ポリペプチド、及びユビキチン化タンパク質の回収方法
【課題】非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できるポリペプチド及び回収方法等の提供。
【解決手段】該ユビキチン化タンパク質の回収方法は、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、試料に含まれるユビキチン化タンパク質をポリペプチドに結合させる捕捉手順と、このポリペプチドを２−メルカプトエタノールを添加して担体から解離させることで、ユビキチン化タンパク質を溶出する溶出手順と、を有する。これにより、ユビキチン化タンパク質は、その結合性タンパク質に結合された複合体として得られる。
【解決手段】該ユビキチン化タンパク質の回収方法は、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、試料に含まれるユビキチン化タンパク質をポリペプチドに結合させる捕捉手順と、このポリペプチドを２−メルカプトエタノールを添加して担体から解離させることで、ユビキチン化タンパク質を溶出する溶出手順と、を有する。これにより、ユビキチン化タンパク質は、その結合性タンパク質に結合された複合体として得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチン化タンパク質を回収する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の多くは、様々な翻訳後修飾を受けることで機能調節されている。その中でも、ユビキチン化は、パーキンソン病やある種の癌等の様々な重篤な疾患への関与が報告されていることからも、注目すべき翻訳後修飾の一つである。ここで、ユビキチンとは、７６アミノ酸からなる分子量の極めて小さなタンパク質である。
【０００３】
ユビキチン化は、一分子のユビキチンが修飾されるモノユビキチン化と、鎖状に連なった複数のユビキチンが修飾されるポリユビキチン化とに分類される。更に、ポリユビキチン化は、ユビキチン分子同士の結合に使われるアミノ酸（リジン残基）の違いによって、機能的に細分化される。即ち、ユビキチンの４８番目のリジン残基を介して起こるＫ４８結合型ユビキチン化はタンパク質分解を誘発する一方、他のリジン残基を介したユビキチン化（Ｋ６３等）やモノユビキチン化は、エンドサイトーシスや細胞内タンパク質輸送制御といった、タンパク質分解とは異なる細胞内機能に関与している。
【０００４】
多くのタンパク質が、分解や活性制御のためにユビキチン化されることが既に報告されているが、そのユビキチン化は、緻密に制御された調節機構に基づいて行われる。例えば、タンパク質のユビキチン化は、ユビキチンリガーゼにより触媒されるが、このユビキチンリガーゼは、特定のタンパク質のみをユビキチン化する基質特異性を有している。従って、ユビキチン化されるタンパク質（基質）の種類に匹敵する数だけのユビキチンリガーゼが細胞内に存在することが予想される。
【０００５】
そこで、ユビキチンリガーゼ及び基質の関連性を探索するため、まずユビキチン化タンパク質を回収する必要がある。従来行われている回収方法は、抗原抗体反応を用いるものであり、具体的には、担体に固定化された抗ユビキチン抗体で、細胞溶解液から免疫沈降させて回収する方法である（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平７−２３８０９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前述した従来技術では、担体上に捕捉したポリユビキチン化タンパク質を溶出する際、酸やアルコールといった変性剤を用いる必要がある。この過程で、ユビキチン化タンパク質が変性するため、ユビキチンリガーゼ等の結合タンパク質が分離する。このため、ユビキチン化の調節機構を解明することが困難である。
【０００７】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、その第１の目的は、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できるポリペプチド及び回収方法、並びに、ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法、ポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、このＤＮＡを有するベクター、このベクターが導入された形質転換体を提供することである。
【０００８】
また、本発明の第２の目的は、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できるポリペプチドのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、抗体の代わりに、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用すれば、このポリペプチドに結合するユビキチン化タンパク質を非変性条件下で回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１０】
（１） ユビキチンへの結合能を有する以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ユビキチンへの結合能を有するポリペプチド
【００１１】
（２） 担体に結合及び解離可能なタグを更に有する（１）記載のポリペプチド。
【００１２】
（３） 前記タグは、１以上のシステイン分子を有する（２）記載のポリペプチド。
【００１３】
（４） ユビキチン化タンパク質の回収方法であって、
（１）から（３）いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させることで、前記ユビキチン化タンパク質を溶出する溶出手順と、を有する回収方法。
【００１４】
（５） 前記ポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して前記担体に固定化され、
前記溶出手順は、還元剤を添加することで、前記ポリペプチドを前記担体から解離させる手順である（４）記載の回収方法。
【００１５】
（６） ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法であって、
（１）から（３）いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させて得られる溶出液から、前記ユビキチン化タンパク質を回収する回収手順と、
前記ユビキチン化タンパク質とともに回収された前記結合タンパク質のアミノ酸配列を決定し、既知のアミノ酸配列と比較することで前記結合タンパク質を同定する同定手順と、を有する特定方法。
【００１６】
（７） 前記回収手順は、前記ユビキチン化タンパク質に結合する抗体と、抗ユビキチン抗体とを用いて、前記ユビキチン化タンパク質を沈降させる手順である（６）記載の特定方法。
【００１７】
（８） （１）から（３）いずれか記載のポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント。
【００１８】
（９） （１）から（３）いずれか記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【００１９】
（１０） （９）記載のＤＮＡ分子を有するベクター。
【００２０】
（１１） （１０）記載のベクターが導入された形質転換体。
【００２１】
（１２） ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列のスクリーニング方法であって、
ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するユビキチン結合性タンパク質の一部が削除された変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させる接触手順と、
前記変異ポリペプチドの各々へのユビキチンの結合を判定する判定手順と、
ユビキチンが結合すると判定された前記変異ポリペプチドから、最短のアミノ酸配列を選別する選別手順と、を有するスクリーニング方法。
【００２２】
（１３） 前記ユビキチン結合性タンパク質は、以下の式で示されるアミノ酸配列からなるユビキチン結合モチーフを有する（１２）記載のスクリーニング方法。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸、Φは疎水性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【００２３】
（１４） 前記ユビキチン結合性タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなるヒトＡＳＢ２ａである（１２）又は（１３）記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明が特に限定されるものではない。
【００２６】
＜ポリペプチド＞
本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ユビキチンへの結合能を有するポリペプチドである。
【００２７】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することは既に知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００２９】
配列番号１のアミノ酸配列は、後述する実施例に示されるように、ヒトＡＳＢ２ａの１３番目〜４１番目に位置し、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列である。ただし、アミノ酸配列の由来は、ヒトに限らず任意であってよい。
【００３０】
このヒトＡＳＢ２ａは、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ（ＵＩＭ）と呼ばれるユビキチン結合モチーフを２６番目〜４１番目の位置に有し、ユビキチンリガーゼを構成するタンパク質である（配列表、図１（Ａ）参照）。
【００３１】
ＵＩＭのアミノ酸配列は高度に保存されており、以下の式で示されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）、Φは疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【００３２】
本発明のポリペプチドは、より穏和な条件下でユビキチン化タンパク質を溶出できる点で、担体に結合及び解離可能なタグを更に有することが好ましい。このようなタグとしては、例えば、システイン、ポリヒスチジン、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。これらタグを用いてポリペプチドを担体に固定化する技術は、いずれも周知である。
【００３３】
これらのうち、小分子であり、回収されるユビキチン化タンパク質への夾雑物の混入を抑制できる点で、システイン、ポリヒスチジン、ビオチンが好ましい。また、ポリペプチドを人工的に合成する場合には、安価にポリペプチドを合成できる点で、システインがより好ましい。システイン分子の数は、ポリペプチド１分子につき１分子以上であってよいが、担体への結合性に問題がない限りにおいて１分子で充分である。
【００３４】
タグの位置は、特に限定されないが、本発明のポリペプチドの特性変化を抑制するため、Ｎ末端であることが好ましい。
【００３５】
［作製方法］
本発明のポリペプチドは、従来公知の方法で作製でき、具体的には、化学的に合成する方法（例えば、固相合成法、Ｆｍｏｃ法、ｔ−Ｂｏｃ法）、細胞培養を通じて合成する方法が挙げられる。しかし、ポリペプチドの純度に優れ、ユビキチン化タンパク質への夾雑物の混入を抑制できる点で、化学的に合成する方法が好ましい。
