マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法
【課題】マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する新たな微生物を見出し、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、製造に要する期間を短縮し、より安価にマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を製造することができる方法を提供すること。
【解決手段】栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
【解決手段】栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノシルエリスリトールリピッド（以下、単に「ＭＥＬ」と略記する場合がある。）の生産に要する期間を大幅に短縮させることができるマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノシルエリスリトールリピッド（特許文献１参照）は、脂肪酸と糖（マンノースとエリスリトール）が結合した物質である。脂質の性質に由来する親油性と糖の性質に由来する親水性を併せ持つ両親媒性物質であるため界面活性能を有し、生物により生産されることより糖脂質系のバイオサーファクタントの一種である。ＭＥＬは、界面活性作用を有すると共に抗微生物活性、細胞分化誘導活性（何れも非特許文献１参照 総説）や抗アレルギー活性（特許文献２参照）などが報告されている。また、マンノシルエリスリトールリピッドには生分解性があり、高い安全性を有すると考えられ、食品工業、医薬品工業、化学工業、環境関連分野などへの適用も広く検討されている。このような背景から安価なＭＥＬの製造方法の開発が望まれている。
【０００３】
ＭＥＬの製造方法については、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐ．Ｂ−７株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献２及び３参照）。また、キャンディダ アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ｔ−３４株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献４及び５参照）。同じく、キャンディダ アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ｔ−３４株を用いて６日間隔で計３回の逐次油脂流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献６参照）。
【０００４】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐ．ＳＹ−１６株を用いて流加培養法により２００時間後に１８質量％の大豆油から９５ｇ／Ｌ（生産速度：０．４８ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４５質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献７参照）。また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油（あぶら）を原料としてキャンディダ アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ｔ−３４株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが提案されている（特許文献３参照）。
【０００５】
シュードジーマ アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）ＤＳＭ１４９３０株を用いて油脂の流加培養法により１４日間で１６５ｇ／Ｌ（生産速度：０．５８ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献８参照）。
また、本発明者らは、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株を用いて１８質量％の植物油脂から回分培養法により１０日間で１５３ｇ／Ｌ（生産速度：０．６４ｇ／Ｌ／ｈ，原料収率：８５質量％）のＭＥＬの生産が可能であること、及び、油脂の流加培養法により２４日間で４０質量％の油脂から３０７ｇ／Ｌ（生産速度：０．５３ｇ／Ｌ／ｈ，原料収率：７７質量％）のＭＥＬの生産が可能であることを報告している（特許文献４参照）。
【０００６】
さらに、最近になってＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａ ＮＢＲＣ １０８７７を用いて植物油脂とエリスリトールの流加培養により２８日間で１９０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２８ｇ／Ｌ／ｈ）のＭＥＬの生産（特許文献５参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＫＭ−３４株を用いてグルコースから２．７ｇ／ＬのＭＥＬの生産（特許文献６参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＪＣＭ １０３１７株を用いてグリセロールから３ｇ／ＬのＭＥＬの生産（特許文献７参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐａｒａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＪＣＭ １１７５２株を用いて植物性油脂の流加により１４日間で１９０ｇ／Ｌ（生産速度：０．５６ｇ／Ｌ／ｈ）のＭＥＬ生産（特許文献８参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ ＣＢＳ １００９２を用いて大豆油から７日間で１３ｇ／ＬのＭＥＬ−Ｃ生産（特許文献９参照）が可能であることが報告されている。
【０００７】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【特許文献２】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献３】特開２００２−１０１８４７号公報
【特許文献４】特開２００４−２５４５９５号公報
【特許文献５】特開２００７−１８５１４２号公報
【特許文献６】特開２００７−２０９３３２号公報
【特許文献７】特開２００７−２０９３３３号公報
【特許文献８】特開２００７−２５２２７９号公報
【特許文献９】特開２００８−０７９６００号公報
【非特許文献１】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｉｓｏｄａ ａｎｄ Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．，９４，１８７（２００２）．
【非特許文献２】Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，１９（１９８３）．
【非特許文献３】Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｍ．Ｏｏｇａｋｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，１４３（１９８３）．
【非特許文献４】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａｋｉｂａ，Ｃ．Ｈｉｏｋｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３１（１９９０）．
【非特許文献５】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｈａｎｅｉｓｈｉ，Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３７（１９９０）．
【非特許文献６】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｆｉｊｉｓｈｉｒｏ，Ｈ．Ｙａｎａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｎａｋａｎｅ ａｎｄ Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４，３０５（１９９２）．
【非特許文献７】Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．Ｊｅｏｎ，Ｂ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｙ．Ａｈｎ，Ｈ．Ｍ．Ｏｈ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｙｏｏｎ：Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７０，３９１（２００６）．
【非特許文献８】Ｕ．Ｒａｕ，Ｌ．Ａ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｒｏｅｐｅｒ，Ｈ．Ｋｏｃｈ ａｎｄ Ｓ．Ｌａｎｇ：Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６８，６０７（２００５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれるマンノシルエリスリトールリピッドを食品工業、医薬品工業、化学工業などで広く普及させていくためには、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが必要である。しかしながら、前記のごとく、マンノシルエリスリトールリピッドの生産速度は低く、その充分な量の製造に１０日以上の期間を要しているのが現状である。そこで、更なるマンノシルエリスリトールリピッドの製造期間を短縮できる製造方法の開発が強く望まれている。
【０００９】
本発明は、このような要望に応え、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する新たな微生物を見出し、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、製造に要する期間を短縮し、より安価にマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を製造することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。即ち、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）のようなバイオサーファクタントは自然界に広く存在する微生物自身が生存するために生産している物質であって、今までに発見されてきたバイオサーファクタント生産微生物は自然界から分離されているという事実に基づき、日本各地から各種の試料を採取し、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を生産する微生物を分離したところ、新規酵母であるシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を得た。前記株はマンノシルエリスリトールリピッドの生産菌として優れた特徴を有しており、その培地組成、培養条件、培養方法を検討することにより、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を効率的に生産できることを知見した。
【００１１】
一般に、微生物を用いた発酵生産においては、培地組成及び培養条件によって菌体増殖や目的生産物の収率が大きく影響を受けることが知られている。そこで、前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用い、ＭＥＬ生産用培地における酵母エキス、コーンスティープリカー、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム、及び無機窒素源の濃度を変えると共に、ｐＨ、溶存酸素濃度及び温度の培養条件を変えてＭＥＬの生産に与える影響を調べて、ＭＥＬの生産における最適な培地組成及び培養条件を求めた。
【００１２】
また、従来の回分培養では、前培養液を培養槽に接種することにより培養を行ってきた。通常、前培養液は培地に対して１０容量％程度接種するが、前培養液中の菌体濃度は高くないために培養開始時の菌体濃度はあまり高くない。このため、ＭＥＬの生産が開始するまでに１日程度の時間を要している。この期間を誘導期と呼んでいるが、この誘導期を短縮することにより、よりＭＥＬ生産に要する培養時間を短縮することができると考えられる。誘導期を短縮するためには、培養開始時の菌体濃度を高くすることが有効である。初発の菌体濃度を高くする手法の１つに繰り返し回分培養があり、この手法は、初発の菌体濃度を高くできること以外にも、前培養が不要、培養槽の洗浄が不要などの利点を有している。
繰り返し回分培養では、前記回分培養と同様の方法で培養を開始し、任意の時間培養を行ってＭＥＬを生産した後に菌体を含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して予め滅菌しておいた新たな培地（油脂を含む）を所定量だけ無菌的に加えて、次の回分培養を開始する。以後、このような操作を繰り返すことによりＭＥＬ生産に要する培養期間を短縮できる。
【００１３】
また、マンノシルエリスリトールリピッドは、後述する構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４への水素原子及びアセチル基の結合の数と位置により４種類の物質が報告されている。アセチル基は親油基であり水への溶解度を低下させるため、アセチル基が結合していないマンノシルエリスリトールが望まれている。しかしながら、現在までその存在は知られていたが、生産量は微量であった。ここで、本発明者らは更に、回分培養或いは繰り返し回分培養を行った後の培養液を、最適の温度下に保存することにより、後述する構造式（１）においてＲ１〜Ｒ４にアセチル基が結合していないＭＥＬ（後述する構造式（２）で示されるＭＥＬ）を製造できることを知見した。
【００１４】
従って、前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用いてマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産用培地のｐＨ等を制御し、最適な培地組成及び培養条件を設定して回分培養及び繰り返し回分培養を実施することにより、ＭＥＬ生産に要する培養期間を短縮できることと共に、後述する構造式（１）においてＲ１〜Ｒ４にアセチル基が結合しないマンノシルエリスリトールリピッド（後述する構造式（２）で示されるマンノシルエリスリトールリピッド）を生産できることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１５】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、下記の通りである。即ち、
