リシン化合物並びにペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾におけるそれらの使用
本発明は、ペプチド及びタンパク質のための構築ブロックとして使用することができ、前記ペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを形成する新規なチオリシン化合物及びセレノリシン化合物に関する。特に、本発明は、化合物５−チオリシン（δ−チオリシンとも呼ばれる）；４−チオリシン（γ−チオリシンとも呼ばれる）；５−セレノリシン（δ−セレノリシンとも呼ばれる）及び４−セレノリシン（γ−セレノリシンとも呼ばれる）（の使用）を提供する。それぞれの炭素原子におけるチオール基又はセレノール基の位置決めによって、非常に効率的な分子内転移反応を、選択されたリガンドとのコンジュゲーションの後に行うことが可能になり、チオール基又はセレノール基は、その後に、報告されている手順で除去することができ、それによって天然のリシン構造を復元し、又は追加のコンジュゲーションハンドルとして使用することができる。この方法は高速であり、明確に定義された材料をもたらす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾の分野に関する。特に、本発明は、前記ペプチド及びタンパク質用の構築ブロックとして使用することができる新規なチオリシン化合物及びセレノリシン化合物を提供する。このように含められるリシン残基は、その後に機能性剤とのコンジュゲーション用の標的部位として作用することができ、その機能性剤は、典型的には次いでチオリシン残基又はセレノリシン残基のεアミン又はαアミンに転移される。本発明は、選択されたペプチド配列又はタンパク質配列のこれらの部位選択的及び官能基選択的修飾プロセス、並びにこのようなプロセスのそれぞれのステップにおいて得られる中間体及び最終生成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の部位特異的共有結合的修飾は、生体系において極めて重要なプロセスである。酵素修飾（リン酸化、グリコシル化、硫酸化、アセチル化、メチル化、イソプレニル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化など）は、タンパク質局在化及び輸送、シグナル伝達、転写制御、並びに標的タンパク質の破壊を含めて、細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。タンパク質表面の天然修飾を再現することは、それらの機能を研究するのに貴重である。
【０００３】
フルオロフォア、アフィニティーラベル、スピンラベルプローブ、放射性ラベル及び他の（バイオ直交性）官能基などの「非天然」部分のタンパク質及びペプチドへの部位特異的共有結合的付加も、インビボ及びインビトロの両方において非常に多様な用途及びプロセスに有用であることがわかっている。
【０００４】
生体適合性合成有機化学の進歩につれて、連結成分の性質及び連結反応の選択について高い多様性が可能になり、成功の機会に満ちた全く新しい分野が開けてきている。化学的連結は、第１の化学成分の第２の化学成分との官能基選択的共有結合に伴って生じる。タンパク質又はペプチド及び第２の連結成分上に存在する独自の相互反応性官能基を使用して、連結反応を官能基選択的なものにすることができる。しかし、タンパク質又はペプチドを選択的に修飾する強固な方法の開発は、典型的なタンパク質に存在する官能基の種類及び数のため、依然としてかなり難題である。一般に、タンパク質を部位特異的に修飾して、コンジュゲートされた官能基とタンパク質又はペプチドの固有特性を最適に組み合わせることが求められ、又は必要とされている。したがって、このような修飾タンパク質への制御された選択的アクセスには、独自のバイオ直交性化学的ハンドル又は付着部位が、所望の分子のそれへの連結又はコンジュゲーションにしばしば必要とされる。
【０００５】
バイオコンジュゲートの生成方法の大半は、タンパク質表面のアミン（リシン側鎖及びＮ末端）又はチオール（システイン側鎖）の求核性を利用するものである。タンパク質の部位特異的修飾には、修飾部位を単一位置に限定するために、タンパク質のリシン残基全部が置換されている変異体又はシステイン残基の１つだけを除いて全部が置換されている変異体を設計することを含む方法が提案されてきた。
【０００６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−エステルなどの活性化された酸を使用して、アミンを標的とすることができる。しかし、タンパク質は、典型的には複数のアミンを含有し、さらにはタンパク質のアミノ末端のｐＫａがリシン側鎖に比べて低下しており、この標識は一般に非特異的である。この問題を克服するために、研究者らは、表面リシンをすべてなくすようにタンパク質標的を進化させるところまで行ってきた。研究者らは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）についてファージディスプレイ法による選択を行って、リシン欠損タンパク質を進化させ、Ｎ末端において残存する単一アミンの部位特異的ペグ化を可能にした。Ｎ末端だけに修飾を行って進化させたＴＮＦ−αは、ランダムに標識した野生型ＴＮＦ−αに比べて改善された安定性及び生物活性を有する。一般に、すべての部位の大部分において所与のタイプ（単数又は複数）のアミノ酸を置換する大規模なアミノ酸置換は、タンパク質活性の低下という欠点を伴うものであった。
【０００７】
アミン標識より、システイン標識は、チオール基がより求核性なので典型的には特異的であり、単一のシステインを、部位特異的突然変異誘発によって、タンパク質の機能に影響を及ぼすことなく導入することができる。突然変異誘発によって導入されたシステインは、チオールと優先的に反応する低分子結合マレイミド、α−ハロケトン、又は他の求電子性基で標識される。しかし、システインをベースとした方法単独では、２つのシステインの反応性が全く異なる場合を除いて、タンパク質に対する複数の修飾（蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析のために２つのフルオロフォアを導入するなど）を容易に行うことはできず、すべてのタンパク質標的が、機能を損なうことなくシステインの導入を可能にするとは限らない。
【０００８】
天然アミノ酸中に存在する追加の官能基を標的とする別の方法は、タンパク質修飾を行う化学者の道具箱に加えられた貴重なツールと考えられる。
【０００９】
Ｆｒａｎｃｉｓ及び同僚（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻、１０２５６頁）は、トリプトファン残基とチロシン残基の両方を特異的に標的とすることができる反応を特定した。ロジウムカルベノイドを使用して、トリプトファンのインドール官能基の（Ｎ−１又はＣ−２における）選択的修飾を実現することができる。ミオグロビン又はスブチリシング・カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｇ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）に（それぞれ、２つ及び１つの表面トリプトファンについて）適用すると、修飾はトリプトファン残基のみに収率約５０〜６０％で起こる。系では、有機試薬を可溶性にするための共溶媒が必要とされるが、この共溶媒（エチレングリコール）はタンパク質標的を変性させないことが期待される。化学のさらに重大な限界は、極度に低いｐＨ（１．５〜３．５）の要件であり、大部分のタンパク質の変性及びミオグロビンのヘム基の喪失を引き起こすものである。ミオグロビンを再構成する方法を用いれば、そのタンパク質の構造を回復することができるが、これらの極端な条件は多くの標的と適合しないであろう。しかし、結果が示唆することは、遷移金属錯体を、タンパク質における芳香族残基の特定のバイオコンジュゲーションに使用できる点である。
【００１０】
Ｆｒａｎｃｉｓ及び同僚（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻、１５９４２頁）は、アルデヒド及びアニリンをｐＨ ６．５で使用して、チロシンを選択的に標的とするマンニッヒ型反応についても記載している。フルオロフォアをアニリンに付着させることによって、タンパク質の活性を変更することなく、ローダミンのキモトリプシノゲンＡへのコンジュゲーションが実現される。様々なチロシンの相対的表面アクセシビリティーについては、特定のチロシン残基に対する選択性が考慮される。キモトリプシノゲンＡでは、３つの表面チロシンのうちの１つが優先的に標的とされる。
【００１１】
戦略の中には、非天然官能基を利用するものもある。このようなアミノ酸は、全合成、合成断片と生物学的に発現させた断片の連結である半合成、転移反応などを含めて様々な方法で導入することができる。これらの非天然バイオ直交性官能基の存在によって、天然アミノ酸側鎖基との偶発的な架橋反応又は他の反応が起こることなく、個々のターゲティングが可能になる。
【００１２】
例としては、バイオ直交性連結ハンドルとしてタンパク質におけるアジドの制御された導入が挙げられる。この点で有用であることがわかっている反応は、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓによって改良されたアルキンとアジドのＨｕｉｓｇｅｎ環化である。触媒量のＣｕ（Ｉ）の存在下で、この環化は官能基選択的に行われて、１，４−二置換トリアゾール環が生成する。一般的な生物学的官能基との交差反応性はアルキンにもアジドにも見られず、これらの基は両方とも、生物学的条件下で安定である。この反応は、細胞表面上のウイルス粒子及びタンパク質の修飾から低分子活性プローブでタグを付けた糖結合タンパク質及び細胞性タンパク質の同定まで様々な用途で使用されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記のことから明らかなように、選択的に修飾されたタンパク質が並外れて興味深いものであるにもかかわらず、現在利用可能な技法にはそれぞれ、特定の欠点がある。それに加えて、一般に使用可能で柔軟な方法が全く欠如している。したがって、選択的（バイオ直交性）連結ハンドルを形成するさらなる化学的戦略が、生物学に由来する方法を補完及び詳述するのに依然として必要とされている。本発明の目的は、このような戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、新規で一般に適用可能であり、特に高速で柔軟で経済的である、ペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾手法を提供する。本発明によれば、タンパク質又はペプチド合成において、ある種の新規なリシン化合物を構築ブロックとして使用し、部位選択的及び官能基選択的に修飾するための特定連結ハンドル（単数又は複数）を形成する。
【００１５】
特に、本発明は、ペプチド又はタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾を行うための特定のチオリシン化合物及びセレノリシン化合物、特に化合物５−チオリシン（δ−チオリシンとも呼ばれる）及び４−チオリシン（γ−チオリシンとも呼ばれる）、並びに５−セレノリシン（δ−セレノリシンとも呼ばれる）及び４−セレノリシン（γ−セレノリシンとも呼ばれる）の使用を伴う。本発明のリシン化合物は、本明細書で説明するように、市販の構築ブロックから比較的少ない数の合成ステップで高収率で容易に合成される。
【００１６】
本リシン化合物の設計には、重要な２つの特徴がある。第１に、それぞれの炭素におけるチオール基又はセレノール基の位置決めによって、非常に効率的な分子内転移反応が起り得る。第２に、チオール基又はセレノール基は、報告された手順でその後に除去し、それによって本来のリシン構造を回復することができ、又は追加のコンジュゲーションハンドルとして使用することができる。この方法は高速であり、明確に定義された材料をもたらす。
【００１７】
リシンのε−アミン、又は適用できる場合にはα−アミンの近くにチオール残基又はセレノール残基が存在すると、非常に好ましいＳからＮ又はＳｅからＮへのエステル交換反応が可能になり、それによって、選択された機能性剤が、チオエステル化又はセレノエステル化を介してペプチド又はタンパク質に導入され、前記ε−アミン又はα−アミンに転移される。
【００１８】
実施例で極めて詳細に説明するように、本発明者らは、選択されたペプチド標的のユビキチン化における本発明のリシン構築ブロックの適用を実証した。全長ユビキチンチオエステル及び新たに開発されたアミノ酸５−チオリシンのＥ１媒介合成を使用することによって、本発明者らは、Ｈ２Ｂ、ＰＣＮＡ、ＰＴＥＮ及びｐ５３に基づいて、選択された標的ペプチドにおけるリシン残基の部位特異的ユビキチン化を実証した。この方法は、他の機能性剤又はリガンドにも容易に適応可能である。連結後、穏やかな脱硫条件の使用は、ペプチド若しくはタンパク質中に存在する他の構築ブロック又は選択された機能性剤の機能的完全性に影響を及ぼさない。
【００１９】
要約すれば、本発明は、ある種のリシン化合物、それらを合成する方法、並びにタンパク質又はペプチド合成における構築ブロック、典型的にはポリペプチド配列又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のためのバイオ直交性標的としてのそれらの使用に関する。本発明は、本リシン化合物を使用した、選択されたタンパク質配列又はペプチド配列を合成及び修飾する方法にも関する。さらに、本発明は、このような方法で得られた中間体及び最終生成物に関する。添付の特許請求の範囲で定義されている本発明の上記及び他の態様を、以下の説明及び実施例でさらに詳細に説明及び例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の態様は、式（Ｉａ）若しくは（Ｉｂ）で表されるリシン化合物：
【化１】
［式中、−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、（ｉ）水素又は（ｉｉ）アミン保護基を表し、−Ｐ３は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式−Ｘ−Ｒ６で表されるアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキルセレノ又はアルケニルセレノ基（式中、−Ｒ６は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す）；（ｉｉｉ）チオール又はセレノール保護基；或いは（ｉｖ）−Ｒ５部分又は（ｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される、共有結合したリガンドの残基を表し、−Ｒ７は、（ｉ）水素或いは（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す］、又は前記リシン化合物のエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物に関する。
【００２１】
上記の式において、−Ｘ−は硫黄又はセレンを表すことができる。チオリシン化合物及びセレノリシン化合物も同様の方式で得られ、使用することができる。それにもかかわらず、本発明の利点は、チオリシン化合物で最も顕著であることが明らかになった。したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、−Ｘ−が−Ｓ−を表す、以上に定義したリシン化合物に関する。
【００２２】
上記の式において、−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、水素又はアミン保護基を表すことができる。当業者に理解されるように、本発明は、リシン化合物を非保護、部分保護又は完全保護された形で提供する。ペプチド合成における化合物の使用では、典型的にはすべての官能基の保護が必要とされるようになるので、本発明の特に好ましい実施形態は、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の保護されたリシン化合物（式中、−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、選択されたアミン保護基を表す）に関する。
【００２３】
「アミン保護基」という用語は、アミン窒素原子に容易に付着し、アミン窒素に結合しているときに、得られる保護されたアミン基を化合物の他の部分に実施される反応条件に対して不活性にし、適切なときに、除去して、アミン基を再生することができる任意の有機部分を指す。このようなアミン保護基の例は当業者に公知であり、その例としては、ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリル、及びｐ−トルエンスルホニルなどのアシルタイプ；ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及び置換ベンジルオキシ−カルボニル、１−（ｐ−ビフェニル）−１−メチルエトキシ−カルボニル、及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの芳香族カルバメートタイプ；ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、エトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニルなどの脂肪族カルバメートタイプ；シクロペンチルオキシカルボニルやアダマンチルオキシカルボニルなどの環式アルキルカルバメートタイプ；トリチルやベンジルなどのアルキルタイプ；トリメチルシランなどのトリアルキルシラン；並びにフェニルチオカルボニルやジチアスクシノイルなどのチオール含有タイプが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明によるアミン保護基は、Ｃｂｚ；ｐ−メトキシベンジルカルボニル；Ｂｏｃ；Ｆｍｏｃ；ベンジル；ｐ−メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；ｐ−メトキシフェニル；トシル；スルホンアミド；アリルオキシカルボニル；トリチル及びメトキシトリチルからなる群から選択されるが、それらはすべて、アミン保護基として市販されており、当技術分野において周知である。広範囲に及ぶ用途のため、ペプチド合成におけるこれらの基の使用に関与する正確な化学作用は詳細に記述されており、当業者の共通一般知識の一部分である。アミン保護基及び保護されたアミン基については、例えばＣ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ及びＥ．Ｈａｓｌａｍ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７３年、３章及び４章にそれぞれ記載されており、またＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９１年、２章及び３章に記載されている。
【００２４】
上記の式において、−Ｐ３は、式−Ｘ−Ｒ６で表されるアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキルセレノ又はアルケニルセレノ基を表すことができ、−Ｒ６は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す。本明細書では、「場合によっては置換されている」という用語は、１種又は複数の置換基を含んでもよい、どんな種類のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニルでも包含することになっている。前記置換基は、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素、塩素、臭素、又はヨウ素など、１種又は複数のヘテロ原子を典型的には組み込むことができる。−Ｐ３が式−Ｘ−Ｒ６の部分を表すとき、当業者に理解されるように、典型的にはジスルフィド又はジセレニド化合物が与えられ、その形の場合、γ位又はδ位の官能基を効果的にブロック又は保護することができる。したがって、−Ｘ−Ｒ６部分が存在する場合その最小限の機能は、チオール又はセレノール部分を、例えばタンパク質又はペプチド合成時にブロックすることのみになるので、−Ｒ６の正確な構造はそれほど重要なものではない。好ましい実施形態において、−Ｒ６は、場合によっては置換されている低級アルキル又はアルケニル部分、より好ましくは場合によっては置換されているＣ１〜Ｃ４アルキル又は場合によっては置換されているＣ２〜Ｃ４アルケニル、最も好ましくはメチルスルフィドを表す。
【００２５】
さらに、上記の式において、−Ｐ３は、チオール保護基又はセレノール保護基を表すことができる。「チオール保護基」及び「セレノール保護基」という用語は、チオール硫黄原子又はセレン原子に容易に付着し、前記原子に結合しているときに、得られる保護された基を化合物の他の部分に実施される反応条件に対して不活性にし、適切なときに、除去して、チオール基又はセレノール基を再生することができる任意の有機部分を指す。このような保護基の好適な例は当業者に公知である。好ましくは、本発明による保護基は、ベンジル；４−メトキシベンジル；トリチル；メトキシトリチル；ｔ−ブチル；ｔ−ブチルチオール；メチルチオール；アセチル；３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル；アセトアミドメチル；Ｃｂｚ及び２−ニトロベンジルからなる群から選択される。チオール保護基の使用は、当技術分野において周知である。例えば、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９年）を参照のこと。
【００２６】
上記の式において、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、共有結合したリガンドの残基を表す。前記リガンドは、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される。好ましい実施形態において、前記リガンドはカルボキシル基を含み、それを介して、硫黄原子又はセレン原子に付着しており、その場合、−Ｐ３はアシルを表す。−Ｒ５は、リガンドと本リシン構築ブロックとの結合の性質に関してなんら制限のないリガンドを表すために本明細書で使用されることを理解されたい。したがって、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’はカルボキシル基を含有するリガンドのチオエステル又はセレノエステルを特に意味するために使用されるものであるが、−Ｒ５に包含される。以下でさらに詳細に説明されるように、アシル、すなわち式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を、リシン構築ブロックのε−アミン（又は、α−アミンの場合もある）に転移させることができる。リガンドの−Ｒ５残基がアシルでない場合、このような分子内転移は典型的には起こり得ない。というのは、その結合の反応性が低くなるからである。前記結合の反応性が低くなることの別の結果として、−Ｒ５がアシルを表さない場合にすでに存在している、本発明のリシン構築ブロックを使用して、ペプチドを好都合に合成することができる。ペプチドにおいて、リガンドがチオエステル又はセレノエステルとして組み込まれることができる場合、すなわちリガンドの前記残基がアシルである場合、ペプチドの合成後に連結を行うことがより好都合である。
【００２７】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）における−Ｒ５はアシル部分を表さない。すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’を除く部分を表し、好ましくは場合によっては置換されている第一級、第二級又は第三級の脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニルなどの第一級、第二級又は第三級の炭素構造を表し、チオエーテル又はセレノエーテル化合物が得られる。特に好ましい実施形態において、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）における−Ｒ５は、ガラクトースなどの炭水化物を表す。
【００２８】
本発明の文脈の範囲内で、「リガンド」という用語の意味はそういうものとして当業者に明白であろう。特に、本発明では、タンパク質又はペプチドの新規な部位選択的及び官能基選択的修飾方法を提供することが目的とされているので、前記用語は、例えばある目的で当技術分野において選択されたペプチド又はタンパク質へのコンジュゲーションが記載又は示唆されている任意の作用物質を包含することになっていることが明白であろう。リガンドの導入によって、典型的には前記ペプチド又はタンパク質の特定の機能性が導入又は影響される（したがって、「機能性剤」などと呼ばれることもある）。このようなリガンド又は機能性剤の特に好ましい例としては、染料、プローブ、ラベル、タグ、溶解性改変剤、酵素標的、受容体リガンド、免疫調節剤、補助因子、及び架橋剤が挙げられる。一実施形態において、リガンドは治療剤である。以下の実施例において、ある種のペプチドとユビキチン及びユビキチン様タンパク質との連結が開示される。上記の式において、−Ｒ７は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表すことができる。−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分の分子内転移の後に、このような基が存在すると、プロテアーゼでは加水分解することができない第三級ε−アミドが得られるようになる。これは、例えばリシン構築ブロックがペプチド又はタンパク質のユビキチン化のために組み込まれるとき、特定の利点をもたらす。本発明の特に好ましい実施形態において、上記の式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）において、−Ｒ７は、（ｉ）水素、或いは（ｉｉ）メチル又はエチルなどの低級アルキルなど、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状アルキルを表す。
【００２９】
当業者にはすぐに認知されるように、本発明のリシン化合物には、キラル中心が２個あり、したがって４個の潜在的立体異性体が考えられる。本発明は、異性体として純粋な任意の化合物、及び任意のラセミ混合物又は非ラセミ混合物（の使用）を包含する。本リシン化合物の対象とする用途を考慮すると、天然のＬ−アミノ酸立体配置が特に好ましい。したがって、本発明の実施形態は、本明細書の以上に定義するリシン化合物（ここで、α−炭素原子はＬ−立体配置をとる）に関する。
【００３０】
これらのチオリシン化合物のエステル、塩、水和物、溶媒和物及び他の誘導体も、本発明の範囲内である。したがって、このような誘導体はいずれも、本発明の範囲から逸脱することなく提供することができる。但し、タンパク質又はペプチド合成における構築ブロックとして使用して、前記使用に先立って主要な化学修飾を必要とすることなく、バイオ直交性連結ハンドルを形成するのにやはり適していることを条件とする。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態において、式（Ｉａ）によるリシン化合物［式中、−Ｘ−は硫黄を表し、−Ｐ１は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ２は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ３は、−Ｓ−ＣＨ３、トリチル又はメトキシトリチルを表し、Ｒ７は水素又はメチルを表す］、又はその塩、エステル、水和物、若しくは溶媒和物が得られる。
【００３２】
本発明の特に好ましい別の実施形態において、式（Ｉｂ）によるリシン化合物［式中、−Ｘ−は硫黄を表し、−Ｐ１は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ２は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ３は、−Ｓ−ＣＨ３、トリチル又はメトキシトリチルを表し、Ｒ７は水素又はメチルを表す］、又はその塩、エステル、水和物、若しくは溶媒和物が得られる。
【００３３】
本発明の第２の態様は、本明細書で先に定義したリシン化合物の合成に関し、前記方法は、（ｉ）式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される４−ヒドロキシリシン又は５−ヒドロキシリシンを有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を生成し、それをその後にアミン保護基と反応させ、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）で表される保護された４−ヒドロキシリシン又は５−ヒドロキシリシンを生成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた化合物をメシル化し、それをその後に好適なチオカルボン酸又はセレノカルボン酸又はその塩若しくはエステルと反応させて、式（Ｖａ又はＶｂ）で表されるような対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られたチオエステル又はセレノエステルをアルカリ金属水酸化物の水溶液で加水分解し、チオール又はセレノール化合物を生成し、それをその後に本明細書で先に定義した−Ｐ３基を前記チオール基又はセレノール基に転移させることができる作用物質と反応させ、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で表される化合物を生成するステップと、（ｉｖ）アミノ酸を保護している有機ボラン基を除去し、その後に化合物とアミン保護剤を場合によっては反応させて、本明細書で以上に定義した式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による化合物を得るステップとを含む。式（ＩＩＩａ−ＶＩａ）及び（ＩＩＩｂ−ＶＩｂ）において、−Ｘ−及び−Ｐ３は、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した意味と同じ意味を有する。前記式において、−Ｐ１は、以上に定義したアミン保護基を表す。
【化２】
【００３４】
化合物（ＩＩＩｂ）の４−ヒドロキシリシンは合成により得ることができる（Ｊ．Ｍａｒｉｎ、Ｃ．Ｄｉｄｉｅｒｊｅａｎ、Ａ．Ａｕｂｒｙ、Ｊ．Ｒ．Ｃａｓｉｍｉｒ、Ｊ．Ｐ．Ｂｒｉａｎｄ、Ｇ．Ｇｕｉｃｈａｒｄ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、６９巻、１３０頁）。化合物（ＩＩＩａ）の５−ヒドロキシリシンは、例えばＢａｃｈｅｍ又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。５−ヒドロキシリシンは、エナンチオマーとして純粋な形（すなわち、天然の２Ｓ／５Ｒの形）、及び考えられる４個の異性体の混合物（５Ｓ／Ｒ及びＤ／Ｌ）として利用可能である。すべての形を対応する保護されたリシン構築ブロックの合成において使用することができる。
【００３５】
上述の通り、合成は、好ましくは有機ボラン化合物を用いた処理によるα−アミノ酸基の同時保護で開始する。このような有機ボラン化合物の特に好ましい例は９−ボラビシクロボラン（９−ＢＢＮ）であり、機能性アミノ酸を保護するためのその使用が当技術分野で記述されている。典型的には、このような反応は、固体結晶質のヒドロキシリシンを９−ＢＢＮ又は他の有機ボランの好適な溶媒、例えば熱メタノール溶液に添加し、その後に不活性雰囲気下で還流することによって行われる。反応が終了した後、溶媒を典型的には蒸発させ、残渣を好適な溶媒に溶解し、アミン保護剤、例えば二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる。その後に、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）による化合物を、当業者には公知の適切な任意の方法、例えば抽出及びシリカゲル精製で単離及び精製することができる。
【００３６】
その後に、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物は、メシル化及びその後の好適なチオカルボン酸又はセレノカルボン酸又はその塩又はエステルとの反応により、対応する式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）のチオエステル又はセレノエステルに変換される。典型的には、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物を、好適な溶媒中でＭｓＣｌなどのメシレートと反応させることによって、まずメシル化する。メシル化された化合物を、当業者には公知の一般的な技法で単離及び精製することができる。次いで、メシル化された化合物を、好適な溶媒中で前記チオ酢酸若しくはセレノ酢酸又はその塩と反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得る。本発明の好ましい実施形態において、チオ酢酸若しくはセレノ酢酸又はその塩が使用される。反応が実質的に終了した後、一般的な単離及び／又は精製技法を用いて、反応生成物を高純度固体として得る。
【００３７】
