マイタケ由来の骨粗鬆症予防改善剤
【課題】医薬品、飲食品、飼料に利用可能な骨粗鬆症予防改善剤の提供。
【解決手段】乾燥マイタケを有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防改善剤、並びにその骨粗鬆症予防改善剤を含む医薬品、飲食品及び飼料。
【解決手段】乾燥マイタケを有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防改善剤、並びにその骨粗鬆症予防改善剤を含む医薬品、飲食品及び飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイタケから製造される骨粗鬆症予防改善剤に関する。本発明における骨粗鬆症予防改善剤とは、骨粗鬆症（Osteoporosis）の予防、骨粗鬆症の進行・進展の防止、及び／又は骨粗鬆症患者における骨の状態（骨密度や骨の質によって示される骨強度など）の改善のため、更には骨の健康状態を維持するために、ヒト若しくはヒト以外の動物に与えられる医薬品（動物用治療薬も含む）用、飲食品用、及び飼料用の組成物を意味する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症とは、一般的には、骨量が減少し、骨組織の微細構造が変化して骨がもろくなり、骨強度が低下して骨折を起こしやすくなった状態を言う。骨粗鬆症のこのような骨の状態は、骨代謝における骨形成と骨吸収のバランスが崩れることにより引き起こされる骨の質の低下に起因するものと考えられている。特に閉経後の女性では、女性ホルモン分泌の低下に伴い、骨吸収に対する女性ホルモンの抑制効果が低下するため、骨粗鬆症が発症しやすい。
【０００３】
骨粗鬆症の治療には、現在、ビスホスフォネート、エストロゲン、カルシトニンなどの骨吸収抑制剤、ビタミンＫ２などの骨形成促進剤、カルシウム剤などの骨代謝調節剤のような、骨代謝を改善するための薬剤が使用されている。閉経後の女性においては、人工エストロゲンを投与するエストロゲン補充療法が特に有効とされているが、人工エストロゲンの投与には、乳癌や心血管障害のリスクが高まるなどの無視できない副作用も指摘されている（非特許文献１）。このため、そのような副作用がより少なく、そして簡便に服用出来る骨粗鬆症の治療又は改善用の薬剤の開発が望まれている。
【０００４】
また骨粗鬆症は、進行すると少しの衝撃でも簡単に骨折を起こすようになり、その結果、患者の「寝たきり」を誘発する。このため、骨粗鬆症の予防や進行抑制に有効な医薬品や機能性食品等の開発も急務となっている。骨粗鬆症の予防には、一般にカルシウムを多く摂取することが効果的とされているが、食餌性カルシウムの腸管吸収には活性型ビタミンＤ３の存在が重要な役割を果たす。この活性型ビタミンＤ３、すなわち1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3（1,25(OH)2D3）は、ビタミンＤが生体内で肝臓及び腎臓において水酸化を受けて活性化されることにより生成される。統合失調症の代表的な治療薬であるクロルプロマジンを長期服用する患者に骨吸収性疾患が発症することは知られているが（非特許文献２）、これはクロルプロマジンがビタミンＤの活性型への代謝系を阻害し、結果的に食餌性カルシウムの腸管吸収を阻害することに起因すると考えられている（非特許文献３）。すなわち、骨粗鬆症の有効な予防及び改善には、カルシウムの摂取と併せて活性型ビタミンＤ３の生成増強が重要である。
【０００５】
健康食品の利用は、高齢化社会の到来や医療費負担の増加等を背景として、代替医療として注目を集めるようになってきている。現在では、健康食品素材として非常に幅広い食材が研究されている。例えば骨粗鬆症の予防効果を狙ったものとして、女性ホルモン様作用を有するイソフラボンが含まれる大豆を利用した健康食品が数多く市販されている。このように食品素材の中から骨粗鬆症の予防改善効果のあるものを探索することは医薬品による副作用の回避や安全性の面から望ましい。しかし、現在用いられている食品素材では、必ずしも骨粗鬆症における作用機構が明らかになっていない。より安全でより効果の高い骨粗鬆症予防改善用の健康食品等を開発するためには、骨の代謝のメカニズムにおける作用点の解明が進んだ食品素材を用いることが望ましい。
【０００６】
キノコは、古くより、食事によって健康を維持するという意味の「医食同源」に適した食材として知られてきた。霊芝は古代から不老不死の妙薬として珍重されてきたし、また「椎茸は気を益しも飢えず、風を治し、血を破る」と中国の古書（日用本草、呉端著）に紹介されるなど、キノコ類のもつ薬理効果は高く評価されてきた。
【０００７】
近年、キノコ類の薬理活性についての化学的・臨床的な分析が進められている。かつて大々的に報道されたサルノコシカケの抗癌作用の他にも、シイタケのレンチナン、カワラタケのクレスチン、スエヒロタケのシゾフィラン、マイタケの熱水抽出物などに制癌作用が認められている（特許文献１及び２、非特許文献４）。マイタケについては、馬の体調維持増進用や、家畜飼料添加剤としての用途も知られている（特許文献３及び４）。また、キノコ類のもつβ−グルカンは、食物繊維として有用であるだけでなく、ナチュラルキラー細胞やＴリンパ球の活性を高める免疫賦活作用を有することが知られている（非特許文献５）。また、キノコ類に含まれるエリタデニンはコレステロール代謝を促進し、動脈硬化を予防する効果があるとされる（非特許文献６）。キノコ類は、ビタミンも豊富に含んでおり、特にビタミンＤの含量は他の食材と比較して高含量である（非特許文献７）。上述した通り、ビタミンＤは食餌性カルシウムの腸管吸収に不可欠であり、ビタミンＤの欠乏は骨軟化症や骨粗鬆症などの骨吸収性疾患を招くことが知られている。
【０００８】
【特許文献１】特開平０９−２３８６９７号公報
【特許文献２】特開２００１−０９７８８１号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９２４号公報
【特許文献４】特開２００３−２５９８１６号公報
【非特許文献１】Writing Group for the WHI Investigators, JAMA(2002)288(3): p.321-333
【非特許文献２】Komoda T., et al., Calcif. Tissue Int. (1989) 42: p.58-62
【非特許文献３】Oh-ie K. et al., J. Bone Mine. Metab. (2002) 20: p.21-27
【非特許文献４】Hishida I. et al., Chem. Pharm. Bull. (1988) 36(5): p.1819-1827
【非特許文献５】Fullerton SA et al., Molecul. Urol. (2000) 4: p. 7-13
【非特許文献６】Shimada Y. et al., J. Nutrit. (2003) 133: p.758-765
【非特許文献７】五訂日本食品標準成分表（科学技術庁資源調査会編）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、より長期間にわたり安全に、しかも簡便に摂取出来る医薬品は勿論のこと飲食品や飼料にも使用できる骨粗鬆症予防改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、乾燥マイタケを骨粗鬆症予防改善剤として投与することにより、骨吸収を増大させる酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）の活性を低下させるという新知見を得ると共に、加えてカルシウムの腸管吸収に不可欠である活性型ビタミンＤ３の血中濃度増加をも達成できることを見出し、この知見に基いて本発明を完成させた。すなわち本発明は次の通りである。
【００１１】
（１）乾燥マイタケを有効成分として含有することを特徴とする、骨粗鬆症予防改善剤、
（２）骨吸収抑制作用と骨形成促進作用とを有する、上記（１）に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（３）骨吸収抑制作用が酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下によって示され、かつ、骨形成促進作用が活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加によって示される、上記（２）に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（４）乾燥マイタケが、マイタケを８５℃以下の温度で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（５）乾燥マイタケが、マイタケを６０℃以上８０℃以下の温度で、温度を上げながら乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（６）乾燥マイタケが、−４０℃以下の温度で凍結したマイタケを凍結乾燥機で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の、飲食品又は飼料。
（８）上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の医薬品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、良好な骨粗鬆症の予防及び改善効果を発揮する。さらに、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含む飲食品及び飼料を用いれば、簡便に骨粗鬆症の予防効果及び改善効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
1. 骨粗鬆症
骨は、破骨細胞が古い骨を壊し（骨吸収）、骨芽細胞が新しい骨をつくる（骨形成）という骨代謝が繰り返される（骨代謝回転）ことにより、新しい骨に置き換えられていく。この骨吸収と骨形成のバランスが崩れると、骨の微細構造の劣化が起こり、骨粗鬆症が誘発される。
【００１５】
臨床的には、骨粗鬆症の診断は、主にレントゲン評価法と骨密度測定法によって行われており、明らかな外傷がないのにレントゲン検査で骨折が認められた場合の他、骨折がなくても骨密度測定検査で若年者の骨密度基準値（20〜44歳の骨密度平均値）の70％未満であれば、骨粗鬆症と判断される。なお、骨密度が若年者の基準値の70〜80％である場合は骨量減少（骨粗鬆症の予備軍）、80％以上であれば正常とみなされる。
【００１６】
2000年の米国公衆衛生研究所（ＮＩＨ）のコンセンサス会議において、骨粗鬆症の国際的な定義は、「骨折リスクを増すような骨強度上の問題（compromised bone strength）をすでに持っている人に起こる骨格の疾患」に変更された。この「骨強度」は、骨密度（bone mineral density; BMD）と骨の質（bone quality）の両方によって決まるものである。骨密度は、単位面積または単位体積あたりのミネラル量（骨量）として表され、一方、骨の質は、骨の微細構造、骨代謝回転、微小ダメージの蓄積、石灰化の程度、コラーゲン等の骨基質の特性で規定される。骨粗鬆症においては骨密度と骨折リスクが必ずしも相関しないことから、骨強度の重要な決定要因として骨の質を考慮するように骨粗鬆症の定義が改定されたという経緯がある。
【００１７】
本発明では、このような骨粗鬆症に対し良好な効果を有する食品素材や薬剤として、後述のようにして製造される乾燥マイタケを用いた骨粗鬆症予防改善剤を提供する。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、投与した被験体において骨吸収を抑制し、かつ骨形成を促進することができ、それにより骨の質を改善する効果を有する。
【００１８】
2. 乾燥マイタケの製造及び乾燥マイタケの骨粗鬆症予防改善剤としての効果
本発明の乾燥マイタケの原料として用いるマイタケには、例えば、日常食材として用いられているマイタケ［舞茸］（Grifola frondosa）に限られることなくシロマイタケ（Grifola albicans Imaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）、トンビマイタケ（Grifola gigantea）なども包含する。本発明の乾燥マイタケの原料としては、マイタケの菌糸体及びその培養物を用いてもよいが、その子実体を用いることがより好ましい。マイタケ（例えば、Grifola frondosa）の子実体としては人工的に栽培され食用に販売されているものを入手して用いてもよいし、野生のものを採集して用いてもよい。品質の安定性、安定供給の面からは、人工的に栽培した子実体を用いるのが好ましい。
【００１９】
乾燥マイタケは、原料とするマイタケを自然乾燥法又は人工乾燥法等の任意の乾燥法によって乾燥させることによって製造することができる。自然乾燥法としては天日乾燥、日陰干し乾燥などが挙げられる。人工乾燥法としては加熱及び／又は加温による乾燥法、凍結乾燥法などが挙げられる。しかし本発明における乾燥マイタケの製造においては、これらに限定されることなく使用目的に応じて種々の乾燥方法を適宜選択出来る。どの様な乾燥方法であれ、８５℃以下の温度でマイタケを乾燥させるのがより好ましい。
【００２０】
乾燥マイタケを経済的且つ大量生産に適した方法で製造するには、加熱及び／又は加温による乾燥法、集中熱風乾燥法などを用いることが好ましい。これらの方法には箱型棚式、回転式、トンネル式等などの様々な乾燥機を使用できる。加熱による乾燥法の場合、温度条件には特に配慮が必要である。例えば５０℃以上８５℃以下の温度範囲、好ましくは６０℃以上８０℃以下（６０℃〜８０℃）の温度で乾燥させるのが好ましい。マイタケは、徐々に、段階的に温度を上げながら乾燥させてもよい。更に好ましくは、マイタケを、６０℃から徐々に段階的に温度を上げ最終的に８０℃に至る間に乾燥させるのが好ましい。乾燥の終了時点は、通常は、乾燥マイタケの水分含量が約１０％以下となるのを目処として決定する。できるならば、乾燥マイタケの水分含量は約８％以下であるのが好ましい。乾燥マイタケの水分含量は、一般的な食品の水分含量の測定法に従って測定することができる。乾燥に要する時間（加熱乾燥法の場合には、加熱時間）は、原料とするマイタケ（例えば、生マイタケ）の水分含有量、乾燥する総量などによって異なり、一概に特定出来ないが、概ね約１５〜３０時間の範囲である。上記の様に乾燥温度の上限を８５℃以下に設定し、より低い温度から徐々に温度を上げながらその上限温度に達するまでの間にマイタケを乾燥させることにより得られた乾燥マイタケは，硬質化したり黒褐色化したりすることなく、粉末化などの加工も容易である。以上のような本発明の乾燥マイタケの具体的な製造例は、後述の実施例に記載されている。
