マイクロＲＮＡの検出方法、これに用いられるマイクロアレイおよびキット
【課題】簡便な手順で、高い配列相同性を有するｍｉＲＮＡをそれぞれ検出することができ、さらに検出感度も良好であるマイクロＲＮＡの検出方法を提供する。
【解決手段】ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ、逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法である。
【解決手段】ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ、逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法、およびこの方法に用いるマイクロアレイならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ以外のＲＮＡ（非コードＲＮＡ）の一つであり、遺伝子の発現を抑制する働きがある機能性ＲＮＡの一種として知られている。ｍｉＲＮＡは、植物、動物の発達、アポトーシス、脂肪代謝、生育調節、造血分化において重要な役割を果たすことが報告されているが、遺伝子発現調節の機構は明らかにされていない。
【０００３】
非特許文献１には、ＲＮＡサンプルに含まれるｍｉＲＮＡを検出する手法として、ガラス基板上に固定化したＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた後、エキソヌクレアーゼＩにてハイブリダイズしなかったＤＮＡ断片を分解し、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用いて、固体表面でＤＮＡ断片を鋳型にし、ｍｉＲＮＡをプライマーとした伸長反応を行うＲＡＫＥ（RNA-primed, array-based Klenow enzyme）アッセイが開示されている。
【０００４】
非特許文献２には、ｍｉＲＮＡの３'末端にラベル化シチジル酸を導入し、ラベル化されたｍｉＲＮＡと、固相基板の表面に固定化されたＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせた後、ＤＮＡプローブの５'末端にグアニル酸を挿入して、ラベル化シチジル酸をＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成に利用することにより、ｍｉＲＮＡを検出する方法が開示されている。
【非特許文献１】Nature Methods Vol. 1, No. 2, p155-161 (2004)
【非特許文献２】RNA 13(1), p151-159 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、ｍｉＲＮＡは約２２塩基程度の一本鎖核酸であって、サイズが小さく、かつ、ｍｉＲＮＡ同士が高い配列相同性を有することから、各ｍｉＲＮＡに特異的な反応を起こすことが困難である。また、通常サンプル中の存在量が非常に小さいため、検出の感度も小さい。以上のことにより、通常のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの検出に用いられる技術を適用したとしても、ｍｉＲＮＡの検出は困難である。また、例えば非特許文献２に記載のような特殊な伸長反応を固定ＤＮＡプライマー上で行うに際して、操作が複雑になり、ある程度の技能が要求されることもある。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、簡便な手順で、高い配列相同性を有するｍｉＲＮＡをそれぞれ検出することができ、さらに検出感度も良好なマイクロＲＮＡの検出方法、およびこれに用いられるマイクロアレイならびにキットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ、
逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い、
伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（２）（１）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板の表面は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（３）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、当該固定ＤＮＡプライマーの３'末端に１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（４）（３）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記モノヌクレオチドとして、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体を混在させて、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体または２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体による１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（５）（４）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（６）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（７）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（８）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（９）（２）または（８）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（１０）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（１１）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されていることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（１２）ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるマイクロアレイであって、
各アレイは、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に設けられ、
複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定させて構成されることを特徴とするマイクロアレイ；
（１３）（１２）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ；
（１４）（１３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロアレイ；
（１５）（１３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロアレイ；
（１６）（１３）または（１５）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロアレイ；
（１７）（１３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロアレイ；
（１８）ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるキットであって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板と、
逆転写酵素と、
モノヌクレオチドと
を含むキット；
（１９）（１８）に記載のキットにおいて、
前記モノヌクレオチドの中に、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体が含まれることを特徴とするキット；
（２０）（１９）に記載のキットにおいて、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするキット；
（２１）（１８）に記載のキットにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするキット；
（２２）（２１）に記載のキットにおいて、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするキット；
（２３）（２１）に記載のキットにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするキット；
（２４）（２１）に記載のキットにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするキット；
（２５）（２１）または（２４）に記載のキットにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするキット；
（２６）（２１）に記載のキットにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするキット；
（２７）（２１）に記載のキットにおいて、
前記基板には、複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されているマイクロアレイが形成されることを特徴とするキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便な手順で、高い配列相同性を有するｍｉＲＮＡをそれぞれ検出することができ、さらに検出感度も良好なマイクロＲＮＡの検出方法、およびこれに用いられるマイクロアレイならびにキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本実施形態に係るマイクロＲＮＡの検出方法は、ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ（第一の段階）、逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い（第二の段階）、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出する（第三の段階）ことを特徴としている。
【００１０】
（第一の段階）
第一の段階は、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させるステップである。
【００１１】
