マイクロアレイの測定方法
【課題】マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定する手段を提供する。
【解決手段】マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程を含む、前記方法。
【解決手段】マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な生物の遺伝子構造を明らかにするのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。マイクロアレイは、スライドガラス等の担体に多数のポリヌクレオチドを所定の領域毎に整列固定させた高密度のアレイであり、遺伝子の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多型性などの同時解析に非常に有用である。このマイクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに極めて有用である。
【０００３】
マイクロアレイを用いた検出では、まず担体表面に高密度に整列したプローブポリヌクレオチドに対して、放射性同位体や蛍光色素で標識したターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。このとき、プローブポリヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつターゲットポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドと相補的にハイブリダイズするが、ハイブリダイズしなかったポリヌクレオチドは洗浄により除去される。
【０００４】
マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションの検出では、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などにより誤判定が起こる場合がある。しかし、その誤判定か否かの判断は、マイクロアレイを使用するユーザーに委ねられており、非常にあいまいであった。このような状況では検出器と反応装置と組み合わせた自動装置で多数の試料を処理することは不可能であった。
【０００５】
特許文献１には、スポットの輝度が検出器の検出下限以下である場合や検出上限以上である場合に生じる判定誤差をなくすために、プローブＤＮＡを濃度を変えてスポットしたマイクロアレイを用い、特定の範囲の輝度を有するスポットの結果のみで判定する方法が記載されている。しかし、当該方法では、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを判定することはできない。
【０００６】
【特許文献１】特許０８８０３６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、プローブポリヌクレオチドが固定化されたスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを設けたマイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーション反応して洗浄した後に、まず基準スポットの蛍光を測定することによりマイクロアレイごとの信頼性を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
（１）マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び
４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。
【００１１】
（２）基準ポリヌクレオチドの蛍光標識とターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識が同一である、（１）記載の方法。
【００１２】
（３）マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが整列して配置されており、基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離と基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置が検出される、（１）又は（２）記載の方法。
【００１３】
（４）プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されており、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在する、（３）記載の方法。
【００１４】
（５）マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置されており、基準スポットがその対角線上の頂点に二箇所存在し、
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各スポット位置が検出される、（１）又は（２）記載の方法。
【００１５】
（６）工程２）の後かつ工程４）の前において、
すべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（７）工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（８）前記スポットの中心から一定の範囲が、スポットの中心位置から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内である（６）又は（７）に記載の方法。
【００１８】
（９）バックグラウンド代表値が、複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（１０）工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（１１）バックグラウンド代表値を、マイクロアレイにおけるスポット群の最外周に存在する複数のスポットのバックグラウンド値から算出することを特徴とする（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（１２）基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度が、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、マイクロアレイごとの信頼性が判定でき、信頼性のあるマイクロアレイを用いて測定を実施することができる。従って、誤判定を抑えることができる。また、自動反応装置などと組み合わせることで、自動でマイクロアレイの測定を高い信頼性をもって実施できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。
【００２４】
本発明においてポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが包含され、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸が包含される。ＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。また、核酸には、リン酸ジエステル部位を修飾した人工核酸；フラノース部位のグリコシル結合やヒドロキシル基を修飾した人工核酸；核酸塩基部位を修飾した人工核酸；および糖・リン酸骨格以外の構造を利用した人工核酸なども包含され、より具体的には、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型またはメチルホスホノチオエート型の人工核酸；フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、または多環式糖骨格型の人工核酸；ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型、または環拡張修飾塩基型の人工核酸などが包含される。
【００２５】
