リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
【課題】植物への芳香性の付与または芳香性の改変に利用できる、新たな遺伝子、より詳細には、リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途を提供する。
【解決手段】ポリヌクレオチドは、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードする、特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドを植物体に導入することによって、前記植物体に芳香性を付与したり、または、前記植物体の芳香性を改変する。
【解決手段】ポリヌクレオチドは、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードする、特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドを植物体に導入することによって、前記植物体に芳香性を付与したり、または、前記植物体の芳香性を改変する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドに関し、さらに、これを用いた形質転換体、植物体の芳香性の改変方法および芳香性改変植物体の製造方法等の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
花において、香りは、色および形と並ぶ花の魅力の1つである。特に、野生種には、香りを有するものが多いが、品種改良の過程において、色、形、耐病性および日持ち等が優先された結果、その代償に、本来の香りが弱くなったものや、香りを失ったものも多く存在する。香りの感じ方および嗜好には、個人差があり、また、栽培による香りのバラつきも大きいことから、色や形に比べて特にその取り扱いが難しい。この理由から、これまで、色および形と比較して、芳香性品種の育種についての試みは、ほとんど報告されていない。
【０００３】
しかしながら、近年、ニーズの多様化に伴って、香りに対する理解および消費が高まってきており、香りは、生花における大きな魅力の一つとして捉えられている。また、香りは、人の感性にとって、重要な役割も有している。このような状況において、色、形および日持ち性に加えて、優れた芳香性を示す園芸植物は、高い商品価値を有することが期待され、その開発が望まれている。これまでに、ツバキやスイトピー、シクラメン等に関して、交雑育種による芳香性品種の開発が行われている。この場合、通常、片親には香りの強い野生種または比較的野生種に近い品種が使用されるが、これら野生種またはこれに近い品種は、一般に、園芸種に比べて花が小さく、花色も限られている。このため、得られる交雑種では、花の大きさが既存の品種よりも小さくなる傾向にあり、色のバリエーションも制限されるという問題があった。
【０００４】
他方、花の香りは、多種類の香気成分の混合物であり（非特許文献１）、前記香気成分は、大きく、芳香族化合物、テルペノイド、脂肪族化合物、含窒素化合物等に分類される。花は、例えば、含有される香気成分の違いだけなく、含有される香気成分が同じであっても、その割合によって、香りの質が大きく変化する。このように、様々な香気成分がブレンドされることで、多様な花の香りが生まれている。中でも、リナロールは、バラおよびスズラン等の甘いフローラルな香りを有する花の多くに含まれている。
【０００５】
また、これら植物の主要な香気成分であるリナロールは、花の香気成分としての利用に限定されず、例えば、これらの植物を原料とする食品、酒類等のフレーバーや、化粧品および香水に至る工業製品にまで、幅広く利用されている。
【０００６】
前記リナロールの生合成経路は、植物の場合、細胞質に存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路と、プラスチドに存在するメチルエリトリトール（ＭＥＰ）経路の２種類が知られている。前記メバロン酸経路では、アセチルＣｏＡが他の２分子のアセチルＣｏＡと反応し、還元されて生じるメバロン酸を介して、モノテルペンが合成される。具体的には、メバロン酸が脱炭酸して、イソペンテニルピロリン酸（以下、ＩＰＰと表す）およびジメチルアリルピロリン酸（以下、ＤＭＡＰＰと表す）となり、これら２つが、テルペノイド芳香性化合物の基本構造であるイソプレン骨格の起源となる。一方、メチルエリトリトール経路では、３−ホスホグリセルアルデヒドとピルビン酸から、脱炭酸および異性化を経て生じる２−メチル−エリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）を介して、ＩＰＰとＤＭＡＰＰが合成される。そして、ゲラニルピロリン酸合成酵素（以下、ＧＰＰＳと表す）の作用により、ＤＭＡＰＰに、一分子のＩＰＰが付加することで、ゲラニルピロリン酸（以下、ＧＰＰと表す）となり、ＧＰＰにリナロール合成酵素（以下、ＬＩＳと表す）等のモノテルペン合成酵素が作用し、リナロールが生成する。
【０００７】
前記ＬＩＳ遺伝子は、以下に示すように、これまでに多数の植物から取得されている。前記ＬＩＳ遺伝子は、例えば、Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ由来（Ｓ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献２)、アルテミシア由来（３Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献３)、オウシュウトウヒ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献４)、ラベンダー由来（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献５)、トマト由来（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献６)、キンギョソウ由来ＮＥＳ／ＬＩＳ遺伝子１，２（非特許文献７)、サルナシ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献８)、トラノオジソ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献９)、マタタビ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献１０)、シトカトウヒ由来ＬＩＳ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＨＱ４２６１６４．１)、カナダトウヒ由来ＬＩＳ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＨＱ４２６１５１．１）等がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｕｄａｒｅｖａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．．１８１−１８９， ２００８
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８， １１３７−１１４８， １９９６
【非特許文献３】Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３７２， １４３−１４９， １９９９
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １３５， １９０８−１９２７， ２００４
【非特許文献５】Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ４６５， ４１７−４２９， ２００７
【非特許文献６】Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． ｂｉｏｌ．， ６４， ２５１−２６３， ２００７
【非特許文献７】Ｐｌａｎｔ Ｊ， ５５， ２２４−２３９， ２００８
【非特許文献８】Ｆｕｎｃｔ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．， ３７， ２３２−２４３， ２０１０
【非特許文献９】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，７１，１０６８−１０７５，２０１０
【非特許文献１０】Ｆｕｎｃｔ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，３７，２３２−２４３，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、交雑育種によると、種々の問題が生じるため、優良な形質を維持したまま、芳香性の付与または改変を行うには、遺伝子組換え技術の適用が有用と考えられる。そこで、本発明は、植物への芳香性の付与または芳香性の改変に利用できる、新たな遺伝子、より詳細には、リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明のポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであることを特徴とする。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１１】
本発明の発現ベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターが導入された非ヒト宿主であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することを特徴とする。
【００１４】
本発明の加工品は、前記本発明の形質転換体、または、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織もしくは細胞の加工品であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の芳香性の改変方法は、非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明の芳香性非ヒト宿主の製造方法は、前記本発明の芳香性の改変方法により、非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明のタンパク質は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドによれば、遺伝子工学的手法によりリナロール合成酵素の発現が可能である。このため、前記本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物に導入して形質転換体を作製することで、前記形質転換体において、リナロール合成酵素が発現し、これによって香気成分であるリナロールの合成が可能となる。このため、本発明によれば、例えば、植物に芳香性を付与したり、その芳香性の改変を行うことができるため、生花等の園芸植物の栽培において、商品価値の高い園芸植物を提供できることから、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の実施例３における、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図２】図２は、本発明の実施例３における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図３】図３は、本発明の実施例３における、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図４】図４は、本発明の実施例４における、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図５】図５は、本発明の実施例４における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図６】図６は、本発明の実施例４における、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図７】図７は、本発明の実施例５における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図８】図８は、本発明の実施例５における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであることを特徴とする。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２１】