本実施形態で使用される基板の表面は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することが好ましい。
【００１２】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００１３】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１４】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１５】
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリン基を下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
【００１６】
【化１】
【００１７】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００１８】
カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；等の基を有することができる。
【００１９】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００２０】
【化２】
【００２１】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００２２】
【化３】
【００２３】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２４】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２５】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【００２６】
【化４】
【００２７】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２８】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００２９】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３０】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００３１】
表面にプライマーが固定化される基板の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組合せとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００３２】
また、本実施形態で使用することができる基板のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００３３】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３４】
【化５】
【００３５】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３６】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基板上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。
【００３７】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３８】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００３９】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００４０】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００４１】
なお、ここでは、本実施形態で用いることができる基板として、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものを説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００４２】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００４３】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４４】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４５】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４６】
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４７】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグラウンドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【００４８】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００４９】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５０】
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００５１】
次に、基板の表面へのプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００５２】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーを基板上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００５３】
このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００５４】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５５】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００５６】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００５７】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５８】
また、基板に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００５９】
以上により、本実施形態で使用することができる基板が得られる。この基板は、表面上にプライマーが固定化されている。また、基板の表面に設けられる反応空間としては、ウェル、液体流路などＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことができる反応空間を提供できれば、どのような形状であってもよい。また、プライマーの長さは、目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００６０】
また、本実施形態において、基板では、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成してもよい。この各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定することができる。基板をこのようなアレイ状にすることで、複数のアッセイを同時に行うことができ、スクリーニングなどが可能になる。
【００６１】
このような観点から、本発明は、前述したようなマイクロアレイを提供する。すなわち、このマイクロアレイは、ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるマイクロアレイであって、各アレイは、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に設けられ、複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定させて構成されることを特徴としている。
【００６２】
固定ＤＮＡプライマーは、例えば配列番号４５６で示されるようなスペーサ配列（5'-CTTTGGACC-3'）を介して、前述したような基板の表面で固定化される。また、このような固定ＤＮＡプライマーは、マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な配列を有する。特に、高い相同性を有するマイクロＲＮＡ同士を分離して検出する観点から、それぞれの固定ＤＮＡプライマーにおいて、１０塩基連続した共通配列がないように、または５'末端から４塩基（４塩基目を含む）から３'末端にかけて、少なくとも一点の変異点を存在するように、固定ＤＮＡプライマーの配列を設計することが好ましい。また、後述するような各マイクロＲＮＡに特異的な伸長反応をより確実に起こすという観点から、ＤＮＡプライマーはマイクロＲＮＡ配列の中でも比較的特異性の高い３'側の相補鎖から始まり、５'側の途中に存在するＡまたはＵの塩基の一つ手前までの相補鎖となるように設計することが好ましい。
【００６３】
このような観点から、本実施形態で使用するヒトの各マイクロＲＮＡ（human_miRNA）について、固定ＤＮＡプライマーの配列（probe_for_miRNA）と、この固定ＤＮＡプライマーが実際に基板上に固定化されるときの配列、すなわち固定ＤＮＡプライマーの５'末端にスペーサ配列（5'-spacer_sequence）を付加して得られる配列（probe_sequence_on_chip）との例を挙げる。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
【表６】
【００７０】
【表７】
【００７１】
【表８】
【００７２】
【表９】
【００７３】
【表１０】
【００７４】
また、ＲＮＡを含む試料としては、マイクロＲＮＡを含む試料、マイクロＲＮＡとその前駆体との両方のスモールＲＮＡを含む試料、トータルＲＮＡを含む試料が挙げられ、中でもマイクロＲＮＡを含む試料、スモールＲＮＡを含む試料が好ましく用いられる。
【００７５】
（第二の段階）
第二の段階は、第一の段階でＲＮＡを含む試料が導入された基板表面において、逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行うステップである。
【００７６】
