ラクトフェリン・ポリペプチド及びその製造方法
【課題】各種炎症性サイトカイン産生誘導活性、各種ケモカイン産生誘導活性、ＮＦκＢの発現増強を有する小分子ラクトフェリン及びペプチド並びにその製造方法を提供する。
【解決手段】ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られた、各種炎症性サイトカイン産生誘導活性、各種ケモカイン産生誘導活性を有し、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満の小分子ラクトフェリン、及び製造方法。
【解決手段】ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られた、各種炎症性サイトカイン産生誘導活性、各種ケモカイン産生誘導活性を有し、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満の小分子ラクトフェリン、及び製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリン分子中に含まれる、炎症性サイトカインの産生誘導能、ケモカインの産生誘導能などの炎症誘起作用を有する新規ペプチドに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリンは多機能性の糖タンパクで、各種疾患において乳汁、唾液、涙、糞便、尿や血液などの体液中に増加する。また、抗菌作用、抗ウイルス作用、リンパ球の活性化作用、抗腫瘍作用鉄結合性など、生体にとって有益な作用が数多く報告されている（非特許文献１：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５．１５．９３−１１０．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１９９６．４０．２５７−２６２．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２００１．５７．２４０−２４９．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２００２．６４．８７３−８７８．）。そのため、ラクトフェリンを各種疾患に応用する研究が多く成されている。
【０００３】
一方、細菌性疾患で増加するラクトフェリンは、細菌の産生する酵素などにより切断されその作用は失活するものと考えられている（非特許文献２：ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９６．１４５．２０９−２１４．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８．９５．，１２６４１−１２６４６．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３．４７．６０７−６１７．）。
【０００４】
そのため、感染菌による炎症像がラクトフェリンの存在にもかかわらず悪化すると考えられている。また、ウシの細菌性疾患であるウシ乳房炎において、乳汁中に催炎作用を示す「炎症性ラクトフェリン」という分子量３０〜６０ｋＤａのラクトフェリン蛋白群が増加し、炎症を増悪することが報告されている（特許文献１：特開２００３−２８９７４９号公報）。しかしながら、この炎症性ラクトフェリン蛋白群においては、催炎作用を示す詳細な部位も構造も明らかとされておらず、その性状と生理的な作用意義には不明の点が多い。
【０００５】
一方、特許文献２（特開２００４−００２４７１号公報）には、次のペプチドが記載されている。
「Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ」のアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
また、特許文献２には、ウシ・ラクトフェリンを、プロテアーゼにより酵素分解し、酵素分解物から上記ペプチドを採取する技術が記載されている。
【０００６】
炎症性疾患において体液中に増加するタンパクとして、セリンプロテアーゼの一種である、白血球の産生するエラスターゼがある（Ｃｌｉｎｉｃａ．Ｃｈｅｍｉｃａ．Ａｃｔａ．１９９５．２３９．９１−１０１．）。
エラスターゼは、炎症時には補体成分やグロブリンを分解することが知られている（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７９．９４．７５−８３．，Ｅｌａｓｔａｓｅ．（Ｒ．Ｐ．Ｍｅｃｈａｍ，ｅｄ）１９８６．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｓｓ，２１７−３２０．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７．１６．３３９０−３３９６．）。
しかしながら、このエラスターゼとラクトフェリンの関与を報告した事例はない。また、細菌性疾患で、細菌の産生する酵素により分解されるラクトフェリンについても、その生理作用は報告されていない。
【０００７】
特許文献２記載のペプチドは、免疫賦活剤であり、炎症誘起活性を有するものではない。
本発明では、炎症性疾患で増加するエラスターゼに着目し、ラクトフェリンが分解されることを明らかとし、分解されたラクトフェリン中に各種炎症性サイトカインやケモカインの産生誘導活性を有するポリペプチドを分離できるようにしたものである。
また、このポリペプチドより、ヒトのラクトフェリンに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成し、この様な炎症誘起活性を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドを見出した。本発明はこの新知見に基づき発明したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２８９７４９号公報
【特許文献２】特開２００４−００２４７１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５．１５．９３−１１０．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１９９６．４０．２５７−２６２．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２００１．５７．２４０−２４９．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２００２．６４．８７３−８７８
