飾用の少なくとも１つのラクトバシラス（Lactobacillus）菌株は、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバシラス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、および ラクトバシラス・アルゲントラテンシス（Lactobacillus argentoratensis）を含む群から選択される。
【００１５】
好ましくは、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）は、そのとき以下の登録番号が付与された１９９１年７月２日日付で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたラクトバシラス・プランタラム（Lactoabacillus plantarum）299、DSM 6595、１９９５年３月１６日日付で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v、DSM 9843、および２００２年１１月２７日付で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL 9、DSM 15312、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL 19、DSM DSM 15313、およびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL 99、DSM 15316からなる菌株群から選択される。
【００１６】
特定の乳酸菌菌株を添加した後、発酵条件は、大気圧下液体培地内でおよそ３０℃〜５０℃、好ましくはおよそ３５℃〜４５℃、特におよそ３７℃〜４０℃である。発酵は通常、５未満、好ましくは４未満のｐＨ値に達するまで続行される。ヨーグルトを発酵させる場合には、発酵は４．６〜４．７未満のｐＨまで続けられる。発酵はおよそ１０〜３０時間、好ましくはおよそ１５〜２５時間、例えばおよそ２０〜２４時間行なわれる。発酵持続時間は、有益な修飾型ポリフェノール含有植物材料を提供するのに充分なものでなくてはならない。
【００１７】
発酵が完了した後、ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を除去する任意のステップｆ）は、加熱、紫外線、ガンマ線、圧力、電流、放電、パルス電場、電気ショックまたは無菌化ろ過によって行なわれる。乳酸菌菌株を除去することにより、個体が摂取できる任意の組成物の形で、乳酸菌を含まない修飾型ポリフェノール含有植物混合物の得られた混合物を使用することが可能となる。
【００１８】
乳酸菌菌株の発酵によって修飾される１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料は例えば、果物、野菜、ベリー類、茶、穀物、緑茶、コーヒー、ココア、チョコレートおよび樹皮を含む群から選択される。果物およびベリー類は、例えばブルーベリー、コケモモ、クランベリー、リンゴ、バナナ、クロフサスグリ、イチゴ、木イチゴ、ローズヒップ、ブドウ、カンキツ類、アロニア、ボケ、アメリカスモモ、ローズヒップおよびエルダーベリー、オリーブ、ケーパーベリーまたはその他のポリフェノールに富む果実の群から選択される。樹皮は好ましくはシナモンから選択される。野菜は例えば豆から選択される。本発明は、上述の具体例に限定されない。選択された１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を考慮する上での重要な側面は、使用すべきこの１つまたは複数ポリフェノール含有植物材料が、乳酸菌菌株での発酵による影響を受け、修飾型ポリフェノール含有植物材料を提供しなければならないという点にある。
【００１９】
本明細書に関連して、「ポリフェノール含有植物材料を修飾する」という語句は、添加された乳酸菌菌株の発酵がポリフェノールを含有する植物材料の存在下で起こったということを意味する。発酵が起こり、これらのポリフェノール基に影響を及ぼし、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料を提供する。
【００２０】
本明細書に関連して「１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料」という用語は、本書に規定されている条件で乳酸菌菌株の存在下でのポリフェノール含有植物材料の発酵の後に得られる１つまたは複数の製品を意図している。実験の部で、試験対象のポリフェノール含有材料は、ブルーベリー、コケモモおよびローズヒップであり、インスリン応答低下の有意な効果をひき起こすのは、発酵を受けたブルーベリー、コケモモおよびローズヒップを含有する被験製品のみであることが示されており、このことはすなわち、インスリン応答の低下をひき起こすのがポリフェノール含有材料の発酵である確率が最も高いということを意味している。したがって本発明に関連して「１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料」という用語は、ポリフェノール含有植物材料の発酵後に得られるような物質を意味する。かかる「修飾型ポリフェノール含有植物材料」は、乳酸菌菌株での発酵を受けなかったポリフェノール含有植物材料の摂取と比べ、これを摂取した後のヒトにおいてインスリン応答を低下させるという所望の効果を提供するはずである。任意の適切な形態で修飾型ポリフェノール含有植物材料を摂取することによるインスリンレベルの低下は、およそ１〜５０％、好ましくはおよそ５〜４０％、より好ましくはおよそ１０〜３０％、さらに一層好ましくはおよそ１５〜２５％、例えばおよそ２５％の間隔内にあるはずである。
【００２１】
本発明はさらに、糖尿病、メタボリック症候群、肥満症および血管心臓疾患の予防または治療向けの組成物の製造を目的とする、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物の使用に関する。
【００２２】
組成物は、医薬組成物または食物組成物である。食物組成物は、例えば食品または食物サプリメントである。
【００２３】
食品は、パン、チーズ、ヨーグルトジュース、栄養ドリンク、栄養バー、スプレッド、ビスケットおよびシリアルを含む群から選択でき得る。食物組成物は、健康維持のため個体が容易に摂取でき、上述の通りの心臓血管疾患を予防できることから、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を食物組成物の中に含み入れるのが望ましい。
【００２４】
方法と材料
被験製品
本発明の効果を示すために、１）ブルーベリー組成物の熱処理のタイプおよび程度、２）組成物内の乳酸産生菌（それぞれラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vおよびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19）の存在、および３）Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19を用いたブルーベリー組成物の発酵に応じて、ポリフェノール含有植物材料、例えばブルーベリーとスクロースをベースとする異なる組成物の摂取の後の食後血中グルコースおよびインスリン応答の潜在的差異を評価するための試験を行なった。
【００２５】
試験には、異なる５つの被験飲料および基準飲料（Ref．）が含まれていた。被験飲料は、未処理未発酵ブルーベリー飲料（B-untr）１つ、低温殺菌された未発酵ブルーベリーをベースとする飲料１つ（B-past）、それぞれラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vおよびHEAL19の添加を伴う低温殺菌された未発酵の飲料２つ（B-299vおよびB-HEAL）および、低温殺菌されＬ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19で発酵された飲料１つ（B-ferm）からなっていた。基準飲料は、水中に溶解されたグルコースからなっていた。ブルーベリー（バクシニウム・ミルティルス（Vaccinium myrtillus））を、−２０℃での貯蔵に先立ちピューレ状態に混合した。解凍後、ブルーベリーを水（１：１）で希釈し、家庭用ミキサーを用いて５分間均質化した。その後、ブルーベリーを再度希釈し（１：１）、２５％のブルーベリー溶液を得た。その後ブルーベリーを、高性能分散装置（Ultra Turrax T25, Janke & Kunkel IKA, Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Germany）を用いて２５０００ｒｐｍで均質化した。未発酵ブルーベリー飲料用の試料（B-untreated）を採取し、食事試験で使用するまで−２０℃で凍結させた。残りのブルーベリー溶液を低温殺菌し（９４℃、２秒）、−２０℃で貯蔵した（B-pasteurized）。
【００２６】
試験の前日にB-pasturized飲料を解凍してラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v（B-299v）およびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19（B-HEAL19）を別々に添加した２つの飲料を調製し、それぞれのラクトバシラス菌株を加えその後供与するまで冷蔵庫内（＋４℃）に一晩放置した。
【００２７】
供与のおよそ一週間前に、６００ｍｌの殺菌されたブルーベリー溶液を容器内で発酵させ、ｐＨを５に調整するためにＫＯＨを添加した。その後、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19（１×１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を用いてブルーベリー溶液に接種した。窒素源として加熱滅菌したソラマメの花１グラムを加えた。１×１０９／ｍｌ（ｐＨ３．８）という最終ｃｆｕに達するまで２０時間、ブルーベリー溶液を発酵させた（B-fermented）。発酵後、ブルーベリー溶液を４℃で貯蔵した。発酵はProbi AB (Lund, Sweden)が実施した。３００ｍｌの水に対し、３０ｇのＤ＋−グルコース（VWR international Ltd. Poole, England）を含有するグルコース飲料を基準食として用いた。全ての食事が３０ｇの炭水化物で提供された。試験開始時点で、被験対象の各人に対し、一斤の小麦精白パン（WWB, Dollar Storfranska, Lockarp, Sweden）を提供した。各試験実施の前夜に個々に選択された量のスライスを摂取させることになっていた。
【００２８】
表１は、被験飲料および基準の異なる組成を示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
供与の前に、７２．８のアスコルビン酸、３２０．１のtrecomex（ジャガイモ加工デンプン）、２９１ｍｇのＣＮＫ（カラギナンＥ４０７）および２６．１８ｇのスクロースを、各ブルーベリー飲料に添加した。さらに、１．１８ｇのグルコースをB-fermented飲料に添加して、発酵中のこの炭水化物の損失を補填した。最終的に、２０％のブルーベリーおよび３０ｇの炭水化物を含む３００ｇのブルーベリー飲料が得られるように、全てのブルーベリー飲料を３２．０ｇの水で調整した。