ここで、逆転写酵素と一緒に存在させるモノヌクレオチドとしては、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸（ｄｄＡＴＰ）あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸（ｄｄＴＴＰ）あるいはその誘導体が挙げられる。前述したように、ＤＮＡプライマーの３'末端に相補的なマイクロＲＮＡの配列部分の５'末端側に一塩基隣りの配列がＡまたはＵとなるように、ＤＮＡプライマーを設計することにより、マイクロＲＮＡの配列と相補的な配列を有する、伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、当該固定ＤＮＡプライマーの３'末端に１塩基のみの伸長を行うことができる。
【００７７】
本発明者等により、ＤＮＡプライマーの伸長反応を１塩基のみの伸長反応とすることにより、各マイクロＲＮＡと対応するＤＮＡプライマーに特異的な反応を、より確実に起こすことが可能であることが、見出されている。すなわち、図１に示したように、基板１０の表面で、マイクロＲＮＡ鎖１２を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー１１を一塩基分のみ伸長反応を行うことにより、非特異的な伸長反応を抑えることが可能になる。
【００７８】
また、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸（ｄｄＡＴＰ）あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸（ｄｄＴＴＰ）あるいはその誘導体を、標識化しておくことが好ましい。これにより、固定ＤＮＡプライマーの伸長反応に際して、伸長反応が起こったプライマーに標識を導入することが可能になり、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することが容易になる。また、標識化の方法としては、蛍光化合物であるＣｙ３、Ｃｙ５の導入の方法、他の光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ddATP、P32-ddTTP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などが挙げられる。
【００７９】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合したｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ（例えば、biotin-ddATP、DIG-ddATP）を使用し、伸長反応後、蛍光標識化したアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによって、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーに標識が導入され、このＤＮＡプライマーを検出することができる。
【００８０】
（第三の段階）
第三の段階は、第二の段階で伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出するステップである。
第二の段階にて伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出する。特に、伸長反応により標識化された固定ＤＮＡプライマーを検出する場合には、それぞれの標識を検出するための通常の方法を採用することができる。
【００８１】
このようにして、第一の段階で導入された試料にマイクロＲＮＡまたはその前駆体であるスモールＲＮＡが含まれている場合、第二の段階ではマイクロＲＮＡの配列の一部と相補的な配列を含む固定ＤＮＡプライマーで伸長反応が起こり、第三の段階では、この伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーが検出される。
【００８２】
また、別の側面から、本発明はＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるキットを提供する。すなわち、このキットは、詳述してきたような、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板と、逆転写酵素と、モノヌクレオチドとを含む。
【００８３】
非特許文献１に記載の技術では、エキソヌクレアーゼを作用させて不要なＤＮＡ断片を分解する関係で、マイクロＲＮＡと、ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる必要があるが、ハイブリダイズは非特異的な反応が起こりやすくなり、反応時間も長くとる必要がある。これに対して、本発明では、特別にハイブリダイズの操作を設ける必要はなく、さらに適切な固定ＤＮＡプライマーの配列を設計することにより、検出されるマイクロＲＮＡと固定ＤＮＡプライマーとの間で特異的に伸長反応を起こすことが可能になり、マイクロＲＮＡの検出が容易に、かつ、より確実になる。
【００８４】
また、非特許文献２に記載の技術では、特殊な反応系によりラベル化されたマイクロＲＮＡと、基板表面に固定化されたＤＮＡプローブとを、特殊な溶液中でハイブリダイズさせることにより実現される。また、非特許文献２には、検出のために高感度で大きなダイナミックレンジの装置が必要になると記載されている。したがって、反応操作が煩雑となり、熟練した技能が要求されるとともに、コストがかかる。これに対して、本発明では、特殊な操作や検出のための装置は必要ではなく、簡便な操作によりマイクロＲＮＡの検出が可能になる。
【００８５】
以上のように、具体的なＤＮＡプローブの配列、標識化の方法などを挙げながら説明したが、本発明はこれらに限定されることはなく、検出対象となるマイクロＲＮＡに応じて、適宜変更することが可能である。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
図１に示したように、基板１０の表面に固定ＤＮＡプライマー１１を固定化させた。固定ＤＮＡプライマー１１としては、配列番号１４（asD_h100_2）、５１（asD_h148b_2）、７（asD_hl7d_2）、１５５（asD_h30a_3p_2）、１３５（asD_h26b_3）、１６３（asD_h30e_3p_2）、５（asD_hl7c_2）、１２（asD_hl7i_2）、４２（*asD_h141_2*）番の配列を有する各断片を使用した。次に、この基板の表面に、ＲＮＡを含有する試料を接触させた。このとき、ＲＮＡを含有する試料としては、各ＤＮＡプライマーに対応するｍｉＲＮＡを合成したものを、次に述べる分子数になるように調製して混合した試料を用いた。導入するＲＮＡの分子数は、配列番号４２の配列を有する固定ＤＮＡプライマー用の合成ＲＮＡでは１femtoモルとし、その他の固定ＤＮＡプライマーでの反応用には、１、１０、１００、１０００、１００００attoモル（１attoモルは、６×１０5分子）と合成ＲＮＡの量を変動させて行った。続いて、この基板の表面に、逆転写酵素、およびモノヌクレオチドとしてビオチン化ｄｄＡＴＰおよびビオチン化ｄｄＵＴＰを含む溶液を導入し、伸長反応を行った。伸長反応の条件としては、反応溶液の組成は下記のとおりであり、反応時間は４２℃、反応時間は２ｈｒであった。
【表１１】
【００８７】
結果を、図２に示す。
図２によれば、いずれの系、すなわち固定ＤＮＡプライマーにおいても、１０attoモルのＲＮＡ導入量において、一般にバックグラウンドと考えられているシグナル強度１００を上回っており、感度の観点から検出可能であることが示唆される結果が得られた。中には、１attoモルのレベルでも、検出可能なマイクロＲＮＡも存在することがわかった。
【００８８】
非特許文献１では、１０7個（すなわち、約１００attoモル）の分子数レベルでＲＮＡを含む試料を導入しても、マイクロＲＮＡを検出する際のシグナル強度が、バックグラウンドとして考えられるシグナル強度１００を下回っており、マイクロＲＮＡの検出には感度の面から必ずしも十分であるとは言えない。
【００８９】
（実施例２）
固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号９０（asD_h196a_3）、９２（asD_h196b_3）番の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４５７番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図３に示す。
【００９０】
配列番号９０と、配列番号９２とでは、３'末端から４塩基の部分のみが互いに異なる固定ＤＮＡプライマーであるところ、図３によれば、１０attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルで、配列番号９０の固定ＤＮＡプライマーについてのみ起こった特異的な伸長反応が検出されたことが示されている。このように、同じターゲットのマイクロＲＮＡを、１塩基が異なるだけの固定ＤＮＡプライマーのそれぞれと反応させたときに、特異的な伸長反応のみを起こして、かつ、当該特異的な伸長反応を検出することができる。
【００９１】
（実施例３）
固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号１３７（miR-27a）、１３８（miR-27b）番の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４５９番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図４および図５に示す。図５は、図４において、導入されたマイクロＲＮＡの分子数が１から１００attoモルである部分を拡大したグラフである。
【００９２】
配列番号１３７と、配列番号１３８とでは、連続する１０塩基が同一配列であるが、図５によれば、１０attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルで、配列番号１３７の固定ＤＮＡプライマーについてのみ起こった特異的な伸長反応が検出されたことが示されている。このように、共通する配列が１０塩基長程度あったとしても、その共通配列部分の外側の配列によって特異性を上げることが可能な場合には、特異的な伸長反応のみを起こして、かつ、当該特異的な伸長反応を検出することができる。
【００９３】
（実施例４）
固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号６６（miR-181a）、６７（miR-181b）、６８（miR-181c）、６９（miR-181d）番の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４６０番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図６および図７に示す。図７は、図６において、導入されたマイクロＲＮＡの分子数が１から１００attoモルである部分を拡大したグラフである。
【００９４】