【非特許文献２】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．１９９６．１４５．２０９−２１４．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８．９５．，１２６４１−１２６４６．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３．４７．６０７−６１７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、各種炎症性サイトカイン産生誘導活性、各種ケモカイン産生誘導活性、ＮＦκＢの発現増強を有する小分子ラクトフェリン及びペプチド並びにその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のラクトフェリンは、ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られたフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満の小分子ラクトフェリンであることを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
【００１２】
本発明のペプチドは、ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られるフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のペプチドであることを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
前記ペプチドは合成ペプチドであることを特徴とする。
【００１３】
本発明のペプチドは、ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００１４】
本発明の各種炎症性サイトカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明の各種ケモカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明のＮＦκＢの発現増強物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
【００１５】
本発明のラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法は、ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをエラスターゼにより分解後精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のラクトフェリン・ポリペプチドを採取することを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
【００１６】
本発明の合成ペプチドを作成する製造法は、ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをプロテアーゼにより分解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法、ゲルろ過法、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）アフィニティークロマトグラフィー法、ラクトフェリン抗体結合アフィニティークロマトグラフィー法により精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含むラクトフェリン・ポリペプチドを単離し、アミノ酸シークエンサーにより確定し、合成ペプチドを作成することを特徴とする。
【００１７】
本発明は、炎症性疾患（歯周病）を罹患したヒトの唾液を、５０％飽和硫酸アンモニュウム沈殿法により濃縮後、トリス−塩酸緩衝液で脱塩後、ヒト・ラクトフェリン抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）ＣＮＢ ｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりラクトフェリンを精製した。
【００１８】
さらに、ヒト・ラクトフェリン（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）をセリンプロテアーゼの一種である、エラスターゼ（ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）により３７℃で１時間処理し、その後、エラスターゼ阻害剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ−ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）により反応を停止した。
そして、炎症性疾患の検体から得られたラクトフェリンと、エラスターゼ処理したラクトフェリンを、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）二次元免疫電気泳動法によりその泳動像を観察した。
【００１９】
さらに、炎症性疾患検体とエラスターゼ処理ヒト・ラクトフェリンは１５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により詠動した。
泳動後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に転写し、各検体に共通して認められたバンドを切り出した後、Ｎ−末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）により解析した。
そして、各ラクトフェリン・ポリペプチドを作成し、サイトカインならびにケモカインの産生誘導能を各種細胞により解析し、炎症誘起活性を有するペプチドを確定した。
【００２０】
なお、特許文献２に記載されているペプチドのアミノ酸配列は、本願発明に係るペプチドのアミノ酸配列とは異なる。
本願発明におけるアミノ酸配列は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（略記号：ＦＫＤ）を含むペプチドである。また、Ｎ−アミノ酸配列の位置もＣ末領域に近い部分に位置している。
【００２１】
さらに、ＦＫＤは、ヒト・ラクトフェリンでは２箇所、ウシ・ラクトフェリンでは一箇所しか存在しない。
