ポリフェノール類化合物の吸収促進剤及びポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法
【課題】広範囲の飲料および食品に適用可能な、ポリフェノール類化合物の吸収促進剤及びポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法を提供する。
【解決手段】セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種をポリフェノール類化合物の吸収促進剤の有効成分とする。また、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法において、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加するか、又はセリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する。
【解決手段】セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種をポリフェノール類化合物の吸収促進剤の有効成分とする。また、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法において、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加するか、又はセリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール類化合物の吸収促進剤及びポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
緑茶は日本人が古くから親しんできた飲料であり、近年では容器詰緑茶飲料の普及もあって、非常に多く飲用されている。緑茶には茶カテキンと総称される一群のフラバノール化合物が含まれており、抗腫瘍効果、抗血小板凝集効果、抗高血圧効果、抗肥満効果 、抗酸化効果など、健康にとって有益な多くの機能を有することが知られている。しかし、茶カテキンを経口的に摂取しても一般に吸収率が低く、摂取量の極一部分しか体内に吸収されない。このため、茶カテキンの吸収性を高める工夫が多くなされてきた。
【０００３】
例えば、下記特許文献１には、緑茶飲料中の茶カテキン濃度を高め、茶カテキンの摂取量を多くすることにより、茶カテキンの吸収量ならびに血中濃度を高める方法が開示されている。しかし、この方法では茶カテキン濃度が高くなることにより、茶カテキンに特有の苦味・渋味が強くなるため、緑茶飲料中に添加できる茶カテキンの量には限界があるほか、原料の茶カテキンを多量に使用することになるため、経済的な負担が増加するなどの問題があった。このほか、下記特許文献２には、飲料中のアルコール沈殿性物質の量を低減することにより茶カテキンの吸収率を高める方法が開示されている。しかし、この方法はアルコール沈殿性物質量を一定の含有量以下とするために精製、酵素処理等の操作を追加しなければならず、製造工程が煩雑になりコストが嵩むという問題があった。また、紅茶飲料中に含まれる茶カテキンのエピ体と非エピ体の含有量を一定の条件を満たすように配合することにより茶カテキンの吸収率を高める方法が知られている（下記特許文献３、及び特許文献４参照。）しかし、エピ体および非エピ体の含有量に関する要件は、一般家庭で飲用される緑茶等では通常満たされており、容器詰飲料のうちの紅茶飲料以外の飲食品への応用は難しいと考えられる。更には、下記特許文献５には、緑茶中のエピガロカテキンガレート（EGCG）およびカフェインの含有量が所定の関係を満たすように配合することによりエピガロカテキンガレート（EGCG）の吸収を促進する方法が開示されている。しかし、合成吸着剤カラムを用いたクロマト処理等でカフェインを除去する処理を行わなくてはならず、本来の味や風味の成分までも損ねてしまうという問題があった。
【特許文献１】特開２００２−１４２６７７号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６４１号公報
【特許文献３】特開２００３−３３３９８９号公報
【特許文献４】特開２００４−４１１８６号公報
【特許文献５】特開２００７−１５１４６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、緑茶には茶カテキンと総称される一群のフラバノール化合物が含まれており、抗腫瘍効果[Katiyar SK and Mukhtar H （1996） Int J Oncol 7：133-141； Bu-Tian JI et al. （1997） Int J Cancer 70：255-258； Su LJ and Arab L（2002） Public Health Nutr 5：419-425]、抗血小板凝集効果[Duffy SJ et al. （2001） Arterioscler Thromb Vasc 21：1084-1089]、抗高血圧効果 [Negishi H et al. （2005） J Nutr 134：38-42]、抗肥満効果 [Nagao T et al.（2005） Am J Clin Nutr 81：122-9； Murase T et al. （2002） Int J Obes 26：1459-64]、抗酸化効果[ Sano M et al. （2003） J Agric Food Chem 51：2912-2916] など、健康にとって有益な多くの機能を有することが知られている。緑茶中に含まれる主要な茶カテキンは、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレートの８種類であるが、その中でも総茶カテキンの約５０％を占めるエピガロカテキンガレート（以下、「EGCG」という。）は、他と比較して高い生理活性を有するとされている。
【０００５】
しかし、茶カテキンは一般に吸収率が低く、ことに EGCG の吸収率は非常に低いため、摂取量の極一部分しか体内に吸収されない [ラットでの研究結果は Chen L et al. （1997） Drug Metab Dispos 25：1045-1050； Zhu M et al. （2000） Planta Med 66：444-447] [ヒトでの研究結果はWarden BA et al. （2001） J Nutr 131：1731-1737； Chow et al. （2001） Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10：53-58； Vaidyanathan and Walle （2001） Pharm Res （NY） 18：1420-1425]。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、広範囲の飲料および食品に適用可能で、摂取する茶カテキン、その中でも特に生理作用が強い EGCG の吸収性を顕著に向上させることが可能な、茶カテキンの吸収性を改善する方法を見出すことであり、これを利用して茶カテキン、ことに EGCG の吸収性が改善された飲食品ならびに茶カテキンの吸収性を改善するための飲食品素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、Caco-2培養細胞を用いた測定系により EGCG の吸収効率を高めることができる食品および食品成分を探索した。その結果、いくつかの食品および食品成分にEGCGの吸収を顕著に促進する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記のとおりである。
[１] 下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とするポリフェノール類化合物の吸収促進剤。
【０００８】
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
[２] 前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である上記[１]記載の吸収促進剤。
[３] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である上記[１]記載の吸収促進剤。
[４] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である上記[１]記載の吸収促進剤。
[５] ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
【０００９】
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
[６] 下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
【００１０】
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
[７] 前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である上記[５]又は[６]記載の製造方法。
[８] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である上記[５]又は[６]記載の製造方法。
[９] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である上記[５]又は[６]記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、セリン又はその塩類、アスパラギン酸又はその塩類、リンゴ酸又はその塩類、カプリン酸、その塩類又はそのエステル類、ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種をそれぞれ単独あるいは組み合わせて摂取することにより、ポリフェノール類化合物、例えば茶カテキンの吸収率を顕著に向上させることができる。したがって、少量の摂取によっても従来と同等あるいはそれ以上の効果を得ることが可能となる。また、吸収率が高まれば、これらの血中濃度を有効濃度に到達させるために必要な飲食品中の配合量を従来よりも少なくすることができるので、ポリフェノール類化合物、例えば茶カテキンに特有の苦味・渋味などを感じさせない、又はそれらの低減された、摂取しやすい飲食品を提供することができる。更に、原料として必要な量を減らすことができるので経済的である。これらの食品および食品成分はそれぞれ単独でEGCGの吸収を促進する効果を有するが、２種類以上を組み合わせることにより更に大きな吸収促進効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について好ましい態様を挙げて、更に詳細に説明する。
【００１３】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるセリンは、非必須アミノ酸の一種であり、細胞膜の構成成分であるホスファチジルセリンの原料として重要である。食品中ではそのほとんどがタンパク質の形で存在しており、多くの食品中に含まれている栄養素である。L-セリンは既存添加物として認可されており、調味料、栄養強化剤として広く使用されている。また、セリンの塩類としては、セリン塩酸塩、セリン硫酸塩、セリンリン酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるアスパラギン酸は、非必須アミノ酸の一種であり、酸性アミノ酸に分類される。様々な食品中に含まれており、L-アスパラギン酸は既存添加物に認可され、調味料、栄養強化剤として使用されている。また、アスパラギン酸の塩類としては、アスパラギン酸ナトリウム、アスパラギン酸カリウム、アスパラギン酸マグネシウム、アスパラギン酸カルシウム等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、L-アスパラギン酸のナトリウム塩は、指定添加物に認可され、調味料、栄養強化剤として使用されている。
【００１５】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるリンゴ酸は、ヒドロキシ酸に分類される有機化合物の一種であり、りんごなどに含まれている成分である。また、リンゴ酸の塩類としては、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、リンゴ酸マグネシウム、リンゴ酸カルシウム等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、DL-リンゴ酸、DL-リンゴ酸ナトリウムは指定添加物として認可されており、酸味料やpH調整剤の用途で食品添加物として広く使用されている。一日の摂取許容量（ADI）も設定されておらず、極めて安全性の高い成分として認識されている。
【００１６】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるグレープフルーツ果汁の原料であるグレープフルーツは、そのまま生で食べるほか、ジュースやカクテル、サワーなどに用いられる、食経験豊富な柑橘類である。