【００３６】
なお、細胞培養は、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する発現ベクターが導入された形質転換体を用いて行われてよい。形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量に且つ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる。
【００３７】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３８】
＜抗体・抗体フラグメント＞
本発明は、前述したポリペプチドに結合する抗体も包含する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。また、抗体には、ウサギ等の免疫動物に本発明のポリペプチドを免疫して得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、ヒト抗体や遺伝子組換えによるヒト型化抗体、種々の修飾が施された抗体が含まれる。
【００３９】
なお、本発明の抗体の作成方法としては、例えば、従来公知のハイブリドーマ法が挙げられる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５ （１９７５））。
【００４０】
また、本発明の抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェーンＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。
【００４１】
＜ＤＮＡ分子＞
本発明のＤＮＡは、センス鎖（例えば、タンパク質合成に適用できる）又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
【００４２】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４３】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより作製できる。
【００４４】
「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択でき、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択できる。
【００４５】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のＤＮＡを含むベクターを宿主に導入することにより、作製できる。
【００４６】
このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４７】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４８】
＜回収方法＞
本発明のポリペプチドによれば、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できる。このような本発明の回収方法は、捕捉手順と、溶出手順とを有する。各手順の詳細について、以下に説明する。
【００４９】
（捕捉手順）
捕捉手順は、本発明のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、試料に含まれるユビキチン化タンパク質をポリペプチドに結合させる手順である。
【００５０】
担体へのポリペプチドの固定化は、非変性条件下で解離できる様式であれば特に限定されない。具体的には、ポリペプチドが有するシステイン、ポリヒスチジン、アビジン等のタグと、担体が有するシステイン、ニトリロ三酢酸及びニッケルイオン、ストレプトアビジン等とを結合させればよい。この中でも、システイン分子同士によるジスルフィド結合を介する固定化が、安価にポリペプチドを合成できる点で、より好ましい。
【００５１】
（溶出手順）
溶出手順は、ポリペプチドを担体から解離させることで、ユビキチン化タンパク質を溶出する手順である。即ち、ポリペプチドを担体から解離させると、ポリペプチドが溶出することに伴い、このポリペプチドに結合したユビキチン化タンパク質が溶出する。
【００５２】
解離の様式は、固定化の様式に応じて適宜設定される。即ち、ポリペプチドが有するシステインを用いて固定化を行った場合、解離は還元剤を用いて行われ、ポリペプチドが有するポリヒスチジンを用いて固定化を行った場合、解離はイミダゾールを用いて行われ、ポリペプチドが有するアビジンを用いて固定化を行った場合、解離はビオチン誘導体であるデスチオビオチンを用いて行われてよい。これらの解離様式は、いずれも非変性条件にある。
【００５３】
本発明の回収方法を通じて得られる溶出液は、非変性条件下で得られるものであるため、ユビキチン化タンパク質と、このユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質とを有するライブラリーを含有する。従って、本発明の回収方法は、これらユビキチン化タンパク質及び結合タンパク質のライブラリーを包含するものである。このライブラリーは、溶液状、固体状、又は後述する基盤上に配列された状態等、任意の形態で保存されてよい。
【００５４】
＜特定方法＞
本発明は、ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法も包含する。この特定方法は、捕捉手順と、回収手順と、同定手順とを有する。捕捉手順は前述した回収方法と共通するため、回収手順及び同定手順について以下説明する。
【００５５】
（回収手順）
回収手順は、ポリペプチドを担体から解離させて得られる溶出液から、ユビキチン化タンパク質を回収する手順である。即ち、前述した回収方法で得られるユビキチン化タンパク質及び結合タンパク質のライブラリーから、目的のユビキチン化タンパク質と、このユビキチン化タンパク質の結合タンパク質とを精製する。例えば、溶出液に対して、目的のユビキチン化タンパク質に対する抗体と、抗ユビキチン抗体とを用いて共免疫沈降処理を行えばよい。
【００５６】
（同定手順）
同定手順は、ユビキチン化タンパク質とともに回収された結合タンパク質のアミノ酸配列を決定し、既知のアミノ酸配列と比較することで結合タンパク質を同定する手順である。例えば、回収手順で回収された目的のユビキチン化タンパク質と、このユビキチン化タンパク質の結合タンパク質とを電気泳動し、染色（例えば、銀染色）し、観察されたバンドに存在するタンパク質のアミノ酸配列を質量分析で決定する。続いて、決定されたアミノ酸配列を、データベース等に保存された既知のアミノ酸配列と比較して、結合タンパク質を同定する。
【００５７】
本発明の特定方法によれば、多種多様に亘るユビキチン化タンパク質が回収され、このユビキチン化タンパク質の結合タンパク質が特定される。従って、本発明の特定方法は、個別の基質に対するユビキチン化機構に関する深遠な調査のみならず、網羅的なユビキチン化機構の解析にも寄与できる。
【００５８】
＜スクリーニング方法＞
本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるものとしたが、これに限られず、以下のスクリーニング方法によって得られる、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列によっても、ユビキチン化タンパク質を非変性条件下で回収できることが期待される。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法は、接触手順と、判定手順と、選別手順とを有する。各手順の詳細について、以下に説明する。
【００６０】
（接触手順）
接触手順は、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するユビキチン結合性タンパク質の一部が削除された変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させる手順である。これにより、ユビキチン結合能を有する変異ポリペプチドにはユビキチンが結合するが、ユビキチン結合能を有しない変異ポリペプチドにはユビキチンが結合しない。
【００６１】
ユビキチン結合性タンパク質は、以下の式で示されるアミノ酸配列からなるユビキチン結合モチーフを有することが好ましく、ヒトＡＳＢ２ａであることがより好ましい。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸、Φは疎水性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【００６２】
なお、ＵＩＭは、２６ＳプロテアソームのサブユニットＳ５ａに存在するユビキチン結合モチーフとして最初に発見され、現在では、特にエンドサイトーシスや小胞輸送等の膜輸送系に関与する多くのタンパク質中に存在することが明らかになっている。具体的には、ＵＩＭは、前述したヒトＡＳＢ２ａの他、ＨＲＳ、Ｅｐｓ１５、ｅｐｓｉｎ（Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｏｌｏ Ｓ ，Ｓｉｇｉｓｍｕｎｄ Ｓ ，Ｆａｒｅｔｔａ Ｍ ，Ｇｕｉｄｉ Ｍ ，Ｃａｐｕａ ＭＲ ，Ｂｏｓｓｉ Ｇ ，Ｃｈｅｎ Ｈ ，Ｄｅ Ｃａｍｉｌｌｉ Ｐ ，Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ ＰＰ ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２；４１６（６８７９）：４５１−５）、Ｒｐｎ１０（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ． Ｍｕｅｌｌｅｒ ＴＤ ，Ｆｅｉｇｏｎ Ｊ ． ＥＭＢＯ Ｊ． ２００３；２２（１８）：４６３４−４５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ２６ Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ５ａ． Ｙｏｕｎｇ Ｐ ，Ｄｅｖｅｒａｕｘ Ｑ ，Ｂｅａｌ ＲＥ ，Ｐｉｃｋａｒｔ ＣＭ ，Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ Ｍ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９８；２７３（１０）：５４６１−７）、ＭＪＤ１（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｔａｘｉｎ−３． Ｂｅｒｋｅ ＳＪ ，Ｃｈａｉ Ｙ ，Ｍａｒｒｓ ＧＬ ，Ｗｅｎ Ｈ ，Ｐａｕｌｓｏｎ ＨＬ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００５；２８０（３６）：３２０２６−３４）、Ｕｆｏ１（Ｕｎｉｑｕｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＵｂＬ−ＵｂＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｄｉ１ ｉｎ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ＳＣＦＵｆｏ１ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｉｖａｎｔｓｉｖ Ｙ ，Ｋａｐｌｕｎ Ｌ ，Ｔｚｉｒｋｉｎ−Ｇｏｌｄｉｎ Ｒ ，Ｓｈａｂｅｋ Ｎ ，Ｒａｖｅｈ Ｄ ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００６；２６（５）：１５７９−８８）、ＭＥＫＫ１（Ｎｏｎ−ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｃｈｎｅｌｌ ＪＤ ，Ｈｉｃｋｅ Ｌ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３；２７８（３８）：３５８５７−６０）等の種々のタンパク質の中に存在する（図１（Ｂ）参照）。