配列番号６６から６９では、５'末端またはその近傍の連続する６塩基の配列と、３'末端から連続する４塩基の部分とが共通配列であり、両共通配列部分間の長さおよび５'末端の配列が互いに異なる固定ＤＮＡプライマーであるところ、図６によれば１０００attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルでそれぞれのプライマーについて特異的な伸長反応が検出され、特に図７によれば、１０attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルで、配列番号６６の固定ＤＮＡプライマーについてのみ起こった特異的な伸長反応が検出されたことが示されている。このように、同じターゲットのマイクロＲＮＡを、共通する塩基配列が複数部分存在するが、互いに異なる配列を有する固定ＤＮＡプライマーのそれぞれと反応させたときに、特異的な伸長反応のみを起こして、かつ、当該特異的な伸長反応を検出することができる。
【００９５】
（実施例５−１）
互いに相同性が高いことで知られているlet-7のマイクロＲＮＡのプローブファミリーについて、伸長反応を行った。すなわち、固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号１（asD_hl7a_2）、３（asD_hl7b_2）、５（asD_hl7c_2）、７（asD_hl7d_2）、８（asD_hl7e_2）、９（asD_hl7f_2）、１１（asD_hl7g_2）、１２（asD_hl7i_2）の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４５８番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図８に示す。
【００９６】
（実施例５−２）
実施例５−１と同じマイクロＲＮＡのプローブファミリーについて、実施例５−１で用いた固定ＤＮＡプライマーよりも短いプライマーを用いて、実施例５−１と同様にマイクロＲＮＡの検出を行った。すなわち、実施例５−２において固定ＤＮＡプライマーとして用いた断片は、配列番号２（asD_hl7a_3）、４（asD_hl7b_3）、６（asD_hl7c_3）、４６１（asD_hl7d_3）、４６２（asD_hl7e_3）、１０（asD_hl7f_3）、４６３（asD_hl7g_3）、４６４（asD_hl7i_3）であった。結果を図９に示す。
【００９７】
実施例５−１および５−２で固定ＤＮＡプライマーとして用いたＤＮＡ配列は、１塩基または２塩基が互いに異なるものである。配列番号１、５の固定ＤＮＡプライマー間では、実施例５−１においてはシグナル強度において有意な差異を認めることが困難であったところ、実施例５−２では、固定ＤＮＡプライマーの３'末端側を短くしただけで、有意な差異を認めることができた。
【００９８】
（実施例６）
市販されているヒトのトータルＲＮＡを含む試料と、ヒトの腎臓細胞、脳細胞および肝臓細胞から、それぞれスモールＲＮＡ分画を精製して得られた試料とを準備して、それぞれについて共通する５３種類の固定ＤＮＡプライマーにて伸長反応を行った。トータルＲＮＡを試料として用いたときのシグナル強度と、スモールＲＮＡを試料として用いたときのシグナル強度との関係を、図１０に示す。図１０において、縦（Ｙ）軸はスモールＲＮＡより検出されたシグナル強度を示し、横（Ｘ）軸はトータルＲＮＡより検出されたシグナル強度を示す。
【００９９】
図１０によれば、スモールＲＮＡより検出されたシグナル強度と、トータルＲＮＡより検出されたシグナル強度との間には、相関関係があり、および一般に、トータルＲＮＡを試料として用いたときよりも、スモールＲＮＡを試料として用いたときの方が、シグナル強度が大きいことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明の実施形態の伸長反応を説明する模式図である。
【図２】本発明の一実施例の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図５】図４の一部を拡大して示すグラフである。
【図６】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図７】図５の一部を拡大して示すグラフである。
【図８】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図９】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０１】
１０ 基板
１１ 固定ＤＮＡプライマー
１２ マイクロＲＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法、およびこの方法に用いるマイクロアレイならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ以外のＲＮＡ（非コードＲＮＡ）の一つであり、遺伝子の発現を抑制する働きがある機能性ＲＮＡの一種として知られている。ｍｉＲＮＡは、植物、動物の発達、アポトーシス、脂肪代謝、生育調節、造血分化において重要な役割を果たすことが報告されているが、遺伝子発現調節の機構は明らかにされていない。
【０００３】
非特許文献１には、ＲＮＡサンプルに含まれるｍｉＲＮＡを検出する手法として、ガラス基板上に固定化したＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた後、エキソヌクレアーゼＩにてハイブリダイズしなかったＤＮＡ断片を分解し、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用いて、固体表面でＤＮＡ断片を鋳型にし、ｍｉＲＮＡをプライマーとした伸長反応を行うＲＡＫＥ（RNA-primed, array-based Klenow enzyme）アッセイが開示されている。
【０００４】
非特許文献２には、ｍｉＲＮＡの３'末端にラベル化シチジル酸を導入し、ラベル化されたｍｉＲＮＡと、固相基板の表面に固定化されたＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせた後、ＤＮＡプローブの５'末端にグアニル酸を挿入して、ラベル化シチジル酸をＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成に利用することにより、ｍｉＲＮＡを検出する方法が開示されている。
【非特許文献１】Nature Methods Vol. 1, No. 2, p155-161 (2004)
【非特許文献２】RNA 13(1), p151-159 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、ｍｉＲＮＡは約２２塩基程度の一本鎖核酸であって、サイズが小さく、かつ、ｍｉＲＮＡ同士が高い配列相同性を有することから、各ｍｉＲＮＡに特異的な反応を起こすことが困難である。また、通常サンプル中の存在量が非常に小さいため、検出の感度も小さい。以上のことにより、通常のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの検出に用いられる技術を適用したとしても、ｍｉＲＮＡの検出は困難である。また、例えば非特許文献２に記載のような特殊な伸長反応を固定ＤＮＡプライマー上で行うに際して、操作が複雑になり、ある程度の技能が要求されることもある。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、簡便な手順で、高い配列相同性を有するｍｉＲＮＡをそれぞれ検出することができ、さらに検出感度も良好なマイクロＲＮＡの検出方法、およびこれに用いられるマイクロアレイならびにキットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ、
逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い、
伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（２）（１）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板の表面は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（３）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、当該固定ＤＮＡプライマーの３'末端に１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（４）（３）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記モノヌクレオチドとして、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体を混在させて、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体または２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体による１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（５）（４）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（６）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（７）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（８）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（９）（２）または（８）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（１０）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（１１）（２）に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されていることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法；
（１２）ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるマイクロアレイであって、
各アレイは、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に設けられ、
複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定させて構成されることを特徴とするマイクロアレイ；