【００２１】
一方、凍結乾燥法で乾燥マイタケを製造する場合の一例を示すと、まず、フリーザー中で少なくとも−４０℃以下、好ましくは−８０℃前後でマイタケを凍結する。凍結する際、マイタケは１cm角以下にカットしておくことが好ましい。次いで、凍結したマイタケを凍結乾燥機で乾燥させる。
【００２２】
この乾燥は通常、加熱板（棚）を有する乾燥庫（棚）で、減圧下、加熱板（棚）を加熱することによって行われる。加熱板（棚）の加熱温度は特定されるものでなく、適宜選択しうるが、例えば、凍結マイタケを、減圧下、加熱板（棚）上にのせ、該加熱板（棚）を３０℃〜５０℃の範囲の温度に加熱して乾燥させるのが好ましい。乾燥の終了時点は、通常は、乾燥マイタケの水分含量が約１０％以下となるのを目処として決定する。できるならば、乾燥マイタケの水分含量は約８％以下であるのが好ましい。凍結乾燥法で得られた乾燥マイタケはソフトで、粉末化などの加工も容易である。凍結乾燥法による本発明の乾燥マイタケの具体的な製造例は、後述の実施例に記載されている。
【００２３】
以上のようにして得られた乾燥マイタケは、例えば粉砕機により、粉末化することが出来る。粉砕機としては、ボールミル、ジェットミル、揺動ミル、挽臼その他種々の粉砕機が使用できる。あるいは、この乾燥マイタケは、粉末化せず、当業者に周知の食品・飼料の加工技術により、各種用途（例えば動物の飼料への配合等）に適した小片状、細粒状、顆粒状等の任意の形状に調製することもできる。本発明における「乾燥マイタケ」とは、乾燥させたマイタケ子実体の他に、そのような粉末状、細粒状、小片状、顆粒状などの任意の形状の乾燥マイタケも意味するものとする。
【００２４】
以上のようにして製造される本発明の乾燥マイタケは、被験体に投与（好ましくは経口投与）することにより、骨粗鬆症予防改善効果を発揮する。本発明において「骨粗鬆症予防改善効果」とは、投与した被験体（ヒト及び他のヒト以外の動物を含む、骨粗鬆症患者及び健常者等）において、骨の健康状態の維持、骨粗鬆症の発症予防、骨粗鬆症の進行・進展の防止及び／又は骨の状態（骨密度及び骨の質によって示される骨強度など）の改善をもたらすことを意味する。すなわち本発明の乾燥マイタケは、骨粗鬆症予防改善剤として用いることができる。骨粗鬆症予防改善剤として用いる上で、本発明の乾燥マイタケは、通常は、上記のように粉末状や細粒状などに成形したものを用いるのが好ましい。
【００２５】
本発明の乾燥マイタケに加えて、場合により、医薬品や飲食品に使用できる任意の添加剤（水、安定化剤、緩衝剤、賦形剤、保存剤、及び抗酸化剤等）をさらに添加した組成物も、本発明の骨粗鬆症予防改善剤として用いることができる。本発明の骨粗鬆症予防改善剤の効果は、例えば、当技術分野において通常用いられる骨粗鬆症の検査法を用いて確認することができる。
【００２６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤による骨粗鬆症予防効果は、限定するものではないが、例えば本発明の骨粗鬆症予防改善剤（例えば、乾燥マイタケ又は乾燥マイタケに添加剤を加えた組成物）を投与した被験体の骨密度が、若年者の骨密度基準値（２０〜４４歳の骨密度平均値）の７０％以上の範囲、好ましくは８０％以上の範囲に維持されることによって示される。また本発明の骨粗鬆症予防改善剤による骨粗鬆症改善効果は、例えば本発明の骨粗鬆症予防改善剤を投与した被験体の骨密度が、投与前と比較して増加することによって示される。
【００２７】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用とを有することが好ましい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤が有するこれらの作用は、限定するものではないが、例えば、被験体由来の検体（例えば血液、尿など）中の骨代謝マーカーの量によって示されるものであってよい。骨代謝マーカーは、従来、骨代謝回転を評価するための指標として用いられてきたが、近年、骨の質の将来予測や骨粗鬆症治療薬の効果の評価にも利用されるようになってきている。骨代謝マーカーには、骨吸収に伴って生成する物質である骨吸収マーカー、及び骨形成に伴って生成する物質である骨形成マーカーがある。例えば、測定の結果、骨吸収マーカー値が高いか又は上昇傾向を示していれば、骨吸収は亢進しており、骨の質は低下傾向にあると判断される。逆に骨吸収マーカーの測定値が低いか又は下降傾向を示していれば、骨吸収は抑制されており、骨の質は維持又は改善傾向にあると判断される。一方、骨形成マーカー値が低いか又は下降傾向を示している場合には、骨形成は抑制されており、骨の質は低下傾向にあると判断される。そして骨の質が低下傾向にある場合には、将来の骨折リスクがより高まっていると予測される。逆に、骨形成マーカー値が高いか又は上昇傾向を示している場合には、骨形成は促進されており、骨の質は改善傾向にあると判断される。
【００２８】
骨代謝マーカーとしては、限定するものではないが、以下のようなものを用いることができる。
【００２９】
【表１】
【００３０】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤の骨吸収抑制作用は、特に、好ましくは骨吸収マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の低下によって示される。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の低下とは、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を投与しない場合と比較して、それを投与した被験体における酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性が低下することを意味する。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性を低下させることによって、骨吸収量の増加を抑制し（より好ましくは骨吸収量を減少させ）、その結果、骨粗鬆症の病状の進行（すなわち、骨の状態の悪化）を阻止又は遅延させたり、骨粗鬆症の骨の状態を改善（すなわち、骨密度の増加及び／又は骨の質の健常化）させたり、未だ骨粗鬆症に至っていない骨の状態を改善させて骨粗鬆症の発症を予防又は遅延させたりすることができる。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の測定は、比色法、ELISA、RIA等の当業者に公知の任意の測定法によって行えばよい。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の測定用キットも、市販されている（TRACP & ALP二重染色キット（TaKaRa社）、Bone TRAP Assay [ヒト用、ラット用、マウス用]（SBA社）等）。
【００３１】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤の骨形成促進作用は、骨形成マーカー以外の指標によって示されるものでもよく、好ましくは、活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加によって示されるものである。活性型ビタミンＤ３は、カルシウムやリンの腸管からの吸収を促進し、それらを骨に沈着させる作用などによって骨形成を助ける働きをもつことが知られており、そのため活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加は骨形成を促進する効果をもたらす。本発明における活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加とは、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を投与しない場合と比較して、それを投与した被験体における活性型ビタミンＤ３の血中濃度が増加することを意味する。限定するものではないが、本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、活性型ビタミンＤ３の血中濃度を、投与しない場合と比較して有意に増加させるものであることがより好ましい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、活性型ビタミンＤ３の血中濃度を増加させることによって骨形成を促進し、その結果、骨粗鬆症の病状の進行（すなわち、骨の状態の悪化）を阻止又は遅延させたり、骨粗鬆症の骨の状態を改善（すなわち、骨密度の増加及び／又は骨の質の健常化）させたり、未だ骨粗鬆症に至っていない骨の状態を改善させて骨粗鬆症の発症を予防又は遅延させたりすることができる。活性型ビタミンＤ３の血中濃度の測定法としては、HPLC法、RRA法、RIA法等が知られ、測定用のキットも市販されている。当業者に公知の任意の測定法によって行うことできるが、好適な測定方法は、後述の実施例に記載した通りである。
【００３２】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、骨吸収を抑制し、かつ骨形成を促進することができるため、骨粗鬆症の予防及び改善において非常に有効である。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、長期にわたって継続して摂取することができ、かつその結果として良好な骨粗鬆症予防効果及び改善効果を発揮する。
【００３３】
3. 骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品又は飼料
本発明は、上記のような骨粗鬆症予防改善剤を配合し含有させた飲食品にも関する。本明細書において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品及び機能性食品等を包含する。
【００３４】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合する飲食品は、特に限定されない。例えば本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含む飲料として、発酵乳（ヨーグルト飲料等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳等）、牛乳、加工乳、お茶系飲料（緑茶、ウーロン茶など）、果物・野菜系飲料（りんご等の果汁や、トマト等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、ワイン等）等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（社団法人 全国清涼飲料工業会、財団法人 日本炭酸飲料検査協会 監修；株式会社光琳 発行）等を参考にすることができる。
【００３５】
また本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合する食品は、特に限定されず、生鮮食品であってもよいし、加工食品であってもよい。例えば、アイスクリーム、チーズ、バター、パスタ、かまぼこ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、スープ、パン、魚肉、加工肉、野菜、きのこなどの様々な食品を例示することができる。本発明において特に好適な食品としては、カルシウムを多く含む食品である乳製品や小魚の乾物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合した飲食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する加工食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[条件付き特定保健用食品]を含む）および栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセルおよび液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。
【００３７】
特に本邦では、規制当局の認可を得たり基準に合致したりすれば、「骨の健康が気になる方の食品」等の表示の可能な特定保健用食品や栄養機能食品等が認められている。そこで、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合した機能性食品は、例えば「骨吸収の抑制と骨形成の促進を助けるため」、「骨の健康が気になる方のため」、又は「骨粗鬆症のリスクを低減するため」などの表示を付した特定保健用食品や栄養機能食品であってもよい。しかし本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合した機能性食品は、当然これらの特定保健用食品等に限定されるものではない。
【００３８】
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジェル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。
【００３９】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤の飲食品への配合量は特に限定されず、場合に応じて様々であってよい。具体的な配合量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。