本発明においてプローブポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、目的遺伝子を検出するために用いられるポリヌクレオチドであって、目的遺伝子に対応するポリヌクレオチドまたはその断片と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさす。プローブポリヌクレオチドとしては、通常、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの（例えば、一本鎖を二本鎖に変性させたもの）等が用いられる。プローブポリヌクレオチドは、通常３〜５０００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基を有する。マイクロアレイに固定化するプローブポリヌクレオチドの濃度は、通常１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。
【００２６】
本発明においてターゲットポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、検出対象であるポリヌクレオチドをさす。ターゲットは標的と称される場合もある。通常、被検試料由来のポリヌクレオチドおよびそれを基にして酵素的に合成されたポリヌクレオチド、具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ａＲＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの等が用いられる。
【００２７】
ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、相補的な配列を持つポリヌクレオチド同士、例えば、一本鎖のＤＮＡ同士、一本鎖のＲＮＡ同士、または一本鎖のＤＮＡと一本鎖のＲＮＡが適切な条件下で二本鎖を形成することをいう。
【００２８】
本発明においては、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを用いる。標識方法や標識の種類は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されず、当技術分野で公知である。例えば、ターゲットポリヌクレオチドを合成または増幅する際に蛍光標識を共有結合させた基質（主にＵＴＰ）を取り込ませることにより、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを得ることができる。蛍光標識としては、Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられる。
【００２９】
本発明では、マイクロアレイとして、プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上、好ましくは少なくとも２箇所、より好ましくは２〜４箇所、さらに好ましくは２箇所有するマイクロアレイを用いる。基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度は、通常１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。
【００３０】
本発明においては、上記マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させ、洗浄により未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去した後、基準ポリヌクレオチドの蛍光を測定する。基準ポリヌクレオチドは蛍光標識を有することから、ターゲットポリヌクレオチドがハイブリダイズしなくとも蛍光が検出されるはずである。蛍光が検出されない、または蛍光の値が低いということは、基準ポリヌクレオチドがマイクロアレイから失われていること、すなわち、その他のプローブポリヌクレオチドも同様に失われていることを意味する。従って、基準ポリヌクレオチドの蛍光を測定し、所定の値を満たすかどうか判定することにより、マイクロアレイが劣化しているか否か、換言すればマイクロアレイの信頼性を判断することができる。
【００３１】
基準ポリヌクレオチドの蛍光標識は、特に制限されないが、ターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識と同じものを用いるのが好ましい。同じものを用いることで、同じ検出器を用いて双方の蛍光標識を一括して測定することができ、迅速且つ簡便に測定を実施できる。
【００３２】
本発明で用いるマイクロアレイにおいては、好ましくは、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットとが整列して、好ましくは格子状に配置されている。そして、好ましくは基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離及び基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置（スポットの中心）が検出される。より具体的には、基準スポットからの距離及び基準線からの角度（各スポットと基準スポットを結ぶ線と基準線とがなす角度）、並びに所望によりスポットピッチ等から各スポットの中心位置を決定することができる。
【００３３】
また、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットを、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置し、基準スポットをその対角線上の向かい合う頂点に二箇所存在させることができる。この場合には、それぞれの基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、この交点とそれぞれの二箇所の基準スポットを結ぶ二つの結線を検出する。そして、結線の長さを算出しこの距離を、あらかじめ決定されている（四角形の外周上のスポット数−１）の数で割ることで、結線上の各スポット間隔が求められ、このスポット間隔から各スポット位置を検出することができる。例えば、スポットが４行×４列のマイクロアレイを用いたとする。このときは結線上のスポット数は４点である。結線の長さが９００μｍだったとすると、９００÷（４−１）＝３００となり、スポット間隔は３００μｍとなる。これを用いて、基準スポットから結線上に３００μｍ移動したところをスポットの中心とすることができ、さらにこの中心から結線上に３００μｍ移動したところが次のスポットの中心となる。
【００３４】
基準線を構成する二箇所の基準スポットは、マイクロアレイ上に整列したスポット群において、遠い位置に存在することが好ましい。プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットは、外周が四角形の格子状に配置されており（例えば、図１）、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在することが好ましい。
【００３５】
プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットにおける蛍光を測定するための検出器としては、例えば、蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、マイクロアレイ上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型または非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、マイクロアレイ上に固定化されたプローブポリヌクレオチドに対して相補性を有するターゲットポリヌクレオチドを同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定したりすることが可能になる。
【００３６】
本発明の一実施形態では、マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程の後、実際の測定、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光の測定の前に、さらに以下の工程を実施することが好ましい。下記工程は、基準スポットにおける蛍光測定の前に実施してもよいし、後に実施してもよい。
【００３７】
複数、好ましくはすべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程。
【００３８】