【００１７】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるカプリン酸は炭素数１０、ラウリン酸は炭素数１２の飽和脂肪酸であり、共にココナッツオイルやヤシ油に多く含まれている。また、カプリン酸又はラウリン酸の塩類としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等との塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、カプリン酸又はラウリン酸のエステル類としては、メチルエステル、エチルエステル、グリコールエステル、グリセリンエステル、ショ糖エステル等のエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、カプリン酸エチル（別名：デカン酸エチル）は指定添加物に認可されている。
【００１８】
本発明においては、ポリフェノール類化合物、好ましくはフラボノイド類化合物、更により好ましくはカテキン類化合物を経口的に摂取する際に、上記有効成分を単独で又は組み合わせて摂取することで、ポリフェノール類化合物、フラボノイド類化合物、又はカテキン類化合物の体内への吸収を促進させることができる。ポリフェノール類化合物としては、例えば、お茶等に含まれるカテキン類化合物を好ましく例示できる。ここで、カテキン類化合物とは、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレートなどの非エピ体カテキン類及びそのメチル化体などの誘導体、またはエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレートなどのエピ体カテキン類及びそのメチル化体などの誘導体を併せた総称である。なかでも、エピガロカテキンガレート及びそのメチル化体などの誘導体を特に好ましく例示できる。
【００１９】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤の有効性を発揮するための上記有効成分の好ましい摂取量としては、後述する試験例の結果から概算すると、１日あたり、セリンの場合には、０．０５〜１１０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０〜９０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０〜２５ｍｇ／体重１ｋｇであり、アスパラギン酸の場合には、０．０５〜１３０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０〜１１０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０〜３０ｍｇ／体重１ｋｇであり、リンゴ酸の場合には、０．０５〜２６０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０〜２２０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０〜６０ｍｇ／体重１ｋｇであり、カプリン酸の場合には、０．００４〜２５ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇであり、ラウリン酸の場合には、０．０１〜２５ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは２〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは２〜６ｍｇ／体重１ｋｇであり、グレープフルーツ果汁の場合には、固形分換算で、５〜１００００ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０００〜８０００ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０００〜２０００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００２０】
また、ポリフェノール類化合物の吸収を効果的に高めるための質量比としては、ポリフェノール類化合物１ｍｇあたり、セリンの場合には、０．０１〜３０ｍｇ、より好ましくは２〜２０ｍｇ、更により好ましくは２〜５ｍｇであり、アスパラギン酸の場合には、０．０１〜４０ｍｇ、より好ましくは２〜３０ｍｇ、更により好ましくは２〜６ｍｇであり、リンゴ酸の場合には、０．０１〜７０ｍｇ、より好ましくは２〜５０ｍｇ、更により好ましくは２〜１５ｍｇであり、カプリン酸の場合には、０．００１〜６ｍｇ、より好ましくは０．２〜４ｍｇ、更により好ましくは０．２〜３ｍｇであり、ラウリン酸の場合には、０．００２〜７ｍｇ、より好ましくは０．４〜５ｍｇ、更により好ましくは０．４〜２ｍｇであり、グレープフルーツ果汁の場合には、固形分換算で、１〜２６００ｍｇ、より好ましくは２００〜１８００ｍｇ、更により好ましくは２００〜５００ｍｇである。
【００２１】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤においては、その総量当たり、上記有効成分を、セリンの場合には、固形分換算で１．０〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、アスパラギン酸の場合には、固形分換算で１．０〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、リンゴ酸の場合には固形分換算で１．５〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、カプリン酸の場合には固形分換算で１．５〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、ラウリン酸の場合には固形分換算で１．０〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、グレープフルーツ果汁の場合には、固形分換算で１．５〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい。含有量がそれぞれの下限未満であると、十分な効果を得るには、飲食品への添加量を増加したり、摂取量を増やす必要が生じる。
【００２２】
また、上記の基本的成分以外に、炭水化物、食物繊維、たんぱく質、ビタミン類等を含むことができる。
【００２３】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤は、医薬品、健康食品、加工食品等の各種分野で用いられ、医薬の有効成分、食品原料等として使用することができる。
【００２４】
例えば、医薬品とする場合には、薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化し、医薬組成物として提供することができる。この医薬組成物には、基材や担体の他、薬学的に許容されることを限度として、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、抗菌剤、防腐剤、香料、顔料、界面活性剤、安定剤、溶解補助剤等の添加剤を任意に配合してもよい。そして、当該医薬組成物の形態としては、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、ゼリー剤、トローチ剤等の剤型が例示できる。
【００２５】
また、本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤を飲食品に添加して摂取する場合には、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等に配合して用いることができる。このような食品としては、例えば、チョコレート、ビスケット、ガム、キャンディー、クッキー、グミ、打錠菓子等の菓子類；シリアル；粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓が挙げられる。また、特定保健用食品や栄養補助食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠等の形態のものであってもよい。
【００２６】
一方、本発明のもう一つは、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、セリン又はその塩類、アスパラギン酸又はその塩類、リンゴ酸又はその塩類、カプリン酸、その塩類又はそのエステル類、ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加する工程を含む、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法である。また、本発明の他のもう一つは、セリン又はその塩類、アスパラギン酸又はその塩類、リンゴ酸又はその塩類、カプリン酸、その塩類又はそのエステル類、ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する工程を含む、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法である。
【００２７】
本発明の飲食品又は飲食品素材の製造方法においては、上記基本成分を添加する工程に、その飲食品又は飲食品素材に応じた公知の方法、又はこれに準じた方法にしたがって、適宜他の工程を施すことにより、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下に例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
＜試験例１＞（in vitroのEGCG吸収測定系の確立）
経口摂取した茶カテキンの体内吸収の場は、腸管、ことに小腸、が主要な場であると考えられている。茶カテキン、ことにEGCG、の小腸吸収を促進する食品および食品成分を広範な対象から簡便にスクリーニングするために、本発明者らはヒト結腸癌由来Caco-2細胞株（American TypeCulture Collection） を用いた小腸上皮モデルによるinvitroのEGCG吸収測定系を確立した。以下に具体的な方法と結果を示す。
【００３０】
Caco-2細胞は培養を３週間程度継続する間に自然に分化し、小腸上皮様の多くの特質を示すことが知られている。Caco-2細胞は、5% CO2を含む加湿した空気の存在下で、75cm2のプラスチックフラスコ中にて、10%非働化ウシ胎児血清（HyClone社製） 、50 U/mL ペニシリン-50 μg/mLストレプトマイシン （GIBCO社製）および1%非必須アミノ酸 （GIBCO社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM， pH7.4； GIBCO社製）中 で培養した。細胞は、80〜90%コンフルエントに到達する5〜8日毎に継代して維持した。以下に述べるEGCGの吸収実験は、継代数30〜70のCaco-2細胞を用いて実施した。
【００３１】
EGCGの吸収実験は、直径12 mmのTranswell（ポリカーボネートフィルターの培養面積1.13 cm2, ポアサイズ0.4 μm； Corning社製） 上で培養したCaco-2細胞単層を用いて行った。Caco-2細胞をTranswell のインサート上に1.0×105 cells/cm2の密度で播種し、2日おきに新たな培地に交換しつつ培養を継続し、MillicellERSメーター （Millipore社製） を用いて経上皮電気抵抗値（以下、「TEER」という。） を測定することによって細胞単層のタイトジャンクションの完成度をモニターし、タイトジャンクションの形成が完成したことを確認できたものを実験に使用した。TEERの平均値は、播種後4週目に500〜1,000Ωcm2に達し、その後7週目まで安定に保持された。吸収実験に用いたCaco-2細胞単層は、播種後4〜6週目のものを用いた。
【００３２】
Caco-2細胞単層が乗ったTranswellインサートの上部 （絨毛側） の培地をpH 5.5のHanks’ Balanced SaltSolution-like Transport Medium （絨毛側HBSS溶液； 10 mM MES, 5mM グルコース,10 mMグルタミン, 1 mM アスコルビン酸含有）に、また、インサート下部 （漿膜側） の培地をpH 7.4のHBSS（漿膜側HBSS溶液； 10 mM HEPES, 5mM グルコース,10 mMグルタミン, 1 mM アスコルビン酸含有） に置換して2回繰り返して洗った後、絨毛側に0.5 mL、漿膜側に1.5mLの各HBSS溶液を新たに加えて、5% CO2存在下で37℃にて30分間インキュベーションした。30分経過後にTEERを測定した後、再度上下の溶液を新たなHBSS溶液に置換して30分間インキュベーションし、再びTEERを測定した。この時点を吸収開始後0時間とした。
【００３３】
EGCGは中性〜アルカリ性の水溶液中では酸化されやすく不安定であるが、絨毛側HBSS溶液中に1 mMのアスコルビン酸を添加し、且つ、pHを5.5に保つことにより、吸収実験の実施時間中、EGCGは完全に安定に維持された。また、測定系の絨毛側および漿膜側HBSS溶液中に10mMのグルタミンを添加することにより、Caco-2細胞のEGCG吸収能を4時間以上一定に維持できた。