次に、ＮａＯＨなどのアルカリ金属水酸化物の水溶液を用いて、チオエステル又はセレノエステルを加水分解すると、チオール又はセレノールが得られ、それを好適な溶媒中で、−Ｐ３基を前記チオール又はセレノールに転移させることができる作用物質と組み合わせて、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の化合物を生成することによって、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の任意の他の化合物に変換することができる。例えば、式（Ｖａ）で表されるチオエステルを、１Ｎ ＮａＯＨを用いて対応するチオールに変換することができ、その後に、溶液としてのそのチオールを滴下して、メタンチオスルホン酸Ｓ−メチル溶液と組み合わせて、式（ＶＩａ）の化合物（式中、−Ｘ−Ｐ３は−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３を表す）を生成する。
【００３８】
最後に、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の化合物を、典型的には好適な溶媒中、例えばエチレンジアミンのＴＨＦ溶液中、７０℃に加熱し、その後、化合物を好適なアミン保護基で処理することによって、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の化合物のアミノ酸を保護している有機ボラン部分を除去すると、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の保護された化合物が生成する。当業者に理解されるように、対応する非保護化合物は、アミン保護基と反応させる最後のステップを省略し、望むなら任意の他の保護基を除去することによって得ることができる。
【００３９】
本発明の代替実施形態において、上記の方法を、ヒドロキシリシンの代わりに対応するクロロリシン又はブロモリシンで始めることができ、中間体のメシル化の追加ステップを省略することができるという特定の利点がある。本方法のこの実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン又は５−ブロモリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を生成し、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン又は５−ブロモリシンを得るステップを含み、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）で得られた化合物と好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩を反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップを含み、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は本明細書で以上に記載された通りである。
【００４０】
上記の反応はすべて、異なる化合物の合成に関するものではあるが、それ自体当技術分野において公知なので、所望の化合物を可能な限り高収率で得るために上記ステップのそれぞれについて適切で且つ最適の反応条件を決定し、上記ステップ間に追加の単離又は精製技法を適用することは完全に、訓練を受けた専門家の技能の範囲内である。以下の実施例で、本発明のいくつかの化合物の合成について段階的に徹底した説明を記載する。
【００４１】
本発明は、本リシン化合物の合成において得られたいかなる中間生成物、特に上記の式（ＩＩＩａ−ＶＩａ）及び（ＩＩＩｂ−ＶＩｂ）で表される中間生成物にも関する。
【００４２】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）で表されるペプチド：
【化３】
［式中、
−Ｒ１は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した−Ｐ１；又は（ｉｉｉ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ１’は、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ２は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した−Ｐ２；（ｉｉｉ）Ｃ→Ｎポリペプチド鎖又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ３は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した−Ｐ３；（ｉｉｉ）−Ｒ５部分；又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ４は、（ｉ）−ＯＨ又は（ｉｉ）Ｎ→Ｃポリペプチド鎖を表し、−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した意味と同じ意味を有し、−Ｒ７は、（ｉ）水素又は（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す、但し、それぞれの式において、−Ｒ２及び−Ｒ４の少なくとも一方は、ポリペプチド鎖を表すことを条件とする。
【００４３】
本発明のペプチドは、実際に本発明のプロセスで得られたかどうかにかかわらず、好ましくは非天然ペプチドであり、非天然という用語は、自然に生じるペプチドは本発明の範囲内に含まれていないということを示すために用いられる。天然ペプチドとは本発明のリシン構築ブロックの存在及び／又は−Ｒ５基若しくは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’基の存在が異なるペプチドは、本明細書では非天然ペプチドを構成すると解釈され、したがって特許請求の範囲に包含されるものである。
【００４４】
当業者には明白であるように、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、及び（ＩＩｃ）による上記のペプチドは、−Ｒ１、−Ｒ２、−Ｒ３、及び−Ｒ４の特定の意味にもよるが、本発明のプロセス、すなわち上記のチオリシン又はセレノリシン構築ブロックの１種又は複数が組み込まれるペプチド又はタンパク質合成、及びその後のリガンドの共有結合による部位選択的及び官能基選択的修飾の中間体及び最終生成物を構成する。関連する反応経路の詳細については、本明細書で以下に記載する。
【００４５】
当業者に明らかであるように、本発明のペプチドのＮ→Ｃ骨格は、Ｒ２→Ｒ４鎖で表される。本発明の連結ハンドルを用いてペプチドに共有結合したリガンド又は機能性剤も、ペプチドとすることができ、したがって、いくつかの実施形態において、第２のペプチド鎖は、Ｒ２→Ｒ４鎖で表される主鎖に直角に付着して存在することができる。以下でさらに詳細に説明されるように、式（Ｉｂ）による本発明のリシン構築ブロックがＲ２→Ｒ４鎖のＮ末端のアミノ酸として組み込まれる場合、すなわち式（ＩＩｂ）におけるＲ２がペプチド鎖ではなく水素を表すとき、連結ハンドルによって、ε−アミン基ではなくα−アミン基における修飾リガンドの付着が促進され得る。その場合にリガンドもペプチドである場合、得られる「修飾された」ペプチドは、任意の別の修飾ステップにもよるが、単一ペプチド鎖を含む。このような連結生成物も本発明の範囲内である。但し、先に説明したように、それらが天然ペプチド又はタンパク質と同一でないことを条件とする。
【００４６】
本発明は、先に指摘したように、興味の対象となるペプチド又はタンパク質配列中に、部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを含む可能性を提供する。本発明の一実施形態によれば、連結ハンドルは、前記配列のＣ末端又はＮ末端にではなく興味の対象となるペプチド又はタンパク質配列内に位置することが特に好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態は、本明細書で先に定義した非天然ペプチドを提供する。式中、Ｒ２とＲ４は共に、ポリペプチド鎖を表す。しかし、好ましい別の実施形態によれば、本チオリシン又はセレノリシン連結ハンドルは、以下でさらに詳細に説明される理由でペプチドのＮ末端に位置することが好ましい。したがって、本発明の好ましい別の実施形態は、本明細書で先に定義した、好ましくは式（ＩＩｂ）による非天然ペプチドを提供する。式中、−Ｒ４はポリペプチド鎖を表し、−Ｒ２は−Ｐ２又は水素を表す。
【００４７】
当業者に理解されるように、前記連結ハンドルは、本発明のリシン構築ブロックを前記配列に加えることによって、又は前記配列に由来するアミノ酸残基を本発明のリシン構築ブロックの残基で置換すること、特に「天然」リシン残基を置換することによって、興味の対象となるペプチド又はタンパク質に組み込むことができる。
【００４８】
したがって、好ましい一実施形態において、本明細書で先に定義した非天然ペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されている。本発明の文脈において、「相補部分」（又は「相補断片」）という用語は、それぞれの部分（又は断片）が所与の方向で、連続した順序で組み合わせて、それぞれのアミノ酸配列を、典型的には前記部分又は断片間にギャップ又は重複領域なしに形成する又は含むことができることを示すのに使用される。
【００４９】
同様に好ましい別の実施形態において、本明細書で先に定義した非天然ペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片のアミノ酸配列中の選択された単一アミノ酸残基、好ましくはリシン残基に隣接するＣ→Ｎ及びＮ→Ｃポリペプチド部分を表すように選択されている。
【００５０】
前記天然ポリペプチド又はタンパク質の特定の選択は、当業者に認知されているように、本発明ではクリティカルではない。例えば、インビボ又はインビトロで自然の作用過程を研究及び／又は改変するための修飾が、当業者にとって興味の対象となり得るポリペプチド又はタンパク質であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、いずれでも使用することができる。以下の実施例において、本発明によるｐ５３、ＰＴＥＮ、ヒストンＨ２Ｂ、及びＰＣＮＡの修飾を開示する。
【００５１】
天然ポリペプチド又はタンパク質の機能性変種は、置換、挿入、欠失、Ｎ末端若しくはＣ末端の付加的アミノ酸、及び／又は付加的化学部分などのマイナーな修飾が前記天然ポリペプチド又はタンパク質と異なることがあるが、天然型の基本ポリペプチド及び側鎖構造、並びにある生物学的機能又は活性をインビトロ及び／又はインビボで誘発する能力を維持する。典型的には、デフォルトパラメータを使用して、ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴのプログラムなどにより最適にアライメントすると、天然ポリペプチド及びその同族体は、少なくともある一定の百分率の配列同一性を共有する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、一致数を最大にして、２つの配列をそれらの全長にわたってアライメントし、ギャップ数を最小にする。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップクリエーションペナルティー＝８及びギャップエクステンションペナルティー＝２で使用する。タンパク質について、デフォルトのスコアリング行列はＢｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ、１９９２年、８９巻、９１５頁）である。配列アラインメント及び配列同一性（％）スコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．（９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、９２１２１−３７５２、ＵＳＡ）から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用して決定することができる。或いは、類似性（％）又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースに対して検索することによって決定することができる。本明細書では「その機能性変種」は、興味の対象となる選択された上記天然ポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であり、適切な条件下で、依然としてその正常な機能を著しい程度に誘発することができるポリペプチド又はタンパク質を含むものであると理解される。
【００５２】
当業者に理解されるように、本発明に従って特に使用することができる修飾は、本発明によるものなどさらなる連結ハンドルを含めることを含む。特に好ましい実施形態において、−Ｒ２及び−Ｒ４のペプチド鎖の一方又は両方は、本発明の１種又は複数の追加のリシン構築ブロックを含む。さらにより好ましくは、反応性に差異がある連結ハンドルを形成する本発明の２個以上のリシン構築ブロックを含む、先に定義したペプチドが得られる。例えば、本発明の第１のリシン構築ブロック（式中、−Ｘ−は硫黄を表す）及び本発明の第２のリシン構築ブロック（式中、−Ｘ−はセレンを表す）を含むペプチドを生成することができる。別の実施形態において、本発明の第１のリシン構築ブロック及び第２のリシン構築ブロック（式中、−Ｘ−は同じでも異なってもよく、両方の構築ブロックにおける−Ｐ３基は異なる）を含むペプチドを生成することができる。２個を超える構築ブロックが含まれ、それぞれ、−Ｘ−及び−Ｐ３を好適に選択することにより反応性に差がある別の実施形態を記載する。当業者に理解されるように、このような実施形態に従って、２個以上の同一の構築ブロックを含めることも想定することができる。
【００５３】
「その機能性断片」という用語は、天然全長ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種の一部分であるペプチド断片を指す。但し、その一部分は、対応する全長配列の特徴である生物学的機能又は活性を誘発する能力を有することを条件とする。
【００５４】
上記の式（ＩＩａ〜ＩＩｃ）において、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義し説明したように、共有結合したリガンドの残基を表す。
【００５５】
本発明の実施形態において、好ましいリガンドはユビキチン又はユビキチン様タンパク質である。ユビキチンコンジュゲーション又はユビキチン化は、すべての真核生物において自然に発生するプロセスであり、タンパク質安定性、細胞周期進行、転写調節、受容体輸送、及び免疫応答を含めて、多種多様でクリティカルな細胞プロセスに関係している。ユビキチン及びユビキチン様タンパク質は、約１００ａａポリペプチドである。現在までに、ＮＥＤＤ８、ＩＳＧ１５、ＦＵＢ１、ＦＡＴ１０、ＵＢＬ５、ＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３、ＵＦＭ１、ＭＬＰ３Ａ−ＬＣ３、ＡＴＧ１２、及びＵＲＭ１を含めて、異なる約１２種のユビキチン様タンパク質が同定されている。前記リガンドがユビキチンである上述したペプチド、又は前記ユビキチン様タンパク質の１つが特に好ましい。以下の実施例において、ある種のペプチドとユビキチン及びユビキチン様タンパク質との連結が開示される。ユビキチン及びユビキチン様タンパク質の機能及び構造に関するさらに詳細な情報については、Ｊｅｒａｍ及び同僚（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００９年、９２２〜９３４頁）を参照することができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
本発明の特に好ましい実施形態において、式（ＩＩａ）によるペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は両方とも、ポリペプチド鎖を表し、−Ｒ１及び−Ｒ３の少なくとも一方は、以上に定義した共有結合したリガンドの残基を表し、−Ｒ７は水素又はメチルを表し、−Ｘ−は硫黄を表す。
【００５７】
本発明の特に好ましい別の実施形態において、式（ＩＩｂ）によるペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は両方とも、ポリペプチド鎖を表し、−Ｒ１及び−Ｒ３の少なくとも一方は、以上に定義した共有結合したリガンドの残基を表し、−Ｒ７は水素又はメチルを表し、−Ｘ−は硫黄を表す。
【００５８】
本発明の特に好ましい別の実施形態において、式（ＩＩｃ）によるペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は両方とも、好ましくは天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されているポリペプチド鎖を表し、−Ｒ７は、水素又は低級アルキル、好ましくはメチルを表し、−Ｒ１’は、共有結合したユビキチン又はユビキチン様タンパク質の残基を表す。
【００５９】
本発明の第４の態様は、選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾方法であって、ｉ）前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列に、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による少なくとも１種のリシン化合物（式中、−Ｐ３は、水素、又は好ましくは本明細書で先に定義した保護基を表す）が付加又は置換により組み込まれる、前記選択された配列を化学的、生化学的又は生物学的に合成又は生成するステップと、ｉｉ）前記リシン化合物の残基中の−Ｐ３で表される基を除去し、式−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基（式中、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（ＩＩａ−ＩＩｃ）に関して定義したのと同じ意味を有する）と前記リシン化合物の残基を硫黄原子又はセレン原子においてコンジュゲートするステップとを含む方法に関する。
【００６０】
以上に説明したように、本発明の構築ブロックの特定の利点は、アシル部分−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’をチオール又はセレノール連結ハンドルからε−アミン、又は何らかの場合にはα−アミンに転移させる可能性にある。したがって、本発明の好ましい実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分が、リシン化合物の残基にコンジュゲートし、−Ｐ３基を置換して、対応するチオエステル又はセレノエステルを生成する、本明細書で先に定義した部位選択的及び官能基選択的修飾方法が提供され、方法は、その後に式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される前記基のα−アミン又はε−アミン基への分子内転移ステップｉｉｉ）を含む。
【００６１】
化学的ペプチド合成方法は、当業者に周知である。本発明によれば、ペプチドは、典型的には化学的に、好ましくは固相合成法で合成される。本発明によれば、配列全体が逐次延長によってのみ合成されているかどうかということ、又はプロセスが別々に得られた２種以上の断片の連結を伴うかどうかということはクリティカルではない。典型的には、配列長が１００アミノ酸を超える場合、別個の断片を生成し、断片縮合及び／又は化学的連結と呼ばれるプロセスによりそれらを連結するのが好ましいことがある。以下でさらに詳細に説明されるように、本発明は、ペプチド合成の目的で特に有利な化学的連結プロセスも提供する。或いは、本明細書に記載されているチオリシン化合物及びセレノリシン化合物は、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用してタンパク質に組み込むことができ、非天然チオリシン構築ブロックが、興味の対象となるタンパク質の遺伝子中のナンセンスコドン又は４塩基コドンに応答して組み込まれる。現在までに、この技術によって、約５０個の非天然アミノ酸の組込みが可能になった（Ｊ．Ｍ．Ｘｉｅ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００６年、７巻、７７５頁、並びに／又はＰ．Ｒ．Ｃｈｅｎ、Ｄ．Ｇｒｏｆｆ、Ｊ．Ｇｕｏ、Ｗ．Ｏｕ、Ｓ．Ｃｅｌｌｉｔｔｉ、Ｂ．Ｈ．Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ、及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９年、４８巻、４０５２頁を参照のこと）。このために、本発明のリシン構築ブロックが、α−アミン及びカルボン酸において非コンジュゲート形で、好ましくは非保護形で用いられていることは好ましい。
【００６２】
−Ｒ５基が、上記の場合によっては置換されている第一級、第二級又は第三級の脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニルを表す場合、コンジュゲーションは典型的には、非保護チオールを対応する化合物Ｌ−Ｒ５（ここで、Ｌは、ハロゲン原子又は良好な別の脱離基を表す）と反応させる、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成と呼ばれる反応を含む。
【００６３】
式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基は典型的には、対応する酸又はエステル、典型的には式Ｈ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるカルボン酸；式Ｈ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるチオカルボン酸；又は式Ｈ−Ｓｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるセレノカルボン酸；或いは前記酸のエステル又は塩と反応させることによって非保護チオール基又はセレノール基にコンジュゲートさせる。
【００６４】
或いは、本発明に従って−Ｒ５部分又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分を生成することができる選択されたリガンドの正確な性質に応じて、本方法は、化学的コンジュゲーションの代わりに酵素的コンジュゲーションを伴うことがある。場合によっては、これは、例えば特異性の増大及び／又は穏やかな反応条件のため好ましいことがある。所与の酵素的コンジュゲーションプロセスに好適な材料及び条件は、正確なリガンドによって決まり、一般に当技術分野において本質的に公知である。
【００６５】
式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基のε−アミン基への分子内転移は、以上に説明したように、当技術分野において本質的に公知である反応により前記アミン基の脱保護を必要とする。リガンドのＳからＮへの分子内転移は、標準化学も必要とする。典型的には、ＳからＮへの分子内転移はアミンの脱保護を行った後に化学的に好ましく、したがって好ましくは中性又は（わずかに）アルカリ性の環境において自然発生する。式（Ｉｂ）によるリシン構築ブロックをＮ末端のアミノ酸残基として使用した場合、転移反応は、特定のアミンの特定の保護／脱保護ステップを経て、α−アミン基又はε−アミン基に対して行うことができる。このために適した保護基及び反応条件を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６６】
式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基をリシン構築ブロックのアミンに転移させた後、非ブロック化したチオール基又はセレノール基は、本発明のリシン化合物の残基において再び利用可能である。この基を再び連結ハンドルとして使用して、−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される、最初の基と同じでも異なってもよい別の基を付着させて、対応するコンジュゲートを得ることができる。式（Ｉｂ）によるリシン構築ブロックをＮ末端のアミノ酸残基として使用し、第２のリガンドも−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるアシルである場合、第２の分子内転移、並びに望むならその後に−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される第３の部分（その他の部分と同じでも異なってもよい）とのコンジュゲート形成も利用することができる。或いは、チオール基又はセレノール基を、当業者には公知の反応物質及び条件によってリシン構築ブロックから除去することができる。
【００６７】
先に指摘したように、ペプチドの合成は、好ましくは固相基質上で行われ、前記基質に共有結合したペプチドが得られる。本方法のその後のステップのうち１つ又は複数は、前記固相基質からペプチドを遊離させる前又は後に行うことができる。本発明の実施形態において、リガンドのリシン構築ブロックへのコンジュゲーションも同様に、固相上で行われる。より好ましくは、チオール基又はセレノール基（単数又は複数）のコンジュゲーション、分子内転移又は除去とすることができる本発明の最終修飾ステップを行った後に、ペプチドを固相基質から遊離させる。この戦略によって、修飾されたタンパク質を高純度で直接得ることができ、潜在的にその後の一部又は全部の精製ステップを余分なものとする。或いは、本発明の方法は、例えばタンパク質をマイクロアレイ表面に直接合成することができるタンパク質（マイクロ）アレイの場合に発明のその後のステップの前又は後に固相基質から遊離させない固相合成に関することがある。
【００６８】
選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の正確な性質は、本発明では全くクリティカルでないが、本発明の好ましい実施形態は、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列が本明細書で以上に定義した天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片である、以上に定義した方法に関する。
【００６９】
さらに、好ましい実施形態において、前記部位選択的及び官能基選択的修飾方法はユビキチン化であり、又はユビキチン化を含む。したがって、本発明の好ましい実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分をリシン化合物の残基にコンジュゲートし、−Ｐ３基を置換し、前記−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分がユビキチン又はユビキチン様タンパク質である、以上に定義した方法が提供される。
【００７０】
本発明の第５の態様は、前記選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを形成するための本明細書で先に定義したリシン化合物の使用に関する。先に記載したように、本発明の実施形態は、ペプチドとすることができる機能性リガンドの機能性ペプチド又はタンパク質、典型的には本明細書で以上に定義した天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片への共有結合、典型的には直交性共有結合に関する。
【００７１】
しかし、本発明の別の態様は、すでに先に記載したように、一方の断片のＣ末端のカルボン酸基が他方の断片であるＮ末端のチオリシン又はセレノリシン構築ブロックのα−アミン基に付着している、あるペプチド断片の別のペプチド断片への線状結合のための、式（Ｉｂ）の本リシン構築ブロックの使用に関する。これは、ビルドポリペプチド鎖を別々に付着させて、（バイオ直交性）機能性リガンドを含んでも含まなくてもよい機能性ペプチド又はタンパク質を最終的に得ることが望ましい場合が多い、ある一定の長さを超えるペプチドの合成において特に有用な道具であることがわかった。
【００７２】
したがって、本発明の別の態様は、選択されたポリペプチド又はタンパク質配列を合成する方法であって、ｉ）Ｎ末端のアミノ酸残基として、式（Ｉｂ）によるリシン化合物（式中、−Ｐ３は本明細書で先に定義したアミン保護基を表す）が付加又は置換により組み込まれる、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の断片を合成するステップと、ｉｉ）前記断片において、−Ｐ３で表される基を、Ｃ−末端カルボキシル基を介して結合している、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の相補的ペプチド断片で置換するステップと、ｉｉｉ）前記相補的ペプチド断片をＮ末端のα−アミンに分子内転移させるステップとを含む方法に関する。
【００７３】
先に記載したように、このような方法によれば、分子内転移を行った後、チオール基又はセレノール基は、チオリシン又はセレノリシン残基において、上記の方法及び使用による機能性剤の部位選択的及び官能基選択的（直交性）連結のための連結ハンドルとして再び利用可能である。当業者に理解されるように、このような手法は、単一リシンブロックがペプチド及びタンパク質の合成及びその後の修飾において非常に効率的に使用されることを可能にし、したがって特に好ましい実施形態になる。或いは、望むなら、ペプチド断片の線状連結後に、チオール基又はセレノール基を除去することができる。
【００７４】
本発明の別の態様は、先に記載したことに従って、選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、個々のペプチド断片を線状共有結合させるための連結ハンドルを形成するための本明細書で先に定義したリシン化合物の使用に関する。
【００７５】
さらに、本発明の別の態様は、本明細書で先に定義した式（ＩＩａ−ＩＩｃ）のペプチド又はタンパク質の治療剤又は診断剤としての使用に関する。先に記載したように、官能基選択的及び部位選択的に修飾されたペプチドは、診断及び治療方法に適用され得る。例えば、ある種のタグ、プローブ又はマーカーで標識された内在性タンパク質及び／又はペプチドは、診断剤として有用な道具となり得る。さらに、（潜在的）治療剤又は診断剤と現在呼ばれるタンパク質を、例えば溶解性変更リガンドを含めることによってそれらの臨床成績が改善されるなどのように、本発明に従って修飾することができる。ペプチド性及び非ペプチド性の治療剤又は診断剤を特定の作用部位に仕向ける本発明の技法を使用して、前記剤を特定のタンパク質にリガンドとして連結させることができる。
【００７６】
本文書及びその特許請求の範囲において、「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、その単語に続くアイテムが包含され、具体的に記載されていないアイテムも排除されないことを意味するように、その非限定的意味において使用される。さらに、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、唯一の要素しかないことが文脈に明白に定められていない限り、１つを超える要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００７７】
本明細書で先に記載した本発明の様々な態様は、以下の例１〜３、及びその中で参照されている図１〜１２で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示す図である。
【図２】反応進行のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋約１７８ｎＭ Ｅ１＋２５μＭ Ｕｂ＋２ｍＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ、３７℃でインキュベーション。
【図３】ペプチド最小必要濃度（単位μＭ）のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋約７１ｎＭ Ｅ１＋２５μＭ Ｕｂ、３７℃で終夜インキュベーション。
【図４】Ｅ１最小必要濃度（単位ｎＭ）のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ＋２５μＭ Ｕｂ、３７℃で終夜インキュベーション。
【図５】ジスルフィド中間体をＴＣＥＰで処理した後の連結生成物形成のＥＳ＋スペクトルを示す図である。
【図６】ペプチド１〜３のユビキチン連結のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ；３７℃で終夜インキュベーション。１＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド１（ＤＭＦ、５％）＋１５０ｎＭ Ｅ１；２＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド１（ＤＭＳＯ、１０％）＋３００ｎＭ Ｅ１；３＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド１（ＤＭＦ、１０％）＋３００ｎＭ Ｅ１；４＝３３μＭ Ｕｂ＋４５μＭ ペプチド１（ＤＭＳＯ、１％）＋３００ｎＭ Ｅ１；５＝３３μＭ Ｕｂ＋４５μＭ ペプチド１（ＤＭＦ、１％）＋３００ｎＭ Ｅ１；６＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド２＋１５０ｎＭ Ｅ１；７＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド３＋３００ｎＭ Ｅ１；８＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド３＋１５０ｎＭ Ｅ１；９＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド３＋３００ｎＭ Ｅ１。１→＝連結生成物；２→＝Ｅ１、３→＝ペプチド（残基）。