ここで、スポットには、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットの双方が包含される。バックグラウンド値を得る複数のスポットとしては、マイクロアレイに整列して配置されたスポットのうち、少なくとも外周を形成するスポットすべてについてバックグラウンド値を測定することが好ましい。また、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定する必要はないが、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定してもよい。バックグラウンド値を測定する複数のスポットは、例えば、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されている場合、通常、少なくとも四角形の頂点の２スポット、好ましくは少なくとも四角形の頂点の４スポット、より好ましくは最外周のスポットすべてである。より具体的には、１６行×１６列のスポットであったときの最外周の６０スポット、又は１６行×１６列のスポットであったときの全スポットである２５６スポットである。
【００３９】
スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、バックグラウンド値とする際、中心から一定の範囲は、スポットの大きさとスポット間隔等に基づいて適宜設定される。例えば、図４に示すように、スポットの中心から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内とすることができる。例えば、スポット中心から７０μｍ以上で一辺が１０００μｍの四角形の範囲内、好ましくはスポット中心から７０μｍ以上で一辺が３８０μｍの四角形の範囲内である。また、一定の範囲の位置のスポット全て又は一部について輝度を測定した平均値をバックグラウンド値としてもよいし、一定の範囲の位置の一スポットのみの輝度を測定してそれをバックグラウンド値としてもよい。
【００４０】
スポットの中心の位置決め方法は特に制限されないが、例えば、各スポットにおいて、所定の蛍光強度（例えば、３０００以上）を有する部分を検出し、その部分の中心とすることができる。あるいは、二箇所の基準スポットの中心を結ぶ線を基準線とし、基準スポットからの距離及び基準線からの角度、並びにスポットピッチ等から各スポットの中心位置を決定してもよい。
【００４１】
バックグラウンド代表値は、測定した複数のバックグラウンド値を代表する値であれば特に制限されないが、好ましくは複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である。
【００４２】
すべてのスポットについて、又は、バックグラウンド値を測定した全てのスポットについてのバックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合は、スポット周囲のバックグラウンド値にばらつきが大きいと判定でき、従って、当該マイクロアレイは洗浄不良であり、信頼性に欠けることから測定不可と判断することができる。ここで、所定の値は、条件等によって異なるが、例えば、画像の表示が１６ビット諧調であるときは１０００以上に設定することができる。画像の表示が例えば８ビット諧調であるときは、１０００よりも小さい値を設定することになる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程の後、実際の測定、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光の測定の前に、さらに以下の工程を実施することが好ましい。下記工程は、基準スポットにおける蛍光測定の前に実施してもよいし、後に実施してもよい。
【００４４】
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程。
【００４５】
ここで、スポットには、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットの双方が包含される。バックグラウンド値を得る複数のスポットとしては、マイクロアレイに整列して配置されたスポットのうち、少なくとも外周を形成するスポットすべてについてバックグラウンド値を測定することが好ましい。また、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定する必要はないが、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定してもよい。バックグラウンド値を測定する複数のスポットは、例えば、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されている場合、通常、少なくとも四角形の頂点の２スポット、好ましくは少なくとも四角形の頂点の４スポット、より好ましくは最外周のスポットすべてである。より具体的には、１６行×１６列のスポットであったときの最外周の６０スポット、又は１６行×１６列のスポットであったときの全スポットである２５６スポットである。
【００４６】
スポットの中心から一定の距離、及び中心の決定方法については、上述のとおりである。
【００４７】
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値であるバックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には、スポット周囲のバックグラウンド値が全体的に大きいと判定でき、従って、当該マイクロアレイは洗浄不良であり、信頼性に欠けることから測定不可と判断することができる。ここで、所定の値は、条件等によって異なるが、例えば、１０００以上に設定することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１ 担体の調製
３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で２層のＤＬＣ層の製膜を行った。
【００５０】
【表１】
【００５１】
得られた表面にＤＬＣ層を有するシリコン基板上に、下記の条件でアンモニアプラズマを用いて、アミノ基を導入した。
【００５２】
【表２】
【００５３】
１４０ｍＭ 無水コハク酸及び０．１Ｍ ホウ酸ナトリウムを含む１−メチル−２−ピロリドン溶液に３０分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー、０．１Ｍ １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシイミドを含む溶液に３０分間浸漬し、活性化を行い、シリコン基板表面にＤＬＣ層及び化学修飾基としてのＮ−ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を得た。
【００５４】
実施例２ マイクロアレイの作製
プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡをそれぞれＳｏｌ．６に溶解し（２５０ｎＭ）、実施例１で作製した担体上に図１のような配置でスポット（日立ソフトウエア製 ＳＰＢＩＯ）した。基準ＤＮＡはＣｙＤｙｅ（Ｃｙ５）で標識されたものを用いた。スポットピッチは、２８０μｍとした。プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡにおけるＤＮＡの配列は、以下のとおりである。
プローブＤＮＡ：ＴＴＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＣＴＣ（配列番号１）
基準ＤＮＡ：ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴ（配列番号２）
【００５５】
６０℃で３時間ベーキングを実施した後に、次の手順で洗浄した。まず、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、室温で、攪拌しながら１５分間洗浄し、続いて、同溶液を用いて６０℃に加熱しながら５分間洗浄し、超純水にてリンスした。再度にエアーにて吹き付け乾燥し、プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡがスポットされたマイクロアレイを作製した。
【００５６】
上記実施例１及び２の手順に従って、２つのマイクロアレイ、すなわち、マイクロアレイ１及びマイクロアレイ２を作製した。
【００５７】
実施例３ ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション
ラムダファージのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プローブＤＮＡとハイブリダイズする領域を以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。
プライマー１：ＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＣ（配列番号３）
プライマー２：ＡＡＴＡＡＣＣＧＡＣＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣ（配列番号４）
標識は、ＣｙＤｙｅ（Ｃｙ５）を用いて行った。ＰＣＲ溶液の組成は以下のとおりとした。
【００５８】
【表３】
【００５９】
得られたＰＣＲ産物１μｌを、ハイブリダイズ溶液２μｌに溶かし（最終濃度１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液）、実施例２で作製したマイクロアレイ１及び２にそれぞれ滴下し、湿箱に入れて４５℃で１時間インキュベートした。２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、続いて２×ＳＳＣで洗浄し、乾燥した。
【００６０】
実施例４ マイクロアレイの信頼性の判定及びハイブリダイゼーションの検出
蛍光の測定は、図２に示すような検出器を用いて実施した。レーザーで励起光をマイクロアレイ全面に照射した。蛍光フィルターにより、目的の波長以外の波長を有する光をカットした。
【００６１】
まず、基準スポットの蛍光を測定した。基準スポットにおいて、８０００以上の蛍光強度を有する部分を検出し、その部分の中心を決定し、基準スポットの中心とした。基準スポットにおいて、８０００以上の蛍光強度が検出されなかった場合は、測定不可と判定することとした。マイクロアレイ１においては、基準スポット１（Ｙ＝８、Ｘ＝１）で８５００の蛍光強度が検出され、基準スポット２（Ｙ＝８、Ｘ＝８）で８１９７の蛍光強度が検出された。マイクロアレイ２においては、基準スポット１（Ｙ＝８、Ｘ＝１）で７１６８の蛍光強度が検出され、基準スポット２（Ｙ＝８、Ｘ＝８）で７２４３の蛍光強度が検出された。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
【００６２】
また、上記２つのマイクロアレイにおいて、二箇所の基準スポットの中心を結ぶ線を基準線とし、基準スポットからの距離及び基準線からの角度（各スポットと基準スポットを結ぶ線と基準線とがなす角度）、並びにスポットピッチから各スポットの中心位置を決定した。
【００６３】
なお、各スポットの中心位置から２２０μｍの位置以上から、スポット間隔（２８０μｍ）長を１辺とした四角形（中心はスポット中心と同じ）の内部で囲まれるピクセルの輝度をバックグラウンド値算出対象とすることができる。最外周の全スポットのバックグラウンド値を測定し、その平均値をバックグラウンド代表値として求めた。これが所定の値（１５００）より高い場合、マイクロアレイの洗浄不良と判断し、測定不可と判断することとした。
【００６４】
また、最外周すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出し、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットが存在する場合にもマイクロアレイの洗浄不良と判断し、測定不可と判断することとした。
【００６５】
最外周の全スポットのバックグラウンド値の測定結果、並びにバックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差を以下の表に示す。
【００６６】
【表４】
【００６７】
マイクロアレイ１では、最外周の全スポットのバックグラウンド値の平均値は３９１．５７であった。一方、マイクロアレイ２では、最外周の全スポットのバックグラウンド値の平均値は１８７１．１４であった。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
【００６８】
また最外周の全スポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差を測定した結果、マイクロアレイ１では、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットは存在しなかった。一方、マイクロアレイ２では、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットが存在した。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
【００６９】
マイクロアレイ１及び２の蛍光画像を図３に示す。マイクロアレイ２は洗浄不良であることが蛍光画像から明らかである。以上から、本発明の方法により、ユーザーが蛍光画像を見て判断することなく、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定できることが示された。
【００７０】
なお、上記実施例では最外周すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出したが、最外周すべてのスポットのみではなく、マイクロアレイ上の全てのスポットのバックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出して処理を行うこともできる。この場合には、より精度が高い判断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】マイクロアレイにおけるプローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡのスポットの配置の一態様を示す。
【図２】マイクロアレイの蛍光検出に用いる検出器の一態様を示す。
【図３】本発明において測定可と判断されるマイクロアレイと測定不可と判断されるマイクロアレイの蛍光画像を示す。
【図４】バックグラウンド値として輝度を測定する、スポットの中心から一定の範囲の位置を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な生物の遺伝子構造を明らかにするのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。マイクロアレイは、スライドガラス等の担体に多数のポリヌクレオチドを所定の領域毎に整列固定させた高密度のアレイであり、遺伝子の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多型性などの同時解析に非常に有用である。このマイクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに極めて有用である。
【０００３】
マイクロアレイを用いた検出では、まず担体表面に高密度に整列したプローブポリヌクレオチドに対して、放射性同位体や蛍光色素で標識したターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。このとき、プローブポリヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつターゲットポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドと相補的にハイブリダイズするが、ハイブリダイズしなかったポリヌクレオチドは洗浄により除去される。
【０００４】
マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションの検出では、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などにより誤判定が起こる場合がある。しかし、その誤判定か否かの判断は、マイクロアレイを使用するユーザーに委ねられており、非常にあいまいであった。このような状況では検出器と反応装置と組み合わせた自動装置で多数の試料を処理することは不可能であった。
【０００５】
特許文献１には、スポットの輝度が検出器の検出下限以下である場合や検出上限以上である場合に生じる判定誤差をなくすために、プローブＤＮＡを濃度を変えてスポットしたマイクロアレイを用い、特定の範囲の輝度を有するスポットの結果のみで判定する方法が記載されている。しかし、当該方法では、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを判定することはできない。