【００４０】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲食品に配合させればよい。例えば、本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、液体状、ゲル状、固体状、粉末状または顆粒状に調製した後、それを飲食品に配合してもよい。また本発明の骨粗鬆症予防改善剤に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明の免疫賦活用組成物を含有させた飲食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。
【００４１】
本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤、着色料、香料、甘味料、保存料、乳化剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、化学調味料、増粘剤、膨張剤、消泡剤等、結着剤、栄養強化剤等が挙げられる。
【００４２】
本発明では、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合し含有させた飼料も提供する。そのような飼料としては、家畜、家禽その他の哺乳動物、又は魚類に用いる粉状、練り製品状、ペレット状、固形状、フレーク状等の飼料、栄養補助製品（サプリメント）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの飼料には、通常の飼料に使用される任意の原材料、例えば動物性材料、植物性材料、各種添加物等を基礎飼料として使用することができる。
【００４３】
動物由来材料としては、限定するものではないが、例えば、牛、豚、鶏、羊等の家畜、魚介類（例えばマグロ、カツオ、アジ、イワシ、タコ等）等から得られる肉、皮膚、骨、臓器、卵、血液、乳、動物性脂肪等の生体組織、その乾燥粉末、又はそれらの加工製品が挙げられる。
【００４４】
また植物由来材料としては、限定するものではないが、例えば、ニンジン、キャベツ等の野菜類、ゴマ、ヒマワリの実等の種実類、コムギ、トウモロコシ等の穀類、ダイズ、インゲン等の豆類、サツマイモ、コーンスターチ等の澱粉類、ダイズ油、ゴマ油等の植物性油脂類、ミカン、リンゴ等の果実類、エノキ、シメジ等の菌糸類、ワカメ、クロレラ等の藻類、イネ科牧草、マメ科牧草等の牧草等から得られる植物組織、その乾燥粉末、又はそれらの加工製品が挙げられる。
【００４５】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を動物飼料に配合する場合、骨粗鬆症予防改善剤に用いられる乾燥マイタケの形状は、乾燥させたそのままの状態、又は小片、細粒、若しくは粉末等から、目的に応じて適宜選択できる。
【００４６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、上述の飲食品と同様の方法によって飼料に配合すればよい。飼料にさらに配合できる添加物の例は、飲食品に関する上記説明と同様である。また、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有させた飼料をさらに加工することもできる。そのような加工製品も、本発明の範囲に包含される。
【００４７】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、好ましくは、骨粗鬆症の予防、進行の防止用、及び骨粗鬆症の骨の状態（例えば、低下した骨強度など）の改善用のものである。本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料はまた、骨粗鬆症を発症していない骨の健康保持用（例えば、健全な骨強度の保持用）のものであってもよい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、限定するものではないが、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物が摂取するためのものであることが好ましく、特に、骨粗鬆症に罹患している哺乳動物、骨粗鬆症の素因（例えば、骨粗鬆症に罹患しやすい環境要因や遺伝的素因）を有する哺乳動物、骨の質（例えば骨代謝マーカーの値を指標として示される）や骨密度が低下している哺乳動物が、摂取するためのものであることが好ましい。例えば、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の上昇と、活性型ビタミンＤ３の血中濃度の低下を示している哺乳動物が摂取するためのものであってよい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料はまた、哺乳類の雌（ヒトでは女性）が摂取するのに適している。雌（又は女性）は、妊娠中や授乳期に大量のカルシウムを必要とし、また閉経後には骨吸収を抑制する作用を有する女性ホルモンの分泌が激減することから、骨量が減少しやすく骨粗鬆症に罹患しやすいためである。より具体的には、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品は、骨粗鬆症患者のほか、骨量減少が認められる骨粗鬆症予備軍の患者や、骨粗鬆症の素因を有するヒト、例えば妊婦や授乳期の女性、閉経後の女性、女性ホルモンの分泌に異常のある女性、日常的にカルシウム摂取不足の人、喫煙習慣のある人、日常的なアルコール摂取量が多い人、日常的に運動不足の人、痩せている人（体重が重いほど骨に加重がかかり、骨形成が促されることに加え、脂肪中には女性ホルモンが含まれるため）、骨粗鬆症患者を家族にもつ人などが摂取するのに特に適している。
【００４８】
何れにしても、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、広範な被験体において、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下による骨吸収の抑制効果と、活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加による骨形成の促進効果とを発揮する。すなわち、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料の投与対象（被験体）は、性別や年齢等によって限定されるものではなく、上記のような女性や高齢者にも限定されない。
【００４９】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を飲食品に配合する場合、骨粗鬆症を予防・改善するのに必要な配合量は、年齢及び体重、摂取頻度、骨の状態等により異なるが、当業者であればその具体的な量を適宜決定することができる。例えば、乾燥マイタケの重量を基準として、１日につき体重１kg当たり３０〜１００mgを目安とするがこれに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を飼料に配合する量は、生物種、性別、年齢によって異なり一概に特定しがたいが、１日につき体重kg当たり、乾燥マイタケの量で、５〜６００mg（乾燥重量）を目安とする（但し、この量に限定されるものではない）。
【００５１】
摂取期間は、被験体の骨粗鬆症の骨の状態、症状、骨代謝マーカーの値等の経過を考慮して決定すればよいが、できるだけ長期にわたって摂取することが好ましい。
【００５２】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含む飲食品及び飼料を用いれば、経口摂取によって骨の健康の維持効果は勿論のこと簡便に骨粗鬆症の良好な予防効果及び改善効果を得ることができる。
【００５３】
4. 骨粗鬆症予防改善剤を含有する医薬品
本発明は、上記のようにして調製された骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品(動物薬を含む)にも関する。本発明では任意の形状に調製された乾燥マイタケを含有する骨粗鬆症予防改善剤を医薬品に配合することができるが、一般的には、粉末化した乾燥マイタケを骨粗鬆症予防改善剤として医薬品に配合することが好ましい。
【００５４】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品には、医薬製剤に一般的に使用される担体、賦形剤、その他の添加剤を配合してもよい。例えば、水、生理食塩水、薬学上許容される有機溶剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤等を添加することができる。これらは製剤の剤形等に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の医薬品には、さらに他の薬理成分が配合されていてもよい。
【００５５】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品は、経口的又は非経口的に投与できるが、特に経口的に投与することが好ましい。経口投与するための本発明の医薬品は、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジェル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であり得る。本発明の医薬品は、使用前に液体製剤として調製してから用いることを意図した乾燥物の状態であってもよい。
【００５６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品は、被験体に投与することにより、骨粗鬆症予防改善効果を発揮する。本発明の医薬品は、他の薬理物質を含む別の治療用途のための医薬品に、骨粗鬆症予防改善効果を追加するものであってもよい。
【００５７】
本発明の医薬品は、骨吸収抑制作用を有する。この骨吸収抑制作用は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下によって明確に示される。本発明の医薬品はまた、骨形成促進作用を有する。その骨形成促進作用は、活性型ビタミンＤ３(1,25(OH)2D3)の血中濃度の増加によって明確に示される。従って本発明の医薬品は、骨粗鬆症の予防、その進行の防止、及び／又は骨粗鬆症に罹患した骨の状態の改善だけでなく、骨粗鬆症を発症していない骨の健康保持のためにも有用である。本発明の医薬品を投与する対象（被験体）は、上記の飲食品及び飼料を摂取するのに適しているとして記載した対象と同じであるが、骨粗鬆症に罹患している哺乳動物や骨の質（例えば骨代謝マーカーの値を指標として示される）や骨密度が低下している哺乳動物が特に好ましい。
【００５８】
本発明の医薬品の投与量は、投与対象の生物種、年齢及び体重、投与経路、投与回数、状態により異なり、一概には決めがたいが、当業者ならば前記、飲食品、又は飼料への配合量を目安として個々のケースに対応して用量を増やすなど適宜決定することができる。本発明の医薬品は、単回投与でもよいが、長期にわたって反復的に投与することができる。本発明の医薬品は、長期間投与しても有害な副作用がほとんど無く、安全性が高い。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。
【００６０】
[実施例１] 乾燥マイタケの製造 −加熱乾燥法−
乾燥マイタケ粉末は、以下の手順に従って製造した。
人工栽培で生産したマイタケ子実体を、厚さ５〜１０mmにスライスし棚型式乾燥室の棚に、出来るだけ重ならないように置き、６０℃〜８０℃の温度に加熱した熱風を当てて乾燥させた。このとき、熱風の温度を最初は６０℃とし、それから徐々に段階的に温度を上げ、最終的に８０℃で維持して、ほぼ１日かけて乾燥した。生マイタケがやや縮小した外観を保つが重量は乾燥前の９〜１１分の１の乾燥マイタケを得た。この乾燥マイタケは、手の力によって簡単に崩れるような状態であった。
【００６１】
この乾燥マイタケを粉砕機ロールミルで粉砕することにより、淡褐色の、マイタケ特有の匂いを有する、水分含有率が５%以下のふんわりした微粉末を得た。
【００６２】
【表２】
【００６３】
［実施例２］ 乾燥マイタケの製造 −凍結乾燥法−
乾燥マイタケ微粉末を以下の手順に従って製造した。
人工栽培で生産したマイタケの子実体を５〜１０mm角となるようカットし、その２００gをとってステンレス皿に平らに入れ、−８０℃の冷凍庫に収納して凍結マイタケ片を得た。
【００６４】
冷凍庫からステンレス皿を取り出し、予め稼働させておいた凍結乾燥装置の乾燥庫内加熱板へ速やかに載せた後、乾燥庫を真空ポンプで減圧し、凍結乾燥を開始した。このとき、乾燥庫内加熱板の温度を予め３０℃に保っておき、乾燥の進行とともに徐々に昇温させ、最終温度が５０℃になるよう調節操作し、乾燥の進行を早めた。加熱板の温度５０℃を維持したまま、乾燥を開始してから２４時間後、ソフトな乾燥マイタケ片を得た。
【００６５】
次いで得られた乾燥マイタケ片を粉砕ミルを用いて粉砕したところ、上記の実施例１で得た粉末よりも淡い匂いの灰白色の乾燥マイタケ微粉末１９．５gを得た。この乾燥マイタケ微粉末の水分含有率は４．６％であった。
【００６６】
［実施例３］ 飼料の調製と投与
実施例１で製造した乾燥マイタケ粉末を、最終濃度１０％になるように固形飼料（日本クレア製）に混合し、これを、乾燥マイタケを含有する飼料（以下マイタケ飼料と称す）として用いた。対照として、乾燥マイタケ粉末を配合しない同じ固形飼料（以下対照飼料と称す）を使用した。
【００６７】
ウィスター系雌ラット（体重約150g）４〜６匹を１グループとして、８グループを用意した。その半分（各４グループ）のラットには、正常群としてエーテル麻酔下で疑似（sham）手術を行った。一方、もう半分（各４グループ）のラットには、OVX群（試験群）として同様のエーテル麻酔下で卵巣切除術（ovarietectomy, OVX）［Gala J. et al., Bri. J. Nutrit. (2001) 86: p.521-527に詳述］を施した。以下の実施例ではこのOVX群を骨粗鬆症のモデル動物として用いた。これら正常群とOVX群の両方について、それぞれ半分のグループ（各２グループ）のラットに対照飼料を自由摂取させ、また残りのグループ（各２グループ）のラットにマイタケ飼料を自由摂取させた。このようにして、正常ラット対照飼料摂取群、正常ラットマイタケ飼料摂取群、OVXラット対照飼料摂取群、そしてOVXラットマイタケ飼料摂取群の４つの実験群を構築し、１２週間にわたって上記飼料を与えて飼育した。