【００３４】
吸収開始後0時間のTEERを測定後、インサート上下の溶液を新しいHBSS溶液に置換した。この時、Caco-2細胞単層の絨毛側HBSS溶液には、EGCG濃度が50μM、200μM、500μM、1000μMとなる様にEGCG試薬 （エピガロカテキンガレート，Cat. No. E4143；Sigma社製） あるいは緑茶エキス （緑茶熱水抽出物, No. 16714；三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製） を添加した。5% CO2存在下で37℃に1時間インキュベーションし、TEERを測定した後、インサート上の絨毛側HBSS溶液は交換せずにインサートを新しい漿膜側HBSS溶液の入ったウェルに移動し、さらに2時間インキュベーションした。2時間経過後TEERを測定し、吸収開始後0時間、1時間、3時間の漿膜側HBSS溶液中に含まれるEGCGの濃度を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、以下のようにして測定した。
【００３５】
漿膜側HBSS溶液中に含まれるEGCG濃度の測定は、150 mm×4.6mm （粒子径5μm）の逆相系カラム （Mightysil RP-18 GP； 関東化学株式会社製）を装着したHPLC装置 （CBM-20AまたはSCL-10Avp； いずれも株式会社島津製作所製）を用い、280 nmにおける吸光度の溶出パターンのピーク面積を測定することにより行った。カラム温度は40℃で行った。カラムからのEGCGの溶出はA液およびB液（A液：水/アセトニトリル/リン酸 = 700/10/1； B液： A液/メタノール =2/1）を用いた直線濃度勾配法により、流速0.5 mL/minで行った。まず、400μLの漿膜側HBSS溶液をカラムにインジェクションしたあと、0分から12分までの12分間100%A液を流し、55分までの43分間でB液の濃度を0から80%まで上昇させた。60分まで80%B液を流した後、65分までの5分間でA液の濃度を再び100%として１サイクル75分間の分析を完了した。サンプル中のEGCG濃度は、濃度既知のEGCG標準物質のピーク面積から作成した標準直線を用いて定量した。標準物質において、EGCGの保持時間は53分、検出感度は10nMであった。
【００３６】
Caco-2細胞の絨毛側へEGCG試薬溶液を添加したときの結果を図1に、緑茶エキス溶液を添加したときの結果を図２に示す。図1及び図２に明らかなように、いずれのEGCG濃度においても、漿膜側に吸収されたEGCG濃度はインキュベーション時間にほぼ比例して増加した。また、EGCGの吸収速度を、絨毛側へ添加したEGCGの濃度に対してプロットすると、絨毛側へ添加したEGCGの濃度にほぼ比例して増加していることが明らかとなった（図３）。また、異なる濃度のEGCG試薬を添加したときのTEERの経時変化は図４のとおりであり、TEERは時間経過により若干の低下傾向を示すものの、3時間の測定時間中は開始時のTEERが良好に維持されていた。
【００３７】
以上の結果より、Caco-2細胞単層を小腸吸収モデルとして用いることにより、EGCG試薬および緑茶からのEGCG吸収を簡便に測定することができることがわかる。即ち、EGCGを安定に保ちつつ、且つ、生体内に近い条件でEGCGの吸収を簡便に測定できるin vitro実験系を確立できた。
【００３８】
＜試験例２＞（Caco-2細胞のEGCG吸収を促進する食品および食品成分のスクリーニング）
上記試験例１のEGCG吸収測定系を用い、絨毛側に下記表1に示す種々の食品あるいは食品成分を添加してEGCGの吸収速度を測定し、無添加の場合の吸収速度と比較した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
具体的には、吸収開始後0時間の時点でCaco-2細胞の絨毛側へ1 mMのEGCG試薬と共に異なる濃度（2〜3濃度）の種々の食品あるいは食品成分を添加し、一定時間後に漿膜側へ吸収されたEGCG量をHPLCにより測定し、食品あるいは食品成分は添加せず1 mMのEGCG試薬のみを添加したときのEGCG吸収量と比較した。食品あるいは食品成分を添加しなかった場合のEGCG吸収速度を１として、各食品あるいは食品成分を添加した場合の相対的なEGCG吸収速度を求めた。その結果EGCGの吸収を有意に促進したものを表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２に示すように、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、グレープフルーツ果汁の6種の食品および食品成分は、それぞれ単独で、絨毛側への添加濃度依存的にEGCGの吸収を促進した。
【００４３】
＜試験例３＞（食品および食品成分の組み合わせによるEGCGの吸収促進効果）
EGCG吸収促進効果が認められた上記6種の食品あるいは食品成分のうち、ラウリン酸と同一の中鎖脂肪酸に属するカプリン酸を除いたセリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、グレープフルーツ果汁、ラウリン酸の5種類について、2種類ずつを組み合わせることによるEGCG吸収促進効果の相乗的あるいは相加的な効果について調べた。具体的には、試験例２と同様にして、Caco-2細胞の絨毛側へ1 mMのEGCGと同時に2種類の食品あるいは食品成分を組み合わせて添加し、漿膜側へのEGCG吸収速度を測定し、無添加の場合と比較した。その結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３に示すように、セリン＋アスパラギン酸、セリン＋リンゴ酸、セリン＋グレープフルーツ果汁、アスパラギン酸＋リンゴ酸、アスパラギン酸＋グレープフルーツ果汁、アスパラギン酸＋ラウリン酸、リンゴ酸＋グレープフルーツ果汁の組み合わせで、相加的なEGCG吸収促進効果が見られた。また、グレープフルーツ果汁＋ラウリン酸の組み合わせでは、EGCG吸収促進効果は相乗的であった。
【００４６】
また、このとき、細胞間タイトジャンクションの開閉度合いの指標となるTEERは、EGCGの吸収速度と逆相関の関係にあった。したがって、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、グレープフルーツ果汁、ラウリン酸、カプリン酸などの働きによって、Caco-2細胞の細胞間通路が開かれ、そこを通ってEGCGが漿膜側へ移行したものと推察された。また、EGCGが細胞内を経由して吸収される場合には硫酸抱合やグルクロン酸抱合される可能性があるため、漿膜側へ通過したEGCGの脱抱合処理を試みたが、抱合体の形で吸収されたEGCGは存在しなかった。このことは、Caco-2細胞においてEGCGは大部分が遊離体の形で吸収されることを示唆し、EGCGが上記の細胞間通路を通って吸収される可能性を示唆していた。
【００４７】
＜試験例４＞（ラットにおける食品および食品成分のEGCG吸収促進効果）
Caco-2細胞を用いた測定系でEGCGの吸収促進効果を示した上記の食品および食品成分が、動物が口から摂取した場合にも同様のEGCG吸収促進効果を有するかどうかについて調べた。具体的には、緑茶エキス溶液中に添加したセリンとリンゴ酸の最終濃度が(i)無添加、(ii)20 mMセリン＋40 mMリンゴ酸、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸、(iv)80 mM セリン＋160 mMリンゴ酸となるように4種類の投与液を準備し、それぞれの投与液をラットへ強制経口投与し、投与後の時間経過を追って採血して得た血漿中のEGCG濃度を測定し、濃度×時間（曲線下面積）に変換してEGCGの血中滞在量を比較した。それぞれの投与液中に含まれる緑茶エキス由来のEGCGの濃度は、最終濃度が１ mMになるように調節した。
【００４８】
実験に使用したラット（Sprague Dawley、雄、8週齢；日本SLC株式会社製）は、前もって頸静脈からカニューレを心臓方向に挿入し、カニューレ先端の開口部が右心房の入口近傍に位置するよう留置手術を行った後、実験開始までに1週間の回復期間をおいた。回復期間中のラットは、床網を備えたケージ中で個別に飼育し、CE-2飼料（日本クレア株式会社製）を自由摂食させた。
【００４９】
実験前日の夕方から、16時間絶食させたラットに体重100 g 当たり1 mLの上記投与液(i)〜(iv)を単回強制経口投与した。投与前、投与後0.25、0.5、1、2、3時間の時点で各ラットからカニューレを通して0.5 mLずつヘパリン採血し、採血直後に血漿を分離して分析時まで酸性下で-80℃に保存した。
【００５０】
血漿中のEGCG濃度は、各血漿をβ-グルクロニダーゼおよびスルファターゼにより脱抱合処理する前と後の両方のサンプルについて、サンプル中のEGCGを酸性下において酢酸エチル抽出・乾固した後、HPLCの移動相溶液に溶解してHPLC分析（電気化学検出法）することにより測定した。HPLCによるEGCGの分離は、HPLC装置（SCL-10Avp； 株式会社島津製作所製）に2.0 mm×150 mm（粒子径5μm） の逆相系カラム （CAPCELL PAKC18 MGII；株式会社資生堂製） を装着し、カラム温度40℃にて実施した。カラムへのサンプルのインジェクション量は20μL、移動相には0.1 mMのEDTA・2Naを含む0.1% リン酸：アセトニトリル = 90：10を用い、流速0.4 mL/minでアイソクラティック溶出した。EGCGの検出は、電気化学検出器（NANOSPACESI-2； 株式会社資生堂製）により行い、600 mVの印加電圧で検出された電流値の溶出パターンからピーク面積を算出し、濃度既知のEGCG標準物質のピーク面積から作成した標準直線を用いて定量した。EGCG標準物質の保持時間は8.0分、検出感度は2 nMであった。実際の投与液についてもEGCGの含有濃度を再度分析し、予定通りのEGCG量がラットへ投与されたことを確認した。(i)、(ii)、(iii)、及び(iv)の各投与液を投与後に採取したラット血漿を上記のように処理してHPLC分析した結果、(i)〜(iv)のいずれについても脱抱合処理の前後でEGCG濃度に変化はなかった。すなわち、EGCGは大部分が未抱合の遊離体として血中へ吸収されたと考えられる。
【００５１】
各投与液を投与後3時間までのラット血漿中EGCG濃度の経時変化を図５に示す。また、血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を図６に示す。これらの結果について以下のように統計解析を行った。
【００５２】
まず、各投与液をラットに投与した後の3時間までの血漿中EGCG濃度の経時変化について、投与液の種類および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置分散分析法による多重比較検定（Scheffe法；危険率５％）を実施した。その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４に示すように、Scheffeの多重比較検定の結果は、緑茶エキス中に(ii)20 mMセリン＋40 mMリンゴ酸、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸、(iv)80mM セリン＋160mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加の緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度が有意に高く（P<0.05）、緑茶エキス中へ(ii)(iii)(iv)のいずれの濃度のセリン＋リンゴ酸の組み合わせを添加しても緑茶エキスからのEGCG吸収が促進されることを示した。
【００５５】
続いて、同様にして、各投与液をラットに投与した後の3時間までについての血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置分散分析法による多重比較検定（Scheffe法；危険率５％）を実施した。その結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
表５に示すように、Scheffeの多重比較検定の結果は、緑茶エキス中に(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸、(iv)80 mM セリン＋160 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加の緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度×時間（曲線下面積）が有意に高く（P<0.05）、緑茶エキス中へ(ii)(iii)(iv)のいずれの濃度のセリン＋リンゴ酸の組み合わせを添加しても緑茶エキスから吸収されたEGCGの血中持続滞在量が増加することを示した。
【００５８】
