マウス多量体免疫グロブリンレセプターに反応するモノクローナル抗体
【課題】マウス多量体免疫グロブリンレセプター（マウスｐＩｇＲ）に反応するモノクローナル抗体および該抗体を産生できるハイブリドーマの提供。当該抗体を用いて試料（検出対象）に存在するマウスｐＩｇＲを検出する方法の提供。
【解決手段】マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫することで、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体を産生し得る、複数のハイブリドーマ株。ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法。
【解決手段】マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫することで、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体を産生し得る、複数のハイブリドーマ株。ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマウス多量体免疫グロブリンレセプター（以下、ｐＩｇＲとする）に反応するモノクローナル抗体に関する。特に、天然型マウスｐＩｇＲに反応する高感度のモノクローナル抗体に関する。また、これらのモノクローナル抗体をコンスタントに産生できるハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ｐＩｇＲは、粘膜免疫機構において主体的役割を果たす分泌型ＩｇＡ分子の構成成分であり、生体の恒常性維持にとって必要不可欠のものとして知られている。
【０００３】
ｐＩｇＲは、レセプター仲介取り込み等の薬物伝達方法に有用と考えられ、これに特異的に結合する抗体として、ウサギｐＩｇＲ由来のペプチドを抗原とする抗体（例えば、特許文献１参照）や、ウサギ胆汁、ラット胆汁から精製されるｐＩｇＲのタンパク質分解フラグメントを抗原とする抗体（例えば、特許文献２参照）等が作製されている。
【０００４】
また、マウスｐＩｇＲに反応する抗体として、免疫したウサギ等の血清から得られるポリクローナル抗体が得られているが、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体は未だ作製されていない。
ポリクローナル抗体は、その製造には量的な制限があり、同一のロットで永続的に抗体を作製することができないという問題があった。そこで、抗体を安定して供給できるハイブリドーマを得て、モノクローナル抗体を得ることが望まれていた。
【特許文献１】特表２０００−５１１４３２号公報
【特許文献２】特表２００３−５２８８９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はマウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体の提供を課題とする。特に、天然型マウスｐＩｇＲに反応する高感度のモノクローナル抗体の提供を課題とする。また、これらのモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体を産生し得る、複数のハイブリドーマ株を樹立することで本発明を完成するに至った。
本発明によって作製されるモノクローナル抗体は、従来のポリクローナル抗体と比較して、マウスｐＩｇＲに反応する感度が高く、また、天然型マウスｐＩｇＲに反応するため有用である。本発明のモノクローナル抗体は、本発明において樹立されたハイブリドーマ株により、永続的に作製できる。
さらに本発明のモノクローナル抗体は、免疫増強シグナルを付与して抗原抗体反応の活性化を行うことで得られたマウス抗体であるため、マウスに投与した場合に異物として認識されず、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏの実験に使用できる。このようなマウス抗原に反応するマウス抗体の作製自体は非常に困難であり、本発明のモノクローナル抗体は有用性が高いといえる。
【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１３）に記載のモノクローナル抗体、当該抗体を産生するハイブリドーマ等に関する。
（１）マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体。
（２）天然型マウスｐＩｇＲに反応する上記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）反応部位がマウスｐＩｇＲの細胞外領域である上記（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドと反応する上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（５）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫して得られる上記（１）〜（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（６）動物がマウスである上記（５）に記載のモノクローナル抗体。
（７）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターが、免疫増強シグナルをコードする塩基配列を含むベクターである上記（５）または（６）に記載のモノクローナル抗体。
（８）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列が、マウスｐＩｇＲの細胞外領域の塩基配列である上記（５）〜（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（９）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列である上記（５）〜（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の抗体を用いて試料（検出対象）に存在するマウスｐＩｇＲを検出する方法。
（１１）ウェスタンブロッティングまたはＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ（ＥＬＩＳＡ）を用いる上記（１０）に記載のマウスｐＩｇＲを検出する方法。
（１２）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１３）ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）のいずれかである上記（１２）に記載のハイブリドーマ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体は感度が高く、また、天然型マウスｐＩｇＲに反応するため、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ等の実験手法において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体であればいずれのものも該当するが、天然型マウスｐＩｇＲに反応するものが好ましく、感度が高いものが特に好ましい。また、本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、マウスｐＩｇＲの細胞外領域に反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１０】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドと反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。
マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列は、「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」を得られる塩基配列であればいずれの塩基配列であってもよく、マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列の一部であってもよい。例えば、マウスｐＩｇＲの細胞外領域をコードする塩基配列を用いることが好ましく、配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００１１】
本発明のマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列はＰＣＲ法等、一般的に知られているいずれの方法でもクローニングする事ができ、例えば、次のように行うことができる。
マウスの組織または細胞から、例えばクロロホルム／フェノール／イソアミルアルコール／グアニジニウム／ＣｓＣｌ法等公の知のＲＮＡ調製法にて全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー処理にてポリＡ（＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を取得し、逆転写酵素の存在下でｃＤＮＡ合成を行うことができる。ｃＤＮＡ合成およびクローニングキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から市販されているものを用いることができる。このようにして合成されたｃＤＮＡを鋳型にして、プライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＩｇＲをコードするｃＤＮＡを増幅する。
プライマーはマウスｐＩｇＲのセンス鎖およびアンチセンス鎖に対してアニーリングすることができるプライマーであればいずれのものも用いることができる。例えば、データバンク等に記載されているマウスｐＩｇＲのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて設計し、合成することができる。プライマーは１５〜２５塩基程度のサイズを有しており、マウスｐＩｇＲのｃＤＮＡ塩基配列の５′末端および３′末端側の配列からなることが好ましい。プライマーの合成は、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて行うことができる。