【００３１】
被験飲料試験
全ての飲料を朝食として供与し、少なくとも５日あけて無作為に提供した。全ての対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。これらの対象はまた、試験中いつでも特段の説明無く自主的に中止できるという事実を充分認識していた。ルンド大学医学部倫理委員会は、この試験を承認した。
【００３２】
被験対象
１５名の健常な非喫煙ボランティア、つまり７人の女性および８人の男性が、緊急食事試験に参加した。平均年令は２５±２．４（平均±ＳＤ（標準偏差））才であり、平均肥満度指数は正常範囲（２２．４±２．０ｋｇ／ｍ２；平均±ＳＤ）内であった。対象は、いかなる薬物治療も受けていなかった。対象には、試験前日のアルコール摂取、身体活動および繊維が豊富な夕食を避けるように依頼した。対象は、各試験実施の前夜、午後９時〜１０時の間に個々に選択された量のＷＷＢを食べた。試験全体にわたり、個々に選択されたスライスの量を等しく保った。ＷＷＢ食の後、対象には、研究所に到着するまで何も摂取しないよう依頼した。ただし必要な場合は、午後１０時以降、少量の水分の摂取は許された。各対象は、少なくとも１週間あけて４回の試験実施に参加した。
【００３３】
試験設計および血液試料採取
対象は、朝７時４５分に研究所に到着し、末梢カテーテルが肘正中動脈内に挿入された。毎回、全ての参加者は、ストレスまたは不安の感情を含めたその日の自らの身体状態に関する質問用紙に記入した。食事を、１０分間落ちついて摂らせた。空腹時および食事摂取から１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０分後に、血清インスリンおよび血漿血中グルコース分析のために、毛細管血を収集した。
【００３４】
グルコース分析
β−グルコース分析装置（Hemocue 201+, Hemocue AB, Aengelholm, Sweden）を用いて血中グルコースを決定した。
【００３５】
インスリン分析
血清インスリン試料を−２０℃で貯蔵した。分析は、酵素免疫測定キット（Mercodia Insulin Elisa; Mercodia AB, Uppsala, Sweden）を使用することにより、総合型免疫測定分析装置（CODA Open Microplate System; Bio-Rad Laboratories, Hercules CA）上で実施された。
【００３６】
計算と統計的分析
各参加者および各被験飲料について、血中グルコースおよび血清インスリンに関する０〜４５分および０〜１２０分での増分的曲線下面積（ＡＵＣ）を、GraphPad PRISM (version 3.02; GraphPad Software Inc, San Diego)を使用して計算した。ベースライン下の全ての面積は、計算から除外した。血中グルコース、および血清インスリンを各時点で統計的に分析した。統計的計算はMINITAB Statistical Software (release 13.1 for windows)を用いて実施した。一般線形モデル（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキー多重比較検定またはダネット検定により、有意性を判定した。Ｐ＜０．０５という結果をもたらした差異が、有意とみなされた。
【００３７】
血漿グルコース
グルコース曲線下の初期（０〜４５分）面積も後期（０〜９０分）面積も同様に、グルコース基準に比べブルーベリー飲料の摂取後に有意な形で低下していた。ブルーベリー飲料についてのＧＩ値は、間隔５８〜６４の中に充分集められ、グルコース基準（ＧＩ＝１００）よりも有意に低下していた。血漿グルコースは図１に示されている。
【００３８】
【表２】
【００３９】
血清インスリン
異なるブルーベリー飲料摂取後のインスリン応答および基準は、図２に示されている。３０〜６０分の間隔内で、全てのブルーベリー飲料は、グルコース基準に比べて有意に低いインスリン応答を発生させた。１５分後、B-fermの摂取後のインスリンレベルは、グルコース基準に比べて有意に低かった。食後初期（０〜４５分のＡＵＣとして表現）において、B-fermは、B-HEAL19よりも低いインスリン応答を発生させた。
【００４０】
低温殺菌および発酵（Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19を用いた）またはブルーベリー原料へのラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の添加の重要性を試験するため、B-past、B-ferm、B-299vおよびB-HEAL19のインスリン応答を未処理対照飲料（B-untr）と比較した。摂取から３０分後に、B-fermは、B-treatedに比べ有意に低下していた。１２０分後に、B-299vおよびB-HEAL19は、B-untreatedに比べて著しく低いインスリン応答を示した。初期インスリン応答（０〜４５分ＡＵＣ）の比較から、B-fermが未処理ブルーベリー飲料に比べて有意に低いインスリン応答（２５％）を提供することが示された（Ｐ＜０．０５、表４）。低温殺菌もラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19各々の添加も、未処理のブルーベリー飲料との関係において、食後インスリン面積に有意な形で影響を及ぼさなかった。
【００４１】
【表３】
【００４２】
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19を用いたブルーベリーの発酵は、インスリン応答の低下の鍵となる要因であると思われる。結果は、発酵プロセスがインスリン終止を改善することを示唆している。
【００４３】
【表４】
【００４４】
ブルーベリー飲料後の食後血漿グルコース応答は同じレベルにあったことから、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19を含む発酵済みブルーベリー飲料の摂取後の２５％低いインスリン応答は、血漿グルコースの類似の減少と同時には見られなかった。しかしながら、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19を用いたブルーベリーの発酵は、発酵ブルーベリーを含有する飲料で見られたインスリン応答低下の鍵となる要因であるように思われる。この効果は、同じ細菌ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19が、摂取直前にブルーベリー飲料に添加された場合には見られない。したがって、インスリン応答の低下を発生させるのは細菌自体の存在ではなく、むしろ重要なのは発酵そのものである。この興味深い効果をひき起こす活発な機序は、発酵により産生されるかまたは修飾される構成要素すなわち、発酵後のブルーベリー内で利用可能な修飾型ポリフェノール構成要素に起因し得ると思われる。
【００４５】
要約すると、発酵ブルーベリー飲料は、未発酵ブルーベリー飲料に比べてインスリン応答を２５％削減したという結論を下すことができる。将来は、代謝性障害を患う人々を目的とする製品が、２型糖尿病および内皮障害の発生を予防させ恐らくは減少もさせる付加的な方法を提示できるものと思われる。好ましくは問題の全ての側面すなわち栄養面および臨床的側面のみならず社会的、文化的および経済的側面をも統合することによって、より大きな観点で「代謝性障害の蔓延」を考慮して、西欧諸国および開発途上国において全体的に健康的なライフスタイルを導入することができるかもしれない。全ての消費者の知識が増大することで、業界を市場の要望に従わせることが望まれる。
【００４６】
生菌を含む飲料についての効果を細菌が除去された飲料についての効果と比較する試験
Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19の培養液を発酵後に低温殺菌した飲料が、Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19の培養液を発酵後に生きた状態に保っている飲料と同じ低いインスリン応答を提供するか否かを評価するために、２つの異なる被験飲料を含み入れた。
【００４７】
被験飲料は、低温殺菌されＬ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19で発酵された１つの飲料と、低温殺菌されＬ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19で発酵され次に発酵後低温殺菌された１つの飲料からなっていた。ブルーベリー（バクシニウム・ミルティルス（Vaccinium myrtillus））をピューレ状態に混合し、その後−２０℃で貯蔵した。解凍後、ブルーベリーを水で希釈させ（１：１）、家庭用ミキサーを用いて５分間均質化させた。その後ブルーベリーを再度希釈し（１：１）、２５％のブルーベリー溶液を得た。その後、ブルーベリー溶液を、高性能分散装置（Ultra Turrax T25, Janke & Kunkel IKA, Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Germany）を用いて２５０００ｒｐｍで均質化させた。未発酵ブルーベリー飲料用の試料を採取し（B-untreated）、食事試験で使用するまで−２０℃で凍結させた。残りのブルーベリー溶液を低温殺菌し（９４℃、２秒）、−２０℃で貯蔵した（B-past.）。
【００４８】
供与のおよそ一週間前に、６００ｍｌの殺菌されたブルーベリー溶液を容器内で発酵させ、ｐＨを５に調整するためにＫＯＨを添加した。その後、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19（１×１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を用いてブルーベリー溶液に接種した。窒素源として加熱滅菌したソラマメの花１グラムを加えた。１×１０９／ｍｌ（ｐＨ３．８）という最終ｃｆｕに達するまで２０時間、ブルーベリー溶液を発酵させた。発酵後、ブルーベリー溶液を４℃で貯蔵し、再び低温殺菌させ（９４℃、２秒）４℃で貯蔵した。発酵はProbi AB (Lund, Sweden)が実施した。
【００４９】
表５は、被験飲料および基準の異なる組成を示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】
供与の前に、７２．８ｍｇのアスコルビン酸、３２０．１ｍｇのtrecomex（ジャガイモ加工デンプン）、２９１ｍｇのＣＮＫ（カラギナンＥ４０７）および２６．１８ｇのスクロースを、各ブルーベリー飲料に添加した。さらに、１．１８ｇのグルコースをB-fermented飲料に添加して、発酵中のこの炭水化物の損失を補填した。最終的に、２０％のブルーベリーおよび３０ｇの炭水化物を含む３００ｇのブルーベリー飲料が得られるように、全てのブルーベリー飲料を３２．０ｇの水で調整した。
【００５２】
被験飲料試験
全ての飲料を朝食として供与し、少なくとも５日あけて無作為に提供した。全ての対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。これらの対象はまた、試験中いつでも特段の説明無く自主的に中止できるという事実を充分認識していた。ルンド大学医学部倫理委員会は、この試験を承認した。
【００５３】