【００６３】
大部分のタンパク質では、一分子中に複数のコンセンサス配列がタンデムに存在するが、ＡＳＢ２ａやＨＲＳでは、一分子中に一つのコンセンサス配列しか存在しないことが特徴的である。即ち、ＡＳＢ２ａ又はＨＲＳが有するＵＩＭは、それ自身で、ユビキチン結合能を発揮する。従って、ＡＳＢ２ａ又はＨＲＳの変異ポリペプチドを用いれば、ユビキチン結合能を有するために最低限必要な短いアミノ酸配列が得られることが期待される。アミノ酸配列が短いことは、そのポリペプチドを安価に合成できる点、及び夾雑物の混入を抑制できる点において有利である。
【００６４】
なお、変異ポリペプチドの作製方法は、特に限定されないが、例えば、変異ポリペプチドの各々をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを作成し、この発現ベクターを導入した形質転換体を培養し変異ポリペプチドを合成させ、合成された変異ポリペプチドを精製すればよい。精製用タグが融合した形で変異ポリペプチドが合成されるように発現ベクターを作成すれば、変異ポリペプチドの精製が容易となる。このような精製系は、従来周知であり、例えば、グルタチオンが担持された担体及びＧＳＴタグを使用する系、マルトースが担持された担体及びＭＢＰタグを使用する系であってよい。
【００６５】
（判定手順）
判定手順は、変異ポリペプチドの各々へのユビキチンの結合を判定する手順である。ユビキチンの結合の有無は、例えば、各変異ポリペプチドを担体から解離させて得られる溶出液を電気泳動し、抗ユビキチン抗体を用いて免疫ブロッティングを行うことで判定できる。即ち、抗ユビキチン抗体の存在を示すバンドが確認されれば、溶出液中に変異タンパク質とともにユビキチンが存在し、これらが互いに結合することが示唆される。
【００６６】
（選別手順）
ユビキチンが結合すると判定された変異ポリペプチドから、最短のアミノ酸配列を選別する手順である。これにより、ユビキチンに結合するために最低限必要なアミノ酸配列が選別される。このようなアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ユビキチン化タンパク質を非変性条件下で回収できることに加え、安価に合成できる点及び夾雑物の混入を抑制できる点において有利である。
【００６７】
＜その他＞
［記録媒体］
新規なユビキチン化タンパク質や結合タンパク質のアミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能記録媒体に保存されてよい。この記録媒体によれば、保存されているアミノ酸配列を、コンピュータを用いてデータベース化することができ、配列情報としても活用できる。
【００６８】
記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能であれば、特に限定されず、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等が挙げられる。
【００６９】
［網羅的解析用ツール］
本発明のポリペプチド及びＤＮＡ、並びに、これらの部分断片は、基盤上に結合された状態で使用することもできる。このようなツールは、ユビキチン化機構の網羅的な解析のために使用できる。
【００７０】
基盤としては、特に限定されないが、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションの検出を、例えば蛍光物質といった非放射性同位体物質を用いて行う場合、基盤として、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等を好ましく使用できる。なお、ポリペプチドやＤＮＡの基板上への結合は、公知の方法で行うことができる。
【実施例】
【００７１】
＜実施例１＞ スクリーニング方法
ヒトＡＳＢ２ａに着目した出願人は、ユビキチン結合性タンパク質としてのヒトＡＳＢ２ａから、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列のスクリーニングを行った。まず、図２（Ａ）に示されるヒトＡＳＢ２ａｃＤＮＡから、ヒトＡＳＢ２ａアミノ酸配列（配列番号３）の１〜６８番目、１〜４１番目、１２〜６８番目、２６〜６８番目、１２〜４１番目、２６〜４１番目からなる変異ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子をそれぞれ作製し、大腸菌発現用の発現ベクターである「ｐＧＥＸ−２ＴＫ」（ＧＥヘルスケア社製）の挿入部位に挿入した。挿入は、変異ポリペプチドのＮ末端側にＧＳＴタグが融合した形でタンパク質発現がなされるように行った。この発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に導入して形質転換体を作製した。この形質転換体を２ｘＹＴ培地（終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）で終夜３０℃にて培養し、翌日、この終夜培養液を新しい２×ＹＴ培地（終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に種菌し、３０℃で２時間更に培養した。次に、培養液に、終濃度が０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃で２時間培養することでタンパク質発現を誘導した。
【００７２】
培養液を遠心分離して菌体を回収し、冷ＰＢＳで洗浄した。菌体を５０ｍＬの溶解用緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１％「ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ」（Ｓｉｇｍａ社製））で懸濁し、超音波破砕機により破砕した。その遠心上清を菌体溶解液として回収し、この菌体溶解液を、グルタチオンを担持した「グルタチオンセファロース４Ｂ」（ＧＥヘルスケア社製）とともに、１〜２時間に亘ってインキュベーションすることで、各変異ポリペプチドを「グルタチオンセファロース４Ｂ」ビーズに固定した。ビーズを、１０倍容量の洗浄用緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄することで、各変異ポリペプチドを担体に固定化した。
【００７３】
一方、ヒト子宮頸由来ＨｅＬａ細胞を、直径１０ｃｍの組織培養ディッシュに１枚当り３．７５ｘ１０６個の細胞密度で播種し、翌日、無血清培地に交換した。更に翌日、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ディッシュ１枚当り５００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１％プロテアーゼインヒビターカクテル、１０ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド）を加えた。直ちにセルスクレイパーを用いて細胞を剥離し、回収した溶解液を氷上で３０分間静置した後、１７，５００ｇ、４℃にて３０分間遠心した。得られた細胞溶解液を試料とした。
【００７４】
図２（Ａ）に示されるように、細胞溶解液には、ユビキチンが結合したタンパク質の他、ユビキチンが結合しなかったタンパク質、及び遊離ユビキチン等の種々の物質が混在している。このような細胞溶解液を、変異ポリペプチドが固定化されたカラムを通過させることで、変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させた。以上は、接触手順の一例である。
【００７５】
カラムを洗浄することで、カラム中に残存する夾雑物を除去した後、変異ポリペプチドを担体から解離させ、溶出液を得た。得られた各溶出液に含有された物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分離した。分離後のタンパク質を、ゲルからＰＶＤＦ膜へと転写し、この膜を、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％「Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）」）に溶解した５％スキムミルク中で、室温にて２時間反応させた。膜をＴＢＳＴで洗浄し（１０分間、３回）、抗ユビキチンモノクローナル抗体（一次抗体）で室温にて一晩反応させた。その後、膜をＴＢＳＴで洗浄し（１０分間、３回）、一次抗体に対応したＨＲＰ標識二次抗体で、室温にて１時間反応させた。膜をＴＢＳＴで洗浄し（１０分間、３回）、「ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（商品名）」（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で反応させた後、Ｘ線フィルムに露光させた。この結果を、図２（Ｂ）に示す。
【００７６】
図２（Ｂ）に示されるように、ユビキチンの結合が認められた変異ポリペプチドは、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１〜６８番目、１〜４１番目、１２〜６８番目、１２〜４１番目のアミノ酸配列からなっていた。一方、２６〜６８番目、２６〜４１番目のアミノ酸からなる変異ポリペプチドへのユビキチンの結合は認められなかった。以上は、判定手順の一例である。
【００７７】
ユビキチンが結合する変異ポリペプチドから選別される最短のアミノ酸配列は、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１２〜４１番目のアミノ酸配列であった。以上は、選別手順の一例である。なお、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１２〜４１番目のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にシステインが付加された配列に等しい。
【００７８】
＜実施例２＞ ユビキチン化タンパク質の回収方法
次に、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１２〜４１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、化学的に合成した（図５において「ＷＴ」と表記する）。このポリペプチドを、担体であるセファロースレジン「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（商品名）」（アマシャムバイオサイエンス社製）に固定化し（捕捉手順）、実施例１と同様の手順でユビキチン化タンパク質との結合活性の有無を調べた。
【００７９】