＜１＞ 栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜２＞ マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）である前記＜１＞に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜３＞ 培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御して培養を行う前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜４＞ 培養液のｐＨ制御をアンモニアを用いて行う前記＜３＞に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜５＞ 培養液の溶存酸素濃度を１〜５ｐｐｍの範囲に制御して培養を行う前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜６＞ 培養液中にコーンスティープリカーを０．１〜４ｇ／Ｌ含有させて培養を行う前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜７＞ 炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜８＞ 炭素源として炭素数６〜２４の脂肪酸を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜９＞ 炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１０＞ 炭素源として炭水化物を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１１＞ 炭素源として食品廃油を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１２＞ 炭素源濃度が１０〜３２質量％の範囲で培養を行う前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１３＞ マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物におけるマンノシルエリスリトールリピッドを生産する上での培地組成及び培養条件が、下記の通りである前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー：０．１〜４ｇ／Ｌ
硝酸アンモニウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
炭素源：１００〜３２０ｇ／Ｌ
培養液ｐＨ：５．０〜５．８
溶存酸素濃度：１〜５ｐｐｍ
培養温度：２６〜３２℃
＜１４＞ 炭素源濃度が１０〜３０質量％の範囲で培養を開始し、該培養開始後２〜６日間の培養終了時に菌体とマンノシルエリスリトールリピッドを含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して新たな培地を加えて、次の回分培養を開始し、該操作を繰り返して培養を行う前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１５＞ 更に、培養終了後の培養液を２０〜７０℃に保持する工程を含み、下記構造式（２）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを得る前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
【化２】
ただし、前記構造式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、又は炭素原子数１〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す（ただし、アセチル基を除く）。
＜１６＞ マンノシルエリスリトールリピッドの生産量が、７質量％以上（７０ｇ／Ｌ以上）である前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する新たな微生物を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、製造に要する期間を短縮し、より安価にマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を製造することができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法）
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法であって、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする。
【００１８】
＜マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物＞
前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物としては、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）を使用する。前記シュードジーマ ツクバエンシスとしては、使用する菌株に特に制限はなく、例えば、ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）、ＮＢＲＣ１９４０、ＡＴＣＣ２４５５５、ＣＢＳ６３８９などが挙げられるが、これらの中でも、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）が、ＭＥＬの生産速度が高い点で、特に好ましい。
【００１９】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株は、本発明者らにより単離された新規酵母であり、国内寄託機関である独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２００８年３月１７日に寄託（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）されている。なお、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株がマンノシルエリスリトールリピッドの生産菌として優れた特徴を有していることは、従来には全く知られておらず、このことは、本発明者の新知見にかかるものである。
【００２０】
以下、前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株について説明する。
【００２１】
（ａ）各培地における生育状態
ｉ．コロニー観察
ＹＭ寒天培地上で２５℃下、７日間の培養において、形成したコロニーは次のような形状を示した。
周縁の形状はほぼ全縁、隆起状態はクッション状、表面の状態は平滑、光沢及び性状は弱い光沢と湿性、色調は桃色味から黄色味を帯びたクリーム色
ｉｉ．顕微鏡観察
ＹＭ寒天培地上で２５℃下、７日間の培養において，栄養細胞は長楕円形であり、極出芽により増殖する。培養開始後３週間後において有性生殖器官の形成は認められない。
（ｂ）生理性状試験
１）生育できる範囲
ｐＨ２〜７、温度１０〜３７℃
２）糖類醗酵試験
グルコースを醗酵しなかった。
３）炭素源資化性試験
【表１】
４）窒素源資化性試験
【表２】
５）ビタミンの要求性無し。
６）デンプン類似物質の生成無し。
（ｃ）２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析
抽出からサイクルシークエンスまでの操作は、各プロトコールに基づいて行った。
１）ＤＮＡ抽出：ＤＮＡｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
２）ＰＣＲ：ｐｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）
３）サイクルシークエンス：ＧｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
４）使用プライマー：ＮＬ１，ＮＬ２，ＮＬ３及びＮＬ４（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３）
５）シークエンス：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
６）配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．，Ｔｅｗａｎｔｉｎ，ＡＵＳ）
７）相同性検索及び簡易分子系統解析：
ソフトウエア アポロン ２．０
データベース アポロン ＤＢ−ＦＵ １．０
国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）
以上の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析、簡易形態観察、及び生理・生化学的性状試験の結果より、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）に帰属すると推定した。
【００２２】
＜培養＞
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株の培養には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができ、酵母に対して一般に用いられる培地、例えば、ＹＰＤ培地（例えば、イーストイクストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇの組成）を使用することができる。また、最適生育ｐＨは５．２であり、生育可能なｐＨ範囲は２〜７である。最適生育温度は３０℃であり、生育可能な温度範囲は１０〜３６℃である。なお、ＭＥＬの生産性を高めるためには、単にシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株が生育できるだけでは十分ではなく、培地組成及び培養条件を最適化する必要があり、これら最適条件については後述する。
【００２３】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を培養するための炭素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、トリグリセリド、脂肪族炭化水素、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。
【００２４】
前記トリグリセリドとしては、特に制限はなく、植物油脂、動物油脂等が挙げられ、目的に応じて適宜選定することができる。前記植物油脂としては、大豆油、亜麻仁油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、亜麻仁油、大豆油、菜種油が好ましい。前記動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。前記トリグリセリドとしては、炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドが好ましい。なお、植物油脂、動物油脂等としては、てんぷら等を製造した後の食品廃油等も利用可能である。
【００２５】
前記脂肪族炭化水素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。前記炭化水素の炭素数は６〜２４の範囲であることが好ましく、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ドデカン、ヘキサデカン、オクタデカンといった飽和炭化水素、或いは１−ペンタデセン（Ｃ１５Ｈ３０）、１−ヘプタデセン（Ｃ１７Ｈ３４）等の不飽和炭化水素及びその混合物であって、より好ましくは炭素数１４〜２０の飽和或いは不飽和炭化水素及びその混合物、さらに好ましくはオクタデカンを主成分とする混合物を用いることができる。また、前記脂肪族炭化水素としては、直鎖の脂肪族炭化水素が好ましい。
【００２６】
前記脂肪酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。前記脂肪酸の炭素数は６〜２４の範囲であることが好ましく、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸といった飽和脂肪酸、或いはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸及びその混合物であって、より好ましくは炭素数１４〜２０の飽和或いは不飽和脂肪酸及びその混合物、さらに好ましくはリノール酸及びリノール酸を主成分とする混合物を用いることができる。
【００２７】
前記炭水化物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖とその誘導体、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖及びその混合物であって、好ましくは単糖、さらに好ましくはグルコースである。
【００２８】
中でも、前記炭素源としては植物油脂が好ましく、亜麻仁油、大豆油、菜種油が特に好ましい。前記炭素源の含有量は、培地中、１０〜３２質量％が好ましく、１４〜３０質量％が特に好ましい。
【００２９】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を培養するための栄養素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、ポリペプトン、コーンスティープリカー、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安、リン酸２水素カリウム、リン酸１水素カリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられ、酵母エキス、コーンスティープリカー、硝酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウムなどが好ましい。
【００３０】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を培養するための無機窒素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安等が挙げられ、これらの中でも、硝酸アンモニウム、尿素が好ましい。
【００３１】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成及び培養条件としては、以下の通りである。酵母エキスは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい。コーンスティープリカーは、０．１〜４ｇ／Ｌが好ましく、２ｇ／Ｌが特に好ましい。硝酸アンモニウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。リン酸２水素カリウムは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。硫酸マグネシウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。植物油脂等の炭素源は、１００〜３２０ｇ／Ｌが好ましく、１４０〜３００ｇ／Ｌが特に好ましい。溶存酸素濃度は、１〜５ｐｐｍが好ましく、３〜５ｐｐｍが特に好ましい。培養温度は、２６〜３２℃が好ましく、３０℃が特に好ましい。ｐＨは、５．０〜５．８が好ましく、５．２が特に好ましい。なお、培養液のｐＨ調整は、菌体の栄養素となり得るアンモニアを用いて行うことが好ましい。
【００３２】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管にシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行う。更に、これを所定量の油脂と酵母エキス１ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始する。なお、ｐＨは、ｐＨメーターで測定できる。溶存酸素濃度は、溶存酸素濃度メーターで測定できる。
【００３３】
−回分培養−
回分培養では、培養途中で油脂などの炭素源の供給は行わないで、１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定する。ＭＥＬ、トリグリセリド、ジグリセリド、炭化水素、及び脂肪酸については、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、所定の方法により各成分を定量分析する。
【００３４】
ここで、前記回分培養においては、培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御し、培養液中に無機窒素源を含有させ、該無機窒素源が、硝酸アンモニウム及び尿素のいずれかであることが好ましい。この場合、初発炭素源濃度が１０〜３２質量％の範囲で培養を行うことが好ましく、１０〜３０質量％の範囲で培養を行うことがより好ましい。
【００３５】