（１３）（１２）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ；
（１４）（１３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロアレイ；
（１５）（１３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロアレイ；
（１６）（１３）または（１５）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロアレイ；
（１７）（１３）に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロアレイ；
（１８）ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるキットであって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板と、
逆転写酵素と、
モノヌクレオチドと
を含むキット；
（１９）（１８）に記載のキットにおいて、
前記モノヌクレオチドの中に、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体が含まれることを特徴とするキット；
（２０）（１９）に記載のキットにおいて、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするキット；
（２１）（１８）に記載のキットにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするキット；
（２２）（２１）に記載のキットにおいて、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするキット；
（２３）（２１）に記載のキットにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするキット；
（２４）（２１）に記載のキットにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするキット；
（２５）（２１）または（２４）に記載のキットにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするキット；
（２６）（２１）に記載のキットにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするキット；
（２７）（２１）に記載のキットにおいて、
前記基板には、複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されているマイクロアレイが形成されることを特徴とするキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便な手順で、高い配列相同性を有するｍｉＲＮＡをそれぞれ検出することができ、さらに検出感度も良好なマイクロＲＮＡの検出方法、およびこれに用いられるマイクロアレイならびにキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本実施形態に係るマイクロＲＮＡの検出方法は、ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ（第一の段階）、逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い（第二の段階）、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出する（第三の段階）ことを特徴としている。
【００１０】
（第一の段階）
第一の段階は、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させるステップである。
【００１１】
本実施形態で使用される基板の表面は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することが好ましい。
【００１２】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００１３】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１４】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１５】
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリン基を下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
【００１６】
【化１】
【００１７】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００１８】
カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；等の基を有することができる。
【００１９】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００２０】
【化２】
【００２１】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００２２】
【化３】
【００２３】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２４】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２５】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【００２６】
【化４】
【００２７】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２８】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００２９】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３０】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００３１】
表面にプライマーが固定化される基板の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組合せとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００３２】
また、本実施形態で使用することができる基板のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００３３】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３４】
【化５】
【００３５】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３６】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基板上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。
【００３７】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３８】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００３９】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００４０】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００４１】
なお、ここでは、本実施形態で用いることができる基板として、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものを説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００４２】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００４３】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４４】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４５】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４６】
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４７】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグラウンドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【００４８】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００４９】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５０】
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００５１】
次に、基板の表面へのプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００５２】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーを基板上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００５３】
このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００５４】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５５】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００５６】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００５７】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５８】
また、基板に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００５９】