なお、この実施例において、ポリペプチドの１６〜１８番目に位置する「ＥＤＥ」を、「ＡＡＡ」に置換した変異ポリペプチドを対照区（図５において「ＭＴ」と表記する）として使用した。この３つの酸性アミノ酸は、ユビキチンへの結合に極めて重要な役割を果たすことが既に報告されている（Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｏｌｏ Ｓ ，Ｓｉｇｉｓｍｕｎｄ Ｓ ，Ｆａｒｅｔｔａ Ｍ ，Ｇｕｉｄｉ Ｍ ，Ｃａｐｕａ ＭＲ ，Ｂｏｓｓｉ Ｇ ，Ｃｈｅｎ Ｈ ，Ｄｅ Ｃａｍｉｌｌｉ Ｐ ，Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ ＰＰ ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２ Ｍａｒ ２８；４１６（６８７９）：４５１−５．、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ． Ｍｉｌｌｅｒ ＳＬ ，Ｍａｌｏｔｋｙ Ｅ ，Ｏ’Ｂｒｙａｎ ＪＰ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００４；２７９（３２）：３３５２８−３７）。
【００８０】
この実験系において、ポリペプチドは、そのＮ末端に存在するシステイン分子を用い、ジスルフィド結合を介して「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ」に固定化されるため、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）等の還元剤で、レジンから溶出できる（図３参照）。従って、ポリペプチドにユビキチン化タンパク質との結合活性があれば、レジンに捕捉されたユビキチン化タンパク質を変性させることなく、タンパク質間相互作用を破壊しない穏和な条件で溶出できる（図４参照）。
【００８１】
ポリペプチドを固定化した「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ」を、実施例１で用いた細胞溶解液と混合した後、２−ＭＥを添加することで、ポリペプチドをレジンから溶出した（溶出手順）。この溶出液を用い、実施例１と同様の手順で、ユビキチンの存在を確認した。この結果を図５に示す。
【００８２】
図５に示されるように、ポリペプチド（ＷＴ）とともに溶出した画分には、幅広い分子量に亘るユビキチン化タンパク質の存在が確認された。一方、ユビキチンへの結合活性を失っていると予想される変異ポリペプチド（ＭＴ）とともに溶出した画分には、ユビキチン化タンパク質の存在が確認されなかった。従って、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質由来のポリペプチドは、化学的に合成しても、ユビキチン化タンパク質との結合活性を保持することが示された。
【００８３】
＜実施例３＞
実施例２で使用したポリペプチド固定化レジンを、４８番目のリジン残基を介して互いに結合されたオリゴユビキチン分子（図６において「Ｋ４８」と表記する）、又は６３番目のリジン残基を介して互いに結合されたオリゴユビキチン分子（図６において「Ｋ６３」と表記する）と混合した。オリゴユビキチン分子は、１〜７分子が結合された各々を用いた。その後、実施例２と同様の手順で、ユビキチン化タンパク質を溶出し、溶出画分におけるユビキチン（Ｕｂ）の存在を確認した。この結果を図６に示す。
【００８４】
図６に示されるように、ポリペプチド（ＷＴ）とともに溶出した画分には、Ｋ４８及びＫ６３のいずれの様式で結合したオリゴユビキチン分子も存在した。一方、ユビキチンへの結合活性を失っていると予想される変異ポリペプチド（ＭＴ）とともに溶出した画分には、Ｋ４８及びＫ６３のいずれの様式で結合したオリゴユビキチンの存在も確認されなかった。従って、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質由来のポリペプチドによれば、試料中に存在するあらゆる種類のユビキチン化タンパク質を回収できることが期待される。
【００８５】
また、ポリペプチド（ＷＴ）とともに溶出した画分には、モノユビキチン分子の存在を確認できなかった。従って、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質由来のポリペプチドによれば、試料中に存在する遊離のユビキチンが結合しないので、回収物への夾雑物の混入を抑制できることも期待される。
【００８６】
＜実施例４＞
増殖因子の一つであるＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）は、その受容体であるＥＧＦＲ（ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合すると、ＥＧＦＲのリン酸化を引き金とした細胞内シグナル伝達の活性化を誘導する。それに伴って負の制御機構が同時に働き、間もなくＥＧＦＲはエンドサイトーシスで細胞内に取り込まれる。その機構に重要な役割を果たすのがＣｂｌであり、このＣｂｌは、ＥＧＦ刺激依存的にＥＧＦＲをモノユビキチン化するユビキチンリガーゼである。Ｃｂｌは、過剰なモノユビキチン化を抑えるために、別のユビキチンリガーゼであるＮｅｄｄ４により、Ｋ４８結合型でポリユビキチン化されることが既に報告されている。しかし、最近、ＥＧＦ刺激依存的なＥＧＦＲのユビキチン化には、モノユビキチン化のみならず、Ｋ６３結合型のポリユビキチン化も含まれることが明らかになってきた（図７参照）。このモデルについて、本発明のポリペプチドの適用を試みた。
【００８７】
まず、ヒト子宮頸由来ＨｅＬａ細胞を、直径１０ｃｍの組織培養ディッシュに１枚当り３．７５ｘ１０６個の細胞密度で播種し、翌日、無血清培地に交換した。更に翌日、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを５分間処理した後、実施例１と同様の手順で細胞溶解液（図８〜９において「＋」と表記する）を得た。一方、ＥＧＦ処理を行わない対照区として、実施例１で得た細胞溶解液（図８〜９において「−」と表記する）を使用した。各細胞溶解液を用い、実施例２と同様の手順で、ユビキチン（Ｕｂ）の存在を確認した。また、一次抗体として、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｃｂｌ抗体を用いた以外は、実施例２と同様の手順で、ＥＧＦＲ、Ｃｂｌの存在を確認した。この結果を併せて図８に示す。
【００８８】
図８上段に示されるように、ポリペプチド固定化レジンを用い、ポリペプチドとともに溶出した画分には、ＥＧＦ処理の有無に関わらず、幅広い分子量に亘る多様なユビキチン化タンパク質の存在が確認された。また、図８中段、下段に示されるように、ＥＧＦ処理を行った画分には、ＥＧＦＲ、Ｃｂｌの存在を示す、幅広い分子量に亘るバンドが検出された。以上をまとめると、この溶出画分には、Ｋ６３結合型のユビキチン化ＥＧＦＲ（図８中段のバンド）、Ｋ４８結合型のユビキチン化Ｃｂｌ（図８下段の上側バンド）、及びユビキチン化タンパク質に結合したＣｂｌ（図８下段の下側バンド）のすべてが存在することが明らかになった。
【００８９】
＜実施例５＞
続いて、実施例４で得た溶出画分から、抗ＥＧＦＲ抗体を用いて、ユビキチン化ＥＧＦＲを沈降させ、精製した。この精製物について、実施例４と同様の手順で、ユビキチン、ＥＧＦＲ、Ｃｂｌの存在を確認した。この結果を図９に示す。
【００９０】
図９上段及び中段に示されるように、精製物には、ユビキチン化ＥＧＦＲが存在していた。そして、図９下段に示されるように、この精製物には、Ｃｂｌの存在も確認された。以上から、ＥＧＦＲとＣｂｌとが結合した複合体が、その形態を保持したまま存在することが明らかになった。従って、本発明のポリペプチドを用いることで、ユビキチン化タンパク質及びその結合タンパク質を複合体の形態のまま回収できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の一実施例に係るスクリーニング方法で用いたユビキチン結合性タンパク質の一次構造を示す図である。
【図２】本発明の一実施例に係るスクリーニング方法で用いた変異ポリペプチドへのユビキチンの結合の有無を示す図である。
【図３】本発明の一実施例に係る回収方法の機構を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施例に係る回収方法の機構を示す模式図である。
【図５】本発明の一実施例に係る回収方法を通じて得られるユビキチン化タンパク質の存在を示す図である。
【図６】本発明の一実施例に係る回収方法を通じて得られるオリゴユビキチンの存在を示す図である。
【図７】本発明の一実施例に係る回収方法で用いられた実験系の模式図である。
【図８】本発明の一実施例に係る回収方法で得られるユビキチン化タンパク質及びその結合タンパク質の存在を示す図である。
【図９】本発明の一実施例に係る回収方法で得られるユビキチン化タンパク質及びその結合タンパク質の複合状態を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチン化タンパク質を回収する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の多くは、様々な翻訳後修飾を受けることで機能調節されている。その中でも、ユビキチン化は、パーキンソン病やある種の癌等の様々な重篤な疾患への関与が報告されていることからも、注目すべき翻訳後修飾の一つである。ここで、ユビキチンとは、７６アミノ酸からなる分子量の極めて小さなタンパク質である。
【０００３】
ユビキチン化は、一分子のユビキチンが修飾されるモノユビキチン化と、鎖状に連なった複数のユビキチンが修飾されるポリユビキチン化とに分類される。更に、ポリユビキチン化は、ユビキチン分子同士の結合に使われるアミノ酸（リジン残基）の違いによって、機能的に細分化される。即ち、ユビキチンの４８番目のリジン残基を介して起こるＫ４８結合型ユビキチン化はタンパク質分解を誘発する一方、他のリジン残基を介したユビキチン化（Ｋ６３等）やモノユビキチン化は、エンドサイトーシスや細胞内タンパク質輸送制御といった、タンパク質分解とは異なる細胞内機能に関与している。
【０００４】
多くのタンパク質が、分解や活性制御のためにユビキチン化されることが既に報告されているが、そのユビキチン化は、緻密に制御された調節機構に基づいて行われる。例えば、タンパク質のユビキチン化は、ユビキチンリガーゼにより触媒されるが、このユビキチンリガーゼは、特定のタンパク質のみをユビキチン化する基質特異性を有している。従って、ユビキチン化されるタンパク質（基質）の種類に匹敵する数だけのユビキチンリガーゼが細胞内に存在することが予想される。
【０００５】
そこで、ユビキチンリガーゼ及び基質の関連性を探索するため、まずユビキチン化タンパク質を回収する必要がある。従来行われている回収方法は、抗原抗体反応を用いるものであり、具体的には、担体に固定化された抗ユビキチン抗体で、細胞溶解液から免疫沈降させて回収する方法である（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平７−２３８０９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前述した従来技術では、担体上に捕捉したポリユビキチン化タンパク質を溶出する際、酸やアルコールといった変性剤を用いる必要がある。この過程で、ユビキチン化タンパク質が変性するため、ユビキチンリガーゼ等の結合タンパク質が分離する。このため、ユビキチン化の調節機構を解明することが困難である。
【０００７】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、その第１の目的は、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できるポリペプチド及び回収方法、並びに、ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法、ポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、このＤＮＡを有するベクター、このベクターが導入された形質転換体を提供することである。
【０００８】