これらのポリヌクレオチドは、例えば、後述するように、フリージアおよびスイトピーより取得できる。これまで取得されたリナロール合成酵素遺伝子は、いずれも双子葉植物由来であり、単子葉植物由来のリナロール合成酵素遺伝子については、本発明により初めて明らかにされたものである。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードする。このため、例えば、前記ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることで、リナロール合成活性を有するタンパク質を製造できる。前記タンパク質の発現は、例えば、非ヒト宿主への導入によって行ってもよいし、いわゆる無細胞タンパク質合成系において行ってもよい。また、前記ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させ、発現した前記タンパク質のリナロール合成活性によって、リナロールを合成できる。前記リナロールは、例えば、前記発現したタンパク質を基質として含む反応系に添加して、合成することができ、また、前記非ヒト宿主に前記ポリヌクレオチドを導入し、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質の発現および発現した前記タンパク質によるリナロール合成を行うこともできる。前記非ヒト宿主内で前記リナロール合成を行うことによって、前記非ヒト宿主について、例えば、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等が可能となる。前記ポリヌクレオチドによって芳香性を改変する場合、後述するように、前記非ヒト宿主は、例えば、植物体またはその部分が好ましい。
【００２３】
本発明において、以下、リナロール合成活性をＬＩＳ活性という。本発明のポリヌクレオチドは、ＬＩＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることから、リナロール合成酵素遺伝子（以下、「ＬＩＳ遺伝子」ともいう）と表わすこともできる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、後述する本発明のタンパク質であり、ＬＩＳ活性を有することから、リナロール合成酵素（以下、「ＬＩＳ」または「ＬＩＳタンパク質」ともいう）と表わすこともできる。
【００２４】
前記ＬＩＳ活性は、基質からのリナロールの生成を触媒する活性である。前記基質は、特に制限されず、例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）があげられる。
【００２５】
前記ＬＩＳ活性により生成される前記リナロールは、例えば、他の酵素の働きや自動的な化学変換により、配糖体やアルデヒド体、ケトン体、エステル体等に変換できる。
【００２６】
リナロールは、３位に不斉炭素をもち、（３Ｓ）−リナロールと（３Ｒ）−リナロールとの１組の光学異性体が存在する。（３Ｓ）−リナロールは、例えば、プチグレイン、ラベンダー様香気を有し、（３Ｒ）−リナロールは、例えば、フローラル、ラベンダーおよびウッディ様香気を有する。特に、(３Ｒ)−リナロールは、(３Ｓ)−リナロールに比べて、におい閾値が約８０倍低いことから、微量でも香ることが知られている。このため、本発明において、前記リナロール合成活性は、例えば、（３Ｒ）−リナロール合成活性および（３Ｓ）−リナロール合成活性のいずれでもよく、また、両方でもよく、好ましくは、（３Ｒ）−リナロール合成活性である。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、例えば、ＬＩＳ活性のみを有してもよいし、さらに、その他の触媒機能を有してもよい。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。後者の場合、例えば、センス鎖として、前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドと、アンチセンス鎖として、前記ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを含む。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドから構成されるＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドから構成されるＲＮＡでもよい。後者の場合、例えば、ＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列、具体的には、塩基Ｔが塩基Ｕに置換された塩基配列からなるＲＮＡがあげられる。
【００３０】
前記（ａ）において、配列番号１および配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ）から得られ、具体的には、品種アラジン（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ ｃｖ． Ａｌａｄｄｉｎ）から得られる。配列番号１の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列であり、１〜２３４位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、２３５〜１７７９位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号１の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で表わされ、１〜７８位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、７９〜５９２位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド（ｃＴＰ）配列として存在する。また、配列番号３の塩基配列は、配列番号１において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号３の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４で表わされる。
【００３１】
ＦＡ２５遺伝子（ｓ＋：シグナルペプチドのコード配列を含む）
１７７９ｂｐ（配列番号１）
ATGGCTCTCTTGCCGTGTCTTCCATCTCAGTTTCCATGTTCTCCAGTAACAGGCTTCGTGCGATTGCCTCTTCTCTCTTCCCGTAGGTCATCCAAAGGAGTTCAAAGCTCTAACTATCGTTTTCGCTGTTGTATCAACACTGGAACTTCAGTGTCTCAGCCTTTGCGACGGGCGGCAAGCTATCCACAGAACATATGGGATGATAGCTACATTCAAGCACTCAATTGTGGCTACATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGAAGTGGGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTCTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGAGAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAGTCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCAGAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGAATGATATGGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCGGTGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACATCTGTCAGAGTCATTAGTGGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTTTAGGATGTCGAGGTTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTGCAGAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATTTGGGTCTTGGACAAAAACTGAGCTTTGCTAGAGACAGGTTGGTGGAGAATTACTTGTTTGTTATAGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATGGCAAAATAGGGAAGCAATGACAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAACTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAGCTTCCAGATTATATGAAGACATGCATTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCAACAAAATTATGTACTCGAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAGCGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACTGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTACTGTACAAGTGAGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTAGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACGTCAACGGCCGAAATGGAGAGGGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATGATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCCATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAATATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGACATCAAAAGAGGGAACAAGTCATCTCATTACTTTTTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２５タンパク質（ｓ＋：シグナルペプチドを含む）