【０００６】
【特許文献１】特許０８８０３６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、プローブポリヌクレオチドが固定化されたスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを設けたマイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーション反応して洗浄した後に、まず基準スポットの蛍光を測定することによりマイクロアレイごとの信頼性を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
（１）マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び
４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。
【００１１】
（２）基準ポリヌクレオチドの蛍光標識とターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識が同一である、（１）記載の方法。
【００１２】
（３）マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが整列して配置されており、基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離と基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置が検出される、（１）又は（２）記載の方法。
【００１３】
（４）プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されており、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在する、（３）記載の方法。
【００１４】
（５）マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置されており、基準スポットがその対角線上の頂点に二箇所存在し、
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各スポット位置が検出される、（１）又は（２）記載の方法。
【００１５】
（６）工程２）の後かつ工程４）の前において、
すべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（７）工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（８）前記スポットの中心から一定の範囲が、スポットの中心位置から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内である（６）又は（７）に記載の方法。
【００１８】
（９）バックグラウンド代表値が、複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（１０）工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（１１）バックグラウンド代表値を、マイクロアレイにおけるスポット群の最外周に存在する複数のスポットのバックグラウンド値から算出することを特徴とする（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（１２）基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度が、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、マイクロアレイごとの信頼性が判定でき、信頼性のあるマイクロアレイを用いて測定を実施することができる。従って、誤判定を抑えることができる。また、自動反応装置などと組み合わせることで、自動でマイクロアレイの測定を高い信頼性をもって実施できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。
【００２４】
本発明においてポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが包含され、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸が包含される。ＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。また、核酸には、リン酸ジエステル部位を修飾した人工核酸；フラノース部位のグリコシル結合やヒドロキシル基を修飾した人工核酸；核酸塩基部位を修飾した人工核酸；および糖・リン酸骨格以外の構造を利用した人工核酸なども包含され、より具体的には、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型またはメチルホスホノチオエート型の人工核酸；フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、または多環式糖骨格型の人工核酸；ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型、または環拡張修飾塩基型の人工核酸などが包含される。
【００２５】
本発明においてプローブポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、目的遺伝子を検出するために用いられるポリヌクレオチドであって、目的遺伝子に対応するポリヌクレオチドまたはその断片と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさす。プローブポリヌクレオチドとしては、通常、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの（例えば、一本鎖を二本鎖に変性させたもの）等が用いられる。プローブポリヌクレオチドは、通常３〜５０００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基を有する。マイクロアレイに固定化するプローブポリヌクレオチドの濃度は、通常１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。
【００２６】
本発明においてターゲットポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、検出対象であるポリヌクレオチドをさす。ターゲットは標的と称される場合もある。通常、被検試料由来のポリヌクレオチドおよびそれを基にして酵素的に合成されたポリヌクレオチド、具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ａＲＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの等が用いられる。
【００２７】
ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、相補的な配列を持つポリヌクレオチド同士、例えば、一本鎖のＤＮＡ同士、一本鎖のＲＮＡ同士、または一本鎖のＤＮＡと一本鎖のＲＮＡが適切な条件下で二本鎖を形成することをいう。
【００２８】
本発明においては、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを用いる。標識方法や標識の種類は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されず、当技術分野で公知である。例えば、ターゲットポリヌクレオチドを合成または増幅する際に蛍光標識を共有結合させた基質（主にＵＴＰ）を取り込ませることにより、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを得ることができる。蛍光標識としては、Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられる。
【００２９】