【図７】ペプチド４、５及びＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫのユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ；３７℃で終夜インキュベーション。１０＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド４＋１５０ｎＭ Ｅ１；１１＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド４＋３００ｎＭ Ｅ１；１２＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド５＋１５０ｎＭ Ｅ１；１３＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド５＋３００ｎＭ Ｅ１；１４＝２５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ＋１５０ｎＭ Ｅ１；１５＝２５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ（ＤＭＳＯ、１．２５％）＋１５０ｎＭ Ｅ１；１６＝２５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ（ＤＭＳＯ、１０％）＋１５０ｎＭ Ｅ１。１→＝連結生成物；３→＝ペプチド（残基）。
【図８】ペプチド１〜１０のユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）−パートＩＩを示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０ｎＭ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。１７＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１；２１＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド３；１８＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１；２２＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド３；１９＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド２；２０＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド２。１→＝連結生成物。
【図９】ペプチド１〜１０のユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）−パートＩＩを示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０ｎＭ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。２３＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド４ ２７＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド６；２４＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド４、２８＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド６；２５＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド５；２６＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド５。１→＝連結生成物。
【図１０】ペプチド１〜１０のユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）−パートＩＩを示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０ｎＭ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。２９＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド７、３３＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド９；３０＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド７、３４＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド９；３１＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド８、３５＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１０；３２＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド８、３６＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１０。１→＝連結生成物。
【図１１】ペプチド１〜１０（５０μＭ、１当量）のＳＵＭＯ−１連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋１００μＭ ＳＵＭＯ−１（ペプチドに基づいて２当量）＋２５０ｎＭ ＳＵＭＯ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。１→＝連結生成物。１）ｐ５３：ＨＬＫ＊ＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；２）ｐ５３：ＨＬＫＳＫ＊ＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；３）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫ＊ＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；４）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫ＊ＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；５）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫ＊ＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；６）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫ＊ＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；７）ＰＣＮＡ：ＧＤＡＶＶＩＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫＦＳＡＳＧＥＬＧＮＧＮＩＫＬＳＱ１８４（３．１８ｋＤａ）；８）ＰＣＮＡ：ＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫ１６８（１．０２ｋＤａ）；９）ＰＴＥＮ：ＭＴＡＩＩＫＥＩＶＳＲＮＫ＊ＲＲＹＱＥＤ（２．４３ｋＤａ）；１０）ＰＴＥＮ：ＴＳＥＫ＊ＶＥＮＧＳＬＣ＊ＤＱＥＩＤＳＩＣ＊ＳＩＥＲＡ（２．９８ｋＤａ）。
【図１２】ペプチド１〜１０（５０μＭ、１当量）のＳＵＭＯ−２連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋１００μＭ ＳＵＭＯ−２（ペプチドに基づいて２当量）＋２５０ｎＭ ＳＵＭＯ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。１→＝連結生成物。１）ｐ５３：ＨＬＫ＊ＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；２）ｐ５３：ＨＬＫＳＫ＊ＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；３）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫ＊ＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；４）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫ＊ＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；５）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫ＊ＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；６）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫ＊ＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；７）ＰＣＮＡ：ＧＤＡＶＶＩＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫＦＳＡＳＧＥＬＧＮＧＮＩＫＬＳＱ１８４（３．１８ｋＤａ）；８）ＰＣＮＡ：ＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫ１６８（１．０２ｋＤａ）；９）ＰＴＥＮ：ＭＴＡＩＩＫＥＩＶＳＲＮＫ＊ＲＲＹＱＥＤ（２．４３ｋＤａ）；１０）ＰＴＥＮ：ＴＳＥＫ＊ＶＥＮＧＳＬＣ＊ＤＱＥＩＤＳＩＣ＊ＳＩＥＲＡ（２．９８ｋＤａ）。
【図１３】ＣＦ４１ Ｃｒｙｏ−Ｃｏｍｐａｃｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ（７０℃）（１）及び光化学反応器用中圧Ｈｇランプ（４５０Ｗ）（２）を含む、Ｌ（＋）−リシンの光化学的塩素化に使用された実験装置を示す図である。
【実施例】
【００７９】
一般材料及び方法
一般試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ及びＡｃｒｏｓから入手し、精製をさらに行うことなく使用した。Ｈ−ＤＬ−δ−ヒドロキシ−ＤＬ−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＨＣｌはＢａｃｈｅｍから、（５Ｒ）−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン二塩酸塩一水和物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ユビキチンはＢＩＯＭＯＬから購入した。ＳＵＭＯタンパク質１及び２、ユビキチン用のＥ１（ＵＢＡ）、並びにＳＵＭＯ（ＡＯＳ１−ＳＡＥ２ダイマー）は、Ｐｒｏｆ．Ｔｉｔｉａ Ｓｉｘｍａのグループ（ＮＫＩ−ＡＶＬ）からの寄贈であった。Ｖ５０（２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ＶＡ−０４４（２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩）は、和光純薬工業（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）（日本）から購入した。溶媒は、ＢＩＯＳＯＬＶＥ及びＡｌｄｒｉｃｈから購入し、必要な場合はモレキュラーシーブ（ＤＣＭ、ＤＭＦについては４Å、ＭｅＯＨについては３Å）で終夜乾燥した。分析用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｆ２５４でプレコーティングしたアルミニウムシートで行い、エタノール中２０％ニンヒドリンを使用し、ヒートガンで加熱した。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（０．０３５〜０．０７０ｍｍ、９０Å、Ａｃｒｏｓ）で実施した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ及びＨＳＱＣ）は、別段の示唆のない限り、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ ４００分光計（１Ｈ：４００ＭＨｚ、１３Ｃ：１００ＭＨｚ）又はＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−ＩＩＩ ３００分光計（１Ｈ：３００ＭＨｚ、１３Ｃ：７５ＭＨｚ）を使用して、重水素化メタノール（ＭｅＯＤ−ｄ４、１Ｈ基準δ ４．８７ｐｐｍ；１３Ｃ基準δ ４９．１５ｐｐｍ）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３、１Ｈ基準δ ７．２６ｐｐｍ；１３Ｃ基準δ ７７．００ｐｐｍ）又は重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６、１Ｈ基準δ ２．５０ｐｐｍ；１３Ｃ基準δ ３９．５２ｐｐｍ）中、２９８Ｋで決定した。ＮＭＲスペクトルのピーク形状は、「ｄ」（二重線）、「ｄｄ」（二重二重線）、「ｓ」（一重線）、「ｂｒ ｓ」（ブロード一重線）、「ｔ」（三重線）及び「ｍ」（多重線）という記号で示される。化学シフト（δ）はｐｐｍの単位で示され、結合定数ＪはＨｚの単位で示される。ＬＣ−ＭＳ測定は、Ｗａｔｅｒｓ ２７９５分離モジュール（Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ）、Ｗａｔｅｒｓ ２９９６フォトダイオードアレイ検出器（１９０−７５０ｎｍ）、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８カラム（２．１ｘ１００ｍｍ）及びＬＣＴ（商標）垂直加速飛行時間型質量分析計を装備したシステムで行われた。２つの移動相：Ａ＝０．１％ギ酸水溶液及びＢ＝０．１％ギ酸水溶液中ＣＨ３ＣＮを使用して、試料を流速０．４０ｍｌ／分で流した。
【００８０】
ＬＣ−ＭＳプログラム１（Ｃ１８カラム）：
Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ Ｃ１８、２．１×１００ｍｍ、３μＭ）；流速＝０．４ｍＬ／分、ランタイム＝１０分、カラムＴ＝２０℃、ストローク容積＝２５μＬ；グラジエント：０．０→２．０分：５％ Ｂ；２．０→５．０分：５％ Ｂ→９５％ Ｂ；５．０→７．０分：９５％ Ｂ；７．０→７．２分：９５％ Ｂ→５％ Ｂ；７．２→９．９分：５％ Ｂ。
【００８１】
ＬＣ−ＭＳプログラム２（Ｃ４カラム）：
Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００、２．１×１００ｍｍ、３．５μＭ；流速＝０．４ｍＬ／分、ランタイム＝２４分、カラムＴ＝２０℃、ストローク容積＝２５μＬ；グラジエント：０．０〜２．０分：５％ Ｂ；２．０〜２０．０分：５％ Ｂ→９０％ Ｂ；２０．０〜２１．０分：９０％ Ｂ→９５％ Ｂ；２１．０〜２４．０分：９５％ Ｂ→５％ Ｂ。
【００８２】
ＨＰＬＣ（Ｃ４、ユビキチン由来化合物）：
Ｃ４ Ｖｙｄａｃカラムを使用したＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ／Ｔ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、カタログ番号２１４ＴＰ１０２２）。移動相：Ａ＝０．０５％ＴＦＡ水溶液、及びＢ＝０．０５％ＴＦＡ水溶液中ＣＨ３ＣＮ。カラムＴ＝２０℃。流速＝１０．０ｍＬ／分。ＬＣ−ＭＳプログラム２と同様のグラジエント。
【００８３】
（例１）：δ−チオリシン構築ブロックＤＬ−３．４及びＬ−３．４の合成
【化４】
【００８４】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシナト−ビシクロノニルボロン（ＤＬ−３．１）
アンモニア水溶液（５０ｍＬ）を、（５ＲＳ）−５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩（５ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。３０分間撹拌した後、溶液を濃縮し、結晶質固体を、さらに使用する前に高真空中で乾燥した。固体を、撹拌している９−ＢＢＮ（７．００ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）の熱メタノール（１００ｍＬ）溶液に１回で添加した。反応混合物を、清澄な溶液が得られるまで窒素下で（約３時間）還流した。溶媒を蒸発させた後、残渣を１，４−ジオキサン／水（１／１ ｖ／ｖ、５０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、ＮａＨＣＯ３（２．５ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（５．５ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）で処理した。終夜撹拌した後、反応混合物を濃縮し、塩水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮した後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；１／０→１／１→１／９）で精製した。表題化合物（Ｒｆ＝０．４、ＥｔＯＡｃ）が白色の発泡体として得られた。
【化５】
【００８５】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｒ−ヒドロキシ−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（Ｌ−３．１）
アンモニア水溶液（１０ｍＬ）を、（５Ｒ）−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン二塩酸塩一水和物（１．０４ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。３０分間撹拌した後、溶液を濃縮し、結晶質固体を、さらに使用する前に高真空中で乾燥した。固体を、撹拌している９−ＢＢＮ（１．２ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の熱メタノール（２０ｍＬ）溶液に１回で添加した。反応混合物を、清澄な溶液が得られるまで窒素下で（約３時間）還流した。溶媒を蒸発させた後、残渣を１，４−ジオキサン／水（２／３ ｖ／ｖ、３０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、ＮａＨＣＯ３（０．５ｇ）及びＢｏｃ２Ｏ（１．１ｇ）で処理した。終夜撹拌した後、反応混合物を濃縮し、塩水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮した後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；１／０→０／１）で精製した。表題化合物（Ｒｆ＝０．４、ＥｔＯＡｃ）が白色の発泡体として得られた。収率：１．３９ｇ、３．６３ｍｍｏｌ、２ステップ全体で８９％。４５．７ｍｍｏｌのスケールで、生成物を全収率８２％で得た（シリカゲルクロマトグラフィー、ＤＣＭ→１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。
【化６】
【００８６】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５ＳＲ−（Ｓ−アセチル）−ＤＬ−リシナト−ビシクロノニルボロン（ＤＬ−３．２）
ステップ１：０℃のＤＬ−３．１（０．９５ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７３０μＬ、５．２４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、ＭｓＣｌ（３２６μＬ、４．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を終夜撹拌したが、ＴＬＣ分析によって、反応が完結していないことが明らかになった。さらに０．５２ｍＬのＥｔ３Ｎ及び０．２３ｍＬのＭｓＣｌを添加した後、１時間以内で反応が完結したことがＴＬＣ分析によってわかった。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／１→１／４）で精製し、高真空下で乾燥した後、メシレート（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が発泡体として得られた。
【化７】
反応を２０ｍｍｏｌスケールでも行い、メシレートを＞９９％で５ＲＳ−δ−ヒドロキシ−ＤＬ−リシンから単離した。
【００８７】
ステップ２：チオ酢酸のＤＢＵ塩を使用する方法：冷却したＤＢＵ（５当量）の乾燥ＤＭＦ溶液（３．５Ｍ）にチオ酢酸（５当量）を添加することによって生成されるチオ酢酸ＤＢＵ塩溶液を予め生成し、メシレート（１．０当量、０．４５ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。反応を室温で終夜撹拌し、ＴＬＣ分析によって、出発材料が完全に消費され、ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／６でＲｆ ０．６で生成物スポットが生成したことがわかった。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物を酢酸エチルに溶解し、塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ １／３）で精製して、ＤＬ−３．２が発泡体として得られた。
【化８】
【００８８】
ステップ２：チオ酢酸カリウムを使用する方法：チオ酢酸カリウム（１．７５当量）を、メシレート（１．０当量、０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（７ｍＬ）溶液に添加した。反応を６５℃で２ １／２時間撹拌し、ＴＬＣ分析によって、出発材料が完全に消費され、生成物スポットが生成したことがわかった。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。
【化９】
【００８９】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（Ｓ−アセチル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（Ｌ−３．２）
ステップ１：０℃のＬ−３．１（１．３５ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７３０μＬ、５．２４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、ＭｓＣｌ（３２６μＬ、４．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１時間撹拌し、ＴＬＣ分析によって、反応が完結したことがわかった。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／１→１／３）で精製して、Ｌ−３．１（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が発泡体として得られた。
【化１０】
【００９０】
ステップ２：チオ酢酸のＤＢＵ塩を使用する方法：冷却したＤＢＵ（５当量）の乾燥ＤＭＦ溶液（３．５Ｍ）にチオ酢酸（５当量）を添加することによって生成されるチオ酢酸ＤＢＵ塩溶液を予め生成し、メシレート（１．０当量）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。反応を室温で終夜撹拌し、ＴＬＣ分析によって、出発材料の消費が不完全であることがわかった。さらに２．５当量の新鮮なＤＢＵＨＳＡｃを添加した。反応を終夜撹拌したままにした。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ １／３）で精製して、Ｌ−３．２が発泡体として得られた。
【化１１】
【００９１】
ステップ２：チオ酢酸カリウムを使用する方法：ＫＳＡｃ（１．７５当量、１０．９ｍｍｏｌ、１．２５ｇ）を、メシレート（１．０当量、２．８７ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（５８ｍＬ）溶液に添加した。反応を６５℃で３時間撹拌し、ＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳ分析によって、反応が完結したことがわかった。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物をＥｔＯＡｃに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。
【化１２】
【００９２】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−（メチルジスルファニル）−リシナト−ビシクロノニルボロン（ＤＬ−３．３）
チオアセテートＤＬ−３．２（１．００ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ溶液（３ｍＬ）で１５分間、０℃で処理した。反応混合物を、等モル量のＨＯＡｃを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、粗チオールが油として得られた。次に、粗チオールのＤＣＭ（７ｍＬ）溶液を、メタンチオールスルホン酸Ｓ−メチル（３当量、６．９ｍｍｏｌ、０．６６ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（９当量、２．７６ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を１時間撹拌し、その後、ＴＬＣ分析（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／３）によって、出発材料が完全に消費されたことがわかった。ＤＣＭを蒸発させた後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ ２／３）で精製して、ジスルフィドＤＬ−３．３（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が黄色の油として得られた。
【化１３】
【００９３】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（メチルジスルファニル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（Ｌ−３．３）
チオアセテートＬ−３．２（１．１３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ溶液（３ｍＬ）で１５分間、０℃で処理した。反応混合物を、等モル量のＨＯＡｃを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、粗チオールが油として得られた。
【化１４】
次に、粗チオールのＤＣＭ（７ｍＬ）溶液を、メタンチオールスルホン酸Ｓ−メチル（３当量、６．９ｍｍｏｌ、０．６６ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（９当量、２．７６ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を１時間撹拌し、その後、ＴＬＣ分析（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／３）によって、出発材料が完全に消費されたことがわかった。ＤＣＭを蒸発させた後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ ２／３）で精製して、ジスルフィドＬ−３．３（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が油として得られた。
【化１５】
【００９４】
Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−（メチルジスルファニル）−ＤＬ−リシン（ＤＬ−３．４）
化合物ＤＬ−３．３（２．６ｇ、５．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、エチレンジアミン（３．０ｍＬ）を添加した。溶液を約７０℃に５分間加熱すると、白色の固体が沈殿した。反応混合物をＨｙｆｌｏ（登録商標）に通して濾過し、濾液をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中４０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）で精製した。遊離アミノ酸が油として得られた。
【化１６】
次に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２．５ｇ、７．４ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍＬ）溶液を、この粗アミノ酸及びＮａＨＣＯ３（０．５９ｇ、１．１当量）のアセトン／Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ／５０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、ＤＣＭで抽出した。水層をクロロホルム及びＥｔＯＡｃで再び抽出した。有機層を合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）で精製した。
【化１７】
【００９５】
Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（メチルジスルファニル）−Ｌ−リシン（Ｌ−３．４）
化合物Ｌ−３．３（１．１５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、エチレンジアミン（１．３ｍＬ）を添加した。溶液を約７０℃に５分間加熱すると、白色の固体が沈殿した。沈殿物は、Ｆａｌｃｏｎ管で遠心分離する（４０００ｒｐｍで１０分）又はＨｙｆｌｏ（登録商標）に通して濾過することによって除去した。濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中４０％ ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）で精製した。
【化１８】
次に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１．２５当量、０．６６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）のアセトン（１０ｍＬ）溶液を、このアミノ酸（０．５１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（１４５ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．１当量）のアセトン／Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ／１０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１０％ ＭｅＯＨ）で精製した。
【化１９】
【００９６】
（例２）：ＤＬ−３．４及び（ｏ−ニトロベンジル）−システインで修飾されたペプチドの固相合成
Ｓｙｒｏ ＩＩ ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ自動ペプチド合成装置で、標準的９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ−）をベースとした固相ペプチド化学により、２５又は５０μｍｏｌの単位で、ペプチドを合成した。前処置したＦｍｏｃアミノ酸Ｗａｎｇ樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）で始めて、連続するアミノ酸をそれぞれ、４モル過剰で、ｐｙＢＯＰ及びＤｉＰＥＡと４５分間カップリングさせた。Ｆｍｏｃ−基の脱保護は、ＮＭＰ中２０％ピペリジンで実現した（３×１．２ｍＬ、２×２及び１×５分）。ペプチドは、ＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９５／２．５／２．５）で切断され、冷ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル中で沈殿した。精製は、Ｗａｔｅｒｓ １５２５ＥＦ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣでＡｔｌａｎｔｉｓ（Ｗａｔｅｒｓ、１９×２５０ｍｍ、１０μＭ）分取カラムを使用して行った。
【化２０】
【化２１】
【表１】
【００９７】
（例３）：トレースレスリシン構築ブロックであるδ−チオリシンを使用したペプチドの部位選択的及び官能基選択的ユビキチン化
一般プロトコル ５−チオリシン修飾ペプチドのユビキチン連結
ストック溶液試薬：
２００ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．５Ｍ ＡＴＰ
２．０Ｍ ＭＥＳＮａ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中１０ｍｇｍＬユビキチン