以上により、本実施形態で使用することができる基板が得られる。この基板は、表面上にプライマーが固定化されている。また、基板の表面に設けられる反応空間としては、ウェル、液体流路などＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことができる反応空間を提供できれば、どのような形状であってもよい。また、プライマーの長さは、目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００６０】
また、本実施形態において、基板では、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成してもよい。この各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定することができる。基板をこのようなアレイ状にすることで、複数のアッセイを同時に行うことができ、スクリーニングなどが可能になる。
【００６１】
このような観点から、本発明は、前述したようなマイクロアレイを提供する。すなわち、このマイクロアレイは、ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるマイクロアレイであって、各アレイは、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に設けられ、複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定させて構成されることを特徴としている。
【００６２】
固定ＤＮＡプライマーは、例えば配列番号４５６で示されるようなスペーサ配列（5'-CTTTGGACC-3'）を介して、前述したような基板の表面で固定化される。また、このような固定ＤＮＡプライマーは、マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な配列を有する。特に、高い相同性を有するマイクロＲＮＡ同士を分離して検出する観点から、それぞれの固定ＤＮＡプライマーにおいて、１０塩基連続した共通配列がないように、または５'末端から４塩基（４塩基目を含む）から３'末端にかけて、少なくとも一点の変異点を存在するように、固定ＤＮＡプライマーの配列を設計することが好ましい。また、後述するような各マイクロＲＮＡに特異的な伸長反応をより確実に起こすという観点から、ＤＮＡプライマーはマイクロＲＮＡ配列の中でも比較的特異性の高い３'側の相補鎖から始まり、５'側の途中に存在するＡまたはＵの塩基の一つ手前までの相補鎖となるように設計することが好ましい。
【００６３】
このような観点から、本実施形態で使用するヒトの各マイクロＲＮＡ（human_miRNA）について、固定ＤＮＡプライマーの配列（probe_for_miRNA）と、この固定ＤＮＡプライマーが実際に基板上に固定化されるときの配列、すなわち固定ＤＮＡプライマーの５'末端にスペーサ配列（5'-spacer_sequence）を付加して得られる配列（probe_sequence_on_chip）との例を挙げる。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
【表６】
【００７０】
【表７】
【００７１】
【表８】
【００７２】
【表９】
【００７３】
【表１０】
【００７４】
また、ＲＮＡを含む試料としては、マイクロＲＮＡを含む試料、マイクロＲＮＡとその前駆体との両方のスモールＲＮＡを含む試料、トータルＲＮＡを含む試料が挙げられ、中でもマイクロＲＮＡを含む試料、スモールＲＮＡを含む試料が好ましく用いられる。
【００７５】
（第二の段階）
第二の段階は、第一の段階でＲＮＡを含む試料が導入された基板表面において、逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行うステップである。
【００７６】
ここで、逆転写酵素と一緒に存在させるモノヌクレオチドとしては、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸（ｄｄＡＴＰ）あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸（ｄｄＴＴＰ）あるいはその誘導体が挙げられる。前述したように、ＤＮＡプライマーの３'末端に相補的なマイクロＲＮＡの配列部分の５'末端側に一塩基隣りの配列がＡまたはＵとなるように、ＤＮＡプライマーを設計することにより、マイクロＲＮＡの配列と相補的な配列を有する、伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、当該固定ＤＮＡプライマーの３'末端に１塩基のみの伸長を行うことができる。
【００７７】
本発明者等により、ＤＮＡプライマーの伸長反応を１塩基のみの伸長反応とすることにより、各マイクロＲＮＡと対応するＤＮＡプライマーに特異的な反応を、より確実に起こすことが可能であることが、見出されている。すなわち、図１に示したように、基板１０の表面で、マイクロＲＮＡ鎖１２を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー１１を一塩基分のみ伸長反応を行うことにより、非特異的な伸長反応を抑えることが可能になる。
【００７８】
また、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸（ｄｄＡＴＰ）あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸（ｄｄＴＴＰ）あるいはその誘導体を、標識化しておくことが好ましい。これにより、固定ＤＮＡプライマーの伸長反応に際して、伸長反応が起こったプライマーに標識を導入することが可能になり、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することが容易になる。また、標識化の方法としては、蛍光化合物であるＣｙ３、Ｃｙ５の導入の方法、他の光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ddATP、P32-ddTTP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などが挙げられる。
【００７９】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合したｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ（例えば、biotin-ddATP、DIG-ddATP）を使用し、伸長反応後、蛍光標識化したアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによって、伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーに標識が導入され、このＤＮＡプライマーを検出することができる。
【００８０】
（第三の段階）
第三の段階は、第二の段階で伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出するステップである。
第二の段階にて伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出する。特に、伸長反応により標識化された固定ＤＮＡプライマーを検出する場合には、それぞれの標識を検出するための通常の方法を採用することができる。
【００８１】
このようにして、第一の段階で導入された試料にマイクロＲＮＡまたはその前駆体であるスモールＲＮＡが含まれている場合、第二の段階ではマイクロＲＮＡの配列の一部と相補的な配列を含む固定ＤＮＡプライマーで伸長反応が起こり、第三の段階では、この伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーが検出される。
【００８２】
また、別の側面から、本発明はＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるキットを提供する。すなわち、このキットは、詳述してきたような、親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板と、逆転写酵素と、モノヌクレオチドとを含む。
【００８３】
非特許文献１に記載の技術では、エキソヌクレアーゼを作用させて不要なＤＮＡ断片を分解する関係で、マイクロＲＮＡと、ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる必要があるが、ハイブリダイズは非特異的な反応が起こりやすくなり、反応時間も長くとる必要がある。これに対して、本発明では、特別にハイブリダイズの操作を設ける必要はなく、さらに適切な固定ＤＮＡプライマーの配列を設計することにより、検出されるマイクロＲＮＡと固定ＤＮＡプライマーとの間で特異的に伸長反応を起こすことが可能になり、マイクロＲＮＡの検出が容易に、かつ、より確実になる。
【００８４】
また、非特許文献２に記載の技術では、特殊な反応系によりラベル化されたマイクロＲＮＡと、基板表面に固定化されたＤＮＡプローブとを、特殊な溶液中でハイブリダイズさせることにより実現される。また、非特許文献２には、検出のために高感度で大きなダイナミックレンジの装置が必要になると記載されている。したがって、反応操作が煩雑となり、熟練した技能が要求されるとともに、コストがかかる。これに対して、本発明では、特殊な操作や検出のための装置は必要ではなく、簡便な操作によりマイクロＲＮＡの検出が可能になる。
【００８５】
以上のように、具体的なＤＮＡプローブの配列、標識化の方法などを挙げながら説明したが、本発明はこれらに限定されることはなく、検出対象となるマイクロＲＮＡに応じて、適宜変更することが可能である。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
図１に示したように、基板１０の表面に固定ＤＮＡプライマー１１を固定化させた。固定ＤＮＡプライマー１１としては、配列番号１４（asD_h100_2）、５１（asD_h148b_2）、７（asD_hl7d_2）、１５５（asD_h30a_3p_2）、１３５（asD_h26b_3）、１６３（asD_h30e_3p_2）、５（asD_hl7c_2）、１２（asD_hl7i_2）、４２（*asD_h141_2*）番の配列を有する各断片を使用した。次に、この基板の表面に、ＲＮＡを含有する試料を接触させた。このとき、ＲＮＡを含有する試料としては、各ＤＮＡプライマーに対応するｍｉＲＮＡを合成したものを、次に述べる分子数になるように調製して混合した試料を用いた。導入するＲＮＡの分子数は、配列番号４２の配列を有する固定ＤＮＡプライマー用の合成ＲＮＡでは１femtoモルとし、その他の固定ＤＮＡプライマーでの反応用には、１、１０、１００、１０００、１００００attoモル（１attoモルは、６×１０5分子）と合成ＲＮＡの量を変動させて行った。続いて、この基板の表面に、逆転写酵素、およびモノヌクレオチドとしてビオチン化ｄｄＡＴＰおよびビオチン化ｄｄＵＴＰを含む溶液を導入し、伸長反応を行った。伸長反応の条件としては、反応溶液の組成は下記のとおりであり、反応時間は４２℃、反応時間は２ｈｒであった。