【００６８】
[実施例４] ラットの経時的体重変化
ラットの成長に対するマイタケ飼料の影響を調べるために、実施例３の正常ラット対照飼料摂取群、正常ラットマイタケ飼料摂取群、OVXラット対照飼料摂取群、及びOVXラットマイタケ飼料摂取群の各ラットについて、飼料摂取の開始時、４週間後、８週間後及び１２週間後に体重測定を行った。この結果を図１に示す。図１から分かるように、正常群では、マイタケ飼料を摂取した場合（正常ラットマイタケ飼料摂取群；(A)の黒丸）、体重増加が１２週間にわたり継続的に抑制された（正常ラット対照飼料摂取群［(A)の白丸］と比較して）。これに対しOVX群では、OVXラットマイタケ飼料摂取群［(B)の黒丸］とOVXラット対照飼料摂取群［(B)の白丸］との間に体重増加率の相違は認められなかった。
【００６９】
なおOVX群と正常群とを比較すると、OVX群でより高い体重増加率が示された。飼料摂取開始の１２週間後の平均体重は、正常ラット対照飼料摂取群で354gであったのに対し、OVXラット対照飼料摂取群では398gであり約１２％高い値となった。また正常ラットマイタケ飼料摂取群の１２週間後の平均体重が317gであったのに対し、OVXラットマイタケ飼料摂取群では418gであり約３２％も高い値となった。この結果は、閉経後の女性において体重増加がよく認められることと一致しており、OVX群が骨粗鬆症をよく反映したモデルであることを示している。
【００７０】
[実施例５] 試料の調製と血清試料の分析
実施例３の正常ラット対照飼料摂取群、正常ラットマイタケ飼料摂取群、OVXラット対照飼料摂取群、及びOVXラットマイタケ飼料摂取群について、飼料摂取開始から４週間後及び１２週間後に、各群につき１グループのラットをエーテル麻酔下で脱血致死させ、常法により血清を採取して、これを以下で用いる血清試料とした。さらに、脱血致死させたラットから頭頂骨を採取し、これをプロテアーゼインヒビターおよび0.1％ Triton-Xを含むトリス緩衝液（TB, pH7.5, 50mM）中でホモジナイズして、得られたホモジネートを後述のAP活性又はTRAP活性測定用の試料とした［Koyama, I. et al., J.Chromatogr. (1986)374: p51-59に詳述］。
【００７１】
［実施例６］血清カルシウム濃度及び血清無機リン濃度の測定
実施例５で得られた血清試料について、o-クレゾールフタレインコンプレクソン（oCPC）法［金井泉，金井正光：臨床検査法提要 第29版 (1983) 金原出版，p.477-484に詳述］により血清カルシウム濃度を測定した。この方法では、8-オキシキノリンにてマグネシウムを隠蔽し、アルカリ性下でカルシウムをoCPCとキレート結合させ、570nmにて比色定量した。
【００７２】
一方、上記で得られた血清試料について、フィスケサバロウ（Fiske-SubbaRow）法［金井泉，金井正光：臨床検査法提要 第29版 (1983) 金原出版，p.484-487に詳述］により血清無機リン濃度の測定も行った。この方法では、除蛋白した試料にモリブデン酸アンモニウムを加え、さらに還元剤にて還元して得られたモリブデンブルーを660nmで比色定量した。
【００７３】
これらの結果を図２に示す。図２中、（A）は血清中カルシウム濃度、（B）は血清中無機リン濃度、＋はマイタケ飼料摂取群、−は対照飼料摂取群を表す。飼料摂取開始から４週間後の血清試料について、正常群では、マイタケ飼料摂取群と対照飼料摂取群の間で血清中カルシウム濃度及び血清中無機リン濃度に有意な差は認められなかった。一方、OVX群では、４週間後の血清中カルシウム濃度と血清中無機リン濃度は共に、対照飼料摂取群で、マイタケ飼料摂取群と比較して有意（p＜0.05）に高い値を示した。また、OVXラットマイタケ飼料摂取群のカルシウム濃度及び無機リン濃度は正常群と同程度であった。
【００７４】
この結果に示されるように、骨粗鬆症モデル動物であるOVX群において骨吸収が促進され、結果として血中のカルシウム及び無機リンの量が増加し、またマイタケ飼料の摂取により、OVX群におけるそのようなカルシウム及び無機リンの血中量が正常群と同程度にまで抑制された。すなわち、マイタケ飼料摂取により、OVX処理によって引き起こされる過剰な骨吸収作用が改善されたことを示す。
【００７５】
[実施例７] 血清中のアルカリホスファターゼ活性の測定及びアイソザイムの確認
実施例５で得られた血清試料について、ベッセイ・ローリー（Bessey-Lowry）法によりアルカリホスファターゼ（以下APと略称することがある）活性を測定した。基質に4-ニトロフェニルリン酸、緩衝液には炭酸／重炭酸緩衝液（pH10.0, 50mM）を用いて血清試料と反応させ、生じた4-ニトロフェノールを405nmで比色定量した。なお手順の詳細はKoyama, I. et al., J. Chromatogr. (1986) 374: p51-59を参照して実施した。この結果を図３(A)に示す。
【００７６】
図３(A)に示されるように、OVX群では、４週間後と１２週間後のいずれにおいても、マイタケ飼料摂取群の血清アルカリホスファターゼ活性が、対照飼料摂取群と比較して増大する傾向が示された。このことは、骨粗鬆症モデル動物であるOVX群において、マイタケ飼料摂取により、骨形成マーカーであるアルカリホスファターゼの活性が増加したこと、すなわち骨形成が促進されたことを示している。なお４週間後と１２時間後の血清試料を比較すると、いずれの実験群でも１２週間後の方が血清アルカリホスファターゼ活性が低下していた。
【００７７】
続いて、上記でマイタケ飼料摂取により血清アルカリホスファターゼ活性が増大する傾向が示された血清試料について、ポリアクリルアミドゲルを支持体としたディスク電気泳動により、血清アルカリホスファターゼのアイソザイムの活性を確認した。実施例５で得た飼料摂取開始から４週間後の血清試料を、ディスクゲル（アルフォー、常光）に載せて、３mA／ゲルにて通電して約９０分間電気泳動した後、5-ブロモ-3-インドリルリン酸（BIP）を基質として用いてアルカリホスファターゼ活性バンドを検出した。手順の詳細はKoyama et al., Comp. Biochem. Physiol. (1998) 121B: p.417-423を参照して実施した。この結果を図３(B)に示す。
【００７８】
図３(B)中、骨型アイソザイムをＢ、小腸型アイソザイムをＩで示す。図３(B)から分かるように、正常群とOVX群の両方において、マイタケ飼料摂取群では、対照飼料摂取群と比較して骨型アイソザイム活性が明らかに増加した。すなわちこの結果は、上記実験で示されたマイタケ飼料摂取群における血清中アルカリホスファターゼの活性上昇傾向が、少なくとも一部はアルカリホスファターゼの骨型アイソザイムの活性増加によるものであることを示している。なお、ヒト血清に含まれる主たるアルカリホスファターゼアイソザイムは肝型と骨型であるが、ラット血清の場合は骨型と小腸型である。
【００７９】
［実施例８］骨組織中のアルカリホスファターゼ活性の測定
実施例５で調製した頂頭骨のホモジネート試料について、その抽出液中のアルカリホスファターゼ活性を実施例７と同様にベッセイ・ローリー（Bessey-Lowry）法によって測定し、AP活性を蛋白質１mg当たりの比活性（μmol/min/mg）で表した。その結果を図４に示す。
【００８０】
図４に示すように、飼料摂取開始から４週間後の頂頭骨組織では、OVX対照飼料摂取群におけるアルカリホスファターゼ活性が、正常群と比較して低下した。一方、OVXマイタケ飼料摂取群では、正常群と同程度のアルカリホスファターゼ活性が示され、OVX対照飼料摂取群で見られたアルカリホスファターゼ活性の低下が改善された。
【００８１】
[実施例９] 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の測定
実施例５で得られた頭頂骨由来のホモジネート試料について、TRAP活性を、最終濃度５０mMの酒石酸を加えた酢酸基質液（pH4.8, 50mM）を用いたベッセイ・ローリー（Bessey-Lowry）法にて測定した。結果は図５に示した。
【００８２】
図５に示すように、飼料摂取開始から４週間後、１２週間後のいずれにおいても、OVX群では、マイタケ飼料摂取群では、対照飼料摂取群と比較してTRAP活性が低下する傾向にあった。特に１２週間後のTRAP活性は、対照飼料摂取群では0.72μmol/min/mgであったのに対して、マイタケ飼料摂取群では0.64μmol/min/mgに低下しており、p＜0.05で有意差が認められた。
【００８３】
以上の測定の結果、骨吸収マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの活性が、OVX群において、マイタケ飼料摂取群で（対照飼料摂取群と比較して）低下したことが示された。すなわち、マイタケ飼料を摂取したラットでは、骨吸収が抑制されたと考えられた。
【００８４】
[実施例１０] 活性型ビタミンＤ３濃度の測定
実施例５で得られた血清試料中の活性型ビタミンＤ３濃度の測定は、検体を脱脂後、モノクローナル抗体を用いたカラムにより前処理し、［125I］を用いたラジオイムノアッセイ（RIA）により測定するW. D. Fraserらにより報告された方法［Ann. Clin. Biochem.(1997)34: p632-637］に準じて、行った。この結果を図６に示す。
【００８５】
図６に示すように、飼料摂取開始から４週間後の血清1,25(OH)2D3［活性型ビタミンＤ３］量は、正常群とOVX群の両方において、マイタケ飼料摂取群で、対照飼料摂取群に比べて増加する傾向を示した。１２週間後の血清1,25(OH)2.D3［活性型ビタミンＤ３］量は、４週間後よりも減少していたが、やはりマイタケ飼料摂取群で、対照飼料摂取群に比べて明らかに増加していた。特にOVX群では、マイタケ飼料摂取群の１２週間後の血清1,25(OH)2D3量が、対照飼料摂取群と比較して有意差（p＜0.05）をもって増加したことが示されていた。
【００８６】
以上の結果は、マイタケ飼料の摂取によって活性型ビタミンＤ３の血清中濃度が増加したことを示していた。このことから、マイタケ飼料を摂取したラットでは、食餌性カルシウムの吸収が促進され、骨形成が促進されたと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、効果的に骨粗鬆症を予防し改善するための医薬組成物、飲食品及び飼料を製造するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、マイタケ飼料又は対照飼料を摂取したラットの経時的な体重変化を示すグラフである。縦軸はラットの体重（g）、横軸は対照飼料又はマイタケ飼料の摂取を開始した日からの週数を示す。(A)は正常群、(B)はOVX群の結果を示す。白丸は対照飼料摂取群、黒丸はマイタケ飼料摂取群である。データは１グループの４〜６匹の平均値である。横棒は標準偏差を示す。
【図２】図２は、マイタケ飼料又は対照飼料を摂取したラットにおける４週間後の血清カルシウム濃度（mg/dl）［図２(A)］及び血清無機リン濃度（mg/dl）［図２(B)］を示すグラフである。Shamは擬似手術を施した群（正常群）、OVXは卵巣切除術を施した群（OXV群）、＋はマイタケ飼料摂取群、−は対照飼料摂取群を表す（これらは下記図３〜図６についても同様である）。＊は、対照サンプルとの間で有意差が示されたことを示す。
【図３】図３は、血清アルカリホスファターゼ活性の分析結果を示す。図３(A)は、マイタケ飼料又は対照飼料を摂取したラットにおける４週間後及び１２週間後の血清試料についてのアルカリホスファターゼ活性（IU/L）を示すグラフである。図３(B)は、４週間後の血清試料についてアルカリホスファターゼ・アイソザイム毎の活性を検出した電気泳動写真である。アルカリホスファターゼの骨型アイソザイムをＢ、小腸型アイソザイムをＩで示す。
【図４】図４は、４週間後の骨組織中のアルカリホスファターゼ活性（μmol/min/mg）を示すグラフである。＊、＊＊は、対照サンプルとの間で有意差が示されたことを示す。
【図５】図５は、骨組織中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性（μmol/min/mg）を示すグラフである。＊＊は、対照サンプルとの間で有意差が示されたことを示す。
【図６】図６は、血清1,25(OH)2D3［活性型ビタミンＤ３］（pg/ml）量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイタケから製造される骨粗鬆症予防改善剤に関する。本発明における骨粗鬆症予防改善剤とは、骨粗鬆症（Osteoporosis）の予防、骨粗鬆症の進行・進展の防止、及び／又は骨粗鬆症患者における骨の状態（骨密度や骨の質によって示される骨強度など）の改善のため、更には骨の健康状態を維持するために、ヒト若しくはヒト以外の動物に与えられる医薬品（動物用治療薬も含む）用、飲食品用、及び飼料用の組成物を意味する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症とは、一般的には、骨量が減少し、骨組織の微細構造が変化して骨がもろくなり、骨強度が低下して骨折を起こしやすくなった状態を言う。骨粗鬆症のこのような骨の状態は、骨代謝における骨形成と骨吸収のバランスが崩れることにより引き起こされる骨の質の低下に起因するものと考えられている。特に閉経後の女性では、女性ホルモン分泌の低下に伴い、骨吸収に対する女性ホルモンの抑制効果が低下するため、骨粗鬆症が発症しやすい。
【０００３】
骨粗鬆症の治療には、現在、ビスホスフォネート、エストロゲン、カルシトニンなどの骨吸収抑制剤、ビタミンＫ２などの骨形成促進剤、カルシウム剤などの骨代謝調節剤のような、骨代謝を改善するための薬剤が使用されている。閉経後の女性においては、人工エストロゲンを投与するエストロゲン補充療法が特に有効とされているが、人工エストロゲンの投与には、乳癌や心血管障害のリスクが高まるなどの無視できない副作用も指摘されている（非特許文献１）。このため、そのような副作用がより少なく、そして簡便に服用出来る骨粗鬆症の治療又は改善用の薬剤の開発が望まれている。
【０００４】
