マダイ由来マイクロサテライトＤＮＡ及びそれらを用いた個体識別法
【課題】 マイクロサテライトＤＮＡによって、マダイの親子や個体を簡便かつ確実に識別する方法を提供する。
【解決手段】 特定の塩基配列を含むＤＮＡ、特に特定塩基配列で示されるＤＮＡ、さらにマダイ由来のもの。該塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ、また該ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ。マイクロサテライトＤＮＡの長さを調べることを特徴とするマダイの個体あるいは親子を識別する方法、詳しくは該ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを用い、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことを特徴とする該方法、特に該方法のオリゴヌクレオチドプライマーが特定塩基配列のプライマーである方法及びそれらのプライマー。
【解決手段】 特定の塩基配列を含むＤＮＡ、特に特定塩基配列で示されるＤＮＡ、さらにマダイ由来のもの。該塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ、また該ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ。マイクロサテライトＤＮＡの長さを調べることを特徴とするマダイの個体あるいは親子を識別する方法、詳しくは該ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを用い、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことを特徴とする該方法、特に該方法のオリゴヌクレオチドプライマーが特定塩基配列のプライマーである方法及びそれらのプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マダイの新規マイクロサテライトＤＮＡ、及びそれらを用いたマダイの親子、あるいは個体等の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロサテライトＤＮＡマーカーは、高い度合いで個体の識別を行うことが可能で有る。ヒトの場合、マイクロサテライトＤＮＡを用いた識別により、法律に関する医学に絶大な影響を与えてきた。植物分野においては、イネ科の細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置するＤＮＡマーカー及び診断法（特許文献１参照）、あるいはナシ類植物由来のマイクロサテライトＤＮＡ及びそれを用いた識別方法（特許文献２参照）等が既に出願されている。また、マダイについても、マイクロサテライトＤＮＡの多型を用いた親子及び個体の識別方法について記載がある。（非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平９−３１３１８７号公報
【特許文献２】特開２００２−３４５９７号公報
【非特許文献１】次世代の水産バイオテクノロジー、成山堂書店、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは鋭意探索の結果、マダイから新規なマイクロサテライトＤＮＡを取得することに成功し、本発明に至った。従って本発明は、マダイの個体の識別、親子の識別、有用形質の選抜、及び有用遺伝子の単離等を行うために有効なＤＮＡマーカーとなるマイクロサテライトＤＮＡの提供、さらに該マイクロサテライトＤＮＡを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの提供、これらを用いたマダイの個体識別法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ、特に配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列で示されるＤＮＡであり、さらにマダイ由来のものに関する。又、配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列において、１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ、また該ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡに関するものである。これらのＤＮＡは、マダイの個体あるいは親子識別マーカーとして有用である。又、マイクロサテライトＤＮＡの長さを調べることを特徴とする、マイクロサテライトＤＮＡによるマダイの個体あるいは親子を識別する方法に関し、該ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを用い、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことを特徴とする方法であり、特にオリゴヌクレオチドプライマーが配列表配列番号１３〜３６に記載されるプライマーである方法に関する。又、該ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマー、特に配列表配列番号１３〜３６で表されるオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によりマダイのマイクロサテライトＤＮＡマーカー、それを増幅するオリゴヌクレオチドプライマー、及びそれらを用いたマダイの個体識別及び親子識別方法が提供される。本発明のマイクロサテライトＤＮＡマーカーを利用することにより、マダイの個体識別及び親子識別を簡便に、しかも精度良く行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は配列番号１〜１２で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡに関し、これらはマダイから得ることが出来る。これらのマイクロサテライトＤＮＡは、個体の識別、親子の識別、有用形質の選抜、及び有用遺伝子の単離を行うためのＤＮＡマーカーとして利用できる。
本発明においてマイクロサテライトＤＮＡとは、１種類以上の塩基が４回以上反復した塩基配列を含むＤＮＡのことである。１種類以上の塩基が４回以上反復した塩基配列としては、例えば、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（Ｃ）ｎ、（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＴＧ）ｎ、（ＴＣ）ｎ、（ＧＣ）ｎ、（ＴＡ）ｎ（但しｎは４以上）などを挙げることが出来る。マイクロサテライトＤＮＡは、これら反復した塩基配列が１種類含まれている場合、及び複数種類含まれている場合のどちらでも良い。さらに本発明では、配列番号１〜１２に示される本発明マイクロサテライトＤＮＡの塩基配列の１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ、また該ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ等、マダイの親子識別あるいは個体識別等本発明の同等の効果を有する、又は本発明の目的を達するＤＮＡを含む。塩基配列の相同性は、数学的アルゴリズムによる算出等常法に従い行うことができる。
配列番号１〜１２で示されるマイクロサテライトＤＮＡは、マダイから取得される新規マイクロサテライトＤＮＡである。これらのマイクロサテライトＤＮＡは、マダイから得られるゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１〜１２の反復配列の両側に存在する塩基配列の一部をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅を行うことが出来る。この時、増幅の対象となる塩基配列（マイクロサテライトＤＮＡ）は、配列番号１〜１２に示される塩基配列の１以上のＤＮＡである。