【表１１】
【００８７】
結果を、図２に示す。
図２によれば、いずれの系、すなわち固定ＤＮＡプライマーにおいても、１０attoモルのＲＮＡ導入量において、一般にバックグラウンドと考えられているシグナル強度１００を上回っており、感度の観点から検出可能であることが示唆される結果が得られた。中には、１attoモルのレベルでも、検出可能なマイクロＲＮＡも存在することがわかった。
【００８８】
非特許文献１では、１０7個（すなわち、約１００attoモル）の分子数レベルでＲＮＡを含む試料を導入しても、マイクロＲＮＡを検出する際のシグナル強度が、バックグラウンドとして考えられるシグナル強度１００を下回っており、マイクロＲＮＡの検出には感度の面から必ずしも十分であるとは言えない。
【００８９】
（実施例２）
固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号９０（asD_h196a_3）、９２（asD_h196b_3）番の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４５７番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図３に示す。
【００９０】
配列番号９０と、配列番号９２とでは、３'末端から４塩基の部分のみが互いに異なる固定ＤＮＡプライマーであるところ、図３によれば、１０attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルで、配列番号９０の固定ＤＮＡプライマーについてのみ起こった特異的な伸長反応が検出されたことが示されている。このように、同じターゲットのマイクロＲＮＡを、１塩基が異なるだけの固定ＤＮＡプライマーのそれぞれと反応させたときに、特異的な伸長反応のみを起こして、かつ、当該特異的な伸長反応を検出することができる。
【００９１】
（実施例３）
固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号１３７（miR-27a）、１３８（miR-27b）番の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４５９番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図４および図５に示す。図５は、図４において、導入されたマイクロＲＮＡの分子数が１から１００attoモルである部分を拡大したグラフである。
【００９２】
配列番号１３７と、配列番号１３８とでは、連続する１０塩基が同一配列であるが、図５によれば、１０attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルで、配列番号１３７の固定ＤＮＡプライマーについてのみ起こった特異的な伸長反応が検出されたことが示されている。このように、共通する配列が１０塩基長程度あったとしても、その共通配列部分の外側の配列によって特異性を上げることが可能な場合には、特異的な伸長反応のみを起こして、かつ、当該特異的な伸長反応を検出することができる。
【００９３】
（実施例４）
固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号６６（miR-181a）、６７（miR-181b）、６８（miR-181c）、６９（miR-181d）番の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４６０番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図６および図７に示す。図７は、図６において、導入されたマイクロＲＮＡの分子数が１から１００attoモルである部分を拡大したグラフである。
【００９４】
配列番号６６から６９では、５'末端またはその近傍の連続する６塩基の配列と、３'末端から連続する４塩基の部分とが共通配列であり、両共通配列部分間の長さおよび５'末端の配列が互いに異なる固定ＤＮＡプライマーであるところ、図６によれば１０００attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルでそれぞれのプライマーについて特異的な伸長反応が検出され、特に図７によれば、１０attoモルのサンプルＲＮＡ分子数のレベルで、配列番号６６の固定ＤＮＡプライマーについてのみ起こった特異的な伸長反応が検出されたことが示されている。このように、同じターゲットのマイクロＲＮＡを、共通する塩基配列が複数部分存在するが、互いに異なる配列を有する固定ＤＮＡプライマーのそれぞれと反応させたときに、特異的な伸長反応のみを起こして、かつ、当該特異的な伸長反応を検出することができる。
【００９５】
（実施例５−１）
互いに相同性が高いことで知られているlet-7のマイクロＲＮＡのプローブファミリーについて、伸長反応を行った。すなわち、固定ＤＮＡプライマーとして、配列番号１（asD_hl7a_2）、３（asD_hl7b_2）、５（asD_hl7c_2）、７（asD_hl7d_2）、８（asD_hl7e_2）、９（asD_hl7f_2）、１１（asD_hl7g_2）、１２（asD_hl7i_2）の配列を有する各断片を使用し、ターゲットとなるマイクロＲＮＡとして、配列番号４５８番の配列を有するマイクロＲＮＡを用いた以外は、実施例１にて行った手順を繰り返した。結果を図８に示す。
【００９６】
（実施例５−２）
実施例５−１と同じマイクロＲＮＡのプローブファミリーについて、実施例５−１で用いた固定ＤＮＡプライマーよりも短いプライマーを用いて、実施例５−１と同様にマイクロＲＮＡの検出を行った。すなわち、実施例５−２において固定ＤＮＡプライマーとして用いた断片は、配列番号２（asD_hl7a_3）、４（asD_hl7b_3）、６（asD_hl7c_3）、４６１（asD_hl7d_3）、４６２（asD_hl7e_3）、１０（asD_hl7f_3）、４６３（asD_hl7g_3）、４６４（asD_hl7i_3）であった。結果を図９に示す。
【００９７】
実施例５−１および５−２で固定ＤＮＡプライマーとして用いたＤＮＡ配列は、１塩基または２塩基が互いに異なるものである。配列番号１、５の固定ＤＮＡプライマー間では、実施例５−１においてはシグナル強度において有意な差異を認めることが困難であったところ、実施例５−２では、固定ＤＮＡプライマーの３'末端側を短くしただけで、有意な差異を認めることができた。
【００９８】
（実施例６）
市販されているヒトのトータルＲＮＡを含む試料と、ヒトの腎臓細胞、脳細胞および肝臓細胞から、それぞれスモールＲＮＡ分画を精製して得られた試料とを準備して、それぞれについて共通する５３種類の固定ＤＮＡプライマーにて伸長反応を行った。トータルＲＮＡを試料として用いたときのシグナル強度と、スモールＲＮＡを試料として用いたときのシグナル強度との関係を、図１０に示す。図１０において、縦（Ｙ）軸はスモールＲＮＡより検出されたシグナル強度を示し、横（Ｘ）軸はトータルＲＮＡより検出されたシグナル強度を示す。
【００９９】
図１０によれば、スモールＲＮＡより検出されたシグナル強度と、トータルＲＮＡより検出されたシグナル強度との間には、相関関係があり、および一般に、トータルＲＮＡを試料として用いたときよりも、スモールＲＮＡを試料として用いたときの方が、シグナル強度が大きいことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明の実施形態の伸長反応を説明する模式図である。
【図２】本発明の一実施例の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図５】図４の一部を拡大して示すグラフである。
【図６】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図７】図５の一部を拡大して示すグラフである。
【図８】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図９】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の他の実施例の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０１】
１０ 基板
１１ 固定ＤＮＡプライマー
１２ マイクロＲＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ、
逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い、
伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板の表面は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、当該固定ＤＮＡプライマーの３'末端に１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記モノヌクレオチドとして、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体を混在させて、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体または２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体による１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項７】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項８】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項９】
請求項２または８に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項１０】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項１１】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されていることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項１２】
ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるマイクロアレイであって、
各アレイは、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に設けられ、