本発明では、マイクロアレイとして、プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上、好ましくは少なくとも２箇所、より好ましくは２〜４箇所、さらに好ましくは２箇所有するマイクロアレイを用いる。基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度は、通常１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。
【００３０】
本発明においては、上記マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させ、洗浄により未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去した後、基準ポリヌクレオチドの蛍光を測定する。基準ポリヌクレオチドは蛍光標識を有することから、ターゲットポリヌクレオチドがハイブリダイズしなくとも蛍光が検出されるはずである。蛍光が検出されない、または蛍光の値が低いということは、基準ポリヌクレオチドがマイクロアレイから失われていること、すなわち、その他のプローブポリヌクレオチドも同様に失われていることを意味する。従って、基準ポリヌクレオチドの蛍光を測定し、所定の値を満たすかどうか判定することにより、マイクロアレイが劣化しているか否か、換言すればマイクロアレイの信頼性を判断することができる。
【００３１】
基準ポリヌクレオチドの蛍光標識は、特に制限されないが、ターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識と同じものを用いるのが好ましい。同じものを用いることで、同じ検出器を用いて双方の蛍光標識を一括して測定することができ、迅速且つ簡便に測定を実施できる。
【００３２】
本発明で用いるマイクロアレイにおいては、好ましくは、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットとが整列して、好ましくは格子状に配置されている。そして、好ましくは基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離及び基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置（スポットの中心）が検出される。より具体的には、基準スポットからの距離及び基準線からの角度（各スポットと基準スポットを結ぶ線と基準線とがなす角度）、並びに所望によりスポットピッチ等から各スポットの中心位置を決定することができる。
【００３３】
また、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットを、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置し、基準スポットをその対角線上の向かい合う頂点に二箇所存在させることができる。この場合には、それぞれの基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、この交点とそれぞれの二箇所の基準スポットを結ぶ二つの結線を検出する。そして、結線の長さを算出しこの距離を、あらかじめ決定されている（四角形の外周上のスポット数−１）の数で割ることで、結線上の各スポット間隔が求められ、このスポット間隔から各スポット位置を検出することができる。例えば、スポットが４行×４列のマイクロアレイを用いたとする。このときは結線上のスポット数は４点である。結線の長さが９００μｍだったとすると、９００÷（４−１）＝３００となり、スポット間隔は３００μｍとなる。これを用いて、基準スポットから結線上に３００μｍ移動したところをスポットの中心とすることができ、さらにこの中心から結線上に３００μｍ移動したところが次のスポットの中心となる。
【００３４】
基準線を構成する二箇所の基準スポットは、マイクロアレイ上に整列したスポット群において、遠い位置に存在することが好ましい。プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットは、外周が四角形の格子状に配置されており（例えば、図１）、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在することが好ましい。
【００３５】
プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットにおける蛍光を測定するための検出器としては、例えば、蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、マイクロアレイ上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型または非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、マイクロアレイ上に固定化されたプローブポリヌクレオチドに対して相補性を有するターゲットポリヌクレオチドを同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定したりすることが可能になる。
【００３６】
本発明の一実施形態では、マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程の後、実際の測定、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光の測定の前に、さらに以下の工程を実施することが好ましい。下記工程は、基準スポットにおける蛍光測定の前に実施してもよいし、後に実施してもよい。
【００３７】
複数、好ましくはすべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程。
【００３８】
ここで、スポットには、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットの双方が包含される。バックグラウンド値を得る複数のスポットとしては、マイクロアレイに整列して配置されたスポットのうち、少なくとも外周を形成するスポットすべてについてバックグラウンド値を測定することが好ましい。また、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定する必要はないが、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定してもよい。バックグラウンド値を測定する複数のスポットは、例えば、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されている場合、通常、少なくとも四角形の頂点の２スポット、好ましくは少なくとも四角形の頂点の４スポット、より好ましくは最外周のスポットすべてである。より具体的には、１６行×１６列のスポットであったときの最外周の６０スポット、又は１６行×１６列のスポットであったときの全スポットである２５６スポットである。
【００３９】
スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、バックグラウンド値とする際、中心から一定の範囲は、スポットの大きさとスポット間隔等に基づいて適宜設定される。例えば、図４に示すように、スポットの中心から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内とすることができる。例えば、スポット中心から７０μｍ以上で一辺が１０００μｍの四角形の範囲内、好ましくはスポット中心から７０μｍ以上で一辺が３８０μｍの四角形の範囲内である。また、一定の範囲の位置のスポット全て又は一部について輝度を測定した平均値をバックグラウンド値としてもよいし、一定の範囲の位置の一スポットのみの輝度を測定してそれをバックグラウンド値としてもよい。
【００４０】
スポットの中心の位置決め方法は特に制限されないが、例えば、各スポットにおいて、所定の蛍光強度（例えば、３０００以上）を有する部分を検出し、その部分の中心とすることができる。あるいは、二箇所の基準スポットの中心を結ぶ線を基準線とし、基準スポットからの距離及び基準線からの角度、並びにスポットピッチ等から各スポットの中心位置を決定してもよい。
【００４１】
バックグラウンド代表値は、測定した複数のバックグラウンド値を代表する値であれば特に制限されないが、好ましくは複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である。
【００４２】