−繰り返し回分培養−
前記回分培養では、前培養液を培養槽に接種することにより培養を行う。通常、前培養は培地に対して１０容量％程度接種するが、前培養液中の菌体濃度は高くないために培養開始時の菌体濃度はあまり高くない。このため、ＭＥＬの生産が開始するまでに１日程度の時間を要する。この期間を誘導期と呼んでいるが，この誘導期を短縮することにより，より短時間でＭＥＬを生産することができると考えられる。誘導期を短縮するためには，培養開始時の菌体濃度を高くすることが有効である。初発の菌体濃度を高くする手法の１つに繰り返し回分培養があり、この手法は，初発の菌体濃度を高くできること以外に、前培養が不要、培養槽の洗浄が不要などの利点を有している。
【００３６】
繰り返し回分培養では、前記回分培養と同様の方法で培養を開始し、任意の時間培養を行ってＭＥＬを生産した後に菌体を含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して予め滅菌しておいた新たな培地（油脂を含む）を所定量だけ無菌的に加えて，次の回分培養を開始する。以後、このような操作を繰り返す。
【００３７】
ここで、前記繰り返し回分培養においては、培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御し、培養液中に無機窒素源を含有させ、該無機窒素源が、硝酸アンモニウム及び尿素のいずれかであることが好ましい。この場合、初発炭素源濃度が１０〜３６質量％の範囲で培養を行うことが好ましく、１４〜３０質量％の範囲で培養を行うことがより好ましい。培養時間は２〜６日間が好ましい。また、該培養槽内に残す培養液量を培養液全体の６〜３５容量％として、次の回分培養を開始することが好ましい。
【００３８】
＜マンノシルエリスリトールリピッド＞
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法により得られるマンノシルエリスリトールリピッドは、下記構造式（１）で表される化合物である。
【００３９】
【化３】
【００４０】
前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜２０、好ましくは３〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す。
【００４１】
−Ｒ１〜Ｒ４にアセチル基が結合していないマンノシルエリスリトールリピッドの製造−
マンノシルエリスリトールリピッドは、前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４への水素原子及びアセチル基の結合の数と位置により４種類の物質が報告されている。ここで、アセチル基は親油基であり水への溶解度を低下させるため、中でも、アセチル基の無いマンノシルエリスリトールリピッドが望まれている。
このアセチル基の無いマンノシルエリスリトールリピッドは、下記構造式（２）で示される。（前記構造式（１）と前記構造式（２）とでは、Ｒ１〜Ｒ４の種類が異なる。）
【化４】
前記構造式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、又は炭素原子数１〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す（ただし、アセチル基を除く）。
【００４２】
しかしながら、前記構造式（２）で表されるアセチル基の無いＭＥＬは、現在までその存在は知られていたが、生産量は微量であった。
そこで、本発明者らは更に、前記のように回分培養或いは繰り返し回分培養を行った後のＭＥＬ含有培養液を、任意の温度下に保存することにより、前記構造式（１）においてＲ１〜Ｒ４にアセチル基が結合していないＭＥＬ（前記構造式（２）で示されるＭＥＬ）を製造できることを見出した。方法は以下の通りである。
【００４３】
培養を行った後のＭＥＬ含有培養液を１０〜７０℃の温度の恒温槽に入れて保温する。一定期間毎に等容積量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、ＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認する。ここで、ＭＥＬ含有培養液の保存温度は、２０〜７０℃が好ましく、３０〜５０℃が特に好ましい。保存時間は、２〜３０日が好ましく、３〜２０日が特に好ましい。
【００４４】
一定温度で保存したＭＥＬ含有培養液に等容量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去し、脂質成分を回収する。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：酢酸エチル溶液（４：１）、アセトン、メタノールの順で溶出させる。各溶液をＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認する。アセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去してアセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分を得た。得られたＭＥＬ成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離する。
【００４５】
マンノース残基上のアシル基の結合位置の同定は、過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲによる解析で行うことができる。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖のＨ−２〜Ｈ−６のプロトンは３．５ｐｐｍ付近にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本ＭＥＬにおいても脂肪酸の結合によると考えられる低磁場シフトした２つのプロトンシグナルが観測されたことから、このＭＥＬは、２分子のアシル基が結合していると同定できる。さらに、２分子の−ＣＯＣＨ２−の存在を示すシグナルが観測されたが、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）の存在を示すシグナルは観測されなかったことより、マンノースに結合しているアシル基は、２つの脂肪酸であると同定できる。
【００４６】
以上説明したような、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法によれば、前記マンノシルエリスリトールリピッドを、好ましくは７質量％以上（７０ｇ／Ｌ以上）、より好ましくは２０質量％以上（２００ｇ／Ｌ以上）、更に好ましくは２０〜４０質量％（２００〜４００ｇ／Ｌ）の高濃度に、短期間で製造することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明について更に詳細に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１：マンノシルエリスリトールリピッド生産微生物株の選択）
本実施例１では、マンノシルエリスリトールリピッドを短時間で効率的に生産できる微生物株を選択した。
【００４９】
糖脂質生産量の高い微生物８菌株（ＴＭ−１７９、ＴＭ−１８０、ＴＭ−１８１、ＴＭ−１８２、ＴＭ−１８３、ＴＭ−１８４、ＴＭ−１８５、ＴＭ−１８６）について、以下のように培養を行った。なお、前記各菌株は、特開２００５−１０４８３７号の段落番号〔００２３〕、〔００４９〕等に記載の方法に従い、本発明者らにより自然界から分離されたものである。グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地（以下、前培養用培地と略する）４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日振とう間培養を行った。更に、これを１８質量％の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。なお、ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４質量％のアンモニアを供給することにより５．４に保持した。１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、経時的に培養液中の各成分を測定した。各菌株におけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を、参考菌株としてのクルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２６）の結果と共に表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
菌株によりＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間に違いがあった。ＴＭ−１７９、ＴＭ−１８１、ＴＭ−１８２、ＴＭ−１８３は、いずれも１３０ｇ／Ｌ以上のＭＥＬを生産したが、最も培養に要する期間が短かったのはＴＭ−１８１であった。
【００５２】
ＴＭ−１８１株は、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２６）に比較してＭＥＬ生産量は７ｇ／Ｌ低い値であったが、生産に要する時間は１４４時間であり、９６時間（４日）生産に要する時間を短縮できた。
【００５３】
このＴＭ−１８１株は、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析、簡易形態観察、及び生理・生化学的性状試験等の結果から、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）に帰属すると推定され（詳細は前記の通り）、本発明者らにより、国内寄託機関である独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２００８年３月１７日に寄託（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）された。
本実施例１における結果から、以降の実施例については、マンノシルエリスリトールリピッド生産微生物株として、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用いることとした。
【００５４】
（実施例２：培地成分の最適濃度の決定）
本実施例２では、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）におけるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高めるための培地成分の最適濃度を決定した。
【００５５】
培地成分の酵母エキス、コーンスティープリカー、硝酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、及び硫酸マグネシウムの各培地成分の最適濃度を決定するため、各成分について６〜８段階に濃度を変えて以下のように回分培養を行った。前培養用培地の４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを１８質量％の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成を基準として、酵母エキス（０〜４ｇ／Ｌ）、コーンスティープリカー（０〜６ｇ／Ｌ）、硝酸アンモニウム（０〜４ｇ／Ｌ）、リン酸２水素カリウム（０〜４ｇ／Ｌ）、及び硫酸マグネシウム（０〜４ｇ／Ｌ）の濃度を６〜８段階に変えた液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。なお、ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４質量％のアンモニアを供給することにより、５．４に保持した。１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、経時的に培養液中の各成分を測定した。
その結果、酵母エキス１ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌが最適濃度であった。
【００５６】
（実施例３：ｐＨ、溶存酸素濃度、培養温度の最適条件の決定）
本実施例３では、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）におけるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高めるためのｐＨ、溶存酸素濃度、培養温度の最適条件を決定した。
【００５７】
ｐＨ、溶存酸素濃度、培養温度の最適条件を決定するため、これらの３つの条件について３〜７段階に変えて回分培養を行った。なお、培養液のｐＨは、ｐＨメーターにより測定し、アンモニアを滴下することにより所定のｐＨに制御した。溶存酸素濃度は、溶存酸素濃度メーターにより測定し、回転数を自動的に制御することにより所定の溶存酸素濃度に制御した。その結果、ｐＨ５．２、溶存酸素濃度３〜５ｐｐｍ、培養温度３０℃が最適条件であった。これらのうち、ｐＨ、及び、溶存酸素濃度の最適条件の決定方法の詳細を以下に示す。
【００５８】
−基本培養条件−
前培養用培地４ｍＬが入った試験管にシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを所定量の植物油脂（亜麻仁油あるいは大豆油）と酵母エキス１ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌの組成の液体培地（以下、本培養用培地と略する）１．４Ｌ（回分培養）及び４．６Ｌ（繰り返し回分培養）が入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分（回分培養）及び５Ｌ／分（繰り返し回分培養）の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。
【００５９】
−回分培養−
回分培養では、培養途中において植物油脂（亜麻仁油あるいは大豆油）の供給を行わないで、１日に１乃至２回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定した。ＭＥＬ、トリグリセリド、ジグリセリド、及び脂肪酸は、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後、静置し、上清の酢酸エチル層を回収した。この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして所定の方法により各成分を定量分析した。
【００６０】
−培養液のｐＨ選定−
次に、ＭＥＬ生産に及ぼす培養液のｐＨの影響を調べるため、初発油脂濃度を１８質量％として、ｐＨコントローラーを用いて培養期間中のｐＨ５．０〜５．８の間で一定の値に保持して培養を行った。なお、ｐＨを調整するために用いるアルカリ溶液としては、菌体の栄養素となり得るアンモニア（１４質量％アンモニア溶液）を使用した。
各ｐＨにおけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を表４に示す。ｐＨが５．０〜５．８、特にｐＨ５．２に制御して培養することがＭＥＬの生産効率を高める上で効果的であることが認められた。
【００６１】
【表４】
【００６２】
−培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ）の選定−
次に、ＭＥＬ生産に及ぼす培養液の溶存酸素濃度の影響を調べるため、初発油脂濃度を２０質量％としてＤＯを１、３、５ｐｐｍに制御して培養を行った。この時、溶存酸素濃度は溶存酸素濃度メーターにより測定し、回転数を自動的に制御することにより所定の溶存酸素濃度に制御した。各溶存酸素濃度におけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を表５に示す。ＤＯを３〜５に制御して培養することがＭＥＬの生産効率を高める上で効果的であることが認められた。
【００６３】
【表５】
【００６４】
（実施例４：最適油脂濃度の決定）
