ポリペプチドレパートリーから可逆的にアンフォールドするポリペプチドを回収するための方法
本発明は、可逆的にアンフォールドする（例えば、加熱されるとアンフォールドし、冷却されるとリフォールドする）ポリペプチド、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含むレパートリーおよび可逆的にアンフォールドするポリペプチドまたは可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸を含むライブラリーに関する。本発明はさらに、可逆的にアンフォールドするポリペプチドまたは可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸が富化されたライブラリーを製造する方法、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを選択および／または単離する方法、および可逆的にアンフォールドするポリペプチドを製造する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドのレパートリーから可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法であって、可逆的にアンフォールドするレパートリー中のポリペプチドが、フォールドしたポリペプチドとアンフォールドまたはミスフォールドしたポリペプチドとを区別する共有の選択可能特徴を有し、
ディスプレイされるポリペプチドのレパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
該ディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部をアンフォードする工程；
アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部をリフォールドする工程；および
リフォールドした部分から、可逆的にアンフォールドし、かつ該選択可能特徴を有する少なくとも１つのポリペプチドを回収する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記アンフォールドが、温度Tsに加熱することにより達成され、前記リフォールドが温度Tcに冷却することにより達成され、前記回収が温度Trで行われ、回収されたポリペプチドが融点Tmを有し、ここでTs＞Tm＞TcかつTs＞Tm＞Trである請求項１記載の方法。
【請求項３】
加熱および冷却の後、ポリペプチドディスプレイシステムが、アンフォールドおよびリフォールドしたポリペプチドの部分ならびに凝集したポリペプチドの部分を少なくとも含有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
可逆的にアンフォールドする回収されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドシステムがライブラリーを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドシステムが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイおよび共有結合ディスプレイからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイである請求項１記載の方法。
【請求項８】
アンフォールドが、ポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させること、ポリペプチドディスプレイシステムの圧力を調整すること、ポリペプチドディスプレイシステムのpHを調整すること、ポリペプチドディスプレイ中のカオトロピック薬剤の濃度を増大すること、および／またはポリペプチドディスプレイシステム中の有機溶媒の濃度を増大させることにより達成される請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドされる請求項１記載の方法。
【請求項１０】
アンフォールドが、少なくとも約50％のディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドするアンフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させることにより達成され、リフォールドが、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部がリフォールドするリフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を減少させることにより達成される請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドディスプレイシステムが、実質的に全てのディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドされるアンフォールド温度に加熱される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記アンフォールド温度およびリフォールド温度が少なくとも１０℃異なる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記共通の選択可能特徴が、リガンドへの結合、触媒活性およびタンパク質分解に対する耐性からなる群より選ばれる選択可能な機能的特徴である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記選択可能な機能的特徴が一般リガンドへの結合である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記共通の選択可能特徴が、フォールドされた場合のディスプレイされるポリペプチド上に存在するが、ミスフォールドまたはアンフォールドしたポリペプチドには存在しないエピトープである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
各々のディスプレイされるポリペプチドが抗体可変ドメインを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記可変ドメインが、生殖細胞系配列によってコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のアミノ酸を含まない請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸配列、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
各々のディスプレイされるポリペプチドが、FR1、FR2およびFR3領域を含有する抗体可変ドメインを含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが、標的リガンドに結合することにより回収される請求項１記載の方法。
【請求項２４】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが一般リガンドに結合することにより回収される請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドディスプレイシステムが、バクテリオファージディスプレイであり、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが、伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収することにより回収される請求項１記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドディスプレイシステムが、各々のディスプレイされるポリペプチドが抗体可変ドメインを含む多価バクテリオファージシステムであり、
アンフォールドが、約80℃のアンフォールド温度に多価バクテリオファージシステムの温度を増大させることにより達成され；
リフォールドが、該アンフォールド温度よりも約10℃低いリフォールド温度に該多価バクテリオファージシステムの温度を減少させることにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドのレパートリーからリガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法であって、
該レパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
少なくとも一部のディスプレイポリペプチドがアンフォールドする温度(Ts)にレパートリーを加熱する工程；
Tsよりも低い温度(Tc)にレパートリーを冷却する工程、ここで冷却されたレパートリーは、アンフォールドしたポリペプチドの部分および凝集したポリペプチドの少なくの部分を少なくとも含む；および
リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを温度(Tr)で回収する工程、ここでリガンドは、フォールドしたポリペプチドに結合し、凝集したポリペプチドに結合せず、回収したポリペプチドは融点(Tm)を有し、Ts＞Tm＞Tc、およびTs＞Tm＞Trである、
を含む、方法。
【請求項２８】
回収されたポリペプチドがリガンドに結合することを確認する工程をさらに含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記リガンドが一般リガンドまたは標的リガンドである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Tm＜Tsであることを確認する工程をさらに含む請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
Tm＞37℃である請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
TcがTrと実質的に同一である請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドディスプレイシステムが複数の複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがファージディスプレイシステムである請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
前記ファージディスプレイシステムが多価ファージディスプレイシステムである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
冷却されたレパートリーの凝集した少なくともポリペプチドの部分が、ファー時間凝集物を形成する請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
冷却されたレパートリーの凝集したポリペプチドが、ファージ間凝集物およびファージ内凝集物を形成する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記レパートリーが少なくとも約103個のメンバーを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドのレパートリーから、リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法であって、該方法が：
前記レパートリーを含むポリペプチドディプレイシステムを提供する工程、ここで該レパートリーが、ディプレイされるポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドする温度(Ts)に加熱されており、およびTsよりも低い温度(Tc)に冷却されており、冷却されたレパートリーが、アンフォールドおよびリフォールドしたポリペプチドの部分および凝集したポリペプチドの部分を少なくとも含む；および
リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを温度(Tr)で回収する工程、ここでリガンドはフォールドしたポリペプチドに結合し、凝集したポリペプチドには結合せず、回収したポリペプチドは融点(Tm)を有し、Ts＞Tm＞Tc、およびTs＞Tm＞Trである、方法。
【請求項４０】
リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたレパートリーを製造する方法であって、該方法が：
リガンドに結合するポリペプチドのレパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
ディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドする温度(Ts)にレパートリーを加熱する工程；および
Tsよりも低い温度である温度(Tc)にレパートリーを冷却する工程、ここで冷却したレパートリーは、アンフォールドおよびリフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部ならびに凝集したポリペプチドの部分を含有し、それによりリガンドに結合し、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたレパートリーが製造される、方法。
【請求項４１】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製する方法であって、
(a)親ポリペプチドの１つ以上の変異体を提供する工程、ここで親ポリペプチドは、フォールド親ポリペプチドとアンフォールドまたはミスフォールド親ポリペプチドとを区別する選択可能特徴を有し、該変異体は、１つ以上のアミノ酸残基残基が置換された親ポリペプチドのアミノ酸配列を含む；
(b)該１つ以上の変異体をアンフォールドし、次いでリフォールドする工程；
(c)親ポリペプチドの選択可能特徴を保有する１つ以上のリフォールド変異体ポリペプチドを選択すること
(d)(c)において選択された１つ以上のリフォールドした変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、親アミノ酸配列の対応する残基と同一でないリフォールド変異体のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；および
(e)(d)において同定されたアミノ酸残基で少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された該親ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドされる請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
変異体ポリペプチドが、変異体ポリペプチドの融点(Tm)よりも高い温度に加熱することによりアンフォールドし、冷却によりリフォールドする請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記親ポリペプチドが抗体可変ドメインである請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
熱凝集に耐性である可変ドメインが富化された抗体可変ドメインライブラリーを製造する方法であって、