被験対象
１３名の健常な非喫煙ボランティアが、緊急食事試験に参加した。平均年令は２５．５±１．３４（平均±ＳＤ（標準偏差））才であり、平均肥満度指数は正常範囲（２０．８±０．２４ｋｇ／ｍ２；平均±ＳＤ）内であった。対照の一人は１つの試験の前日に胃腸障害を起こすインフルエンザを患い、したがって試験から除外された。対象は、いかなる薬物治療も受けていなかった。対象には、試験前日のアルコール摂取、身体活動および繊維が豊富な夕食を避けるように依頼した。対象は、各試験機会の前夜、午後９時〜１０時の間に個々に選択された量のＷＷＢを食べた。試験全体にわたり、個々に選択されたスライスの量を等しく保った。ＷＷＢ食の後、対象には、研究所に到着するまで何も摂取しないよう依頼した。ただし必要な場合は、午後１０時以降、少量の水分の摂取は許された。各対象は、少なくとも１週間あけて４回の試験実施に参加した。
【００５４】
試験設計および血液試料採取
対象は、朝７時４５分に研究所に到着し、末梢カテーテルが肘正中動脈内に挿入された。毎回、全ての参加者は、ストレスまたは不安の感情を含めたその日の自らの身体状態に関する質問用紙に記入した。食事を、１０分間落ちついて摂らせた。空腹時および食事摂取から１５、３０、６０、９０、１２０分後に、血清インスリンおよび血漿血中グルコース分析のために、毛細管血を収集した。
【００５５】
グルコース分析
β−グルコース分析装置（model no. 120401, Hemocue AB, Aengelholm, Sweden）を用いて血中グルコースを決定した。
【００５６】
インスリン分析
血清インスリン試料を−２０℃で貯蔵した。分析は、酵素免疫測定キット（Mercodia Insulin Elisa; Mercodia AB, Uppsala, Sweden）を使用することにより、総合型免疫測定分析装置（CODA Open Microplate System; Bio-Rad Laboratories, Hercules CA）上で実施された。
【００５７】
計算と統計的分析
各参加者および各被験飲料について、血中グルコースおよび血清インスリンに関する０〜４５分および０〜１２０分での増分的曲線下面積（ＡＵＣ）を、GraphPad PRISM (version 3.02; GraphPad Software Inc, San Diego)を使用して計算した。ベースライン下の全ての面積は、計算から除外した。血中グルコース、および血清インスリンを各時点で統計的に分析した。統計的計算はMINITAB Statistical Software (release 13.1 for windows)を用いて実施した。一般線形モデル（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキー多重比較検定またはダネット検定により、有意性を判定した。Ｐ＜０．０５という結果をもたらした差異が、有意とみなされた。
【００５８】
血漿グルコース
図４を見ればわかるように、グルコース曲線の下の初期（０〜４５分）面積も後期（０〜１２０分）面積も同様に生菌を伴う被験飲料に比べ発酵後低温殺菌された被験飲料の摂取後わずかに低下していた。血中グルコースが空腹時値より上にとどまっている期間を、空腹時値からの血中グルコースの最大増加で除することによって、グルコース曲線のプロフィールを分析した。この商は、グルコース持続時間／ピーク定数と呼ばれる（分／ΔｍＭ）。グルコース持続時間／ピーク定数の高い値は、グルコース曲線が長く低いことを意味し、低い値は、短く高い曲線を伴う好ましくない曲線プロフィールを表わす。この試験には基準が一切含み入れられなかったため、ＧＩ値は全く判定できなかった。
【００５９】
【表６】
【００６０】
【表７】
【００６１】
血清インスリン
２つのブルーベリー飲料を摂取した後のインスリン応答は、図５に示されている。生菌を含む被験飲料に比べて発酵後低温殺菌された被験飲料摂取後にＡＵＣは低下していた。この試験には基準が一切含み入れられなかったため、ＩＩ値は全く判定できなかった。
【００６２】
【表８】
【００６３】
論述
両方の飲料とも、グルコースについてほぼ同じ応答を示した。低温殺菌された、すなわち細菌が死滅した飲料は、生菌を含む飲料に比べインスリン応答について優れた結果を示した。以前の試験においては、低温殺菌のみではインスリン応答に対する効果が全く見られなかった。すなわち、低温殺菌されたブルーベリーは、低温殺菌されていないブルーベリーと同じ結果をもたらした。しかしながら、本試験は、発酵後の熱処理の度合がインスリン応答に大きく影響し得るということを表わしている。
【００６４】
この効果の機序については、さらに評価する必要がある。１つの理論としては、より強力な熱処理がブルーベリー内のポリフェノールおよびその他の生物活性構成要素に対する効果を通してインスリン低下効果を提供し、このことは、熱処理の追加ステップによって熱滅菌された細菌を伴う飲料によって例示されるという考え方である。
【００６５】
ポリフェノール化合物分析
ポリフェノール含有植物材料の修飾が起こることの証拠を提供するため、発酵前後のローズヒップピューレ、ブルーベリー、ブルーベリーピールおよびコケモモピール内のカテキン、エピカテキン、プロアントシアニジンダイマーアグリコン、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの含有量を比較する試験を行なった。
【００６６】
その他の微生物が発酵に影響を及ぼすのを回避するため、発酵前に全ての果物画分を低温殺菌した。
【００６７】
フェノール化合物の分析のため、試料を秤量し、抽出用の溶液を添加した（試料中の濃度：５０％のエタノール、０．０５Ｍのリン酸、あるいは５０％のメタノール、０．５％）。その後、試料を超音波浴内で１０分間抽出し、その後遠心分離し、さらにその後上清をバイアルに移し、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により分析した。Salminen et al. Characterisation of proanthocyanidin aglycones and glycosides from rose hips by high-performancce liquid chromatography-mass spectrometry、and their rapid quantification together with Vitamin C. J Chrom A 2005; 1077:170-180、およびSalminen et al. Characterisation of hydrolysable tannins from leaves of Betula pubescens by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. J Chrom A 1999; 864: 283-291にある通り、API 150 EX TurboによってＨＰＬＣ−ＭＳ分析を実施した。
【００６８】
計器を、マイナスモードに設定した。すなわちマイナスイオンを分析した。ＨＰＬＣ系は、Perkin Elmer LC-200 Micro PumpタイプのＨＰＬＣポンプおよびPerkin Elmer 200 Autoサンプラからなっていた。試料の注入体積は８μｌであった。
【００６９】
９０〜１０００ｍ／ｚの間の質量数にわたり、走査を実施した。
【００７０】
検出のために用いられる具体的質量数：
カテキン、ｍ／ｚ２８９（Ｍ−Ｈ）
エピカテキン、ｍ／ｚ２８９（Ｍ−Ｈ）
プロシアニジンＢ２、ｍ／ｚ５７７（Ｍ−Ｈ）
プロアントシアニジンダイマーアグリコン、ｍ／ｚ５７７（Ｍ−Ｈ）
プロアントシアニジントリマーアグリコン、ｍ／ｚ８６５（Ｍ−Ｈ）
プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、ｍ／ｚ１１５３（Ｍ−Ｈ）
３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ｍ／ｚ１８１（Ｍ−Ｈ）
Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、ｍ／ｚ１６５（Ｍ−Ｈ）
プロトカテク酸、ｍ／ｚ１５３（Ｍ−Ｈ）
シアニジン−３−ガラクトシド、シアニジン−３−グルコシド、ｍ／ｚ４４７（Ｍ−Ｈ）
【００７１】
試験の結果は、図６を見るとわかり、これは、ブルーベリーならびにコケモモおよびローズヒップの両方においてポリフェノール含有植物材料の修飾が起こることを示している。
【００７２】
【表９】
【００７３】
ラットに対する試験において、選択されたフェノール化合物の盲腸内の濃度は、ローズヒップのみが消費された場合に比べ、ローズヒップに加えてラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19が消費された場合異なるものであることが示された（表１０）。このことは、盲腸内での発酵中にポリフェノール構成要素が修飾されたことを表わしている。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を用いた発酵の比較試験
ポリフェノール含有植物材料の修飾が、その他の細菌を用いて発酵させた場合にも起こることの証拠を提供するために、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）での発酵の前後のブルーベリー中のカテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの含有量を比較する試験を実施した。
【００７６】
試験の結果は図７を見るとわかり、これは、ポリフェノール含有植物材料の修飾が、試験された全ての細菌すなわちラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を用いた発酵の後に起こるということを示している。
【００７７】
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料の修飾方法および、１つまたは複数の異なる修飾型ポリフェノール含有植物材料の新規医療向け使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
世界保健機構（ＷＨＯ）は、２型糖尿病患者が２０２５年には３億人（現在の人口の約５％）になると予測している。これはすなわち、人口のかなりの部分がメタボリック症候群などのさまざまな代謝障害に罹患することを意味している。「メタボリック症候群」という用語は、臨床診断および定義の両面で大いに議論されてきた。とはいえこの用語は、２型糖尿病および心臓血管疾患を発生させるリスクの高い対象を特定する一群の警告的代謝性危険因子を表わしている。
【０００３】
現在、国際糖尿病連合（ＩＤＦ）および世界保健機構（ＷＨＯ）によって一般的に認められている主要な基準が３つあり、それらは、肥満、異常脂質血症およびインスリン耐性という尺度である。これらの危険因子のそれぞれは、心臓血管疾患の有効な予測因子である。しかしながら、インスリン耐性は、２型糖尿病および心臓血管疾患の両方を予測することから、メタボリック症候群の主要構成要素とみなされている。インスリンの分泌は、グルコース代謝を維持するためのみならず、脂質代謝および血管緊張を制御するためにも必要である。インスリン耐性の結果、正常血糖を維持するベータ細胞の調節が不精確になり、高インスリン血症を導き、それが今度は、筋肉、脂肪組織および肝臓といったような主要代謝組織および臓器におけるインスリン耐性を断つことになり、インスリン耐性と高インスリン血症の間の悪循環が発生する。インスリン耐性の原因は、充分に理解されておらず、複数の遺伝性素因（遺伝的形質、多型）、酸化的ストレスなどの分子的因子、およびインスリンシグナリングと干渉し得るさまざまな炎症マーカーが存在する。