配列番号１〜１２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅可能なプライマーとしては、該ＤＮＡを増幅できるよう設計されたものであれば特に限定されないが、具体的には配列番号１３〜３６に示されるオリゴヌクレオチド等を挙げることが出来る。これらは通常、増幅対象とする塩基配列１つに対し、5'側及び3'側の２つのプライマーを用いるが、それ以上を用いて行っても良い。なお、プライマーとして利用できるオリゴヌクレオチド、例えばβ−シアノエチルホスホアミダイド法やチオホスファイト法を用いるオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置によって容易に得ることが出来る。
上記プライマーを用いて、ＰＣＲ法によりマダイのゲノムＤＮＡを増幅し、増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出を行うことにより、マダイの個体の識別、親子の識別、有用形質の選抜、あるいは有用遺伝子の単離等を行うことができる。ＰＣＲ（酵素連鎖反応）法とは、変成工程、プライマーのアニーリング工程及びＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行う反応を利用して特定のＤＮＡを増幅させる方法であり、これは当業者に公知の方法（例えば、「実験医学別冊 ここまでできるＰＣＲ最新活用マニュアル」、羊土社、２００３年）に従って行うことが出来る。
本発明に用いられるゲノムＤＮＡは、常法に従って得ることができる（例えば、「魚類のＤＮＡ」、恒星社厚生閣、１９９７年）。本発明に用いられるＰＣＲは、当業者に公知の方法であり適宜設定することが可能なため、その条件・方法等は特に限定されない。
増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出法としては、例えば、蛍光ＤＮＡシークエンサーにおいてレーザー光照射により発生した蛍光をＣＣＤカメラで検出する方法等を挙げることが出来る。これらの方法により、各マイクロサテライトＤＮＡの長さから示される遺伝子型から個体の識別、あるいは親子の識別が可能となる。
【０００８】
以下の実施例をもって本発明を詳細に述べるが、これらは例示したのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０００９】
本発明マイクロサテライトＤＮＡの取得
ゲノムライブラリーの作製には日本水産（株）大分海洋研究センターで飼育したマダイを用いた。マダイ脾臓からゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。得られたゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で一晩酵素消化した後にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）に連結した。
上記のプラスミドベクターを用いて宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン含有培地に塗布した。得られた形質転換体をメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写後、メンブレンフィルターを変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を含む濾紙上に置き、形質転換体に含まれるプラスミドＤＮＡをメンブレンフィルターに吸着させた。次いで、メンブレンフィルターを中和溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を含む濾紙上で中和した。メンブレンフィルターを２×ＳＳＣで洗浄した後に１２０℃、１５分間の乾熱を行うことでプラスミドＤＮＡをメンブレンフィルター上に固定した。
メンブレンフィルターをハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液）中で３７℃、２時間のプレハイブリダイゼーションを行った後に５‘末端をＤＩＧ標識した（ＣＡ）×１０オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを加え３７℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。４℃に冷却した６×ＳＳＣでメンブレンフィルターを洗浄した後に、塩化テトラメチルアンモニウム溶液（３Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）で５５℃、２０分間の洗浄を２度行い過剰なオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを除いた。
メンブレンフィルターをＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）で室温、３０分間のブロッキングした後に、１５０ｍＵ／ｍＬのＡｎｔｉ−ＤＩＧ−ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔに移し、室温、３０分間、抗原抗体反応を行った。メンブレンフィルターをＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１５分の洗浄を２度行い、未反応抗体を除去した後にＮＢＴ／ＢＣＩＰ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む発色溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で発色させ陽性クローンの検出を行った。
陽性クローンからのプラスミドＤＮＡの抽出はＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて行い、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてサイクルシークエンス反応を行い、次いで反応産物を３１００−Ａｖａｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列の決定を行った。 得られた塩基配列からマイクロサテライトを含むクローンを選択した。得られた塩基配列を、配列番号１〜１２に示す。
【実施例２】
【００１０】
プライマーの設計及び対立遺伝子の遺伝の確認
実施例１で得られた塩基配列（配列番号１〜１２）をもとに、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエア（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いてマイクロサテライトを増幅させるプライマーを設計した。設計したプライマーの配列を配列表配列番号１３〜３６に示す。この設計したプライマーを用いて、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行ってマイクロサテライトを増幅し、マダイ親子間での対立遺伝子の遺伝を確認した。すなわち、配列番号１〜１２のマイクロサテライトの増幅はそれぞれ、配列番号１３及び配列番号１４の組み合わせ（配列番号１）、配列番号１５及び配列番号１６の組み合わせ（配列番号２）、配列番号１７及び配列番号１８の組み合わせ（配列番号３）、配列番号１９及び配列番号２０の組み合わせ（配列番号４）、配列番号２１及び配列番号２２の組み合わせ（配列番号５）、配列番号２３及び配列番号２４の組み合わせ（配列番号６）、配列番号２５及び配列番号２６の組み合わせ（配列番号７）、配列番号２７及び配列番号２８の組み合わせ（配列番号８）、配列番号２９及び配列番号３０の組み合わせ（配列番号９）、配列番号３１及び配列番号３２の組み合わせ（配列番号１０）、及び配列番号３３及び配列番号３４の組み合わせ（配列番号１１）、及び配列番号３５及び配列番号３６の組み合わせ（配列番号１２）のプライマー対を用いて行った。ＰＣＲはＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（エッペンドルフ社製）を使用し、２０μｌの反応量で行った。反応液中には１０×ＰＣＲバッファー（宝酒造社製）２μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（宝酒造社製）１．６μｌ、１０ｐＭプライマー（片鎖をＦＡＭラベル）、０．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラ―ゼ（宝酒造社製）、及び１０ｎｇのマダイ・ゲノムＤＮＡを混合し、滅菌蒸留水で希釈して全量を２０μｌとした。サーマルサイクラー中で、鋳型ＤＮＡを９４℃で５分間の熱変成を行った後に、９４℃で３０秒間変成、５８℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとして３０サイクル反応させ、更に７２℃で５分間伸長反応させ、最後に４℃まで温度を下げてＰＣＲ反応を終了した。次に、該ＰＣＲ産物の長さを３１００−Ａｖａｎｔを用いて検出し、各個体の各遺伝子座の対立遺伝子を決定した。結果を表１に示す。