すべてのスポットについて、又は、バックグラウンド値を測定した全てのスポットについてのバックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合は、スポット周囲のバックグラウンド値にばらつきが大きいと判定でき、従って、当該マイクロアレイは洗浄不良であり、信頼性に欠けることから測定不可と判断することができる。ここで、所定の値は、条件等によって異なるが、例えば、画像の表示が１６ビット諧調であるときは１０００以上に設定することができる。画像の表示が例えば８ビット諧調であるときは、１０００よりも小さい値を設定することになる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程の後、実際の測定、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光の測定の前に、さらに以下の工程を実施することが好ましい。下記工程は、基準スポットにおける蛍光測定の前に実施してもよいし、後に実施してもよい。
【００４４】
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程。
【００４５】
ここで、スポットには、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットの双方が包含される。バックグラウンド値を得る複数のスポットとしては、マイクロアレイに整列して配置されたスポットのうち、少なくとも外周を形成するスポットすべてについてバックグラウンド値を測定することが好ましい。また、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定する必要はないが、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定してもよい。バックグラウンド値を測定する複数のスポットは、例えば、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されている場合、通常、少なくとも四角形の頂点の２スポット、好ましくは少なくとも四角形の頂点の４スポット、より好ましくは最外周のスポットすべてである。より具体的には、１６行×１６列のスポットであったときの最外周の６０スポット、又は１６行×１６列のスポットであったときの全スポットである２５６スポットである。
【００４６】
スポットの中心から一定の距離、及び中心の決定方法については、上述のとおりである。
【００４７】
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値であるバックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には、スポット周囲のバックグラウンド値が全体的に大きいと判定でき、従って、当該マイクロアレイは洗浄不良であり、信頼性に欠けることから測定不可と判断することができる。ここで、所定の値は、条件等によって異なるが、例えば、１０００以上に設定することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１ 担体の調製
３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で２層のＤＬＣ層の製膜を行った。
【００５０】
【表１】
【００５１】
得られた表面にＤＬＣ層を有するシリコン基板上に、下記の条件でアンモニアプラズマを用いて、アミノ基を導入した。
【００５２】
【表２】
【００５３】
１４０ｍＭ 無水コハク酸及び０．１Ｍ ホウ酸ナトリウムを含む１−メチル−２−ピロリドン溶液に３０分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー、０．１Ｍ １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシイミドを含む溶液に３０分間浸漬し、活性化を行い、シリコン基板表面にＤＬＣ層及び化学修飾基としてのＮ−ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を得た。
【００５４】
実施例２ マイクロアレイの作製
プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡをそれぞれＳｏｌ．６に溶解し（２５０ｎＭ）、実施例１で作製した担体上に図１のような配置でスポット（日立ソフトウエア製 ＳＰＢＩＯ）した。基準ＤＮＡはＣｙＤｙｅ（Ｃｙ５）で標識されたものを用いた。スポットピッチは、２８０μｍとした。プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡにおけるＤＮＡの配列は、以下のとおりである。
プローブＤＮＡ：ＴＴＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＣＴＣ（配列番号１）
基準ＤＮＡ：ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴ（配列番号２）
【００５５】
６０℃で３時間ベーキングを実施した後に、次の手順で洗浄した。まず、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、室温で、攪拌しながら１５分間洗浄し、続いて、同溶液を用いて６０℃に加熱しながら５分間洗浄し、超純水にてリンスした。再度にエアーにて吹き付け乾燥し、プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡがスポットされたマイクロアレイを作製した。
【００５６】
上記実施例１及び２の手順に従って、２つのマイクロアレイ、すなわち、マイクロアレイ１及びマイクロアレイ２を作製した。
【００５７】
実施例３ ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション
ラムダファージのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プローブＤＮＡとハイブリダイズする領域を以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。
プライマー１：ＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＣ（配列番号３）
プライマー２：ＡＡＴＡＡＣＣＧＡＣＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣ（配列番号４）
標識は、ＣｙＤｙｅ（Ｃｙ５）を用いて行った。ＰＣＲ溶液の組成は以下のとおりとした。
【００５８】
【表３】
【００５９】
得られたＰＣＲ産物１μｌを、ハイブリダイズ溶液２μｌに溶かし（最終濃度１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液）、実施例２で作製したマイクロアレイ１及び２にそれぞれ滴下し、湿箱に入れて４５℃で１時間インキュベートした。２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、続いて２×ＳＳＣで洗浄し、乾燥した。
【００６０】
実施例４ マイクロアレイの信頼性の判定及びハイブリダイゼーションの検出
蛍光の測定は、図２に示すような検出器を用いて実施した。レーザーで励起光をマイクロアレイ全面に照射した。蛍光フィルターにより、目的の波長以外の波長を有する光をカットした。
【００６１】
まず、基準スポットの蛍光を測定した。基準スポットにおいて、８０００以上の蛍光強度を有する部分を検出し、その部分の中心を決定し、基準スポットの中心とした。基準スポットにおいて、８０００以上の蛍光強度が検出されなかった場合は、測定不可と判定することとした。マイクロアレイ１においては、基準スポット１（Ｙ＝８、Ｘ＝１）で８５００の蛍光強度が検出され、基準スポット２（Ｙ＝８、Ｘ＝８）で８１９７の蛍光強度が検出された。マイクロアレイ２においては、基準スポット１（Ｙ＝８、Ｘ＝１）で７１６８の蛍光強度が検出され、基準スポット２（Ｙ＝８、Ｘ＝８）で７２４３の蛍光強度が検出された。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
【００６２】
また、上記２つのマイクロアレイにおいて、二箇所の基準スポットの中心を結ぶ線を基準線とし、基準スポットからの距離及び基準線からの角度（各スポットと基準スポットを結ぶ線と基準線とがなす角度）、並びにスポットピッチから各スポットの中心位置を決定した。