また、本発明の第２の目的は、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できるポリペプチドのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、抗体の代わりに、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用すれば、このポリペプチドに結合するユビキチン化タンパク質を非変性条件下で回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１０】
（１） ユビキチンへの結合能を有する以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ユビキチンへの結合能を有するポリペプチド
【００１１】
（２） 担体に結合及び解離可能なタグを更に有する（１）記載のポリペプチド。
【００１２】
（３） 前記タグは、１以上のシステイン分子を有する（２）記載のポリペプチド。
【００１３】
（４） ユビキチン化タンパク質の回収方法であって、
（１）から（３）いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させることで、前記ユビキチン化タンパク質を溶出する溶出手順と、を有する回収方法。
【００１４】
（５） 前記ポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して前記担体に固定化され、
前記溶出手順は、還元剤を添加することで、前記ポリペプチドを前記担体から解離させる手順である（４）記載の回収方法。
【００１５】
（６） ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法であって、
（１）から（３）いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させて得られる溶出液から、前記ユビキチン化タンパク質を回収する回収手順と、
前記ユビキチン化タンパク質とともに回収された前記結合タンパク質のアミノ酸配列を決定し、既知のアミノ酸配列と比較することで前記結合タンパク質を同定する同定手順と、を有する特定方法。
【００１６】
（７） 前記回収手順は、前記ユビキチン化タンパク質に結合する抗体と、抗ユビキチン抗体とを用いて、前記ユビキチン化タンパク質を沈降させる手順である（６）記載の特定方法。
【００１７】
（８） （１）から（３）いずれか記載のポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント。
【００１８】
（９） （１）から（３）いずれか記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【００１９】
（１０） （９）記載のＤＮＡ分子を有するベクター。
【００２０】
（１１） （１０）記載のベクターが導入された形質転換体。
【００２１】
（１２） ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列のスクリーニング方法であって、
ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するユビキチン結合性タンパク質の一部が削除された変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させる接触手順と、
前記変異ポリペプチドの各々へのユビキチンの結合を判定する判定手順と、
ユビキチンが結合すると判定された前記変異ポリペプチドから、最短のアミノ酸配列を選別する選別手順と、を有するスクリーニング方法。
【００２２】
（１３） 前記ユビキチン結合性タンパク質は、以下の式で示されるアミノ酸配列からなるユビキチン結合モチーフを有する（１２）記載のスクリーニング方法。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸、Φは疎水性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【００２３】
（１４） 前記ユビキチン結合性タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなるヒトＡＳＢ２ａである（１２）又は（１３）記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明が特に限定されるものではない。
【００２６】
＜ポリペプチド＞
本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ユビキチンへの結合能を有するポリペプチドである。
【００２７】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することは既に知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００２９】
配列番号１のアミノ酸配列は、後述する実施例に示されるように、ヒトＡＳＢ２ａの１３番目〜４１番目に位置し、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列である。ただし、アミノ酸配列の由来は、ヒトに限らず任意であってよい。
【００３０】
このヒトＡＳＢ２ａは、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ（ＵＩＭ）と呼ばれるユビキチン結合モチーフを２６番目〜４１番目の位置に有し、ユビキチンリガーゼを構成するタンパク質である（配列表、図１（Ａ）参照）。
【００３１】
ＵＩＭのアミノ酸配列は高度に保存されており、以下の式で示されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）、Φは疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【００３２】
本発明のポリペプチドは、より穏和な条件下でユビキチン化タンパク質を溶出できる点で、担体に結合及び解離可能なタグを更に有することが好ましい。このようなタグとしては、例えば、システイン、ポリヒスチジン、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。これらタグを用いてポリペプチドを担体に固定化する技術は、いずれも周知である。
【００３３】
これらのうち、小分子であり、回収されるユビキチン化タンパク質への夾雑物の混入を抑制できる点で、システイン、ポリヒスチジン、ビオチンが好ましい。また、ポリペプチドを人工的に合成する場合には、安価にポリペプチドを合成できる点で、システインがより好ましい。システイン分子の数は、ポリペプチド１分子につき１分子以上であってよいが、担体への結合性に問題がない限りにおいて１分子で充分である。
【００３４】
タグの位置は、特に限定されないが、本発明のポリペプチドの特性変化を抑制するため、Ｎ末端であることが好ましい。
【００３５】
［作製方法］
本発明のポリペプチドは、従来公知の方法で作製でき、具体的には、化学的に合成する方法（例えば、固相合成法、Ｆｍｏｃ法、ｔ−Ｂｏｃ法）、細胞培養を通じて合成する方法が挙げられる。しかし、ポリペプチドの純度に優れ、ユビキチン化タンパク質への夾雑物の混入を抑制できる点で、化学的に合成する方法が好ましい。
【００３６】
なお、細胞培養は、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する発現ベクターが導入された形質転換体を用いて行われてよい。形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量に且つ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる。
【００３７】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３８】
＜抗体・抗体フラグメント＞
本発明は、前述したポリペプチドに結合する抗体も包含する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。また、抗体には、ウサギ等の免疫動物に本発明のポリペプチドを免疫して得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、ヒト抗体や遺伝子組換えによるヒト型化抗体、種々の修飾が施された抗体が含まれる。
【００３９】
なお、本発明の抗体の作成方法としては、例えば、従来公知のハイブリドーマ法が挙げられる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５ （１９７５））。
【００４０】
また、本発明の抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェーンＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。
【００４１】
＜ＤＮＡ分子＞
本発明のＤＮＡは、センス鎖（例えば、タンパク質合成に適用できる）又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
【００４２】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４３】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより作製できる。
【００４４】
「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択でき、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択できる。
【００４５】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のＤＮＡを含むベクターを宿主に導入することにより、作製できる。
【００４６】
このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４７】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４８】
＜回収方法＞
本発明のポリペプチドによれば、非変性条件下でユビキチン化タンパク質を回収できる。このような本発明の回収方法は、捕捉手順と、溶出手順とを有する。各手順の詳細について、以下に説明する。
【００４９】
（捕捉手順）
捕捉手順は、本発明のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、試料に含まれるユビキチン化タンパク質をポリペプチドに結合させる手順である。
【００５０】
担体へのポリペプチドの固定化は、非変性条件下で解離できる様式であれば特に限定されない。具体的には、ポリペプチドが有するシステイン、ポリヒスチジン、アビジン等のタグと、担体が有するシステイン、ニトリロ三酢酸及びニッケルイオン、ストレプトアビジン等とを結合させればよい。この中でも、システイン分子同士によるジスルフィド結合を介する固定化が、安価にポリペプチドを合成できる点で、より好ましい。
【００５１】
（溶出手順）
溶出手順は、ポリペプチドを担体から解離させることで、ユビキチン化タンパク質を溶出する手順である。即ち、ポリペプチドを担体から解離させると、ポリペプチドが溶出することに伴い、このポリペプチドに結合したユビキチン化タンパク質が溶出する。
【００５２】
解離の様式は、固定化の様式に応じて適宜設定される。即ち、ポリペプチドが有するシステインを用いて固定化を行った場合、解離は還元剤を用いて行われ、ポリペプチドが有するポリヒスチジンを用いて固定化を行った場合、解離はイミダゾールを用いて行われ、ポリペプチドが有するアビジンを用いて固定化を行った場合、解離はビオチン誘導体であるデスチオビオチンを用いて行われてよい。これらの解離様式は、いずれも非変性条件にある。