そのため、このＦＫＤを含むラクトフェリン・ポリペプチドが炎症誘起作用を示すものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によると、アミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している新規ラクトフェリン・ポリペプチドは催炎作用を有する物質であり、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド」と呼べる物質であった。そして本発明により、従来のラクトフェリンが持つ有益な生理作用の他に、催炎作用を持つドメインの発見は、ラクトフェリンの有効利用、炎症性疾患ならびに各種感染症など、多くの研究分野の進展に大きく寄与する発明である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】歯周病患者唾液中ラクトフェリンとエラスターゼ処理後のヒト・ラクトフェリンのＳＤＳ ＰＡＧＥならびにＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像。
【図２】エラスターゼ処理後のヒト・ラクトフェリンの分子量とＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像の変化。
【図３】分子量ならびにＮ−末端アミノ酸配列とラクトフェリン分子中の位置。
【図４】作成ヒト・ラクトフェリン・ポリペプチドとの共培養による、炎症性サイトカイン、ケモカインおよびＮＦκＢｐ６５の発現増強効果。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ヒトの炎症性疾患の検体とエラスターゼ処理した検体では、検体中のラクトフェリンの小分子化の起こっていることが確認された。また、この際のＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像でも、両検体はＣｏｎ Ａ親和性の弱い画分の出現することが判明した。第１図に示す。
【００２５】
エラスターゼ濃度を０．００１ｕｎｉｔ〜１．０ｕｎｉｔまで、段階的に変え反応させたところ、エラスターゼの反応濃度の増加に従い、分子量２０ｋＤａ近辺の小分子のラクトフェリンが増加した。さらに、Ｃｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動においてもＣｏｎ Ａ親和性の弱い画分が増加した。この小分子化したラクトフェリンは、ウシ乳房炎乳汁で報告されている、「炎症性ラクトフェリン」蛋白群（分子量３０〜６０ｋＤａ）とは明らかに異なる分子量のものであった。第２図に示す。
【００２６】
ヒトの炎症性疾患の検体と、エラスターゼ処理した検体に共通して認められたラクトフェリン・ドメインは、第１図に示した通りである。この内、ヒトならびにウシで、Ｎ−末端側にあるドメインは既に抗菌活性や、腫瘍細胞に対するアポトーシス活性が報告されているアミノ酸配列を含んでいた。また、ヒトのドメインではＮ−末端アミノ酸配列の中ほどに位置するドメインには、免疫抑制作用を有するミニドメインの一部が含まれていた。これより下流に位置する他の二つのドメインは未報告のものであった。第３図に示す。
【００２７】
これらラクトフェリン・ドメインのうち、既にその作用が報告されているドメインを除外し、エラスターゼ処理したヒト・ラクトフェリンと炎症性疾患分泌液中のラクトフェリンに共通して認められた、分子量２０〜２５ｋＤａの主たる二つのラクトフェリン分子は、アミノ酸配列の解析結果から、Ｎ−末領域に位置することが判明した。そして、この二つのドメインからペプチドを作成し、その生理作用について解析した。作成したポリペプチドは表１に示した通りである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
これら作成ポリペプチドは、健康なヒトの抹消血を、ヘパリンナトリウムを用いて採血し、リンフォライトＨ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｃａｎａｄａ）を用いた比重遠心法によりリンパ球を分離し、これを用いて各種サイトカインならびにケモカイン産生誘導能と、細胞内転写因子であるＮＦκＢｐ６５の発現誘導能を解析した。ヒトのサイトカイン（ＩＬ−６とＴＮＦα；Ｔｅｃｈｎｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）、ケモカイン（ＩＬ−８とＭＣＰ−１；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびＮＦκＢ（ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ κ Ｂ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，Ｃｏ．，ＵＳＡ）の測定は酵素抗体法により測定した。
【００３０】
エラスターゼ処理ヒト・ラクトフェリン中から分離し作成したポリペプチドのうち、ＨｕＰｅｐ１．とＨｕＰｅｐ４．で、炎症性サイトカインのＩＬ−６の産生誘導能が確認された。また、これらのポリペプチドでは、炎症時に血液中に増加するＩＬ−８とＭＣＰ−１の産生誘導能や、これらサイトカインやケモカインの産生誘導をつかさどる、細胞内転写因子のＮＦκＢｐ６５の発現増強も確認された。このＨｕｐｅｐ１．ならびにＨｕＰｅｐ４．は、ＦＫＤのアミノ酸配列が共通していた。図４に示す。
【００３１】
本発明において見出された、エラスターゼにより分解された、ヒトのラクトフェリン中に含まれる、ＦＫＤのアミノ酸配列を含む新規ラクトフェリン・ポリペプチドは、ヒトでは２箇所あった。そして、この新規ラクトフェリン・ポリペプチドは、細胞内の転写因子であるＮＦκＢの発現を増強し、細胞障害作用などを示すサイトカインや、白血球の遊走化活性を示すケモカインの産生を誘導し、炎症を引き起こす物質であった。さらに、ＮＦκＢは一酸化窒素（ＮＯ）、アラキドン酸代謝産物や各種酵素などの炎症メディエーターの産生を誘導することが知られている。そのため、本発明で見出された新規ラクトフェリン・ポリペプチド、これら炎症メディエーターの産生誘導能を示すことは容易に想定される、新規のラクトフェリン・ポリペプチドである。また、この新規ポリペプチドは、エラスターゼ以外のプロテアーゼによってラクトフェリン分子が分解され、出現することが可能と考えられる。この、ＦＫＤを含むアミノ酸配列はウシのラクトフェリン中にも一箇所（Ｎ末端より３００番目から３０２番目）あり、ヒトのラクトフェリンで確認されたポリペプチドと近い位置に存在する。また、エラスターゼなどのプロテアーゼにより切断されるアミノ酸も近傍に位置している。