また骨粗鬆症は、進行すると少しの衝撃でも簡単に骨折を起こすようになり、その結果、患者の「寝たきり」を誘発する。このため、骨粗鬆症の予防や進行抑制に有効な医薬品や機能性食品等の開発も急務となっている。骨粗鬆症の予防には、一般にカルシウムを多く摂取することが効果的とされているが、食餌性カルシウムの腸管吸収には活性型ビタミンＤ３の存在が重要な役割を果たす。この活性型ビタミンＤ３、すなわち1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3（1,25(OH)2D3）は、ビタミンＤが生体内で肝臓及び腎臓において水酸化を受けて活性化されることにより生成される。統合失調症の代表的な治療薬であるクロルプロマジンを長期服用する患者に骨吸収性疾患が発症することは知られているが（非特許文献２）、これはクロルプロマジンがビタミンＤの活性型への代謝系を阻害し、結果的に食餌性カルシウムの腸管吸収を阻害することに起因すると考えられている（非特許文献３）。すなわち、骨粗鬆症の有効な予防及び改善には、カルシウムの摂取と併せて活性型ビタミンＤ３の生成増強が重要である。
【０００５】
健康食品の利用は、高齢化社会の到来や医療費負担の増加等を背景として、代替医療として注目を集めるようになってきている。現在では、健康食品素材として非常に幅広い食材が研究されている。例えば骨粗鬆症の予防効果を狙ったものとして、女性ホルモン様作用を有するイソフラボンが含まれる大豆を利用した健康食品が数多く市販されている。このように食品素材の中から骨粗鬆症の予防改善効果のあるものを探索することは医薬品による副作用の回避や安全性の面から望ましい。しかし、現在用いられている食品素材では、必ずしも骨粗鬆症における作用機構が明らかになっていない。より安全でより効果の高い骨粗鬆症予防改善用の健康食品等を開発するためには、骨の代謝のメカニズムにおける作用点の解明が進んだ食品素材を用いることが望ましい。
【０００６】
キノコは、古くより、食事によって健康を維持するという意味の「医食同源」に適した食材として知られてきた。霊芝は古代から不老不死の妙薬として珍重されてきたし、また「椎茸は気を益しも飢えず、風を治し、血を破る」と中国の古書（日用本草、呉端著）に紹介されるなど、キノコ類のもつ薬理効果は高く評価されてきた。
【０００７】
近年、キノコ類の薬理活性についての化学的・臨床的な分析が進められている。かつて大々的に報道されたサルノコシカケの抗癌作用の他にも、シイタケのレンチナン、カワラタケのクレスチン、スエヒロタケのシゾフィラン、マイタケの熱水抽出物などに制癌作用が認められている（特許文献１及び２、非特許文献４）。マイタケについては、馬の体調維持増進用や、家畜飼料添加剤としての用途も知られている（特許文献３及び４）。また、キノコ類のもつβ−グルカンは、食物繊維として有用であるだけでなく、ナチュラルキラー細胞やＴリンパ球の活性を高める免疫賦活作用を有することが知られている（非特許文献５）。また、キノコ類に含まれるエリタデニンはコレステロール代謝を促進し、動脈硬化を予防する効果があるとされる（非特許文献６）。キノコ類は、ビタミンも豊富に含んでおり、特にビタミンＤの含量は他の食材と比較して高含量である（非特許文献７）。上述した通り、ビタミンＤは食餌性カルシウムの腸管吸収に不可欠であり、ビタミンＤの欠乏は骨軟化症や骨粗鬆症などの骨吸収性疾患を招くことが知られている。
【０００８】
【特許文献１】特開平０９−２３８６９７号公報
【特許文献２】特開２００１−０９７８８１号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９２４号公報
【特許文献４】特開２００３−２５９８１６号公報
【非特許文献１】Writing Group for the WHI Investigators, JAMA(2002)288(3): p.321-333
【非特許文献２】Komoda T., et al., Calcif. Tissue Int. (1989) 42: p.58-62
【非特許文献３】Oh-ie K. et al., J. Bone Mine. Metab. (2002) 20: p.21-27
【非特許文献４】Hishida I. et al., Chem. Pharm. Bull. (1988) 36(5): p.1819-1827
【非特許文献５】Fullerton SA et al., Molecul. Urol. (2000) 4: p. 7-13
【非特許文献６】Shimada Y. et al., J. Nutrit. (2003) 133: p.758-765
【非特許文献７】五訂日本食品標準成分表（科学技術庁資源調査会編）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、より長期間にわたり安全に、しかも簡便に摂取出来る医薬品は勿論のこと飲食品や飼料にも使用できる骨粗鬆症予防改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、乾燥マイタケを骨粗鬆症予防改善剤として投与することにより、骨吸収を増大させる酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）の活性を低下させるという新知見を得ると共に、加えてカルシウムの腸管吸収に不可欠である活性型ビタミンＤ３の血中濃度増加をも達成できることを見出し、この知見に基いて本発明を完成させた。すなわち本発明は次の通りである。
【００１１】
（１）乾燥マイタケを有効成分として含有することを特徴とする、骨粗鬆症予防改善剤、
（２）骨吸収抑制作用と骨形成促進作用とを有する、上記（１）に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（３）骨吸収抑制作用が酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下によって示され、かつ、骨形成促進作用が活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加によって示される、上記（２）に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（４）乾燥マイタケが、マイタケを８５℃以下の温度で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（５）乾燥マイタケが、マイタケを６０℃以上８０℃以下の温度で、温度を上げながら乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（６）乾燥マイタケが、−４０℃以下の温度で凍結したマイタケを凍結乾燥機で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の、飲食品又は飼料。
（８）上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の医薬品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、良好な骨粗鬆症の予防及び改善効果を発揮する。さらに、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含む飲食品及び飼料を用いれば、簡便に骨粗鬆症の予防効果及び改善効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
1. 骨粗鬆症
骨は、破骨細胞が古い骨を壊し（骨吸収）、骨芽細胞が新しい骨をつくる（骨形成）という骨代謝が繰り返される（骨代謝回転）ことにより、新しい骨に置き換えられていく。この骨吸収と骨形成のバランスが崩れると、骨の微細構造の劣化が起こり、骨粗鬆症が誘発される。
【００１５】
臨床的には、骨粗鬆症の診断は、主にレントゲン評価法と骨密度測定法によって行われており、明らかな外傷がないのにレントゲン検査で骨折が認められた場合の他、骨折がなくても骨密度測定検査で若年者の骨密度基準値（20〜44歳の骨密度平均値）の70％未満であれば、骨粗鬆症と判断される。なお、骨密度が若年者の基準値の70〜80％である場合は骨量減少（骨粗鬆症の予備軍）、80％以上であれば正常とみなされる。
【００１６】
2000年の米国公衆衛生研究所（ＮＩＨ）のコンセンサス会議において、骨粗鬆症の国際的な定義は、「骨折リスクを増すような骨強度上の問題（compromised bone strength）をすでに持っている人に起こる骨格の疾患」に変更された。この「骨強度」は、骨密度（bone mineral density; BMD）と骨の質（bone quality）の両方によって決まるものである。骨密度は、単位面積または単位体積あたりのミネラル量（骨量）として表され、一方、骨の質は、骨の微細構造、骨代謝回転、微小ダメージの蓄積、石灰化の程度、コラーゲン等の骨基質の特性で規定される。骨粗鬆症においては骨密度と骨折リスクが必ずしも相関しないことから、骨強度の重要な決定要因として骨の質を考慮するように骨粗鬆症の定義が改定されたという経緯がある。
【００１７】
本発明では、このような骨粗鬆症に対し良好な効果を有する食品素材や薬剤として、後述のようにして製造される乾燥マイタケを用いた骨粗鬆症予防改善剤を提供する。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、投与した被験体において骨吸収を抑制し、かつ骨形成を促進することができ、それにより骨の質を改善する効果を有する。
【００１８】
2. 乾燥マイタケの製造及び乾燥マイタケの骨粗鬆症予防改善剤としての効果
本発明の乾燥マイタケの原料として用いるマイタケには、例えば、日常食材として用いられているマイタケ［舞茸］（Grifola frondosa）に限られることなくシロマイタケ（Grifola albicans Imaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）、トンビマイタケ（Grifola gigantea）なども包含する。本発明の乾燥マイタケの原料としては、マイタケの菌糸体及びその培養物を用いてもよいが、その子実体を用いることがより好ましい。マイタケ（例えば、Grifola frondosa）の子実体としては人工的に栽培され食用に販売されているものを入手して用いてもよいし、野生のものを採集して用いてもよい。品質の安定性、安定供給の面からは、人工的に栽培した子実体を用いるのが好ましい。
【００１９】
乾燥マイタケは、原料とするマイタケを自然乾燥法又は人工乾燥法等の任意の乾燥法によって乾燥させることによって製造することができる。自然乾燥法としては天日乾燥、日陰干し乾燥などが挙げられる。人工乾燥法としては加熱及び／又は加温による乾燥法、凍結乾燥法などが挙げられる。しかし本発明における乾燥マイタケの製造においては、これらに限定されることなく使用目的に応じて種々の乾燥方法を適宜選択出来る。どの様な乾燥方法であれ、８５℃以下の温度でマイタケを乾燥させるのがより好ましい。
【００２０】
乾燥マイタケを経済的且つ大量生産に適した方法で製造するには、加熱及び／又は加温による乾燥法、集中熱風乾燥法などを用いることが好ましい。これらの方法には箱型棚式、回転式、トンネル式等などの様々な乾燥機を使用できる。加熱による乾燥法の場合、温度条件には特に配慮が必要である。例えば５０℃以上８５℃以下の温度範囲、好ましくは６０℃以上８０℃以下（６０℃〜８０℃）の温度で乾燥させるのが好ましい。マイタケは、徐々に、段階的に温度を上げながら乾燥させてもよい。更に好ましくは、マイタケを、６０℃から徐々に段階的に温度を上げ最終的に８０℃に至る間に乾燥させるのが好ましい。乾燥の終了時点は、通常は、乾燥マイタケの水分含量が約１０％以下となるのを目処として決定する。できるならば、乾燥マイタケの水分含量は約８％以下であるのが好ましい。乾燥マイタケの水分含量は、一般的な食品の水分含量の測定法に従って測定することができる。乾燥に要する時間（加熱乾燥法の場合には、加熱時間）は、原料とするマイタケ（例えば、生マイタケ）の水分含有量、乾燥する総量などによって異なり、一概に特定出来ないが、概ね約１５〜３０時間の範囲である。上記の様に乾燥温度の上限を８５℃以下に設定し、より低い温度から徐々に温度を上げながらその上限温度に達するまでの間にマイタケを乾燥させることにより得られた乾燥マイタケは，硬質化したり黒褐色化したりすることなく、粉末化などの加工も容易である。以上のような本発明の乾燥マイタケの具体的な製造例は、後述の実施例に記載されている。
【００２１】
一方、凍結乾燥法で乾燥マイタケを製造する場合の一例を示すと、まず、フリーザー中で少なくとも−４０℃以下、好ましくは−８０℃前後でマイタケを凍結する。凍結する際、マイタケは１cm角以下にカットしておくことが好ましい。次いで、凍結したマイタケを凍結乾燥機で乾燥させる。
【００２２】
この乾燥は通常、加熱板（棚）を有する乾燥庫（棚）で、減圧下、加熱板（棚）を加熱することによって行われる。加熱板（棚）の加熱温度は特定されるものでなく、適宜選択しうるが、例えば、凍結マイタケを、減圧下、加熱板（棚）上にのせ、該加熱板（棚）を３０℃〜５０℃の範囲の温度に加熱して乾燥させるのが好ましい。乾燥の終了時点は、通常は、乾燥マイタケの水分含量が約１０％以下となるのを目処として決定する。できるならば、乾燥マイタケの水分含量は約８％以下であるのが好ましい。凍結乾燥法で得られた乾燥マイタケはソフトで、粉末化などの加工も容易である。凍結乾燥法による本発明の乾燥マイタケの具体的な製造例は、後述の実施例に記載されている。
【００２３】
以上のようにして得られた乾燥マイタケは、例えば粉砕機により、粉末化することが出来る。粉砕機としては、ボールミル、ジェットミル、揺動ミル、挽臼その他種々の粉砕機が使用できる。あるいは、この乾燥マイタケは、粉末化せず、当業者に周知の食品・飼料の加工技術により、各種用途（例えば動物の飼料への配合等）に適した小片状、細粒状、顆粒状等の任意の形状に調製することもできる。本発明における「乾燥マイタケ」とは、乾燥させたマイタケ子実体の他に、そのような粉末状、細粒状、小片状、顆粒状などの任意の形状の乾燥マイタケも意味するものとする。
【００２４】