【００５３】
本発明の回収方法を通じて得られる溶出液は、非変性条件下で得られるものであるため、ユビキチン化タンパク質と、このユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質とを有するライブラリーを含有する。従って、本発明の回収方法は、これらユビキチン化タンパク質及び結合タンパク質のライブラリーを包含するものである。このライブラリーは、溶液状、固体状、又は後述する基盤上に配列された状態等、任意の形態で保存されてよい。
【００５４】
＜特定方法＞
本発明は、ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法も包含する。この特定方法は、捕捉手順と、回収手順と、同定手順とを有する。捕捉手順は前述した回収方法と共通するため、回収手順及び同定手順について以下説明する。
【００５５】
（回収手順）
回収手順は、ポリペプチドを担体から解離させて得られる溶出液から、ユビキチン化タンパク質を回収する手順である。即ち、前述した回収方法で得られるユビキチン化タンパク質及び結合タンパク質のライブラリーから、目的のユビキチン化タンパク質と、このユビキチン化タンパク質の結合タンパク質とを精製する。例えば、溶出液に対して、目的のユビキチン化タンパク質に対する抗体と、抗ユビキチン抗体とを用いて共免疫沈降処理を行えばよい。
【００５６】
（同定手順）
同定手順は、ユビキチン化タンパク質とともに回収された結合タンパク質のアミノ酸配列を決定し、既知のアミノ酸配列と比較することで結合タンパク質を同定する手順である。例えば、回収手順で回収された目的のユビキチン化タンパク質と、このユビキチン化タンパク質の結合タンパク質とを電気泳動し、染色（例えば、銀染色）し、観察されたバンドに存在するタンパク質のアミノ酸配列を質量分析で決定する。続いて、決定されたアミノ酸配列を、データベース等に保存された既知のアミノ酸配列と比較して、結合タンパク質を同定する。
【００５７】
本発明の特定方法によれば、多種多様に亘るユビキチン化タンパク質が回収され、このユビキチン化タンパク質の結合タンパク質が特定される。従って、本発明の特定方法は、個別の基質に対するユビキチン化機構に関する深遠な調査のみならず、網羅的なユビキチン化機構の解析にも寄与できる。
【００５８】
＜スクリーニング方法＞
本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるものとしたが、これに限られず、以下のスクリーニング方法によって得られる、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列によっても、ユビキチン化タンパク質を非変性条件下で回収できることが期待される。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法は、接触手順と、判定手順と、選別手順とを有する。各手順の詳細について、以下に説明する。
【００６０】
（接触手順）
接触手順は、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するユビキチン結合性タンパク質の一部が削除された変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させる手順である。これにより、ユビキチン結合能を有する変異ポリペプチドにはユビキチンが結合するが、ユビキチン結合能を有しない変異ポリペプチドにはユビキチンが結合しない。
【００６１】
ユビキチン結合性タンパク質は、以下の式で示されるアミノ酸配列からなるユビキチン結合モチーフを有することが好ましく、ヒトＡＳＢ２ａであることがより好ましい。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸、Φは疎水性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【００６２】
なお、ＵＩＭは、２６ＳプロテアソームのサブユニットＳ５ａに存在するユビキチン結合モチーフとして最初に発見され、現在では、特にエンドサイトーシスや小胞輸送等の膜輸送系に関与する多くのタンパク質中に存在することが明らかになっている。具体的には、ＵＩＭは、前述したヒトＡＳＢ２ａの他、ＨＲＳ、Ｅｐｓ１５、ｅｐｓｉｎ（Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｏｌｏ Ｓ ，Ｓｉｇｉｓｍｕｎｄ Ｓ ，Ｆａｒｅｔｔａ Ｍ ，Ｇｕｉｄｉ Ｍ ，Ｃａｐｕａ ＭＲ ，Ｂｏｓｓｉ Ｇ ，Ｃｈｅｎ Ｈ ，Ｄｅ Ｃａｍｉｌｌｉ Ｐ ，Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ ＰＰ ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２；４１６（６８７９）：４５１−５）、Ｒｐｎ１０（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ． Ｍｕｅｌｌｅｒ ＴＤ ，Ｆｅｉｇｏｎ Ｊ ． ＥＭＢＯ Ｊ． ２００３；２２（１８）：４６３４−４５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ２６ Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ５ａ． Ｙｏｕｎｇ Ｐ ，Ｄｅｖｅｒａｕｘ Ｑ ，Ｂｅａｌ ＲＥ ，Ｐｉｃｋａｒｔ ＣＭ ，Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ Ｍ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９８；２７３（１０）：５４６１−７）、ＭＪＤ１（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｔａｘｉｎ−３． Ｂｅｒｋｅ ＳＪ ，Ｃｈａｉ Ｙ ，Ｍａｒｒｓ ＧＬ ，Ｗｅｎ Ｈ ，Ｐａｕｌｓｏｎ ＨＬ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００５；２８０（３６）：３２０２６−３４）、Ｕｆｏ１（Ｕｎｉｑｕｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＵｂＬ−ＵｂＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｄｉ１ ｉｎ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ＳＣＦＵｆｏ１ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｉｖａｎｔｓｉｖ Ｙ ，Ｋａｐｌｕｎ Ｌ ，Ｔｚｉｒｋｉｎ−Ｇｏｌｄｉｎ Ｒ ，Ｓｈａｂｅｋ Ｎ ，Ｒａｖｅｈ Ｄ ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００６；２６（５）：１５７９−８８）、ＭＥＫＫ１（Ｎｏｎ−ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｃｈｎｅｌｌ ＪＤ ，Ｈｉｃｋｅ Ｌ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３；２７８（３８）：３５８５７−６０）等の種々のタンパク質の中に存在する（図１（Ｂ）参照）。
【００６３】
大部分のタンパク質では、一分子中に複数のコンセンサス配列がタンデムに存在するが、ＡＳＢ２ａやＨＲＳでは、一分子中に一つのコンセンサス配列しか存在しないことが特徴的である。即ち、ＡＳＢ２ａ又はＨＲＳが有するＵＩＭは、それ自身で、ユビキチン結合能を発揮する。従って、ＡＳＢ２ａ又はＨＲＳの変異ポリペプチドを用いれば、ユビキチン結合能を有するために最低限必要な短いアミノ酸配列が得られることが期待される。アミノ酸配列が短いことは、そのポリペプチドを安価に合成できる点、及び夾雑物の混入を抑制できる点において有利である。
【００６４】
なお、変異ポリペプチドの作製方法は、特に限定されないが、例えば、変異ポリペプチドの各々をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを作成し、この発現ベクターを導入した形質転換体を培養し変異ポリペプチドを合成させ、合成された変異ポリペプチドを精製すればよい。精製用タグが融合した形で変異ポリペプチドが合成されるように発現ベクターを作成すれば、変異ポリペプチドの精製が容易となる。このような精製系は、従来周知であり、例えば、グルタチオンが担持された担体及びＧＳＴタグを使用する系、マルトースが担持された担体及びＭＢＰタグを使用する系であってよい。
【００６５】
（判定手順）
判定手順は、変異ポリペプチドの各々へのユビキチンの結合を判定する手順である。ユビキチンの結合の有無は、例えば、各変異ポリペプチドを担体から解離させて得られる溶出液を電気泳動し、抗ユビキチン抗体を用いて免疫ブロッティングを行うことで判定できる。即ち、抗ユビキチン抗体の存在を示すバンドが確認されれば、溶出液中に変異タンパク質とともにユビキチンが存在し、これらが互いに結合することが示唆される。
【００６６】
（選別手順）
ユビキチンが結合すると判定された変異ポリペプチドから、最短のアミノ酸配列を選別する手順である。これにより、ユビキチンに結合するために最低限必要なアミノ酸配列が選別される。このようなアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ユビキチン化タンパク質を非変性条件下で回収できることに加え、安価に合成できる点及び夾雑物の混入を抑制できる点において有利である。
【００６７】
＜その他＞
［記録媒体］
新規なユビキチン化タンパク質や結合タンパク質のアミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能記録媒体に保存されてよい。この記録媒体によれば、保存されているアミノ酸配列を、コンピュータを用いてデータベース化することができ、配列情報としても活用できる。
【００６８】
記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能であれば、特に限定されず、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等が挙げられる。
【００６９】
［網羅的解析用ツール］
本発明のポリペプチド及びＤＮＡ、並びに、これらの部分断片は、基盤上に結合された状態で使用することもできる。このようなツールは、ユビキチン化機構の網羅的な解析のために使用できる。
【００７０】
基盤としては、特に限定されないが、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションの検出を、例えば蛍光物質といった非放射性同位体物質を用いて行う場合、基盤として、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等を好ましく使用できる。なお、ポリペプチドやＤＮＡの基板上への結合は、公知の方法で行うことができる。
【実施例】
【００７１】
＜実施例１＞ スクリーニング方法