そのため、これらプロテアーゼにより分解され得るものと考えられる。すなわち、ヒト以外でも、同様のアミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している、ウシを始めとした動物由来のラクトフェリンからも、同様の炎症誘起作用を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドは分離可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によると、アミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している新規ラクトフェリン・ポリペプチドは催炎作用を有する物質であり、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド」と呼べる物質であった。そして本発明により、従来のラクトフェリンが持つ有益な生理作用の他に、催炎作用を持つドメインの発見は、ラクトフェリンの有効利用、炎症性疾患ならびに各種感染症など、多くの研究分野の進展に大きく寄与する発明である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリン分子中に含まれる、炎症性サイトカインの産生誘導能、ケモカインの産生誘導能などの炎症誘起作用を有する新規ペプチドに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリンは多機能性の糖タンパクで、各種疾患において乳汁、唾液、涙、糞便、尿や血液などの体液中に増加する。また、抗菌作用、抗ウイルス作用、リンパ球の活性化作用、抗腫瘍作用鉄結合性など、生体にとって有益な作用が数多く報告されている（非特許文献１：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５．１５．９３−１１０．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１９９６．４０．２５７−２６２．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２００１．５７．２４０−２４９．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２００２．６４．８７３−８７８．）。そのため、ラクトフェリンを各種疾患に応用する研究が多く成されている。
【０００３】
一方、細菌性疾患で増加するラクトフェリンは、細菌の産生する酵素などにより切断されその作用は失活するものと考えられている（非特許文献２：ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９６．１４５．２０９−２１４．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８．９５．，１２６４１−１２６４６．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３．４７．６０７−６１７．）。
【０００４】
そのため、感染菌による炎症像がラクトフェリンの存在にもかかわらず悪化すると考えられている。また、ウシの細菌性疾患であるウシ乳房炎において、乳汁中に催炎作用を示す「炎症性ラクトフェリン」という分子量３０〜６０ｋＤａのラクトフェリン蛋白群が増加し、炎症を増悪することが報告されている（特許文献１：特開２００３−２８９７４９号公報）。しかしながら、この炎症性ラクトフェリン蛋白群においては、催炎作用を示す詳細な部位も構造も明らかとされておらず、その性状と生理的な作用意義には不明の点が多い。
【０００５】
一方、特許文献２（特開２００４−００２４７１号公報）には、次のペプチドが記載されている。
「Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ」のアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
また、特許文献２には、ウシ・ラクトフェリンを、プロテアーゼにより酵素分解し、酵素分解物から上記ペプチドを採取する技術が記載されている。
【０００６】
炎症性疾患において体液中に増加するタンパクとして、セリンプロテアーゼの一種である、白血球の産生するエラスターゼがある（Ｃｌｉｎｉｃａ．Ｃｈｅｍｉｃａ．Ａｃｔａ．１９９５．２３９．９１−１０１．）。
エラスターゼは、炎症時には補体成分やグロブリンを分解することが知られている（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７９．９４．７５−８３．，Ｅｌａｓｔａｓｅ．（Ｒ．Ｐ．Ｍｅｃｈａｍ，ｅｄ）１９８６．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｓｓ，２１７−３２０．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７．１６．３３９０−３３９６．）。
しかしながら、このエラスターゼとラクトフェリンの関与を報告した事例はない。また、細菌性疾患で、細菌の産生する酵素により分解されるラクトフェリンについても、その生理作用は報告されていない。
【０００７】
特許文献２記載のペプチドは、免疫賦活剤であり、炎症誘起活性を有するものではない。
本発明では、炎症性疾患で増加するエラスターゼに着目し、ラクトフェリンが分解されることを明らかとし、分解されたラクトフェリン中に各種炎症性サイトカインやケモカインの産生誘導活性を有するポリペプチドを分離できるようにしたものである。
また、このポリペプチドより、ヒトのラクトフェリンに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成し、この様な炎症誘起活性を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドを見出した。本発明はこの新知見に基づき発明したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２８９７４９号公報
【特許文献２】特開２００４−００２４７１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５．１５．９３−１１０．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１９９６．４０．２５７−２６２．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２００１．５７．２４０−２４９．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２００２．６４．８７３−８７８