上記実施例３のようにして設定した基本培養条件において、初発油脂濃度を表６に示すように変化させて、ＭＥＬ生産に与える初発油脂濃度の影響を検討した。ＭＥＬの効率生産を考慮すると、更なる高濃度化が望まれる。このためには、初発の油脂濃度を増加させる必要がある。そこで、油脂濃度を１０から３６質量％まで変化させて培養を行った。各培養におけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を表６に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
初発油脂濃度の増加により、ＭＥＬ生産量は増加し、３０質量％で２２０ｇ／ＬのＭＥＬを１２６時間で生産した。３４質量％以上では生産量は急激に低下した。現在、ＭＥＬ生産量は、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１を用いた流加回分培養法による３０７ｇ／Ｌが最も高い。シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株での回分培養では２２１ｇ／Ｌが最高値であるが、流加回分培養法を用いることにより、さらに高濃度のＭＥＬをより短時間で生産できると考えられる。
【００６７】
なお、参考として、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株は、初発油脂濃度２０質量％とした場合に２４０時間で１５３ｇ／ＬのＭＥＬを生産し、油脂濃度をこれ以上に増加させてもＭＥＬ生産量は増加しなかった。シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株は、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株よりも６９ｇ／Ｌ高いＭＥＬ生産量で１１４時間短い時間で生産できた。
【００６８】
（実施例５：繰り返し回分培養）
前培養用培地４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを１８質量％の亜麻仁油と本培養用培地４．６Ｌが入ったジャーファメンターに４本（合計０．４Ｌ）接種して、３０℃で５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。なお、ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４質量％のアンモニアを供給することにより５．２に保持して、１回目の回分培養を９６時間行った。植物油脂（亜麻仁油）は、菌体が分泌したリパーゼにより急速に脂肪酸とグリセロールに分解された。生成した中間代謝物である脂肪酸は、細胞内に取り込まれて代謝され、菌体とＭＥＬが生産された。
２回目の回分培養は、攪拌羽根の回転を停止させ、４．３Ｌの培養液を試料採取管を通じてジャーファメンターから引き抜き、０．７Ｌをジャーファメンター内に残した。直ちに、予め滅菌しておいた１８質量％の亜麻仁油を含む本培養用培地４．３Ｌを接種口からジャーファメンターに無菌的に流し込み、回転羽根を８００ｒｐｍの攪拌速度で培養を開始した。ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４量％のアンモニアを供給することにより５．２に保持した。
３回目以降の回分培養は、上記のような操作を繰り返し、培養時間を次第に短くして、計１０回の回分培養を繰り返した。この時、各回分培養での残存培養液量は表７に示すように０．３〜１．７５Ｌの範囲で変化させると共に引き抜いた培養液と同量の滅菌した新たな培地を加えた。また、１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、経時的に培養液中の各成分を測定した。
表７に示したように、１０回の培養何れも原料の油脂を完全に分解し、生成した脂肪酸をほぼ消費して約１３０ｇ／ＬのＭＥＬを安定に生産でき、菌株の生産能力の低下はなかった。また、培養液を随時顕微鏡で観察した結果、バクテリアなどの雑菌は観察されず、雑菌汚染もなかった。これらのことより、さらに長期間の培養も可能であると考えられた。
【００６９】
【表７】
【００７０】
１回目の回分培養では、ＭＥＬを開始するまでに要する時間（誘導時間）に１８時間を要した。２回目以降は、誘導時間は短縮された。このように誘導時間が短縮されたのは、１回目の培養では振とうフラスコからの培養液を接種したために培養槽中の初発の菌体が低濃度であるのに対して、２回目以降では新たな回分培養開始時の菌体濃度が高くなっているためである。新たな回分培養開始時のＭＥＬ及び菌体濃度は、残液率に影響される。また、ＭＥＬ生産を開始した後、何れの培養においてもＭＥＬ濃度はほぼ直線的に増加した。その後、ＭＥＬ濃度は最高生産量に達する前からその増加の程度は次第に低下していった。なお、ＭＥＬ生産速度は、培養の経時変化よりＭＥＬがほぼ直線的に増加する部分の傾きから最小自乗法により計算した。初発のＭＥＬ濃度が高い（＝残存培養液の量が多い）と最高生産量に達するまでの時間が短くなり、２回目以降は、何れも７２時間（３日）で１３０ｇ／Ｌに達した。なかでも、１０回目の培養（残液率：０．３５）では６０時間（２．５日）で１３０ｇ／Ｌに達した。これは、残液率を高くすることにより培養槽内の菌体濃度を高くできたことによるものと考えられる。また、リパーゼとＭＥＬが培養の最初から相当量存在するために油脂の分解が促進され、脂肪酸の細胞への取り込みが促進されたと考えられる。
【００７１】
（実施例６：構造式（１）においてＲ１からＲ４にアセチル基が結合しないマンノシルエリスリトールリピッド（＝構造式（２）で示されるマンノシルエリスリトールリピッド）の製造方法）
前培養用培地４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを１８質量％の亜麻仁油と本培養用培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。培養期間中、ｐＨコントローラーを用いてｐＨを５．２に保持しつつ４日間培養を行い、ＭＥＬ含有培養液を作製した。ＭＥＬ含有培養液が２０〜７０℃となるように、温度計で測定しながら恒温槽に入れて保温した。一定期間毎に試料を採取して等容積量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、ＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開した。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認した。結果を図１に示す。
【００７２】
図１は、培養液を７日間所定の温度で保存したものである。レーン番号の１は保存開始前、２は３０℃、３は２０℃、４は４０℃、５は５０℃、６は６０℃、７は７０℃で保存した。図中、スポットが大きいものほどＭＥＬの存在量が多い。保存開始前は、アセチル基が１つ結合したＭＥＬのみであったが、７日間の保存後、アセチル基が１つ結合したＭＥＬ（図１中、上のスポット）は減少し、アセチル基が無いと推定されるＭＥＬのスポット（図１中、下のスポット）が大きくなった。レーン３の２０℃ではアセチル基が１つ結合したＭＥＬの方がスポット（上のスポット）は大きいが、レーン２、４、５の３０〜５０℃では、アセチル基が１つ結合したＭＥＬのスポットはほとんど無く、ほぼ全てがアセチル基が無いと推定されるＭＥＬのスポット（下のスポット）となった。レーン６と７の６０と７０℃では両方のスポットが小さくなった。このような結果から、ＭＥＬ含有培養液の保存温度は、２０〜７０℃が好ましく、特に３０〜５０℃が好ましいことがわかる。
【００７３】
＜糖脂質の単離＞
一定温度で保存したＭＥＬ含有培養液に等容量の酢酸エチルの酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルをエバポレーターを用いて留去し、脂質成分を回収した。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：酢酸エチル溶液（４：１）、アセトン、メタノールの順で溶出させた。各溶液をＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開した。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認した。アセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去してアセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分を得た。得られたＭＥＬ成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離した。
【００７４】
＜糖脂質の構造決定＞
アシル基の結合位置は、過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲにより解析した。対照としてマンノースに２つのアセチル基と脂肪酸が結合したマンノシルエリスルトールリピッド（ＭＥＬ：４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−４−ｍｅｓｏ−エリスリトール）を用いた。
４．０ｐｐｍより低磁場側のシグナルから、マンノースが確認された。これらのシグナルに加えて、高磁場の領域には、アシル基の特性を示すシグナルが観測されており、それぞれ−ＣＯＣＨ２−基の−ＣＨ２−プロトンシグナルと同定できることから、２分子の脂肪酸が存在していることがわかる。一方、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）のメチルプロトンの存在を示すシグナルは観測されなかったことより、マンノースにアセチル基は結合していないと同定できた。結果を図２に示す。なお、この化合物は慣例的にＭＥＬ−Ｄと呼ばれている。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によると、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物としてシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドの生産に要する時間を大幅に向上させることができた。更に、本発明では、アセチル基が結合していないマンノシルエリスリトールリピッドの大量生産をも可能とした。本発明により得られるマンノシルエリスリトールリピッドは、例えば、食品工業、医薬品工業、化学工業、環境関連分野などで好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ＭＥＬ含有培養液を７日間所定の温度で保存した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で展開し、存在するＭＥＬの種類を確認した結果を示す図である。（レーン番号の１は保存開始前のＭＥＬ含有培養液、２は３０℃、３は２０℃、４は４０℃、５は５０℃、６は６０℃、７は７０℃で保存した後のＭＥＬ含有培養液を示す。）
【図２】図２は、実施例６に係わるマンノシルエリスリトールリピッドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。＜１Ｈ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属水素，Ｄ２Ｏ）＞マンノシルエリスリトール部：３．３０−４．００（Ｍａｎ−４−Ｈ，５−Ｈ，６−Ｈ２，Ｅｒｙ−１−Ｈ２，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ），４．７７（Ｍａｎ−１−Ｈ），４．９３（Ｍａｎ−３−Ｈ），５．４３（Ｍａｎ−２−Ｈ）；アシル部：０．８６，０．９５（ＣＨ３），１．０５−１．４０，１．９０−２．１０［−（ＣＨ２）ｎ−］，１．６０−１．７０（−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．２７，２．３６（−ＣＯ−ＣＨ２−），５．２３（−ＣＨ＝ＣＨ−）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノシルエリスリトールリピッド（以下、単に「ＭＥＬ」と略記する場合がある。）の生産に要する期間を大幅に短縮させることができるマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノシルエリスリトールリピッド（特許文献１参照）は、脂肪酸と糖（マンノースとエリスリトール）が結合した物質である。脂質の性質に由来する親油性と糖の性質に由来する親水性を併せ持つ両親媒性物質であるため界面活性能を有し、生物により生産されることより糖脂質系のバイオサーファクタントの一種である。ＭＥＬは、界面活性作用を有すると共に抗微生物活性、細胞分化誘導活性（何れも非特許文献１参照 総説）や抗アレルギー活性（特許文献２参照）などが報告されている。また、マンノシルエリスリトールリピッドには生分解性があり、高い安全性を有すると考えられ、食品工業、医薬品工業、化学工業、環境関連分野などへの適用も広く検討されている。このような背景から安価なＭＥＬの製造方法の開発が望まれている。
【０００３】
ＭＥＬの製造方法については、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐ．Ｂ−７株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献２及び３参照）。また、キャンディダ アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ｔ−３４株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献４及び５参照）。同じく、キャンディダ アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ｔ−３４株を用いて６日間隔で計３回の逐次油脂流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献６参照）。
【０００４】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐ．ＳＹ−１６株を用いて流加培養法により２００時間後に１８質量％の大豆油から９５ｇ／Ｌ（生産速度：０．４８ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４５質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献７参照）。また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油（あぶら）を原料としてキャンディダ アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ｔ−３４株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが提案されている（特許文献３参照）。
【０００５】
シュードジーマ アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）ＤＳＭ１４９３０株を用いて油脂の流加培養法により１４日間で１６５ｇ／Ｌ（生産速度：０．５８ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献８参照）。
また、本発明者らは、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株を用いて１８質量％の植物油脂から回分培養法により１０日間で１５３ｇ／Ｌ（生産速度：０．６４ｇ／Ｌ／ｈ，原料収率：８５質量％）のＭＥＬの生産が可能であること、及び、油脂の流加培養法により２４日間で４０質量％の油脂から３０７ｇ／Ｌ（生産速度：０．５３ｇ／Ｌ／ｈ，原料収率：７７質量％）のＭＥＬの生産が可能であることを報告している（特許文献４参照）。
【０００６】