【表１】
【実施例３】
【００１１】
実際の生産種苗のマイクロサテライトの遺伝子型を基に、その親魚の特定を試みた。種苗稚魚４個体及び親魚５５個体の各マイクロサテライトにおける対立遺伝子を、それぞれ表２（種苗稚魚）、表３及び表４（親魚）に示す。
【表２】
【表３】
【表４】
【００１２】
Ｆ１のあるマイクロサテライトにおける対立遺伝子は雄親及び雌親から一つずつ受け継いだものであることから、同じ遺伝子座においてＦ１と親魚では同一の対立遺伝子が存在するはずである。そこで、１２遺伝子座において１遺伝子座でもＦ１と同一の対立遺伝子が存在しない親魚を除外し最後に残った２個体をその親魚とした。結果を表５〜表８に示す。この結果、Ｆ１、４個体及びその親魚間において親子関係に矛盾はなかった。
また、これら１２遺伝子座を用いることで、今回、解析を行った５５個体全てが独自の遺伝子型を示したことから、個体識別にも有用であることが示された。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【配列表フリーテキスト】
【００１３】
配列番号１：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号２：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号３：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号４：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号５：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号６：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号７：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号８：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号９：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１０：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１１：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１２：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１３：配列番号１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１４：配列番号１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１５：配列番号２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１６：配列番号２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１７：配列番号３のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１８：配列番号３のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１９：配列番号４のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２０：配列番号４のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２１：配列番号５のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２２：配列番号５のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２３：配列番号６のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２４：配列番号６のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２５：配列番号７のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２６：配列番号７のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２７：配列番号８のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２８：配列番号８のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２９：配列番号９のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３０：配列番号９のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３１：配列番号１０のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３２：配列番号１０のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３３：配列番号１１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３４：配列番号１１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３５：配列番号１２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３６：配列番号１２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マダイの新規マイクロサテライトＤＮＡ、及びそれらを用いたマダイの親子、あるいは個体等の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロサテライトＤＮＡマーカーは、高い度合いで個体の識別を行うことが可能で有る。ヒトの場合、マイクロサテライトＤＮＡを用いた識別により、法律に関する医学に絶大な影響を与えてきた。植物分野においては、イネ科の細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置するＤＮＡマーカー及び診断法（特許文献１参照）、あるいはナシ類植物由来のマイクロサテライトＤＮＡ及びそれを用いた識別方法（特許文献２参照）等が既に出願されている。また、マダイについても、マイクロサテライトＤＮＡの多型を用いた親子及び個体の識別方法について記載がある。（非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平９−３１３１８７号公報