以上のようにして製造される本発明の乾燥マイタケは、被験体に投与（好ましくは経口投与）することにより、骨粗鬆症予防改善効果を発揮する。本発明において「骨粗鬆症予防改善効果」とは、投与した被験体（ヒト及び他のヒト以外の動物を含む、骨粗鬆症患者及び健常者等）において、骨の健康状態の維持、骨粗鬆症の発症予防、骨粗鬆症の進行・進展の防止及び／又は骨の状態（骨密度及び骨の質によって示される骨強度など）の改善をもたらすことを意味する。すなわち本発明の乾燥マイタケは、骨粗鬆症予防改善剤として用いることができる。骨粗鬆症予防改善剤として用いる上で、本発明の乾燥マイタケは、通常は、上記のように粉末状や細粒状などに成形したものを用いるのが好ましい。
【００２５】
本発明の乾燥マイタケに加えて、場合により、医薬品や飲食品に使用できる任意の添加剤（水、安定化剤、緩衝剤、賦形剤、保存剤、及び抗酸化剤等）をさらに添加した組成物も、本発明の骨粗鬆症予防改善剤として用いることができる。本発明の骨粗鬆症予防改善剤の効果は、例えば、当技術分野において通常用いられる骨粗鬆症の検査法を用いて確認することができる。
【００２６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤による骨粗鬆症予防効果は、限定するものではないが、例えば本発明の骨粗鬆症予防改善剤（例えば、乾燥マイタケ又は乾燥マイタケに添加剤を加えた組成物）を投与した被験体の骨密度が、若年者の骨密度基準値（２０〜４４歳の骨密度平均値）の７０％以上の範囲、好ましくは８０％以上の範囲に維持されることによって示される。また本発明の骨粗鬆症予防改善剤による骨粗鬆症改善効果は、例えば本発明の骨粗鬆症予防改善剤を投与した被験体の骨密度が、投与前と比較して増加することによって示される。
【００２７】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用とを有することが好ましい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤が有するこれらの作用は、限定するものではないが、例えば、被験体由来の検体（例えば血液、尿など）中の骨代謝マーカーの量によって示されるものであってよい。骨代謝マーカーは、従来、骨代謝回転を評価するための指標として用いられてきたが、近年、骨の質の将来予測や骨粗鬆症治療薬の効果の評価にも利用されるようになってきている。骨代謝マーカーには、骨吸収に伴って生成する物質である骨吸収マーカー、及び骨形成に伴って生成する物質である骨形成マーカーがある。例えば、測定の結果、骨吸収マーカー値が高いか又は上昇傾向を示していれば、骨吸収は亢進しており、骨の質は低下傾向にあると判断される。逆に骨吸収マーカーの測定値が低いか又は下降傾向を示していれば、骨吸収は抑制されており、骨の質は維持又は改善傾向にあると判断される。一方、骨形成マーカー値が低いか又は下降傾向を示している場合には、骨形成は抑制されており、骨の質は低下傾向にあると判断される。そして骨の質が低下傾向にある場合には、将来の骨折リスクがより高まっていると予測される。逆に、骨形成マーカー値が高いか又は上昇傾向を示している場合には、骨形成は促進されており、骨の質は改善傾向にあると判断される。
【００２８】
骨代謝マーカーとしては、限定するものではないが、以下のようなものを用いることができる。
【００２９】
【表１】
【００３０】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤の骨吸収抑制作用は、特に、好ましくは骨吸収マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の低下によって示される。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の低下とは、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を投与しない場合と比較して、それを投与した被験体における酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性が低下することを意味する。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性を低下させることによって、骨吸収量の増加を抑制し（より好ましくは骨吸収量を減少させ）、その結果、骨粗鬆症の病状の進行（すなわち、骨の状態の悪化）を阻止又は遅延させたり、骨粗鬆症の骨の状態を改善（すなわち、骨密度の増加及び／又は骨の質の健常化）させたり、未だ骨粗鬆症に至っていない骨の状態を改善させて骨粗鬆症の発症を予防又は遅延させたりすることができる。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の測定は、比色法、ELISA、RIA等の当業者に公知の任意の測定法によって行えばよい。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の測定用キットも、市販されている（TRACP & ALP二重染色キット（TaKaRa社）、Bone TRAP Assay [ヒト用、ラット用、マウス用]（SBA社）等）。
【００３１】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤の骨形成促進作用は、骨形成マーカー以外の指標によって示されるものでもよく、好ましくは、活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加によって示されるものである。活性型ビタミンＤ３は、カルシウムやリンの腸管からの吸収を促進し、それらを骨に沈着させる作用などによって骨形成を助ける働きをもつことが知られており、そのため活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加は骨形成を促進する効果をもたらす。本発明における活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加とは、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を投与しない場合と比較して、それを投与した被験体における活性型ビタミンＤ３の血中濃度が増加することを意味する。限定するものではないが、本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、活性型ビタミンＤ３の血中濃度を、投与しない場合と比較して有意に増加させるものであることがより好ましい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、活性型ビタミンＤ３の血中濃度を増加させることによって骨形成を促進し、その結果、骨粗鬆症の病状の進行（すなわち、骨の状態の悪化）を阻止又は遅延させたり、骨粗鬆症の骨の状態を改善（すなわち、骨密度の増加及び／又は骨の質の健常化）させたり、未だ骨粗鬆症に至っていない骨の状態を改善させて骨粗鬆症の発症を予防又は遅延させたりすることができる。活性型ビタミンＤ３の血中濃度の測定法としては、HPLC法、RRA法、RIA法等が知られ、測定用のキットも市販されている。当業者に公知の任意の測定法によって行うことできるが、好適な測定方法は、後述の実施例に記載した通りである。
【００３２】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、骨吸収を抑制し、かつ骨形成を促進することができるため、骨粗鬆症の予防及び改善において非常に有効である。本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、長期にわたって継続して摂取することができ、かつその結果として良好な骨粗鬆症予防効果及び改善効果を発揮する。
【００３３】
3. 骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品又は飼料
本発明は、上記のような骨粗鬆症予防改善剤を配合し含有させた飲食品にも関する。本明細書において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品及び機能性食品等を包含する。
【００３４】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合する飲食品は、特に限定されない。例えば本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含む飲料として、発酵乳（ヨーグルト飲料等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳等）、牛乳、加工乳、お茶系飲料（緑茶、ウーロン茶など）、果物・野菜系飲料（りんご等の果汁や、トマト等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、ワイン等）等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（社団法人 全国清涼飲料工業会、財団法人 日本炭酸飲料検査協会 監修；株式会社光琳 発行）等を参考にすることができる。
【００３５】
また本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合する食品は、特に限定されず、生鮮食品であってもよいし、加工食品であってもよい。例えば、アイスクリーム、チーズ、バター、パスタ、かまぼこ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、スープ、パン、魚肉、加工肉、野菜、きのこなどの様々な食品を例示することができる。本発明において特に好適な食品としては、カルシウムを多く含む食品である乳製品や小魚の乾物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合した飲食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する加工食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[条件付き特定保健用食品]を含む）および栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセルおよび液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。
【００３７】
特に本邦では、規制当局の認可を得たり基準に合致したりすれば、「骨の健康が気になる方の食品」等の表示の可能な特定保健用食品や栄養機能食品等が認められている。そこで、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合した機能性食品は、例えば「骨吸収の抑制と骨形成の促進を助けるため」、「骨の健康が気になる方のため」、又は「骨粗鬆症のリスクを低減するため」などの表示を付した特定保健用食品や栄養機能食品であってもよい。しかし本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合した機能性食品は、当然これらの特定保健用食品等に限定されるものではない。
【００３８】
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジェル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。
【００３９】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤の飲食品への配合量は特に限定されず、場合に応じて様々であってよい。具体的な配合量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。
【００４０】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲食品に配合させればよい。例えば、本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、液体状、ゲル状、固体状、粉末状または顆粒状に調製した後、それを飲食品に配合してもよい。また本発明の骨粗鬆症予防改善剤に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明の免疫賦活用組成物を含有させた飲食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。
【００４１】
本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤、着色料、香料、甘味料、保存料、乳化剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、化学調味料、増粘剤、膨張剤、消泡剤等、結着剤、栄養強化剤等が挙げられる。
【００４２】
本発明では、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を配合し含有させた飼料も提供する。そのような飼料としては、家畜、家禽その他の哺乳動物、又は魚類に用いる粉状、練り製品状、ペレット状、固形状、フレーク状等の飼料、栄養補助製品（サプリメント）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの飼料には、通常の飼料に使用される任意の原材料、例えば動物性材料、植物性材料、各種添加物等を基礎飼料として使用することができる。
【００４３】
動物由来材料としては、限定するものではないが、例えば、牛、豚、鶏、羊等の家畜、魚介類（例えばマグロ、カツオ、アジ、イワシ、タコ等）等から得られる肉、皮膚、骨、臓器、卵、血液、乳、動物性脂肪等の生体組織、その乾燥粉末、又はそれらの加工製品が挙げられる。
【００４４】
また植物由来材料としては、限定するものではないが、例えば、ニンジン、キャベツ等の野菜類、ゴマ、ヒマワリの実等の種実類、コムギ、トウモロコシ等の穀類、ダイズ、インゲン等の豆類、サツマイモ、コーンスターチ等の澱粉類、ダイズ油、ゴマ油等の植物性油脂類、ミカン、リンゴ等の果実類、エノキ、シメジ等の菌糸類、ワカメ、クロレラ等の藻類、イネ科牧草、マメ科牧草等の牧草等から得られる植物組織、その乾燥粉末、又はそれらの加工製品が挙げられる。