さらに、最近になってＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａ ＮＢＲＣ １０８７７を用いて植物油脂とエリスリトールの流加培養により２８日間で１９０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２８ｇ／Ｌ／ｈ）のＭＥＬの生産（特許文献５参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＫＭ−３４株を用いてグルコースから２．７ｇ／ＬのＭＥＬの生産（特許文献６参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＪＣＭ １０３１７株を用いてグリセロールから３ｇ／ＬのＭＥＬの生産（特許文献７参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐａｒａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＪＣＭ １１７５２株を用いて植物性油脂の流加により１４日間で１９０ｇ／Ｌ（生産速度：０．５６ｇ／Ｌ／ｈ）のＭＥＬ生産（特許文献８参照）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ ＣＢＳ １００９２を用いて大豆油から７日間で１３ｇ／ＬのＭＥＬ−Ｃ生産（特許文献９参照）が可能であることが報告されている。
【０００７】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【特許文献２】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献３】特開２００２−１０１８４７号公報
【特許文献４】特開２００４−２５４５９５号公報
【特許文献５】特開２００７−１８５１４２号公報
【特許文献６】特開２００７−２０９３３２号公報
【特許文献７】特開２００７−２０９３３３号公報
【特許文献８】特開２００７−２５２２７９号公報
【特許文献９】特開２００８−０７９６００号公報
【非特許文献１】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｉｓｏｄａ ａｎｄ Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．，９４，１８７（２００２）．
【非特許文献２】Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，１９（１９８３）．
【非特許文献３】Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｍ．Ｏｏｇａｋｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，１４３（１９８３）．
【非特許文献４】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａｋｉｂａ，Ｃ．Ｈｉｏｋｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３１（１９９０）．
【非特許文献５】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｈａｎｅｉｓｈｉ，Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３７（１９９０）．
【非特許文献６】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｆｉｊｉｓｈｉｒｏ，Ｈ．Ｙａｎａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｎａｋａｎｅ ａｎｄ Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４，３０５（１９９２）．
【非特許文献７】Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．Ｊｅｏｎ，Ｂ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｙ．Ａｈｎ，Ｈ．Ｍ．Ｏｈ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｙｏｏｎ：Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７０，３９１（２００６）．
【非特許文献８】Ｕ．Ｒａｕ，Ｌ．Ａ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｒｏｅｐｅｒ，Ｈ．Ｋｏｃｈ ａｎｄ Ｓ．Ｌａｎｇ：Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６８，６０７（２００５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれるマンノシルエリスリトールリピッドを食品工業、医薬品工業、化学工業などで広く普及させていくためには、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが必要である。しかしながら、前記のごとく、マンノシルエリスリトールリピッドの生産速度は低く、その充分な量の製造に１０日以上の期間を要しているのが現状である。そこで、更なるマンノシルエリスリトールリピッドの製造期間を短縮できる製造方法の開発が強く望まれている。
【０００９】
本発明は、このような要望に応え、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する新たな微生物を見出し、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、製造に要する期間を短縮し、より安価にマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を製造することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。即ち、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）のようなバイオサーファクタントは自然界に広く存在する微生物自身が生存するために生産している物質であって、今までに発見されてきたバイオサーファクタント生産微生物は自然界から分離されているという事実に基づき、日本各地から各種の試料を採取し、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を生産する微生物を分離したところ、新規酵母であるシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を得た。前記株はマンノシルエリスリトールリピッドの生産菌として優れた特徴を有しており、その培地組成、培養条件、培養方法を検討することにより、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を効率的に生産できることを知見した。
【００１１】
一般に、微生物を用いた発酵生産においては、培地組成及び培養条件によって菌体増殖や目的生産物の収率が大きく影響を受けることが知られている。そこで、前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用い、ＭＥＬ生産用培地における酵母エキス、コーンスティープリカー、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム、及び無機窒素源の濃度を変えると共に、ｐＨ、溶存酸素濃度及び温度の培養条件を変えてＭＥＬの生産に与える影響を調べて、ＭＥＬの生産における最適な培地組成及び培養条件を求めた。
【００１２】
また、従来の回分培養では、前培養液を培養槽に接種することにより培養を行ってきた。通常、前培養液は培地に対して１０容量％程度接種するが、前培養液中の菌体濃度は高くないために培養開始時の菌体濃度はあまり高くない。このため、ＭＥＬの生産が開始するまでに１日程度の時間を要している。この期間を誘導期と呼んでいるが、この誘導期を短縮することにより、よりＭＥＬ生産に要する培養時間を短縮することができると考えられる。誘導期を短縮するためには、培養開始時の菌体濃度を高くすることが有効である。初発の菌体濃度を高くする手法の１つに繰り返し回分培養があり、この手法は、初発の菌体濃度を高くできること以外にも、前培養が不要、培養槽の洗浄が不要などの利点を有している。
繰り返し回分培養では、前記回分培養と同様の方法で培養を開始し、任意の時間培養を行ってＭＥＬを生産した後に菌体を含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して予め滅菌しておいた新たな培地（油脂を含む）を所定量だけ無菌的に加えて、次の回分培養を開始する。以後、このような操作を繰り返すことによりＭＥＬ生産に要する培養期間を短縮できる。
【００１３】
また、マンノシルエリスリトールリピッドは、後述する構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４への水素原子及びアセチル基の結合の数と位置により４種類の物質が報告されている。アセチル基は親油基であり水への溶解度を低下させるため、アセチル基が結合していないマンノシルエリスリトールが望まれている。しかしながら、現在までその存在は知られていたが、生産量は微量であった。ここで、本発明者らは更に、回分培養或いは繰り返し回分培養を行った後の培養液を、最適の温度下に保存することにより、後述する構造式（１）においてＲ１〜Ｒ４にアセチル基が結合していないＭＥＬ（後述する構造式（２）で示されるＭＥＬ）を製造できることを知見した。
【００１４】
従って、前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用いてマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産用培地のｐＨ等を制御し、最適な培地組成及び培養条件を設定して回分培養及び繰り返し回分培養を実施することにより、ＭＥＬ生産に要する培養期間を短縮できることと共に、後述する構造式（１）においてＲ１〜Ｒ４にアセチル基が結合しないマンノシルエリスリトールリピッド（後述する構造式（２）で示されるマンノシルエリスリトールリピッド）を生産できることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１５】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、下記の通りである。即ち、
＜１＞ 栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜２＞ マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）である前記＜１＞に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜３＞ 培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御して培養を行う前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜４＞ 培養液のｐＨ制御をアンモニアを用いて行う前記＜３＞に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜５＞ 培養液の溶存酸素濃度を１〜５ｐｐｍの範囲に制御して培養を行う前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜６＞ 培養液中にコーンスティープリカーを０．１〜４ｇ／Ｌ含有させて培養を行う前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜７＞ 炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜８＞ 炭素源として炭素数６〜２４の脂肪酸を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜９＞ 炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１０＞ 炭素源として炭水化物を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１１＞ 炭素源として食品廃油を用いる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１２＞ 炭素源濃度が１０〜３２質量％の範囲で培養を行う前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１３＞ マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物におけるマンノシルエリスリトールリピッドを生産する上での培地組成及び培養条件が、下記の通りである前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー：０．１〜４ｇ／Ｌ
硝酸アンモニウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
炭素源：１００〜３２０ｇ／Ｌ
培養液ｐＨ：５．０〜５．８
溶存酸素濃度：１〜５ｐｐｍ
培養温度：２６〜３２℃
＜１４＞ 炭素源濃度が１０〜３０質量％の範囲で培養を開始し、該培養開始後２〜６日間の培養終了時に菌体とマンノシルエリスリトールリピッドを含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して新たな培地を加えて、次の回分培養を開始し、該操作を繰り返して培養を行う前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
＜１５＞ 更に、培養終了後の培養液を２０〜７０℃に保持する工程を含み、下記構造式（２）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを得る前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
【化２】
ただし、前記構造式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、又は炭素原子数１〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す（ただし、アセチル基を除く）。
＜１６＞ マンノシルエリスリトールリピッドの生産量が、７質量％以上（７０ｇ／Ｌ以上）である前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する新たな微生物を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、製造に要する期間を短縮し、より安価にマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を製造することができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法）
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法であって、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする。
【００１８】
＜マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物＞
前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物としては、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）を使用する。前記シュードジーマ ツクバエンシスとしては、使用する菌株に特に制限はなく、例えば、ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）、ＮＢＲＣ１９４０、ＡＴＣＣ２４５５５、ＣＢＳ６３８９などが挙げられるが、これらの中でも、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）が、ＭＥＬの生産速度が高い点で、特に好ましい。