複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定させて構成されることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のマイクロアレイにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロアレイにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載のマイクロアレイにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１６】
請求項１３または１５に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１７】
請求項１３に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１８】
ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるキットであって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板と、
逆転写酵素と、
モノヌクレオチドと
を含むキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記モノヌクレオチドの中に、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体が含まれることを特徴とするキット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットにおいて、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするキット。
【請求項２１】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするキット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするキット。
【請求項２３】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするキット。
【請求項２４】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするキット。
【請求項２５】
請求項２１または２４に記載のキットにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするキット。
【請求項２６】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするキット。
【請求項２７】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記基板には、複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されているマイクロアレイが形成されることを特徴とするキット。
【請求項１】
ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出する方法であって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、前記マイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に、前記試料を接触させ、
逆転写酵素およびモノヌクレオチドの存在下で、前記マイクロＲＮＡを鋳型とする前記固定ＤＮＡプライマーでの伸長反応操作を行い、
伸長反応が起こった固定ＤＮＡプライマーを検出することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板の表面は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、当該固定ＤＮＡプライマーの３'末端に１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記モノヌクレオチドとして、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体を混在させて、
前記伸長反応の対象となる固定ＤＮＡプライマーでは、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体または２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体による１塩基のみの伸長が行われることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項７】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項８】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項９】
請求項２または８に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項１０】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項１１】
請求項２に記載のマイクロＲＮＡの検出方法において、
前記基板は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されていることを特徴とするマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項１２】
ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるマイクロアレイであって、
各アレイは、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板に設けられ、
複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーを固定させて構成されることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のマイクロアレイにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロアレイにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載のマイクロアレイにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１６】
請求項１３または１５に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１７】
請求項１３に記載のマイクロアレイにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１８】
ＲＮＡを含む試料からマイクロＲＮＡを検出するために用いられるキットであって、
親水性の表面を有し、かつ、この表面に固定され、ＲＮＡを含む試料に含まれるマイクロＲＮＡの一部の配列と相補的な固定ＤＮＡプライマーを含む基板と、
逆転写酵素と、
モノヌクレオチドと
を含むキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記モノヌクレオチドの中に、２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体が含まれることを特徴とするキット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットにおいて、
前記２'、３'−ジデオキシアデノシン５'−三リン酸あるいはその誘導体および２'、３'−ジデオキシチミジン５'−三リン酸あるいはその誘導体は、標識化されたものであることを特徴とするキット。
【請求項２１】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記親水性の表面を有する基板は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするキット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするキット。
【請求項２３】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記プライマーが、前記基板の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、表面に固定化されることを特徴とするキット。
【請求項２４】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするキット。
【請求項２５】
請求項２１または２４に記載のキットにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするキット。
【請求項２６】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするキット。
【請求項２７】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記基板には、複数の互いに独立した反応空間を有し、かつ、それぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されているマイクロアレイが形成されることを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１２４９５７（Ｐ２００９−１２４９５７Ａ）
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３００７４８（Ｐ２００７−３００７４８）
【出願日】平成１９年１１月２０日（２００７．１１．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 経済産業省、委託事業「機能性ＲＮＡプロジェト」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【出願人】（５０１００２１７２）株式会社ＤＮＡチップ研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２０日（２００７．１１．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 経済産業省、委託事業「機能性ＲＮＡプロジェト」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【出願人】（５０１００２１７２）株式会社ＤＮＡチップ研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
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