ヒトＡＳＢ２ａに着目した出願人は、ユビキチン結合性タンパク質としてのヒトＡＳＢ２ａから、ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列のスクリーニングを行った。まず、図２（Ａ）に示されるヒトＡＳＢ２ａｃＤＮＡから、ヒトＡＳＢ２ａアミノ酸配列（配列番号３）の１〜６８番目、１〜４１番目、１２〜６８番目、２６〜６８番目、１２〜４１番目、２６〜４１番目からなる変異ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子をそれぞれ作製し、大腸菌発現用の発現ベクターである「ｐＧＥＸ−２ＴＫ」（ＧＥヘルスケア社製）の挿入部位に挿入した。挿入は、変異ポリペプチドのＮ末端側にＧＳＴタグが融合した形でタンパク質発現がなされるように行った。この発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に導入して形質転換体を作製した。この形質転換体を２ｘＹＴ培地（終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）で終夜３０℃にて培養し、翌日、この終夜培養液を新しい２×ＹＴ培地（終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に種菌し、３０℃で２時間更に培養した。次に、培養液に、終濃度が０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃で２時間培養することでタンパク質発現を誘導した。
【００７２】
培養液を遠心分離して菌体を回収し、冷ＰＢＳで洗浄した。菌体を５０ｍＬの溶解用緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１％「ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ」（Ｓｉｇｍａ社製））で懸濁し、超音波破砕機により破砕した。その遠心上清を菌体溶解液として回収し、この菌体溶解液を、グルタチオンを担持した「グルタチオンセファロース４Ｂ」（ＧＥヘルスケア社製）とともに、１〜２時間に亘ってインキュベーションすることで、各変異ポリペプチドを「グルタチオンセファロース４Ｂ」ビーズに固定した。ビーズを、１０倍容量の洗浄用緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄することで、各変異ポリペプチドを担体に固定化した。
【００７３】
一方、ヒト子宮頸由来ＨｅＬａ細胞を、直径１０ｃｍの組織培養ディッシュに１枚当り３．７５ｘ１０６個の細胞密度で播種し、翌日、無血清培地に交換した。更に翌日、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ディッシュ１枚当り５００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１％プロテアーゼインヒビターカクテル、１０ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド）を加えた。直ちにセルスクレイパーを用いて細胞を剥離し、回収した溶解液を氷上で３０分間静置した後、１７，５００ｇ、４℃にて３０分間遠心した。得られた細胞溶解液を試料とした。
【００７４】
図２（Ａ）に示されるように、細胞溶解液には、ユビキチンが結合したタンパク質の他、ユビキチンが結合しなかったタンパク質、及び遊離ユビキチン等の種々の物質が混在している。このような細胞溶解液を、変異ポリペプチドが固定化されたカラムを通過させることで、変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させた。以上は、接触手順の一例である。
【００７５】
カラムを洗浄することで、カラム中に残存する夾雑物を除去した後、変異ポリペプチドを担体から解離させ、溶出液を得た。得られた各溶出液に含有された物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分離した。分離後のタンパク質を、ゲルからＰＶＤＦ膜へと転写し、この膜を、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％「Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）」）に溶解した５％スキムミルク中で、室温にて２時間反応させた。膜をＴＢＳＴで洗浄し（１０分間、３回）、抗ユビキチンモノクローナル抗体（一次抗体）で室温にて一晩反応させた。その後、膜をＴＢＳＴで洗浄し（１０分間、３回）、一次抗体に対応したＨＲＰ標識二次抗体で、室温にて１時間反応させた。膜をＴＢＳＴで洗浄し（１０分間、３回）、「ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（商品名）」（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で反応させた後、Ｘ線フィルムに露光させた。この結果を、図２（Ｂ）に示す。
【００７６】
図２（Ｂ）に示されるように、ユビキチンの結合が認められた変異ポリペプチドは、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１〜６８番目、１〜４１番目、１２〜６８番目、１２〜４１番目のアミノ酸配列からなっていた。一方、２６〜６８番目、２６〜４１番目のアミノ酸からなる変異ポリペプチドへのユビキチンの結合は認められなかった。以上は、判定手順の一例である。
【００７７】
ユビキチンが結合する変異ポリペプチドから選別される最短のアミノ酸配列は、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１２〜４１番目のアミノ酸配列であった。以上は、選別手順の一例である。なお、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１２〜４１番目のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にシステインが付加された配列に等しい。
【００７８】
＜実施例２＞ ユビキチン化タンパク質の回収方法
次に、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質の１２〜４１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、化学的に合成した（図５において「ＷＴ」と表記する）。このポリペプチドを、担体であるセファロースレジン「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（商品名）」（アマシャムバイオサイエンス社製）に固定化し（捕捉手順）、実施例１と同様の手順でユビキチン化タンパク質との結合活性の有無を調べた。
【００７９】
なお、この実施例において、ポリペプチドの１６〜１８番目に位置する「ＥＤＥ」を、「ＡＡＡ」に置換した変異ポリペプチドを対照区（図５において「ＭＴ」と表記する）として使用した。この３つの酸性アミノ酸は、ユビキチンへの結合に極めて重要な役割を果たすことが既に報告されている（Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｏｌｏ Ｓ ，Ｓｉｇｉｓｍｕｎｄ Ｓ ，Ｆａｒｅｔｔａ Ｍ ，Ｇｕｉｄｉ Ｍ ，Ｃａｐｕａ ＭＲ ，Ｂｏｓｓｉ Ｇ ，Ｃｈｅｎ Ｈ ，Ｄｅ Ｃａｍｉｌｌｉ Ｐ ，Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ ＰＰ ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２ Ｍａｒ ２８；４１６（６８７９）：４５１−５．、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ． Ｍｉｌｌｅｒ ＳＬ ，Ｍａｌｏｔｋｙ Ｅ ，Ｏ’Ｂｒｙａｎ ＪＰ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００４；２７９（３２）：３３５２８−３７）。
【００８０】
この実験系において、ポリペプチドは、そのＮ末端に存在するシステイン分子を用い、ジスルフィド結合を介して「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ」に固定化されるため、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）等の還元剤で、レジンから溶出できる（図３参照）。従って、ポリペプチドにユビキチン化タンパク質との結合活性があれば、レジンに捕捉されたユビキチン化タンパク質を変性させることなく、タンパク質間相互作用を破壊しない穏和な条件で溶出できる（図４参照）。
【００８１】
ポリペプチドを固定化した「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ」を、実施例１で用いた細胞溶解液と混合した後、２−ＭＥを添加することで、ポリペプチドをレジンから溶出した（溶出手順）。この溶出液を用い、実施例１と同様の手順で、ユビキチンの存在を確認した。この結果を図５に示す。
【００８２】
図５に示されるように、ポリペプチド（ＷＴ）とともに溶出した画分には、幅広い分子量に亘るユビキチン化タンパク質の存在が確認された。一方、ユビキチンへの結合活性を失っていると予想される変異ポリペプチド（ＭＴ）とともに溶出した画分には、ユビキチン化タンパク質の存在が確認されなかった。従って、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質由来のポリペプチドは、化学的に合成しても、ユビキチン化タンパク質との結合活性を保持することが示された。
【００８３】
＜実施例３＞
実施例２で使用したポリペプチド固定化レジンを、４８番目のリジン残基を介して互いに結合されたオリゴユビキチン分子（図６において「Ｋ４８」と表記する）、又は６３番目のリジン残基を介して互いに結合されたオリゴユビキチン分子（図６において「Ｋ６３」と表記する）と混合した。オリゴユビキチン分子は、１〜７分子が結合された各々を用いた。その後、実施例２と同様の手順で、ユビキチン化タンパク質を溶出し、溶出画分におけるユビキチン（Ｕｂ）の存在を確認した。この結果を図６に示す。
【００８４】
図６に示されるように、ポリペプチド（ＷＴ）とともに溶出した画分には、Ｋ４８及びＫ６３のいずれの様式で結合したオリゴユビキチン分子も存在した。一方、ユビキチンへの結合活性を失っていると予想される変異ポリペプチド（ＭＴ）とともに溶出した画分には、Ｋ４８及びＫ６３のいずれの様式で結合したオリゴユビキチンの存在も確認されなかった。従って、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質由来のポリペプチドによれば、試料中に存在するあらゆる種類のユビキチン化タンパク質を回収できることが期待される。
【００８５】
また、ポリペプチド（ＷＴ）とともに溶出した画分には、モノユビキチン分子の存在を確認できなかった。従って、ヒトＡＳＢ２ａタンパク質由来のポリペプチドによれば、試料中に存在する遊離のユビキチンが結合しないので、回収物への夾雑物の混入を抑制できることも期待される。
【００８６】
＜実施例４＞
増殖因子の一つであるＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）は、その受容体であるＥＧＦＲ（ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合すると、ＥＧＦＲのリン酸化を引き金とした細胞内シグナル伝達の活性化を誘導する。それに伴って負の制御機構が同時に働き、間もなくＥＧＦＲはエンドサイトーシスで細胞内に取り込まれる。その機構に重要な役割を果たすのがＣｂｌであり、このＣｂｌは、ＥＧＦ刺激依存的にＥＧＦＲをモノユビキチン化するユビキチンリガーゼである。Ｃｂｌは、過剰なモノユビキチン化を抑えるために、別のユビキチンリガーゼであるＮｅｄｄ４により、Ｋ４８結合型でポリユビキチン化されることが既に報告されている。しかし、最近、ＥＧＦ刺激依存的なＥＧＦＲのユビキチン化には、モノユビキチン化のみならず、Ｋ６３結合型のポリユビキチン化も含まれることが明らかになってきた（図７参照）。このモデルについて、本発明のポリペプチドの適用を試みた。