【００１９】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株は、本発明者らにより単離された新規酵母であり、国内寄託機関である独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２００８年３月１７日に寄託（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）されている。なお、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株がマンノシルエリスリトールリピッドの生産菌として優れた特徴を有していることは、従来には全く知られておらず、このことは、本発明者の新知見にかかるものである。
【００２０】
以下、前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株について説明する。
【００２１】
（ａ）各培地における生育状態
ｉ．コロニー観察
ＹＭ寒天培地上で２５℃下、７日間の培養において、形成したコロニーは次のような形状を示した。
周縁の形状はほぼ全縁、隆起状態はクッション状、表面の状態は平滑、光沢及び性状は弱い光沢と湿性、色調は桃色味から黄色味を帯びたクリーム色
ｉｉ．顕微鏡観察
ＹＭ寒天培地上で２５℃下、７日間の培養において，栄養細胞は長楕円形であり、極出芽により増殖する。培養開始後３週間後において有性生殖器官の形成は認められない。
（ｂ）生理性状試験
１）生育できる範囲
ｐＨ２〜７、温度１０〜３７℃
２）糖類醗酵試験
グルコースを醗酵しなかった。
３）炭素源資化性試験
【表１】
４）窒素源資化性試験
【表２】
５）ビタミンの要求性無し。
６）デンプン類似物質の生成無し。
（ｃ）２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析
抽出からサイクルシークエンスまでの操作は、各プロトコールに基づいて行った。
１）ＤＮＡ抽出：ＤＮＡｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
２）ＰＣＲ：ｐｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）
３）サイクルシークエンス：ＧｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
４）使用プライマー：ＮＬ１，ＮＬ２，ＮＬ３及びＮＬ４（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３）
５）シークエンス：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
６）配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．，Ｔｅｗａｎｔｉｎ，ＡＵＳ）
７）相同性検索及び簡易分子系統解析：
ソフトウエア アポロン ２．０
データベース アポロン ＤＢ−ＦＵ １．０
国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）
以上の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析、簡易形態観察、及び生理・生化学的性状試験の結果より、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）に帰属すると推定した。
【００２２】
＜培養＞
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株の培養には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができ、酵母に対して一般に用いられる培地、例えば、ＹＰＤ培地（例えば、イーストイクストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇの組成）を使用することができる。また、最適生育ｐＨは５．２であり、生育可能なｐＨ範囲は２〜７である。最適生育温度は３０℃であり、生育可能な温度範囲は１０〜３６℃である。なお、ＭＥＬの生産性を高めるためには、単にシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株が生育できるだけでは十分ではなく、培地組成及び培養条件を最適化する必要があり、これら最適条件については後述する。
【００２３】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を培養するための炭素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、トリグリセリド、脂肪族炭化水素、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。
【００２４】
前記トリグリセリドとしては、特に制限はなく、植物油脂、動物油脂等が挙げられ、目的に応じて適宜選定することができる。前記植物油脂としては、大豆油、亜麻仁油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、亜麻仁油、大豆油、菜種油が好ましい。前記動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。前記トリグリセリドとしては、炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドが好ましい。なお、植物油脂、動物油脂等としては、てんぷら等を製造した後の食品廃油等も利用可能である。
【００２５】
前記脂肪族炭化水素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。前記炭化水素の炭素数は６〜２４の範囲であることが好ましく、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ドデカン、ヘキサデカン、オクタデカンといった飽和炭化水素、或いは１−ペンタデセン（Ｃ１５Ｈ３０）、１−ヘプタデセン（Ｃ１７Ｈ３４）等の不飽和炭化水素及びその混合物であって、より好ましくは炭素数１４〜２０の飽和或いは不飽和炭化水素及びその混合物、さらに好ましくはオクタデカンを主成分とする混合物を用いることができる。また、前記脂肪族炭化水素としては、直鎖の脂肪族炭化水素が好ましい。
【００２６】
前記脂肪酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。前記脂肪酸の炭素数は６〜２４の範囲であることが好ましく、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸といった飽和脂肪酸、或いはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸及びその混合物であって、より好ましくは炭素数１４〜２０の飽和或いは不飽和脂肪酸及びその混合物、さらに好ましくはリノール酸及びリノール酸を主成分とする混合物を用いることができる。
【００２７】
前記炭水化物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖とその誘導体、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖及びその混合物であって、好ましくは単糖、さらに好ましくはグルコースである。
【００２８】
中でも、前記炭素源としては植物油脂が好ましく、亜麻仁油、大豆油、菜種油が特に好ましい。前記炭素源の含有量は、培地中、１０〜３２質量％が好ましく、１４〜３０質量％が特に好ましい。
【００２９】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を培養するための栄養素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、ポリペプトン、コーンスティープリカー、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安、リン酸２水素カリウム、リン酸１水素カリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられ、酵母エキス、コーンスティープリカー、硝酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウムなどが好ましい。
【００３０】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を培養するための無機窒素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安等が挙げられ、これらの中でも、硝酸アンモニウム、尿素が好ましい。
【００３１】
前記シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成及び培養条件としては、以下の通りである。酵母エキスは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい。コーンスティープリカーは、０．１〜４ｇ／Ｌが好ましく、２ｇ／Ｌが特に好ましい。硝酸アンモニウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。リン酸２水素カリウムは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。硫酸マグネシウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。植物油脂等の炭素源は、１００〜３２０ｇ／Ｌが好ましく、１４０〜３００ｇ／Ｌが特に好ましい。溶存酸素濃度は、１〜５ｐｐｍが好ましく、３〜５ｐｐｍが特に好ましい。培養温度は、２６〜３２℃が好ましく、３０℃が特に好ましい。ｐＨは、５．０〜５．８が好ましく、５．２が特に好ましい。なお、培養液のｐＨ調整は、菌体の栄養素となり得るアンモニアを用いて行うことが好ましい。
【００３２】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管にシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行う。更に、これを所定量の油脂と酵母エキス１ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始する。なお、ｐＨは、ｐＨメーターで測定できる。溶存酸素濃度は、溶存酸素濃度メーターで測定できる。
【００３３】
−回分培養−
回分培養では、培養途中で油脂などの炭素源の供給は行わないで、１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定する。ＭＥＬ、トリグリセリド、ジグリセリド、炭化水素、及び脂肪酸については、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、所定の方法により各成分を定量分析する。
【００３４】
ここで、前記回分培養においては、培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御し、培養液中に無機窒素源を含有させ、該無機窒素源が、硝酸アンモニウム及び尿素のいずれかであることが好ましい。この場合、初発炭素源濃度が１０〜３２質量％の範囲で培養を行うことが好ましく、１０〜３０質量％の範囲で培養を行うことがより好ましい。
【００３５】
−繰り返し回分培養−
前記回分培養では、前培養液を培養槽に接種することにより培養を行う。通常、前培養は培地に対して１０容量％程度接種するが、前培養液中の菌体濃度は高くないために培養開始時の菌体濃度はあまり高くない。このため、ＭＥＬの生産が開始するまでに１日程度の時間を要する。この期間を誘導期と呼んでいるが，この誘導期を短縮することにより，より短時間でＭＥＬを生産することができると考えられる。誘導期を短縮するためには，培養開始時の菌体濃度を高くすることが有効である。初発の菌体濃度を高くする手法の１つに繰り返し回分培養があり、この手法は，初発の菌体濃度を高くできること以外に、前培養が不要、培養槽の洗浄が不要などの利点を有している。
【００３６】
繰り返し回分培養では、前記回分培養と同様の方法で培養を開始し、任意の時間培養を行ってＭＥＬを生産した後に菌体を含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して予め滅菌しておいた新たな培地（油脂を含む）を所定量だけ無菌的に加えて，次の回分培養を開始する。以後、このような操作を繰り返す。
【００３７】
ここで、前記繰り返し回分培養においては、培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御し、培養液中に無機窒素源を含有させ、該無機窒素源が、硝酸アンモニウム及び尿素のいずれかであることが好ましい。この場合、初発炭素源濃度が１０〜３６質量％の範囲で培養を行うことが好ましく、１４〜３０質量％の範囲で培養を行うことがより好ましい。培養時間は２〜６日間が好ましい。また、該培養槽内に残す培養液量を培養液全体の６〜３５容量％として、次の回分培養を開始することが好ましい。
【００３８】
＜マンノシルエリスリトールリピッド＞
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法により得られるマンノシルエリスリトールリピッドは、下記構造式（１）で表される化合物である。
【００３９】
【化３】
【００４０】
前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜２０、好ましくは３〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す。
【００４１】
−Ｒ１〜Ｒ４にアセチル基が結合していないマンノシルエリスリトールリピッドの製造−
マンノシルエリスリトールリピッドは、前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４への水素原子及びアセチル基の結合の数と位置により４種類の物質が報告されている。ここで、アセチル基は親油基であり水への溶解度を低下させるため、中でも、アセチル基の無いマンノシルエリスリトールリピッドが望まれている。
このアセチル基の無いマンノシルエリスリトールリピッドは、下記構造式（２）で示される。（前記構造式（１）と前記構造式（２）とでは、Ｒ１〜Ｒ４の種類が異なる。）
【化４】
前記構造式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、又は炭素原子数１〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す（ただし、アセチル基を除く）。
【００４２】
しかしながら、前記構造式（２）で表されるアセチル基の無いＭＥＬは、現在までその存在は知られていたが、生産量は微量であった。
そこで、本発明者らは更に、前記のように回分培養或いは繰り返し回分培養を行った後のＭＥＬ含有培養液を、任意の温度下に保存することにより、前記構造式（１）においてＲ１〜Ｒ４にアセチル基が結合していないＭＥＬ（前記構造式（２）で示されるＭＥＬ）を製造できることを見出した。方法は以下の通りである。
【００４３】
培養を行った後のＭＥＬ含有培養液を１０〜７０℃の温度の恒温槽に入れて保温する。一定期間毎に等容積量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、ＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認する。ここで、ＭＥＬ含有培養液の保存温度は、２０〜７０℃が好ましく、３０〜５０℃が特に好ましい。保存時間は、２〜３０日が好ましく、３〜２０日が特に好ましい。
【００４４】
一定温度で保存したＭＥＬ含有培養液に等容量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去し、脂質成分を回収する。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：酢酸エチル溶液（４：１）、アセトン、メタノールの順で溶出させる。各溶液をＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認する。アセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去してアセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分を得た。得られたＭＥＬ成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離する。