【非特許文献２】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．１９９６．１４５．２０９−２１４．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８．９５．，１２６４１−１２６４６．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３．４７．６０７−６１７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、各種炎症性サイトカイン産生誘導活性、各種ケモカイン産生誘導活性、ＮＦκＢの発現増強を有する小分子ラクトフェリン及びペプチド並びにその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のラクトフェリンは、ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られたフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満の小分子ラクトフェリンであることを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
【００１２】
本発明のペプチドは、ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られるフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のペプチドであることを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
前記ペプチドは合成ペプチドであることを特徴とする。
【００１３】
本発明のペプチドは、ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００１４】
本発明の各種炎症性サイトカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明の各種ケモカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明のＮＦκＢの発現増強物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
【００１５】
本発明のラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法は、ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをエラスターゼにより分解後精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のラクトフェリン・ポリペプチドを採取することを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
【００１６】
本発明の合成ペプチドを作成する製造法は、ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをプロテアーゼにより分解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法、ゲルろ過法、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）アフィニティークロマトグラフィー法、ラクトフェリン抗体結合アフィニティークロマトグラフィー法により精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含むラクトフェリン・ポリペプチドを単離し、アミノ酸シークエンサーにより確定し、合成ペプチドを作成することを特徴とする。
【００１７】
本発明は、炎症性疾患（歯周病）を罹患したヒトの唾液を、５０％飽和硫酸アンモニュウム沈殿法により濃縮後、トリス−塩酸緩衝液で脱塩後、ヒト・ラクトフェリン抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）ＣＮＢ ｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりラクトフェリンを精製した。
【００１８】
さらに、ヒト・ラクトフェリン（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）をセリンプロテアーゼの一種である、エラスターゼ（ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）により３７℃で１時間処理し、その後、エラスターゼ阻害剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ−ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）により反応を停止した。
そして、炎症性疾患の検体から得られたラクトフェリンと、エラスターゼ処理したラクトフェリンを、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）二次元免疫電気泳動法によりその泳動像を観察した。
【００１９】
さらに、炎症性疾患検体とエラスターゼ処理ヒト・ラクトフェリンは１５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により詠動した。
泳動後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に転写し、各検体に共通して認められたバンドを切り出した後、Ｎ−末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）により解析した。
そして、各ラクトフェリン・ポリペプチドを作成し、サイトカインならびにケモカインの産生誘導能を各種細胞により解析し、炎症誘起活性を有するペプチドを確定した。
【００２０】
なお、特許文献２に記載されているペプチドのアミノ酸配列は、本願発明に係るペプチドのアミノ酸配列とは異なる。
本願発明におけるアミノ酸配列は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（略記号：ＦＫＤ）を含むペプチドである。また、Ｎ−アミノ酸配列の位置もＣ末領域に近い部分に位置している。
【００２１】