【０００４】
重要なのは、集中的なライフスタイルの修正がもつ大きな影響であり、これによって２型糖尿病の発生の４０〜５８％を遅延または予防できることが介入研究において発見された。これらの介入研究における食事療法は、脂肪、とりわけ飽和脂肪（部分的に一価不飽和脂肪によって置換されているもの）からのエネルギー摂取を削減することによる体重削減を目指し、さらに繊維、全粒粉、野菜および果物が豊富なものであった。食事制限には、一日３０分の身体活動が伴っていた。集中的なライフスタイルの修正がもつ生理学的メリットは、体重および血圧の低下そして、インスリン感受性および血中脂質の改善である。これは、危険性構成要素の全領域に影響を及ぼすものであり、メタボリック症候群に関係する疾患の発生を遅延させるかまたは予防することが発見されている。
【０００５】
以上のことを考えると、上述の疾患の背後にある機序の調査において、ならびにこれらの疾患を予防、緩和または治療する新たな方法を見出すために多大な努力が払われてきたことは、意外ではない。
【０００６】
食後の高インスリンレベル（高インスリン血症）が、メタボリック症候群の疾患（心臓血管疾患、２型糖尿病および肥満症）の発生の危険因子であることから、低インスリン応答をひき起こす食物が好ましいと考えられている。したがって、人体内でインスリンレベルを低下させる食物は、２型糖尿病、肥満症およびメタボリック症候群などの心臓血管疾患に伴う問題が増大しつつある先進工業国において、ヒトにとって有益なものになると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明に関連して、かかる疾患を治療し予防するための新規の方法が発見された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、１つの態様において、１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を修飾するための方法であって、
ａ） 少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒を混合して混合物を提供するステップと；
ｂ） 混合物を加熱して、存在する細菌種を除去し、加熱混合物を提供するステップと；
ｃ） 少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株および任意には少なくとも１つのタンパク質源を、加熱混合物に対し任意の順序でまたは同時に添加して発酵混合物を提供するステップと；
ｄ） 発酵混合物の発酵に適した条件に発酵混合物を付して１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと；
ｅ） 任意に、ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を除去して、生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと、
を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、さらなる態様において、糖尿病、メタボリック症候群および血管心臓疾患の予防または治療向けの組成物の製造を目的とする、生菌乳酸菌を含む１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図面の簡単な説明
【図１】グルコース基準飲料との関係における、被験個体による異なるブルーベリー飲料の摂取後に得られた食後血漿グルコース曲線を示す。
【図２】グルコース基準に比べた、異なるプロセス／添加剤に付された、異なるブルーベリー製品の摂取後の血清インスリン応答を示す。
【図３】未処理の対照（B-untreated）に比べた、異なるプロセス／添加剤に付された、異なるブルーベリー製品の摂取後のインスリン応答を示す。３０分後、B-fermは、対照（B-untreated）に比べて有意なインスリン応答の低下を提供している（Ｐ＜０．０５、B-untreatedを対照としたダネット検定）。
【図４】生菌を含む発酵ブルーベリー飲料およびその後の低温殺菌によって殺菌される発酵ブルーベリー飲料を摂取した後に得られる食後血漿グルコース曲線を示す。
【図５】生菌を含む発酵ブルーベリー飲料およびその後の低温殺菌によって殺菌される発酵ブルーベリー飲料を摂取した後のインスリン応答を示す。
【図６】ローズヒップピューレ、ブルーベリー、ブルーベリーピールおよびコケモモピール内のカテキン、エピカテキン、プロアントシアニジンダイマーアグリコン、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの、発酵前後の含有量を示す。
【図７】ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum） HEAL 19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）による発酵前および発酵後のブルーベリー中のカテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの含有量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の実施形態の詳細な説明
本発明の方法の一実施形態においては、少なくとも１つのポリフェノール含有植物材料と少なくとも１つの溶媒の混合物は均質化によって得られる。溶媒は好ましくは、水、水道水または蒸留水であるが、ミネラルウオータなどの別の水性食用溶媒、フルーツジュースおよび野菜ジュースなどのジュース、牛乳およびその他の飲料であってよい。
【００１２】
少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒との調製混合物の中に存在する細菌および／または微生物などのあらゆる細菌種を除去するために、それらの成長をことごとく防止する目的で、ステップｂ）における加熱は、６０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜１００℃、より好ましくは９０℃〜１００℃の温度、すなわち細菌および微生物を殺すのに充分な温度で、例えば９４℃で２秒間の低温殺菌または存在する細菌を除去するための従来のオートクレーブを用いて行なわれる。ステップｄ）において提供されている発酵は、混合物に添加される特定の乳酸菌菌株についてのみ起こらなければならない。したがって、発酵の前に加熱ステップｂ）において存在し得るその他のあらゆる細菌種を除去することが必要である。加熱温度および加熱持続時間は、存在するあらゆる細菌および微生物を殺すためという所望の結果を考慮して決定される。
【００１３】
加熱ステップｂ）の後、ポリフェノール含有材料は酸性であり得ることから、ＫＯＨを添加することなどによって、加熱済み混合物のｐＨを約４．５〜９、好ましくは５〜７の範囲内のｐＨ値に調整することができ得る。これは、添加された乳酸菌菌株が、このｐＨ間隔で良好に成長するからである。少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株は、混合物１ｍｌあたり約１０５〜１０９ｃｆｕの量で添加される。好ましくは、発酵は、少なくとも１つのタンパク質源例えばアミノ酸源の存在下で起こり、このタンパク質源はペプトン、トリプトン（ミルクブロス）、酵母抽出物およびこれらの組合せを含む群から選択されるが、これらに限定されるわけではない。別の例は、ミートブロスまたはオートミールであり、これらは細菌のための必要な構成要素も含んでいる。発酵をタンパク質源の添加無しで、すなわち添加された１つまたは複数ポリフェノール含有植物材料の構成要素すなわちこれらの植物材料中に存在するタンパク質および炭水化物のみの存在下で行なうことも同様に可能である。少なくとも１つのタンパク質は、全混合物の０．０００１〜０．１重量％の量で添加されるかまたは存在する。
【００１４】
本発明の実施形態においては、この少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株は、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ウィッセラ属（Weissella）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）および系統発生学的に関係する属を含む群から選択される。本発明の別の実施形態においては、このポリフェノール修飾用の少なくとも１つのラクトバシラス（Lactobacillus）菌株は、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバシラス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、および ラクトバシラス・アルゲントラテンシス（Lactobacillus argentoratensis）を含む群から選択される。
【００１５】
好ましくは、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）は、そのとき以下の登録番号が付与された１９９１年７月２日日付で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたラクトバシラス・プランタラム（Lactoabacillus plantarum）299、DSM 6595、１９９５年３月１６日日付で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v、DSM 9843、および２００２年１１月２７日付で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL 9、DSM 15312、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL 19、DSM DSM 15313、およびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL 99、DSM 15316からなる菌株群から選択される。
【００１６】
特定の乳酸菌菌株を添加した後、発酵条件は、大気圧下液体培地内でおよそ３０℃〜５０℃、好ましくはおよそ３５℃〜４５℃、特におよそ３７℃〜４０℃である。発酵は通常、５未満、好ましくは４未満のｐＨ値に達するまで続行される。ヨーグルトを発酵させる場合には、発酵は４．６〜４．７未満のｐＨまで続けられる。発酵はおよそ１０〜３０時間、好ましくはおよそ１５〜２５時間、例えばおよそ２０〜２４時間行なわれる。発酵持続時間は、有益な修飾型ポリフェノール含有植物材料を提供するのに充分なものでなくてはならない。
【００１７】
発酵が完了した後、ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を除去する任意のステップｆ）は、加熱、紫外線、ガンマ線、圧力、電流、放電、パルス電場、電気ショックまたは無菌化ろ過によって行なわれる。乳酸菌菌株を除去することにより、個体が摂取できる任意の組成物の形で、乳酸菌を含まない修飾型ポリフェノール含有植物混合物の得られた混合物を使用することが可能となる。