投与後3時間までの曲線下面積（AUC0→3h）で比較したセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加による緑茶エキスからのEGCG吸収促進の度合いは(i)無添加と比べて、(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸の添加により9.9倍、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸の添加により11.0倍、(iv)80 mM セリン＋160 mMリンゴ酸の添加により12.7倍であった。
【００５９】
上記2種類の多重比較検定の結果は、いずれもセリンとリンゴ酸を含む投与液(ii)(iii)(iv)が無添加の投与液(i)に比べてEGCGの吸収を促進することを示しているが、投与液中に含有されるセリンとリンゴ酸の濃度の違いによって(ii)(iii)(iv)の間に有意差は認められない（P≧0.05）。即ち、(ii)20 mMセリン＋40 mMリンゴ酸の濃度では既にEGCG吸収促進効果は頭打ちに近い状態になっていると考えられる。
【００６０】
＜試験例５＞
次に、セリン＋リンゴ酸の添加によるEGCG吸収促進効果が緑茶一般に対して有効であることを示すために、別の種類の緑茶エキスを用いてEGCG吸収促進効果を試験した。具体的には、茶エキスとして、べにふうき緑茶の熱水抽出物 （No. 070423；アサヒ飲料株式会社製）を用いた。また、この試験例では、試験例４で用いた３種類のセリン＋リンゴ酸の組み合わせ濃度のうち中間の濃度である40 mM セリン＋80mMリンゴ酸の添加によるEGCG吸収促進効果を調べた。
【００６１】
試験例４と同様の方法によって、べにふうき緑茶エキス溶液に添加したセリンとリンゴ酸の最終濃度が(i)無添加、(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸となるように2種類の投与液を準備し、それぞれの投与液を静脈にカニューレを装着したラットへ強制経口投与し、投与後の時間経過を追って血漿中のEGCG濃度を測定し、濃度×時間（曲線下面積）に変換してEGCGの血中滞在量を比較した。それぞれの投与液中に含まれるべにふうき緑茶エキス由来のEGCG濃度は、最終濃度が１mMになるように調節した。
【００６２】
各投与液を投与後3時間までのラット血漿中EGCG濃度の経時変化を図７に示す。また、血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を図８に示す。これらの結果について以下のように統計解析を行った。
【００６３】
まず、各投与液をラットに投与した後の3時間までの血漿中EGCG濃度の経時変化について、投与液の種類および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表６に示す。
【００６４】
【表６】
【００６５】
表６に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、べにふうき緑茶エキス中に(ii)40 mMセリン＋80 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のべにふうき緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度が有意に高く、べにふうき緑茶エキス中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によってべにふうき緑茶エキスからのEGCG吸収が試験例４で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に促進されることを示した。
【００６６】
続いて、同様にして、各投与液をラットに投与した後の3時間までについての血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表７に示す。
【００６７】
【表７】
【００６８】
表７に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、べにふうき緑茶エキス中に(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のべにふうき緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度×時間（曲線下面積）が有意に高く、べにふうき緑茶エキス中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によってべにふうき緑茶エキスから吸収されたEGCGの血中持続滞在量が試験例４で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に増加することを示した。
【００６９】
投与後3時間までの（曲線下面積） （AUC0→3h）で比較した(ii)40 mM セリン＋80mMリンゴ酸の組み合わせ添加によるべにふうき緑茶エキスからのEGCG吸収促進の度合いは(i)無添加と比べて、28.6倍であった。
【００７０】
＜試験例６＞
緑茶エキスの代わりにEGCG試薬を用いて、試験例４で用いた3種類のセリン＋リンゴ酸の組み合わせ濃度のうち最も低濃度の組み合わせである20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸を添加した場合のEGCG吸収促進効果について試験例４と同様の方法により試験した。
【００７１】
試験例４と同様にして、１ mMのEGCG試薬を含有する投与液中に添加したセリンとリンゴ酸の最終濃度が(i)無添加、(ii) 20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸となるように2種類の投与液を準備し、それぞれの投与液を静脈にカニューレを装着したラットへ強制経口投与し、投与後の時間経過を追って採血して得た血漿中のEGCG濃度を測定し、濃度×時間（曲線下面積）に変換してEGCGの血中滞在量を比較した。
【００７２】
各投与液を投与後3時間までのラット血漿中EGCG濃度の経時変化を図９に示す。また、血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を図１０に示す。これらの結果について以下のように統計解析を行った。
【００７３】
まず、各投与液をラットに投与した後の3時間までの血漿中EGCG濃度の経時変化について、投与液の種類および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表８に示す。
【００７４】
【表８】
【００７５】
表８に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、EGCG試薬溶液中に(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のEGCG試薬溶液を投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度が有意に高く、EGCG試薬溶液中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によってEGCGの吸収が試験例４および試験例５で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に促進されることを示した。
【００７６】
続いて、同様にして、各投与液をラットに投与した後の3時間までについての血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表９に示す。
【００７７】
【表９】
【００７８】
表９に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、EGCG試薬溶液中に(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のEGCG試薬溶液を投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度×時間（曲線下面積）が有意に高く、EGCG試薬溶液中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によって吸収されたEGCGの血中持続滞在量が試験例４および試験例５で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に増加することを示した。
【００７９】
投与後3時間までの（曲線下面積）（AUC0→3h）で比較した(ii) 20 mM セリン＋40mMリンゴ酸の組み合わせ添加によるEGCG試薬溶液からのEGCG吸収促進の度合いは(i)無添加と比べて、3.1倍であった。
【００８０】
上記の試験例４〜６では、２種類の異なる緑茶エキスおよびEGCG試薬からのEGCGの吸収を促進するために添加する食品成分の一例としてセリン＋リンゴ酸の組み合わせについて例示したが、上記試験例２及び３のin vitro の試験結果を考え合わせると、EGCGの吸収促進効果はカプリン酸、ラウリン酸、グレープフルーツ果汁、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸の単独添加、および、これらの組み合わせ添加によって達成することができるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】Caco-2細胞の絨毛側へ添加したHBSS溶液中に含有されるEGCG試薬の濃度が47.7 μM、184.9μM、492.0 μM、又は954.6 μＭであるのときの、漿膜側へ移行したEGCG濃度の経時変化を示す図表である。
【図２】Caco-2細胞の絨毛側へ添加したHBSS溶液中に含有される緑茶エキス由来のEGCG濃度が38.9 μM、169.5μM、430.2 μM、826.7 μMであるときの、漿膜側へ移行したEGCG濃度の経時変化を示す図表である。
【図３】Caco-2細胞の絨毛側へ添加したEGCG濃度とEGCG吸収速度との関係を示す図表である。
【図４】Caco-2細胞の絨毛側へ異なる濃度のEGCG試薬を添加したときのTEERの経時変化 (吸収実験開始0時間のTEERを100%とした)を示す図表である。
【図５】緑茶エキス溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度の経時変化を示す図表である（mean±SEM； 無添加群(i)のn = 8、添加群(ii)のn = 3、添加群(iii)のn = 2、添加群(iv)のn = 3）。
【図６】緑茶エキス溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を示す図表である（mean±SEM； 無添加群(i)のn = 8、添加群(ii)のn = 3、添加群(iii)のn = 2、添加群(iv)のn = 3）。
【図７】べにふうき緑茶の熱水抽出物を摂取したラット血漿中EGCG濃度の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 6、(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸添加群のn = 2）。
【図８】べにふうき緑茶の熱水抽出物を摂取したラット血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 6、(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸添加群のn = 2）。
【図９】EGCG試薬溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 5、(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸添加群のn = 3）。
【図１０】EGCG試薬溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 5、(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸添加群のn = 3）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール類化合物の吸収促進剤及びポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
緑茶は日本人が古くから親しんできた飲料であり、近年では容器詰緑茶飲料の普及もあって、非常に多く飲用されている。緑茶には茶カテキンと総称される一群のフラバノール化合物が含まれており、抗腫瘍効果、抗血小板凝集効果、抗高血圧効果、抗肥満効果 、抗酸化効果など、健康にとって有益な多くの機能を有することが知られている。しかし、茶カテキンを経口的に摂取しても一般に吸収率が低く、摂取量の極一部分しか体内に吸収されない。このため、茶カテキンの吸収性を高める工夫が多くなされてきた。
【０００３】