(a)複数のディスプレイされる抗体可変ドメインを含むファージディスプレイシステムを提供する工程、ここでディスプレイされる可変ドメインの少なくとも一部がアンフォールドおよびリフォールドされている；
(b)該ファージディスプレイシステムからアンフォールド、リフォールドおよび回復した結合機能を有する可変領域をディスプレイする少なくとも１つのファージを選択する工程；
(C)(b)で選択されたファージにおいてディスプレイされる可変ドメインのCDR1および任意にCDR2をコードする核酸を得る工程；
(d)抗体可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを調製する工程、ここで(c)で得られた該核酸が少なくとも１つの他の核酸と作動可能に連結され、CD1および任意にCDR2が(c)で得られた核酸によりコードされる抗体可変ドメインをコードする核酸構築物のライブラリーを製造される、
を含む、方法。
【請求項４６】
(a)のディスプレイされる可変領域の実質的に全てが約80℃に加熱することによりアンフォールドしており、冷却によりリフォールドしている請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
(d)で構築された核酸のライブラリーが、CDR3がランダム化されているか、または加熱の際に可逆的にアンフォールドする能力について選択された抗体可変領域に由来しない抗体可変ドメインをコードする請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
親ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する工程；
疎水性である該アミノ酸配列の領域を同定する工程；
同定された疎水性領域を選択する工程；
選択された疎水性領域の１つ以上のアミノ酸を置換し、領域の疎水性が減少している可変アミノ酸配列を生成する工程；および
該変異体アミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを生成する工程
を含む、可逆的にアンフォールドした変異体ポリペプチドを調製する方法。
【請求項４９】
変異体ポリペプチドのアンフォールドおよびリフォールドを評価する工程をさらに含む請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
変異体ポリペプチドが、変異体ポリペプチドの融点(Tm)よりも高い温度に変異体ポリペプチドを加熱することによりアンフォールドし、冷却によりリフォールドする請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記疎水性領域が、親アミノ酸配列に対してSweet-Eisenberg疎水性スコアを用いることにより同定される請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
親VHドメインのアミノ酸配列を提供する工程；
該親VHのH1ループの１つ以上のアミノ酸を置換し、H1ループのSweet-Eisenberg(S/E)疎水性スコアが、親VHのH1ループと比べて減少している変異体VHを生成する工程、ここで該H1ループは、AbMアミノ酸ナンバリングシステムにより規定されるものである；または
該親VHのアミノ酸配列の22位〜36位の１つ以上のアミノ酸を置換し、22位〜36位のアミノ酸に関するS/E疎水性スコアが、親VHの22位〜36位の配列に関するS/Eスコアと比べて減少している変異体VHを生成する工程、ここで22〜36位は、Kabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている；および
該変異体VHを含有する変異体ポリペプチドを生成する工程、
を含む、可逆的にアンフォールドする変異体抗体重鎖可変ドメイン(VH)を含有するポリペプチドを調製する方法。
【請求項５３】
変異体VHのアンフォールディングおよびリフォールディングを評価する工程をさらに含む請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドする請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
変異体VHが、変異体VHの融点(Tm)よりも高い温度にかねつすることによりアンフォールドする請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
前記親VHがヒトVHである請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
前記変異体VHが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
前記変異体VHの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含み、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
前記可変VHドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
前記可変VHのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、またはFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
変異体VHが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP47生殖細胞系VH遺伝子セグメントを含む請求項５８〜６１いずれか記載の方法。
【請求項６３】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP45、DP46、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68およびDP69からなる群より選ばれるVH遺伝子セグメントを含む請求項５８〜６１いずれか記載の方法。
【請求項６４】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系JH遺伝子セグメントをさらに含む請求項６２または請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
親VLのアミノ酸配列を提供する工程；
該親VLのFR2-CDR2の１つ以上のアミノ酸を置換し、FR2-CDR2領域に関するSweet/Eisenberg疎水性スコア(S/Eスコア)が、親VLドメインの対応する領域と比べて減少している変異体VLを生成する工程；または
該親VLのFR3の１つ以上のアミノ酸を置換し、FR3に関するS/Eスコアが親VLドメインの対応する領域と比べて減少している変異体VLを生成する工程；または
該親VLのアミノ酸配列の44位〜53位の１つ以上のアミノ酸を置換して、44位〜53位のアミノ酸配列に関するS/Eスコアが、親VLドメインの対応する部分に関するS/Eスコアと比べて減少している変異体VLを生成する工程；または
該親VLのアミノ酸配列の73位から76位の１つ以上のアミノ酸配列を置換して、73位〜76位のアミノ酸配列に関するS/Eスコアが親VLドメインの対応する部分に関するS/Eスコアと比べて減少している変異体VLを生成する工程；および
該変異体VLを含む変異体ポリペプチドを生成する工程、
を含み、FR2-CDR2領域、FR3、44〜53位および73〜76位がKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、可逆的にアンフォールドする変異体抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含むポリペプチドを調製する方法。
【請求項６６】
変異体VLのアンフォールドおよびリフォールドを評価する工程をさらに含む請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドされる請求項１記載の方法。
【請求項６８】
変異体VLが、変異体VLの融点(Tm)よりも高い温度に加熱することによりアンフォールドし、冷却によりリフォールドする請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
前記親VLがヒトVLである請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
前記変異体VLが生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項６５記載の方法。
【請求項７１】
前記変異体VLの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含み、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記可変VLドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
前記可変VLのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、またはFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
変異体VLが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26およびDPK28からなる群より選ばれるVL遺伝子セグメントを含む請求項７１〜７４いずれか記載の方法。
【請求項７６】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JK1、JK2、JK3、JK4、JK4b、およびJK5からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系JK遺伝子セグメントをさらに含む請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
該ディスプレイされるポリペプチドをアンフォールドする工程；
該ポリペプチドの少なくとも一部をリフォールドする工程；および
可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションを該一部から回収する工程、
を含む、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたライブラリーを製造する方法であって、可逆的にアンフォールドする該ポリペプチドが、フォールドしたポリペプチドとアンフォールドまたはミスフォールドしたポリペプチドとを区別する共通の選択可能特徴を有する、方法。
【請求項７８】
該ポリペプチドディスプレイシステムが、核酸のコードする機能を、それがコードするポリペプチドの物理、化学および／または機能的特徴に関連付ける請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリペプチドシステムが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイおよび共有結合ディスプレイからなる群より選ばれる請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイである請求項７７記載の方法。
【請求項８１】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドする請求項７７記載の方法。
【請求項８２】
アンフォールドが、ポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させること、ポリペプチドディスプレイシステムの圧力を調整すること、ポリペプチドディスプレイシステムのpHを調整すること、ポリペプチドディスプレイ中のカオトロピック薬剤の濃度を増大すること、および／またはポリペプチドディスプレイシステム中の有機溶媒の濃度を増大させることにより達成される請求項７７記載の方法。
【請求項８３】
アンフォールドが、少なくとも約50％のディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドするアンフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させることにより達成され、リフォールドが、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部がリフォールドするリフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を減少させることにより達成される請求項７７記載の方法。
【請求項８４】
ポリペプチドディスプレイシステムが、実質的に全てのディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドされるアンフォールド温度に加熱される請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
アンフォールド温度および該リフォールド温度が少なくとも約10℃異なる請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイであり、可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションが、伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収することにより回収される請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
前記共通の選択可能特徴が、リガンドへの結合、触媒活性およびタンパク質分解に対する耐性からなる群より選ばれる選択可能な機能的特徴である請求項１記載の方法。
【請求項８８】
前記抗可変ドメインがヒト抗体可変ドメインを含む請求項７７記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
抗体可変ドメインが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項７７記載の方法。
【請求項９１】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションが標的リガンドへの結合により回収される請求項７７記載の方法。
【請求項９２】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションが、一般リガンドへの結合により回収される請求項７７記載の方法。
【請求項９３】
ポリペプチドディスプレイシステムが、各々のディスプレイされるポリペプチドが抗体可変ドメインを含む多価バクテリオファージシステムであり、
アンフォールドが、約80℃のアンフォールド温度に多価バクテリオファージシステムの温度を増大させることにより達成され；
リフォールドが、該アンフォールド温度よりも約10℃低いリフォールド温度に該多価バクテリオファージシステムの温度を減少させることにより達成される、請求項７７記載の方法。
【請求項９４】
免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインが標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度に加熱されると可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない、単離されたポリペプチド。