【特許文献２】特開２００２−３４５９７号公報
【非特許文献１】次世代の水産バイオテクノロジー、成山堂書店、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは鋭意探索の結果、マダイから新規なマイクロサテライトＤＮＡを取得することに成功し、本発明に至った。従って本発明は、マダイの個体の識別、親子の識別、有用形質の選抜、及び有用遺伝子の単離等を行うために有効なＤＮＡマーカーとなるマイクロサテライトＤＮＡの提供、さらに該マイクロサテライトＤＮＡを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの提供、これらを用いたマダイの個体識別法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ、特に配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列で示されるＤＮＡであり、さらにマダイ由来のものに関する。又、配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列において、１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ、また該ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡに関するものである。これらのＤＮＡは、マダイの個体あるいは親子識別マーカーとして有用である。又、マイクロサテライトＤＮＡの長さを調べることを特徴とする、マイクロサテライトＤＮＡによるマダイの個体あるいは親子を識別する方法に関し、該ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを用い、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことを特徴とする方法であり、特にオリゴヌクレオチドプライマーが配列表配列番号１３〜３６に記載されるプライマーである方法に関する。又、該ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマー、特に配列表配列番号１３〜３６で表されるオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によりマダイのマイクロサテライトＤＮＡマーカー、それを増幅するオリゴヌクレオチドプライマー、及びそれらを用いたマダイの個体識別及び親子識別方法が提供される。本発明のマイクロサテライトＤＮＡマーカーを利用することにより、マダイの個体識別及び親子識別を簡便に、しかも精度良く行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は配列番号１〜１２で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡに関し、これらはマダイから得ることが出来る。これらのマイクロサテライトＤＮＡは、個体の識別、親子の識別、有用形質の選抜、及び有用遺伝子の単離を行うためのＤＮＡマーカーとして利用できる。
本発明においてマイクロサテライトＤＮＡとは、１種類以上の塩基が４回以上反復した塩基配列を含むＤＮＡのことである。１種類以上の塩基が４回以上反復した塩基配列としては、例えば、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（Ｃ）ｎ、（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＴＧ）ｎ、（ＴＣ）ｎ、（ＧＣ）ｎ、（ＴＡ）ｎ（但しｎは４以上）などを挙げることが出来る。マイクロサテライトＤＮＡは、これら反復した塩基配列が１種類含まれている場合、及び複数種類含まれている場合のどちらでも良い。さらに本発明では、配列番号１〜１２に示される本発明マイクロサテライトＤＮＡの塩基配列の１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ、また該ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ等、マダイの親子識別あるいは個体識別等本発明の同等の効果を有する、又は本発明の目的を達するＤＮＡを含む。塩基配列の相同性は、数学的アルゴリズムによる算出等常法に従い行うことができる。
配列番号１〜１２で示されるマイクロサテライトＤＮＡは、マダイから取得される新規マイクロサテライトＤＮＡである。これらのマイクロサテライトＤＮＡは、マダイから得られるゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１〜１２の反復配列の両側に存在する塩基配列の一部をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅を行うことが出来る。この時、増幅の対象となる塩基配列（マイクロサテライトＤＮＡ）は、配列番号１〜１２に示される塩基配列の１以上のＤＮＡである。
配列番号１〜１２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅可能なプライマーとしては、該ＤＮＡを増幅できるよう設計されたものであれば特に限定されないが、具体的には配列番号１３〜３６に示されるオリゴヌクレオチド等を挙げることが出来る。これらは通常、増幅対象とする塩基配列１つに対し、5'側及び3'側の２つのプライマーを用いるが、それ以上を用いて行っても良い。なお、プライマーとして利用できるオリゴヌクレオチド、例えばβ−シアノエチルホスホアミダイド法やチオホスファイト法を用いるオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置によって容易に得ることが出来る。
上記プライマーを用いて、ＰＣＲ法によりマダイのゲノムＤＮＡを増幅し、増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出を行うことにより、マダイの個体の識別、親子の識別、有用形質の選抜、あるいは有用遺伝子の単離等を行うことができる。ＰＣＲ（酵素連鎖反応）法とは、変成工程、プライマーのアニーリング工程及びＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行う反応を利用して特定のＤＮＡを増幅させる方法であり、これは当業者に公知の方法（例えば、「実験医学別冊 ここまでできるＰＣＲ最新活用マニュアル」、羊土社、２００３年）に従って行うことが出来る。
本発明に用いられるゲノムＤＮＡは、常法に従って得ることができる（例えば、「魚類のＤＮＡ」、恒星社厚生閣、１９９７年）。本発明に用いられるＰＣＲは、当業者に公知の方法であり適宜設定することが可能なため、その条件・方法等は特に限定されない。
増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出法としては、例えば、蛍光ＤＮＡシークエンサーにおいてレーザー光照射により発生した蛍光をＣＣＤカメラで検出する方法等を挙げることが出来る。これらの方法により、各マイクロサテライトＤＮＡの長さから示される遺伝子型から個体の識別、あるいは親子の識別が可能となる。
【０００８】
以下の実施例をもって本発明を詳細に述べるが、これらは例示したのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０００９】
本発明マイクロサテライトＤＮＡの取得
ゲノムライブラリーの作製には日本水産（株）大分海洋研究センターで飼育したマダイを用いた。マダイ脾臓からゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。得られたゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で一晩酵素消化した後にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）に連結した。