例えば、下記特許文献１には、緑茶飲料中の茶カテキン濃度を高め、茶カテキンの摂取量を多くすることにより、茶カテキンの吸収量ならびに血中濃度を高める方法が開示されている。しかし、この方法では茶カテキン濃度が高くなることにより、茶カテキンに特有の苦味・渋味が強くなるため、緑茶飲料中に添加できる茶カテキンの量には限界があるほか、原料の茶カテキンを多量に使用することになるため、経済的な負担が増加するなどの問題があった。このほか、下記特許文献２には、飲料中のアルコール沈殿性物質の量を低減することにより茶カテキンの吸収率を高める方法が開示されている。しかし、この方法はアルコール沈殿性物質量を一定の含有量以下とするために精製、酵素処理等の操作を追加しなければならず、製造工程が煩雑になりコストが嵩むという問題があった。また、紅茶飲料中に含まれる茶カテキンのエピ体と非エピ体の含有量を一定の条件を満たすように配合することにより茶カテキンの吸収率を高める方法が知られている（下記特許文献３、及び特許文献４参照。）しかし、エピ体および非エピ体の含有量に関する要件は、一般家庭で飲用される緑茶等では通常満たされており、容器詰飲料のうちの紅茶飲料以外の飲食品への応用は難しいと考えられる。更には、下記特許文献５には、緑茶中のエピガロカテキンガレート（EGCG）およびカフェインの含有量が所定の関係を満たすように配合することによりエピガロカテキンガレート（EGCG）の吸収を促進する方法が開示されている。しかし、合成吸着剤カラムを用いたクロマト処理等でカフェインを除去する処理を行わなくてはならず、本来の味や風味の成分までも損ねてしまうという問題があった。
【特許文献１】特開２００２−１４２６７７号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６４１号公報
【特許文献３】特開２００３−３３３９８９号公報
【特許文献４】特開２００４−４１１８６号公報
【特許文献５】特開２００７−１５１４６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、緑茶には茶カテキンと総称される一群のフラバノール化合物が含まれており、抗腫瘍効果[Katiyar SK and Mukhtar H （1996） Int J Oncol 7：133-141； Bu-Tian JI et al. （1997） Int J Cancer 70：255-258； Su LJ and Arab L（2002） Public Health Nutr 5：419-425]、抗血小板凝集効果[Duffy SJ et al. （2001） Arterioscler Thromb Vasc 21：1084-1089]、抗高血圧効果 [Negishi H et al. （2005） J Nutr 134：38-42]、抗肥満効果 [Nagao T et al.（2005） Am J Clin Nutr 81：122-9； Murase T et al. （2002） Int J Obes 26：1459-64]、抗酸化効果[ Sano M et al. （2003） J Agric Food Chem 51：2912-2916] など、健康にとって有益な多くの機能を有することが知られている。緑茶中に含まれる主要な茶カテキンは、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレートの８種類であるが、その中でも総茶カテキンの約５０％を占めるエピガロカテキンガレート（以下、「EGCG」という。）は、他と比較して高い生理活性を有するとされている。
【０００５】
しかし、茶カテキンは一般に吸収率が低く、ことに EGCG の吸収率は非常に低いため、摂取量の極一部分しか体内に吸収されない [ラットでの研究結果は Chen L et al. （1997） Drug Metab Dispos 25：1045-1050； Zhu M et al. （2000） Planta Med 66：444-447] [ヒトでの研究結果はWarden BA et al. （2001） J Nutr 131：1731-1737； Chow et al. （2001） Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10：53-58； Vaidyanathan and Walle （2001） Pharm Res （NY） 18：1420-1425]。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、広範囲の飲料および食品に適用可能で、摂取する茶カテキン、その中でも特に生理作用が強い EGCG の吸収性を顕著に向上させることが可能な、茶カテキンの吸収性を改善する方法を見出すことであり、これを利用して茶カテキン、ことに EGCG の吸収性が改善された飲食品ならびに茶カテキンの吸収性を改善するための飲食品素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、Caco-2培養細胞を用いた測定系により EGCG の吸収効率を高めることができる食品および食品成分を探索した。その結果、いくつかの食品および食品成分にEGCGの吸収を顕著に促進する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記のとおりである。
[１] 下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とするポリフェノール類化合物の吸収促進剤。
【０００８】
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
[２] 前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である上記[１]記載の吸収促進剤。
[３] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である上記[１]記載の吸収促進剤。
[４] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である上記[１]記載の吸収促進剤。
[５] ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
【０００９】
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
[６] 下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
【００１０】
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
[７] 前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である上記[５]又は[６]記載の製造方法。
[８] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である上記[５]又は[６]記載の製造方法。
[９] 前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である上記[５]又は[６]記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、セリン又はその塩類、アスパラギン酸又はその塩類、リンゴ酸又はその塩類、カプリン酸、その塩類又はそのエステル類、ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種をそれぞれ単独あるいは組み合わせて摂取することにより、ポリフェノール類化合物、例えば茶カテキンの吸収率を顕著に向上させることができる。したがって、少量の摂取によっても従来と同等あるいはそれ以上の効果を得ることが可能となる。また、吸収率が高まれば、これらの血中濃度を有効濃度に到達させるために必要な飲食品中の配合量を従来よりも少なくすることができるので、ポリフェノール類化合物、例えば茶カテキンに特有の苦味・渋味などを感じさせない、又はそれらの低減された、摂取しやすい飲食品を提供することができる。更に、原料として必要な量を減らすことができるので経済的である。これらの食品および食品成分はそれぞれ単独でEGCGの吸収を促進する効果を有するが、２種類以上を組み合わせることにより更に大きな吸収促進効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について好ましい態様を挙げて、更に詳細に説明する。
【００１３】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるセリンは、非必須アミノ酸の一種であり、細胞膜の構成成分であるホスファチジルセリンの原料として重要である。食品中ではそのほとんどがタンパク質の形で存在しており、多くの食品中に含まれている栄養素である。L-セリンは既存添加物として認可されており、調味料、栄養強化剤として広く使用されている。また、セリンの塩類としては、セリン塩酸塩、セリン硫酸塩、セリンリン酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるアスパラギン酸は、非必須アミノ酸の一種であり、酸性アミノ酸に分類される。様々な食品中に含まれており、L-アスパラギン酸は既存添加物に認可され、調味料、栄養強化剤として使用されている。また、アスパラギン酸の塩類としては、アスパラギン酸ナトリウム、アスパラギン酸カリウム、アスパラギン酸マグネシウム、アスパラギン酸カルシウム等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、L-アスパラギン酸のナトリウム塩は、指定添加物に認可され、調味料、栄養強化剤として使用されている。
【００１５】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるリンゴ酸は、ヒドロキシ酸に分類される有機化合物の一種であり、りんごなどに含まれている成分である。また、リンゴ酸の塩類としては、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、リンゴ酸マグネシウム、リンゴ酸カルシウム等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、DL-リンゴ酸、DL-リンゴ酸ナトリウムは指定添加物として認可されており、酸味料やpH調整剤の用途で食品添加物として広く使用されている。一日の摂取許容量（ADI）も設定されておらず、極めて安全性の高い成分として認識されている。
【００１６】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるグレープフルーツ果汁の原料であるグレープフルーツは、そのまま生で食べるほか、ジュースやカクテル、サワーなどに用いられる、食経験豊富な柑橘類である。
【００１７】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤において、その吸収促進のための有効成分であるカプリン酸は炭素数１０、ラウリン酸は炭素数１２の飽和脂肪酸であり、共にココナッツオイルやヤシ油に多く含まれている。また、カプリン酸又はラウリン酸の塩類としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等との塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、カプリン酸又はラウリン酸のエステル類としては、メチルエステル、エチルエステル、グリコールエステル、グリセリンエステル、ショ糖エステル等のエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、カプリン酸エチル（別名：デカン酸エチル）は指定添加物に認可されている。
【００１８】
本発明においては、ポリフェノール類化合物、好ましくはフラボノイド類化合物、更により好ましくはカテキン類化合物を経口的に摂取する際に、上記有効成分を単独で又は組み合わせて摂取することで、ポリフェノール類化合物、フラボノイド類化合物、又はカテキン類化合物の体内への吸収を促進させることができる。ポリフェノール類化合物としては、例えば、お茶等に含まれるカテキン類化合物を好ましく例示できる。ここで、カテキン類化合物とは、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレートなどの非エピ体カテキン類及びそのメチル化体などの誘導体、またはエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレートなどのエピ体カテキン類及びそのメチル化体などの誘導体を併せた総称である。なかでも、エピガロカテキンガレート及びそのメチル化体などの誘導体を特に好ましく例示できる。