【００４５】
マンノース残基上のアシル基の結合位置の同定は、過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲによる解析で行うことができる。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖のＨ−２〜Ｈ−６のプロトンは３．５ｐｐｍ付近にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本ＭＥＬにおいても脂肪酸の結合によると考えられる低磁場シフトした２つのプロトンシグナルが観測されたことから、このＭＥＬは、２分子のアシル基が結合していると同定できる。さらに、２分子の−ＣＯＣＨ２−の存在を示すシグナルが観測されたが、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）の存在を示すシグナルは観測されなかったことより、マンノースに結合しているアシル基は、２つの脂肪酸であると同定できる。
【００４６】
以上説明したような、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法によれば、前記マンノシルエリスリトールリピッドを、好ましくは７質量％以上（７０ｇ／Ｌ以上）、より好ましくは２０質量％以上（２００ｇ／Ｌ以上）、更に好ましくは２０〜４０質量％（２００〜４００ｇ／Ｌ）の高濃度に、短期間で製造することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明について更に詳細に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１：マンノシルエリスリトールリピッド生産微生物株の選択）
本実施例１では、マンノシルエリスリトールリピッドを短時間で効率的に生産できる微生物株を選択した。
【００４９】
糖脂質生産量の高い微生物８菌株（ＴＭ−１７９、ＴＭ−１８０、ＴＭ−１８１、ＴＭ−１８２、ＴＭ−１８３、ＴＭ−１８４、ＴＭ−１８５、ＴＭ−１８６）について、以下のように培養を行った。なお、前記各菌株は、特開２００５−１０４８３７号の段落番号〔００２３〕、〔００４９〕等に記載の方法に従い、本発明者らにより自然界から分離されたものである。グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地（以下、前培養用培地と略する）４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日振とう間培養を行った。更に、これを１８質量％の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。なお、ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４質量％のアンモニアを供給することにより５．４に保持した。１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、経時的に培養液中の各成分を測定した。各菌株におけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を、参考菌株としてのクルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２６）の結果と共に表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
菌株によりＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間に違いがあった。ＴＭ−１７９、ＴＭ−１８１、ＴＭ−１８２、ＴＭ−１８３は、いずれも１３０ｇ／Ｌ以上のＭＥＬを生産したが、最も培養に要する期間が短かったのはＴＭ−１８１であった。
【００５２】
ＴＭ−１８１株は、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２６）に比較してＭＥＬ生産量は７ｇ／Ｌ低い値であったが、生産に要する時間は１４４時間であり、９６時間（４日）生産に要する時間を短縮できた。
【００５３】
このＴＭ−１８１株は、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析、簡易形態観察、及び生理・生化学的性状試験等の結果から、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）に帰属すると推定され（詳細は前記の通り）、本発明者らにより、国内寄託機関である独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２００８年３月１７日に寄託（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）された。
本実施例１における結果から、以降の実施例については、マンノシルエリスリトールリピッド生産微生物株として、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用いることとした。
【００５４】
（実施例２：培地成分の最適濃度の決定）
本実施例２では、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）におけるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高めるための培地成分の最適濃度を決定した。
【００５５】
培地成分の酵母エキス、コーンスティープリカー、硝酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、及び硫酸マグネシウムの各培地成分の最適濃度を決定するため、各成分について６〜８段階に濃度を変えて以下のように回分培養を行った。前培養用培地の４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを１８質量％の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成を基準として、酵母エキス（０〜４ｇ／Ｌ）、コーンスティープリカー（０〜６ｇ／Ｌ）、硝酸アンモニウム（０〜４ｇ／Ｌ）、リン酸２水素カリウム（０〜４ｇ／Ｌ）、及び硫酸マグネシウム（０〜４ｇ／Ｌ）の濃度を６〜８段階に変えた液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。なお、ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４質量％のアンモニアを供給することにより、５．４に保持した。１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、経時的に培養液中の各成分を測定した。
その結果、酵母エキス１ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌが最適濃度であった。
【００５６】
（実施例３：ｐＨ、溶存酸素濃度、培養温度の最適条件の決定）
本実施例３では、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）におけるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高めるためのｐＨ、溶存酸素濃度、培養温度の最適条件を決定した。
【００５７】
ｐＨ、溶存酸素濃度、培養温度の最適条件を決定するため、これらの３つの条件について３〜７段階に変えて回分培養を行った。なお、培養液のｐＨは、ｐＨメーターにより測定し、アンモニアを滴下することにより所定のｐＨに制御した。溶存酸素濃度は、溶存酸素濃度メーターにより測定し、回転数を自動的に制御することにより所定の溶存酸素濃度に制御した。その結果、ｐＨ５．２、溶存酸素濃度３〜５ｐｐｍ、培養温度３０℃が最適条件であった。これらのうち、ｐＨ、及び、溶存酸素濃度の最適条件の決定方法の詳細を以下に示す。
【００５８】
−基本培養条件−
前培養用培地４ｍＬが入った試験管にシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを所定量の植物油脂（亜麻仁油あるいは大豆油）と酵母エキス１ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌの組成の液体培地（以下、本培養用培地と略する）１．４Ｌ（回分培養）及び４．６Ｌ（繰り返し回分培養）が入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分（回分培養）及び５Ｌ／分（繰り返し回分培養）の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。
【００５９】
−回分培養−
回分培養では、培養途中において植物油脂（亜麻仁油あるいは大豆油）の供給を行わないで、１日に１乃至２回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定した。ＭＥＬ、トリグリセリド、ジグリセリド、及び脂肪酸は、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後、静置し、上清の酢酸エチル層を回収した。この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして所定の方法により各成分を定量分析した。
【００６０】
−培養液のｐＨ選定−
次に、ＭＥＬ生産に及ぼす培養液のｐＨの影響を調べるため、初発油脂濃度を１８質量％として、ｐＨコントローラーを用いて培養期間中のｐＨ５．０〜５．８の間で一定の値に保持して培養を行った。なお、ｐＨを調整するために用いるアルカリ溶液としては、菌体の栄養素となり得るアンモニア（１４質量％アンモニア溶液）を使用した。
各ｐＨにおけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を表４に示す。ｐＨが５．０〜５．８、特にｐＨ５．２に制御して培養することがＭＥＬの生産効率を高める上で効果的であることが認められた。
【００６１】
【表４】
【００６２】
−培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ）の選定−
次に、ＭＥＬ生産に及ぼす培養液の溶存酸素濃度の影響を調べるため、初発油脂濃度を２０質量％としてＤＯを１、３、５ｐｐｍに制御して培養を行った。この時、溶存酸素濃度は溶存酸素濃度メーターにより測定し、回転数を自動的に制御することにより所定の溶存酸素濃度に制御した。各溶存酸素濃度におけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を表５に示す。ＤＯを３〜５に制御して培養することがＭＥＬの生産効率を高める上で効果的であることが認められた。
【００６３】
【表５】
【００６４】
（実施例４：最適油脂濃度の決定）
上記実施例３のようにして設定した基本培養条件において、初発油脂濃度を表６に示すように変化させて、ＭＥＬ生産に与える初発油脂濃度の影響を検討した。ＭＥＬの効率生産を考慮すると、更なる高濃度化が望まれる。このためには、初発の油脂濃度を増加させる必要がある。そこで、油脂濃度を１０から３６質量％まで変化させて培養を行った。各培養におけるＭＥＬ生産量とこの濃度に達するために要した培養時間を表６に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
初発油脂濃度の増加により、ＭＥＬ生産量は増加し、３０質量％で２２０ｇ／ＬのＭＥＬを１２６時間で生産した。３４質量％以上では生産量は急激に低下した。現在、ＭＥＬ生産量は、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１を用いた流加回分培養法による３０７ｇ／Ｌが最も高い。シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株での回分培養では２２１ｇ／Ｌが最高値であるが、流加回分培養法を用いることにより、さらに高濃度のＭＥＬをより短時間で生産できると考えられる。
【００６７】
なお、参考として、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株は、初発油脂濃度２０質量％とした場合に２４０時間で１５３ｇ／ＬのＭＥＬを生産し、油脂濃度をこれ以上に増加させてもＭＥＬ生産量は増加しなかった。シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株は、クルツマノマイセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．Ｉ−１１株よりも６９ｇ／Ｌ高いＭＥＬ生産量で１１４時間短い時間で生産できた。
【００６８】
（実施例５：繰り返し回分培養）
前培養用培地４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを１８質量％の亜麻仁油と本培養用培地４．６Ｌが入ったジャーファメンターに４本（合計０．４Ｌ）接種して、３０℃で５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。なお、ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４質量％のアンモニアを供給することにより５．２に保持して、１回目の回分培養を９６時間行った。植物油脂（亜麻仁油）は、菌体が分泌したリパーゼにより急速に脂肪酸とグリセロールに分解された。生成した中間代謝物である脂肪酸は、細胞内に取り込まれて代謝され、菌体とＭＥＬが生産された。
２回目の回分培養は、攪拌羽根の回転を停止させ、４．３Ｌの培養液を試料採取管を通じてジャーファメンターから引き抜き、０．７Ｌをジャーファメンター内に残した。直ちに、予め滅菌しておいた１８質量％の亜麻仁油を含む本培養用培地４．３Ｌを接種口からジャーファメンターに無菌的に流し込み、回転羽根を８００ｒｐｍの攪拌速度で培養を開始した。ｐＨは、ｐＨコントローラーを用いて１４量％のアンモニアを供給することにより５．２に保持した。
３回目以降の回分培養は、上記のような操作を繰り返し、培養時間を次第に短くして、計１０回の回分培養を繰り返した。この時、各回分培養での残存培養液量は表７に示すように０．３〜１．７５Ｌの範囲で変化させると共に引き抜いた培養液と同量の滅菌した新たな培地を加えた。また、１日に２乃至３回培養液を無菌的に採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収し、この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして、経時的に培養液中の各成分を測定した。
表７に示したように、１０回の培養何れも原料の油脂を完全に分解し、生成した脂肪酸をほぼ消費して約１３０ｇ／ＬのＭＥＬを安定に生産でき、菌株の生産能力の低下はなかった。また、培養液を随時顕微鏡で観察した結果、バクテリアなどの雑菌は観察されず、雑菌汚染もなかった。これらのことより、さらに長期間の培養も可能であると考えられた。
【００６９】
【表７】
【００７０】
１回目の回分培養では、ＭＥＬを開始するまでに要する時間（誘導時間）に１８時間を要した。２回目以降は、誘導時間は短縮された。このように誘導時間が短縮されたのは、１回目の培養では振とうフラスコからの培養液を接種したために培養槽中の初発の菌体が低濃度であるのに対して、２回目以降では新たな回分培養開始時の菌体濃度が高くなっているためである。新たな回分培養開始時のＭＥＬ及び菌体濃度は、残液率に影響される。また、ＭＥＬ生産を開始した後、何れの培養においてもＭＥＬ濃度はほぼ直線的に増加した。その後、ＭＥＬ濃度は最高生産量に達する前からその増加の程度は次第に低下していった。なお、ＭＥＬ生産速度は、培養の経時変化よりＭＥＬがほぼ直線的に増加する部分の傾きから最小自乗法により計算した。初発のＭＥＬ濃度が高い（＝残存培養液の量が多い）と最高生産量に達するまでの時間が短くなり、２回目以降は、何れも７２時間（３日）で１３０ｇ／Ｌに達した。なかでも、１０回目の培養（残液率：０．３５）では６０時間（２．５日）で１３０ｇ／Ｌに達した。これは、残液率を高くすることにより培養槽内の菌体濃度を高くできたことによるものと考えられる。また、リパーゼとＭＥＬが培養の最初から相当量存在するために油脂の分解が促進され、脂肪酸の細胞への取り込みが促進されたと考えられる。