７１μＭ Ｅ１及びミリＱ中７．１μＭ（第１ストックを１０倍希釈）
【００９８】
ストック溶液ペプチド：
【化２２】
【００９９】
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中の標準反応混合物：
４ｍＭ ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ ＭＥＳＮａ
ユビキチン
ペプチド
２ｍＭ ＡＴＰ
Ｅ１
【０１００】
反応を３７℃で＞６時間インキュベートし、試料をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（３倍、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、７１℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｖ＝２００Ｖ）を使用して、１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードする。マーカーとして、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（図１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１０１】
無金属脱硫のための一般プロトコル
０．５ｍＭペプチドのミリＱ（４００μＬ）溶液を、下記を使用して３７℃で終夜インキュベートした。
１００μＬの４０ｍＭグルタチオン溶液
８０μＬの０．２Ｍ ＶＡ−０４４又はＶ−５０溶液（以下の構造を参照のこと）
０．５Ｍ ＴＣＥＰを含有する、４００μＬの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．５）。
【化２３】
【０１０２】
チオリシン構築ブロックＤＬ−３．４で修飾されたＨ２Ｂ（１１５−１２５）ペプチドＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫについてのＵｂ連結
本明細書に記載されたチオリシン構築ブロックのペプチドのユビキチン化における効率を評価するために、Ｍｕｉｒ及び同僚によって使用されたペプチド（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００７年、４６巻、２８１４頁）であるＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫにおいて、ＤＬ−３．４を組み込むことを選択する。この配列は、ヒストン核タンパク質Ｈ２Ｂの残基１１５−１２５に対応し、イタリック体のＫ＊はチオリシン残基の位置を示す。さらに、天然アラニン残基を位置１１７において使用することに決定した。対照的に、Ｍｕｉｒ及び同僚（Ｎａｔｕｒｅ、２００８年、４５３巻、８１２頁）は、この代わりにシステインをチオールコンジュゲーションのための潜在的部位として使用した。Ｂａｌａｋｉｒｅｖ及び同僚によるプロトコル（ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ、２００６年、７巻、１６６７頁）に基づいて、本発明者らは１組の実験を行い、その間に、ユビキチンのペプチドへの完全な連結が何時間後に観察されたか（図２）、ペプチドの最少量（図３）及びＥ１濃度（図４）を決定した。連結反応混合物を３７℃でインキュベートし、以下の材料からなるものであった。
【化２４】
反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１０３】
図２〜４の結果から、Ｕｂ連結は高速であり（＜４時間で完全変換）、（この時間枠内での）ユビキチンの完全変換には低ｎＭ濃度のＥ１（≧１５ｎＭ）及び≧１０当量のペプチドを必要とすることがわかる。ＭＥＳＮａをＴＣＥＰの代わりに使用すると、連結は観察されなかったが、これは、ＭＥＳＮａチオエステルが反応性種であるというＢａｌａｋｉｒｅｖ及び同僚による以前の観察を支持するものである。予想されるように、５−チオリシン構築ブロックを（したがって、ペプチドＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫを使用する）天然リシンに代えると、連結が起きなかった。全体的に見て、チオリシンをベースとするペプチドの使用によって、非常に効率的で経済的なユビキチン連結が行われるということが確立した。ＬＣ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩの分析により、連結生成物が形成されたことがわかり、その質量は９．９３ｋＤａであり、これは、予想される連結生成物の非対称的ジスルフィド（質量９．７９ｋＤａ）とメルカプトエタンスルホン酸（０．１４ｋＤａ）に対応する。ＬＣ−ＭＳ試料をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）中０．５Ｍ ＴＣＥＰで調製すると、低減された連結生成物が認められた（図５）。（ＨＰＬＣ）精製した連結生成物試料を、熱に侵されやすいフリーラジカル開始剤ＶＡ−０４４及びＶ−５０の使用に基づく選択的チオール脱硫プロトコルにかけた。したがって、ＴＫＡＶＴＫ＊（Ｕｂ）ＹＴＳＳＫの水溶液を、グルタチオン（水素源）、ＶＡ−０４４又はＶ−５０及びＴＣＥＰと共にリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）中、３７℃で終夜インキュベートすると、ＬＣ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ分析により脱硫生成物が生成された。
【０１０４】
ＰＣＮＡ、ＰＴＥＮ及びｐ５３に由来するδ−チオリシンペプチドについてのＵｂ連結
その後に、構築ブロックＤＬ−３．４を、３種の生物学的に関連性のあるモノユビキチン化タンパク質に由来する１組のペプチド（表１）に組み込んだ。ペプチド１及び２はそれぞれ、ＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティー因子であるＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の残基１５５〜１８４及び１６１〜１６８に対応する。構築ブロックＤＬ−３．４（Ｋ＊）を、位置１６４において組み込んだ。それは、保存（酵母及び哺乳類）モノユビキチン化リシン残基である。ペプチド３及び４はそれぞれ、腫瘍抑制物質ＰＴＥＮ（染色体ＴＥＮに位置するホスファターゼ及びテンシン相同体）の残基１〜１９及び２８６〜３０９に対応する。ＤＬ−３．４を、ＰＴＥＮの２つの主要なモノユビキチン化部位であることがわかっている位置１３及び２８９に組み込み、その核内移行を制御した。４種のペプチド配列がすべて、システイン残基を含むとき、それがＳ−（ｏ−ニトロベンジル）システイン（Ｃ＊、表１）として組み込まれるように選択した。というのは、ニトロベンジル基は、連結条件と適合性があるはずであり、光分解により容易に除去されるからである。最後に、ＤＬ−３．４は、ｐ５３配列において、そのＣ末端の調節部分の残基３６５−３８９に対応して組み込まれた。Ｃ末端のｐ５３ペプチドが、ヒト変異ｐ５３癌細胞において放射線誘導アポトーシスを増強させることがわかったことを指摘するのは興味深い。この配列中の６種のリシン残基はすべて、ユビキチン化部位であることが公知なので、６種のペプチド１組を合成した。
【０１０５】
ペプチド２〜１０は、連結反応時に使用されるＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）緩衝液に可溶であることがわかった。しかし、ペプチド１は、ＤＭＦやＤＭＳＯなどの極性有機溶媒にのみ可溶であることがわかった。これは、このペプチドは、ほぼ５０％が疎水性アミノ酸で構成されており、３本のβストランドを天然ＰＣＮＡタンパク質中に含むので驚くべきことではない（支援情報を参照のこと）。過剰のペプチドとのユビキチン連結を行うこと（ｒｘｎ１〜３及び６〜１６、図６及び７）に加えて、（およそ）等モル量のユビキチン及びペプチドの使用（ｒｘｎ４、５、図６及び図８〜１０）によって、連結が可能になることも観察された。ペプチドを固体支持体に固定して固相ペプチドを合成するための本明細書で記載された連結方法を開発することができるためには、すべてのペプチドを完全に消費することが重要である。極性有機溶媒が反応条件と適合性があることを確認するために、Ｈ２ＢペプチドＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫのユビキチン連結を、ペプチドのＤＭＳＯストックを使用して最終濃度１０％ＤＭＳＯになるまで繰り返した（ｒｘｎ１４〜１６、図７）。ｒｘｎ１〜５（図６）についてわかるように、ＤＭＳＯは、ユビキチン連結反応に対して負の効果を示さなかった。
【０１０６】
ユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌ）をコンジュゲートする本手法の普遍性を実証するために、２５０ｎＭ ＳＵＭＯ Ｅ１（Ａｏｓ１−ＳＡＥ２ダイマー）を使用して、ペプチド１〜１０（表１）とＳＵＭＯ−１（図１１）及びＳＵＭＯ−２（図１２）を連結することも行った。
【０１０７】
（例４）：γ−チオリシン構築ブロック４の合成
【化２５】
【０１０８】
γ−クロロ−Ｌ−リシン二塩酸塩（４．１）
４．１の合成は、図１３に示すような実験装置を使用して、Ｋｏｌｌｏｎｉｔｓｃｈら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６４年、８６巻、１８５７頁）に記載された文献の手順に従って行った。
【０１０９】
Ｌ（＋）−リシン一塩酸塩（１５０ｇ、８２１ｍｍｏｌ）のＨＣｌ（３６％）溶液に、塩素を７０℃でバブリングした。混合物を撹拌しながら、中圧水銀ランプで照射した。２時間後、反応混合物を７℃まで冷却し、種結晶を添加して、結晶化を誘導した。１時間後、得られた結晶を濾取し、粗生成物をＭｅＯＨで２回粉末にした。結晶を回収して、４．１が白色の固体として得られた。
【化２６】
【０１１０】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．２）
４．１（１．２７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）溶液に、撹拌しながらＤｉＰＥＡ（１．７５ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は混濁し、５分後に、９−ＢＢＮ（１．４０ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、窒素下で清澄な溶液が得られるまで、７０℃で加熱した（約２時間）。ＬＣ−ＭＳ分析によって、ボロネート化生成物への完全変換が確認された：Ｒｔ＝６．７３分（ＬＣ−ＭＳプログラム３）、ＭＳ ＥＳ＋（原子質量単位）：３００．９８［Ｍ＋Ｈ］＋）。溶媒を真空中で除去し、残渣をＤＣＭで２回共蒸発させた。残渣を乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解し、ＤｉＰＥＡ（１．７５ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（１．０９１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３時間撹拌した後、１Ｎ ＫＨＳＯ４（２５ｍＬ）を添加した。ＴＨＦを真空中で除去し、残留している水相をＥｔＯＡｃで抽出した。その後、有機層を１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン ３／７→１／１ ｖ／ｖ）で白色の発泡体として単離した。
【化２７】
【０１１１】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（Ｓ−アセチル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．３）
ＫＳＡｃ（１２２ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を、４．２（２４４ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を６５℃で３時間撹拌した後、溶媒を真空中で除去した。残渣をＥｔＯＡｃに再溶解し、塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン ３／７→１／１ ｖ／ｖ）で白色の発泡体として単離した。
【化２８】
【０１１２】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．４）
チオアセテート４．３（５９７ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をメタノール（１４ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ（１．３６ｍＬ）で３０分間、０℃で処理した。反応混合物を、等モル量のＨＯＡｃを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに再溶解し、１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して、粗チオールが油として得られた。別のフラスコにおいて、ＤＣＭ（２５ｍＬ）中ＭｓＣｌ（０．５３ｍＬ、６．８０ｍｍｏｌ）、２−メチル−２−プロパンチオール（０．７６７ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１．９０ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した後、粗チオール及びＥｔ３Ｎ（０．１９０ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物をさらに２時間撹拌した。次に、１Ｎ ＫＨＳＯ４（５０ｍＬ）を添加し、ＤＣＭを真空中で除去した。水性残渣をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ １／１ ｖ／ｖ）で白色の発泡体として単離した。
【化２９】
【０１１３】
Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．５）
２Ｎ ＬｉＯＨ（７．５ｍＬ）を４．４（２４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７．５ｍＬ）溶液に添加し、２時間激しく撹拌した後、ＴＨＦを真空中で除去した。水性残渣を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝４まで酸性にし、ＤＣＭで洗浄した。水層を２５ｍＬまで濃縮し、Ｅｔ３ＮでｐＨ ８．５にした。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２５２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で撹拌する一方、ｐＨを８から８．５の間に保った。３０分後、反応混合物を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝３に酸性にし、ＭｅＣＮを真空中で除去した。１Ｎ ＫＨＳＯ４（２５ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ→ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ ｖ／ｖ％）で白色の発泡体として単離した。
【化３０】
【０１１４】
（例５）：ガラクトシルブロミド修飾チオリシン構築ブロックの合成
【化３１】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−チオ−リシナト−ビシクロノニルボロン（１００ｍｇ、２５１μｍｏｌ）及びテトラ−Ｏ−アセチル−ガラクトシルブロミド（１８０ｍｇ、４４０μｍｏｌ、１．７５当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、５％Ｎａ２ＣＯ３（１０ｍＬ）を添加した。混合物を終夜撹拌した後、ＬＣ−ＭＳ分析によって、チオールは存在せず、チオグリコシドが生成されていることがわかった。反応をＥｔＯＡｃで希釈し、塩水及び飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮して、残渣を得、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ）で精製した。
【化３２】
（参考文献：Ｘ．Ｚｈｕ、Ｋ．Ｐａｃｈａｍｕｔｈｕ、Ｒ．Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅm．２００３年、６８巻、５６４１頁）
【０１１５】
（例６）：Ｆｍｏｃ−チオリシン構築ブロックを介した蛍光偏光アッセイ試薬の合成
【化３３】
【０１１６】
ＴＡＭＲＡ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（１．０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）に、ピペリジン：ＮＭＰ（２０：８０ ｖ／ｖ、５ｍＬ）を添加した。４５分間振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。この手順を繰り返し、続いてＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）及びＮＭＰで洗浄した。樹脂に、Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（メチルジスルファニル）−Ｌ−リシン（１９６．８ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２０６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１３８μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）、及びＮＭＰ（５ｍＬ）を添加した。樹脂を室温で終夜振盪し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で十分に洗浄し、最後にＥｔ２Ｏで洗浄した後、高真空下で乾燥した。Ｆｍｏｃ含有量の分光光度分析によって、チオリシン修飾樹脂では、含有量が１８ｍｍｏｌ／ｇ（収率＞９９％）であることがわかった。
【０１１７】
次に、樹脂（２５５ｍｇ、４５．９μｍｏｌ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＮＭＰ（５ｍＬ）中２０％ピペリジンで３回、５分間処理し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で徹底的に洗浄した。脱保護した樹脂に、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ、２３．７ｍｇ、５５．１μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２８．９ｍｇ、５５．１μｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１８μＬ、１０３μｍｏｌ）及びＮＭＰ（５ｍＬ）を添加した。終夜振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で素通り画分が無色になるまで洗浄した。次いで、樹脂をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／Ｐｒ３ＳｉＨ（９０／５／５、ｖ／ｖ／ｖ、４ｍＬ）で１時間処理した。溶液を溶離し、樹脂をＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／１、ｖ／ｖ）と、その後に続いてＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。素通り画分を濃縮し、高真空下で乾燥して、ＴＡＭＲＡ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ（２９．３ｍｇ、９２％、３ステップ）が紫色の油として得られた。
【化３４】
【０１１８】
スルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ
Ｈ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（１．０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）に、スルホローダミンＢ酸クロリド（３１．９ｍｇ、５５．３μｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１８μＬ、１０３μｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加した。１５分間振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で洗浄し、スルホローダミンＢ酸クロリド（１３．３ｍｇ、２３．０５μｍｏｌ）及びＤｉＰＥＡ（８μＬ、４６．１μｍｏｌ）で再び処理した。室温で終夜振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で素通り画分が無色になるまで洗浄した。ＴＦＡを用いた脱保護を、ＴＡＭＲＡコンジュゲートで記載されているように行うと、所望のスルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙが紫色の油（３３．０ｍｇ、８７％）として得られた。
【化３５】
【０１１９】
Ｕｂの５（６）−ＴＡＭＲＡ−及びスルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙへのコンジュゲーション
表２の反応混合物：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２（４ｍＭ）、５０ｍＭ ＭＥＳＮａ、２５μＭ Ｕｂ、２５〜５００μＭ ５（６）ＴＡＭＲＡ−又はスルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ、４ｍＭ ＡＴＰ、及び１００ｎＭ Ｅ１を３７℃で３時間インキュベートし、さらに４μＬのＡＴＰを加え、３７℃で終夜インキュベートした。ＬＣ−ＭＳ分析によって、すべての例において完全な連結が見られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と、その後に続くゲルの蛍光イメージング（ＰｒｏＸｐｒｅｓｓ ２Ｄ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって、染料のＵｂへのコンジュゲーションが確認された。
【表２】
【０１２０】
５（６）−ＴＡＭＲＡ−及びスルホローダミンＢ−チオリシン（Ｕｂ）−Ｇｌｙ−ＯＨの脱硫
粗反応混合物（１．８８ｍＬ、最終濃度１２．２μＭ）に、０．５Ｍ ＴＣＥＰ（１．８８ｍＬ、最終濃度０．２４Ｍ）及び１００μＬの０．２Ｍ ＶＡ−０４４溶液（最終濃度５．２ｍＭ）を添加した。反応を３７℃で終夜インキュベートし、その後、ＬＣ−ＭＳ分析によって、出発材料の完全な脱硫が見られた。反応混合物を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）で全量１５ｍＬまで希釈し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ装置（３ｋＤａカットオフ、４０００ｒｐｍで３０分）で濾過した。これを６回繰り返した後、無色の素通り画分を得、ＴＡＭＲＡ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨが存在していないことを示唆した。これは、ＬＣ−ＭＳ分析で確認された。脱硫生成物は全量で４．０ｍＬ回収し、最終濃度３．１３μＭに相当するものであった。
【化３６】
【０１２１】
この手順は、スルホローダミンＢコンジュゲートの場合と同一であり、同一の結果が得られた。
【化３７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾の分野に関する。特に、本発明は、前記ペプチド及びタンパク質用の構築ブロックとして使用することができる新規なチオリシン化合物及びセレノリシン化合物を提供する。このように含められるリシン残基は、その後に機能性剤とのコンジュゲーション用の標的部位として作用することができ、その機能性剤は、典型的には次いでチオリシン残基又はセレノリシン残基のεアミン又はαアミンに転移される。本発明は、選択されたペプチド配列又はタンパク質配列のこれらの部位選択的及び官能基選択的修飾プロセス、並びにこのようなプロセスのそれぞれのステップにおいて得られる中間体及び最終生成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の部位特異的共有結合的修飾は、生体系において極めて重要なプロセスである。酵素修飾（リン酸化、グリコシル化、硫酸化、アセチル化、メチル化、イソプレニル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化など）は、タンパク質局在化及び輸送、シグナル伝達、転写制御、並びに標的タンパク質の破壊を含めて、細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。タンパク質表面の天然修飾を再現することは、それらの機能を研究するのに貴重である。
【０００３】
フルオロフォア、アフィニティーラベル、スピンラベルプローブ、放射性ラベル及び他の（バイオ直交性）官能基などの「非天然」部分のタンパク質及びペプチドへの部位特異的共有結合的付加も、インビボ及びインビトロの両方において非常に多様な用途及びプロセスに有用であることがわかっている。
【０００４】
生体適合性合成有機化学の進歩につれて、連結成分の性質及び連結反応の選択について高い多様性が可能になり、成功の機会に満ちた全く新しい分野が開けてきている。化学的連結は、第１の化学成分の第２の化学成分との官能基選択的共有結合に伴って生じる。タンパク質又はペプチド及び第２の連結成分上に存在する独自の相互反応性官能基を使用して、連結反応を官能基選択的なものにすることができる。しかし、タンパク質又はペプチドを選択的に修飾する強固な方法の開発は、典型的なタンパク質に存在する官能基の種類及び数のため、依然としてかなり難題である。一般に、タンパク質を部位特異的に修飾して、コンジュゲートされた官能基とタンパク質又はペプチドの固有特性を最適に組み合わせることが求められ、又は必要とされている。したがって、このような修飾タンパク質への制御された選択的アクセスには、独自のバイオ直交性化学的ハンドル又は付着部位が、所望の分子のそれへの連結又はコンジュゲーションにしばしば必要とされる。
【０００５】
バイオコンジュゲートの生成方法の大半は、タンパク質表面のアミン（リシン側鎖及びＮ末端）又はチオール（システイン側鎖）の求核性を利用するものである。タンパク質の部位特異的修飾には、修飾部位を単一位置に限定するために、タンパク質のリシン残基全部が置換されている変異体又はシステイン残基の１つだけを除いて全部が置換されている変異体を設計することを含む方法が提案されてきた。
【０００６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−エステルなどの活性化された酸を使用して、アミンを標的とすることができる。しかし、タンパク質は、典型的には複数のアミンを含有し、さらにはタンパク質のアミノ末端のｐＫａがリシン側鎖に比べて低下しており、この標識は一般に非特異的である。この問題を克服するために、研究者らは、表面リシンをすべてなくすようにタンパク質標的を進化させるところまで行ってきた。研究者らは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）についてファージディスプレイ法による選択を行って、リシン欠損タンパク質を進化させ、Ｎ末端において残存する単一アミンの部位特異的ペグ化を可能にした。Ｎ末端だけに修飾を行って進化させたＴＮＦ−αは、ランダムに標識した野生型ＴＮＦ−αに比べて改善された安定性及び生物活性を有する。一般に、すべての部位の大部分において所与のタイプ（単数又は複数）のアミノ酸を置換する大規模なアミノ酸置換は、タンパク質活性の低下という欠点を伴うものであった。
【０００７】
アミン標識より、システイン標識は、チオール基がより求核性なので典型的には特異的であり、単一のシステインを、部位特異的突然変異誘発によって、タンパク質の機能に影響を及ぼすことなく導入することができる。突然変異誘発によって導入されたシステインは、チオールと優先的に反応する低分子結合マレイミド、α−ハロケトン、又は他の求電子性基で標識される。しかし、システインをベースとした方法単独では、２つのシステインの反応性が全く異なる場合を除いて、タンパク質に対する複数の修飾（蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析のために２つのフルオロフォアを導入するなど）を容易に行うことはできず、すべてのタンパク質標的が、機能を損なうことなくシステインの導入を可能にするとは限らない。
【０００８】
天然アミノ酸中に存在する追加の官能基を標的とする別の方法は、タンパク質修飾を行う化学者の道具箱に加えられた貴重なツールと考えられる。
【０００９】
Ｆｒａｎｃｉｓ及び同僚（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻、１０２５６頁）は、トリプトファン残基とチロシン残基の両方を特異的に標的とすることができる反応を特定した。ロジウムカルベノイドを使用して、トリプトファンのインドール官能基の（Ｎ−１又はＣ−２における）選択的修飾を実現することができる。ミオグロビン又はスブチリシング・カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｇ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）に（それぞれ、２つ及び１つの表面トリプトファンについて）適用すると、修飾はトリプトファン残基のみに収率約５０〜６０％で起こる。系では、有機試薬を可溶性にするための共溶媒が必要とされるが、この共溶媒（エチレングリコール）はタンパク質標的を変性させないことが期待される。化学のさらに重大な限界は、極度に低いｐＨ（１．５〜３．５）の要件であり、大部分のタンパク質の変性及びミオグロビンのヘム基の喪失を引き起こすものである。ミオグロビンを再構成する方法を用いれば、そのタンパク質の構造を回復することができるが、これらの極端な条件は多くの標的と適合しないであろう。しかし、結果が示唆することは、遷移金属錯体を、タンパク質における芳香族残基の特定のバイオコンジュゲーションに使用できる点である。
【００１０】
Ｆｒａｎｃｉｓ及び同僚（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻、１５９４２頁）は、アルデヒド及びアニリンをｐＨ ６．５で使用して、チロシンを選択的に標的とするマンニッヒ型反応についても記載している。フルオロフォアをアニリンに付着させることによって、タンパク質の活性を変更することなく、ローダミンのキモトリプシノゲンＡへのコンジュゲーションが実現される。様々なチロシンの相対的表面アクセシビリティーについては、特定のチロシン残基に対する選択性が考慮される。キモトリプシノゲンＡでは、３つの表面チロシンのうちの１つが優先的に標的とされる。
【００１１】
戦略の中には、非天然官能基を利用するものもある。このようなアミノ酸は、全合成、合成断片と生物学的に発現させた断片の連結である半合成、転移反応などを含めて様々な方法で導入することができる。これらの非天然バイオ直交性官能基の存在によって、天然アミノ酸側鎖基との偶発的な架橋反応又は他の反応が起こることなく、個々のターゲティングが可能になる。
【００１２】
例としては、バイオ直交性連結ハンドルとしてタンパク質におけるアジドの制御された導入が挙げられる。この点で有用であることがわかっている反応は、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓによって改良されたアルキンとアジドのＨｕｉｓｇｅｎ環化である。触媒量のＣｕ（Ｉ）の存在下で、この環化は官能基選択的に行われて、１，４−二置換トリアゾール環が生成する。一般的な生物学的官能基との交差反応性はアルキンにもアジドにも見られず、これらの基は両方とも、生物学的条件下で安定である。この反応は、細胞表面上のウイルス粒子及びタンパク質の修飾から低分子活性プローブでタグを付けた糖結合タンパク質及び細胞性タンパク質の同定まで様々な用途で使用されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記のことから明らかなように、選択的に修飾されたタンパク質が並外れて興味深いものであるにもかかわらず、現在利用可能な技法にはそれぞれ、特定の欠点がある。それに加えて、一般に使用可能で柔軟な方法が全く欠如している。したがって、選択的（バイオ直交性）連結ハンドルを形成するさらなる化学的戦略が、生物学に由来する方法を補完及び詳述するのに依然として必要とされている。本発明の目的は、このような戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、新規で一般に適用可能であり、特に高速で柔軟で経済的である、ペプチド及びタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾手法を提供する。本発明によれば、タンパク質又はペプチド合成において、ある種の新規なリシン化合物を構築ブロックとして使用し、部位選択的及び官能基選択的に修飾するための特定連結ハンドル（単数又は複数）を形成する。