【００１９】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤の有効性を発揮するための上記有効成分の好ましい摂取量としては、後述する試験例の結果から概算すると、１日あたり、セリンの場合には、０．０５〜１１０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０〜９０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０〜２５ｍｇ／体重１ｋｇであり、アスパラギン酸の場合には、０．０５〜１３０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０〜１１０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０〜３０ｍｇ／体重１ｋｇであり、リンゴ酸の場合には、０．０５〜２６０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０〜２２０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０〜６０ｍｇ／体重１ｋｇであり、カプリン酸の場合には、０．００４〜２５ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇであり、ラウリン酸の場合には、０．０１〜２５ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは２〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは２〜６ｍｇ／体重１ｋｇであり、グレープフルーツ果汁の場合には、固形分換算で、５〜１００００ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１０００〜８０００ｍｇ／体重１ｋｇ、更により好ましくは１０００〜２０００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００２０】
また、ポリフェノール類化合物の吸収を効果的に高めるための質量比としては、ポリフェノール類化合物１ｍｇあたり、セリンの場合には、０．０１〜３０ｍｇ、より好ましくは２〜２０ｍｇ、更により好ましくは２〜５ｍｇであり、アスパラギン酸の場合には、０．０１〜４０ｍｇ、より好ましくは２〜３０ｍｇ、更により好ましくは２〜６ｍｇであり、リンゴ酸の場合には、０．０１〜７０ｍｇ、より好ましくは２〜５０ｍｇ、更により好ましくは２〜１５ｍｇであり、カプリン酸の場合には、０．００１〜６ｍｇ、より好ましくは０．２〜４ｍｇ、更により好ましくは０．２〜３ｍｇであり、ラウリン酸の場合には、０．００２〜７ｍｇ、より好ましくは０．４〜５ｍｇ、更により好ましくは０．４〜２ｍｇであり、グレープフルーツ果汁の場合には、固形分換算で、１〜２６００ｍｇ、より好ましくは２００〜１８００ｍｇ、更により好ましくは２００〜５００ｍｇである。
【００２１】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤においては、その総量当たり、上記有効成分を、セリンの場合には、固形分換算で１．０〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、アスパラギン酸の場合には、固形分換算で１．０〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、リンゴ酸の場合には固形分換算で１．５〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、カプリン酸の場合には固形分換算で１．５〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、ラウリン酸の場合には固形分換算で１．０〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい、グレープフルーツ果汁の場合には、固形分換算で１．５〜１００質量％含有することが好ましく、４．５〜１００質量％含有することがより好ましい。含有量がそれぞれの下限未満であると、十分な効果を得るには、飲食品への添加量を増加したり、摂取量を増やす必要が生じる。
【００２２】
また、上記の基本的成分以外に、炭水化物、食物繊維、たんぱく質、ビタミン類等を含むことができる。
【００２３】
本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤は、医薬品、健康食品、加工食品等の各種分野で用いられ、医薬の有効成分、食品原料等として使用することができる。
【００２４】
例えば、医薬品とする場合には、薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化し、医薬組成物として提供することができる。この医薬組成物には、基材や担体の他、薬学的に許容されることを限度として、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、抗菌剤、防腐剤、香料、顔料、界面活性剤、安定剤、溶解補助剤等の添加剤を任意に配合してもよい。そして、当該医薬組成物の形態としては、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、ゼリー剤、トローチ剤等の剤型が例示できる。
【００２５】
また、本発明のポリフェノール類化合物の吸収促進剤を飲食品に添加して摂取する場合には、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等に配合して用いることができる。このような食品としては、例えば、チョコレート、ビスケット、ガム、キャンディー、クッキー、グミ、打錠菓子等の菓子類；シリアル；粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓が挙げられる。また、特定保健用食品や栄養補助食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠等の形態のものであってもよい。
【００２６】
一方、本発明のもう一つは、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、セリン又はその塩類、アスパラギン酸又はその塩類、リンゴ酸又はその塩類、カプリン酸、その塩類又はそのエステル類、ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加する工程を含む、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法である。また、本発明の他のもう一つは、セリン又はその塩類、アスパラギン酸又はその塩類、リンゴ酸又はその塩類、カプリン酸、その塩類又はそのエステル類、ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類、及びグレープフルーツ果汁からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する工程を含む、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法である。
【００２７】
本発明の飲食品又は飲食品素材の製造方法においては、上記基本成分を添加する工程に、その飲食品又は飲食品素材に応じた公知の方法、又はこれに準じた方法にしたがって、適宜他の工程を施すことにより、ポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下に例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
＜試験例１＞（in vitroのEGCG吸収測定系の確立）
経口摂取した茶カテキンの体内吸収の場は、腸管、ことに小腸、が主要な場であると考えられている。茶カテキン、ことにEGCG、の小腸吸収を促進する食品および食品成分を広範な対象から簡便にスクリーニングするために、本発明者らはヒト結腸癌由来Caco-2細胞株（American TypeCulture Collection） を用いた小腸上皮モデルによるinvitroのEGCG吸収測定系を確立した。以下に具体的な方法と結果を示す。
【００３０】
Caco-2細胞は培養を３週間程度継続する間に自然に分化し、小腸上皮様の多くの特質を示すことが知られている。Caco-2細胞は、5% CO2を含む加湿した空気の存在下で、75cm2のプラスチックフラスコ中にて、10%非働化ウシ胎児血清（HyClone社製） 、50 U/mL ペニシリン-50 μg/mLストレプトマイシン （GIBCO社製）および1%非必須アミノ酸 （GIBCO社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM， pH7.4； GIBCO社製）中 で培養した。細胞は、80〜90%コンフルエントに到達する5〜8日毎に継代して維持した。以下に述べるEGCGの吸収実験は、継代数30〜70のCaco-2細胞を用いて実施した。
【００３１】
EGCGの吸収実験は、直径12 mmのTranswell（ポリカーボネートフィルターの培養面積1.13 cm2, ポアサイズ0.4 μm； Corning社製） 上で培養したCaco-2細胞単層を用いて行った。Caco-2細胞をTranswell のインサート上に1.0×105 cells/cm2の密度で播種し、2日おきに新たな培地に交換しつつ培養を継続し、MillicellERSメーター （Millipore社製） を用いて経上皮電気抵抗値（以下、「TEER」という。） を測定することによって細胞単層のタイトジャンクションの完成度をモニターし、タイトジャンクションの形成が完成したことを確認できたものを実験に使用した。TEERの平均値は、播種後4週目に500〜1,000Ωcm2に達し、その後7週目まで安定に保持された。吸収実験に用いたCaco-2細胞単層は、播種後4〜6週目のものを用いた。
【００３２】
Caco-2細胞単層が乗ったTranswellインサートの上部 （絨毛側） の培地をpH 5.5のHanks’ Balanced SaltSolution-like Transport Medium （絨毛側HBSS溶液； 10 mM MES, 5mM グルコース,10 mMグルタミン, 1 mM アスコルビン酸含有）に、また、インサート下部 （漿膜側） の培地をpH 7.4のHBSS（漿膜側HBSS溶液； 10 mM HEPES, 5mM グルコース,10 mMグルタミン, 1 mM アスコルビン酸含有） に置換して2回繰り返して洗った後、絨毛側に0.5 mL、漿膜側に1.5mLの各HBSS溶液を新たに加えて、5% CO2存在下で37℃にて30分間インキュベーションした。30分経過後にTEERを測定した後、再度上下の溶液を新たなHBSS溶液に置換して30分間インキュベーションし、再びTEERを測定した。この時点を吸収開始後0時間とした。
【００３３】
EGCGは中性〜アルカリ性の水溶液中では酸化されやすく不安定であるが、絨毛側HBSS溶液中に1 mMのアスコルビン酸を添加し、且つ、pHを5.5に保つことにより、吸収実験の実施時間中、EGCGは完全に安定に維持された。また、測定系の絨毛側および漿膜側HBSS溶液中に10mMのグルタミンを添加することにより、Caco-2細胞のEGCG吸収能を4時間以上一定に維持できた。
【００３４】
吸収開始後0時間のTEERを測定後、インサート上下の溶液を新しいHBSS溶液に置換した。この時、Caco-2細胞単層の絨毛側HBSS溶液には、EGCG濃度が50μM、200μM、500μM、1000μMとなる様にEGCG試薬 （エピガロカテキンガレート，Cat. No. E4143；Sigma社製） あるいは緑茶エキス （緑茶熱水抽出物, No. 16714；三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製） を添加した。5% CO2存在下で37℃に1時間インキュベーションし、TEERを測定した後、インサート上の絨毛側HBSS溶液は交換せずにインサートを新しい漿膜側HBSS溶液の入ったウェルに移動し、さらに2時間インキュベーションした。2時間経過後TEERを測定し、吸収開始後0時間、1時間、3時間の漿膜側HBSS溶液中に含まれるEGCGの濃度を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、以下のようにして測定した。
【００３５】
漿膜側HBSS溶液中に含まれるEGCG濃度の測定は、150 mm×4.6mm （粒子径5μm）の逆相系カラム （Mightysil RP-18 GP； 関東化学株式会社製）を装着したHPLC装置 （CBM-20AまたはSCL-10Avp； いずれも株式会社島津製作所製）を用い、280 nmにおける吸光度の溶出パターンのピーク面積を測定することにより行った。カラム温度は40℃で行った。カラムからのEGCGの溶出はA液およびB液（A液：水/アセトニトリル/リン酸 = 700/10/1； B液： A液/メタノール =2/1）を用いた直線濃度勾配法により、流速0.5 mL/minで行った。まず、400μLの漿膜側HBSS溶液をカラムにインジェクションしたあと、0分から12分までの12分間100%A液を流し、55分までの43分間でB液の濃度を0から80%まで上昇させた。60分まで80%B液を流した後、65分までの5分間でA液の濃度を再び100%として１サイクル75分間の分析を完了した。サンプル中のEGCG濃度は、濃度既知のEGCG標準物質のピーク面積から作成した標準直線を用いて定量した。標準物質において、EGCGの保持時間は53分、検出感度は10nMであった。
【００３６】