【００１８】
乳酸菌菌株の発酵によって修飾される１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料は例えば、果物、野菜、ベリー類、茶、穀物、緑茶、コーヒー、ココア、チョコレートおよび樹皮を含む群から選択される。果物およびベリー類は、例えばブルーベリー、コケモモ、クランベリー、リンゴ、バナナ、クロフサスグリ、イチゴ、木イチゴ、ローズヒップ、ブドウ、カンキツ類、アロニア、ボケ、アメリカスモモ、ローズヒップおよびエルダーベリー、オリーブ、ケーパーベリーまたはその他のポリフェノールに富む果実の群から選択される。樹皮は好ましくはシナモンから選択される。野菜は例えば豆から選択される。本発明は、上述の具体例に限定されない。選択された１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を考慮する上での重要な側面は、使用すべきこの１つまたは複数ポリフェノール含有植物材料が、乳酸菌菌株での発酵による影響を受け、修飾型ポリフェノール含有植物材料を提供しなければならないという点にある。
【００１９】
本明細書に関連して、「ポリフェノール含有植物材料を修飾する」という語句は、添加された乳酸菌菌株の発酵がポリフェノールを含有する植物材料の存在下で起こったということを意味する。発酵が起こり、これらのポリフェノール基に影響を及ぼし、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料を提供する。
【００２０】
本明細書に関連して「１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料」という用語は、本書に規定されている条件で乳酸菌菌株の存在下でのポリフェノール含有植物材料の発酵の後に得られる１つまたは複数の製品を意図している。実験の部で、試験対象のポリフェノール含有材料は、ブルーベリー、コケモモおよびローズヒップであり、インスリン応答低下の有意な効果をひき起こすのは、発酵を受けたブルーベリー、コケモモおよびローズヒップを含有する被験製品のみであることが示されており、このことはすなわち、インスリン応答の低下をひき起こすのがポリフェノール含有材料の発酵である確率が最も高いということを意味している。したがって本発明に関連して「１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料」という用語は、ポリフェノール含有植物材料の発酵後に得られるような物質を意味する。かかる「修飾型ポリフェノール含有植物材料」は、乳酸菌菌株での発酵を受けなかったポリフェノール含有植物材料の摂取と比べ、これを摂取した後のヒトにおいてインスリン応答を低下させるという所望の効果を提供するはずである。任意の適切な形態で修飾型ポリフェノール含有植物材料を摂取することによるインスリンレベルの低下は、およそ１〜５０％、好ましくはおよそ５〜４０％、より好ましくはおよそ１０〜３０％、さらに一層好ましくはおよそ１５〜２５％、例えばおよそ２５％の間隔内にあるはずである。
【００２１】
本発明はさらに、糖尿病、メタボリック症候群、肥満症および血管心臓疾患の予防または治療向けの組成物の製造を目的とする、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物の使用に関する。
【００２２】
組成物は、医薬組成物または食物組成物である。食物組成物は、例えば食品または食物サプリメントである。
【００２３】
食品は、パン、チーズ、ヨーグルトジュース、栄養ドリンク、栄養バー、スプレッド、ビスケットおよびシリアルを含む群から選択でき得る。食物組成物は、健康維持のため個体が容易に摂取でき、上述の通りの心臓血管疾患を予防できることから、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を食物組成物の中に含み入れるのが望ましい。
【００２４】
方法と材料
被験製品
本発明の効果を示すために、１）ブルーベリー組成物の熱処理のタイプおよび程度、２）組成物内の乳酸産生菌（それぞれラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vおよびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19）の存在、および３）Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19を用いたブルーベリー組成物の発酵に応じて、ポリフェノール含有植物材料、例えばブルーベリーとスクロースをベースとする異なる組成物の摂取の後の食後血中グルコースおよびインスリン応答の潜在的差異を評価するための試験を行なった。
【００２５】
試験には、異なる５つの被験飲料および基準飲料（Ref．）が含まれていた。被験飲料は、未処理未発酵ブルーベリー飲料（B-untr）１つ、低温殺菌された未発酵ブルーベリーをベースとする飲料１つ（B-past）、それぞれラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vおよびHEAL19の添加を伴う低温殺菌された未発酵の飲料２つ（B-299vおよびB-HEAL）および、低温殺菌されＬ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19で発酵された飲料１つ（B-ferm）からなっていた。基準飲料は、水中に溶解されたグルコースからなっていた。ブルーベリー（バクシニウム・ミルティルス（Vaccinium myrtillus））を、−２０℃での貯蔵に先立ちピューレ状態に混合した。解凍後、ブルーベリーを水（１：１）で希釈し、家庭用ミキサーを用いて５分間均質化した。その後、ブルーベリーを再度希釈し（１：１）、２５％のブルーベリー溶液を得た。その後ブルーベリーを、高性能分散装置（Ultra Turrax T25, Janke & Kunkel IKA, Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Germany）を用いて２５０００ｒｐｍで均質化した。未発酵ブルーベリー飲料用の試料（B-untreated）を採取し、食事試験で使用するまで−２０℃で凍結させた。残りのブルーベリー溶液を低温殺菌し（９４℃、２秒）、−２０℃で貯蔵した（B-pasteurized）。
【００２６】
試験の前日にB-pasturized飲料を解凍してラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v（B-299v）およびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19（B-HEAL19）を別々に添加した２つの飲料を調製し、それぞれのラクトバシラス菌株を加えその後供与するまで冷蔵庫内（＋４℃）に一晩放置した。
【００２７】
供与のおよそ一週間前に、６００ｍｌの殺菌されたブルーベリー溶液を容器内で発酵させ、ｐＨを５に調整するためにＫＯＨを添加した。その後、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19（１×１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を用いてブルーベリー溶液に接種した。窒素源として加熱滅菌したソラマメの花１グラムを加えた。１×１０９／ｍｌ（ｐＨ３．８）という最終ｃｆｕに達するまで２０時間、ブルーベリー溶液を発酵させた（B-fermented）。発酵後、ブルーベリー溶液を４℃で貯蔵した。発酵はProbi AB (Lund, Sweden)が実施した。３００ｍｌの水に対し、３０ｇのＤ＋−グルコース（VWR international Ltd. Poole, England）を含有するグルコース飲料を基準食として用いた。全ての食事が３０ｇの炭水化物で提供された。試験開始時点で、被験対象の各人に対し、一斤の小麦精白パン（WWB, Dollar Storfranska, Lockarp, Sweden）を提供した。各試験実施の前夜に個々に選択された量のスライスを摂取させることになっていた。
【００２８】
表１は、被験飲料および基準の異なる組成を示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
供与の前に、７２．８のアスコルビン酸、３２０．１のtrecomex（ジャガイモ加工デンプン）、２９１ｍｇのＣＮＫ（カラギナンＥ４０７）および２６．１８ｇのスクロースを、各ブルーベリー飲料に添加した。さらに、１．１８ｇのグルコースをB-fermented飲料に添加して、発酵中のこの炭水化物の損失を補填した。最終的に、２０％のブルーベリーおよび３０ｇの炭水化物を含む３００ｇのブルーベリー飲料が得られるように、全てのブルーベリー飲料を３２．０ｇの水で調整した。
【００３１】
被験飲料試験
全ての飲料を朝食として供与し、少なくとも５日あけて無作為に提供した。全ての対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。これらの対象はまた、試験中いつでも特段の説明無く自主的に中止できるという事実を充分認識していた。ルンド大学医学部倫理委員会は、この試験を承認した。
【００３２】
被験対象
１５名の健常な非喫煙ボランティア、つまり７人の女性および８人の男性が、緊急食事試験に参加した。平均年令は２５±２．４（平均±ＳＤ（標準偏差））才であり、平均肥満度指数は正常範囲（２２．４±２．０ｋｇ／ｍ２；平均±ＳＤ）内であった。対象は、いかなる薬物治療も受けていなかった。対象には、試験前日のアルコール摂取、身体活動および繊維が豊富な夕食を避けるように依頼した。対象は、各試験実施の前夜、午後９時〜１０時の間に個々に選択された量のＷＷＢを食べた。試験全体にわたり、個々に選択されたスライスの量を等しく保った。ＷＷＢ食の後、対象には、研究所に到着するまで何も摂取しないよう依頼した。ただし必要な場合は、午後１０時以降、少量の水分の摂取は許された。各対象は、少なくとも１週間あけて４回の試験実施に参加した。
【００３３】
試験設計および血液試料採取
対象は、朝７時４５分に研究所に到着し、末梢カテーテルが肘正中動脈内に挿入された。毎回、全ての参加者は、ストレスまたは不安の感情を含めたその日の自らの身体状態に関する質問用紙に記入した。食事を、１０分間落ちついて摂らせた。空腹時および食事摂取から１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０分後に、血清インスリンおよび血漿血中グルコース分析のために、毛細管血を収集した。
【００３４】
グルコース分析
β−グルコース分析装置（Hemocue 201+, Hemocue AB, Aengelholm, Sweden）を用いて血中グルコースを決定した。
【００３５】
インスリン分析
血清インスリン試料を−２０℃で貯蔵した。分析は、酵素免疫測定キット（Mercodia Insulin Elisa; Mercodia AB, Uppsala, Sweden）を使用することにより、総合型免疫測定分析装置（CODA Open Microplate System; Bio-Rad Laboratories, Hercules CA）上で実施された。
【００３６】
計算と統計的分析