５９２ａａ（配列番号２）
MALLPCLPSQFPCSPVTGFVRLPLLSSRRSSKGVQSSNYRFRCCINTGTSVSQPLRRAASYPQNIWDDSYIQALNCGYMGDEQVNEIRKLKEEVGQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMENDLKATSLVFRLLREHGFHASADIFNNFRENKGNFKSCLKNDMEGMINLYEASFFAVEGENQLDEARVFATEHLRHLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLWQNREAMTMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKTCIMALFNTTNLTANKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTSENITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDMIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQYEDGYGEQGHQKREQVISLLFEPIPL
【００３２】
ＦＡ２５遺伝子（ｓ−：シグナルペプチドのコード配列を含まない）
１５４５ｂｐ（配列番号３）
ATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGAAGTGGGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTCTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGAGAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAGTCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCAGAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGAATGATATGGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCGGTGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACATCTGTCAGAGTCATTAGTGGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTTTAGGATGTCGAGGTTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTGCAGAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATTTGGGTCTTGGACAAAAACTGAGCTTTGCTAGAGACAGGTTGGTGGAGAATTACTTGTTTGTTATAGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATGGCAAAATAGGGAAGCAATGACAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAACTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAGCTTCCAGATTATATGAAGACATGCATTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCAACAAAATTATGTACTCGAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAGCGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACTGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTACTGTACAAGTGAGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTAGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACGTCAACGGCCGAAATGGAGAGGGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATGATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCCATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAATATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGACATCAAAAGAGGGAACAAGTCATCTCATTACTTTTTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２５タンパク質（ｓ−：シグナルペプチドを含まない）
５１４ａａ（配列番号４）
MGDEQVNEIRKLKEEVGQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMENDLKATSLVFRLLREHGFHASADIFNNFRENKGNFKSCLKNDMEGMINLYEASFFAVEGENQLDEARVFATEHLRHLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLWQNREAMTMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKTCIMALFNTTNLTANKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTSENITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDMIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQYEDGYGEQGHQKREQVISLLFEPIPL
【００３３】
前記（ａ）において、配列番号５および配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ）から得られ、具体的には、品種アラジン（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ ｃｖ． Ａｌａｄｄｉｎ）から得られる。配列番号５の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列であり、１〜２３４位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、２３５〜１７７９位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号５の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６で表わされ、１〜７８位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、７９〜５９２位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド（ｃＴＰ）配列として存在する。また、配列番号７の塩基配列は、配列番号５において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号７の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８で表わされる。
【００３４】
ＦＡ２６遺伝子（ｓ＋：シグナルペプチドのコード配列を含む）
１７７９ｂｐ（配列番号５）
ATGGCTTTCTTGCCGTGTCTTCCATCTCAGTTTTCATGTTCTCCAGTAACGGGCTTCGTCCGATTGCCTCTTCTCTCTACCCGTAGGTCATCCCAAGGAGTTCAAAGCTCTAACTATCGTTTTCACTGTTGTATCAACACTGGAACTTCAGTGTCTCAGCCTTTGCGACGGACGGCAAGCTATCCACAGAACATATGGGATGATAGCTACATTCAAGCACTCAATTGTGGCTACATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGACGTGAGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTTTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGACAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAATCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCATAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGGATGATATAGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCCATGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACAATTGTCGGAGTCATTAGTAGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTGCATTTTAGGATGTCGAGGCTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTTCAAAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATCTGGGTCTTGGACAAAAGCTGAGCTTTGCTAGAGATAGGTTGGTGGAAAATTACTTGTTTGTTATTGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATCGCAAAATAGGGAAGCAATGGCAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAGCTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAACTTCCAGATTATATGAAGATATGCTTTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCTACAAAATTATGTACTCAAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAACGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACGGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTATTGTACAAATGGGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTCGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACCTCAACGGCCGAAATGGAGAGAGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATCATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCAATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAAAATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGAAATGAAAAAAGGAAACAAGTCATCTCATTACTTATTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２６タンパク質（ｓ＋：シグナルペプチドを含む）
５９２ａａ（配列番号６）
MAFLPCLPSQFSCSPVTGFVRLPLLSTRRSSQGVQSSNYRFHCCINTGTSVSQPLRRTASYPQNIWDDSYIQALNCGYMGDEQVNEIRKLKEDVRQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMDNDLKATSLIFRLLREHGFHASADIFNNFIENKGNFKSCLKDDIEGMINLYEASFFAMEGENQLDEARVFATEHLRQLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLSQNREAMAMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKICFMALFNTTNLTAYKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHNGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTNGNITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDIIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQNEDGYGEQGNEKRKQVISLLIEPIPL
【００３５】
ＦＡ２６遺伝子（ｓ−：シグナルペプチドのコード配列を含まない）
１５４５ｂｐ（配列番号７）
ATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGACGTGAGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTTTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGACAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAATCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCATAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGGATGATATAGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCCATGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACAATTGTCGGAGTCATTAGTAGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTGCATTTTAGGATGTCGAGGCTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTTCAAAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATCTGGGTCTTGGACAAAAGCTGAGCTTTGCTAGAGATAGGTTGGTGGAAAATTACTTGTTTGTTATTGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATCGCAAAATAGGGAAGCAATGGCAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAGCTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAACTTCCAGATTATATGAAGATATGCTTTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCTACAAAATTATGTACTCAAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAACGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACGGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTATTGTACAAATGGGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTCGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACCTCAACGGCCGAAATGGAGAGAGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATCATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCAATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAAAATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGAAATGAAAAAAGGAAACAAGTCATCTCATTACTTATTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２６タンパク質（ｓ−：シグナルペプチドを含まない）
５１４ａａ（配列番号８）
MGDEQVNEIRKLKEDVRQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMDNDLKATSLIFRLLREHGFHASADIFNNFIENKGNFKSCLKDDIEGMINLYEASFFAMEGENQLDEARVFATEHLRQLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLSQNREAMAMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKICFMALFNTTNLTAYKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHNGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTNGNITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDIIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQNEDGYGEQGNEKRKQVISLLIEPIPL
【００３６】
前記（ａ）において、配列番号９および配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、スイトピー（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｏｄｏｒａｔｕｓ）から得られ、具体的には、品種スイートスノー（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｏｄｏｒａｔｕｓ ｃｖ．Ｓｗｅｅｔ Ｓｎｏｗ）から得られる。配列番号９の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列であり、１〜２５２位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、２５３〜１６９２位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号９の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０で表わされ、１〜８４位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、８５〜５６３位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記スイトピーにおいては、クロロプラスト トランジット（ｃＴＰ）配列として存在する。また、配列番号１１の塩基配列は、配列番号９において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号１１の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２で表わされる。
【００３７】
ＳＳ１９遺伝子（ｓ＋：シグナルペプチドのコード配列を含む）
１６９２ｂｐ（配列番号９）