【００４５】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を動物飼料に配合する場合、骨粗鬆症予防改善剤に用いられる乾燥マイタケの形状は、乾燥させたそのままの状態、又は小片、細粒、若しくは粉末等から、目的に応じて適宜選択できる。
【００４６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、上述の飲食品と同様の方法によって飼料に配合すればよい。飼料にさらに配合できる添加物の例は、飲食品に関する上記説明と同様である。また、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有させた飼料をさらに加工することもできる。そのような加工製品も、本発明の範囲に包含される。
【００４７】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、好ましくは、骨粗鬆症の予防、進行の防止用、及び骨粗鬆症の骨の状態（例えば、低下した骨強度など）の改善用のものである。本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料はまた、骨粗鬆症を発症していない骨の健康保持用（例えば、健全な骨強度の保持用）のものであってもよい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、限定するものではないが、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物が摂取するためのものであることが好ましく、特に、骨粗鬆症に罹患している哺乳動物、骨粗鬆症の素因（例えば、骨粗鬆症に罹患しやすい環境要因や遺伝的素因）を有する哺乳動物、骨の質（例えば骨代謝マーカーの値を指標として示される）や骨密度が低下している哺乳動物が、摂取するためのものであることが好ましい。例えば、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の上昇と、活性型ビタミンＤ３の血中濃度の低下を示している哺乳動物が摂取するためのものであってよい。本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料はまた、哺乳類の雌（ヒトでは女性）が摂取するのに適している。雌（又は女性）は、妊娠中や授乳期に大量のカルシウムを必要とし、また閉経後には骨吸収を抑制する作用を有する女性ホルモンの分泌が激減することから、骨量が減少しやすく骨粗鬆症に罹患しやすいためである。より具体的には、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品は、骨粗鬆症患者のほか、骨量減少が認められる骨粗鬆症予備軍の患者や、骨粗鬆症の素因を有するヒト、例えば妊婦や授乳期の女性、閉経後の女性、女性ホルモンの分泌に異常のある女性、日常的にカルシウム摂取不足の人、喫煙習慣のある人、日常的なアルコール摂取量が多い人、日常的に運動不足の人、痩せている人（体重が重いほど骨に加重がかかり、骨形成が促されることに加え、脂肪中には女性ホルモンが含まれるため）、骨粗鬆症患者を家族にもつ人などが摂取するのに特に適している。
【００４８】
何れにしても、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料は、広範な被験体において、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下による骨吸収の抑制効果と、活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加による骨形成の促進効果とを発揮する。すなわち、本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含有する飲食品及び飼料の投与対象（被験体）は、性別や年齢等によって限定されるものではなく、上記のような女性や高齢者にも限定されない。
【００４９】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を飲食品に配合する場合、骨粗鬆症を予防・改善するのに必要な配合量は、年齢及び体重、摂取頻度、骨の状態等により異なるが、当業者であればその具体的な量を適宜決定することができる。例えば、乾燥マイタケの重量を基準として、１日につき体重１kg当たり３０〜１００mgを目安とするがこれに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を飼料に配合する量は、生物種、性別、年齢によって異なり一概に特定しがたいが、１日につき体重kg当たり、乾燥マイタケの量で、５〜６００mg（乾燥重量）を目安とする（但し、この量に限定されるものではない）。
【００５１】
摂取期間は、被験体の骨粗鬆症の骨の状態、症状、骨代謝マーカーの値等の経過を考慮して決定すればよいが、できるだけ長期にわたって摂取することが好ましい。
【００５２】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を含む飲食品及び飼料を用いれば、経口摂取によって骨の健康の維持効果は勿論のこと簡便に骨粗鬆症の良好な予防効果及び改善効果を得ることができる。
【００５３】
4. 骨粗鬆症予防改善剤を含有する医薬品
本発明は、上記のようにして調製された骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品(動物薬を含む)にも関する。本発明では任意の形状に調製された乾燥マイタケを含有する骨粗鬆症予防改善剤を医薬品に配合することができるが、一般的には、粉末化した乾燥マイタケを骨粗鬆症予防改善剤として医薬品に配合することが好ましい。
【００５４】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品には、医薬製剤に一般的に使用される担体、賦形剤、その他の添加剤を配合してもよい。例えば、水、生理食塩水、薬学上許容される有機溶剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤等を添加することができる。これらは製剤の剤形等に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の医薬品には、さらに他の薬理成分が配合されていてもよい。
【００５５】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品は、経口的又は非経口的に投与できるが、特に経口的に投与することが好ましい。経口投与するための本発明の医薬品は、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジェル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であり得る。本発明の医薬品は、使用前に液体製剤として調製してから用いることを意図した乾燥物の状態であってもよい。
【００５６】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤を有効成分として含有する医薬品は、被験体に投与することにより、骨粗鬆症予防改善効果を発揮する。本発明の医薬品は、他の薬理物質を含む別の治療用途のための医薬品に、骨粗鬆症予防改善効果を追加するものであってもよい。
【００５７】
本発明の医薬品は、骨吸収抑制作用を有する。この骨吸収抑制作用は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下によって明確に示される。本発明の医薬品はまた、骨形成促進作用を有する。その骨形成促進作用は、活性型ビタミンＤ３(1,25(OH)2D3)の血中濃度の増加によって明確に示される。従って本発明の医薬品は、骨粗鬆症の予防、その進行の防止、及び／又は骨粗鬆症に罹患した骨の状態の改善だけでなく、骨粗鬆症を発症していない骨の健康保持のためにも有用である。本発明の医薬品を投与する対象（被験体）は、上記の飲食品及び飼料を摂取するのに適しているとして記載した対象と同じであるが、骨粗鬆症に罹患している哺乳動物や骨の質（例えば骨代謝マーカーの値を指標として示される）や骨密度が低下している哺乳動物が特に好ましい。
【００５８】
本発明の医薬品の投与量は、投与対象の生物種、年齢及び体重、投与経路、投与回数、状態により異なり、一概には決めがたいが、当業者ならば前記、飲食品、又は飼料への配合量を目安として個々のケースに対応して用量を増やすなど適宜決定することができる。本発明の医薬品は、単回投与でもよいが、長期にわたって反復的に投与することができる。本発明の医薬品は、長期間投与しても有害な副作用がほとんど無く、安全性が高い。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。
【００６０】
[実施例１] 乾燥マイタケの製造 −加熱乾燥法−
乾燥マイタケ粉末は、以下の手順に従って製造した。
人工栽培で生産したマイタケ子実体を、厚さ５〜１０mmにスライスし棚型式乾燥室の棚に、出来るだけ重ならないように置き、６０℃〜８０℃の温度に加熱した熱風を当てて乾燥させた。このとき、熱風の温度を最初は６０℃とし、それから徐々に段階的に温度を上げ、最終的に８０℃で維持して、ほぼ１日かけて乾燥した。生マイタケがやや縮小した外観を保つが重量は乾燥前の９〜１１分の１の乾燥マイタケを得た。この乾燥マイタケは、手の力によって簡単に崩れるような状態であった。
【００６１】
この乾燥マイタケを粉砕機ロールミルで粉砕することにより、淡褐色の、マイタケ特有の匂いを有する、水分含有率が５%以下のふんわりした微粉末を得た。
【００６２】
【表２】
【００６３】
［実施例２］ 乾燥マイタケの製造 −凍結乾燥法−
乾燥マイタケ微粉末を以下の手順に従って製造した。
人工栽培で生産したマイタケの子実体を５〜１０mm角となるようカットし、その２００gをとってステンレス皿に平らに入れ、−８０℃の冷凍庫に収納して凍結マイタケ片を得た。
【００６４】
冷凍庫からステンレス皿を取り出し、予め稼働させておいた凍結乾燥装置の乾燥庫内加熱板へ速やかに載せた後、乾燥庫を真空ポンプで減圧し、凍結乾燥を開始した。このとき、乾燥庫内加熱板の温度を予め３０℃に保っておき、乾燥の進行とともに徐々に昇温させ、最終温度が５０℃になるよう調節操作し、乾燥の進行を早めた。加熱板の温度５０℃を維持したまま、乾燥を開始してから２４時間後、ソフトな乾燥マイタケ片を得た。
【００６５】
次いで得られた乾燥マイタケ片を粉砕ミルを用いて粉砕したところ、上記の実施例１で得た粉末よりも淡い匂いの灰白色の乾燥マイタケ微粉末１９．５gを得た。この乾燥マイタケ微粉末の水分含有率は４．６％であった。
【００６６】
［実施例３］ 飼料の調製と投与
実施例１で製造した乾燥マイタケ粉末を、最終濃度１０％になるように固形飼料（日本クレア製）に混合し、これを、乾燥マイタケを含有する飼料（以下マイタケ飼料と称す）として用いた。対照として、乾燥マイタケ粉末を配合しない同じ固形飼料（以下対照飼料と称す）を使用した。
【００６７】
ウィスター系雌ラット（体重約150g）４〜６匹を１グループとして、８グループを用意した。その半分（各４グループ）のラットには、正常群としてエーテル麻酔下で疑似（sham）手術を行った。一方、もう半分（各４グループ）のラットには、OVX群（試験群）として同様のエーテル麻酔下で卵巣切除術（ovarietectomy, OVX）［Gala J. et al., Bri. J. Nutrit. (2001) 86: p.521-527に詳述］を施した。以下の実施例ではこのOVX群を骨粗鬆症のモデル動物として用いた。これら正常群とOVX群の両方について、それぞれ半分のグループ（各２グループ）のラットに対照飼料を自由摂取させ、また残りのグループ（各２グループ）のラットにマイタケ飼料を自由摂取させた。このようにして、正常ラット対照飼料摂取群、正常ラットマイタケ飼料摂取群、OVXラット対照飼料摂取群、そしてOVXラットマイタケ飼料摂取群の４つの実験群を構築し、１２週間にわたって上記飼料を与えて飼育した。
【００６８】
[実施例４] ラットの経時的体重変化
ラットの成長に対するマイタケ飼料の影響を調べるために、実施例３の正常ラット対照飼料摂取群、正常ラットマイタケ飼料摂取群、OVXラット対照飼料摂取群、及びOVXラットマイタケ飼料摂取群の各ラットについて、飼料摂取の開始時、４週間後、８週間後及び１２週間後に体重測定を行った。この結果を図１に示す。図１から分かるように、正常群では、マイタケ飼料を摂取した場合（正常ラットマイタケ飼料摂取群；(A)の黒丸）、体重増加が１２週間にわたり継続的に抑制された（正常ラット対照飼料摂取群［(A)の白丸］と比較して）。これに対しOVX群では、OVXラットマイタケ飼料摂取群［(B)の黒丸］とOVXラット対照飼料摂取群［(B)の白丸］との間に体重増加率の相違は認められなかった。
【００６９】
なおOVX群と正常群とを比較すると、OVX群でより高い体重増加率が示された。飼料摂取開始の１２週間後の平均体重は、正常ラット対照飼料摂取群で354gであったのに対し、OVXラット対照飼料摂取群では398gであり約１２％高い値となった。また正常ラットマイタケ飼料摂取群の１２週間後の平均体重が317gであったのに対し、OVXラットマイタケ飼料摂取群では418gであり約３２％も高い値となった。この結果は、閉経後の女性において体重増加がよく認められることと一致しており、OVX群が骨粗鬆症をよく反映したモデルであることを示している。
【００７０】
[実施例５] 試料の調製と血清試料の分析
実施例３の正常ラット対照飼料摂取群、正常ラットマイタケ飼料摂取群、OVXラット対照飼料摂取群、及びOVXラットマイタケ飼料摂取群について、飼料摂取開始から４週間後及び１２週間後に、各群につき１グループのラットをエーテル麻酔下で脱血致死させ、常法により血清を採取して、これを以下で用いる血清試料とした。さらに、脱血致死させたラットから頭頂骨を採取し、これをプロテアーゼインヒビターおよび0.1％ Triton-Xを含むトリス緩衝液（TB, pH7.5, 50mM）中でホモジナイズして、得られたホモジネートを後述のAP活性又はTRAP活性測定用の試料とした［Koyama, I. et al., J.Chromatogr. (1986)374: p51-59に詳述］。
【００７１】