各参加者および各被験飲料について、血中グルコースおよび血清インスリンに関する０〜４５分および０〜１２０分での増分的曲線下面積（ＡＵＣ）を、GraphPad PRISM (version 3.02; GraphPad Software Inc, San Diego)を使用して計算した。ベースライン下の全ての面積は、計算から除外した。血中グルコース、および血清インスリンを各時点で統計的に分析した。統計的計算はMINITAB Statistical Software (release 13.1 for windows)を用いて実施した。一般線形モデル（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキー多重比較検定またはダネット検定により、有意性を判定した。Ｐ＜０．０５という結果をもたらした差異が、有意とみなされた。
【００３７】
血漿グルコース
グルコース曲線下の初期（０〜４５分）面積も後期（０〜９０分）面積も同様に、グルコース基準に比べブルーベリー飲料の摂取後に有意な形で低下していた。ブルーベリー飲料についてのＧＩ値は、間隔５８〜６４の中に充分集められ、グルコース基準（ＧＩ＝１００）よりも有意に低下していた。血漿グルコースは図１に示されている。
【００３８】
【表２】
【００３９】
血清インスリン
異なるブルーベリー飲料摂取後のインスリン応答および基準は、図２に示されている。３０〜６０分の間隔内で、全てのブルーベリー飲料は、グルコース基準に比べて有意に低いインスリン応答を発生させた。１５分後、B-fermの摂取後のインスリンレベルは、グルコース基準に比べて有意に低かった。食後初期（０〜４５分のＡＵＣとして表現）において、B-fermは、B-HEAL19よりも低いインスリン応答を発生させた。
【００４０】
低温殺菌および発酵（Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19を用いた）またはブルーベリー原料へのラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の添加の重要性を試験するため、B-past、B-ferm、B-299vおよびB-HEAL19のインスリン応答を未処理対照飲料（B-untr）と比較した。摂取から３０分後に、B-fermは、B-treatedに比べ有意に低下していた。１２０分後に、B-299vおよびB-HEAL19は、B-untreatedに比べて著しく低いインスリン応答を示した。初期インスリン応答（０〜４５分ＡＵＣ）の比較から、B-fermが未処理ブルーベリー飲料に比べて有意に低いインスリン応答（２５％）を提供することが示された（Ｐ＜０．０５、表４）。低温殺菌もラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19各々の添加も、未処理のブルーベリー飲料との関係において、食後インスリン面積に有意な形で影響を及ぼさなかった。
【００４１】
【表３】
【００４２】
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19を用いたブルーベリーの発酵は、インスリン応答の低下の鍵となる要因であると思われる。結果は、発酵プロセスがインスリン終止を改善することを示唆している。
【００４３】
【表４】
【００４４】
ブルーベリー飲料後の食後血漿グルコース応答は同じレベルにあったことから、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19を含む発酵済みブルーベリー飲料の摂取後の２５％低いインスリン応答は、血漿グルコースの類似の減少と同時には見られなかった。しかしながら、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19を用いたブルーベリーの発酵は、発酵ブルーベリーを含有する飲料で見られたインスリン応答低下の鍵となる要因であるように思われる。この効果は、同じ細菌ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19が、摂取直前にブルーベリー飲料に添加された場合には見られない。したがって、インスリン応答の低下を発生させるのは細菌自体の存在ではなく、むしろ重要なのは発酵そのものである。この興味深い効果をひき起こす活発な機序は、発酵により産生されるかまたは修飾される構成要素すなわち、発酵後のブルーベリー内で利用可能な修飾型ポリフェノール構成要素に起因し得ると思われる。
【００４５】
要約すると、発酵ブルーベリー飲料は、未発酵ブルーベリー飲料に比べてインスリン応答を２５％削減したという結論を下すことができる。将来は、代謝性障害を患う人々を目的とする製品が、２型糖尿病および内皮障害の発生を予防させ恐らくは減少もさせる付加的な方法を提示できるものと思われる。好ましくは問題の全ての側面すなわち栄養面および臨床的側面のみならず社会的、文化的および経済的側面をも統合することによって、より大きな観点で「代謝性障害の蔓延」を考慮して、西欧諸国および開発途上国において全体的に健康的なライフスタイルを導入することができるかもしれない。全ての消費者の知識が増大することで、業界を市場の要望に従わせることが望まれる。
【００４６】
生菌を含む飲料についての効果を細菌が除去された飲料についての効果と比較する試験
Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19の培養液を発酵後に低温殺菌した飲料が、Ｌ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19の培養液を発酵後に生きた状態に保っている飲料と同じ低いインスリン応答を提供するか否かを評価するために、２つの異なる被験飲料を含み入れた。
【００４７】
被験飲料は、低温殺菌されＬ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19で発酵された１つの飲料と、低温殺菌されＬ．プランタラム（L. plantarum）HEAL19で発酵され次に発酵後低温殺菌された１つの飲料からなっていた。ブルーベリー（バクシニウム・ミルティルス（Vaccinium myrtillus））をピューレ状態に混合し、その後−２０℃で貯蔵した。解凍後、ブルーベリーを水で希釈させ（１：１）、家庭用ミキサーを用いて５分間均質化させた。その後ブルーベリーを再度希釈し（１：１）、２５％のブルーベリー溶液を得た。その後、ブルーベリー溶液を、高性能分散装置（Ultra Turrax T25, Janke & Kunkel IKA, Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Germany）を用いて２５０００ｒｐｍで均質化させた。未発酵ブルーベリー飲料用の試料を採取し（B-untreated）、食事試験で使用するまで−２０℃で凍結させた。残りのブルーベリー溶液を低温殺菌し（９４℃、２秒）、−２０℃で貯蔵した（B-past.）。
【００４８】
供与のおよそ一週間前に、６００ｍｌの殺菌されたブルーベリー溶液を容器内で発酵させ、ｐＨを５に調整するためにＫＯＨを添加した。その後、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19（１×１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を用いてブルーベリー溶液に接種した。窒素源として加熱滅菌したソラマメの花１グラムを加えた。１×１０９／ｍｌ（ｐＨ３．８）という最終ｃｆｕに達するまで２０時間、ブルーベリー溶液を発酵させた。発酵後、ブルーベリー溶液を４℃で貯蔵し、再び低温殺菌させ（９４℃、２秒）４℃で貯蔵した。発酵はProbi AB (Lund, Sweden)が実施した。
【００４９】
表５は、被験飲料および基準の異なる組成を示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】
供与の前に、７２．８ｍｇのアスコルビン酸、３２０．１ｍｇのtrecomex（ジャガイモ加工デンプン）、２９１ｍｇのＣＮＫ（カラギナンＥ４０７）および２６．１８ｇのスクロースを、各ブルーベリー飲料に添加した。さらに、１．１８ｇのグルコースをB-fermented飲料に添加して、発酵中のこの炭水化物の損失を補填した。最終的に、２０％のブルーベリーおよび３０ｇの炭水化物を含む３００ｇのブルーベリー飲料が得られるように、全てのブルーベリー飲料を３２．０ｇの水で調整した。
【００５２】
被験飲料試験
全ての飲料を朝食として供与し、少なくとも５日あけて無作為に提供した。全ての対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。これらの対象はまた、試験中いつでも特段の説明無く自主的に中止できるという事実を充分認識していた。ルンド大学医学部倫理委員会は、この試験を承認した。
【００５３】
被験対象
１３名の健常な非喫煙ボランティアが、緊急食事試験に参加した。平均年令は２５．５±１．３４（平均±ＳＤ（標準偏差））才であり、平均肥満度指数は正常範囲（２０．８±０．２４ｋｇ／ｍ２；平均±ＳＤ）内であった。対照の一人は１つの試験の前日に胃腸障害を起こすインフルエンザを患い、したがって試験から除外された。対象は、いかなる薬物治療も受けていなかった。対象には、試験前日のアルコール摂取、身体活動および繊維が豊富な夕食を避けるように依頼した。対象は、各試験機会の前夜、午後９時〜１０時の間に個々に選択された量のＷＷＢを食べた。試験全体にわたり、個々に選択されたスライスの量を等しく保った。ＷＷＢ食の後、対象には、研究所に到着するまで何も摂取しないよう依頼した。ただし必要な場合は、午後１０時以降、少量の水分の摂取は許された。各対象は、少なくとも１週間あけて４回の試験実施に参加した。
【００５４】
試験設計および血液試料採取
対象は、朝７時４５分に研究所に到着し、末梢カテーテルが肘正中動脈内に挿入された。毎回、全ての参加者は、ストレスまたは不安の感情を含めたその日の自らの身体状態に関する質問用紙に記入した。食事を、１０分間落ちついて摂らせた。空腹時および食事摂取から１５、３０、６０、９０、１２０分後に、血清インスリンおよび血漿血中グルコース分析のために、毛細管血を収集した。
【００５５】
グルコース分析
β−グルコース分析装置（model no. 120401, Hemocue AB, Aengelholm, Sweden）を用いて血中グルコースを決定した。
【００５６】
インスリン分析
血清インスリン試料を−２０℃で貯蔵した。分析は、酵素免疫測定キット（Mercodia Insulin Elisa; Mercodia AB, Uppsala, Sweden）を使用することにより、総合型免疫測定分析装置（CODA Open Microplate System; Bio-Rad Laboratories, Hercules CA）上で実施された。
【００５７】
計算と統計的分析
各参加者および各被験飲料について、血中グルコースおよび血清インスリンに関する０〜４５分および０〜１２０分での増分的曲線下面積（ＡＵＣ）を、GraphPad PRISM (version 3.02; GraphPad Software Inc, San Diego)を使用して計算した。ベースライン下の全ての面積は、計算から除外した。血中グルコース、および血清インスリンを各時点で統計的に分析した。統計的計算はMINITAB Statistical Software (release 13.1 for windows)を用いて実施した。一般線形モデル（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキー多重比較検定またはダネット検定により、有意性を判定した。Ｐ＜０．０５という結果をもたらした差異が、有意とみなされた。