ATGGCTGTTACTTCTCAACTACGAGTTTCATATCTCACAAACTCAATTCCTCGTTGCAACTCTTGGACTTCTACGTATCACTCACGGAATTTGTCGCTTAAAACTTCAAATTCAAGGATGGTTCATATTAAGTCCATTGCTTTTAATGATAAGTTGCCACCTTTACAGAAAGTTGACAAGACAAGAAGTTTGGAGCAAGTCAAACGAAGAAGCCGAGACTCATTGTTAAATTCGAGTGATCCTATTGAAACGATGAAGATGATTGACTCAATCCAAGGGCTAGGAATTAGCCACCATTTGGAAGATGAGGTCAATATACAACTTGAGAGGATATGTGATTGGGATGCTTCTACAAACCTCTTTGCAACATCTCTTCAATTTCGTTTACTTAGGCATAATGGTTGGCCTACATGTTCTGACATATTCAGAGACTTCTTGGACAAAAGTGGCAATTTCAAAGAATCACTCGCCAAAGACATTTTTGGTATGTTGAGCCTATATGAGGCATCATATTTAGGGACAGAAGATGAAGAAATATTAAAGAAGGCCATGCAATTTTCTAAGGATCATTTAAATGAGTCAATCCCACACCTTAGTCCTGAAGTTGGTAAACATATTGATAGAGCTTTAACACTTCCAAAGCACCTAAGAATGGCAAGGTTAGAAGCTAGAAACTACATGGATGAATATAGACATGCAAGTAAGCAAATACCAGCTCTTTGGGAATTGGCAAAGTTAGACAATGACATGATTCAATCACTACATCAGACAGAATTAAGAGAAATATGCAGGTGGTGGAAAGAGTTGGGACTTGTGGAAAAACTAAGTTTTGCCAGAGATAGACCAACAGAGTGCTTCTTATGGACAGTTGGAATTTTTCCAGAACCATGTTATACAAATTGTCGAATCGAACTTACAAAAACTATATGCATTTTGGATGTTATTGATGACATCTTTGACAATTACGGCACATTAGATGAACTTATTCTTTTCACAAATGCAATCAAAAGGTGGGACCTTGATTCAATGGAGCAACTTCCTGAGTATATGAAGATATGTTACATGGCATTATATAACACCACAAATGAAATTTCCTATAAAATTCAAACAGTGCATGGGATAAATGGTCTTTCATACTTAAAAAGAACATGGATGGACATGTTTGATGCATATTTGGAAGAAGCGAAATGGTTCAATAGTGGATATGTGCCAAGTTTTAGGACATATTTGGATAATGGAACAATTTCTGTTGGATCATGCATGGCTATGGTGCATGCTACTTTCCTCATTGGTAATGGTTTATCAAAGGAAACTATTTCCATGATGAGGCCATATCCTAGACTCTTCACTTGTACCGGAGAAATTCTTCGATTATGGGATGACTTAGGAACATCAACGGAGGAACGTGAAAGAGGGGATAATGCTTCTAGCATAGAATGCTTGATGGAAGAGAATAATATTTTGGATGAAAATGAGAGTAGGAAACACATAAGACTGTTAATAAGGAACTTGTGGCGAGAACTCAATGGCCTTGCCATGAACAAAACCATGCCATTGTCTGTTGTTAAATCTTCTCTTAACATGGCTAGAACTGCTCAAGTTATTTATCAACATGGAGATGATCAAAGCACTTTTACTGTTGATGATTATGTGCAAACACTGATTTTCTCATCATTACCCACTAGCCATTAA
ＳＳ１９タンパク質（ｓ＋：シグナルペプチドを含む）
５６３ａａ（配列番号１０）
MAVTSQLRVSYLTNSIPRCNSWTSTYHSRNLSLKTSNSRMVHIKSIAFNDKLPPLQKVDKTRSLEQVKRRSRDSLLNSSDPIETMKMIDSIQGLGISHHLEDEVNIQLERICDWDASTNLFATSLQFRLLRHNGWPTCSDIFRDFLDKSGNFKESLAKDIFGMLSLYEASYLGTEDEEILKKAMQFSKDHLNESIPHLSPEVGKHIDRALTLPKHLRMARLEARNYMDEYRHASKQIPALWELAKLDNDMIQSLHQTELREICRWWKELGLVEKLSFARDRPTECFLWTVGIFPEPCYTNCRIELTKTICILDVIDDIFDNYGTLDELILFTNAIKRWDLDSMEQLPEYMKICYMALYNTTNEISYKIQTVHGINGLSYLKRTWMDMFDAYLEEAKWFNSGYVPSFRTYLDNGTISVGSCMAMVHATFLIGNGLSKETISMMRPYPRLFTCTGEILRLWDDLGTSTEERERGDNASSIECLMEENNILDENESRKHIRLLIRNLWRELNGLAMNKTMPLSVVKSSLNMARTAQVIYQHGDDQSTFTVDDYVQTLIFSSLPTSH
【００３８】
ＳＳ１９遺伝子（ｓ−：シグナルペプチドのコード配列を含まない）
１４４０ｂｐ（配列番号１１）
ATGAAGATGATTGACTCAATCCAAGGGCTAGGAATTAGCCACCATTTGGAAGATGAGGTCAATATACAACTTGAGAGGATATGTGATTGGGATGCTTCTACAAACCTCTTTGCAACATCTCTTCAATTTCGTTTACTTAGGCATAATGGTTGGCCTACATGTTCTGACATATTCAGAGACTTCTTGGACAAAAGTGGCAATTTCAAAGAATCACTCGCCAAAGACATTTTTGGTATGTTGAGCCTATATGAGGCATCATATTTAGGGACAGAAGATGAAGAAATATTAAAGAAGGCCATGCAATTTTCTAAGGATCATTTAAATGAGTCAATCCCACACCTTAGTCCTGAAGTTGGTAAACATATTGATAGAGCTTTAACACTTCCAAAGCACCTAAGAATGGCAAGGTTAGAAGCTAGAAACTACATGGATGAATATAGACATGCAAGTAAGCAAATACCAGCTCTTTGGGAATTGGCAAAGTTAGACAATGACATGATTCAATCACTACATCAGACAGAATTAAGAGAAATATGCAGGTGGTGGAAAGAGTTGGGACTTGTGGAAAAACTAAGTTTTGCCAGAGATAGACCAACAGAGTGCTTCTTATGGACAGTTGGAATTTTTCCAGAACCATGTTATACAAATTGTCGAATCGAACTTACAAAAACTATATGCATTTTGGATGTTATTGATGACATCTTTGACAATTACGGCACATTAGATGAACTTATTCTTTTCACAAATGCAATCAAAAGGTGGGACCTTGATTCAATGGAGCAACTTCCTGAGTATATGAAGATATGTTACATGGCATTATATAACACCACAAATGAAATTTCCTATAAAATTCAAACAGTGCATGGGATAAATGGTCTTTCATACTTAAAAAGAACATGGATGGACATGTTTGATGCATATTTGGAAGAAGCGAAATGGTTCAATAGTGGATATGTGCCAAGTTTTAGGACATATTTGGATAATGGAACAATTTCTGTTGGATCATGCATGGCTATGGTGCATGCTACTTTCCTCATTGGTAATGGTTTATCAAAGGAAACTATTTCCATGATGAGGCCATATCCTAGACTCTTCACTTGTACCGGAGAAATTCTTCGATTATGGGATGACTTAGGAACATCAACGGAGGAACGTGAAAGAGGGGATAATGCTTCTAGCATAGAATGCTTGATGGAAGAGAATAATATTTTGGATGAAAATGAGAGTAGGAAACACATAAGACTGTTAATAAGGAACTTGTGGCGAGAACTCAATGGCCTTGCCATGAACAAAACCATGCCATTGTCTGTTGTTAAATCTTCTCTTAACATGGCTAGAACTGCTCAAGTTATTTATCAACATGGAGATGATCAAAGCACTTTTACTGTTGATGATTATGTGCAAACACTGATTTTCTCATCATTACCCACTAGCCATTAA
ＳＳ１９タンパク質（ｓ−：シグナルペプチドを含まない）
４７９ａａ（配列番号１２）
MKMIDSIQGLGISHHLEDEVNIQLERICDWDASTNLFATSLQFRLLRHNGWPTCSDIFRDFLDKSGNFKESLAKDIFGMLSLYEASYLGTEDEEILKKAMQFSKDHLNESIPHLSPEVGKHIDRALTLPKHLRMARLEARNYMDEYRHASKQIPALWELAKLDNDMIQSLHQTELREICRWWKELGLVEKLSFARDRPTECFLWTVGIFPEPCYTNCRIELTKTICILDVIDDIFDNYGTLDELILFTNAIKRWDLDSMEQLPEYMKICYMALYNTTNEISYKIQTVHGINGLSYLKRTWMDMFDAYLEEAKWFNSGYVPSFRTYLDNGTISVGSCMAMVHATFLIGNGLSKETISMMRPYPRLFTCTGEILRLWDDLGTSTEERERGDNASSIECLMEENNILDENESRKHIRLLIRNLWRELNGLAMNKTMPLSVVKSSLNMARTAQVIYQHGDDQSTFTVDDYVQTLIFSSLPTSH
【００３９】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、塩基は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換および／または付加されてもよい。付加は、例えば、配列内への挿入の意味も含む。本発明において、塩基数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３個」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００４０】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００４１】
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイ、プラークハイブリダイゼーションアッセイ等の公知の方法があげられる。ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００４２】
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００４３】
前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｅ）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。具体的として、配列番号２または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（ａ）における配列番号１または３の塩基配列があげられる。配列番号６または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（ａ）における配列番号５または７の塩基配列があげられる。配列番号１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（ａ）における配列番号９または１１の塩基配列があげられる。
【００４４】
前記（ｆ）において、アミノ酸に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ酸は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換および／または付加されてもよい。
【００４５】