【請求項９５】
前記適切なアンフォールド温度が、免疫グロブリン可変ドメインの融点(Tm)よりも高い請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９６】
前記適切なアンフォールド温度が約80℃である請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９７】
前記可変ドメインがヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)である請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９８】
前記可変ドメインがヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９９】
標的リガンドがヒト抗原またはエピトープである請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１００】
前記ポリペプチドが抗体の形式である請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０１】
前記ポリペプチドが単一のVHからなる請求項１００記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０２】
前記可変ドメインが、約50nM〜約20pMの解離定数(Kd)および約5×10−1s-1〜約1×10−7s-1のKoffを有する前記標的リガンドに結合する請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０３】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０４】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも約１mg/L〜少なくとも約1g/mLの量で分泌される請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０５】
可逆的にアンフォールドする変異体免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VHが親VHのアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、ここでH1ループの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Sweet/Eisenberg(S/E)疎水性スコアが親VHのH1ループと比べて減少しているように置換されている、ここで該H1ループはAbMアミノ酸ナンバリングシステムによって規定されているものである；または
該変異体VHが、親VHのアミノ酸配列を含み、ここで22位〜36位の少なくとも１つのアミノ酸残基のS/Eスコアが、親VHの22位〜36位の配列に関するS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている、ここで23〜36位はKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１０６】
変異体VHのH1ループのS/Eスコアが０以下であるか、または該変異体Hの位置22〜位置36のアミノ酸配列が０以下である請求項１０５記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０７】
可逆的にアンフォールドする可変免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VHが、H1ループの少なくとも１つのアミノ酸残基がProまたはGly残基と置換されている親VHのアミノ酸配列を含み、該H1ループはAbMアミノ酸ナンバリングシステムによって規定されている；または
該変異体VHが、22位〜36位の少なくとも１つアミノ酸残基がProまたはGly残基で置換されている親VHのアミノ酸配列を含み、該位置が、Kabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１０８】
前記変異体VHが、その融点(Tm)よりも高い温度に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０９】
前記変異体VHが約80℃に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１０】
前記変異体VHが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１１】
親VHがヒトVHである請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１２】
前記単離されたポリペプチドが抗体の形式である請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１３】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸配列、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１０５から１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１４】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１０５〜１０７いずれか記載の方法。
【請求項１１５】
前記変異体VHのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１０５〜１０７いずれか記載の方法。
【請求項１１６】
変異体VHが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１０５〜１０７いずれか記載の方法。
【請求項１１７】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP47生殖細胞系VH遺伝子セグメントを含む請求項１１３〜１１６いずれか記載の方法。
【請求項１１８】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP45、DP46、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68およびDP69からなる群より選ばれるVH遺伝子セグメントを含む請求項１１３〜１１６いずれか記載の方法。
【請求項１１９】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系JH遺伝子セグメントをさらに含む請求項１１７または請求項１１８記載の方法。
【請求項１２０】
可逆的にアンフォールドする変異体免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VLが親VLのアミノ酸配列を含み、ここでFR2-CDR2領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が、FR2-CDR2領域のSweet/Eisenberg疎水性スコア(S/Eスコア)が親VLのFR2-CDR2領域のS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている；
該変異体VLが親VLのアミノ酸配列を含み、ここで44位〜53位の少なくとも１つのアミノ酸残基が、S/Eスコアが親VLの44位〜53位のアミノ酸配列のS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている；および／または
該変異体VLが親VLのアミノ酸配列を含み、ここで73位〜76位の少なくとも１つのアミノ酸残基が、S/Eスコアが親VLの73位〜76位のアミノ酸配列のS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている；
ここでFR2-CDR2領域、FR3，44〜53位および73〜76位はKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１２１】
前記VLのFR2-CDR2領域のS/Eスコアが0.23以下であり；
前記VLのFR3のS/Eスコアが0.35以下であり；
前記変異体VLの44位〜53位のアミノ酸配列のS/Eスコアが0.23以下であり；および／または
前記VLの44位〜53位のアミノ酸配列のS/Eスコアが0.23以下であり；および／または
前記VLの73位〜76位のアミノ酸配列が0.35以下である、
請求項１２０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２２】
可逆的にアンフォールドする変異体免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメイン(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VLが、FR3の少なくとも１つのアミノ酸残基がProまたはGly残基で置換されている親VLのアミノ酸配列を含み；および／または
該変異体VLが、44位〜53位の少なくとも１つのアミノ酸残基がProまたはGly残基で置換されている、
ここで、FR3および44位〜53位がKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１２３】
前記変異体VLが、その融点(Tm)よりも高い温度に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２４】
前記変異体VHが約80℃に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２５】
前記単離されたポリペプチドが抗体の形式である請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２６】
前記変異体VLの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２７】
前記変異体VLの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２８】
前記変異体VLのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２９】
変異体VLドメインが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３０】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26およびDPK28からなる群より選ばれるVL遺伝子セグメントを含む請求項１２６〜１２９いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３１】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JκセグメントJκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4およびJκ5からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系Jκ遺伝子セグメントをさらに含む請求項１３０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３２】
前記レパートリーの少なくとも約10％のポリペプチドが可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるポリペプチドのレパートリー。
【請求項１３３】
ポリペプチドが抗体可変ドメインを含む請求項１３２記載のレパートリー。
【請求項１３４】
前記抗体可変ドメインが抗原結合部位を含む請求項１３３記載のレパートリー。
【請求項１３５】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである請求項１３３記載のレパートリー。
【請求項１３６】
前記可変ドメインが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項１３３記載のレパートリー。
【請求項１３７】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸配列、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１３８】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１３９】
前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１４０】
各々のディスプレイされるポリペプチドが、FR1、FR2およびFR3領域を含有する抗体可変ドメインを含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１４１】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが、フォールドした場合、共通の選択可能特徴を有し、該共通の選択可能特徴がアンフォールドまたはミスフォールドしたポリペプチドには存在しない請求項１３２記載のレパートリー。
【請求項１４２】
前記選択可能な機能的特徴が、リガンドへの結合、触媒活性およびタンパク質分解に対する耐性からなる群より選ばれる選択可能な機能的特徴である請求項１４１記載のレパートリー。
【請求項１４３】
前記ポリペプチドが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイおよび共有結合ディスプレイからなる群より選ばれるポリペプチドディスプレイにおいてディスプレイされる請求項１３２記載のレパートリー。
【請求項１４４】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸のライブラリーであって、ライブラリーの各々のメンバーが、少なくとも１つのアミノ酸残基がフォールディングゲートキーパー残基で置換され、少なくとも１つの他のアミノ酸残基が置換、付加または欠失されている親ポリペプチドのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする、ライブラリー。
【請求項１４５】
前記親ポリペプチドが抗体可変ドメインである請求項１４４記載のライブラリー。
【請求項１４６】
前記抗体可変ドメインがヒトVHである請求項１４５記載のライブラリー。
【請求項１４７】
前記フォールディングゲートキーパー残基がCDR1に存在する請求項１４６記載のライブラリー。
【請求項１４８】
前記抗体可変ドメインがヒトVLである請求項１４５記載のライブラリー。
【請求項１４９】
可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインをコードする核酸のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーが可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインのCDR1をコードする、ライブラリー。