【００１２】
ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−９６００，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔなど）を使用して行うことが好ましい。ＰＣＲ条件として、例えば１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）、ｄＮＴＰｓ ２ｍＭ、プラーマー２．５μＭ〜１０μＭ中、Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（１〜２．５単位；ｒＴａｑ（Ｔａｋａｒａ、京都、日本），Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）など）を添加して反応を行うことができる。ＰＣＲは、例えば９５℃、２〜５分での１回の変性サイクルの後、９５℃、０．２〜１分での変性、５０〜６５℃、０．５〜１分でのアニーリング、および７２℃、０．５〜２分での伸長を１サイクルとして１５〜４０サイクルを行い、最後に、７２℃、５分の伸長を行う方法等が挙げられる。
これらのｃＤＮＡクローニングおよびＰＣＲについては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）等）を参照できる。
【００１３】
上記のようにして得られたマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を組み込むベクターとして、プラスミド、ウイルス、ファージ等の一般的に知られているいずれのベクターをも用いることができる。このうち動物細胞発現ベクターを用いる事が好ましく、例えば昆虫細胞発現ベクターまたは哺乳動物細胞発現ベクターが挙げられ、哺乳動物細胞発現ベクターを用いることが特に好ましい。哺乳動物細胞発現ベクターとしては、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等のプラスミドベクター等が挙げられる。これらのベクターは市販のものを用いることができる。
【００１４】
本発明で用いることができるベクターにおいて、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、またはターミネーター等の調節配列を含むことができる。これらの配列を含むことによって、宿主の細胞内でプロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合することによって転写が開始され、目的のタンパク質またはペプチドに翻訳される。プロモーターとしては、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（呼吸器多核体ウイルス）プロモーター、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）等のウイルスプロモーターを含むことが好ましい。また、これらのベクターには、免疫増強シグナルおよび局在シグナルを含むペプチドをコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【００１５】
免疫増強シグナルは、免疫増強エレメントとも称し、マウスｐＩｇＲの免疫原活性または抗原活性を高めるための任意のペプチドのことをいう。このようなペプチドとして、免疫アジュバント活性を有するペプチドやＴ細胞エピトープ等が挙げられる。このうちＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞レセプターを認識し、これに結合することができるものである。また、種々のウイルス抗原、種々の細菌毒素などのエピトープやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのＴ細胞依存性抗原のエピトープなどが含まれる。本発明において、これらの免疫増強シグナルは、１つまたは複数を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
局在シグナルは、細胞内で発現、翻訳されたマウスｐＩｇＲを細胞膜に移行し、かつ分泌されたマウスｐＩｇＲを細胞膜上にアンカーする働きを有する任意のペプチドのことをいう。局在シグナルは、発現されたマウスｐＩｇＲを細胞表面に一定時間高濃度で留まらせることができ、高感度のマウスｐＩｇＲ抗体を得るために有用である。
このような局在シグナルとして、例えばＧＰＩ（グリコシルフォスファチジルイノシトール）−アンカー等が挙げられる。ＧＰＩアンカーは、タンパク質の疎水性のＣ末端の３２アミノ酸残基が３位のＡｓｐ残基の直後でトランスアミナーゼにより切断されＡｓｐ残基の後ろに付与される。これにより、３位のＡｓｐ残基を介してターゲットタンパクを細胞膜上にアンカーさせることを可能とする。本発明で使用可能な局在シグナルは、上記のようなアンカー作用を示すものであればいずれも用いることができ、上記のシグナルに限定されない。
【００１７】
本発明の発現ベクターの作成にあたり、これらの免疫増強シグナル、マウスｐＩｇＲと局在シグナルは、Ｎ末端側からこの順序で連結することが好ましく、それぞれのシグナル間に１〜数個の任意のアミノ酸からなるリンカーが結合してもよい。また、各配列間は、１〜数個の任意のアミノ酸からなるリンカーを介在させて、マウスｐＩｇＲまたはその機能性断片を連結するように配置してもよい。さらに、本発明の発現ベクターには細胞内で発現したマウスｐＩｇＲまたはその機能性断片を細胞膜に輸送するための分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を連結することが好ましい。このよう分泌シグナルペプチドとして、マウスｐＩｇＲのシグナルペプチドを用いる事が好ましい。
【００１８】
本発明の発現ベクターの作成にあたり、Ｎ末端側からプロモーターの下流に、分泌シグナルペプチド、免疫増強シグナルペプチド、マウスｐＩｇＲ、局在シグナルペプチドと並べ、この順序でこれらをコードする塩基配列を並べた発現ベクターを用いる事が好ましい。細胞内で発現されたタンパク質は、細胞膜に移行し、シグナルペプチドから切断されて分泌され、細胞膜にアンカーとして留まるため、マウスｐＩｇＲに反応する抗体が生成されやすくなるためである。
さらに本発明の発現ベクターには、必要に応じて、目的の塩基配列の発現を検出するためのＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ（例えばＨｉｓ６〜Ｈｉｓ１０）などのタグをコードする塩基配列を、目的塩基配列の５′端または３′端に結合することができる。これらのタグは、発現の目的とするタンパク質の検出のために有用である。
【００１９】
マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを免疫する動物としては、脊椎動物であればいずれのものも用いることができるが、鳥類または非ヒト哺乳動物を用いる事が好ましい。例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの有蹄類、ウサギ等が好ましい。 動物への免疫にあたり、マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物の身体部分、例えば皮下等に注入することが好ましい。注入は免疫できる回数および量であればいずれでもよいが、例えば、約１〜２週間置きに数回、約１〜２ヶ月にわたって行うことができる。ベクターの注入量は、例えば１７．５μｇ抗原／回であってもよい。
【００２０】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターをマウス等の動物に免疫することで作製することができる。本発明の抗体の作製にあたり、一般に用いられているいずれの方法を用いることもできるが、ＤＮＡ免疫法を用いることが特に好ましい。
本発明のＤＮＡ免疫法は、例えば、上記のように作成したマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫することで行うことができる。これによって、動物体内においてマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列が発現することでマウスｐＩｇＲが得られ、これに反応する抗体が産生される。
本発明のベクターを用い、動物体内で発現されるマウスｐＩｇＲは天然型であるため、天然型マウスｐＩｇＲに反応する抗体が産生され得る。天然型とは、ジスルフィド結合、糖鎖等を有するマウスｐＩｇＲの天然型高次構造を採ることを意味する。したがって、本発明で作製される抗体は、マウスｐＩｇＲの天然型高次構造を特異的に認識する、天然型マウスｐＩｇＲに反応し、かつ高親和性の抗体であるため有用性が高い。
【００２１】
また、本発明の抗体の作製にあたり、ＤＮＡ免疫法で免疫された動物から脾臓細胞、Ｂ細胞またはリンパ細胞等を取り出し、これと骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合してハイブリドーマを作成することで本発明の抗体を作製することができる。
ハイブリドーマの作製にあたり用いる骨髄腫細胞としては、本発明の抗体を産生できるハイブリドーマの作製にあたり有用なものであればいずれのものも用いることができる。マウス骨髄腫細胞等を用いる事が好ましい。これらの細胞融合のために、公知の細胞凝集性媒体であればいずれのものも用いることができるが、例えばポリエチレングリコールなどの細胞凝集性媒体を用いることが好ましい。
【００２２】
本発明のハイブリドーマは、マウスｐＩｇＲ、好ましくは天然型マウスｐＩｇＲを特異的に認識する抗体を産生できるものであることが好ましい。このハイブリドーマを得るためには、融合細胞の選抜を行うことが好ましく、この選抜にはフローサイトメトリーが有用である。フローサイトメトリーを用いた天然型マウスｐＩｇＲを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマの検出には、ヒトまたはマウスの免疫グロブリンと特異的に結合する蛍光標識二次抗体を用いることが好ましい。
【００２３】