Caco-2細胞の絨毛側へEGCG試薬溶液を添加したときの結果を図1に、緑茶エキス溶液を添加したときの結果を図２に示す。図1及び図２に明らかなように、いずれのEGCG濃度においても、漿膜側に吸収されたEGCG濃度はインキュベーション時間にほぼ比例して増加した。また、EGCGの吸収速度を、絨毛側へ添加したEGCGの濃度に対してプロットすると、絨毛側へ添加したEGCGの濃度にほぼ比例して増加していることが明らかとなった（図３）。また、異なる濃度のEGCG試薬を添加したときのTEERの経時変化は図４のとおりであり、TEERは時間経過により若干の低下傾向を示すものの、3時間の測定時間中は開始時のTEERが良好に維持されていた。
【００３７】
以上の結果より、Caco-2細胞単層を小腸吸収モデルとして用いることにより、EGCG試薬および緑茶からのEGCG吸収を簡便に測定することができることがわかる。即ち、EGCGを安定に保ちつつ、且つ、生体内に近い条件でEGCGの吸収を簡便に測定できるin vitro実験系を確立できた。
【００３８】
＜試験例２＞（Caco-2細胞のEGCG吸収を促進する食品および食品成分のスクリーニング）
上記試験例１のEGCG吸収測定系を用い、絨毛側に下記表1に示す種々の食品あるいは食品成分を添加してEGCGの吸収速度を測定し、無添加の場合の吸収速度と比較した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
具体的には、吸収開始後0時間の時点でCaco-2細胞の絨毛側へ1 mMのEGCG試薬と共に異なる濃度（2〜3濃度）の種々の食品あるいは食品成分を添加し、一定時間後に漿膜側へ吸収されたEGCG量をHPLCにより測定し、食品あるいは食品成分は添加せず1 mMのEGCG試薬のみを添加したときのEGCG吸収量と比較した。食品あるいは食品成分を添加しなかった場合のEGCG吸収速度を１として、各食品あるいは食品成分を添加した場合の相対的なEGCG吸収速度を求めた。その結果EGCGの吸収を有意に促進したものを表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２に示すように、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、グレープフルーツ果汁の6種の食品および食品成分は、それぞれ単独で、絨毛側への添加濃度依存的にEGCGの吸収を促進した。
【００４３】
＜試験例３＞（食品および食品成分の組み合わせによるEGCGの吸収促進効果）
EGCG吸収促進効果が認められた上記6種の食品あるいは食品成分のうち、ラウリン酸と同一の中鎖脂肪酸に属するカプリン酸を除いたセリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、グレープフルーツ果汁、ラウリン酸の5種類について、2種類ずつを組み合わせることによるEGCG吸収促進効果の相乗的あるいは相加的な効果について調べた。具体的には、試験例２と同様にして、Caco-2細胞の絨毛側へ1 mMのEGCGと同時に2種類の食品あるいは食品成分を組み合わせて添加し、漿膜側へのEGCG吸収速度を測定し、無添加の場合と比較した。その結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３に示すように、セリン＋アスパラギン酸、セリン＋リンゴ酸、セリン＋グレープフルーツ果汁、アスパラギン酸＋リンゴ酸、アスパラギン酸＋グレープフルーツ果汁、アスパラギン酸＋ラウリン酸、リンゴ酸＋グレープフルーツ果汁の組み合わせで、相加的なEGCG吸収促進効果が見られた。また、グレープフルーツ果汁＋ラウリン酸の組み合わせでは、EGCG吸収促進効果は相乗的であった。
【００４６】
また、このとき、細胞間タイトジャンクションの開閉度合いの指標となるTEERは、EGCGの吸収速度と逆相関の関係にあった。したがって、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、グレープフルーツ果汁、ラウリン酸、カプリン酸などの働きによって、Caco-2細胞の細胞間通路が開かれ、そこを通ってEGCGが漿膜側へ移行したものと推察された。また、EGCGが細胞内を経由して吸収される場合には硫酸抱合やグルクロン酸抱合される可能性があるため、漿膜側へ通過したEGCGの脱抱合処理を試みたが、抱合体の形で吸収されたEGCGは存在しなかった。このことは、Caco-2細胞においてEGCGは大部分が遊離体の形で吸収されることを示唆し、EGCGが上記の細胞間通路を通って吸収される可能性を示唆していた。
【００４７】
＜試験例４＞（ラットにおける食品および食品成分のEGCG吸収促進効果）
Caco-2細胞を用いた測定系でEGCGの吸収促進効果を示した上記の食品および食品成分が、動物が口から摂取した場合にも同様のEGCG吸収促進効果を有するかどうかについて調べた。具体的には、緑茶エキス溶液中に添加したセリンとリンゴ酸の最終濃度が(i)無添加、(ii)20 mMセリン＋40 mMリンゴ酸、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸、(iv)80 mM セリン＋160 mMリンゴ酸となるように4種類の投与液を準備し、それぞれの投与液をラットへ強制経口投与し、投与後の時間経過を追って採血して得た血漿中のEGCG濃度を測定し、濃度×時間（曲線下面積）に変換してEGCGの血中滞在量を比較した。それぞれの投与液中に含まれる緑茶エキス由来のEGCGの濃度は、最終濃度が１ mMになるように調節した。
【００４８】
実験に使用したラット（Sprague Dawley、雄、8週齢；日本SLC株式会社製）は、前もって頸静脈からカニューレを心臓方向に挿入し、カニューレ先端の開口部が右心房の入口近傍に位置するよう留置手術を行った後、実験開始までに1週間の回復期間をおいた。回復期間中のラットは、床網を備えたケージ中で個別に飼育し、CE-2飼料（日本クレア株式会社製）を自由摂食させた。
【００４９】
実験前日の夕方から、16時間絶食させたラットに体重100 g 当たり1 mLの上記投与液(i)〜(iv)を単回強制経口投与した。投与前、投与後0.25、0.5、1、2、3時間の時点で各ラットからカニューレを通して0.5 mLずつヘパリン採血し、採血直後に血漿を分離して分析時まで酸性下で-80℃に保存した。
【００５０】
血漿中のEGCG濃度は、各血漿をβ-グルクロニダーゼおよびスルファターゼにより脱抱合処理する前と後の両方のサンプルについて、サンプル中のEGCGを酸性下において酢酸エチル抽出・乾固した後、HPLCの移動相溶液に溶解してHPLC分析（電気化学検出法）することにより測定した。HPLCによるEGCGの分離は、HPLC装置（SCL-10Avp； 株式会社島津製作所製）に2.0 mm×150 mm（粒子径5μm） の逆相系カラム （CAPCELL PAKC18 MGII；株式会社資生堂製） を装着し、カラム温度40℃にて実施した。カラムへのサンプルのインジェクション量は20μL、移動相には0.1 mMのEDTA・2Naを含む0.1% リン酸：アセトニトリル = 90：10を用い、流速0.4 mL/minでアイソクラティック溶出した。EGCGの検出は、電気化学検出器（NANOSPACESI-2； 株式会社資生堂製）により行い、600 mVの印加電圧で検出された電流値の溶出パターンからピーク面積を算出し、濃度既知のEGCG標準物質のピーク面積から作成した標準直線を用いて定量した。EGCG標準物質の保持時間は8.0分、検出感度は2 nMであった。実際の投与液についてもEGCGの含有濃度を再度分析し、予定通りのEGCG量がラットへ投与されたことを確認した。(i)、(ii)、(iii)、及び(iv)の各投与液を投与後に採取したラット血漿を上記のように処理してHPLC分析した結果、(i)〜(iv)のいずれについても脱抱合処理の前後でEGCG濃度に変化はなかった。すなわち、EGCGは大部分が未抱合の遊離体として血中へ吸収されたと考えられる。
【００５１】
各投与液を投与後3時間までのラット血漿中EGCG濃度の経時変化を図５に示す。また、血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を図６に示す。これらの結果について以下のように統計解析を行った。
【００５２】
まず、各投与液をラットに投与した後の3時間までの血漿中EGCG濃度の経時変化について、投与液の種類および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置分散分析法による多重比較検定（Scheffe法；危険率５％）を実施した。その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４に示すように、Scheffeの多重比較検定の結果は、緑茶エキス中に(ii)20 mMセリン＋40 mMリンゴ酸、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸、(iv)80mM セリン＋160mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加の緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度が有意に高く（P<0.05）、緑茶エキス中へ(ii)(iii)(iv)のいずれの濃度のセリン＋リンゴ酸の組み合わせを添加しても緑茶エキスからのEGCG吸収が促進されることを示した。
【００５５】
続いて、同様にして、各投与液をラットに投与した後の3時間までについての血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置分散分析法による多重比較検定（Scheffe法；危険率５％）を実施した。その結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
表５に示すように、Scheffeの多重比較検定の結果は、緑茶エキス中に(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸、(iv)80 mM セリン＋160 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加の緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度×時間（曲線下面積）が有意に高く（P<0.05）、緑茶エキス中へ(ii)(iii)(iv)のいずれの濃度のセリン＋リンゴ酸の組み合わせを添加しても緑茶エキスから吸収されたEGCGの血中持続滞在量が増加することを示した。
【００５８】
投与後3時間までの曲線下面積（AUC0→3h）で比較したセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加による緑茶エキスからのEGCG吸収促進の度合いは(i)無添加と比べて、(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸の添加により9.9倍、(iii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸の添加により11.0倍、(iv)80 mM セリン＋160 mMリンゴ酸の添加により12.7倍であった。
【００５９】
上記2種類の多重比較検定の結果は、いずれもセリンとリンゴ酸を含む投与液(ii)(iii)(iv)が無添加の投与液(i)に比べてEGCGの吸収を促進することを示しているが、投与液中に含有されるセリンとリンゴ酸の濃度の違いによって(ii)(iii)(iv)の間に有意差は認められない（P≧0.05）。即ち、(ii)20 mMセリン＋40 mMリンゴ酸の濃度では既にEGCG吸収促進効果は頭打ちに近い状態になっていると考えられる。
【００６０】
＜試験例５＞
次に、セリン＋リンゴ酸の添加によるEGCG吸収促進効果が緑茶一般に対して有効であることを示すために、別の種類の緑茶エキスを用いてEGCG吸収促進効果を試験した。具体的には、茶エキスとして、べにふうき緑茶の熱水抽出物 （No. 070423；アサヒ飲料株式会社製）を用いた。また、この試験例では、試験例４で用いた３種類のセリン＋リンゴ酸の組み合わせ濃度のうち中間の濃度である40 mM セリン＋80mMリンゴ酸の添加によるEGCG吸収促進効果を調べた。
【００６１】
試験例４と同様の方法によって、べにふうき緑茶エキス溶液に添加したセリンとリンゴ酸の最終濃度が(i)無添加、(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸となるように2種類の投与液を準備し、それぞれの投与液を静脈にカニューレを装着したラットへ強制経口投与し、投与後の時間経過を追って血漿中のEGCG濃度を測定し、濃度×時間（曲線下面積）に変換してEGCGの血中滞在量を比較した。それぞれの投与液中に含まれるべにふうき緑茶エキス由来のEGCG濃度は、最終濃度が１mMになるように調節した。
【００６２】
各投与液を投与後3時間までのラット血漿中EGCG濃度の経時変化を図７に示す。また、血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を図８に示す。これらの結果について以下のように統計解析を行った。
【００６３】
まず、各投与液をラットに投与した後の3時間までの血漿中EGCG濃度の経時変化について、投与液の種類および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表６に示す。