【００７１】
（実施例６：構造式（１）においてＲ１からＲ４にアセチル基が結合しないマンノシルエリスリトールリピッド（＝構造式（２）で示されるマンノシルエリスリトールリピッド）の製造方法）
前培養用培地４ｍＬが入った試験管に当該菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間振とう培養を行った。更に、これを１８質量％の亜麻仁油と本培養用培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。培養期間中、ｐＨコントローラーを用いてｐＨを５．２に保持しつつ４日間培養を行い、ＭＥＬ含有培養液を作製した。ＭＥＬ含有培養液が２０〜７０℃となるように、温度計で測定しながら恒温槽に入れて保温した。一定期間毎に試料を採取して等容積量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、ＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開した。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認した。結果を図１に示す。
【００７２】
図１は、培養液を７日間所定の温度で保存したものである。レーン番号の１は保存開始前、２は３０℃、３は２０℃、４は４０℃、５は５０℃、６は６０℃、７は７０℃で保存した。図中、スポットが大きいものほどＭＥＬの存在量が多い。保存開始前は、アセチル基が１つ結合したＭＥＬのみであったが、７日間の保存後、アセチル基が１つ結合したＭＥＬ（図１中、上のスポット）は減少し、アセチル基が無いと推定されるＭＥＬのスポット（図１中、下のスポット）が大きくなった。レーン３の２０℃ではアセチル基が１つ結合したＭＥＬの方がスポット（上のスポット）は大きいが、レーン２、４、５の３０〜５０℃では、アセチル基が１つ結合したＭＥＬのスポットはほとんど無く、ほぼ全てがアセチル基が無いと推定されるＭＥＬのスポット（下のスポット）となった。レーン６と７の６０と７０℃では両方のスポットが小さくなった。このような結果から、ＭＥＬ含有培養液の保存温度は、２０〜７０℃が好ましく、特に３０〜５０℃が好ましいことがわかる。
【００７３】
＜糖脂質の単離＞
一定温度で保存したＭＥＬ含有培養液に等容量の酢酸エチルの酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルをエバポレーターを用いて留去し、脂質成分を回収した。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：酢酸エチル溶液（４：１）、アセトン、メタノールの順で溶出させた。各溶液をＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開した。展開終了後、オルシノール硫酸試薬でＭＥＬの存在を確認した。アセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去してアセチル基が結合していないと思われるＭＥＬ成分を得た。得られたＭＥＬ成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離した。
【００７４】
＜糖脂質の構造決定＞
アシル基の結合位置は、過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲにより解析した。対照としてマンノースに２つのアセチル基と脂肪酸が結合したマンノシルエリスルトールリピッド（ＭＥＬ：４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−４−ｍｅｓｏ−エリスリトール）を用いた。
４．０ｐｐｍより低磁場側のシグナルから、マンノースが確認された。これらのシグナルに加えて、高磁場の領域には、アシル基の特性を示すシグナルが観測されており、それぞれ−ＣＯＣＨ２−基の−ＣＨ２−プロトンシグナルと同定できることから、２分子の脂肪酸が存在していることがわかる。一方、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）のメチルプロトンの存在を示すシグナルは観測されなかったことより、マンノースにアセチル基は結合していないと同定できた。結果を図２に示す。なお、この化合物は慣例的にＭＥＬ−Ｄと呼ばれている。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によると、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物としてシュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドの生産に要する時間を大幅に向上させることができた。更に、本発明では、アセチル基が結合していないマンノシルエリスリトールリピッドの大量生産をも可能とした。本発明により得られるマンノシルエリスリトールリピッドは、例えば、食品工業、医薬品工業、化学工業、環境関連分野などで好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ＭＥＬ含有培養液を７日間所定の温度で保存した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で展開し、存在するＭＥＬの種類を確認した結果を示す図である。（レーン番号の１は保存開始前のＭＥＬ含有培養液、２は３０℃、３は２０℃、４は４０℃、５は５０℃、６は６０℃、７は７０℃で保存した後のＭＥＬ含有培養液を示す。）
【図２】図２は、実施例６に係わるマンノシルエリスリトールリピッドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。＜１Ｈ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属水素，Ｄ２Ｏ）＞マンノシルエリスリトール部：３．３０−４．００（Ｍａｎ−４−Ｈ，５−Ｈ，６−Ｈ２，Ｅｒｙ−１−Ｈ２，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ），４．７７（Ｍａｎ−１−Ｈ），４．９３（Ｍａｎ−３−Ｈ），５．４３（Ｍａｎ−２−Ｈ）；アシル部：０．８６，０．９５（ＣＨ３），１．０５−１．４０，１．９０−２．１０［−（ＣＨ２）ｎ−］，１．６０−１．７０（−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．２７，２．３６（−ＣＯ−ＣＨ２−），５．２３（−ＣＨ＝ＣＨ−）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項２】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）である請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項３】
培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御して培養を行う請求項１から２のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項４】
培養液のｐＨ制御をアンモニアを用いて行う請求項３に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項５】
培養液の溶存酸素濃度を１〜５ｐｐｍの範囲に制御して培養を行う請求項１から４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項６】
培養液中にコーンスティープリカーを０．１〜４ｇ／Ｌ含有させて培養を行う請求項１から５のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項７】
炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項８】
炭素源として炭素数６〜２４の脂肪酸を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項９】
炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１０】
炭素源として炭水化物を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１１】
炭素源として食品廃油を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１２】
炭素源濃度が１０〜３２質量％の範囲で培養を行う請求項１から１１のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１３】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物におけるマンノシルエリスリトールリピッドを生産する上での培地組成及び培養条件が、下記の通りである請求項１から１２のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー：０．１〜４ｇ／Ｌ
硝酸アンモニウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
炭素源：１００〜３２０ｇ／Ｌ
培養液ｐＨ：５．０〜５．８
溶存酸素濃度：１〜５ｐｐｍ
培養温度：２６〜３２℃
【請求項１４】
炭素源濃度が１０〜３６質量％の範囲で培養を開始し、該培養開始後２〜６日間の培養終了時に菌体とマンノシルエリスリトールリピッドを含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して新たな培地を加えて、次の回分培養を開始し、該操作を繰り返して培養を行う請求項１から１３のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１５】
更に、培養終了後の培養液を２０〜７０℃に保持する工程を含み、下記構造式（２）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを得る請求項１から１４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【化１】
ただし、前記構造式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、又は炭素原子数１〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す（ただし、アセチル基を除く）。
【請求項１６】
マンノシルエリスリトールリピッドの生産量が、７質量％以上（７０ｇ／Ｌ以上）である請求項１から１５のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１】
栄養素と炭素源を含む培養液中でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、前記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項２】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードジーマ ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ)ＴＭ−１８１株（ＮＩＴＥ Ｐ−５３０）である請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項３】
培養液のｐＨを５．０〜５．８の範囲に制御して培養を行う請求項１から２のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項４】
培養液のｐＨ制御をアンモニアを用いて行う請求項３に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項５】
培養液の溶存酸素濃度を１〜５ｐｐｍの範囲に制御して培養を行う請求項１から４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項６】
培養液中にコーンスティープリカーを０．１〜４ｇ／Ｌ含有させて培養を行う請求項１から５のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項７】
炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項８】
炭素源として炭素数６〜２４の脂肪酸を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項９】
炭素源として炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１０】
炭素源として炭水化物を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１１】
炭素源として食品廃油を用いる請求項１から６のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１２】
炭素源濃度が１０〜３２質量％の範囲で培養を行う請求項１から１１のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１３】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物におけるマンノシルエリスリトールリピッドを生産する上での培地組成及び培養条件が、下記の通りである請求項１から１２のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
コーンスティープリカー：０．１〜４ｇ／Ｌ
硝酸アンモニウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
炭素源：１００〜３２０ｇ／Ｌ
培養液ｐＨ：５．０〜５．８
溶存酸素濃度：１〜５ｐｐｍ
培養温度：２６〜３２℃
【請求項１４】
炭素源濃度が１０〜３６質量％の範囲で培養を開始し、該培養開始後２〜６日間の培養終了時に菌体とマンノシルエリスリトールリピッドを含む培養液の大部分を培養槽外に排出し、一部を培養槽に残して新たな培地を加えて、次の回分培養を開始し、該操作を繰り返して培養を行う請求項１から１３のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項１５】
更に、培養終了後の培養液を２０〜７０℃に保持する工程を含み、下記構造式（２）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを得る請求項１から１４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【化１】
ただし、前記構造式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、又は炭素原子数１〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族アシル基を表す（ただし、アセチル基を除く）。
【請求項１６】
マンノシルエリスリトールリピッドの生産量が、７質量％以上（７０ｇ／Ｌ以上）である請求項１から１５のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２９６９０８（Ｐ２００９−２９６９０８Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５２６９０（Ｐ２００８−１５２６９０）
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【出願人】（５９１０７９４８７）広島県 (101)
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【出願人】（５９１０７９４８７）広島県 (101)
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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