このようにして得たハイブリドーマをヌードマウスに腹腔内注射し、腹水を採取し、腹水をプロテインＡまたはプロテインＧセファロースカラムに通して、高純度の目的のモノクローナル抗体を回収することができる。このようなモノクローナル抗体の作製法については、公知の文献（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５ （１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２ （１９８３）、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６ （１９８５），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８等）を参照することができる。
【００２４】
本発明の「ハイブリドーマ」には、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであれば、いずれのものも含まれるが、フローサイトメトリー等によって選抜されたマウスｐＩｇＲに反応する感度の高い抗体を産生するものであることが好ましい。
このようなハイブリドーマとして、本発明のＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．８、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３２、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７２またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７３等が挙げられる。
このうち特に、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）等のハイブリドーマが好ましい。
【００２５】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、検出の対象とする試料に存在するマウスｐＩｇＲの検出に用いることができる。試料としては、マウスから摘出した肝臓、腸管組織、唾液、血清、糞便などが挙げられる。
本発明の「マウスｐＩｇＲを検出する方法」には、従来知られている抗体を用いるタンパク質の検出方法であればいずれの物も用いる事ができる。例えば、本発明の抗体を用いたウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降やａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎを用いることができる。
以下、本発明の詳細を実施例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
＜モノクローナル抗体の作製＞
ＤＮＡ免疫法を用いて、マウスｐＩｇＲの立体構造を認識する特異モノクローナル抗体を作製した。
１．発現ベクターの作製
ＰＣＲ法を用いてマウスｐＩｇＲの細胞外領域を増幅した。
鋳型として、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅに所属していたＣｈａｒｌｏｔｔｅ Ｓ． Ｋａｅｔｚｅｌ博士から供与されたｃＤＮＡを用いた。この鋳型ｃＤＮＡは、マウスの組織または細胞からクロロホルム／フェノール／イソアミルアルコール／グアニジニウム／ＣｓＣｌ法によって全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー処理にてポリＡ（＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を取得して、逆転写酵素の存在下で合成することができる。
この鋳型ｃＤＮＡと、マウスｐＩｇＲのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した５′末端および３′末端側の配列からなるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
【００２７】
ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−９６００，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用して実施した。ＰＣＲ条件として、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）、ｄＮＴＰｓ ２ｍＭ、プラーマー２．５μＭ〜１０μＭ中、Ｔａｑポリメラーゼ（１〜２．５単位；ｒＴａｑ（Ｔａｋａｒａ、京都、日本））を添加して反応を行った。ＰＣＲは、９５℃、２〜５分での１回の変性サイクルの後、９５℃、０．２〜１分での変性、５０〜６５℃、０．５〜１分でのアニーリング、および７２℃、０．５〜２分での伸長を１サイクルとして１５〜４０サイクルを行い、最後に、７２℃、５分の伸長を行った。
【００２８】
上記で得たマウスｐＩｇＲの細胞外領域をタグ付の哺乳動物発現ベクターに組込み、キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて作製した発現ベクターを精製した。マウスｐＩｇＲの細胞外領域が設計した通りに細胞表面に発現されるか否かについて、Ｇｅｎｏｖａｃ社より譲渡された２９３Ｔ細胞を用いて検証した。
ベクターを２９３Ｔ細胞に導入し、マウスｐＩｇＲの細胞外領域を一過性強制発現導入した後、当該２９３Ｔ細胞をＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒに、３７℃、１０％ＣＯ２で２４時間培養（培地：Ｄ−ＭＥＭ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ，０４４−２９７６５）５００ｍＬ、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ｌｏｔ．ＦＱＦ２４００９） ５％ ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５１４０−１２２） ５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５０ｕｇ／ｍＬ ４ｍＭ Ｌ−Ｇｌｙｔａｍｉｎｅ）して、ＢＥＣＫＭＡＮ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＸＬ−ＭＣＬを用いてＦＣＭ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）解析を行った。比較として、ｍｏｃｋを一過性強制発現導入した細胞を用いた。
【００２９】
ＦＣＭ解析にあたり、上記の導入遺伝子に付加しているタグに反応する抗体（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（５ｍｇ）ＳＩＧＭＡ Ｆ−３１６５）を遺伝子導入した培養細胞に４℃、３０分間反応させ、その後抗タグ抗体を特異的に認識する蛍光標識した二次抗体（Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ′）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＭＯＵＳＥ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＥ ＢＥＣＫＭＡＮ ＩＭ０８５５）を４℃３０分間反応させＦＣＭ解析に用いた。その結果、図１に示すようにマウスｐＩｇＲの細胞外領域が細胞表面上に発現していることが確認された。
【００３０】
２．モノクローナル抗体の作製
上記１．で作製した発現ベクターを、マウスの皮下に注入し、免疫を行った。免疫は約１〜２週間置きに数回、約１〜２ヶ月行った。ベクターの注入量は、１７．５μｇ抗原／回であった。
免疫したマウスより血清を採集し、血清解析を行った。上記１．と同様にマウスｐＩｇＲの細胞外領域を２９３Ｔ細胞に一過性に発現導入し、当該２９３Ｔ細胞をＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒに２４時間培養した後、この培養溶液に、免疫したマウスより採集した血清を加え、３０分間静置した。
その後、免疫したマウスの免疫グロブリンを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。ＦＣＭ解析の結果を図２−１、２−２に示した。この結果より、マウスｐＩｇＲ遺伝子導入細胞を認識する強い特異抗体を産生しているマウスを選別した。
【００３１】
上記で選別したマウスを解剖して脾臓細胞を取り出し、これとマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの中から、マウスｐＩｇＲの天然型高次構造を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマをフローサイトメトリーを用いて選抜した。
その結果、マウスｐＩｇＲの天然型高次構造を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマ株として、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．８、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３２、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７２またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７３が樹立された。
このうち、次の５株についてはＮＩＴＥに寄託を行った。ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）。これらの５株が産生する抗体は、マウスｐＩｇＲの検出において特に良好な反応を示した。
【００３２】