前記（ｇ）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｇ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、前述のように、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドの使用目的は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにコードされる本発明のＬＩＳタンパク質の製造、前記ＬＩＳタンパク質を発現する発現ベクターの製造、前記ＬＩＳタンパク質を発現する形質転換体の製造、前記ＬＩＳタンパク質のリナロール合成活性によるリナロールの合成等である。前記本発明のポリヌクレオチドから本発明のＬＩＳタンパク質を製造する場合、前記ポリヌクレオチドは、例えば、無細胞タンパク質合成系に使用してもよいし、前記非ヒト宿主に導入して使用してもよい。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドの使用方法は、特に制限されず、例えば、非ヒト宿主（以下、宿主ともいう）に導入することが好ましい。前記宿主に前記ポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明のＬＩＳタンパク質の製造、前記本発明のＬＩＳタンパク質を発現する形質転換体の製造、本発明のＬＩＳタンパク質を発現してリナロールを合成する形質転換体の製造等が可能である。前記宿主は、特に制限されず、例えば、前述した本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて、適宜選択できる。前記宿主は、例えば、植物体またはその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等があげられる。
【００４９】
本発明において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体を意味し、「植物体の部分」は、前記植物個体の部分であり、例えば、器官、組織または細胞等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎（地下茎）、根、むかご等があげられる。前記茎は、例えば、球根等の鱗茎、塊茎、球茎、根茎、ライナー等があげられ、前記根は、例えば、塊根、横走根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記植物体の部分は、例えば、一種類の器官、組織および／または細胞でもよいし、二種類以上の器官、組織および／また細胞でもよい。
【００５０】
前記本発明のポリヌクレオチドによって、前記非ヒト宿主の芳香性を改変する場合、前記非ヒト宿主は、例えば、前記植物体またはその部分が好ましい。前記植物体の種類および前記植物体の部分の種類は、特に制限されない。前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入することによって、例えば、前記非ヒト宿主の非芳香性を芳香性に改変したり、リナロールに由来する芳香性をより増強できる。また、導入前の非ヒト宿主が本来有する芳香化合物とは異なる芳香化合物としてリナロールを合成し、異なる芳香性に改変したり、リナロールのさらなる合成によって、異なる芳香性に改変することが可能である。前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドを導入することにより得られる形質転換体は、後述する本発明の形質転換体であり、芳香性改変形質転換体ともいう。また、前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、芳香性改変植物体ともいう。
【００５１】
芳香性の改変の対象となる植物は、特に制限されず、例えば、ナス科植物（例えば、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、ゴマノハグサ科植物（トレニア等）、ベンケイソウ科植物（カランコエ）、ユリ科植物（チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ等）、アジサイ科植物（アジサイ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）等があげられる。前記芳香性植物は、特に制限されず、例えば、バラ、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ等）、ナス科植物（例えば、ペチュニア等）、バラ科植物（例えば、バラ等）、ラン科植物（ラン等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ユリ科植物（ユリ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）等があげられる。これらの中でも、好ましくは、カーネーションおよびトレニアである。
【００５２】
前記本発明のポリヌクレオチドによって、前記本発明のＬＩＳタンパク質を製造する場合、前記非ヒト宿主は、特に制限されない。前記非ヒト宿主は、前述と同様であるが、中でも、微生物、動物細胞、昆虫細胞、またはこれらの培養細胞等が好ましい。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明のＬＩＳタンパク質を製造できる。前記非ヒト宿主に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより得られる形質転換体は、前述と同様に、本発明の形質転換体である。
【００５３】
前記本発明のポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
【００５４】
前記導入方法は、例えば、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、中でも、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、後述するような本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【００５５】
前記宿主が、植物体またはその部分の場合、前記ポリヌクレオチドの導入は、例えば、前記植物体およびその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは、前記植物体の部分であり、より好ましくは、前記組織または細胞であり、さらに好ましくは細胞である。前記組織は、例えば、前記植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【００５６】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを容易に前記宿主へ導入でき、また、前記宿主における前記本発明のポリヌクレオチドの発現を、容易に制御できる。
【００５７】
本発明の発現ベクターの使用目的および使用方法は、特に制限されず、前述の本発明のポリヌクレオチドと同様である。
【００５８】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記宿主において、前記本発明のポリヌクレオチドがコードする前記本発明のＬＩＳタンパク質を発現可能なように、前記本発明のポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記宿主は、特に制限されず、前述のように、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて、適宜選択できる。前記宿主は、前記本発明のポリヌクレオチドの説明と同様に、例えば、植物体またはその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等があげられる。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記本発明のポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合、例えば、バイナリーベクターが好ましく、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＰＺＰ２０２、ｐＢＩＮＰＬＵＳおよびｐＢＩＮ１９等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（Merck社）、ｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ株式会社）、ＰＱＥベクター（QIAGEN社）等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられ、また、ｐＹＥＳ（Invitrogen社)、ｐＥＳＣ(Stratagene社)等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。
【００６０】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明のＬＩＳタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等があげられる。前記プロモーターは、この他に、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター等があげられる。本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記本発明のＬＩＳタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００６１】
本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００６２】
本発明の発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、宿主の種類、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。
【００６３】
前記導入方法は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの説明と同様であり、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記宿主が植物体またはその部分の場合、例えば、中でも、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。
【００６４】
前記発現ベクターの導入は、例えば、本発明のポリヌクレオチドの説明と同様である。前記宿主は、例えば、前述の通りである。前記宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、植物体およびその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは前記植物体の部分であり、より好ましくは前記組織または前記細胞であり、さらに好ましくは細胞である。前記組織は、例えば、前記植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。本発明の発現ベクターの導入により得られる形質転換体は、後述する本発明の形質転換体であり、芳香性改変形質転換体または芳香性改変植物体ともいう。
【００６５】