【００１５】
特に、本発明は、ペプチド又はタンパク質の部位選択的及び官能基選択的修飾を行うための特定のチオリシン化合物及びセレノリシン化合物、特に化合物５−チオリシン（δ−チオリシンとも呼ばれる）及び４−チオリシン（γ−チオリシンとも呼ばれる）、並びに５−セレノリシン（δ−セレノリシンとも呼ばれる）及び４−セレノリシン（γ−セレノリシンとも呼ばれる）の使用を伴う。本発明のリシン化合物は、本明細書で説明するように、市販の構築ブロックから比較的少ない数の合成ステップで高収率で容易に合成される。
【００１６】
本リシン化合物の設計には、重要な２つの特徴がある。第１に、それぞれの炭素におけるチオール基又はセレノール基の位置決めによって、非常に効率的な分子内転移反応が起り得る。第２に、チオール基又はセレノール基は、報告された手順でその後に除去し、それによって本来のリシン構造を回復することができ、又は追加のコンジュゲーションハンドルとして使用することができる。この方法は高速であり、明確に定義された材料をもたらす。
【００１７】
リシンのε−アミン、又は適用できる場合にはα−アミンの近くにチオール残基又はセレノール残基が存在すると、非常に好ましいＳからＮ又はＳｅからＮへのエステル交換反応が可能になり、それによって、選択された機能性剤が、チオエステル化又はセレノエステル化を介してペプチド又はタンパク質に導入され、前記ε−アミン又はα−アミンに転移される。
【００１８】
実施例で極めて詳細に説明するように、本発明者らは、選択されたペプチド標的のユビキチン化における本発明のリシン構築ブロックの適用を実証した。全長ユビキチンチオエステル及び新たに開発されたアミノ酸５−チオリシンのＥ１媒介合成を使用することによって、本発明者らは、Ｈ２Ｂ、ＰＣＮＡ、ＰＴＥＮ及びｐ５３に基づいて、選択された標的ペプチドにおけるリシン残基の部位特異的ユビキチン化を実証した。この方法は、他の機能性剤又はリガンドにも容易に適応可能である。連結後、穏やかな脱硫条件の使用は、ペプチド若しくはタンパク質中に存在する他の構築ブロック又は選択された機能性剤の機能的完全性に影響を及ぼさない。
【００１９】
要約すれば、本発明は、ある種のリシン化合物、それらを合成する方法、並びにタンパク質又はペプチド合成における構築ブロック、典型的にはポリペプチド配列又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のためのバイオ直交性標的としてのそれらの使用に関する。本発明は、本リシン化合物を使用した、選択されたタンパク質配列又はペプチド配列を合成及び修飾する方法にも関する。さらに、本発明は、このような方法で得られた中間体及び最終生成物に関する。添付の特許請求の範囲で定義されている本発明の上記及び他の態様を、以下の説明及び実施例でさらに詳細に説明及び例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の態様は、式（Ｉａ）若しくは（Ｉｂ）で表されるリシン化合物：
【化１】
［式中、−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、（ｉ）水素又は（ｉｉ）アミン保護基を表し、−Ｐ３は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式−Ｘ−Ｒ６で表されるアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキルセレノ又はアルケニルセレノ基（式中、−Ｒ６は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す）；（ｉｉｉ）チオール又はセレノール保護基；或いは（ｉｖ）−Ｒ５部分又は（ｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される、共有結合したリガンドの残基を表し、−Ｒ７は、（ｉ）水素或いは（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す］、又は前記リシン化合物のエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物に関する。
【００２１】
上記の式において、−Ｘ−は硫黄又はセレンを表すことができる。チオリシン化合物及びセレノリシン化合物も同様の方式で得られ、使用することができる。それにもかかわらず、本発明の利点は、チオリシン化合物で最も顕著であることが明らかになった。したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、−Ｘ−が−Ｓ−を表す、以上に定義したリシン化合物に関する。
【００２２】
上記の式において、−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、水素又はアミン保護基を表すことができる。当業者に理解されるように、本発明は、リシン化合物を非保護、部分保護又は完全保護された形で提供する。ペプチド合成における化合物の使用では、典型的にはすべての官能基の保護が必要とされるようになるので、本発明の特に好ましい実施形態は、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の保護されたリシン化合物（式中、−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、選択されたアミン保護基を表す）に関する。
【００２３】
「アミン保護基」という用語は、アミン窒素原子に容易に付着し、アミン窒素に結合しているときに、得られる保護されたアミン基を化合物の他の部分に実施される反応条件に対して不活性にし、適切なときに、除去して、アミン基を再生することができる任意の有機部分を指す。このようなアミン保護基の例は当業者に公知であり、その例としては、ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリル、及びｐ−トルエンスルホニルなどのアシルタイプ；ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及び置換ベンジルオキシ−カルボニル、１−（ｐ−ビフェニル）−１−メチルエトキシ−カルボニル、及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの芳香族カルバメートタイプ；ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、エトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニルなどの脂肪族カルバメートタイプ；シクロペンチルオキシカルボニルやアダマンチルオキシカルボニルなどの環式アルキルカルバメートタイプ；トリチルやベンジルなどのアルキルタイプ；トリメチルシランなどのトリアルキルシラン；並びにフェニルチオカルボニルやジチアスクシノイルなどのチオール含有タイプが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明によるアミン保護基は、Ｃｂｚ；ｐ−メトキシベンジルカルボニル；Ｂｏｃ；Ｆｍｏｃ；ベンジル；ｐ−メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；ｐ−メトキシフェニル；トシル；スルホンアミド；アリルオキシカルボニル；トリチル及びメトキシトリチルからなる群から選択されるが、それらはすべて、アミン保護基として市販されており、当技術分野において周知である。広範囲に及ぶ用途のため、ペプチド合成におけるこれらの基の使用に関与する正確な化学作用は詳細に記述されており、当業者の共通一般知識の一部分である。アミン保護基及び保護されたアミン基については、例えばＣ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ及びＥ．Ｈａｓｌａｍ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７３年、３章及び４章にそれぞれ記載されており、またＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９１年、２章及び３章に記載されている。
【００２４】
上記の式において、−Ｐ３は、式−Ｘ−Ｒ６で表されるアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキルセレノ又はアルケニルセレノ基を表すことができ、−Ｒ６は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す。本明細書では、「場合によっては置換されている」という用語は、１種又は複数の置換基を含んでもよい、どんな種類のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニルでも包含することになっている。前記置換基は、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素、塩素、臭素、又はヨウ素など、１種又は複数のヘテロ原子を典型的には組み込むことができる。−Ｐ３が式−Ｘ−Ｒ６の部分を表すとき、当業者に理解されるように、典型的にはジスルフィド又はジセレニド化合物が与えられ、その形の場合、γ位又はδ位の官能基を効果的にブロック又は保護することができる。したがって、−Ｘ−Ｒ６部分が存在する場合その最小限の機能は、チオール又はセレノール部分を、例えばタンパク質又はペプチド合成時にブロックすることのみになるので、−Ｒ６の正確な構造はそれほど重要なものではない。好ましい実施形態において、−Ｒ６は、場合によっては置換されている低級アルキル又はアルケニル部分、より好ましくは場合によっては置換されているＣ１〜Ｃ４アルキル又は場合によっては置換されているＣ２〜Ｃ４アルケニル、最も好ましくはメチルスルフィドを表す。
【００２５】
さらに、上記の式において、−Ｐ３は、チオール保護基又はセレノール保護基を表すことができる。「チオール保護基」及び「セレノール保護基」という用語は、チオール硫黄原子又はセレン原子に容易に付着し、前記原子に結合しているときに、得られる保護された基を化合物の他の部分に実施される反応条件に対して不活性にし、適切なときに、除去して、チオール基又はセレノール基を再生することができる任意の有機部分を指す。このような保護基の好適な例は当業者に公知である。好ましくは、本発明による保護基は、ベンジル；４−メトキシベンジル；トリチル；メトキシトリチル；ｔ−ブチル；ｔ−ブチルチオール；メチルチオール；アセチル；３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル；アセトアミドメチル；Ｃｂｚ及び２−ニトロベンジルからなる群から選択される。チオール保護基の使用は、当技術分野において周知である。例えば、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９年）を参照のこと。
【００２６】
上記の式において、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、共有結合したリガンドの残基を表す。前記リガンドは、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される。好ましい実施形態において、前記リガンドはカルボキシル基を含み、それを介して、硫黄原子又はセレン原子に付着しており、その場合、−Ｐ３はアシルを表す。−Ｒ５は、リガンドと本リシン構築ブロックとの結合の性質に関してなんら制限のないリガンドを表すために本明細書で使用されることを理解されたい。したがって、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’はカルボキシル基を含有するリガンドのチオエステル又はセレノエステルを特に意味するために使用されるものであるが、−Ｒ５に包含される。以下でさらに詳細に説明されるように、アシル、すなわち式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を、リシン構築ブロックのε−アミン（又は、α−アミンの場合もある）に転移させることができる。リガンドの−Ｒ５残基がアシルでない場合、このような分子内転移は典型的には起こり得ない。というのは、その結合の反応性が低くなるからである。前記結合の反応性が低くなることの別の結果として、−Ｒ５がアシルを表さない場合にすでに存在している、本発明のリシン構築ブロックを使用して、ペプチドを好都合に合成することができる。ペプチドにおいて、リガンドがチオエステル又はセレノエステルとして組み込まれることができる場合、すなわちリガンドの前記残基がアシルである場合、ペプチドの合成後に連結を行うことがより好都合である。
【００２７】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）における−Ｒ５はアシル部分を表さない。すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’を除く部分を表し、好ましくは場合によっては置換されている第一級、第二級又は第三級の脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニルなどの第一級、第二級又は第三級の炭素構造を表し、チオエーテル又はセレノエーテル化合物が得られる。特に好ましい実施形態において、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）における−Ｒ５は、ガラクトースなどの炭水化物を表す。
【００２８】
本発明の文脈の範囲内で、「リガンド」という用語の意味はそういうものとして当業者に明白であろう。特に、本発明では、タンパク質又はペプチドの新規な部位選択的及び官能基選択的修飾方法を提供することが目的とされているので、前記用語は、例えばある目的で当技術分野において選択されたペプチド又はタンパク質へのコンジュゲーションが記載又は示唆されている任意の作用物質を包含することになっていることが明白であろう。リガンドの導入によって、典型的には前記ペプチド又はタンパク質の特定の機能性が導入又は影響される（したがって、「機能性剤」などと呼ばれることもある）。このようなリガンド又は機能性剤の特に好ましい例としては、染料、プローブ、ラベル、タグ、溶解性改変剤、酵素標的、受容体リガンド、免疫調節剤、補助因子、及び架橋剤が挙げられる。一実施形態において、リガンドは治療剤である。以下の実施例において、ある種のペプチドとユビキチン及びユビキチン様タンパク質との連結が開示される。上記の式において、−Ｒ７は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表すことができる。−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分の分子内転移の後に、このような基が存在すると、プロテアーゼでは加水分解することができない第三級ε−アミドが得られるようになる。これは、例えばリシン構築ブロックがペプチド又はタンパク質のユビキチン化のために組み込まれるとき、特定の利点をもたらす。本発明の特に好ましい実施形態において、上記の式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）において、−Ｒ７は、（ｉ）水素、或いは（ｉｉ）メチル又はエチルなどの低級アルキルなど、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状アルキルを表す。
【００２９】
当業者にはすぐに認知されるように、本発明のリシン化合物には、キラル中心が２個あり、したがって４個の潜在的立体異性体が考えられる。本発明は、異性体として純粋な任意の化合物、及び任意のラセミ混合物又は非ラセミ混合物（の使用）を包含する。本リシン化合物の対象とする用途を考慮すると、天然のＬ−アミノ酸立体配置が特に好ましい。したがって、本発明の実施形態は、本明細書の以上に定義するリシン化合物（ここで、α−炭素原子はＬ−立体配置をとる）に関する。
【００３０】
これらのチオリシン化合物のエステル、塩、水和物、溶媒和物及び他の誘導体も、本発明の範囲内である。したがって、このような誘導体はいずれも、本発明の範囲から逸脱することなく提供することができる。但し、タンパク質又はペプチド合成における構築ブロックとして使用して、前記使用に先立って主要な化学修飾を必要とすることなく、バイオ直交性連結ハンドルを形成するのにやはり適していることを条件とする。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態において、式（Ｉａ）によるリシン化合物［式中、−Ｘ−は硫黄を表し、−Ｐ１は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ２は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ３は、−Ｓ−ＣＨ３、トリチル又はメトキシトリチルを表し、Ｒ７は水素又はメチルを表す］、又はその塩、エステル、水和物、若しくは溶媒和物が得られる。
【００３２】
本発明の特に好ましい別の実施形態において、式（Ｉｂ）によるリシン化合物［式中、−Ｘ−は硫黄を表し、−Ｐ１は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ２は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、トリチル又はメトキシトリチルから選択されるアミン保護基を表し、−Ｐ３は、−Ｓ−ＣＨ３、トリチル又はメトキシトリチルを表し、Ｒ７は水素又はメチルを表す］、又はその塩、エステル、水和物、若しくは溶媒和物が得られる。
【００３３】
本発明の第２の態様は、本明細書で先に定義したリシン化合物の合成に関し、前記方法は、（ｉ）式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される４−ヒドロキシリシン又は５−ヒドロキシリシンを有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を生成し、それをその後にアミン保護基と反応させ、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）で表される保護された４−ヒドロキシリシン又は５−ヒドロキシリシンを生成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた化合物をメシル化し、それをその後に好適なチオカルボン酸又はセレノカルボン酸又はその塩若しくはエステルと反応させて、式（Ｖａ又はＶｂ）で表されるような対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られたチオエステル又はセレノエステルをアルカリ金属水酸化物の水溶液で加水分解し、チオール又はセレノール化合物を生成し、それをその後に本明細書で先に定義した−Ｐ３基を前記チオール基又はセレノール基に転移させることができる作用物質と反応させ、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）で表される化合物を生成するステップと、（ｉｖ）アミノ酸を保護している有機ボラン基を除去し、その後に化合物とアミン保護剤を場合によっては反応させて、本明細書で以上に定義した式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による化合物を得るステップとを含む。式（ＩＩＩａ−ＶＩａ）及び（ＩＩＩｂ−ＶＩｂ）において、−Ｘ−及び−Ｐ３は、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した意味と同じ意味を有する。前記式において、−Ｐ１は、以上に定義したアミン保護基を表す。
【化２】
【００３４】
化合物（ＩＩＩｂ）の４−ヒドロキシリシンは合成により得ることができる（Ｊ．Ｍａｒｉｎ、Ｃ．Ｄｉｄｉｅｒｊｅａｎ、Ａ．Ａｕｂｒｙ、Ｊ．Ｒ．Ｃａｓｉｍｉｒ、Ｊ．Ｐ．Ｂｒｉａｎｄ、Ｇ．Ｇｕｉｃｈａｒｄ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、６９巻、１３０頁）。化合物（ＩＩＩａ）の５−ヒドロキシリシンは、例えばＢａｃｈｅｍ又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。５−ヒドロキシリシンは、エナンチオマーとして純粋な形（すなわち、天然の２Ｓ／５Ｒの形）、及び考えられる４個の異性体の混合物（５Ｓ／Ｒ及びＤ／Ｌ）として利用可能である。すべての形を対応する保護されたリシン構築ブロックの合成において使用することができる。
【００３５】
上述の通り、合成は、好ましくは有機ボラン化合物を用いた処理によるα−アミノ酸基の同時保護で開始する。このような有機ボラン化合物の特に好ましい例は９−ボラビシクロボラン（９−ＢＢＮ）であり、機能性アミノ酸を保護するためのその使用が当技術分野で記述されている。典型的には、このような反応は、固体結晶質のヒドロキシリシンを９−ＢＢＮ又は他の有機ボランの好適な溶媒、例えば熱メタノール溶液に添加し、その後に不活性雰囲気下で還流することによって行われる。反応が終了した後、溶媒を典型的には蒸発させ、残渣を好適な溶媒に溶解し、アミン保護剤、例えば二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる。その後に、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）による化合物を、当業者には公知の適切な任意の方法、例えば抽出及びシリカゲル精製で単離及び精製することができる。
【００３６】
その後に、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物は、メシル化及びその後の好適なチオカルボン酸又はセレノカルボン酸又はその塩又はエステルとの反応により、対応する式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）のチオエステル又はセレノエステルに変換される。典型的には、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物を、好適な溶媒中でＭｓＣｌなどのメシレートと反応させることによって、まずメシル化する。メシル化された化合物を、当業者には公知の一般的な技法で単離及び精製することができる。次いで、メシル化された化合物を、好適な溶媒中で前記チオ酢酸若しくはセレノ酢酸又はその塩と反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得る。本発明の好ましい実施形態において、チオ酢酸若しくはセレノ酢酸又はその塩が使用される。反応が実質的に終了した後、一般的な単離及び／又は精製技法を用いて、反応生成物を高純度固体として得る。
【００３７】
次に、ＮａＯＨなどのアルカリ金属水酸化物の水溶液を用いて、チオエステル又はセレノエステルを加水分解すると、チオール又はセレノールが得られ、それを好適な溶媒中で、−Ｐ３基を前記チオール又はセレノールに転移させることができる作用物質と組み合わせて、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の化合物を生成することによって、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の任意の他の化合物に変換することができる。例えば、式（Ｖａ）で表されるチオエステルを、１Ｎ ＮａＯＨを用いて対応するチオールに変換することができ、その後に、溶液としてのそのチオールを滴下して、メタンチオスルホン酸Ｓ−メチル溶液と組み合わせて、式（ＶＩａ）の化合物（式中、−Ｘ−Ｐ３は−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３を表す）を生成する。
【００３８】
最後に、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の化合物を、典型的には好適な溶媒中、例えばエチレンジアミンのＴＨＦ溶液中、７０℃に加熱し、その後、化合物を好適なアミン保護基で処理することによって、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の化合物のアミノ酸を保護している有機ボラン部分を除去すると、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の保護された化合物が生成する。当業者に理解されるように、対応する非保護化合物は、アミン保護基と反応させる最後のステップを省略し、望むなら任意の他の保護基を除去することによって得ることができる。
【００３９】
本発明の代替実施形態において、上記の方法を、ヒドロキシリシンの代わりに対応するクロロリシン又はブロモリシンで始めることができ、中間体のメシル化の追加ステップを省略することができるという特定の利点がある。本方法のこの実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン又は５−ブロモリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を生成し、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン又は５−ブロモリシンを得るステップを含み、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）で得られた化合物と好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩を反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップを含み、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は本明細書で以上に記載された通りである。
【００４０】
上記の反応はすべて、異なる化合物の合成に関するものではあるが、それ自体当技術分野において公知なので、所望の化合物を可能な限り高収率で得るために上記ステップのそれぞれについて適切で且つ最適の反応条件を決定し、上記ステップ間に追加の単離又は精製技法を適用することは完全に、訓練を受けた専門家の技能の範囲内である。以下の実施例で、本発明のいくつかの化合物の合成について段階的に徹底した説明を記載する。
【００４１】
本発明は、本リシン化合物の合成において得られたいかなる中間生成物、特に上記の式（ＩＩＩａ−ＶＩａ）及び（ＩＩＩｂ−ＶＩｂ）で表される中間生成物にも関する。
【００４２】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）で表されるペプチド：
【化３】
［式中、
−Ｒ１は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した−Ｐ１；又は（ｉｉｉ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ１’は、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ２は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した−Ｐ２；（ｉｉｉ）Ｃ→Ｎポリペプチド鎖又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ３は、（ｉ）水素；（ｉｉ）式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した−Ｐ３；（ｉｉｉ）−Ｒ５部分；又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、−Ｒ４は、（ｉ）−ＯＨ又は（ｉｉ）Ｎ→Ｃポリペプチド鎖を表し、−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義した意味と同じ意味を有し、−Ｒ７は、（ｉ）水素又は（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す、但し、それぞれの式において、−Ｒ２及び−Ｒ４の少なくとも一方は、ポリペプチド鎖を表すことを条件とする。
【００４３】
本発明のペプチドは、実際に本発明のプロセスで得られたかどうかにかかわらず、好ましくは非天然ペプチドであり、非天然という用語は、自然に生じるペプチドは本発明の範囲内に含まれていないということを示すために用いられる。天然ペプチドとは本発明のリシン構築ブロックの存在及び／又は−Ｒ５基若しくは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’基の存在が異なるペプチドは、本明細書では非天然ペプチドを構成すると解釈され、したがって特許請求の範囲に包含されるものである。
【００４４】
当業者には明白であるように、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、及び（ＩＩｃ）による上記のペプチドは、−Ｒ１、−Ｒ２、−Ｒ３、及び−Ｒ４の特定の意味にもよるが、本発明のプロセス、すなわち上記のチオリシン又はセレノリシン構築ブロックの１種又は複数が組み込まれるペプチド又はタンパク質合成、及びその後のリガンドの共有結合による部位選択的及び官能基選択的修飾の中間体及び最終生成物を構成する。関連する反応経路の詳細については、本明細書で以下に記載する。
【００４５】
当業者に明らかであるように、本発明のペプチドのＮ→Ｃ骨格は、Ｒ２→Ｒ４鎖で表される。本発明の連結ハンドルを用いてペプチドに共有結合したリガンド又は機能性剤も、ペプチドとすることができ、したがって、いくつかの実施形態において、第２のペプチド鎖は、Ｒ２→Ｒ４鎖で表される主鎖に直角に付着して存在することができる。以下でさらに詳細に説明されるように、式（Ｉｂ）による本発明のリシン構築ブロックがＲ２→Ｒ４鎖のＮ末端のアミノ酸として組み込まれる場合、すなわち式（ＩＩｂ）におけるＲ２がペプチド鎖ではなく水素を表すとき、連結ハンドルによって、ε−アミン基ではなくα−アミン基における修飾リガンドの付着が促進され得る。その場合にリガンドもペプチドである場合、得られる「修飾された」ペプチドは、任意の別の修飾ステップにもよるが、単一ペプチド鎖を含む。このような連結生成物も本発明の範囲内である。但し、先に説明したように、それらが天然ペプチド又はタンパク質と同一でないことを条件とする。
【００４６】
本発明は、先に指摘したように、興味の対象となるペプチド又はタンパク質配列中に、部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを含む可能性を提供する。本発明の一実施形態によれば、連結ハンドルは、前記配列のＣ末端又はＮ末端にではなく興味の対象となるペプチド又はタンパク質配列内に位置することが特に好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態は、本明細書で先に定義した非天然ペプチドを提供する。式中、Ｒ２とＲ４は共に、ポリペプチド鎖を表す。しかし、好ましい別の実施形態によれば、本チオリシン又はセレノリシン連結ハンドルは、以下でさらに詳細に説明される理由でペプチドのＮ末端に位置することが好ましい。したがって、本発明の好ましい別の実施形態は、本明細書で先に定義した、好ましくは式（ＩＩｂ）による非天然ペプチドを提供する。式中、−Ｒ４はポリペプチド鎖を表し、−Ｒ２は−Ｐ２又は水素を表す。
【００４７】
当業者に理解されるように、前記連結ハンドルは、本発明のリシン構築ブロックを前記配列に加えることによって、又は前記配列に由来するアミノ酸残基を本発明のリシン構築ブロックの残基で置換すること、特に「天然」リシン残基を置換することによって、興味の対象となるペプチド又はタンパク質に組み込むことができる。
【００４８】
したがって、好ましい一実施形態において、本明細書で先に定義した非天然ペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されている。本発明の文脈において、「相補部分」（又は「相補断片」）という用語は、それぞれの部分（又は断片）が所与の方向で、連続した順序で組み合わせて、それぞれのアミノ酸配列を、典型的には前記部分又は断片間にギャップ又は重複領域なしに形成する又は含むことができることを示すのに使用される。
【００４９】
同様に好ましい別の実施形態において、本明細書で先に定義した非天然ペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片のアミノ酸配列中の選択された単一アミノ酸残基、好ましくはリシン残基に隣接するＣ→Ｎ及びＮ→Ｃポリペプチド部分を表すように選択されている。
【００５０】
前記天然ポリペプチド又はタンパク質の特定の選択は、当業者に認知されているように、本発明ではクリティカルではない。例えば、インビボ又はインビトロで自然の作用過程を研究及び／又は改変するための修飾が、当業者にとって興味の対象となり得るポリペプチド又はタンパク質であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、いずれでも使用することができる。以下の実施例において、本発明によるｐ５３、ＰＴＥＮ、ヒストンＨ２Ｂ、及びＰＣＮＡの修飾を開示する。
【００５１】