【請求項１５０】
ライブラリーの各メンバーが可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインのCDR2をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１４９記載のライブラリー。
【請求項１５１】
ライブラリーのメンバーが、CDR3が多様化または無作為化されている抗体可変ドメインをコードする請求項１４９記載のライブラリー。
【請求項１５２】
ライブラリーがヒト抗体重鎖可変ドメイン(VH)をコードする請求項１４９記載のライブラリー。
【請求項１５３】
請求項４８〜７６いずれか記載の方法に従って製造される可逆的にアンフォールドする単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、大腸菌で産生される場合、分泌可能であり、但し、ポリペプチドはラクダ抗体可変ドメインではない、単離されたポリペプチド。
【請求項１５４】
可逆的にアンフォールドする単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが請求項１〜３９いずれか記載の方法により選択可能であり、該ポリペプチド大腸菌において産生される場合、選択可能であり、但し、ポリペプチドはラクダ抗体可変ドメインではない、単離されたポリペプチド。
【請求項１５５】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１５６】
請求項４１〜４７および７７〜９３いずれか記載の方法により製造される可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたライブラリー。
【請求項１５７】
前記ライブラリーが、可逆的にアンフォールドする前記ポリペプチドをコードする異種核酸のコレクションを含む請求項１５６記載のライブラリー。
【請求項１５８】
請求項４０および１３２〜１４３いずれか記載のポリペプチドのレパートリーをコードする核酸のライブラリー。
【請求項１５９】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項１６０】
前記ポリペプチドが約５重量％〜約99重量％の範囲で存在する請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６１】
前記組成物が溶液である請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６２】
前記組成物が医薬組成物である請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６３】
前記組成物が生物学的粉末洗剤である請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６４】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項１６５】
前記可逆的にアンフォールドする噴霧乾燥ポリペプチドが、再水和された場合、その活性の約20％以下を喪失する請求項１６４記載の組成物。
【請求項１６６】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる密封包装。
【請求項１６７】
無菌器具をさらに含有してなる請求項１６６記載の密封包装。
【請求項１６８】
前記無菌器具が医学的器具である請求項１６７記載の密封無菌包装。
【請求項１６９】
前記医学的器具が外科器具である請求項１６８記載の密封無菌包装。
【請求項１７０】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる、被験体への可逆的にアンフォールドするポリペプチドの投与に使用するためのキット。
【請求項１７１】
前記ポリペプチドが噴霧乾燥されている請求項１７０記載のキット。
【請求項１７２】
前記薬物送達装置が、注射器、吸入器、鼻内投与装置、眼投与装置および無針注射装置からなる群より選ばれる請求項１７１記載のキット。
【請求項１７３】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患または障害を有する被験体を治療または診断する方法。
【請求項１７４】
治療または診断における請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドの使用。
【請求項１７５】
診断を治療するための医薬の製造のための請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドの使用。
【請求項１７６】
治療または診断において使用するための請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチド。
【請求項１７７】
サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質により媒介される疾患または医学的状態の治療および／または予防および／または抑制のための医薬の製造のための請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチド。
【請求項１７８】
サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質を標的化するため、該サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質により媒介される疾患または医学的状態を治療および／または予防および／または抑制するための免疫グロブリン可変ドメインを含有する請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチド。
【請求項１７９】
疾患または医学的状態が、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、および自己免疫疾患からなる群より選ばれる請求項１７６〜１７８いずれか記載のポリペプチド。
【請求項１８０】
疾患または医学的状態が、喘息、乾癬、I型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、重症筋無力症、白血病または固形腫瘍からなる群より選ばれる請求項１７９記載のポリペプチド。
【請求項１８１】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞であって、該組換え核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞。
【請求項１８２】
前記組換え核酸の発現に適した条件下で請求項１８１記載の宿主細胞を維持する工程を含み、それにより前記組換え核酸が発現され、前記可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、可逆的にアンフォールドするポリペプチドの製造方法。
【請求項１８３】
可逆的にリフォールドするポリペプチドを選択するための請求項４０、１４４〜１４８および１５６〜１５８いずれか記載のライブラリーまたはレパートリーの使用。
【請求項１８４】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインを含む請求項１８３記載の使用。
【請求項１８５】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが抗体の形式を含む請求項１８３記載の使用。
【請求項１８６】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーを提供する工程、ここで該ライブラリーのディスプレイされるポリペプチドの一部がアンフォールドおよびリフォールドされている；
宿主細胞とバクテリオファージディスプレイライブラリーとをせっしょくさせ、感染宿主細胞を生成する工程；および
感染宿主細胞から伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それにより可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーが製造される、
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーの製造方法。
【請求項１８７】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーを提供する工程；
該ライブラリーのディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部をアンフォールドし、次いでリフォールドする工程；
得られたアンフォールドおよびリフォールドしたディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーと宿主細胞を接触させて感染祝細胞を生成する工程；および
感染祝細胞から伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それにより、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーが製造される、
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーの製造方法。
【請求項１８８】
前記ディスプレイされるポリペプチドが加熱によりアンフォールドされ、冷却によりリフォールドされているか、またはされる請求項１８６または１８７記載の方法。
【請求項１８９】
前記バクテリオファージディスプレイライブラリーが多価バクテリオファージfdディスプレイライブラリーであり、前記適切な宿主細胞が大腸菌である請求項１８６または１８７記載の方法。
【請求項１９０】
請求項１８６〜１８９いずれか記載の方法により製造されるバクテリオファージディスプレイライブラリー。
【請求項１９１】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディプレイライブラリーを提供する工程、ここで該ライブラリーのディプレイされるポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドおよびリフォールドされている；
宿主細胞と該バクテリオファージディスプレイライブラリーとを接触させて、感染宿主細胞を生成する工程；および
感染宿主細胞から少なくとも１つの伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それによって可逆的にアンフォールドするポリペプチドが回収される、
を含む、バクテリオファージディスプレイライブラリーから可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法。
【請求項１９２】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディプレイライブラリーを提供する工程；
該ライブラリーのディプレイされるポリペプチドの少なくとも一部をアンフォールドさせ、次いでリフォールドさせる工程；
得られるバクテリオファージディスプレイライブラリーと宿主細胞とを接触させて感染宿主細胞を生成する工程；および
感染宿主細胞から少なくとも１つの伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それによって可逆的にアンフォールドするポリペプチドが回収される、
を含む、バクテリオファージディスプレイライブラリーから可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法。
【請求項１９３】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーを提供する工程、ここで該ライブラリーのディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部が、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部が凝集する条件下でアンフォールドおよびリフォールドしている、
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されているバクテリオファージディスプレイシステム。
【請求項１９４】
上記凝集したバクテリオファージが、適切な宿主細菌を遠心分離することにより、または適切な宿主細胞を感染させることにより回収される請求項１９３記載の方法。
【請求項１９５】
(a)請求項４記載の方法により決定された可逆的にアンフォールドするポリペプチドのアミノ酸配列、(b)それに同一なアミノ酸配列、および(c)１〜約１０個のアミノ酸の置換、欠失または挿入によりそれとは異なるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を提供する工程；および
該アミノ酸配列を含むポリペプチドを合成する工程または該アミノ酸配列をコードする核酸を発現させる工程、それによって可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、
を含む、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを製造する方法。
【請求項１９６】
合成したポリペプチドが可逆的にアンフォールドすることを確認する工程をさらに含む請求項１９５記載の方法。
【請求項１９７】
前記ポリペプチドが加熱の際に可逆的にアンフォールドする請求項１９５記載の方法。
【請求項１９８】
免疫グロブリン可変(V)ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該VドメインがCDR2のシステインとCDR3のシステインとの間にジスルフィド結合を含み、CDR2およびCDR3がKabatアミノ酸ナンバリングシステムを用いて規定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１９９】
前記ジスルフィド結合が52a位のシステイン残基と98位との間；51位と98位との間；または51位と100b位との間にあり、該位置がKabatアミノ酸ナンバリングシステムを用いて規定される請求項１９８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２００】
前記ジスルフィド結合が、51位のシステインとCDR3のシステインとの間；またはCDR2のシステインと98位のシステインとの間にあり、CDR2、CDR3および該位置がKabatアミノ酸ナンバリングシステムを用いて規定される請求項１９８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１】
ポリペプチドのレパートリーから可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法であって、可逆的にアンフォールドするレパートリー中のポリペプチドが、フォールドしたポリペプチドとアンフォールドまたはミスフォールドしたポリペプチドとを区別する共有の選択可能特徴を有し、
ディスプレイされるポリペプチドのレパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
該ディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部をアンフォードする工程；
アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部をリフォールドする工程；および
リフォールドした部分から、可逆的にアンフォールドし、かつ該選択可能特徴を有する少なくとも１つのポリペプチドを回収する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記アンフォールドが、温度Tsに加熱することにより達成され、前記リフォールドが温度Tcに冷却することにより達成され、前記回収が温度Trで行われ、回収されたポリペプチドが融点Tmを有し、ここでTs＞Tm＞TcかつTs＞Tm＞Trである請求項１記載の方法。
【請求項３】
加熱および冷却の後、ポリペプチドディスプレイシステムが、アンフォールドおよびリフォールドしたポリペプチドの部分ならびに凝集したポリペプチドの部分を少なくとも含有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
可逆的にアンフォールドする回収されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドシステムがライブラリーを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドシステムが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイおよび共有結合ディスプレイからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイである請求項１記載の方法。
【請求項８】
アンフォールドが、ポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させること、ポリペプチドディスプレイシステムの圧力を調整すること、ポリペプチドディスプレイシステムのpHを調整すること、ポリペプチドディスプレイ中のカオトロピック薬剤の濃度を増大すること、および／またはポリペプチドディスプレイシステム中の有機溶媒の濃度を増大させることにより達成される請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドされる請求項１記載の方法。
【請求項１０】
アンフォールドが、少なくとも約50％のディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドするアンフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させることにより達成され、リフォールドが、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部がリフォールドするリフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を減少させることにより達成される請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドディスプレイシステムが、実質的に全てのディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドされるアンフォールド温度に加熱される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記アンフォールド温度およびリフォールド温度が少なくとも１０℃異なる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記共通の選択可能特徴が、リガンドへの結合、触媒活性およびタンパク質分解に対する耐性からなる群より選ばれる選択可能な機能的特徴である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記選択可能な機能的特徴が一般リガンドへの結合である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記共通の選択可能特徴が、フォールドされた場合のディスプレイされるポリペプチド上に存在するが、ミスフォールドまたはアンフォールドしたポリペプチドには存在しないエピトープである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
各々のディスプレイされるポリペプチドが抗体可変ドメインを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記可変ドメインが、生殖細胞系配列によってコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のアミノ酸を含まない請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸配列、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
各々のディスプレイされるポリペプチドが、FR1、FR2およびFR3領域を含有する抗体可変ドメインを含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが、標的リガンドに結合することにより回収される請求項１記載の方法。
【請求項２４】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが一般リガンドに結合することにより回収される請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドディスプレイシステムが、バクテリオファージディスプレイであり、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが、伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収することにより回収される請求項１記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドディスプレイシステムが、各々のディスプレイされるポリペプチドが抗体可変ドメインを含む多価バクテリオファージシステムであり、
アンフォールドが、約80℃のアンフォールド温度に多価バクテリオファージシステムの温度を増大させることにより達成され；
リフォールドが、該アンフォールド温度よりも約10℃低いリフォールド温度に該多価バクテリオファージシステムの温度を減少させることにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドのレパートリーからリガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法であって、
該レパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
少なくとも一部のディスプレイポリペプチドがアンフォールドする温度(Ts)にレパートリーを加熱する工程；
Tsよりも低い温度(Tc)にレパートリーを冷却する工程、ここで冷却されたレパートリーは、アンフォールドしたポリペプチドの部分および凝集したポリペプチドの少なくの部分を少なくとも含む；および
リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを温度(Tr)で回収する工程、ここでリガンドは、フォールドしたポリペプチドに結合し、凝集したポリペプチドに結合せず、回収したポリペプチドは融点(Tm)を有し、Ts＞Tm＞Tc、およびTs＞Tm＞Trである、
を含む、方法。
【請求項２８】
回収されたポリペプチドがリガンドに結合することを確認する工程をさらに含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記リガンドが一般リガンドまたは標的リガンドである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Tm＜Tsであることを確認する工程をさらに含む請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
Tm＞37℃である請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
TcがTrと実質的に同一である請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドディスプレイシステムが複数の複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがファージディスプレイシステムである請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
前記ファージディスプレイシステムが多価ファージディスプレイシステムである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
冷却されたレパートリーの凝集した少なくともポリペプチドの部分が、ファー時間凝集物を形成する請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
冷却されたレパートリーの凝集したポリペプチドが、ファージ間凝集物およびファージ内凝集物を形成する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記レパートリーが少なくとも約103個のメンバーを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドのレパートリーから、リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法であって、該方法が：
前記レパートリーを含むポリペプチドディプレイシステムを提供する工程、ここで該レパートリーが、ディプレイされるポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドする温度(Ts)に加熱されており、およびTsよりも低い温度(Tc)に冷却されており、冷却されたレパートリーが、アンフォールドおよびリフォールドしたポリペプチドの部分および凝集したポリペプチドの部分を少なくとも含む；および
リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを温度(Tr)で回収する工程、ここでリガンドはフォールドしたポリペプチドに結合し、凝集したポリペプチドには結合せず、回収したポリペプチドは融点(Tm)を有し、Ts＞Tm＞Tc、およびTs＞Tm＞Trである、方法。
【請求項４０】
リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたレパートリーを製造する方法であって、該方法が：
リガンドに結合するポリペプチドのレパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
ディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドする温度(Ts)にレパートリーを加熱する工程；および
Tsよりも低い温度である温度(Tc)にレパートリーを冷却する工程、ここで冷却したレパートリーは、アンフォールドおよびリフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部ならびに凝集したポリペプチドの部分を含有し、それによりリガンドに結合し、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたレパートリーが製造される、方法。
【請求項４１】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製する方法であって、
(a)親ポリペプチドの１つ以上の変異体を提供する工程、ここで親ポリペプチドは、フォールド親ポリペプチドとアンフォールドまたはミスフォールド親ポリペプチドとを区別する選択可能特徴を有し、該変異体は、１つ以上のアミノ酸残基残基が置換された親ポリペプチドのアミノ酸配列を含む；
(b)該１つ以上の変異体をアンフォールドし、次いでリフォールドする工程；
(c)親ポリペプチドの選択可能特徴を保有する１つ以上のリフォールド変異体ポリペプチドを選択すること
(d)(c)において選択された１つ以上のリフォールドした変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、親アミノ酸配列の対応する残基と同一でないリフォールド変異体のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；および
(e)(d)において同定されたアミノ酸残基で少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された該親ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドされる請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
変異体ポリペプチドが、変異体ポリペプチドの融点(Tm)よりも高い温度に加熱することによりアンフォールドし、冷却によりリフォールドする請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記親ポリペプチドが抗体可変ドメインである請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
熱凝集に耐性である可変ドメインが富化された抗体可変ドメインライブラリーを製造する方法であって、
(a)複数のディスプレイされる抗体可変ドメインを含むファージディスプレイシステムを提供する工程、ここでディスプレイされる可変ドメインの少なくとも一部がアンフォールドおよびリフォールドされている；
(b)該ファージディスプレイシステムからアンフォールド、リフォールドおよび回復した結合機能を有する可変領域をディスプレイする少なくとも１つのファージを選択する工程；
(C)(b)で選択されたファージにおいてディスプレイされる可変ドメインのCDR1および任意にCDR2をコードする核酸を得る工程；
(d)抗体可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを調製する工程、ここで(c)で得られた該核酸が少なくとも１つの他の核酸と作動可能に連結され、CD1および任意にCDR2が(c)で得られた核酸によりコードされる抗体可変ドメインをコードする核酸構築物のライブラリーを製造される、
を含む、方法。
【請求項４６】
(a)のディスプレイされる可変領域の実質的に全てが約80℃に加熱することによりアンフォールドしており、冷却によりリフォールドしている請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
(d)で構築された核酸のライブラリーが、CDR3がランダム化されているか、または加熱の際に可逆的にアンフォールドする能力について選択された抗体可変領域に由来しない抗体可変ドメインをコードする請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
親ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する工程；