前記本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入して得られる形質転換体は、例えば、さらに、生育させてもよい。本発明において、「形質転換体」は、例えば、さらに、これらを生育させた生育体の意味も含む。例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを、前記非ヒト宿主に導入して前記形質転換体を得た場合、前記非ヒト宿主を生育させて、さらに、組織、器官または個体に再生させてもよい。このようにして得られた、培養細胞、組織、器官または個体は、本発明において、前述のように、形質転換体に含まれる。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、さらに、組織、器官または植物個体に再生することが好ましい。
【００６６】
＜形質転換体等＞
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主であることを特徴とする。また、本発明の形質転換体は、前記ポリヌクレオチドを有する前記本発明の発現ベクターが導入された非ヒト宿主でもよい。以下、「本発明のポリヌクレオチドの導入」は、特に示さない限り、「本発明の発現ベクターの導入」の意味も含む。
【００６７】
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された非ヒト宿主であればよく、その他の構成は、何ら制限されない。「ポリヌクレオチドが発現可能」は、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能であるとの意味を含む。前記非ヒト宿主に対する、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記本発明の発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記本発明の発現ベクターにおける説明を引用できる。
【００６８】
本発明の形質転換体の使用方法は、特に制限されない。前記本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドの発現によって、前記本発明のＬＩＳタンパク質を発現可能である。このため、前記形質転換体は、本発明のＬＩＳタンパク質の製造に使用できる。前記形質転換体により製造された本発明のＬＩＳタンパク質は、リナロール合成活性を示すことから、前述のようにリナロール合成に使用できる。前記リナロールは、例えば、前記形質転換体から回収した前記ＬＩＳタンパク質を、基質を含む反応液に添加して、合成することもできるし、前記形質転換体において、前記ＬＩＳタンパク質の発現および前記ＬＩＳタンパク質によるリナロール合成を行うこともできる。前記形質転換体内で前記リナロール合成を行うことによって、例えば、前記形質転換体について、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等が可能となる。このような形質転換体は、例えば、芳香性改変形質転換体ということもできる。
【００６９】
前記本発明の形質転換体は、例えば、前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターを導入した後、さらに生育させて得られた生育体でもよい。具体例として、前記本発明のポリヌクレオチドを、前記細胞に導入して前記形質転換体を得た場合、例えば、前記細胞を生育させて、さらに、組織、器官または個体に再生させてもよい。このようにして得られた組織、器官または個体は、本発明において、前述のように、形質転換体に含まれる。
【００７０】
本発明の形質転換体は、導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、ＬＩＳ活性を有する前記本発明のＬＩＳタンパク質が発現されていることが好ましい。また、本発明の形質転換体は、例えば、さらに生育させることで、前記導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、前記本発明のＬＩＳタンパク質が発現されてもよい。
【００７１】
芳香性を改変する場合、前記形質転換体は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された植物体またはその部分が好ましい。前記形質転換体は、例えば、芳香性改変植物体ということもできる。前記形質転換体は、より好ましくは、前記植物体の部分であり、さらに好ましくは、組織または細胞であり、特に好ましくは細胞である。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、さらに、組織、器官または植物個体に再生することが好ましい。
【００７２】
本発明の形質転換体において、前記リナロールが合成される部位は、特に制限されない。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記合成される部位は、例えば、花弁、花冠、花、葉、茎、根等があげられる。
【００７３】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに繁殖させることができる。この際、本発明の形質転換体は、前記繁殖材料として使用できる。前記繁殖材料は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の全体でもよいし、部分でもよい。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記繁殖材料は、例えば、種子、果実、シュート、塊茎等の茎、塊根等の根、株、カルス、プロトプラスト等があげられる。
【００７４】
本発明の形質転換体の繁殖方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記繁殖方法は、例えば、有性生殖および無性生殖のいずれでもよく、好ましくは無性生殖である。前記無性生殖による繁殖は、例えば、栄養繁殖（vegetative propagation）があげられ、栄養生殖（vegetative reproduction）ともいう。前記栄養繁殖の方法は、特に制限されず、前記植物体またはその部分の場合、例えば、挿し芽、挿し木による繁殖、器官からの植物個体への細分化、カルスによる増殖等があげられる。前記器官は、例えば、前述したような葉、茎、根等が利用できる。
【００７５】
前記形質転換体を栄養繁殖することにより得られる繁殖体を、以下、本発明の栄養繁殖体という。本発明の栄養繁殖体は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の栄養繁殖体は、前記形質転換体と同様に、特に制限されず、例えば、植物体またはその部分があげられる。
【００７６】
また、前記形質転換体を有性生殖した場合、例えば、種子、これから生育した生育体等の子孫が得られる。本発明の子孫は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を得ることが好ましい。本発明の子孫は、例えば、前記形質転換体と同様に、例えば、植物体またはその部分のいずれでもよい。
【００７７】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに加工してもよい。加工する前記形質転換体の種類は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等があげられる。前記形質転換体の加工品は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等を乾燥させたポプリ、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、樹脂密封品等があげられる。また、本発明の加工品は、例えば、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品でもよい。
【００７８】
＜非ヒト宿主の芳香性の改変方法および芳香性改変非ヒト宿主の製造方法＞
本発明の非ヒト宿主の芳香性の改変方法は、前述のように、前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入する工程を含むことを特徴とする。また、本発明の非ヒト宿主の芳香性の改変方法は、前記非ヒト宿主に、前記ポリヌクレオチドを含む前記本発明の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴としてもよい。
【００７９】
本発明によれば、例えば、前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入することで、前述した本発明の形質転換体が得られる。前記形質転換体は、前述のように、ＬＩＳ活性を有する前記本発明のタンパク質が発現することによって、リナロールを合成できる。このため、本発明の改変方法によれば、例えば、前記非ヒト宿主の芳香性を、未導入の場合と比較して、非芳香性から芳香性に改変、未導入よりも芳香性を増強、未導入とは異なる芳香性等に改変できる。本発明の改変方法により得られる本発明の形質転換体は、前述のように、例えば、前記芳香性改変形質転換体ということもできる。
【００８０】
本発明において、前記非ヒト宿主は、特に制限されず、前述のものがあげられるが、中でも前記植物体またはその部分が好ましい。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、前記芳香性改変植物体ということもできる。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前述と同様に、植物体およびその部分のいずれに導入してもよく、好ましくは、前記植物体の部分であり、より好ましくは、組織および細胞であり、さらに好ましくは、細胞である。前記本発明のポリヌクレオチドを導入する方法は、何ら制限されず、前述の方法が引用できる。
【００８１】
本発明の改変方法は、前記導入工程の後、さらに、前記ポリヌクレオチドが導入された前記非ヒト宿主、すなわち、前記本発明の形質転換体を生育する工程を有することが好ましい。前記導入工程で得られる前記形質転換体が前記器官、前記組織または細胞の場合、この生育工程において、前記器官は個体に、前記組織は器官または個体に、前記細胞は組織、器官または個体に、再生することが好ましい。前記生育の条件は、特に制限されず、前記形質転換体の種類に応じて、適宜設定できる。前記形質転換体が、例えば、前記植物体の部分、具体的に、前記器官、前記組織または細胞の場合、この生育工程において、前記器官は植物個体に、前記組織は器官または植物個体に、前記細胞は組織、器官または植物個体に、再生することが好ましい。
【００８２】
前記形質転換体は、前述のように、導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、ＬＩＳ活性を有する前記本発明のタンパク質が発現されていることが好ましい。また、前記形質転換体は、例えば、前記生育工程において生育させることで、前記導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、前記本発明のタンパク質が発現されてもよい。
【００８３】
前記芳香性が改変する部位は、特に制限されない。前記形質転換体が植物体またはその部分の場合、例えば、植物体全体でもよいし、花弁、花冠、花、葉、茎、根等でもよい。
【００８４】