【００５８】
血漿グルコース
図４を見ればわかるように、グルコース曲線の下の初期（０〜４５分）面積も後期（０〜１２０分）面積も同様に生菌を伴う被験飲料に比べ発酵後低温殺菌された被験飲料の摂取後わずかに低下していた。血中グルコースが空腹時値より上にとどまっている期間を、空腹時値からの血中グルコースの最大増加で除することによって、グルコース曲線のプロフィールを分析した。この商は、グルコース持続時間／ピーク定数と呼ばれる（分／ΔｍＭ）。グルコース持続時間／ピーク定数の高い値は、グルコース曲線が長く低いことを意味し、低い値は、短く高い曲線を伴う好ましくない曲線プロフィールを表わす。この試験には基準が一切含み入れられなかったため、ＧＩ値は全く判定できなかった。
【００５９】
【表６】
【００６０】
【表７】
【００６１】
血清インスリン
２つのブルーベリー飲料を摂取した後のインスリン応答は、図５に示されている。生菌を含む被験飲料に比べて発酵後低温殺菌された被験飲料摂取後にＡＵＣは低下していた。この試験には基準が一切含み入れられなかったため、ＩＩ値は全く判定できなかった。
【００６２】
【表８】
【００６３】
論述
両方の飲料とも、グルコースについてほぼ同じ応答を示した。低温殺菌された、すなわち細菌が死滅した飲料は、生菌を含む飲料に比べインスリン応答について優れた結果を示した。以前の試験においては、低温殺菌のみではインスリン応答に対する効果が全く見られなかった。すなわち、低温殺菌されたブルーベリーは、低温殺菌されていないブルーベリーと同じ結果をもたらした。しかしながら、本試験は、発酵後の熱処理の度合がインスリン応答に大きく影響し得るということを表わしている。
【００６４】
この効果の機序については、さらに評価する必要がある。１つの理論としては、より強力な熱処理がブルーベリー内のポリフェノールおよびその他の生物活性構成要素に対する効果を通してインスリン低下効果を提供し、このことは、熱処理の追加ステップによって熱滅菌された細菌を伴う飲料によって例示されるという考え方である。
【００６５】
ポリフェノール化合物分析
ポリフェノール含有植物材料の修飾が起こることの証拠を提供するため、発酵前後のローズヒップピューレ、ブルーベリー、ブルーベリーピールおよびコケモモピール内のカテキン、エピカテキン、プロアントシアニジンダイマーアグリコン、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの含有量を比較する試験を行なった。
【００６６】
その他の微生物が発酵に影響を及ぼすのを回避するため、発酵前に全ての果物画分を低温殺菌した。
【００６７】
フェノール化合物の分析のため、試料を秤量し、抽出用の溶液を添加した（試料中の濃度：５０％のエタノール、０．０５Ｍのリン酸、あるいは５０％のメタノール、０．５％）。その後、試料を超音波浴内で１０分間抽出し、その後遠心分離し、さらにその後上清をバイアルに移し、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により分析した。Salminen et al. Characterisation of proanthocyanidin aglycones and glycosides from rose hips by high-performancce liquid chromatography-mass spectrometry、and their rapid quantification together with Vitamin C. J Chrom A 2005; 1077:170-180、およびSalminen et al. Characterisation of hydrolysable tannins from leaves of Betula pubescens by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. J Chrom A 1999; 864: 283-291にある通り、API 150 EX TurboによってＨＰＬＣ−ＭＳ分析を実施した。
【００６８】
計器を、マイナスモードに設定した。すなわちマイナスイオンを分析した。ＨＰＬＣ系は、Perkin Elmer LC-200 Micro PumpタイプのＨＰＬＣポンプおよびPerkin Elmer 200 Autoサンプラからなっていた。試料の注入体積は８μｌであった。
【００６９】
９０〜１０００ｍ／ｚの間の質量数にわたり、走査を実施した。
【００７０】
検出のために用いられる具体的質量数：
カテキン、ｍ／ｚ２８９（Ｍ−Ｈ）
エピカテキン、ｍ／ｚ２８９（Ｍ−Ｈ）
プロシアニジンＢ２、ｍ／ｚ５７７（Ｍ−Ｈ）
プロアントシアニジンダイマーアグリコン、ｍ／ｚ５７７（Ｍ−Ｈ）
プロアントシアニジントリマーアグリコン、ｍ／ｚ８６５（Ｍ−Ｈ）
プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、ｍ／ｚ１１５３（Ｍ−Ｈ）
３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ｍ／ｚ１８１（Ｍ−Ｈ）
Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、ｍ／ｚ１６５（Ｍ−Ｈ）
プロトカテク酸、ｍ／ｚ１５３（Ｍ−Ｈ）
シアニジン−３−ガラクトシド、シアニジン−３−グルコシド、ｍ／ｚ４４７（Ｍ−Ｈ）
【００７１】
試験の結果は、図６を見るとわかり、これは、ブルーベリーならびにコケモモおよびローズヒップの両方においてポリフェノール含有植物材料の修飾が起こることを示している。
【００７２】
【表９】
【００７３】
ラットに対する試験において、選択されたフェノール化合物の盲腸内の濃度は、ローズヒップのみが消費された場合に比べ、ローズヒップに加えてラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19が消費された場合異なるものであることが示された（表１０）。このことは、盲腸内での発酵中にポリフェノール構成要素が修飾されたことを表わしている。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を用いた発酵の比較試験
ポリフェノール含有植物材料の修飾が、その他の細菌を用いて発酵させた場合にも起こることの証拠を提供するために、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）での発酵の前後のブルーベリー中のカテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２、プロアントシアニジントリマーアグリコン、プロアントシアニジンテトラマーアグリコン、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、Ｌ−（−）−３−フェニル乳酸、プロトカテク酸およびシアニジン−３−ガラクトシド／シアニジン−３−グルコシドの含有量を比較する試験を実施した。
【００７６】
試験の結果は図７を見るとわかり、これは、ポリフェノール含有植物材料の修飾が、試験された全ての細菌すなわちラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299vまたはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を用いた発酵の後に起こるということを示している。
【００７７】
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を修飾するための方法であって、
ａ） 少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒を混合して混合物を提供するステップと；
ｂ） 前記混合物を加熱して、存在する細菌種を除去し、加熱混合物を提供するステップと；
ｃ） 少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株および任意には少なくとも１つのタンパク質源を、前記加熱混合物に対し任意の順序でまたは同時に添加して発酵混合物を提供するステップと；
ｄ） 前記発酵混合物を前記発酵混合物の発酵に適した条件に付して１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと；
ｅ） 任意に、前記ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を除去して、生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのポリフェノール含有植物材料および前記少なくとも１つの溶媒の混合物が均質化によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）の加熱が６０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜１００℃、より好ましくは９０℃〜１００℃で行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱混合物のｐＨが、約４．５〜９、好ましくは５〜７の範囲内のｐＨ値に調整される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株が、混合物１ｍｌあたり約１０５〜１０９ｃｆｕの量で添加される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのタンパク質源が、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せを含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのタンパク質が、前記混合物の０．０００１〜０．