疎水性である該アミノ酸配列の領域を同定する工程；
同定された疎水性領域を選択する工程；
選択された疎水性領域の１つ以上のアミノ酸を置換し、領域の疎水性が減少している可変アミノ酸配列を生成する工程；および
該変異体アミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを生成する工程
を含む、可逆的にアンフォールドした変異体ポリペプチドを調製する方法。
【請求項４９】
変異体ポリペプチドのアンフォールドおよびリフォールドを評価する工程をさらに含む請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
変異体ポリペプチドが、変異体ポリペプチドの融点(Tm)よりも高い温度に変異体ポリペプチドを加熱することによりアンフォールドし、冷却によりリフォールドする請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記疎水性領域が、親アミノ酸配列に対してSweet-Eisenberg疎水性スコアを用いることにより同定される請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
親VHドメインのアミノ酸配列を提供する工程；
該親VHのH1ループの１つ以上のアミノ酸を置換し、H1ループのSweet-Eisenberg(S/E)疎水性スコアが、親VHのH1ループと比べて減少している変異体VHを生成する工程、ここで該H1ループは、AbMアミノ酸ナンバリングシステムにより規定されるものである；または
該親VHのアミノ酸配列の22位〜36位の１つ以上のアミノ酸を置換し、22位〜36位のアミノ酸に関するS/E疎水性スコアが、親VHの22位〜36位の配列に関するS/Eスコアと比べて減少している変異体VHを生成する工程、ここで22〜36位は、Kabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている；および
該変異体VHを含有する変異体ポリペプチドを生成する工程、
を含む、可逆的にアンフォールドする変異体抗体重鎖可変ドメイン(VH)を含有するポリペプチドを調製する方法。
【請求項５３】
変異体VHのアンフォールディングおよびリフォールディングを評価する工程をさらに含む請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドする請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
変異体VHが、変異体VHの融点(Tm)よりも高い温度にかねつすることによりアンフォールドする請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
前記親VHがヒトVHである請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
前記変異体VHが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
前記変異体VHの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含み、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
前記可変VHドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
前記可変VHのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、またはFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
変異体VHが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP47生殖細胞系VH遺伝子セグメントを含む請求項５８〜６１いずれか記載の方法。
【請求項６３】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP45、DP46、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68およびDP69からなる群より選ばれるVH遺伝子セグメントを含む請求項５８〜６１いずれか記載の方法。
【請求項６４】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系JH遺伝子セグメントをさらに含む請求項６２または請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
親VLのアミノ酸配列を提供する工程；
該親VLのFR2-CDR2の１つ以上のアミノ酸を置換し、FR2-CDR2領域に関するSweet/Eisenberg疎水性スコア(S/Eスコア)が、親VLドメインの対応する領域と比べて減少している変異体VLを生成する工程；または
該親VLのFR3の１つ以上のアミノ酸を置換し、FR3に関するS/Eスコアが親VLドメインの対応する領域と比べて減少している変異体VLを生成する工程；または
該親VLのアミノ酸配列の44位〜53位の１つ以上のアミノ酸を置換して、44位〜53位のアミノ酸配列に関するS/Eスコアが、親VLドメインの対応する部分に関するS/Eスコアと比べて減少している変異体VLを生成する工程；または
該親VLのアミノ酸配列の73位から76位の１つ以上のアミノ酸配列を置換して、73位〜76位のアミノ酸配列に関するS/Eスコアが親VLドメインの対応する部分に関するS/Eスコアと比べて減少している変異体VLを生成する工程；および
該変異体VLを含む変異体ポリペプチドを生成する工程、
を含み、FR2-CDR2領域、FR3、44〜53位および73〜76位がKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、可逆的にアンフォールドする変異体抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含むポリペプチドを調製する方法。
【請求項６６】
変異体VLのアンフォールドおよびリフォールドを評価する工程をさらに含む請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドされる請求項１記載の方法。
【請求項６８】
変異体VLが、変異体VLの融点(Tm)よりも高い温度に加熱することによりアンフォールドし、冷却によりリフォールドする請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
前記親VLがヒトVLである請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
前記変異体VLが生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項６５記載の方法。
【請求項７１】
前記変異体VLの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含み、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記可変VLドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
前記可変VLのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、またはFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
変異体VLが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26およびDPK28からなる群より選ばれるVL遺伝子セグメントを含む請求項７１〜７４いずれか記載の方法。
【請求項７６】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JK1、JK2、JK3、JK4、JK4b、およびJK5からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系JK遺伝子セグメントをさらに含む請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供する工程；
該ディスプレイされるポリペプチドをアンフォールドする工程；
該ポリペプチドの少なくとも一部をリフォールドする工程；および
可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションを該一部から回収する工程、
を含む、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたライブラリーを製造する方法であって、可逆的にアンフォールドする該ポリペプチドが、フォールドしたポリペプチドとアンフォールドまたはミスフォールドしたポリペプチドとを区別する共通の選択可能特徴を有する、方法。
【請求項７８】
該ポリペプチドディスプレイシステムが、核酸のコードする機能を、それがコードするポリペプチドの物理、化学および／または機能的特徴に関連付ける請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリペプチドシステムが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイおよび共有結合ディスプレイからなる群より選ばれる請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイである請求項７７記載の方法。
【請求項８１】
ポリペプチドが、可逆的にアンフォールドしないアンフォールドしたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しないアンフォールド因子を用いてアンフォールドする請求項７７記載の方法。
【請求項８２】
アンフォールドが、ポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させること、ポリペプチドディスプレイシステムの圧力を調整すること、ポリペプチドディスプレイシステムのpHを調整すること、ポリペプチドディスプレイ中のカオトロピック薬剤の濃度を増大すること、および／またはポリペプチドディスプレイシステム中の有機溶媒の濃度を増大させることにより達成される請求項７７記載の方法。
【請求項８３】
アンフォールドが、少なくとも約50％のディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドするアンフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を上昇させることにより達成され、リフォールドが、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部がリフォールドするリフォールド温度にポリペプチドディスプレイシステムの温度を減少させることにより達成される請求項７７記載の方法。
【請求項８４】
ポリペプチドディスプレイシステムが、実質的に全てのディスプレイされるポリペプチドがアンフォールドされるアンフォールド温度に加熱される請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
アンフォールド温度および該リフォールド温度が少なくとも約10℃異なる請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記ポリペプチドディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイであり、可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションが、伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収することにより回収される請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
前記共通の選択可能特徴が、リガンドへの結合、触媒活性およびタンパク質分解に対する耐性からなる群より選ばれる選択可能な機能的特徴である請求項１記載の方法。
【請求項８８】
前記抗可変ドメインがヒト抗体可変ドメインを含む請求項７７記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
抗体可変ドメインが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項７７記載の方法。
【請求項９１】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションが標的リガンドへの結合により回収される請求項７７記載の方法。
【請求項９２】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドのコレクションが、一般リガンドへの結合により回収される請求項７７記載の方法。
【請求項９３】
ポリペプチドディスプレイシステムが、各々のディスプレイされるポリペプチドが抗体可変ドメインを含む多価バクテリオファージシステムであり、
アンフォールドが、約80℃のアンフォールド温度に多価バクテリオファージシステムの温度を増大させることにより達成され；
リフォールドが、該アンフォールド温度よりも約10℃低いリフォールド温度に該多価バクテリオファージシステムの温度を減少させることにより達成される、請求項７７記載の方法。
【請求項９４】
免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインが標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度に加熱されると可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない、単離されたポリペプチド。
【請求項９５】
前記適切なアンフォールド温度が、免疫グロブリン可変ドメインの融点(Tm)よりも高い請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９６】
前記適切なアンフォールド温度が約80℃である請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９７】
前記可変ドメインがヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)である請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９８】
前記可変ドメインがヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９９】
標的リガンドがヒト抗原またはエピトープである請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１００】
前記ポリペプチドが抗体の形式である請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０１】
前記ポリペプチドが単一のVHからなる請求項１００記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０２】