【００６３】
なお、各スポットの中心位置から２２０μｍの位置以上から、スポット間隔（２８０μｍ）長を１辺とした四角形（中心はスポット中心と同じ）の内部で囲まれるピクセルの輝度をバックグラウンド値算出対象とすることができる。最外周の全スポットのバックグラウンド値を測定し、その平均値をバックグラウンド代表値として求めた。これが所定の値（１５００）より高い場合、マイクロアレイの洗浄不良と判断し、測定不可と判断することとした。
【００６４】
また、最外周すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出し、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットが存在する場合にもマイクロアレイの洗浄不良と判断し、測定不可と判断することとした。
【００６５】
最外周の全スポットのバックグラウンド値の測定結果、並びにバックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差を以下の表に示す。
【００６６】
【表４】
【００６７】
マイクロアレイ１では、最外周の全スポットのバックグラウンド値の平均値は３９１．５７であった。一方、マイクロアレイ２では、最外周の全スポットのバックグラウンド値の平均値は１８７１．１４であった。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
【００６８】
また最外周の全スポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差を測定した結果、マイクロアレイ１では、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットは存在しなかった。一方、マイクロアレイ２では、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットが存在した。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
【００６９】
マイクロアレイ１及び２の蛍光画像を図３に示す。マイクロアレイ２は洗浄不良であることが蛍光画像から明らかである。以上から、本発明の方法により、ユーザーが蛍光画像を見て判断することなく、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定できることが示された。
【００７０】
なお、上記実施例では最外周すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出したが、最外周すべてのスポットのみではなく、マイクロアレイ上の全てのスポットのバックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出して処理を行うこともできる。この場合には、より精度が高い判断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】マイクロアレイにおけるプローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡのスポットの配置の一態様を示す。
【図２】マイクロアレイの蛍光検出に用いる検出器の一態様を示す。
【図３】本発明において測定可と判断されるマイクロアレイと測定不可と判断されるマイクロアレイの蛍光画像を示す。
【図４】バックグラウンド値として輝度を測定する、スポットの中心から一定の範囲の位置を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び
４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
基準ポリヌクレオチドの蛍光標識とターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識が同一である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが整列して配置されており、基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離と基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置が検出される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されており、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置されており、基準スポットがその対角線上の頂点に二箇所存在し、
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各スポット位置が検出される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
工程２）の後かつ工程４）の前において、
すべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記スポットの中心から一定の範囲が、スポットの中心位置から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
バックグラウンド代表値が、複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
バックグラウンド代表値を、マイクロアレイにおけるスポット群の最外周に存在する複数のスポットのバックグラウンド値から算出することを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度が、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び
４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
基準ポリヌクレオチドの蛍光標識とターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識が同一である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが整列して配置されており、基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離と基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置が検出される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されており、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置されており、基準スポットがその対角線上の頂点に二箇所存在し、
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各スポット位置が検出される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
工程２）の後かつ工程４）の前において、
すべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記スポットの中心から一定の範囲が、スポットの中心位置から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
バックグラウンド代表値が、複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
バックグラウンド代表値を、マイクロアレイにおけるスポット群の最外周に存在する複数のスポットのバックグラウンド値から算出することを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度が、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２３６６２６（Ｐ２００９−２３６６２６Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８１７７３（Ｐ２００８−８１７７３）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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