［実施例６］血清カルシウム濃度及び血清無機リン濃度の測定
実施例５で得られた血清試料について、o-クレゾールフタレインコンプレクソン（oCPC）法［金井泉，金井正光：臨床検査法提要 第29版 (1983) 金原出版，p.477-484に詳述］により血清カルシウム濃度を測定した。この方法では、8-オキシキノリンにてマグネシウムを隠蔽し、アルカリ性下でカルシウムをoCPCとキレート結合させ、570nmにて比色定量した。
【００７２】
一方、上記で得られた血清試料について、フィスケサバロウ（Fiske-SubbaRow）法［金井泉，金井正光：臨床検査法提要 第29版 (1983) 金原出版，p.484-487に詳述］により血清無機リン濃度の測定も行った。この方法では、除蛋白した試料にモリブデン酸アンモニウムを加え、さらに還元剤にて還元して得られたモリブデンブルーを660nmで比色定量した。
【００７３】
これらの結果を図２に示す。図２中、（A）は血清中カルシウム濃度、（B）は血清中無機リン濃度、＋はマイタケ飼料摂取群、−は対照飼料摂取群を表す。飼料摂取開始から４週間後の血清試料について、正常群では、マイタケ飼料摂取群と対照飼料摂取群の間で血清中カルシウム濃度及び血清中無機リン濃度に有意な差は認められなかった。一方、OVX群では、４週間後の血清中カルシウム濃度と血清中無機リン濃度は共に、対照飼料摂取群で、マイタケ飼料摂取群と比較して有意（p＜0.05）に高い値を示した。また、OVXラットマイタケ飼料摂取群のカルシウム濃度及び無機リン濃度は正常群と同程度であった。
【００７４】
この結果に示されるように、骨粗鬆症モデル動物であるOVX群において骨吸収が促進され、結果として血中のカルシウム及び無機リンの量が増加し、またマイタケ飼料の摂取により、OVX群におけるそのようなカルシウム及び無機リンの血中量が正常群と同程度にまで抑制された。すなわち、マイタケ飼料摂取により、OVX処理によって引き起こされる過剰な骨吸収作用が改善されたことを示す。
【００７５】
[実施例７] 血清中のアルカリホスファターゼ活性の測定及びアイソザイムの確認
実施例５で得られた血清試料について、ベッセイ・ローリー（Bessey-Lowry）法によりアルカリホスファターゼ（以下APと略称することがある）活性を測定した。基質に4-ニトロフェニルリン酸、緩衝液には炭酸／重炭酸緩衝液（pH10.0, 50mM）を用いて血清試料と反応させ、生じた4-ニトロフェノールを405nmで比色定量した。なお手順の詳細はKoyama, I. et al., J. Chromatogr. (1986) 374: p51-59を参照して実施した。この結果を図３(A)に示す。
【００７６】
図３(A)に示されるように、OVX群では、４週間後と１２週間後のいずれにおいても、マイタケ飼料摂取群の血清アルカリホスファターゼ活性が、対照飼料摂取群と比較して増大する傾向が示された。このことは、骨粗鬆症モデル動物であるOVX群において、マイタケ飼料摂取により、骨形成マーカーであるアルカリホスファターゼの活性が増加したこと、すなわち骨形成が促進されたことを示している。なお４週間後と１２時間後の血清試料を比較すると、いずれの実験群でも１２週間後の方が血清アルカリホスファターゼ活性が低下していた。
【００７７】
続いて、上記でマイタケ飼料摂取により血清アルカリホスファターゼ活性が増大する傾向が示された血清試料について、ポリアクリルアミドゲルを支持体としたディスク電気泳動により、血清アルカリホスファターゼのアイソザイムの活性を確認した。実施例５で得た飼料摂取開始から４週間後の血清試料を、ディスクゲル（アルフォー、常光）に載せて、３mA／ゲルにて通電して約９０分間電気泳動した後、5-ブロモ-3-インドリルリン酸（BIP）を基質として用いてアルカリホスファターゼ活性バンドを検出した。手順の詳細はKoyama et al., Comp. Biochem. Physiol. (1998) 121B: p.417-423を参照して実施した。この結果を図３(B)に示す。
【００７８】
図３(B)中、骨型アイソザイムをＢ、小腸型アイソザイムをＩで示す。図３(B)から分かるように、正常群とOVX群の両方において、マイタケ飼料摂取群では、対照飼料摂取群と比較して骨型アイソザイム活性が明らかに増加した。すなわちこの結果は、上記実験で示されたマイタケ飼料摂取群における血清中アルカリホスファターゼの活性上昇傾向が、少なくとも一部はアルカリホスファターゼの骨型アイソザイムの活性増加によるものであることを示している。なお、ヒト血清に含まれる主たるアルカリホスファターゼアイソザイムは肝型と骨型であるが、ラット血清の場合は骨型と小腸型である。
【００７９】
［実施例８］骨組織中のアルカリホスファターゼ活性の測定
実施例５で調製した頂頭骨のホモジネート試料について、その抽出液中のアルカリホスファターゼ活性を実施例７と同様にベッセイ・ローリー（Bessey-Lowry）法によって測定し、AP活性を蛋白質１mg当たりの比活性（μmol/min/mg）で表した。その結果を図４に示す。
【００８０】
図４に示すように、飼料摂取開始から４週間後の頂頭骨組織では、OVX対照飼料摂取群におけるアルカリホスファターゼ活性が、正常群と比較して低下した。一方、OVXマイタケ飼料摂取群では、正常群と同程度のアルカリホスファターゼ活性が示され、OVX対照飼料摂取群で見られたアルカリホスファターゼ活性の低下が改善された。
【００８１】
[実施例９] 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性の測定
実施例５で得られた頭頂骨由来のホモジネート試料について、TRAP活性を、最終濃度５０mMの酒石酸を加えた酢酸基質液（pH4.8, 50mM）を用いたベッセイ・ローリー（Bessey-Lowry）法にて測定した。結果は図５に示した。
【００８２】
図５に示すように、飼料摂取開始から４週間後、１２週間後のいずれにおいても、OVX群では、マイタケ飼料摂取群では、対照飼料摂取群と比較してTRAP活性が低下する傾向にあった。特に１２週間後のTRAP活性は、対照飼料摂取群では0.72μmol/min/mgであったのに対して、マイタケ飼料摂取群では0.64μmol/min/mgに低下しており、p＜0.05で有意差が認められた。
【００８３】
以上の測定の結果、骨吸収マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの活性が、OVX群において、マイタケ飼料摂取群で（対照飼料摂取群と比較して）低下したことが示された。すなわち、マイタケ飼料を摂取したラットでは、骨吸収が抑制されたと考えられた。
【００８４】
[実施例１０] 活性型ビタミンＤ３濃度の測定
実施例５で得られた血清試料中の活性型ビタミンＤ３濃度の測定は、検体を脱脂後、モノクローナル抗体を用いたカラムにより前処理し、［125I］を用いたラジオイムノアッセイ（RIA）により測定するW. D. Fraserらにより報告された方法［Ann. Clin. Biochem.(1997)34: p632-637］に準じて、行った。この結果を図６に示す。
【００８５】
図６に示すように、飼料摂取開始から４週間後の血清1,25(OH)2D3［活性型ビタミンＤ３］量は、正常群とOVX群の両方において、マイタケ飼料摂取群で、対照飼料摂取群に比べて増加する傾向を示した。１２週間後の血清1,25(OH)2.D3［活性型ビタミンＤ３］量は、４週間後よりも減少していたが、やはりマイタケ飼料摂取群で、対照飼料摂取群に比べて明らかに増加していた。特にOVX群では、マイタケ飼料摂取群の１２週間後の血清1,25(OH)2D3量が、対照飼料摂取群と比較して有意差（p＜0.05）をもって増加したことが示されていた。
【００８６】
以上の結果は、マイタケ飼料の摂取によって活性型ビタミンＤ３の血清中濃度が増加したことを示していた。このことから、マイタケ飼料を摂取したラットでは、食餌性カルシウムの吸収が促進され、骨形成が促進されたと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の骨粗鬆症予防改善剤は、効果的に骨粗鬆症を予防し改善するための医薬組成物、飲食品及び飼料を製造するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、マイタケ飼料又は対照飼料を摂取したラットの経時的な体重変化を示すグラフである。縦軸はラットの体重（g）、横軸は対照飼料又はマイタケ飼料の摂取を開始した日からの週数を示す。(A)は正常群、(B)はOVX群の結果を示す。白丸は対照飼料摂取群、黒丸はマイタケ飼料摂取群である。データは１グループの４〜６匹の平均値である。横棒は標準偏差を示す。
【図２】図２は、マイタケ飼料又は対照飼料を摂取したラットにおける４週間後の血清カルシウム濃度（mg/dl）［図２(A)］及び血清無機リン濃度（mg/dl）［図２(B)］を示すグラフである。Shamは擬似手術を施した群（正常群）、OVXは卵巣切除術を施した群（OXV群）、＋はマイタケ飼料摂取群、−は対照飼料摂取群を表す（これらは下記図３〜図６についても同様である）。＊は、対照サンプルとの間で有意差が示されたことを示す。
【図３】図３は、血清アルカリホスファターゼ活性の分析結果を示す。図３(A)は、マイタケ飼料又は対照飼料を摂取したラットにおける４週間後及び１２週間後の血清試料についてのアルカリホスファターゼ活性（IU/L）を示すグラフである。図３(B)は、４週間後の血清試料についてアルカリホスファターゼ・アイソザイム毎の活性を検出した電気泳動写真である。アルカリホスファターゼの骨型アイソザイムをＢ、小腸型アイソザイムをＩで示す。
【図４】図４は、４週間後の骨組織中のアルカリホスファターゼ活性（μmol/min/mg）を示すグラフである。＊、＊＊は、対照サンプルとの間で有意差が示されたことを示す。
【図５】図５は、骨組織中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性（μmol/min/mg）を示すグラフである。＊＊は、対照サンプルとの間で有意差が示されたことを示す。
【図６】図６は、血清1,25(OH)2D3［活性型ビタミンＤ３］（pg/ml）量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥マイタケを有効成分として含有することを特徴とする、骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項２】
骨吸収抑制作用と骨形成促進作用とを有する、請求項１に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項３】
骨吸収抑制作用が酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下によって示され、かつ、骨形成促進作用が活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加によって示される、請求項２に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項４】
乾燥マイタケが、マイタケを８５℃以下の温度で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項５】
乾燥マイタケが、マイタケを６０℃以上８０℃以下の温度で、温度を上げながら乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項６】
乾燥マイタケが、−４０℃以下に凍結したマイタケを凍結乾燥機で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の、飲食品又は飼料。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の医薬品。
【請求項１】
乾燥マイタケを有効成分として含有することを特徴とする、骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項２】
骨吸収抑制作用と骨形成促進作用とを有する、請求項１に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項３】
骨吸収抑制作用が酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の低下によって示され、かつ、骨形成促進作用が活性型ビタミンＤ３の血中濃度の増加によって示される、請求項２に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項４】
乾燥マイタケが、マイタケを８５℃以下の温度で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項５】
乾燥マイタケが、マイタケを６０℃以上８０℃以下の温度で、温度を上げながら乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項６】
乾燥マイタケが、−４０℃以下に凍結したマイタケを凍結乾燥機で乾燥させることを特徴とする方法により得られるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の、飲食品又は飼料。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨粗鬆症予防改善剤を含有する、骨粗鬆症の予防、進行防止、若しくは改善用、又は骨の健康保持用の医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−８８２９（Ｐ２００７−８８２９Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８８７５８（Ｐ２００５−１８８７５８）
【出願日】平成１７年６月２８日（２００５．６．２８）
【出願人】（５９３０８４９１５）株式会社雪国まいたけ (30)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２８日（２００５．６．２８）
【出願人】（５９３０８４９１５）株式会社雪国まいたけ (30)
【Ｆターム（参考）】
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