前記可変ドメインが、約50nM〜約20pMの解離定数(Kd)および約5×10−1s-1〜約1×10−7s-1のKoffを有する前記標的リガンドに結合する請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０３】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０４】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも約１mg/L〜少なくとも約1g/mLの量で分泌される請求項９４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０５】
可逆的にアンフォールドする変異体免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VHが親VHのアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、ここでH1ループの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Sweet/Eisenberg(S/E)疎水性スコアが親VHのH1ループと比べて減少しているように置換されている、ここで該H1ループはAbMアミノ酸ナンバリングシステムによって規定されているものである；または
該変異体VHが、親VHのアミノ酸配列を含み、ここで22位〜36位の少なくとも１つのアミノ酸残基のS/Eスコアが、親VHの22位〜36位の配列に関するS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている、ここで23〜36位はKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１０６】
変異体VHのH1ループのS/Eスコアが０以下であるか、または該変異体Hの位置22〜位置36のアミノ酸配列が０以下である請求項１０５記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０７】
可逆的にアンフォールドする可変免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VHが、H1ループの少なくとも１つのアミノ酸残基がProまたはGly残基と置換されている親VHのアミノ酸配列を含み、該H1ループはAbMアミノ酸ナンバリングシステムによって規定されている；または
該変異体VHが、22位〜36位の少なくとも１つアミノ酸残基がProまたはGly残基で置換されている親VHのアミノ酸配列を含み、該位置が、Kabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１０８】
前記変異体VHが、その融点(Tm)よりも高い温度に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０９】
前記変異体VHが約80℃に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１０】
前記変異体VHが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１１】
親VHがヒトVHである請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１２】
前記単離されたポリペプチドが抗体の形式である請求項１０５〜１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１３】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸配列、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１０５から１０７いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１４】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１０５〜１０７いずれか記載の方法。
【請求項１１５】
前記変異体VHのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１０５〜１０７いずれか記載の方法。
【請求項１１６】
変異体VHが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１０５〜１０７いずれか記載の方法。
【請求項１１７】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP47生殖細胞系VH遺伝子セグメントを含む請求項１１３〜１１６いずれか記載の方法。
【請求項１１８】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP45、DP46、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68およびDP69からなる群より選ばれるVH遺伝子セグメントを含む請求項１１３〜１１６いずれか記載の方法。
【請求項１１９】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系JH遺伝子セグメントをさらに含む請求項１１７または請求項１１８記載の方法。
【請求項１２０】
可逆的にアンフォールドする変異体免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VLが親VLのアミノ酸配列を含み、ここでFR2-CDR2領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が、FR2-CDR2領域のSweet/Eisenberg疎水性スコア(S/Eスコア)が親VLのFR2-CDR2領域のS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている；
該変異体VLが親VLのアミノ酸配列を含み、ここで44位〜53位の少なくとも１つのアミノ酸残基が、S/Eスコアが親VLの44位〜53位のアミノ酸配列のS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている；および／または
該変異体VLが親VLのアミノ酸配列を含み、ここで73位〜76位の少なくとも１つのアミノ酸残基が、S/Eスコアが親VLの73位〜76位のアミノ酸配列のS/Eスコアと比べて減少しているように置換されている；
ここでFR2-CDR2領域、FR3，44〜53位および73〜76位はKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１２１】
前記VLのFR2-CDR2領域のS/Eスコアが0.23以下であり；
前記VLのFR3のS/Eスコアが0.35以下であり；
前記変異体VLの44位〜53位のアミノ酸配列のS/Eスコアが0.23以下であり；および／または
前記VLの44位〜53位のアミノ酸配列のS/Eスコアが0.23以下であり；および／または
前記VLの73位〜76位のアミノ酸配列が0.35以下である、
請求項１２０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２２】
可逆的にアンフォールドする変異体免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメイン(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、
該変異体VLが、FR3の少なくとも１つのアミノ酸残基がProまたはGly残基で置換されている親VLのアミノ酸配列を含み；および／または
該変異体VLが、44位〜53位の少なくとも１つのアミノ酸残基がProまたはGly残基で置換されている、
ここで、FR3および44位〜53位がKabatアミノ酸ナンバリングシステムに従って割り当てられている、単離されたポリペプチド。
【請求項１２３】
前記変異体VLが、その融点(Tm)よりも高い温度に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２４】
前記変異体VHが約80℃に加熱されると可逆的にアンフォールドする請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２５】
前記単離されたポリペプチドが抗体の形式である請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２６】
前記変異体VLの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２７】
前記変異体VLの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２８】
前記変異体VLのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２９】
変異体VLドメインが、FR1、FR2およびFR3領域を含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１２０〜１２２いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３０】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26およびDPK28からなる群より選ばれるVL遺伝子セグメントを含む請求項１２６〜１２９いずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３１】
前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントが、JκセグメントJκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4およびJκ5からなる群より選ばれるヒト生殖細胞系Jκ遺伝子セグメントをさらに含む請求項１３０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３２】
前記レパートリーの少なくとも約10％のポリペプチドが可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるポリペプチドのレパートリー。
【請求項１３３】
ポリペプチドが抗体可変ドメインを含む請求項１３２記載のレパートリー。
【請求項１３４】
前記抗体可変ドメインが抗原結合部位を含む請求項１３３記載のレパートリー。
【請求項１３５】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである請求項１３３記載のレパートリー。
【請求項１３６】
前記可変ドメインが、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない請求項１３３記載のレパートリー。
【請求項１３７】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域(FR)が、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトワークフレーム領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸配列、または(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、該フレームワーク領域がKabatにより規定されるものである請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１３８】
前記可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて合計で５つまでのアミノ酸差異を含む請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１３９】
前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、または前記可変ドメインのFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と比べて、合計で10個までのアミノ酸差異を含む請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１４０】
各々のディスプレイされるポリペプチドが、FR1、FR2およびFR3領域を含有する抗体可変ドメインを含み、該FR1、FR2、FR3のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である請求項１３５記載のレパートリー。
【請求項１４１】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが、フォールドした場合、共通の選択可能特徴を有し、該共通の選択可能特徴がアンフォールドまたはミスフォールドしたポリペプチドには存在しない請求項１３２記載のレパートリー。
【請求項１４２】
前記選択可能な機能的特徴が、リガンドへの結合、触媒活性およびタンパク質分解に対する耐性からなる群より選ばれる選択可能な機能的特徴である請求項１４１記載のレパートリー。
【請求項１４３】
前記ポリペプチドが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイおよび共有結合ディスプレイからなる群より選ばれるポリペプチドディスプレイにおいてディスプレイされる請求項１３２記載のレパートリー。
【請求項１４４】
可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸のライブラリーであって、ライブラリーの各々のメンバーが、少なくとも１つのアミノ酸残基がフォールディングゲートキーパー残基で置換され、少なくとも１つの他のアミノ酸残基が置換、付加または欠失されている親ポリペプチドのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする、ライブラリー。
【請求項１４５】
前記親ポリペプチドが抗体可変ドメインである請求項１４４記載のライブラリー。
【請求項１４６】
前記抗体可変ドメインがヒトVHである請求項１４５記載のライブラリー。
【請求項１４７】
前記フォールディングゲートキーパー残基がCDR1に存在する請求項１４６記載のライブラリー。
【請求項１４８】
前記抗体可変ドメインがヒトVLである請求項１４５記載のライブラリー。
【請求項１４９】
可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインをコードする核酸のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーが可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインのCDR1をコードする、ライブラリー。
【請求項１５０】
ライブラリーの各メンバーが可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインのCDR2をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１４９記載のライブラリー。
【請求項１５１】