本発明で樹立したこれらのハイブリドーマ株は培地１Ｌあたり５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＨＡＴ培地（１Ｌ Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏ：１１９６５−０８４ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｗｉｔｈ １５％ ＦＣＳ，５％ Ｈｙｂｌｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｃａｔ：２１０００１），４ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ− Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ａｎｄ ５０μｇ／ｍＬ，１ｘＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＡＴ Ｍｅｄｉａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０ｘ） Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｓｔｅｄ ＳＩＧＭＡ Ｃａ：Ｈ ０２６２、これ２本を１ＬのＤ−ＭＥＭに添加した）で培養した。
【００３３】
３．ハイブリドーマ株の特異抗体大量生産
樹立したハイブリドーマ細胞をヌードマウス１匹あたり１Ｘ１０６〜１Ｘ１０７となるように腹腔内に注射した。ハイブリドーマの増殖により、ヌードマウスの腹腔内に腹水が貯留した。この腹水を回収し、ＧＥ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製用樹脂を充填したカラムで腹水より高純度のモノクローナル抗体を回収した。
【実施例２】
【００３４】
ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法
ハイブリドーマＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．８、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３２、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７２またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７３のより得られるモノクローナル抗体を用い、実施例１と同様にマウスｐＩｇＲの細胞外領域を一過性強制発現させた細胞に対するウェスタンブロッティングを行った。
一次抗体として、上記ハイブリドーマの培養上清を用い、二次交代として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（ＢＩＯＲＡＤ社）を用いた。検出にはＥＣＬ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ社）を用いた。
その結果、図３−１から図３−６に示すように、本発明のハイブリドーマが産生する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことで、検出試料中に含まれる天然型マウスｐＩｇＲを特異的に検出できることが示された。図３−１から図３−６における＋は変性試料、−は非変性の生体由来試料を示す。
【実施例３】
【００３５】
ＥＬＩＳＡを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法
１．ハイブリドーマＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９より得られるモノクローナル抗体をＰＢＳにて１，０００倍に希釈し、５０μｌを９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに固層化し、１時間、室温に置いた。
２．上記１．をＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ １００μｌ、１時間、室温においてブロッキングを行った。
３．上記２．に検出のための試料を添加して１時間、室温で反応させた。
４．上記３．をＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１，０００倍希釈したビオチン化したハイブリドーマＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７より得られるモノクローナル抗体を５０ μｌを添加した後、１時間、室温で反応させた。
５．上記４．を洗浄した後１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍希釈したＮｅｕｔｒ． Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を５０μｌ添加して１時間、室温で反応させた。洗浄後発色させ、吸光度を測定した。
マウスｐＩｇＲまたは比較としてｍｏｃｋを一過性強制発現させた細胞の細胞溶解液をそれぞれ用いて、上記１〜５の操作を行ったところ、図４に示すように、本発明のハイブリドーマが産生する抗体を用いることで、検出試料中に含まれるマウスｐＩｇＲを検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のマウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体は、然型マウスｐＩｇＲに反応して高い特異性を示す。また感度が高いため、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ等の実験手法において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】発現ベクターの作製にあたり、ＦＣＭ解析を行った結果を示した図である（実施例１）。
【図２−１】ハイブリドーマの選別にあたり、ＦＣＭ解析を行った結果を示した図である（実施例１）。
【図２−２】ハイブリドーマの選別にあたり、ＦＣＭ解析を行った結果を示した図である（実施例１）。
【図３−１】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−２】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−３】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−４】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−５】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−６】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図４】ＥＬＩＳＡを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例３）。
【技術分野】
【０００１】
本発明はマウス多量体免疫グロブリンレセプター（以下、ｐＩｇＲとする）に反応するモノクローナル抗体に関する。特に、天然型マウスｐＩｇＲに反応する高感度のモノクローナル抗体に関する。また、これらのモノクローナル抗体をコンスタントに産生できるハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ｐＩｇＲは、粘膜免疫機構において主体的役割を果たす分泌型ＩｇＡ分子の構成成分であり、生体の恒常性維持にとって必要不可欠のものとして知られている。
【０００３】
ｐＩｇＲは、レセプター仲介取り込み等の薬物伝達方法に有用と考えられ、これに特異的に結合する抗体として、ウサギｐＩｇＲ由来のペプチドを抗原とする抗体（例えば、特許文献１参照）や、ウサギ胆汁、ラット胆汁から精製されるｐＩｇＲのタンパク質分解フラグメントを抗原とする抗体（例えば、特許文献２参照）等が作製されている。
【０００４】
また、マウスｐＩｇＲに反応する抗体として、免疫したウサギ等の血清から得られるポリクローナル抗体が得られているが、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体は未だ作製されていない。
ポリクローナル抗体は、その製造には量的な制限があり、同一のロットで永続的に抗体を作製することができないという問題があった。そこで、抗体を安定して供給できるハイブリドーマを得て、モノクローナル抗体を得ることが望まれていた。
【特許文献１】特表２０００−５１１４３２号公報
【特許文献２】特表２００３−５２８８９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はマウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体の提供を課題とする。特に、天然型マウスｐＩｇＲに反応する高感度のモノクローナル抗体の提供を課題とする。また、これらのモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体を産生し得る、複数のハイブリドーマ株を樹立することで本発明を完成するに至った。
本発明によって作製されるモノクローナル抗体は、従来のポリクローナル抗体と比較して、マウスｐＩｇＲに反応する感度が高く、また、天然型マウスｐＩｇＲに反応するため有用である。本発明のモノクローナル抗体は、本発明において樹立されたハイブリドーマ株により、永続的に作製できる。
さらに本発明のモノクローナル抗体は、免疫増強シグナルを付与して抗原抗体反応の活性化を行うことで得られたマウス抗体であるため、マウスに投与した場合に異物として認識されず、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏの実験に使用できる。このようなマウス抗原に反応するマウス抗体の作製自体は非常に困難であり、本発明のモノクローナル抗体は有用性が高いといえる。
【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１３）に記載のモノクローナル抗体、当該抗体を産生するハイブリドーマ等に関する。
（１）マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体。