上記のプラスミドベクターを用いて宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン含有培地に塗布した。得られた形質転換体をメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写後、メンブレンフィルターを変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を含む濾紙上に置き、形質転換体に含まれるプラスミドＤＮＡをメンブレンフィルターに吸着させた。次いで、メンブレンフィルターを中和溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を含む濾紙上で中和した。メンブレンフィルターを２×ＳＳＣで洗浄した後に１２０℃、１５分間の乾熱を行うことでプラスミドＤＮＡをメンブレンフィルター上に固定した。
メンブレンフィルターをハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液）中で３７℃、２時間のプレハイブリダイゼーションを行った後に５‘末端をＤＩＧ標識した（ＣＡ）×１０オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを加え３７℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。４℃に冷却した６×ＳＳＣでメンブレンフィルターを洗浄した後に、塩化テトラメチルアンモニウム溶液（３Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）で５５℃、２０分間の洗浄を２度行い過剰なオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを除いた。
メンブレンフィルターをＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）で室温、３０分間のブロッキングした後に、１５０ｍＵ／ｍＬのＡｎｔｉ−ＤＩＧ−ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔに移し、室温、３０分間、抗原抗体反応を行った。メンブレンフィルターをＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１５分の洗浄を２度行い、未反応抗体を除去した後にＮＢＴ／ＢＣＩＰ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む発色溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で発色させ陽性クローンの検出を行った。
陽性クローンからのプラスミドＤＮＡの抽出はＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて行い、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてサイクルシークエンス反応を行い、次いで反応産物を３１００−Ａｖａｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列の決定を行った。 得られた塩基配列からマイクロサテライトを含むクローンを選択した。得られた塩基配列を、配列番号１〜１２に示す。
【実施例２】
【００１０】
プライマーの設計及び対立遺伝子の遺伝の確認
実施例１で得られた塩基配列（配列番号１〜１２）をもとに、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエア（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いてマイクロサテライトを増幅させるプライマーを設計した。設計したプライマーの配列を配列表配列番号１３〜３６に示す。この設計したプライマーを用いて、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行ってマイクロサテライトを増幅し、マダイ親子間での対立遺伝子の遺伝を確認した。すなわち、配列番号１〜１２のマイクロサテライトの増幅はそれぞれ、配列番号１３及び配列番号１４の組み合わせ（配列番号１）、配列番号１５及び配列番号１６の組み合わせ（配列番号２）、配列番号１７及び配列番号１８の組み合わせ（配列番号３）、配列番号１９及び配列番号２０の組み合わせ（配列番号４）、配列番号２１及び配列番号２２の組み合わせ（配列番号５）、配列番号２３及び配列番号２４の組み合わせ（配列番号６）、配列番号２５及び配列番号２６の組み合わせ（配列番号７）、配列番号２７及び配列番号２８の組み合わせ（配列番号８）、配列番号２９及び配列番号３０の組み合わせ（配列番号９）、配列番号３１及び配列番号３２の組み合わせ（配列番号１０）、及び配列番号３３及び配列番号３４の組み合わせ（配列番号１１）、及び配列番号３５及び配列番号３６の組み合わせ（配列番号１２）のプライマー対を用いて行った。ＰＣＲはＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（エッペンドルフ社製）を使用し、２０μｌの反応量で行った。反応液中には１０×ＰＣＲバッファー（宝酒造社製）２μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（宝酒造社製）１．６μｌ、１０ｐＭプライマー（片鎖をＦＡＭラベル）、０．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラ―ゼ（宝酒造社製）、及び１０ｎｇのマダイ・ゲノムＤＮＡを混合し、滅菌蒸留水で希釈して全量を２０μｌとした。サーマルサイクラー中で、鋳型ＤＮＡを９４℃で５分間の熱変成を行った後に、９４℃で３０秒間変成、５８℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとして３０サイクル反応させ、更に７２℃で５分間伸長反応させ、最後に４℃まで温度を下げてＰＣＲ反応を終了した。次に、該ＰＣＲ産物の長さを３１００−Ａｖａｎｔを用いて検出し、各個体の各遺伝子座の対立遺伝子を決定した。結果を表１に示す。
【表１】
【実施例３】
【００１１】
実際の生産種苗のマイクロサテライトの遺伝子型を基に、その親魚の特定を試みた。種苗稚魚４個体及び親魚５５個体の各マイクロサテライトにおける対立遺伝子を、それぞれ表２（種苗稚魚）、表３及び表４（親魚）に示す。
【表２】
【表３】
【表４】
【００１２】
Ｆ１のあるマイクロサテライトにおける対立遺伝子は雄親及び雌親から一つずつ受け継いだものであることから、同じ遺伝子座においてＦ１と親魚では同一の対立遺伝子が存在するはずである。そこで、１２遺伝子座において１遺伝子座でもＦ１と同一の対立遺伝子が存在しない親魚を除外し最後に残った２個体をその親魚とした。結果を表５〜表８に示す。この結果、Ｆ１、４個体及びその親魚間において親子関係に矛盾はなかった。
また、これら１２遺伝子座を用いることで、今回、解析を行った５５個体全てが独自の遺伝子型を示したことから、個体識別にも有用であることが示された。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【配列表フリーテキスト】
【００１３】
配列番号１：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号２：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号３：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号４：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号５：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号６：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号７：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号８：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号９：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１０：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１１：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１２：マダイ由来の新規マイクロサテライトＤＮＡ。