天然ポリペプチド又はタンパク質の機能性変種は、置換、挿入、欠失、Ｎ末端若しくはＣ末端の付加的アミノ酸、及び／又は付加的化学部分などのマイナーな修飾が前記天然ポリペプチド又はタンパク質と異なることがあるが、天然型の基本ポリペプチド及び側鎖構造、並びにある生物学的機能又は活性をインビトロ及び／又はインビボで誘発する能力を維持する。典型的には、デフォルトパラメータを使用して、ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴのプログラムなどにより最適にアライメントすると、天然ポリペプチド及びその同族体は、少なくともある一定の百分率の配列同一性を共有する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、一致数を最大にして、２つの配列をそれらの全長にわたってアライメントし、ギャップ数を最小にする。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップクリエーションペナルティー＝８及びギャップエクステンションペナルティー＝２で使用する。タンパク質について、デフォルトのスコアリング行列はＢｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ、１９９２年、８９巻、９１５頁）である。配列アラインメント及び配列同一性（％）スコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．（９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、９２１２１−３７５２、ＵＳＡ）から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用して決定することができる。或いは、類似性（％）又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースに対して検索することによって決定することができる。本明細書では「その機能性変種」は、興味の対象となる選択された上記天然ポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であり、適切な条件下で、依然としてその正常な機能を著しい程度に誘発することができるポリペプチド又はタンパク質を含むものであると理解される。
【００５２】
当業者に理解されるように、本発明に従って特に使用することができる修飾は、本発明によるものなどさらなる連結ハンドルを含めることを含む。特に好ましい実施形態において、−Ｒ２及び−Ｒ４のペプチド鎖の一方又は両方は、本発明の１種又は複数の追加のリシン構築ブロックを含む。さらにより好ましくは、反応性に差異がある連結ハンドルを形成する本発明の２個以上のリシン構築ブロックを含む、先に定義したペプチドが得られる。例えば、本発明の第１のリシン構築ブロック（式中、−Ｘ−は硫黄を表す）及び本発明の第２のリシン構築ブロック（式中、−Ｘ−はセレンを表す）を含むペプチドを生成することができる。別の実施形態において、本発明の第１のリシン構築ブロック及び第２のリシン構築ブロック（式中、−Ｘ−は同じでも異なってもよく、両方の構築ブロックにおける−Ｐ３基は異なる）を含むペプチドを生成することができる。２個を超える構築ブロックが含まれ、それぞれ、−Ｘ−及び−Ｐ３を好適に選択することにより反応性に差がある別の実施形態を記載する。当業者に理解されるように、このような実施形態に従って、２個以上の同一の構築ブロックを含めることも想定することができる。
【００５３】
「その機能性断片」という用語は、天然全長ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種の一部分であるペプチド断片を指す。但し、その一部分は、対応する全長配列の特徴である生物学的機能又は活性を誘発する能力を有することを条件とする。
【００５４】
上記の式（ＩＩａ〜ＩＩｃ）において、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）に関して本明細書で以上に定義し説明したように、共有結合したリガンドの残基を表す。
【００５５】
本発明の実施形態において、好ましいリガンドはユビキチン又はユビキチン様タンパク質である。ユビキチンコンジュゲーション又はユビキチン化は、すべての真核生物において自然に発生するプロセスであり、タンパク質安定性、細胞周期進行、転写調節、受容体輸送、及び免疫応答を含めて、多種多様でクリティカルな細胞プロセスに関係している。ユビキチン及びユビキチン様タンパク質は、約１００ａａポリペプチドである。現在までに、ＮＥＤＤ８、ＩＳＧ１５、ＦＵＢ１、ＦＡＴ１０、ＵＢＬ５、ＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３、ＵＦＭ１、ＭＬＰ３Ａ−ＬＣ３、ＡＴＧ１２、及びＵＲＭ１を含めて、異なる約１２種のユビキチン様タンパク質が同定されている。前記リガンドがユビキチンである上述したペプチド、又は前記ユビキチン様タンパク質の１つが特に好ましい。以下の実施例において、ある種のペプチドとユビキチン及びユビキチン様タンパク質との連結が開示される。ユビキチン及びユビキチン様タンパク質の機能及び構造に関するさらに詳細な情報については、Ｊｅｒａｍ及び同僚（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００９年、９２２〜９３４頁）を参照することができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
本発明の特に好ましい実施形態において、式（ＩＩａ）によるペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は両方とも、ポリペプチド鎖を表し、−Ｒ１及び−Ｒ３の少なくとも一方は、以上に定義した共有結合したリガンドの残基を表し、−Ｒ７は水素又はメチルを表し、−Ｘ−は硫黄を表す。
【００５７】
本発明の特に好ましい別の実施形態において、式（ＩＩｂ）によるペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は両方とも、ポリペプチド鎖を表し、−Ｒ１及び−Ｒ３の少なくとも一方は、以上に定義した共有結合したリガンドの残基を表し、−Ｒ７は水素又はメチルを表し、−Ｘ−は硫黄を表す。
【００５８】
本発明の特に好ましい別の実施形態において、式（ＩＩｃ）によるペプチドが得られる。式中、−Ｒ２及び−Ｒ４は両方とも、好ましくは天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されているポリペプチド鎖を表し、−Ｒ７は、水素又は低級アルキル、好ましくはメチルを表し、−Ｒ１’は、共有結合したユビキチン又はユビキチン様タンパク質の残基を表す。
【００５９】
本発明の第４の態様は、選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾方法であって、ｉ）前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列に、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による少なくとも１種のリシン化合物（式中、−Ｐ３は、水素、又は好ましくは本明細書で先に定義した保護基を表す）が付加又は置換により組み込まれる、前記選択された配列を化学的、生化学的又は生物学的に合成又は生成するステップと、ｉｉ）前記リシン化合物の残基中の−Ｐ３で表される基を除去し、式−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基（式中、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（ＩＩａ−ＩＩｃ）に関して定義したのと同じ意味を有する）と前記リシン化合物の残基を硫黄原子又はセレン原子においてコンジュゲートするステップとを含む方法に関する。
【００６０】
以上に説明したように、本発明の構築ブロックの特定の利点は、アシル部分−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’をチオール又はセレノール連結ハンドルからε−アミン、又は何らかの場合にはα−アミンに転移させる可能性にある。したがって、本発明の好ましい実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分が、リシン化合物の残基にコンジュゲートし、−Ｐ３基を置換して、対応するチオエステル又はセレノエステルを生成する、本明細書で先に定義した部位選択的及び官能基選択的修飾方法が提供され、方法は、その後に式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される前記基のα−アミン又はε−アミン基への分子内転移ステップｉｉｉ）を含む。
【００６１】
化学的ペプチド合成方法は、当業者に周知である。本発明によれば、ペプチドは、典型的には化学的に、好ましくは固相合成法で合成される。本発明によれば、配列全体が逐次延長によってのみ合成されているかどうかということ、又はプロセスが別々に得られた２種以上の断片の連結を伴うかどうかということはクリティカルではない。典型的には、配列長が１００アミノ酸を超える場合、別個の断片を生成し、断片縮合及び／又は化学的連結と呼ばれるプロセスによりそれらを連結するのが好ましいことがある。以下でさらに詳細に説明されるように、本発明は、ペプチド合成の目的で特に有利な化学的連結プロセスも提供する。或いは、本明細書に記載されているチオリシン化合物及びセレノリシン化合物は、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用してタンパク質に組み込むことができ、非天然チオリシン構築ブロックが、興味の対象となるタンパク質の遺伝子中のナンセンスコドン又は４塩基コドンに応答して組み込まれる。現在までに、この技術によって、約５０個の非天然アミノ酸の組込みが可能になった（Ｊ．Ｍ．Ｘｉｅ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００６年、７巻、７７５頁、並びに／又はＰ．Ｒ．Ｃｈｅｎ、Ｄ．Ｇｒｏｆｆ、Ｊ．Ｇｕｏ、Ｗ．Ｏｕ、Ｓ．Ｃｅｌｌｉｔｔｉ、Ｂ．Ｈ．Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ、及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９年、４８巻、４０５２頁を参照のこと）。このために、本発明のリシン構築ブロックが、α−アミン及びカルボン酸において非コンジュゲート形で、好ましくは非保護形で用いられていることは好ましい。
【００６２】
−Ｒ５基が、上記の場合によっては置換されている第一級、第二級又は第三級の脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニルを表す場合、コンジュゲーションは典型的には、非保護チオールを対応する化合物Ｌ−Ｒ５（ここで、Ｌは、ハロゲン原子又は良好な別の脱離基を表す）と反応させる、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成と呼ばれる反応を含む。
【００６３】
式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基は典型的には、対応する酸又はエステル、典型的には式Ｈ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるカルボン酸；式Ｈ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるチオカルボン酸；又は式Ｈ−Ｓｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるセレノカルボン酸；或いは前記酸のエステル又は塩と反応させることによって非保護チオール基又はセレノール基にコンジュゲートさせる。
【００６４】
或いは、本発明に従って−Ｒ５部分又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分を生成することができる選択されたリガンドの正確な性質に応じて、本方法は、化学的コンジュゲーションの代わりに酵素的コンジュゲーションを伴うことがある。場合によっては、これは、例えば特異性の増大及び／又は穏やかな反応条件のため好ましいことがある。所与の酵素的コンジュゲーションプロセスに好適な材料及び条件は、正確なリガンドによって決まり、一般に当技術分野において本質的に公知である。
【００６５】
式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基のε−アミン基への分子内転移は、以上に説明したように、当技術分野において本質的に公知である反応により前記アミン基の脱保護を必要とする。リガンドのＳからＮへの分子内転移は、標準化学も必要とする。典型的には、ＳからＮへの分子内転移はアミンの脱保護を行った後に化学的に好ましく、したがって好ましくは中性又は（わずかに）アルカリ性の環境において自然発生する。式（Ｉｂ）によるリシン構築ブロックをＮ末端のアミノ酸残基として使用した場合、転移反応は、特定のアミンの特定の保護／脱保護ステップを経て、α−アミン基又はε−アミン基に対して行うことができる。このために適した保護基及び反応条件を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６６】
式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基をリシン構築ブロックのアミンに転移させた後、非ブロック化したチオール基又はセレノール基は、本発明のリシン化合物の残基において再び利用可能である。この基を再び連結ハンドルとして使用して、−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される、最初の基と同じでも異なってもよい別の基を付着させて、対応するコンジュゲートを得ることができる。式（Ｉｂ）によるリシン構築ブロックをＮ末端のアミノ酸残基として使用し、第２のリガンドも−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表されるアシルである場合、第２の分子内転移、並びに望むならその後に−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される第３の部分（その他の部分と同じでも異なってもよい）とのコンジュゲート形成も利用することができる。或いは、チオール基又はセレノール基を、当業者には公知の反応物質及び条件によってリシン構築ブロックから除去することができる。
【００６７】
先に指摘したように、ペプチドの合成は、好ましくは固相基質上で行われ、前記基質に共有結合したペプチドが得られる。本方法のその後のステップのうち１つ又は複数は、前記固相基質からペプチドを遊離させる前又は後に行うことができる。本発明の実施形態において、リガンドのリシン構築ブロックへのコンジュゲーションも同様に、固相上で行われる。より好ましくは、チオール基又はセレノール基（単数又は複数）のコンジュゲーション、分子内転移又は除去とすることができる本発明の最終修飾ステップを行った後に、ペプチドを固相基質から遊離させる。この戦略によって、修飾されたタンパク質を高純度で直接得ることができ、潜在的にその後の一部又は全部の精製ステップを余分なものとする。或いは、本発明の方法は、例えばタンパク質をマイクロアレイ表面に直接合成することができるタンパク質（マイクロ）アレイの場合に発明のその後のステップの前又は後に固相基質から遊離させない固相合成に関することがある。
【００６８】
選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の正確な性質は、本発明では全くクリティカルでないが、本発明の好ましい実施形態は、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列が本明細書で以上に定義した天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片である、以上に定義した方法に関する。
【００６９】
さらに、好ましい実施形態において、前記部位選択的及び官能基選択的修飾方法はユビキチン化であり、又はユビキチン化を含む。したがって、本発明の好ましい実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分をリシン化合物の残基にコンジュゲートし、−Ｐ３基を置換し、前記−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分がユビキチン又はユビキチン様タンパク質である、以上に定義した方法が提供される。
【００７０】
本発明の第５の態様は、前記選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを形成するための本明細書で先に定義したリシン化合物の使用に関する。先に記載したように、本発明の実施形態は、ペプチドとすることができる機能性リガンドの機能性ペプチド又はタンパク質、典型的には本明細書で以上に定義した天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片への共有結合、典型的には直交性共有結合に関する。
【００７１】
しかし、本発明の別の態様は、すでに先に記載したように、一方の断片のＣ末端のカルボン酸基が他方の断片であるＮ末端のチオリシン又はセレノリシン構築ブロックのα−アミン基に付着している、あるペプチド断片の別のペプチド断片への線状結合のための、式（Ｉｂ）の本リシン構築ブロックの使用に関する。これは、ビルドポリペプチド鎖を別々に付着させて、（バイオ直交性）機能性リガンドを含んでも含まなくてもよい機能性ペプチド又はタンパク質を最終的に得ることが望ましい場合が多い、ある一定の長さを超えるペプチドの合成において特に有用な道具であることがわかった。
【００７２】
したがって、本発明の別の態様は、選択されたポリペプチド又はタンパク質配列を合成する方法であって、ｉ）Ｎ末端のアミノ酸残基として、式（Ｉｂ）によるリシン化合物（式中、−Ｐ３は本明細書で先に定義したアミン保護基を表す）が付加又は置換により組み込まれる、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の断片を合成するステップと、ｉｉ）前記断片において、−Ｐ３で表される基を、Ｃ−末端カルボキシル基を介して結合している、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の相補的ペプチド断片で置換するステップと、ｉｉｉ）前記相補的ペプチド断片をＮ末端のα−アミンに分子内転移させるステップとを含む方法に関する。
【００７３】
先に記載したように、このような方法によれば、分子内転移を行った後、チオール基又はセレノール基は、チオリシン又はセレノリシン残基において、上記の方法及び使用による機能性剤の部位選択的及び官能基選択的（直交性）連結のための連結ハンドルとして再び利用可能である。当業者に理解されるように、このような手法は、単一リシンブロックがペプチド及びタンパク質の合成及びその後の修飾において非常に効率的に使用されることを可能にし、したがって特に好ましい実施形態になる。或いは、望むなら、ペプチド断片の線状連結後に、チオール基又はセレノール基を除去することができる。
【００７４】
本発明の別の態様は、先に記載したことに従って、選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、個々のペプチド断片を線状共有結合させるための連結ハンドルを形成するための本明細書で先に定義したリシン化合物の使用に関する。
【００７５】
さらに、本発明の別の態様は、本明細書で先に定義した式（ＩＩａ−ＩＩｃ）のペプチド又はタンパク質の治療剤又は診断剤としての使用に関する。先に記載したように、官能基選択的及び部位選択的に修飾されたペプチドは、診断及び治療方法に適用され得る。例えば、ある種のタグ、プローブ又はマーカーで標識された内在性タンパク質及び／又はペプチドは、診断剤として有用な道具となり得る。さらに、（潜在的）治療剤又は診断剤と現在呼ばれるタンパク質を、例えば溶解性変更リガンドを含めることによってそれらの臨床成績が改善されるなどのように、本発明に従って修飾することができる。ペプチド性及び非ペプチド性の治療剤又は診断剤を特定の作用部位に仕向ける本発明の技法を使用して、前記剤を特定のタンパク質にリガンドとして連結させることができる。
【００７６】
本文書及びその特許請求の範囲において、「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、その単語に続くアイテムが包含され、具体的に記載されていないアイテムも排除されないことを意味するように、その非限定的意味において使用される。さらに、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、唯一の要素しかないことが文脈に明白に定められていない限り、１つを超える要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００７７】
本明細書で先に記載した本発明の様々な態様は、以下の例１〜３、及びその中で参照されている図１〜１２で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示す図である。
【図２】反応進行のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋約１７８ｎＭ Ｅ１＋２５μＭ Ｕｂ＋２ｍＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ、３７℃でインキュベーション。
【図３】ペプチド最小必要濃度（単位μＭ）のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋約７１ｎＭ Ｅ１＋２５μＭ Ｕｂ、３７℃で終夜インキュベーション。
【図４】Ｅ１最小必要濃度（単位ｎＭ）のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ＋２５μＭ Ｕｂ、３７℃で終夜インキュベーション。
【図５】ジスルフィド中間体をＴＣＥＰで処理した後の連結生成物形成のＥＳ＋スペクトルを示す図である。
【図６】ペプチド１〜３のユビキチン連結のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２％）による分析を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ；３７℃で終夜インキュベーション。１＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド１（ＤＭＦ、５％）＋１５０ｎＭ Ｅ１；２＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド１（ＤＭＳＯ、１０％）＋３００ｎＭ Ｅ１；３＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド１（ＤＭＦ、１０％）＋３００ｎＭ Ｅ１；４＝３３μＭ Ｕｂ＋４５μＭ ペプチド１（ＤＭＳＯ、１％）＋３００ｎＭ Ｅ１；５＝３３μＭ Ｕｂ＋４５μＭ ペプチド１（ＤＭＦ、１％）＋３００ｎＭ Ｅ１；６＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド２＋１５０ｎＭ Ｅ１；７＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド３＋３００ｎＭ Ｅ１；８＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド３＋１５０ｎＭ Ｅ１；９＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド３＋３００ｎＭ Ｅ１。１→＝連結生成物；２→＝Ｅ１、３→＝ペプチド（残基）。
【図７】ペプチド４、５及びＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫのユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ；３７℃で終夜インキュベーション。１０＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド４＋１５０ｎＭ Ｅ１；１１＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド４＋３００ｎＭ Ｅ１；１２＝５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ペプチド５＋１５０ｎＭ Ｅ１；１３＝５μＭ Ｕｂ＋５００μＭ ペプチド５＋３００ｎＭ Ｅ１；１４＝２５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ＋１５０ｎＭ Ｅ１；１５＝２５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ（ＤＭＳＯ、１．２５％）＋１５０ｎＭ Ｅ１；１６＝２５μＭ Ｕｂ＋２５０μＭ ＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫ（ＤＭＳＯ、１０％）＋１５０ｎＭ Ｅ１。１→＝連結生成物；３→＝ペプチド（残基）。
【図８】ペプチド１〜１０のユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）−パートＩＩを示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０ｎＭ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。１７＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１；２１＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド３；１８＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１；２２＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド３；１９＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド２；２０＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド２。１→＝連結生成物。
【図９】ペプチド１〜１０のユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）−パートＩＩを示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０ｎＭ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。２３＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド４ ２７＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド６；２４＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド４、２８＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド６；２５＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド５；２６＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド５。１→＝連結生成物。
【図１０】ペプチド１〜１０のユビキチン連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）−パートＩＩを示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋２５０ｎＭ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。２９＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド７、３３＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド９；３０＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド７、３４＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド９；３１＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド８、３５＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１０；３２＝５０μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド８、３６＝１００μＭ Ｕｂ＋５０μＭ ペプチド１０。１→＝連結生成物。
【図１１】ペプチド１〜１０（５０μＭ、１当量）のＳＵＭＯ−１連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋１００μＭ ＳＵＭＯ−１（ペプチドに基づいて２当量）＋２５０ｎＭ ＳＵＭＯ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。１→＝連結生成物。１）ｐ５３：ＨＬＫ＊ＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；２）ｐ５３：ＨＬＫＳＫ＊ＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；３）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫ＊ＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；４）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫ＊ＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；５）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫ＊ＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；６）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫ＊ＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；７）ＰＣＮＡ：ＧＤＡＶＶＩＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫＦＳＡＳＧＥＬＧＮＧＮＩＫＬＳＱ１８４（３．１８ｋＤａ）；８）ＰＣＮＡ：ＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫ１６８（１．０２ｋＤａ）；９）ＰＴＥＮ：ＭＴＡＩＩＫＥＩＶＳＲＮＫ＊ＲＲＹＱＥＤ（２．４３ｋＤａ）；１０）ＰＴＥＮ：ＴＳＥＫ＊ＶＥＮＧＳＬＣ＊ＤＱＥＩＤＳＩＣ＊ＳＩＥＲＡ（２．９８ｋＤａ）。
【図１２】ペプチド１〜１０（５０μＭ、１当量）のＳＵＭＯ−２連結（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。試薬及び条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５＋４ｍＭ ＭｇＣｌ２＋２ｍＭ ＡＴＰ＋５０ｍＭ ＭＥＳＮａ＋１００μＭ ＳＵＭＯ−２（ペプチドに基づいて２当量）＋２５０ｎＭ ＳＵＭＯ Ｅ１；３７℃で終夜インキュベーション。１→＝連結生成物。１）ｐ５３：ＨＬＫ＊ＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；２）ｐ５３：ＨＬＫＳＫ＊ＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；３）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫ＊ＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；４）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫ＊ＫＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；５）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫ＊ＬＭＦＫＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；６）ｐ５３：ＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫ＊ＴＥＧ（２．６４ｋＤａ）；７）ＰＣＮＡ：ＧＤＡＶＶＩＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫＦＳＡＳＧＥＬＧＮＧＮＩＫＬＳＱ１８４（３．１８ｋＤａ）；８）ＰＣＮＡ：ＳＣ＊ＡＫ＊ＤＧＶＫ１６８（１．０２ｋＤａ）；９）ＰＴＥＮ：ＭＴＡＩＩＫＥＩＶＳＲＮＫ＊ＲＲＹＱＥＤ（２．４３ｋＤａ）；１０）ＰＴＥＮ：ＴＳＥＫ＊ＶＥＮＧＳＬＣ＊ＤＱＥＩＤＳＩＣ＊ＳＩＥＲＡ（２．９８ｋＤａ）。
【図１３】ＣＦ４１ Ｃｒｙｏ−Ｃｏｍｐａｃｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ（７０℃）（１）及び光化学反応器用中圧Ｈｇランプ（４５０Ｗ）（２）を含む、Ｌ（＋）−リシンの光化学的塩素化に使用された実験装置を示す図である。
【実施例】
【００７９】
一般材料及び方法