さらに、ＦＫＤは、ヒト・ラクトフェリンでは２箇所、ウシ・ラクトフェリンでは一箇所しか存在しない。
そのため、このＦＫＤを含むラクトフェリン・ポリペプチドが炎症誘起作用を示すものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によると、アミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している新規ラクトフェリン・ポリペプチドは催炎作用を有する物質であり、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド」と呼べる物質であった。そして本発明により、従来のラクトフェリンが持つ有益な生理作用の他に、催炎作用を持つドメインの発見は、ラクトフェリンの有効利用、炎症性疾患ならびに各種感染症など、多くの研究分野の進展に大きく寄与する発明である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】歯周病患者唾液中ラクトフェリンとエラスターゼ処理後のヒト・ラクトフェリンのＳＤＳ ＰＡＧＥならびにＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像。
【図２】エラスターゼ処理後のヒト・ラクトフェリンの分子量とＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像の変化。
【図３】分子量ならびにＮ−末端アミノ酸配列とラクトフェリン分子中の位置。
【図４】作成ヒト・ラクトフェリン・ポリペプチドとの共培養による、炎症性サイトカイン、ケモカインおよびＮＦκＢｐ６５の発現増強効果。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ヒトの炎症性疾患の検体とエラスターゼ処理した検体では、検体中のラクトフェリンの小分子化の起こっていることが確認された。また、この際のＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像でも、両検体はＣｏｎ Ａ親和性の弱い画分の出現することが判明した。第１図に示す。
【００２５】
エラスターゼ濃度を０．００１ｕｎｉｔ〜１．０ｕｎｉｔまで、段階的に変え反応させたところ、エラスターゼの反応濃度の増加に従い、分子量２０ｋＤａ近辺の小分子のラクトフェリンが増加した。さらに、Ｃｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動においてもＣｏｎ Ａ親和性の弱い画分が増加した。この小分子化したラクトフェリンは、ウシ乳房炎乳汁で報告されている、「炎症性ラクトフェリン」蛋白群（分子量３０〜６０ｋＤａ）とは明らかに異なる分子量のものであった。第２図に示す。
【００２６】
ヒトの炎症性疾患の検体と、エラスターゼ処理した検体に共通して認められたラクトフェリン・ドメインは、第１図に示した通りである。この内、ヒトならびにウシで、Ｎ−末端側にあるドメインは既に抗菌活性や、腫瘍細胞に対するアポトーシス活性が報告されているアミノ酸配列を含んでいた。また、ヒトのドメインではＮ−末端アミノ酸配列の中ほどに位置するドメインには、免疫抑制作用を有するミニドメインの一部が含まれていた。これより下流に位置する他の二つのドメインは未報告のものであった。第３図に示す。
【００２７】
これらラクトフェリン・ドメインのうち、既にその作用が報告されているドメインを除外し、エラスターゼ処理したヒト・ラクトフェリンと炎症性疾患分泌液中のラクトフェリンに共通して認められた、分子量２０〜２５ｋＤａの主たる二つのラクトフェリン分子は、アミノ酸配列の解析結果から、Ｎ−末領域に位置することが判明した。そして、この二つのドメインからペプチドを作成し、その生理作用について解析した。作成したポリペプチドは表１に示した通りである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
これら作成ポリペプチドは、健康なヒトの抹消血を、ヘパリンナトリウムを用いて採血し、リンフォライトＨ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｃａｎａｄａ）を用いた比重遠心法によりリンパ球を分離し、これを用いて各種サイトカインならびにケモカイン産生誘導能と、細胞内転写因子であるＮＦκＢｐ６５の発現誘導能を解析した。ヒトのサイトカイン（ＩＬ−６とＴＮＦα；Ｔｅｃｈｎｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）、ケモカイン（ＩＬ−８とＭＣＰ−１；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびＮＦκＢ（ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ κ Ｂ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，Ｃｏ．，ＵＳＡ）の測定は酵素抗体法により測定した。
【００３０】
エラスターゼ処理ヒト・ラクトフェリン中から分離し作成したポリペプチドのうち、ＨｕＰｅｐ１．とＨｕＰｅｐ４．で、炎症性サイトカインのＩＬ−６の産生誘導能が確認された。また、これらのポリペプチドでは、炎症時に血液中に増加するＩＬ−８とＭＣＰ−１の産生誘導能や、これらサイトカインやケモカインの産生誘導をつかさどる、細胞内転写因子のＮＦκＢｐ６５の発現増強も確認された。このＨｕｐｅｐ１．ならびにＨｕＰｅｐ４．は、ＦＫＤのアミノ酸配列が共通していた。図４に示す。
【００３１】
本発明において見出された、エラスターゼにより分解された、ヒトのラクトフェリン中に含まれる、ＦＫＤのアミノ酸配列を含む新規ラクトフェリン・ポリペプチドは、ヒトでは２箇所あった。そして、この新規ラクトフェリン・ポリペプチドは、細胞内の転写因子であるＮＦκＢの発現を増強し、細胞障害作用などを示すサイトカインや、白血球の遊走化活性を示すケモカインの産生を誘導し、炎症を引き起こす物質であった。さらに、ＮＦκＢは一酸化窒素（ＮＯ）、アラキドン酸代謝産物や各種酵素などの炎症メディエーターの産生を誘導することが知られている。そのため、本発明で見出された新規ラクトフェリン・ポリペプチド、これら炎症メディエーターの産生誘導能を示すことは容易に想定される、新規のラクトフェリン・ポリペプチドである。また、この新規ポリペプチドは、エラスターゼ以外のプロテアーゼによってラクトフェリン分子が分解され、出現することが可能と考えられる。この、ＦＫＤを含むアミノ酸配列はウシのラクトフェリン中にも一箇所（Ｎ末端より３００番目から３０２番目）あり、ヒトのラクトフェリンで確認されたポリペプチドと近い位置に存在する。