【００８７】
まず、ヒト子宮頸由来ＨｅＬａ細胞を、直径１０ｃｍの組織培養ディッシュに１枚当り３．７５ｘ１０６個の細胞密度で播種し、翌日、無血清培地に交換した。更に翌日、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを５分間処理した後、実施例１と同様の手順で細胞溶解液（図８〜９において「＋」と表記する）を得た。一方、ＥＧＦ処理を行わない対照区として、実施例１で得た細胞溶解液（図８〜９において「−」と表記する）を使用した。各細胞溶解液を用い、実施例２と同様の手順で、ユビキチン（Ｕｂ）の存在を確認した。また、一次抗体として、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｃｂｌ抗体を用いた以外は、実施例２と同様の手順で、ＥＧＦＲ、Ｃｂｌの存在を確認した。この結果を併せて図８に示す。
【００８８】
図８上段に示されるように、ポリペプチド固定化レジンを用い、ポリペプチドとともに溶出した画分には、ＥＧＦ処理の有無に関わらず、幅広い分子量に亘る多様なユビキチン化タンパク質の存在が確認された。また、図８中段、下段に示されるように、ＥＧＦ処理を行った画分には、ＥＧＦＲ、Ｃｂｌの存在を示す、幅広い分子量に亘るバンドが検出された。以上をまとめると、この溶出画分には、Ｋ６３結合型のユビキチン化ＥＧＦＲ（図８中段のバンド）、Ｋ４８結合型のユビキチン化Ｃｂｌ（図８下段の上側バンド）、及びユビキチン化タンパク質に結合したＣｂｌ（図８下段の下側バンド）のすべてが存在することが明らかになった。
【００８９】
＜実施例５＞
続いて、実施例４で得た溶出画分から、抗ＥＧＦＲ抗体を用いて、ユビキチン化ＥＧＦＲを沈降させ、精製した。この精製物について、実施例４と同様の手順で、ユビキチン、ＥＧＦＲ、Ｃｂｌの存在を確認した。この結果を図９に示す。
【００９０】
図９上段及び中段に示されるように、精製物には、ユビキチン化ＥＧＦＲが存在していた。そして、図９下段に示されるように、この精製物には、Ｃｂｌの存在も確認された。以上から、ＥＧＦＲとＣｂｌとが結合した複合体が、その形態を保持したまま存在することが明らかになった。従って、本発明のポリペプチドを用いることで、ユビキチン化タンパク質及びその結合タンパク質を複合体の形態のまま回収できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の一実施例に係るスクリーニング方法で用いたユビキチン結合性タンパク質の一次構造を示す図である。
【図２】本発明の一実施例に係るスクリーニング方法で用いた変異ポリペプチドへのユビキチンの結合の有無を示す図である。
【図３】本発明の一実施例に係る回収方法の機構を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施例に係る回収方法の機構を示す模式図である。
【図５】本発明の一実施例に係る回収方法を通じて得られるユビキチン化タンパク質の存在を示す図である。
【図６】本発明の一実施例に係る回収方法を通じて得られるオリゴユビキチンの存在を示す図である。
【図７】本発明の一実施例に係る回収方法で用いられた実験系の模式図である。
【図８】本発明の一実施例に係る回収方法で得られるユビキチン化タンパク質及びその結合タンパク質の存在を示す図である。
【図９】本発明の一実施例に係る回収方法で得られるユビキチン化タンパク質及びその結合タンパク質の複合状態を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンへの結合能を有する以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ユビキチンへの結合能を有するポリペプチド
【請求項２】
担体に結合及び解離可能なタグを更に有する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記タグは、１以上のシステイン分子を有する請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ユビキチン化タンパク質の回収方法であって、
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させることで、前記ユビキチン化タンパク質を溶出する溶出手順と、を有する回収方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して前記担体に固定化され、
前記溶出手順は、還元剤を添加することで、前記ポリペプチドを前記担体から解離させる手順である請求項４記載の回収方法。
【請求項６】
ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法であって、
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させて得られる溶出液から、前記ユビキチン化タンパク質を回収する回収手順と、
前記ユビキチン化タンパク質とともに回収された前記結合タンパク質のアミノ酸配列を決定し、既知のアミノ酸配列と比較することで前記結合タンパク質を同定する同定手順と、を有する特定方法。
【請求項７】
前記回収手順は、前記ユビキチン化タンパク質に結合する抗体と、抗ユビキチン抗体とを用いて、前記ユビキチン化タンパク質を沈降させる手順である請求項６記載の特定方法。
【請求項８】
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント。
【請求項９】
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡ分子を有するベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１２】
ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列のスクリーニング方法であって、
ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するユビキチン結合性タンパク質の一部が削除された変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させる接触手順と、
前記変異ポリペプチドの各々へのユビキチンの結合を判定する判定手順と、
ユビキチンが結合すると判定された前記変異ポリペプチドから、最短のアミノ酸配列を選別する選別手順と、を有するスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記ユビキチン結合性タンパク質は、以下の式で示されるアミノ酸配列からなるユビキチン結合モチーフを有する請求項１２記載のスクリーニング方法。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸、Φは疎水性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【請求項１４】
前記ユビキチン結合性タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなるヒトＡＳＢ２ａである請求項１２又は１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
ユビキチンへの結合能を有する以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ユビキチンへの結合能を有するポリペプチド
【請求項２】
担体に結合及び解離可能なタグを更に有する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記タグは、１以上のシステイン分子を有する請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ユビキチン化タンパク質の回収方法であって、
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させることで、前記ユビキチン化タンパク質を溶出する溶出手順と、を有する回収方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して前記担体に固定化され、
前記溶出手順は、還元剤を添加することで、前記ポリペプチドを前記担体から解離させる手順である請求項４記載の回収方法。
【請求項６】
ユビキチン化タンパク質に結合する結合タンパク質の特定方法であって、
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドが固定化された担体を試料に接触させることで、前記試料に含まれるユビキチン化タンパク質を前記ポリペプチドに結合させる捕捉手順と、
前記ポリペプチドを前記担体から解離させて得られる溶出液から、前記ユビキチン化タンパク質を回収する回収手順と、
前記ユビキチン化タンパク質とともに回収された前記結合タンパク質のアミノ酸配列を決定し、既知のアミノ酸配列と比較することで前記結合タンパク質を同定する同定手順と、を有する特定方法。
【請求項７】
前記回収手順は、前記ユビキチン化タンパク質に結合する抗体と、抗ユビキチン抗体とを用いて、前記ユビキチン化タンパク質を沈降させる手順である請求項６記載の特定方法。
【請求項８】
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント。
【請求項９】
請求項１から３いずれか記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡ分子を有するベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１２】
ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列のスクリーニング方法であって、
ユビキチンへの結合に必要なアミノ酸配列を有するユビキチン結合性タンパク質の一部が削除された変異ポリペプチドの各々を、ユビキチンに接触させる接触手順と、
前記変異ポリペプチドの各々へのユビキチンの結合を判定する判定手順と、
ユビキチンが結合すると判定された前記変異ポリペプチドから、最短のアミノ酸配列を選別する選別手順と、を有するスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記ユビキチン結合性タンパク質は、以下の式で示されるアミノ酸配列からなるユビキチン結合モチーフを有する請求項１２記載のスクリーニング方法。
ＸｅｅｅＸΦＸＸＡＸＸＸＳＸＸｅ
（式中、ｅは酸性アミノ酸、Φは疎水性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
【請求項１４】
前記ユビキチン結合性タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなるヒトＡＳＢ２ａである請求項１２又は１３記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−１９９９６７（Ｐ２００８−１９９９６７Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４０２３９（Ｐ２００７−４０２３９）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
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