（２）天然型マウスｐＩｇＲに反応する上記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）反応部位がマウスｐＩｇＲの細胞外領域である上記（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドと反応する上記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（５）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫して得られる上記（１）〜（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（６）動物がマウスである上記（５）に記載のモノクローナル抗体。
（７）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターが、免疫増強シグナルをコードする塩基配列を含むベクターである上記（５）または（６）に記載のモノクローナル抗体。
（８）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列が、マウスｐＩｇＲの細胞外領域の塩基配列である上記（５）〜（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（９）マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列である上記（５）〜（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の抗体を用いて試料（検出対象）に存在するマウスｐＩｇＲを検出する方法。
（１１）ウェスタンブロッティングまたはＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ（ＥＬＩＳＡ）を用いる上記（１０）に記載のマウスｐＩｇＲを検出する方法。
（１２）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１３）ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）のいずれかである上記（１２）に記載のハイブリドーマ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体は感度が高く、また、天然型マウスｐＩｇＲに反応するため、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ等の実験手法において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体であればいずれのものも該当するが、天然型マウスｐＩｇＲに反応するものが好ましく、感度が高いものが特に好ましい。また、本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、マウスｐＩｇＲの細胞外領域に反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１０】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドと反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。
マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列は、「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」を得られる塩基配列であればいずれの塩基配列であってもよく、マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列の一部であってもよい。例えば、マウスｐＩｇＲの細胞外領域をコードする塩基配列を用いることが好ましく、配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００１１】
本発明のマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列はＰＣＲ法等、一般的に知られているいずれの方法でもクローニングする事ができ、例えば、次のように行うことができる。
マウスの組織または細胞から、例えばクロロホルム／フェノール／イソアミルアルコール／グアニジニウム／ＣｓＣｌ法等公の知のＲＮＡ調製法にて全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー処理にてポリＡ（＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を取得し、逆転写酵素の存在下でｃＤＮＡ合成を行うことができる。ｃＤＮＡ合成およびクローニングキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から市販されているものを用いることができる。このようにして合成されたｃＤＮＡを鋳型にして、プライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＩｇＲをコードするｃＤＮＡを増幅する。
プライマーはマウスｐＩｇＲのセンス鎖およびアンチセンス鎖に対してアニーリングすることができるプライマーであればいずれのものも用いることができる。例えば、データバンク等に記載されているマウスｐＩｇＲのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて設計し、合成することができる。プライマーは１５〜２５塩基程度のサイズを有しており、マウスｐＩｇＲのｃＤＮＡ塩基配列の５′末端および３′末端側の配列からなることが好ましい。プライマーの合成は、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて行うことができる。
【００１２】
ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−９６００，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔなど）を使用して行うことが好ましい。ＰＣＲ条件として、例えば１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）、ｄＮＴＰｓ ２ｍＭ、プラーマー２．５μＭ〜１０μＭ中、Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（１〜２．５単位；ｒＴａｑ（Ｔａｋａｒａ、京都、日本），Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）など）を添加して反応を行うことができる。ＰＣＲは、例えば９５℃、２〜５分での１回の変性サイクルの後、９５℃、０．２〜１分での変性、５０〜６５℃、０．５〜１分でのアニーリング、および７２℃、０．５〜２分での伸長を１サイクルとして１５〜４０サイクルを行い、最後に、７２℃、５分の伸長を行う方法等が挙げられる。
これらのｃＤＮＡクローニングおよびＰＣＲについては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）等）を参照できる。
【００１３】
上記のようにして得られたマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を組み込むベクターとして、プラスミド、ウイルス、ファージ等の一般的に知られているいずれのベクターをも用いることができる。このうち動物細胞発現ベクターを用いる事が好ましく、例えば昆虫細胞発現ベクターまたは哺乳動物細胞発現ベクターが挙げられ、哺乳動物細胞発現ベクターを用いることが特に好ましい。哺乳動物細胞発現ベクターとしては、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等のプラスミドベクター等が挙げられる。これらのベクターは市販のものを用いることができる。
【００１４】
本発明で用いることができるベクターにおいて、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、またはターミネーター等の調節配列を含むことができる。これらの配列を含むことによって、宿主の細胞内でプロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合することによって転写が開始され、目的のタンパク質またはペプチドに翻訳される。プロモーターとしては、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（呼吸器多核体ウイルス）プロモーター、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）等のウイルスプロモーターを含むことが好ましい。また、これらのベクターには、免疫増強シグナルおよび局在シグナルを含むペプチドをコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【００１５】
免疫増強シグナルは、免疫増強エレメントとも称し、マウスｐＩｇＲの免疫原活性または抗原活性を高めるための任意のペプチドのことをいう。このようなペプチドとして、免疫アジュバント活性を有するペプチドやＴ細胞エピトープ等が挙げられる。このうちＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞レセプターを認識し、これに結合することができるものである。また、種々のウイルス抗原、種々の細菌毒素などのエピトープやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのＴ細胞依存性抗原のエピトープなどが含まれる。本発明において、これらの免疫増強シグナルは、１つまたは複数を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
局在シグナルは、細胞内で発現、翻訳されたマウスｐＩｇＲを細胞膜に移行し、かつ分泌されたマウスｐＩｇＲを細胞膜上にアンカーする働きを有する任意のペプチドのことをいう。局在シグナルは、発現されたマウスｐＩｇＲを細胞表面に一定時間高濃度で留まらせることができ、高感度のマウスｐＩｇＲ抗体を得るために有用である。