１重量％の量で添加される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株がラクトバシラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ウィッセラ属（Weissella）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）および 系統発生学的に関連する属を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのポリフェノール修飾用ラクトバシラス属（Lactobacillus）菌株が、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバシラス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）およびラクトバシラス・アルゲントラテンシス（Lactobacillus argentoratensis）を含む系統発生学的群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）が、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299、DSM6595、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v、DSM15316、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL9、DSM15312、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、DSM DSM15313およびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL99、DSM15316を含む菌株群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵条件が、大気圧下液体培地中で３０℃〜５０℃の温度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵が、５未満好ましくは４未満のｐＨ値に達するまで進行する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株の除去が、加熱、紫外線、ガンマ線、圧力、電流、放電、パルス電場、無菌化ろ過または電気ショックによって行なわれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料が、果物、野菜、ベリー類、茶、緑茶、コーヒー、ココア、穀物、チョコレートおよび樹皮を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記果物およびベリー類が、ブルーベリー、コケモモ、クランベリー、リンゴ、バナナ、クロフサスグリ、イチゴ、木イチゴ、ローズヒップ、ブドウ、カンキツ類、アロニア、ボケ、アメリカスモモ、ローズヒップおよびエルダーベリー、ケーパーベリー、オリーブまたはその他のポリフェノールに富む果実の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹皮がシナモンから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記穀物が、オートムギ、大麦、小麦、ソルガム、キビ、コメおよびトウモロコシから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
糖尿病、メタボリック症候群、肥満症および血管心臓疾患の予防または治療向けの組成物の製造を目的とする、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物の使用。
【請求項１９】
前記組成物が医薬組成物または食物組成物である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記食物組成物が食品または食物サプリメントである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記食品が、パン、チーズ、ヨーグルトジュース、栄養ドリンク、栄養バー、スプレッド、ビスケットおよびシリアルを含む群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項１】
１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料を修飾するための方法であって、
ａ） 少なくとも１つのポリフェノール含有材料と少なくとも１つの溶媒を混合して混合物を提供するステップと；
ｂ） 前記混合物を加熱して、存在する細菌種を除去し、加熱混合物を提供するステップと；
ｃ） 少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株および任意には少なくとも１つのタンパク質源を、前記加熱混合物に対し任意の順序でまたは同時に添加して発酵混合物を提供するステップと；
ｄ） 前記発酵混合物を前記発酵混合物の発酵に適した条件に付して１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと；
ｅ） 任意に、前記ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株を除去して、生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物を提供するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのポリフェノール含有植物材料および前記少なくとも１つの溶媒の混合物が均質化によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）の加熱が６０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜１００℃、より好ましくは９０℃〜１００℃で行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱混合物のｐＨが、約４．５〜９、好ましくは５〜７の範囲内のｐＨ値に調整される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株が、混合物１ｍｌあたり約１０５〜１０９ｃｆｕの量で添加される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのタンパク質源が、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せを含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのタンパク質が、前記混合物の０．０００１〜０．１重量％の量で添加される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのポリフェノール修飾用乳酸菌菌株がラクトバシラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ウィッセラ属（Weissella）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）および 系統発生学的に関連する属を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのポリフェノール修飾用ラクトバシラス属（Lactobacillus）菌株が、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバシラス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）およびラクトバシラス・アルゲントラテンシス（Lactobacillus argentoratensis）を含む系統発生学的群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）が、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299、DSM6595、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v、DSM15316、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL9、DSM15312、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL19、DSM DSM15313およびラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HEAL99、DSM15316を含む菌株群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵条件が、大気圧下液体培地中で３０℃〜５０℃の温度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵が、５未満好ましくは４未満のｐＨ値に達するまで進行する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリフェノール修飾用乳酸菌菌株の除去が、加熱、紫外線、ガンマ線、圧力、電流、放電、パルス電場、無菌化ろ過または電気ショックによって行なわれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のポリフェノール含有植物材料が、果物、野菜、ベリー類、茶、緑茶、コーヒー、ココア、穀物、チョコレートおよび樹皮を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記果物およびベリー類が、ブルーベリー、コケモモ、クランベリー、リンゴ、バナナ、クロフサスグリ、イチゴ、木イチゴ、ローズヒップ、ブドウ、カンキツ類、アロニア、ボケ、アメリカスモモ、ローズヒップおよびエルダーベリー、ケーパーベリー、オリーブまたはその他のポリフェノールに富む果実の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹皮がシナモンから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記穀物が、オートムギ、大麦、小麦、ソルガム、キビ、コメおよびトウモロコシから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
糖尿病、メタボリック症候群、肥満症および血管心臓疾患の予防または治療向けの組成物の製造を目的とする、１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物または生菌乳酸菌を含まない１つまたは複数の修飾型ポリフェノール含有植物材料の混合物の使用。
【請求項１９】
前記組成物が医薬組成物または食物組成物である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記食物組成物が食品または食物サプリメントである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記食品が、パン、チーズ、ヨーグルトジュース、栄養ドリンク、栄養バー、スプレッド、ビスケットおよびシリアルを含む群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２９９６２（Ｐ２０１０−５２９９６２Ａ）
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１１４３（Ｐ２０１０−５１１１４３）
【出願日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０００３８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０２１２
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０９２４３３００）プロビ アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０００３８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０２１２
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０９２４３３００）プロビ アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
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