配列番号１３：配列番号１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１４：配列番号１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１５：配列番号２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１６：配列番号２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１７：配列番号３のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１８：配列番号３のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１９：配列番号４のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２０：配列番号４のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２１：配列番号５のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２２：配列番号５のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２３：配列番号６のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２４：配列番号６のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２５：配列番号７のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２６：配列番号７のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２７：配列番号８のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２８：配列番号８のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２９：配列番号９のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３０：配列番号９のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３１：配列番号１０のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３２：配列番号１０のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３３：配列番号１１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３４：配列番号１１のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３５：配列番号１２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３６：配列番号１２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列で示されるＤＮＡ。
【請求項３】
マダイ由来である、請求項１又は２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列において、１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１乃至４記載のＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１乃至５記載のＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項７】
マダイの個体識別マーカーとして有用である、請求項１乃至６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
マイクロサテライトＤＮＡの長さを調べることを特徴とする、マイクロサテライトＤＮＡによるマダイの親子を識別する方法。
【請求項９】
請求項１乃至７記載のＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを用い、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列表配列番号１３〜３６に記載されるプライマーである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至７記載のＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１２】
配列表配列番号１３〜３６で表される、請求項１１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１】
配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列で示されるＤＮＡ。
【請求項３】
マダイ由来である、請求項１又は２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列表配列番号１〜１２に記載の塩基配列において、１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１乃至４記載のＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１乃至５記載のＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項７】
マダイの個体識別マーカーとして有用である、請求項１乃至６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
マイクロサテライトＤＮＡの長さを調べることを特徴とする、マイクロサテライトＤＮＡによるマダイの親子を識別する方法。
【請求項９】
請求項１乃至７記載のＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを用い、マダイのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列表配列番号１３〜３６に記載されるプライマーである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至７記載のＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１２】
配列表配列番号１３〜３６で表される、請求項１１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【公開番号】特開２００６−６７８５４（Ｐ２００６−６７８５４Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５３３２１（Ｐ２００４−２５３３２１）
【出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【Ｆターム（参考）】
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