一般試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ及びＡｃｒｏｓから入手し、精製をさらに行うことなく使用した。Ｈ−ＤＬ−δ−ヒドロキシ−ＤＬ−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＨＣｌはＢａｃｈｅｍから、（５Ｒ）−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン二塩酸塩一水和物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ユビキチンはＢＩＯＭＯＬから購入した。ＳＵＭＯタンパク質１及び２、ユビキチン用のＥ１（ＵＢＡ）、並びにＳＵＭＯ（ＡＯＳ１−ＳＡＥ２ダイマー）は、Ｐｒｏｆ．Ｔｉｔｉａ Ｓｉｘｍａのグループ（ＮＫＩ−ＡＶＬ）からの寄贈であった。Ｖ５０（２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ＶＡ−０４４（２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩）は、和光純薬工業（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）（日本）から購入した。溶媒は、ＢＩＯＳＯＬＶＥ及びＡｌｄｒｉｃｈから購入し、必要な場合はモレキュラーシーブ（ＤＣＭ、ＤＭＦについては４Å、ＭｅＯＨについては３Å）で終夜乾燥した。分析用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｆ２５４でプレコーティングしたアルミニウムシートで行い、エタノール中２０％ニンヒドリンを使用し、ヒートガンで加熱した。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（０．０３５〜０．０７０ｍｍ、９０Å、Ａｃｒｏｓ）で実施した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ及びＨＳＱＣ）は、別段の示唆のない限り、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ ４００分光計（１Ｈ：４００ＭＨｚ、１３Ｃ：１００ＭＨｚ）又はＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−ＩＩＩ ３００分光計（１Ｈ：３００ＭＨｚ、１３Ｃ：７５ＭＨｚ）を使用して、重水素化メタノール（ＭｅＯＤ−ｄ４、１Ｈ基準δ ４．８７ｐｐｍ；１３Ｃ基準δ ４９．１５ｐｐｍ）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３、１Ｈ基準δ ７．２６ｐｐｍ；１３Ｃ基準δ ７７．００ｐｐｍ）又は重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６、１Ｈ基準δ ２．５０ｐｐｍ；１３Ｃ基準δ ３９．５２ｐｐｍ）中、２９８Ｋで決定した。ＮＭＲスペクトルのピーク形状は、「ｄ」（二重線）、「ｄｄ」（二重二重線）、「ｓ」（一重線）、「ｂｒ ｓ」（ブロード一重線）、「ｔ」（三重線）及び「ｍ」（多重線）という記号で示される。化学シフト（δ）はｐｐｍの単位で示され、結合定数ＪはＨｚの単位で示される。ＬＣ−ＭＳ測定は、Ｗａｔｅｒｓ ２７９５分離モジュール（Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ）、Ｗａｔｅｒｓ ２９９６フォトダイオードアレイ検出器（１９０−７５０ｎｍ）、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８カラム（２．１ｘ１００ｍｍ）及びＬＣＴ（商標）垂直加速飛行時間型質量分析計を装備したシステムで行われた。２つの移動相：Ａ＝０．１％ギ酸水溶液及びＢ＝０．１％ギ酸水溶液中ＣＨ３ＣＮを使用して、試料を流速０．４０ｍｌ／分で流した。
【００８０】
ＬＣ−ＭＳプログラム１（Ｃ１８カラム）：
Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ Ｃ１８、２．１×１００ｍｍ、３μＭ）；流速＝０．４ｍＬ／分、ランタイム＝１０分、カラムＴ＝２０℃、ストローク容積＝２５μＬ；グラジエント：０．０→２．０分：５％ Ｂ；２．０→５．０分：５％ Ｂ→９５％ Ｂ；５．０→７．０分：９５％ Ｂ；７．０→７．２分：９５％ Ｂ→５％ Ｂ；７．２→９．９分：５％ Ｂ。
【００８１】
ＬＣ−ＭＳプログラム２（Ｃ４カラム）：
Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００、２．１×１００ｍｍ、３．５μＭ；流速＝０．４ｍＬ／分、ランタイム＝２４分、カラムＴ＝２０℃、ストローク容積＝２５μＬ；グラジエント：０．０〜２．０分：５％ Ｂ；２．０〜２０．０分：５％ Ｂ→９０％ Ｂ；２０．０〜２１．０分：９０％ Ｂ→９５％ Ｂ；２１．０〜２４．０分：９５％ Ｂ→５％ Ｂ。
【００８２】
ＨＰＬＣ（Ｃ４、ユビキチン由来化合物）：
Ｃ４ Ｖｙｄａｃカラムを使用したＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ／Ｔ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、カタログ番号２１４ＴＰ１０２２）。移動相：Ａ＝０．０５％ＴＦＡ水溶液、及びＢ＝０．０５％ＴＦＡ水溶液中ＣＨ３ＣＮ。カラムＴ＝２０℃。流速＝１０．０ｍＬ／分。ＬＣ−ＭＳプログラム２と同様のグラジエント。
【００８３】
（例１）：δ−チオリシン構築ブロックＤＬ−３．４及びＬ−３．４の合成
【化４】
【００８４】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシナト−ビシクロノニルボロン（ＤＬ−３．１）
アンモニア水溶液（５０ｍＬ）を、（５ＲＳ）−５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩（５ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。３０分間撹拌した後、溶液を濃縮し、結晶質固体を、さらに使用する前に高真空中で乾燥した。固体を、撹拌している９−ＢＢＮ（７．００ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）の熱メタノール（１００ｍＬ）溶液に１回で添加した。反応混合物を、清澄な溶液が得られるまで窒素下で（約３時間）還流した。溶媒を蒸発させた後、残渣を１，４−ジオキサン／水（１／１ ｖ／ｖ、５０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、ＮａＨＣＯ３（２．５ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（５．５ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）で処理した。終夜撹拌した後、反応混合物を濃縮し、塩水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮した後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；１／０→１／１→１／９）で精製した。表題化合物（Ｒｆ＝０．４、ＥｔＯＡｃ）が白色の発泡体として得られた。
【化５】
【００８５】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｒ−ヒドロキシ−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（Ｌ−３．１）
アンモニア水溶液（１０ｍＬ）を、（５Ｒ）−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン二塩酸塩一水和物（１．０４ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。３０分間撹拌した後、溶液を濃縮し、結晶質固体を、さらに使用する前に高真空中で乾燥した。固体を、撹拌している９−ＢＢＮ（１．２ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の熱メタノール（２０ｍＬ）溶液に１回で添加した。反応混合物を、清澄な溶液が得られるまで窒素下で（約３時間）還流した。溶媒を蒸発させた後、残渣を１，４−ジオキサン／水（２／３ ｖ／ｖ、３０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、ＮａＨＣＯ３（０．５ｇ）及びＢｏｃ２Ｏ（１．１ｇ）で処理した。終夜撹拌した後、反応混合物を濃縮し、塩水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥し、濃縮した後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；１／０→０／１）で精製した。表題化合物（Ｒｆ＝０．４、ＥｔＯＡｃ）が白色の発泡体として得られた。収率：１．３９ｇ、３．６３ｍｍｏｌ、２ステップ全体で８９％。４５．７ｍｍｏｌのスケールで、生成物を全収率８２％で得た（シリカゲルクロマトグラフィー、ＤＣＭ→１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。
【化６】
【００８６】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５ＳＲ−（Ｓ−アセチル）−ＤＬ−リシナト−ビシクロノニルボロン（ＤＬ−３．２）
ステップ１：０℃のＤＬ−３．１（０．９５ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７３０μＬ、５．２４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、ＭｓＣｌ（３２６μＬ、４．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を終夜撹拌したが、ＴＬＣ分析によって、反応が完結していないことが明らかになった。さらに０．５２ｍＬのＥｔ３Ｎ及び０．２３ｍＬのＭｓＣｌを添加した後、１時間以内で反応が完結したことがＴＬＣ分析によってわかった。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／１→１／４）で精製し、高真空下で乾燥した後、メシレート（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が発泡体として得られた。
【化７】
反応を２０ｍｍｏｌスケールでも行い、メシレートを＞９９％で５ＲＳ−δ−ヒドロキシ−ＤＬ−リシンから単離した。
【００８７】
ステップ２：チオ酢酸のＤＢＵ塩を使用する方法：冷却したＤＢＵ（５当量）の乾燥ＤＭＦ溶液（３．５Ｍ）にチオ酢酸（５当量）を添加することによって生成されるチオ酢酸ＤＢＵ塩溶液を予め生成し、メシレート（１．０当量、０．４５ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。反応を室温で終夜撹拌し、ＴＬＣ分析によって、出発材料が完全に消費され、ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／６でＲｆ ０．６で生成物スポットが生成したことがわかった。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物を酢酸エチルに溶解し、塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ １／３）で精製して、ＤＬ−３．２が発泡体として得られた。
【化８】
【００８８】
ステップ２：チオ酢酸カリウムを使用する方法：チオ酢酸カリウム（１．７５当量）を、メシレート（１．０当量、０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（７ｍＬ）溶液に添加した。反応を６５℃で２ １／２時間撹拌し、ＴＬＣ分析によって、出発材料が完全に消費され、生成物スポットが生成したことがわかった。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。
【化９】
【００８９】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（Ｓ−アセチル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（Ｌ−３．２）
ステップ１：０℃のＬ−３．１（１．３５ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７３０μＬ、５．２４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、ＭｓＣｌ（３２６μＬ、４．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１時間撹拌し、ＴＬＣ分析によって、反応が完結したことがわかった。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／１→１／３）で精製して、Ｌ−３．１（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が発泡体として得られた。
【化１０】
【００９０】
ステップ２：チオ酢酸のＤＢＵ塩を使用する方法：冷却したＤＢＵ（５当量）の乾燥ＤＭＦ溶液（３．５Ｍ）にチオ酢酸（５当量）を添加することによって生成されるチオ酢酸ＤＢＵ塩溶液を予め生成し、メシレート（１．０当量）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。反応を室温で終夜撹拌し、ＴＬＣ分析によって、出発材料の消費が不完全であることがわかった。さらに２．５当量の新鮮なＤＢＵＨＳＡｃを添加した。反応を終夜撹拌したままにした。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ １／３）で精製して、Ｌ−３．２が発泡体として得られた。
【化１１】
【００９１】
ステップ２：チオ酢酸カリウムを使用する方法：ＫＳＡｃ（１．７５当量、１０．９ｍｍｏｌ、１．２５ｇ）を、メシレート（１．０当量、２．８７ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（５８ｍＬ）溶液に添加した。反応を６５℃で３時間撹拌し、ＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳ分析によって、反応が完結したことがわかった。ＤＭＦを蒸発させ、濃縮物をＥｔＯＡｃに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。
【化１２】
【００９２】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−（メチルジスルファニル）−リシナト−ビシクロノニルボロン（ＤＬ−３．３）
チオアセテートＤＬ−３．２（１．００ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ溶液（３ｍＬ）で１５分間、０℃で処理した。反応混合物を、等モル量のＨＯＡｃを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、粗チオールが油として得られた。次に、粗チオールのＤＣＭ（７ｍＬ）溶液を、メタンチオールスルホン酸Ｓ−メチル（３当量、６．９ｍｍｏｌ、０．６６ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（９当量、２．７６ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を１時間撹拌し、その後、ＴＬＣ分析（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／３）によって、出発材料が完全に消費されたことがわかった。ＤＣＭを蒸発させた後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ ２／３）で精製して、ジスルフィドＤＬ−３．３（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が黄色の油として得られた。
【化１３】
【００９３】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（メチルジスルファニル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（Ｌ−３．３）
チオアセテートＬ−３．２（１．１３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ溶液（３ｍＬ）で１５分間、０℃で処理した。反応混合物を、等モル量のＨＯＡｃを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、粗チオールが油として得られた。
【化１４】
次に、粗チオールのＤＣＭ（７ｍＬ）溶液を、メタンチオールスルホン酸Ｓ−メチル（３当量、６．９ｍｍｏｌ、０．６６ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（９当量、２．７６ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を１時間撹拌し、その後、ＴＬＣ分析（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／３）によって、出発材料が完全に消費されたことがわかった。ＤＣＭを蒸発させた後、粗生成物をシリカゲル（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ ２／３）で精製して、ジスルフィドＬ−３．３（Ｒｆ＝０．８、ＥｔＯＡｃ）が油として得られた。
【化１５】
【００９４】
Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−（メチルジスルファニル）−ＤＬ−リシン（ＤＬ−３．４）
化合物ＤＬ−３．３（２．６ｇ、５．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、エチレンジアミン（３．０ｍＬ）を添加した。溶液を約７０℃に５分間加熱すると、白色の固体が沈殿した。反応混合物をＨｙｆｌｏ（登録商標）に通して濾過し、濾液をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中４０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）で精製した。遊離アミノ酸が油として得られた。
【化１６】
次に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２．５ｇ、７．４ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍＬ）溶液を、この粗アミノ酸及びＮａＨＣＯ３（０．５９ｇ、１．１当量）のアセトン／Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ／５０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、ＤＣＭで抽出した。水層をクロロホルム及びＥｔＯＡｃで再び抽出した。有機層を合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）で精製した。
【化１７】
【００９５】
Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（メチルジスルファニル）−Ｌ−リシン（Ｌ−３．４）
化合物Ｌ−３．３（１．１５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、エチレンジアミン（１．３ｍＬ）を添加した。溶液を約７０℃に５分間加熱すると、白色の固体が沈殿した。沈殿物は、Ｆａｌｃｏｎ管で遠心分離する（４０００ｒｐｍで１０分）又はＨｙｆｌｏ（登録商標）に通して濾過することによって除去した。濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中４０％ ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）で精製した。
【化１８】
次に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１．２５当量、０．６６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）のアセトン（１０ｍＬ）溶液を、このアミノ酸（０．５１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（１４５ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．１当量）のアセトン／Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ／１０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１０％ ＭｅＯＨ）で精製した。
【化１９】
【００９６】
（例２）：ＤＬ−３．４及び（ｏ−ニトロベンジル）−システインで修飾されたペプチドの固相合成
Ｓｙｒｏ ＩＩ ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ自動ペプチド合成装置で、標準的９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ−）をベースとした固相ペプチド化学により、２５又は５０μｍｏｌの単位で、ペプチドを合成した。前処置したＦｍｏｃアミノ酸Ｗａｎｇ樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）で始めて、連続するアミノ酸をそれぞれ、４モル過剰で、ｐｙＢＯＰ及びＤｉＰＥＡと４５分間カップリングさせた。Ｆｍｏｃ−基の脱保護は、ＮＭＰ中２０％ピペリジンで実現した（３×１．２ｍＬ、２×２及び１×５分）。ペプチドは、ＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９５／２．５／２．５）で切断され、冷ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル中で沈殿した。精製は、Ｗａｔｅｒｓ １５２５ＥＦ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣでＡｔｌａｎｔｉｓ（Ｗａｔｅｒｓ、１９×２５０ｍｍ、１０μＭ）分取カラムを使用して行った。
【化２０】
【化２１】
【表１】
【００９７】
（例３）：トレースレスリシン構築ブロックであるδ−チオリシンを使用したペプチドの部位選択的及び官能基選択的ユビキチン化
一般プロトコル ５−チオリシン修飾ペプチドのユビキチン連結
ストック溶液試薬：
２００ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．５Ｍ ＡＴＰ
２．０Ｍ ＭＥＳＮａ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中１０ｍｇｍＬユビキチン
７１μＭ Ｅ１及びミリＱ中７．１μＭ（第１ストックを１０倍希釈）
【００９８】
ストック溶液ペプチド：
【化２２】
【００９９】
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中の標準反応混合物：
４ｍＭ ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ ＭＥＳＮａ
ユビキチン
ペプチド
２ｍＭ ＡＴＰ
Ｅ１
【０１００】
反応を３７℃で＞６時間インキュベートし、試料をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（３倍、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、７１℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｖ＝２００Ｖ）を使用して、１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードする。マーカーとして、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（図１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１０１】
無金属脱硫のための一般プロトコル
０．５ｍＭペプチドのミリＱ（４００μＬ）溶液を、下記を使用して３７℃で終夜インキュベートした。
１００μＬの４０ｍＭグルタチオン溶液
８０μＬの０．２Ｍ ＶＡ−０４４又はＶ−５０溶液（以下の構造を参照のこと）
０．５Ｍ ＴＣＥＰを含有する、４００μＬの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．５）。
【化２３】
【０１０２】
チオリシン構築ブロックＤＬ−３．４で修飾されたＨ２Ｂ（１１５−１２５）ペプチドＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫについてのＵｂ連結
本明細書に記載されたチオリシン構築ブロックのペプチドのユビキチン化における効率を評価するために、Ｍｕｉｒ及び同僚によって使用されたペプチド（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００７年、４６巻、２８１４頁）であるＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫにおいて、ＤＬ−３．４を組み込むことを選択する。この配列は、ヒストン核タンパク質Ｈ２Ｂの残基１１５−１２５に対応し、イタリック体のＫ＊はチオリシン残基の位置を示す。さらに、天然アラニン残基を位置１１７において使用することに決定した。対照的に、Ｍｕｉｒ及び同僚（Ｎａｔｕｒｅ、２００８年、４５３巻、８１２頁）は、この代わりにシステインをチオールコンジュゲーションのための潜在的部位として使用した。Ｂａｌａｋｉｒｅｖ及び同僚によるプロトコル（ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ、２００６年、７巻、１６６７頁）に基づいて、本発明者らは１組の実験を行い、その間に、ユビキチンのペプチドへの完全な連結が何時間後に観察されたか（図２）、ペプチドの最少量（図３）及びＥ１濃度（図４）を決定した。連結反応混合物を３７℃でインキュベートし、以下の材料からなるものであった。
【化２４】
反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１０３】
図２〜４の結果から、Ｕｂ連結は高速であり（＜４時間で完全変換）、（この時間枠内での）ユビキチンの完全変換には低ｎＭ濃度のＥ１（≧１５ｎＭ）及び≧１０当量のペプチドを必要とすることがわかる。ＭＥＳＮａをＴＣＥＰの代わりに使用すると、連結は観察されなかったが、これは、ＭＥＳＮａチオエステルが反応性種であるというＢａｌａｋｉｒｅｖ及び同僚による以前の観察を支持するものである。予想されるように、５−チオリシン構築ブロックを（したがって、ペプチドＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫを使用する）天然リシンに代えると、連結が起きなかった。全体的に見て、チオリシンをベースとするペプチドの使用によって、非常に効率的で経済的なユビキチン連結が行われるということが確立した。ＬＣ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩの分析により、連結生成物が形成されたことがわかり、その質量は９．９３ｋＤａであり、これは、予想される連結生成物の非対称的ジスルフィド（質量９．７９ｋＤａ）とメルカプトエタンスルホン酸（０．１４ｋＤａ）に対応する。ＬＣ−ＭＳ試料をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）中０．５Ｍ ＴＣＥＰで調製すると、低減された連結生成物が認められた（図５）。（ＨＰＬＣ）精製した連結生成物試料を、熱に侵されやすいフリーラジカル開始剤ＶＡ−０４４及びＶ−５０の使用に基づく選択的チオール脱硫プロトコルにかけた。したがって、ＴＫＡＶＴＫ＊（Ｕｂ）ＹＴＳＳＫの水溶液を、グルタチオン（水素源）、ＶＡ−０４４又はＶ−５０及びＴＣＥＰと共にリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）中、３７℃で終夜インキュベートすると、ＬＣ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ分析により脱硫生成物が生成された。
【０１０４】
ＰＣＮＡ、ＰＴＥＮ及びｐ５３に由来するδ−チオリシンペプチドについてのＵｂ連結
その後に、構築ブロックＤＬ−３．４を、３種の生物学的に関連性のあるモノユビキチン化タンパク質に由来する１組のペプチド（表１）に組み込んだ。ペプチド１及び２はそれぞれ、ＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティー因子であるＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の残基１５５〜１８４及び１６１〜１６８に対応する。構築ブロックＤＬ−３．４（Ｋ＊）を、位置１６４において組み込んだ。それは、保存（酵母及び哺乳類）モノユビキチン化リシン残基である。ペプチド３及び４はそれぞれ、腫瘍抑制物質ＰＴＥＮ（染色体ＴＥＮに位置するホスファターゼ及びテンシン相同体）の残基１〜１９及び２８６〜３０９に対応する。ＤＬ−３．４を、ＰＴＥＮの２つの主要なモノユビキチン化部位であることがわかっている位置１３及び２８９に組み込み、その核内移行を制御した。４種のペプチド配列がすべて、システイン残基を含むとき、それがＳ−（ｏ−ニトロベンジル）システイン（Ｃ＊、表１）として組み込まれるように選択した。というのは、ニトロベンジル基は、連結条件と適合性があるはずであり、光分解により容易に除去されるからである。最後に、ＤＬ−３．４は、ｐ５３配列において、そのＣ末端の調節部分の残基３６５−３８９に対応して組み込まれた。Ｃ末端のｐ５３ペプチドが、ヒト変異ｐ５３癌細胞において放射線誘導アポトーシスを増強させることがわかったことを指摘するのは興味深い。この配列中の６種のリシン残基はすべて、ユビキチン化部位であることが公知なので、６種のペプチド１組を合成した。
【０１０５】
ペプチド２〜１０は、連結反応時に使用されるＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）緩衝液に可溶であることがわかった。しかし、ペプチド１は、ＤＭＦやＤＭＳＯなどの極性有機溶媒にのみ可溶であることがわかった。これは、このペプチドは、ほぼ５０％が疎水性アミノ酸で構成されており、３本のβストランドを天然ＰＣＮＡタンパク質中に含むので驚くべきことではない（支援情報を参照のこと）。過剰のペプチドとのユビキチン連結を行うこと（ｒｘｎ１〜３及び６〜１６、図６及び７）に加えて、（およそ）等モル量のユビキチン及びペプチドの使用（ｒｘｎ４、５、図６及び図８〜１０）によって、連結が可能になることも観察された。ペプチドを固体支持体に固定して固相ペプチドを合成するための本明細書で記載された連結方法を開発することができるためには、すべてのペプチドを完全に消費することが重要である。極性有機溶媒が反応条件と適合性があることを確認するために、Ｈ２ＢペプチドＴＫＡＶＴＫ＊ＹＴＳＳＫのユビキチン連結を、ペプチドのＤＭＳＯストックを使用して最終濃度１０％ＤＭＳＯになるまで繰り返した（ｒｘｎ１４〜１６、図７）。ｒｘｎ１〜５（図６）についてわかるように、ＤＭＳＯは、ユビキチン連結反応に対して負の効果を示さなかった。
【０１０６】
ユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌ）をコンジュゲートする本手法の普遍性を実証するために、２５０ｎＭ ＳＵＭＯ Ｅ１（Ａｏｓ１−ＳＡＥ２ダイマー）を使用して、ペプチド１〜１０（表１）とＳＵＭＯ−１（図１１）及びＳＵＭＯ−２（図１２）を連結することも行った。
【０１０７】
（例４）：γ−チオリシン構築ブロック４の合成
【化２５】
【０１０８】
γ−クロロ−Ｌ−リシン二塩酸塩（４．１）
４．１の合成は、図１３に示すような実験装置を使用して、Ｋｏｌｌｏｎｉｔｓｃｈら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６４年、８６巻、１８５７頁）に記載された文献の手順に従って行った。
【０１０９】
Ｌ（＋）−リシン一塩酸塩（１５０ｇ、８２１ｍｍｏｌ）のＨＣｌ（３６％）溶液に、塩素を７０℃でバブリングした。混合物を撹拌しながら、中圧水銀ランプで照射した。２時間後、反応混合物を７℃まで冷却し、種結晶を添加して、結晶化を誘導した。１時間後、得られた結晶を濾取し、粗生成物をＭｅＯＨで２回粉末にした。結晶を回収して、４．１が白色の固体として得られた。
【化２６】
【０１１０】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．２）
４．１（１．２７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）溶液に、撹拌しながらＤｉＰＥＡ（１．７５ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は混濁し、５分後に、９−ＢＢＮ（１．４０ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、窒素下で清澄な溶液が得られるまで、７０℃で加熱した（約２時間）。ＬＣ−ＭＳ分析によって、ボロネート化生成物への完全変換が確認された：Ｒｔ＝６．７３分（ＬＣ−ＭＳプログラム３）、ＭＳ ＥＳ＋（原子質量単位）：３００．９８［Ｍ＋Ｈ］＋）。溶媒を真空中で除去し、残渣をＤＣＭで２回共蒸発させた。残渣を乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解し、ＤｉＰＥＡ（１．７５ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（１．０９１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３時間撹拌した後、１Ｎ ＫＨＳＯ４（２５ｍＬ）を添加した。ＴＨＦを真空中で除去し、残留している水相をＥｔＯＡｃで抽出した。その後、有機層を１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン ３／７→１／１ ｖ／ｖ）で白色の発泡体として単離した。