また、エラスターゼなどのプロテアーゼにより切断されるアミノ酸も近傍に位置している。そのため、これらプロテアーゼにより分解され得るものと考えられる。すなわち、ヒト以外でも、同様のアミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している、ウシを始めとした動物由来のラクトフェリンからも、同様の炎症誘起作用を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドは分離可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によると、アミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している新規ラクトフェリン・ポリペプチドは催炎作用を有する物質であり、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド」と呼べる物質であった。そして本発明により、従来のラクトフェリンが持つ有益な生理作用の他に、催炎作用を持つドメインの発見は、ラクトフェリンの有効利用、炎症性疾患ならびに各種感染症など、多くの研究分野の進展に大きく寄与する発明である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られたフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満の小分子ラクトフェリン。
【請求項２】
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする請求項１記載の小分子ラクトフェリン。
【請求項３】
ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られるフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は、ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは合成ペプチドである請求項３、４記載のペプチド。
【請求項６】
ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
請求項１、２記載の小分子ラクトフェリン又請求項３−６のいずれか１項記載のペプチドからなることを特徴とする各種炎症性サイトカイン産生誘導活性物質。
【請求項８】
請求項１、２記載の小分子ラクトフェリン又請求項３−６のいずれか１項記載のペプチドからなることを特徴とする各種ケモカイン産生誘導活性物質。
【請求項９】
請求項１、２記載の小分子ラクトフェリン又請求項３−６のいずれか１項記載のペプチドからなることを特徴とするＮＦκＢの発現増強物質。
【請求項１０】
ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをエラスターゼにより分解後精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のラクトフェリン・ポリペプチドを採取することを特徴とするラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする請求項１０記載のラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法。
【請求項１】
ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られたフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満の小分子ラクトフェリン。
【請求項２】
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする請求項１記載の小分子ラクトフェリン。
【請求項３】
ラクトフェリンをエラスターゼにより処理して得られるフェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は、ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは合成ペプチドである請求項３、４記載のペプチド。
【請求項６】
ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
請求項１、２記載の小分子ラクトフェリン又請求項３−６のいずれか１項記載のペプチドからなることを特徴とする各種炎症性サイトカイン産生誘導活性物質。
【請求項８】
請求項１、２記載の小分子ラクトフェリン又請求項３−６のいずれか１項記載のペプチドからなることを特徴とする各種ケモカイン産生誘導活性物質。
【請求項９】
請求項１、２記載の小分子ラクトフェリン又請求項３−６のいずれか１項記載のペプチドからなることを特徴とするＮＦκＢの発現増強物質。
【請求項１０】
ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをエラスターゼにより分解後精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のラクトフェリン・ポリペプチドを採取することを特徴とするラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする請求項１０記載のラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−６４６８（Ｐ２０１１−６４６８Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９９２８１（Ｐ２０１０−１９９２８１）
【出願日】平成２２年９月６日（２０１０．９．６）
【分割の表示】特願２００５−５１５５３８（Ｐ２００５−５１５５３８）の分割
【原出願日】平成１６年２月１６日（２００４．２．１６）
【出願人】（５０７３９７５０４）株式会社多機能性蛋白研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月６日（２０１０．９．６）
【分割の表示】特願２００５−５１５５３８（Ｐ２００５−５１５５３８）の分割
【原出願日】平成１６年２月１６日（２００４．２．１６）
【出願人】（５０７３９７５０４）株式会社多機能性蛋白研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
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