このような局在シグナルとして、例えばＧＰＩ（グリコシルフォスファチジルイノシトール）−アンカー等が挙げられる。ＧＰＩアンカーは、タンパク質の疎水性のＣ末端の３２アミノ酸残基が３位のＡｓｐ残基の直後でトランスアミナーゼにより切断されＡｓｐ残基の後ろに付与される。これにより、３位のＡｓｐ残基を介してターゲットタンパクを細胞膜上にアンカーさせることを可能とする。本発明で使用可能な局在シグナルは、上記のようなアンカー作用を示すものであればいずれも用いることができ、上記のシグナルに限定されない。
【００１７】
本発明の発現ベクターの作成にあたり、これらの免疫増強シグナル、マウスｐＩｇＲと局在シグナルは、Ｎ末端側からこの順序で連結することが好ましく、それぞれのシグナル間に１〜数個の任意のアミノ酸からなるリンカーが結合してもよい。また、各配列間は、１〜数個の任意のアミノ酸からなるリンカーを介在させて、マウスｐＩｇＲまたはその機能性断片を連結するように配置してもよい。さらに、本発明の発現ベクターには細胞内で発現したマウスｐＩｇＲまたはその機能性断片を細胞膜に輸送するための分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を連結することが好ましい。このよう分泌シグナルペプチドとして、マウスｐＩｇＲのシグナルペプチドを用いる事が好ましい。
【００１８】
本発明の発現ベクターの作成にあたり、Ｎ末端側からプロモーターの下流に、分泌シグナルペプチド、免疫増強シグナルペプチド、マウスｐＩｇＲ、局在シグナルペプチドと並べ、この順序でこれらをコードする塩基配列を並べた発現ベクターを用いる事が好ましい。細胞内で発現されたタンパク質は、細胞膜に移行し、シグナルペプチドから切断されて分泌され、細胞膜にアンカーとして留まるため、マウスｐＩｇＲに反応する抗体が生成されやすくなるためである。
さらに本発明の発現ベクターには、必要に応じて、目的の塩基配列の発現を検出するためのＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ（例えばＨｉｓ６〜Ｈｉｓ１０）などのタグをコードする塩基配列を、目的塩基配列の５′端または３′端に結合することができる。これらのタグは、発現の目的とするタンパク質の検出のために有用である。
【００１９】
マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを免疫する動物としては、脊椎動物であればいずれのものも用いることができるが、鳥類または非ヒト哺乳動物を用いる事が好ましい。例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの有蹄類、ウサギ等が好ましい。 動物への免疫にあたり、マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物の身体部分、例えば皮下等に注入することが好ましい。注入は免疫できる回数および量であればいずれでもよいが、例えば、約１〜２週間置きに数回、約１〜２ヶ月にわたって行うことができる。ベクターの注入量は、例えば１７．５μｇ抗原／回であってもよい。
【００２０】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、マウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターをマウス等の動物に免疫することで作製することができる。本発明の抗体の作製にあたり、一般に用いられているいずれの方法を用いることもできるが、ＤＮＡ免疫法を用いることが特に好ましい。
本発明のＤＮＡ免疫法は、例えば、上記のように作成したマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫することで行うことができる。これによって、動物体内においてマウスｐＩｇＲをコードする塩基配列が発現することでマウスｐＩｇＲが得られ、これに反応する抗体が産生される。
本発明のベクターを用い、動物体内で発現されるマウスｐＩｇＲは天然型であるため、天然型マウスｐＩｇＲに反応する抗体が産生され得る。天然型とは、ジスルフィド結合、糖鎖等を有するマウスｐＩｇＲの天然型高次構造を採ることを意味する。したがって、本発明で作製される抗体は、マウスｐＩｇＲの天然型高次構造を特異的に認識する、天然型マウスｐＩｇＲに反応し、かつ高親和性の抗体であるため有用性が高い。
【００２１】
また、本発明の抗体の作製にあたり、ＤＮＡ免疫法で免疫された動物から脾臓細胞、Ｂ細胞またはリンパ細胞等を取り出し、これと骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合してハイブリドーマを作成することで本発明の抗体を作製することができる。
ハイブリドーマの作製にあたり用いる骨髄腫細胞としては、本発明の抗体を産生できるハイブリドーマの作製にあたり有用なものであればいずれのものも用いることができる。マウス骨髄腫細胞等を用いる事が好ましい。これらの細胞融合のために、公知の細胞凝集性媒体であればいずれのものも用いることができるが、例えばポリエチレングリコールなどの細胞凝集性媒体を用いることが好ましい。
【００２２】
本発明のハイブリドーマは、マウスｐＩｇＲ、好ましくは天然型マウスｐＩｇＲを特異的に認識する抗体を産生できるものであることが好ましい。このハイブリドーマを得るためには、融合細胞の選抜を行うことが好ましく、この選抜にはフローサイトメトリーが有用である。フローサイトメトリーを用いた天然型マウスｐＩｇＲを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマの検出には、ヒトまたはマウスの免疫グロブリンと特異的に結合する蛍光標識二次抗体を用いることが好ましい。
【００２３】
このようにして得たハイブリドーマをヌードマウスに腹腔内注射し、腹水を採取し、腹水をプロテインＡまたはプロテインＧセファロースカラムに通して、高純度の目的のモノクローナル抗体を回収することができる。このようなモノクローナル抗体の作製法については、公知の文献（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５ （１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２ （１９８３）、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６ （１９８５），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８等）を参照することができる。
【００２４】
本発明の「ハイブリドーマ」には、マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであれば、いずれのものも含まれるが、フローサイトメトリー等によって選抜されたマウスｐＩｇＲに反応する感度の高い抗体を産生するものであることが好ましい。
このようなハイブリドーマとして、本発明のＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．８、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３２、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７２またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７３等が挙げられる。
このうち特に、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）等のハイブリドーマが好ましい。
【００２５】
本発明の「マウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体」は、検出の対象とする試料に存在するマウスｐＩｇＲの検出に用いることができる。試料としては、マウスから摘出した肝臓、腸管組織、唾液、血清、糞便などが挙げられる。
本発明の「マウスｐＩｇＲを検出する方法」には、従来知られている抗体を用いるタンパク質の検出方法であればいずれの物も用いる事ができる。例えば、本発明の抗体を用いたウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降やａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎを用いることができる。
以下、本発明の詳細を実施例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
＜モノクローナル抗体の作製＞
ＤＮＡ免疫法を用いて、マウスｐＩｇＲの立体構造を認識する特異モノクローナル抗体を作製した。
１．発現ベクターの作製
ＰＣＲ法を用いてマウスｐＩｇＲの細胞外領域を増幅した。
鋳型として、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅに所属していたＣｈａｒｌｏｔｔｅ Ｓ． Ｋａｅｔｚｅｌ博士から供与されたｃＤＮＡを用いた。この鋳型ｃＤＮＡは、マウスの組織または細胞からクロロホルム／フェノール／イソアミルアルコール／グアニジニウム／ＣｓＣｌ法によって全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー処理にてポリＡ（＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を取得して、逆転写酵素の存在下で合成することができる。
この鋳型ｃＤＮＡと、マウスｐＩｇＲのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した５′末端および３′末端側の配列からなるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
【００２７】
ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−９６００，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用して実施した。ＰＣＲ条件として、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）、ｄＮＴＰｓ ２ｍＭ、プラーマー２．５μＭ〜１０μＭ中、Ｔａｑポリメラーゼ（１〜２．５単位；ｒＴａｑ（Ｔａｋａｒａ、京都、日本））を添加して反応を行った。ＰＣＲは、９５℃、２〜５分での１回の変性サイクルの後、９５℃、０．２〜１分での変性、５０〜６５℃、０．５〜１分でのアニーリング、および７２℃、０．５〜２分での伸長を１サイクルとして１５〜４０サイクルを行い、最後に、７２℃、５分の伸長を行った。
【００２８】
上記で得たマウスｐＩｇＲの細胞外領域をタグ付の哺乳動物発現ベクターに組込み、キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて作製した発現ベクターを精製した。マウスｐＩｇＲの細胞外領域が設計した通りに細胞表面に発現されるか否かについて、Ｇｅｎｏｖａｃ社より譲渡された２９３Ｔ細胞を用いて検証した。
ベクターを２９３Ｔ細胞に導入し、マウスｐＩｇＲの細胞外領域を一過性強制発現導入した後、当該２９３Ｔ細胞をＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒに、３７℃、１０％ＣＯ２で２４時間培養（培地：Ｄ−ＭＥＭ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ，０４４−２９７６５）５００ｍＬ、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ｌｏｔ．ＦＱＦ２４００９） ５％ ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５１４０−１２２） ５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、５０ｕｇ／ｍＬ ４ｍＭ Ｌ−Ｇｌｙｔａｍｉｎｅ）して、ＢＥＣＫＭＡＮ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＸＬ−ＭＣＬを用いてＦＣＭ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）解析を行った。比較として、ｍｏｃｋを一過性強制発現導入した細胞を用いた。
【００２９】
ＦＣＭ解析にあたり、上記の導入遺伝子に付加しているタグに反応する抗体（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（５ｍｇ）ＳＩＧＭＡ Ｆ−３１６５）を遺伝子導入した培養細胞に４℃、３０分間反応させ、その後抗タグ抗体を特異的に認識する蛍光標識した二次抗体（Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ′）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＭＯＵＳＥ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＥ ＢＥＣＫＭＡＮ ＩＭ０８５５）を４℃３０分間反応させＦＣＭ解析に用いた。その結果、図１に示すようにマウスｐＩｇＲの細胞外領域が細胞表面上に発現していることが確認された。
【００３０】
２．モノクローナル抗体の作製
上記１．で作製した発現ベクターを、マウスの皮下に注入し、免疫を行った。免疫は約１〜２週間置きに数回、約１〜２ヶ月行った。ベクターの注入量は、１７．５μｇ抗原／回であった。
免疫したマウスより血清を採集し、血清解析を行った。上記１．と同様にマウスｐＩｇＲの細胞外領域を２９３Ｔ細胞に一過性に発現導入し、当該２９３Ｔ細胞をＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒに２４時間培養した後、この培養溶液に、免疫したマウスより採集した血清を加え、３０分間静置した。
その後、免疫したマウスの免疫グロブリンを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。ＦＣＭ解析の結果を図２−１、２−２に示した。この結果より、マウスｐＩｇＲ遺伝子導入細胞を認識する強い特異抗体を産生しているマウスを選別した。
【００３１】
上記で選別したマウスを解剖して脾臓細胞を取り出し、これとマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの中から、マウスｐＩｇＲの天然型高次構造を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマをフローサイトメトリーを用いて選抜した。
その結果、マウスｐＩｇＲの天然型高次構造を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマ株として、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．８、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３２、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７２またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７３が樹立された。
このうち、次の５株についてはＮＩＴＥに寄託を行った。ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）。これらの５株が産生する抗体は、マウスｐＩｇＲの検出において特に良好な反応を示した。
【００３２】
本発明で樹立したこれらのハイブリドーマ株は培地１Ｌあたり５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＨＡＴ培地（１Ｌ Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏ：１１９６５−０８４ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｗｉｔｈ １５％ ＦＣＳ，５％ Ｈｙｂｌｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｃａｔ：２１０００１），４ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ− Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ａｎｄ ５０μｇ／ｍＬ，１ｘＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＡＴ Ｍｅｄｉａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０ｘ） Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｓｔｅｄ ＳＩＧＭＡ Ｃａ：Ｈ ０２６２、これ２本を１ＬのＤ−ＭＥＭに添加した）で培養した。
【００３３】
３．ハイブリドーマ株の特異抗体大量生産
樹立したハイブリドーマ細胞をヌードマウス１匹あたり１Ｘ１０６〜１Ｘ１０７となるように腹腔内に注射した。ハイブリドーマの増殖により、ヌードマウスの腹腔内に腹水が貯留した。この腹水を回収し、ＧＥ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製用樹脂を充填したカラムで腹水より高純度のモノクローナル抗体を回収した。
【実施例２】
【００３４】
ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法
ハイブリドーマＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．８、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３２、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．３５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４３、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４４、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５１、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５６、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．５７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６０、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６５、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６７、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．６９、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７２またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７３のより得られるモノクローナル抗体を用い、実施例１と同様にマウスｐＩｇＲの細胞外領域を一過性強制発現させた細胞に対するウェスタンブロッティングを行った。
一次抗体として、上記ハイブリドーマの培養上清を用い、二次交代として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（ＢＩＯＲＡＤ社）を用いた。検出にはＥＣＬ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ社）を用いた。
その結果、図３−１から図３−６に示すように、本発明のハイブリドーマが産生する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことで、検出試料中に含まれる天然型マウスｐＩｇＲを特異的に検出できることが示された。図３−１から図３−６における＋は変性試料、−は非変性の生体由来試料を示す。
【実施例３】
【００３５】