【化２７】
【０１１１】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（Ｓ−アセチル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．３）
ＫＳＡｃ（１２２ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を、４．２（２４４ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を６５℃で３時間撹拌した後、溶媒を真空中で除去した。残渣をＥｔＯＡｃに再溶解し、塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン ３／７→１／１ ｖ／ｖ）で白色の発泡体として単離した。
【化２８】
【０１１２】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．４）
チオアセテート４．３（５９７ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をメタノール（１４ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ（１．３６ｍＬ）で３０分間、０℃で処理した。反応混合物を、等モル量のＨＯＡｃを添加することによって慎重に中和し、濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに再溶解し、１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して、粗チオールが油として得られた。別のフラスコにおいて、ＤＣＭ（２５ｍＬ）中ＭｓＣｌ（０．５３ｍＬ、６．８０ｍｍｏｌ）、２−メチル−２−プロパンチオール（０．７６７ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１．９０ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した後、粗チオール及びＥｔ３Ｎ（０．１９０ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物をさらに２時間撹拌した。次に、１Ｎ ＫＨＳＯ４（５０ｍＬ）を添加し、ＤＣＭを真空中で除去した。水性残渣をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ １／１ ｖ／ｖ）で白色の発泡体として単離した。
【化２９】
【０１１３】
Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−Ｌ−リシナト−ビシクロノニルボロン（４．５）
２Ｎ ＬｉＯＨ（７．５ｍＬ）を４．４（２４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７．５ｍＬ）溶液に添加し、２時間激しく撹拌した後、ＴＨＦを真空中で除去した。水性残渣を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝４まで酸性にし、ＤＣＭで洗浄した。水層を２５ｍＬまで濃縮し、Ｅｔ３ＮでｐＨ ８．５にした。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２５２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で撹拌する一方、ｐＨを８から８．５の間に保った。３０分後、反応混合物を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝３に酸性にし、ＭｅＣＮを真空中で除去した。１Ｎ ＫＨＳＯ４（２５ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を１Ｎ ＫＨＳＯ４及び塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ→ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ ｖ／ｖ％）で白色の発泡体として単離した。
【化３０】
【０１１４】
（例５）：ガラクトシルブロミド修飾チオリシン構築ブロックの合成
【化３１】
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−チオ−リシナト−ビシクロノニルボロン（１００ｍｇ、２５１μｍｏｌ）及びテトラ−Ｏ−アセチル−ガラクトシルブロミド（１８０ｍｇ、４４０μｍｏｌ、１．７５当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、５％Ｎａ２ＣＯ３（１０ｍＬ）を添加した。混合物を終夜撹拌した後、ＬＣ−ＭＳ分析によって、チオールは存在せず、チオグリコシドが生成されていることがわかった。反応をＥｔＯＡｃで希釈し、塩水及び飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮して、残渣を得、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン→ＥｔＯＡｃ）で精製した。
【化３２】
（参考文献：Ｘ．Ｚｈｕ、Ｋ．Ｐａｃｈａｍｕｔｈｕ、Ｒ．Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅm．２００３年、６８巻、５６４１頁）
【０１１５】
（例６）：Ｆｍｏｃ−チオリシン構築ブロックを介した蛍光偏光アッセイ試薬の合成
【化３３】
【０１１６】
ＴＡＭＲＡ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（１．０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）に、ピペリジン：ＮＭＰ（２０：８０ ｖ／ｖ、５ｍＬ）を添加した。４５分間振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。この手順を繰り返し、続いてＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）及びＮＭＰで洗浄した。樹脂に、Ｎε−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５Ｓ−（メチルジスルファニル）−Ｌ−リシン（１９６．８ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２０６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１３８μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）、及びＮＭＰ（５ｍＬ）を添加した。樹脂を室温で終夜振盪し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で十分に洗浄し、最後にＥｔ２Ｏで洗浄した後、高真空下で乾燥した。Ｆｍｏｃ含有量の分光光度分析によって、チオリシン修飾樹脂では、含有量が１８ｍｍｏｌ／ｇ（収率＞９９％）であることがわかった。
【０１１７】
次に、樹脂（２５５ｍｇ、４５．９μｍｏｌ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＮＭＰ（５ｍＬ）中２０％ピペリジンで３回、５分間処理し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で徹底的に洗浄した。脱保護した樹脂に、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ、２３．７ｍｇ、５５．１μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２８．９ｍｇ、５５．１μｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１８μＬ、１０３μｍｏｌ）及びＮＭＰ（５ｍＬ）を添加した。終夜振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で素通り画分が無色になるまで洗浄した。次いで、樹脂をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／Ｐｒ３ＳｉＨ（９０／５／５、ｖ／ｖ／ｖ、４ｍＬ）で１時間処理した。溶液を溶離し、樹脂をＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／１、ｖ／ｖ）と、その後に続いてＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。素通り画分を濃縮し、高真空下で乾燥して、ＴＡＭＲＡ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ（２９．３ｍｇ、９２％、３ステップ）が紫色の油として得られた。
【化３４】
【０１１８】
スルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ
Ｈ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（１．０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）に、スルホローダミンＢ酸クロリド（３１．９ｍｇ、５５．３μｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１８μＬ、１０３μｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加した。１５分間振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で洗浄し、スルホローダミンＢ酸クロリド（１３．３ｍｇ、２３．０５μｍｏｌ）及びＤｉＰＥＡ（８μＬ、４６．１μｍｏｌ）で再び処理した。室温で終夜振盪した後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＮＭＰ（１／１、ｖ／ｖ）で素通り画分が無色になるまで洗浄した。ＴＦＡを用いた脱保護を、ＴＡＭＲＡコンジュゲートで記載されているように行うと、所望のスルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙが紫色の油（３３．０ｍｇ、８７％）として得られた。
【化３５】
【０１１９】
Ｕｂの５（６）−ＴＡＭＲＡ−及びスルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙへのコンジュゲーション
表２の反応混合物：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２（４ｍＭ）、５０ｍＭ ＭＥＳＮａ、２５μＭ Ｕｂ、２５〜５００μＭ ５（６）ＴＡＭＲＡ−又はスルホローダミンＢ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨ、４ｍＭ ＡＴＰ、及び１００ｎＭ Ｅ１を３７℃で３時間インキュベートし、さらに４μＬのＡＴＰを加え、３７℃で終夜インキュベートした。ＬＣ−ＭＳ分析によって、すべての例において完全な連結が見られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と、その後に続くゲルの蛍光イメージング（ＰｒｏＸｐｒｅｓｓ ２Ｄ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって、染料のＵｂへのコンジュゲーションが確認された。
【表２】
【０１２０】
５（６）−ＴＡＭＲＡ−及びスルホローダミンＢ−チオリシン（Ｕｂ）−Ｇｌｙ−ＯＨの脱硫
粗反応混合物（１．８８ｍＬ、最終濃度１２．２μＭ）に、０．５Ｍ ＴＣＥＰ（１．８８ｍＬ、最終濃度０．２４Ｍ）及び１００μＬの０．２Ｍ ＶＡ−０４４溶液（最終濃度５．２ｍＭ）を添加した。反応を３７℃で終夜インキュベートし、その後、ＬＣ−ＭＳ分析によって、出発材料の完全な脱硫が見られた。反応混合物を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）で全量１５ｍＬまで希釈し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ装置（３ｋＤａカットオフ、４０００ｒｐｍで３０分）で濾過した。これを６回繰り返した後、無色の素通り画分を得、ＴＡＭＲＡ−チオリシン−Ｇｌｙ−ＯＨが存在していないことを示唆した。これは、ＬＣ−ＭＳ分析で確認された。脱硫生成物は全量で４．０ｍＬ回収し、最終濃度３．１３μＭに相当するものであった。
【化３６】
【０１２１】
この手順は、スルホローダミンＢコンジュゲートの場合と同一であり、同一の結果が得られた。
【化３７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表されるリシン化合物：
【化１】
［式中、
−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、
−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、（ｉ）水素又は（ｉｉ）アミン保護基、好ましくはカルボベンジルオキシ；ｐ−メトキシベンジルカルボニル；ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）；ベンジル；ｐ−メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；ｐ−メトキシフェニル；トシル；スルホンアミド；アリルオキシカルボニルトリチル及びメトキシトリチルからなる群から独立して選択されるアミン保護基を表し、
−Ｐ３は、（ｉ）水素、（ｉｉ）式−Ｘ−Ｒ６で表される基（式中、−Ｒ６は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す）；（ｉｉｉ）チオール又はセレノール保護基、好ましくはベンジル；４−メトキシベンジル；トリチル；メトキシトリチル；ｔ−ブチル；ｔ−ブチルチオール；アセチル；３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル；アセトアミドメチル；メタンチオール及び２−ニトロベンジルからなる群から選択されるチオール又はセレノール保護基；（ｉｖ）−Ｒ５部分又は（ｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される、共有結合リガンドの残基を表し、
−Ｒ７は、（ｉ）水素又は（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す］
又は前記リシン化合物のエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物。
【請求項２】
Ｘが硫黄を表す、請求項１に記載のリシン化合物、又はそのエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物。
【請求項３】
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される非天然ペプチド：
【化２】
［式中、
−Ｒ１は、（ｉ）水素、（ｉｉ）請求項１に記載の−Ｐ１、又は（ｉｉｉ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ２は、（ｉ）水素、（ｉｉ）請求項１に記載の−Ｐ２、（ｉｉｉ）Ｃ→Ｎポリペプチド鎖又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ３は、（ｉ）水素、（ｉｉ）請求項１に記載の−Ｐ３；（ｉｉｉ）−Ｒ５部分；又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ４は、（ｉ）−ＯＨ又は（ｉｉ）Ｎ→Ｃポリペプチド鎖を表し、
−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、
−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される共有結合リガンドの残基を表し、
−Ｒ７は、（ｉ）水素又は（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す、
但し、それぞれの式において、−Ｒ２及び−Ｒ４の少なくとも一方は、ポリペプチド鎖を表すことを条件とする］。
【請求項４】
前記リガンドが、染料、プローブ、ラベル、タグ、溶解性改変剤、酵素標的、受容体リガンド、免疫調節剤、補助因子、及び架橋剤からなる群から選択される機能性剤である、請求項３に記載の非天然ペプチド。
【請求項５】
Ｒ２及びＲ４が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されている、請求項３又は４に記載の非天然ペプチド。
【請求項６】
Ｒ２及びＲ４が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片のアミノ酸配列中の選択された単一アミノ酸残基、好ましくはリシン残基に隣接するＣ→Ｎ及びＮ→Ｃポリペプチド部分を表すように選択されている、請求項３又は４に記載の非天然ペプチド。
【請求項７】
−Ｒ４がポリペプチド鎖を表し、−Ｒ２が−Ｐ２又は水素を表す、請求項３又は４に記載の式（ＩＩｂ）による非天然ペプチド。
【請求項８】
治療剤又は診断剤として使用するための、請求項３から６までのいずれか一項に記載の非天然ペプチド。
【請求項９】
選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾方法であって、
ｉ）前記選択された配列に、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による少なくとも１種のリシン化合物（式中、−Ｐ３は水素又は請求項１に記載の保護基を表す）が付加又は置換により組み込まれる、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列を合成又は生成するステップと；
ｉｉ）前記リシン化合物の残基中の−Ｐ３で表される基を除去し、式−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基（式中、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（ＩＩａ−ＩＩｃ）に関して定義したのと同じ意味を有する）と、前記リシン化合物の残基を硫黄原子又はセレン原子においてコンジュゲートするステップと
を含む上記方法。
【請求項１０】
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分が、リシン化合物の残基にコンジュゲートし、−Ｐ３基を置換して、対応するチオエステル又はセレノエステルを生成し、前記方法は、その後に式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される前記基の−εアミン基への分子内転移ステップｉｉｉ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の生成が、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用してリシン化合物を組み込むことを含み、前記リシン化合物が、選択された配列をコードする遺伝子に含まれているナンセンスコドン又は４塩基コドンに応答して組み込まれる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片である、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択的修飾が、ユビキチン化を含み、又は構成する、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のリシン化合物の合成方法であって、
（ｉａ）４−ヒドロキシリシン又は５−ヒドロキシリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を得、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された４−ヒドロキシルシン又は５−ヒドロキシリシンを得るステップ；或いは
（ｉｂ）４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン、又は５−ブロモリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を得、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン、又は５−ブロモリシンを得るステップ；
（ｉｉａ）ステップ（ｉａ）で得られた化合物をメシル化し、それをその後に好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩と反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップ；或いは
（ｉｉｂ）ステップ（ｉｂ）で得られた化合物と好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩を反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉａ）又は（ｉｉｂ）で得られたチオエステル又はセレノエステルを、アルカリ金属水酸化物の水溶液で加水分解して、チオール又はセレノール化合物を得、それをその後に、請求項１に記載の−Ｐ３基を、チオール基又はセレノール基に転移させることができる作用物質と反応させるステップ；及び
（ｉｖ）アミノ酸を保護している有機ボラン基を除去し、場合によっては、その後に前記化合物とアミン保護剤を反応させて、本明細書で以上に定義した式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による化合物を得るステップ
を含む上記方法。
【請求項１５】
選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを形成するための、請求項１又は２に記載のリシン化合物の使用。
【請求項１】
式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表されるリシン化合物：
【化１】
［式中、
−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、
−Ｐ１及び−Ｐ２は、独立して、（ｉ）水素又は（ｉｉ）アミン保護基、好ましくはカルボベンジルオキシ；ｐ−メトキシベンジルカルボニル；ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）；ベンジル；ｐ−メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；ｐ−メトキシフェニル；トシル；スルホンアミド；アリルオキシカルボニルトリチル及びメトキシトリチルからなる群から独立して選択されるアミン保護基を表し、
−Ｐ３は、（ｉ）水素、（ｉｉ）式−Ｘ−Ｒ６で表される基（式中、−Ｒ６は、場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す）；（ｉｉｉ）チオール又はセレノール保護基、好ましくはベンジル；４−メトキシベンジル；トリチル；メトキシトリチル；ｔ−ブチル；ｔ−ブチルチオール；アセチル；３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル；アセトアミドメチル；メタンチオール及び２−ニトロベンジルからなる群から選択されるチオール又はセレノール保護基；（ｉｖ）−Ｒ５部分又は（ｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される、共有結合リガンドの残基を表し、
−Ｒ７は、（ｉ）水素又は（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す］
又は前記リシン化合物のエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物。
【請求項２】
Ｘが硫黄を表す、請求項１に記載のリシン化合物、又はそのエステル、塩、溶媒和物、若しくは水和物。
【請求項３】
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される非天然ペプチド：
【化２】
［式中、
−Ｒ１は、（ｉ）水素、（ｉｉ）請求項１に記載の−Ｐ１、又は（ｉｉｉ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ２は、（ｉ）水素、（ｉｉ）請求項１に記載の−Ｐ２、（ｉｉｉ）Ｃ→Ｎポリペプチド鎖又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ３は、（ｉ）水素、（ｉｉ）請求項１に記載の−Ｐ３；（ｉｉｉ）−Ｒ５部分；又は（ｉｖ）式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される部分を表し、
−Ｒ４は、（ｉ）−ＯＨ又は（ｉｉ）Ｎ→Ｃポリペプチド鎖を表し、
−Ｘ−は（ｉ）硫黄又は（ｉｉ）セレンを表し、
−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、好ましくはペプチド、脂質、炭水化物、ポリマー、有機剤及び無機剤からなる群から選択される共有結合リガンドの残基を表し、
−Ｒ７は、（ｉ）水素又は（ｉｉ）場合によっては置換されている分枝状又は直鎖状脂肪族又は環式のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル又はヘテロアルケニル部分を表す、
但し、それぞれの式において、−Ｒ２及び−Ｒ４の少なくとも一方は、ポリペプチド鎖を表すことを条件とする］。
【請求項４】
前記リガンドが、染料、プローブ、ラベル、タグ、溶解性改変剤、酵素標的、受容体リガンド、免疫調節剤、補助因子、及び架橋剤からなる群から選択される機能性剤である、請求項３に記載の非天然ペプチド。
【請求項５】
Ｒ２及びＲ４が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片の全アミノ酸配列の相補部分を含むように選択されている、請求項３又は４に記載の非天然ペプチド。
【請求項６】
Ｒ２及びＲ４が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片のアミノ酸配列中の選択された単一アミノ酸残基、好ましくはリシン残基に隣接するＣ→Ｎ及びＮ→Ｃポリペプチド部分を表すように選択されている、請求項３又は４に記載の非天然ペプチド。
【請求項７】
−Ｒ４がポリペプチド鎖を表し、−Ｒ２が−Ｐ２又は水素を表す、請求項３又は４に記載の式（ＩＩｂ）による非天然ペプチド。
【請求項８】
治療剤又は診断剤として使用するための、請求項３から６までのいずれか一項に記載の非天然ペプチド。
【請求項９】
選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾方法であって、
ｉ）前記選択された配列に、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による少なくとも１種のリシン化合物（式中、−Ｐ３は水素又は請求項１に記載の保護基を表す）が付加又は置換により組み込まれる、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列を合成又は生成するステップと；
ｉｉ）前記リシン化合物の残基中の−Ｐ３で表される基を除去し、式−Ｒ５又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される基（式中、−Ｒ５及び−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’は、式（ＩＩａ−ＩＩｃ）に関して定義したのと同じ意味を有する）と、前記リシン化合物の残基を硫黄原子又はセレン原子においてコンジュゲートするステップと
を含む上記方法。
【請求項１０】
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’部分が、リシン化合物の残基にコンジュゲートし、−Ｐ３基を置換して、対応するチオエステル又はセレノエステルを生成し、前記方法は、その後に式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５’で表される前記基の−εアミン基への分子内転移ステップｉｉｉ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の生成が、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用してリシン化合物を組み込むことを含み、前記リシン化合物が、選択された配列をコードする遺伝子に含まれているナンセンスコドン又は４塩基コドンに応答して組み込まれる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列が、天然ポリペプチド若しくはタンパク質又はその機能性変種若しくは断片である、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択的修飾が、ユビキチン化を含み、又は構成する、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のリシン化合物の合成方法であって、
（ｉａ）４−ヒドロキシリシン又は５−ヒドロキシリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を得、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された４−ヒドロキシルシン又は５−ヒドロキシリシンを得るステップ；或いは
（ｉｂ）４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン、又は５−ブロモリシン化合物を有機ボラン化合物で処理して、アミノ酸保護化合物を得、それをその後にアミン保護基と反応させて、保護された４−クロロリシン、５−クロロリシン、４−ブロモリシン、又は５−ブロモリシンを得るステップ；
（ｉｉａ）ステップ（ｉａ）で得られた化合物をメシル化し、それをその後に好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩と反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップ；或いは
（ｉｉｂ）ステップ（ｉｂ）で得られた化合物と好適なチオカルボン酸若しくはセレノカルボン酸又はその塩を反応させて、対応するチオエステル又はセレノエステルを得るステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉａ）又は（ｉｉｂ）で得られたチオエステル又はセレノエステルを、アルカリ金属水酸化物の水溶液で加水分解して、チオール又はセレノール化合物を得、それをその後に、請求項１に記載の−Ｐ３基を、チオール基又はセレノール基に転移させることができる作用物質と反応させるステップ；及び
（ｉｖ）アミノ酸を保護している有機ボラン基を除去し、場合によっては、その後に前記化合物とアミン保護剤を反応させて、本明細書で以上に定義した式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）による化合物を得るステップ
を含む上記方法。
【請求項１５】
選択されたペプチド又はタンパク質の合成における構築ブロックとして、前記選択されたポリペプチド又はタンパク質配列の部位選択的及び官能基選択的修飾のための連結ハンドルを形成するための、請求項１又は２に記載のリシン化合物の使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５２６８０５（Ｐ２０１２−５２６８０５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１０７６７（Ｐ２０１２−５１０７６７）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０２７７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３１９６２
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５１１２７５７７３）シュティクティング ヘト ネーデルランズ カンケル インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０２７７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３１９６２
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５１１２７５７７３）シュティクティング ヘト ネーデルランズ カンケル インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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