ライブラリーのメンバーが、CDR3が多様化または無作為化されている抗体可変ドメインをコードする請求項１４９記載のライブラリー。
【請求項１５２】
ライブラリーがヒト抗体重鎖可変ドメイン(VH)をコードする請求項１４９記載のライブラリー。
【請求項１５３】
請求項４８〜７６いずれか記載の方法に従って製造される可逆的にアンフォールドする単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、大腸菌で産生される場合、分泌可能であり、但し、ポリペプチドはラクダ抗体可変ドメインではない、単離されたポリペプチド。
【請求項１５４】
可逆的にアンフォールドする単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが請求項１〜３９いずれか記載の方法により選択可能であり、該ポリペプチド大腸菌において産生される場合、選択可能であり、但し、ポリペプチドはラクダ抗体可変ドメインではない、単離されたポリペプチド。
【請求項１５５】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１５６】
請求項４１〜４７および７７〜９３いずれか記載の方法により製造される可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたライブラリー。
【請求項１５７】
前記ライブラリーが、可逆的にアンフォールドする前記ポリペプチドをコードする異種核酸のコレクションを含む請求項１５６記載のライブラリー。
【請求項１５８】
請求項４０および１３２〜１４３いずれか記載のポリペプチドのレパートリーをコードする核酸のライブラリー。
【請求項１５９】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項１６０】
前記ポリペプチドが約５重量％〜約99重量％の範囲で存在する請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６１】
前記組成物が溶液である請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６２】
前記組成物が医薬組成物である請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６３】
前記組成物が生物学的粉末洗剤である請求項１５９記載の組成物。
【請求項１６４】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項１６５】
前記可逆的にアンフォールドする噴霧乾燥ポリペプチドが、再水和された場合、その活性の約20％以下を喪失する請求項１６４記載の組成物。
【請求項１６６】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる密封包装。
【請求項１６７】
無菌器具をさらに含有してなる請求項１６６記載の密封包装。
【請求項１６８】
前記無菌器具が医学的器具である請求項１６７記載の密封無菌包装。
【請求項１６９】
前記医学的器具が外科器具である請求項１６８記載の密封無菌包装。
【請求項１７０】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる、被験体への可逆的にアンフォールドするポリペプチドの投与に使用するためのキット。
【請求項１７１】
前記ポリペプチドが噴霧乾燥されている請求項１７０記載のキット。
【請求項１７２】
前記薬物送達装置が、注射器、吸入器、鼻内投与装置、眼投与装置および無針注射装置からなる群より選ばれる請求項１７１記載のキット。
【請求項１７３】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患または障害を有する被験体を治療または診断する方法。
【請求項１７４】
治療または診断における請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドの使用。
【請求項１７５】
診断を治療するための医薬の製造のための請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドの使用。
【請求項１７６】
治療または診断において使用するための請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチド。
【請求項１７７】
サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質により媒介される疾患または医学的状態の治療および／または予防および／または抑制のための医薬の製造のための請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチド。
【請求項１７８】
サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質を標的化するため、該サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質により媒介される疾患または医学的状態を治療および／または予防および／または抑制するための免疫グロブリン可変ドメインを含有する請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチド。
【請求項１７９】
疾患または医学的状態が、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、および自己免疫疾患からなる群より選ばれる請求項１７６〜１７８いずれか記載のポリペプチド。
【請求項１８０】
疾患または医学的状態が、喘息、乾癬、I型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、重症筋無力症、白血病または固形腫瘍からなる群より選ばれる請求項１７９記載のポリペプチド。
【請求項１８１】
請求項９４〜１３１、１５３または１５４いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞であって、該組換え核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞。
【請求項１８２】
前記組換え核酸の発現に適した条件下で請求項１８１記載の宿主細胞を維持する工程を含み、それにより前記組換え核酸が発現され、前記可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、可逆的にアンフォールドするポリペプチドの製造方法。
【請求項１８３】
可逆的にリフォールドするポリペプチドを選択するための請求項４０、１４４〜１４８および１５６〜１５８いずれか記載のライブラリーまたはレパートリーの使用。
【請求項１８４】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインを含む請求項１８３記載の使用。
【請求項１８５】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが抗体の形式を含む請求項１８３記載の使用。
【請求項１８６】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーを提供する工程、ここで該ライブラリーのディスプレイされるポリペプチドの一部がアンフォールドおよびリフォールドされている；
宿主細胞とバクテリオファージディスプレイライブラリーとをせっしょくさせ、感染宿主細胞を生成する工程；および
感染宿主細胞から伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それにより可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーが製造される、
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーの製造方法。
【請求項１８７】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーを提供する工程；
該ライブラリーのディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部をアンフォールドし、次いでリフォールドする工程；
得られたアンフォールドおよびリフォールドしたディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーと宿主細胞を接触させて感染祝細胞を生成する工程；および
感染祝細胞から伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それにより、可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーが製造される、
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されたバクテリオファージディスプレイライブラリーの製造方法。
【請求項１８８】
前記ディスプレイされるポリペプチドが加熱によりアンフォールドされ、冷却によりリフォールドされているか、またはされる請求項１８６または１８７記載の方法。
【請求項１８９】
前記バクテリオファージディスプレイライブラリーが多価バクテリオファージfdディスプレイライブラリーであり、前記適切な宿主細胞が大腸菌である請求項１８６または１８７記載の方法。
【請求項１９０】
請求項１８６〜１８９いずれか記載の方法により製造されるバクテリオファージディスプレイライブラリー。
【請求項１９１】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディプレイライブラリーを提供する工程、ここで該ライブラリーのディプレイされるポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドおよびリフォールドされている；
宿主細胞と該バクテリオファージディスプレイライブラリーとを接触させて、感染宿主細胞を生成する工程；および
感染宿主細胞から少なくとも１つの伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それによって可逆的にアンフォールドするポリペプチドが回収される、
を含む、バクテリオファージディスプレイライブラリーから可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法。
【請求項１９２】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディプレイライブラリーを提供する工程；
該ライブラリーのディプレイされるポリペプチドの少なくとも一部をアンフォールドさせ、次いでリフォールドさせる工程；
得られるバクテリオファージディスプレイライブラリーと宿主細胞とを接触させて感染宿主細胞を生成する工程；および
感染宿主細胞から少なくとも１つの伝染性バクテリオファージまたは伝染性バクテリオファージの子孫を回収する工程、それによって可逆的にアンフォールドするポリペプチドが回収される、
を含む、バクテリオファージディスプレイライブラリーから可逆的にアンフォールドする少なくとも１つのポリペプチドを回収する方法。
【請求項１９３】
複数のディスプレイされるポリペプチドを含むバクテリオファージディスプレイライブラリーを提供する工程、ここで該ライブラリーのディスプレイされるポリペプチドの少なくとも一部が、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部が凝集する条件下でアンフォールドおよびリフォールドしている、
可逆的にアンフォールドするポリペプチドが富化されているバクテリオファージディスプレイシステム。
【請求項１９４】
上記凝集したバクテリオファージが、適切な宿主細菌を遠心分離することにより、または適切な宿主細胞を感染させることにより回収される請求項１９３記載の方法。
【請求項１９５】
(a)請求項４記載の方法により決定された可逆的にアンフォールドするポリペプチドのアミノ酸配列、(b)それに同一なアミノ酸配列、および(c)１〜約１０個のアミノ酸の置換、欠失または挿入によりそれとは異なるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を提供する工程；および
該アミノ酸配列を含むポリペプチドを合成する工程または該アミノ酸配列をコードする核酸を発現させる工程、それによって可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、
を含む、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを製造する方法。
【請求項１９６】
合成したポリペプチドが可逆的にアンフォールドすることを確認する工程をさらに含む請求項１９５記載の方法。
【請求項１９７】
前記ポリペプチドが加熱の際に可逆的にアンフォールドする請求項１９５記載の方法。
【請求項１９８】
免疫グロブリン可変(V)ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該VドメインがCDR2のシステインとCDR3のシステインとの間にジスルフィド結合を含み、CDR2およびCDR3がKabatアミノ酸ナンバリングシステムを用いて規定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１９９】
前記ジスルフィド結合が52a位のシステイン残基と98位との間；51位と98位との間；または51位と100b位との間にあり、該位置がKabatアミノ酸ナンバリングシステムを用いて規定される請求項１９８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２００】
前記ジスルフィド結合が、51位のシステインとCDR3のシステインとの間；またはCDR2のシステインと98位のシステインとの間にあり、CDR2、CDR3および該位置がKabatアミノ酸ナンバリングシステムを用いて規定される請求項１９８記載の単離されたポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５３５４８４（Ｐ２００７−５３５４８４Ａ）
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３０５０６（Ｐ２００６−５３０５０６）
【出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２１０２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７９０
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０２１９７０４６）ドマンティス リミテッド (47)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２１０２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７９０
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０２１９７０４６）ドマンティス リミテッド (47)
【Ｆターム（参考）】
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