ＥＬＩＳＡを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法
１．ハイブリドーマＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９より得られるモノクローナル抗体をＰＢＳにて１，０００倍に希釈し、５０μｌを９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに固層化し、１時間、室温に置いた。
２．上記１．をＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ １００μｌ、１時間、室温においてブロッキングを行った。
３．上記２．に検出のための試料を添加して１時間、室温で反応させた。
４．上記３．をＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１，０００倍希釈したビオチン化したハイブリドーマＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７より得られるモノクローナル抗体を５０ μｌを添加した後、１時間、室温で反応させた。
５．上記４．を洗浄した後１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍希釈したＮｅｕｔｒ． Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を５０μｌ添加して１時間、室温で反応させた。洗浄後発色させ、吸光度を測定した。
マウスｐＩｇＲまたは比較としてｍｏｃｋを一過性強制発現させた細胞の細胞溶解液をそれぞれ用いて、上記１〜５の操作を行ったところ、図４に示すように、本発明のハイブリドーマが産生する抗体を用いることで、検出試料中に含まれるマウスｐＩｇＲを検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のマウスｐＩｇＲに反応するモノクローナル抗体は、然型マウスｐＩｇＲに反応して高い特異性を示す。また感度が高いため、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ等の実験手法において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】発現ベクターの作製にあたり、ＦＣＭ解析を行った結果を示した図である（実施例１）。
【図２−１】ハイブリドーマの選別にあたり、ＦＣＭ解析を行った結果を示した図である（実施例１）。
【図２−２】ハイブリドーマの選別にあたり、ＦＣＭ解析を行った結果を示した図である（実施例１）。
【図３−１】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−２】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−３】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−４】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−５】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図３−６】ウェスタンブロッティングを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例２）。
【図４】ＥＬＩＳＡを用いるマウスｐＩｇＲを検出する方法による検出結果を示した図である（実施例３）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
天然型マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）に反応する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
反応部位がマウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の細胞外領域である請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドと反応する請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫して得られる請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
動物がマウスである請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列を含むベクターが、免疫増強シグナルをコードする塩基配列を含むベクターである請求項５または６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列が、マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の細胞外領域の塩基配列である請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列である請求項５〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体を用いて試料（検出対象）に存在するマウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）を検出する方法。
【請求項１１】
ウェスタンブロッティングまたはＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ（ＥＬＩＳＡ）を用いる請求項１０に記載のマウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）を検出する方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１３】
ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）のいずれかである請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【請求項１】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
天然型マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）に反応する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
反応部位がマウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の細胞外領域である請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドと反応する請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列を含むベクターを動物に免疫して得られる請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
動物がマウスである請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列を含むベクターが、免疫増強シグナルをコードする塩基配列を含むベクターである請求項５または６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列が、マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の細胞外領域の塩基配列である請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
マウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）をコードする塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列である請求項５〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体を用いて試料（検出対象）に存在するマウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）を検出する方法。
【請求項１１】
ウェスタンブロッティングまたはＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ（ＥＬＩＳＡ）を用いる請求項１０に記載のマウス多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）を検出する方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１３】
ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．７（ＮＩＴＥ−Ｐ４２３）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．１９（ＮＩＴＥ−Ｐ４２４）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．２４（ＮＩＴＥ−Ｐ４２５）、ＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４１（ＮＩＴＥ−Ｐ４２６）またはＮＵＤ−００１ Ｎｏ．４６（ＮＩＴＥ−Ｐ４２７）のいずれかである請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図４】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１３７８５９（Ｐ２００９−１３７８５９Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１４１６０（Ｐ２００７−３１４１６０）
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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