【００６４】
【表６】
【００６５】
表６に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、べにふうき緑茶エキス中に(ii)40 mMセリン＋80 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のべにふうき緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度が有意に高く、べにふうき緑茶エキス中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によってべにふうき緑茶エキスからのEGCG吸収が試験例４で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に促進されることを示した。
【００６６】
続いて、同様にして、各投与液をラットに投与した後の3時間までについての血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表７に示す。
【００６７】
【表７】
【００６８】
表７に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、べにふうき緑茶エキス中に(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のべにふうき緑茶エキスを投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度×時間（曲線下面積）が有意に高く、べにふうき緑茶エキス中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によってべにふうき緑茶エキスから吸収されたEGCGの血中持続滞在量が試験例４で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に増加することを示した。
【００６９】
投与後3時間までの（曲線下面積） （AUC0→3h）で比較した(ii)40 mM セリン＋80mMリンゴ酸の組み合わせ添加によるべにふうき緑茶エキスからのEGCG吸収促進の度合いは(i)無添加と比べて、28.6倍であった。
【００７０】
＜試験例６＞
緑茶エキスの代わりにEGCG試薬を用いて、試験例４で用いた3種類のセリン＋リンゴ酸の組み合わせ濃度のうち最も低濃度の組み合わせである20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸を添加した場合のEGCG吸収促進効果について試験例４と同様の方法により試験した。
【００７１】
試験例４と同様にして、１ mMのEGCG試薬を含有する投与液中に添加したセリンとリンゴ酸の最終濃度が(i)無添加、(ii) 20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸となるように2種類の投与液を準備し、それぞれの投与液を静脈にカニューレを装着したラットへ強制経口投与し、投与後の時間経過を追って採血して得た血漿中のEGCG濃度を測定し、濃度×時間（曲線下面積）に変換してEGCGの血中滞在量を比較した。
【００７２】
各投与液を投与後3時間までのラット血漿中EGCG濃度の経時変化を図９に示す。また、血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を図１０に示す。これらの結果について以下のように統計解析を行った。
【００７３】
まず、各投与液をラットに投与した後の3時間までの血漿中EGCG濃度の経時変化について、投与液の種類および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表８に示す。
【００７４】
【表８】
【００７５】
表８に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、EGCG試薬溶液中に(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のEGCG試薬溶液を投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度が有意に高く、EGCG試薬溶液中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によってEGCGの吸収が試験例４および試験例５で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に促進されることを示した。
【００７６】
続いて、同様にして、各投与液をラットに投与した後の3時間までについての血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）および投与後の経過時間を因子とした、繰り返しのある二元配置の分散分析を行った。その結果を表９に示す。
【００７７】
【表９】
【００７８】
表９に示すように、投与液の種類間に有意差（P<0.05）が認められたことから、EGCG試薬溶液中に(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸を添加してラットに投与したとき、(i)無添加のEGCG試薬溶液を投与したときに比べて血漿中のEGCG濃度×時間（曲線下面積）が有意に高く、EGCG試薬溶液中へのセリン＋リンゴ酸の組み合わせ添加によって吸収されたEGCGの血中持続滞在量が試験例４および試験例５で示した緑茶エキスへの添加の場合と同様に増加することを示した。
【００７９】
投与後3時間までの（曲線下面積）（AUC0→3h）で比較した(ii) 20 mM セリン＋40mMリンゴ酸の組み合わせ添加によるEGCG試薬溶液からのEGCG吸収促進の度合いは(i)無添加と比べて、3.1倍であった。
【００８０】
上記の試験例４〜６では、２種類の異なる緑茶エキスおよびEGCG試薬からのEGCGの吸収を促進するために添加する食品成分の一例としてセリン＋リンゴ酸の組み合わせについて例示したが、上記試験例２及び３のin vitro の試験結果を考え合わせると、EGCGの吸収促進効果はカプリン酸、ラウリン酸、グレープフルーツ果汁、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸の単独添加、および、これらの組み合わせ添加によって達成することができるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】Caco-2細胞の絨毛側へ添加したHBSS溶液中に含有されるEGCG試薬の濃度が47.7 μM、184.9μM、492.0 μM、又は954.6 μＭであるのときの、漿膜側へ移行したEGCG濃度の経時変化を示す図表である。
【図２】Caco-2細胞の絨毛側へ添加したHBSS溶液中に含有される緑茶エキス由来のEGCG濃度が38.9 μM、169.5μM、430.2 μM、826.7 μMであるときの、漿膜側へ移行したEGCG濃度の経時変化を示す図表である。
【図３】Caco-2細胞の絨毛側へ添加したEGCG濃度とEGCG吸収速度との関係を示す図表である。
【図４】Caco-2細胞の絨毛側へ異なる濃度のEGCG試薬を添加したときのTEERの経時変化 (吸収実験開始0時間のTEERを100%とした)を示す図表である。
【図５】緑茶エキス溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度の経時変化を示す図表である（mean±SEM； 無添加群(i)のn = 8、添加群(ii)のn = 3、添加群(iii)のn = 2、添加群(iv)のn = 3）。
【図６】緑茶エキス溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を示す図表である（mean±SEM； 無添加群(i)のn = 8、添加群(ii)のn = 3、添加群(iii)のn = 2、添加群(iv)のn = 3）。
【図７】べにふうき緑茶の熱水抽出物を摂取したラット血漿中EGCG濃度の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 6、(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸添加群のn = 2）。
【図８】べにふうき緑茶の熱水抽出物を摂取したラット血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 6、(ii)40 mM セリン＋80 mMリンゴ酸添加群のn = 2）。
【図９】EGCG試薬溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 5、(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸添加群のn = 3）。
【図１０】EGCG試薬溶液を摂取したラット血漿中EGCG濃度×時間（曲線下面積）の経時変化を示す図表である（mean±SEM； (i)無添加群のn = 5、(ii)20 mM セリン＋40 mMリンゴ酸添加群のn = 3）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とするポリフェノール類化合物の吸収促進剤。
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
【請求項２】
前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である請求項１記載の吸収促進剤。
【請求項３】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である請求項１記載の吸収促進剤。
【請求項４】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である請求項１記載の吸収促進剤。
【請求項５】
ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
【請求項６】
下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
【請求項７】
前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項９】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項１】
下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とするポリフェノール類化合物の吸収促進剤。
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
【請求項２】
前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である請求項１記載の吸収促進剤。
【請求項３】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である請求項１記載の吸収促進剤。
【請求項４】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である請求項１記載の吸収促進剤。
【請求項５】
ポリフェノール類化合物を含有する飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
【請求項６】
下記（１）〜（６）からなる群から選ばれた少なくとも１種を含む飲食品用原料又は飲食品素材用原料に、ポリフェノール類化合物を添加する工程を含むことを特徴とするポリフェノール類化合物を含有する飲食品又は飲食品素材の製造方法。
（１）セリン又はその塩類
（２）アスパラギン酸又はその塩類
（３）リンゴ酸又はその塩類
（４）カプリン酸、その塩類又はそのエステル類
（５）ラウリン酸、その塩類又はそのエステル類
（６）グレープフルーツ果汁
【請求項７】
前記ポリフェノール類化合物が、フラボノイド類化合物である請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン類化合物である請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項９】
前記ポリフェノール類化合物が、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びそれらのメチル化体からなる群から選ばれた少なくとも１種を含むカテキン類化合物である請求項５又は６記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２４７２８２（Ｐ２００９−２４７２８２Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９９５１４（Ｐ２００８−９９５１４）
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
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