次に、本発明の芳香性改変非ヒト宿主の製造方法は、前述のように、前記本発明の芳香性の改変方法により、前記非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の芳香性の改変方法を実施することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法は、特に示さない限り、前記本発明の芳香性の改変方法を引用できる。
【００８５】
本発明において、芳香性の改変は、例えば、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等のいずれでもよい。
【００８６】
＜ＬＩＳタンパク質＞
本発明のタンパク質は、前述のように、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＩＳ活性を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＬＩＳ活性を有するタンパク質
【００８７】
本発明のタンパク質は、前述のように、ＬＩＳ活性を有するタンパク質であり、ＬＩＳまたはＬＩＳタンパク質ということもできる。本発明のＬＩＳタンパク質は、特に示さない限り、前記本発明のポリヌクレオチドの説明を引用できる。本発明のＬＩＳタンパク質は、前述のようにＬＩＳ活性を有していればよく、例えば、ポリペプチドでもよい。
【００８８】
前記（Ａ）において、配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、前述の通りである。
【００８９】
前記（Ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｂ）のアミノ酸配列からなるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記（Ａ）のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ酸は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換および／または付加されてもよい。
【００９０】
前記（Ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｃ）のアミノ酸配列からなるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、塩基配列の同一性と同様であり、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【００９１】
本発明のＬＩＳタンパク質は、例えば、食品、酒類、化粧品および香水等の工業製品の香料として使用できるリナロールの合成に使用できる。
【００９２】
＜ＬＩＳタンパク質の製造方法＞
本発明のタンパク質の製造方法は、リナロール合成活性を有するタンパク質の製造方法であり、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させることにより、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする。
【００９３】
本発明の製造方法は、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させて、前記本発明のＬＩＳタンパク質を合成することが特徴であり、その他の方法および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法において、前記本発明のポリヌクレオチドの発現は、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
【００９４】
前記タンパク質合成工程は、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程があげられる。前記非ヒト宿主は、例えば、前述と同様であり、好ましくは、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等である。前記非ヒト宿主への導入方法は、特に制限されず、前述の記載が引用できる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより導入されてもよく、前記非ヒト宿主は、例えば、前記発現ベクターが導入された非ヒト宿主があげられる。前記培養の方法は、特に制限されず、前記非ヒト宿主の種類に応じて適宜設定できる。
【００９５】
また、前記タンパク質合成工程は、前述のように、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程でもよい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、前記本発明の発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、市販の試薬キットが使用できる。
【００９６】
本発明の製造方法は、例えば、さらに、前記ＬＩＳタンパク質を精製する工程を含んでもよい。前記ＬＩＳタンパク質の精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００９７】
＜リナロールの製造方法＞
本発明のリナロールの製造方法は、前記本発明のＬＩＳタンパク質を使用し、前記ＬＩＳタンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成するリナロール合成工程を含むことを特徴とする。
【００９８】
本発明の製造方法は、前記本発明のＬＩＳタンパク質を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法により得られるリナロールは、例えば、（３Ｒ）−リナロールおよび（３Ｓ）−リナロールがあげられ、好ましくは、（３Ｒ）−リナロールである。
【００９９】
本発明の製造方法において、前記ＬＩＳタンパク質は、例えば、予め製造したＬＩＳタンパク質を使用してもよいし、前記本発明のポリヌクレオチドの発現により合成してもよい。
【０１００】
前者の場合、前記ＬＩＳタンパク質は、例えば、本発明のＬＩＳタンパク質の製造方法により得ることができる。前記ＬＩＳタンパク質は、例えば、非精製タンパク質でもよいが、精製タンパク質が好ましい。
【０１０１】
後者の場合、本発明の製造方法は、例えば、前記ＬＩＳタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含み、前記リナロール合成工程において、前記合成したＬＩＳタンパク質を使用することが好ましい。前記タンパク質合成工程は、特に制限されず、例えば、前記本発明のＬＩＳタンパク質の製造方法によりタンパク質を合成する工程があげられる。具体的には、例えば、前記タンパク質合成工程において、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された前記非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成することが好ましい。この際、前記非ヒト宿主において合成した前記ＬＩＳタンパク質を単離して、前記リナロール合成工程に使用できる。また、例えば、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質合成工程と前記リナロール合成工程とを行ってもよい。つまり、前記タンパク質合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記ＬＩＳタンパク質を合成する工程であり、前記リナロール合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記合成したＬＩＳタンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成する工程でもよい。
【０１０２】
このようにして得られたリナロールは、例えば、食品、酒類、化粧品および香水等の工業製品の香料として使用できる。
【実施例】
【０１０３】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【０１０４】
［実施例１］
単子葉植物フリージア花弁および双子葉植物スイトピー花弁から、ＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡのクローニングを行った。
【０１０５】
（１）スクリーニング１
フリージア（品種アラジン）およびスイトピー（品種スイートスノー）の新鮮な花弁約２〜３ｇから、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、製造業者が推奨する方法で、トータルＲＮＡを取得し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（ｓｕｐｅｒ）ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、ｐｏｌｙＡを付加したｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。前記ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ−４ ＲＸＮ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、それぞれ、７．２×１０４ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔおよび７．１×１０４ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔであった。
【０１０６】
そして、既知のラベンダー由来（Ｒ）−リナロール合成酵素（ＬａＬＩＳ）のｃＤＮＡ（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． ４６５， ２００７）をプローブとして、前記ｃＤＮＡライブラリーを用いてスクリーニングを行った。
【０１０７】
前記プローブは、以下のようにして作製した。まず、ＰＣＲにより、ＬａＬＩＳ ｃＤＮＡの全長領域のオリゴヌクレオチドを増幅するとともに、ＤＩＧ標識システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者が推奨する条件に従って、前記オリゴヌクレオチドにラベルした。ＰＣＲには、鋳型として、ＬａＬＩＳ ｃＤＮＡを含むプラスミド１０ｎｇ、プライマーとして、以下に示す２種類のオリゴヌクレオチド各０．２μｍｏｌ／Ｌを使用した。ＰＣＲの条件は、９５℃で２分反応させた後、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の反応を１サイクルとして、合計３５サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。ＰＣＲ後の反応物を、Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ロシュ）で精製し、精製物をスクリーニングのプローブとした。
（プライマー）
ＬａＬＩＳＤＩＧ−Ｆ（配列番号１３）
5’-ATGTCGATCAATATCAACATGCCTGC-3’
ＬａＬＩＳＤＩＧ−Ｒ（配列番号１４）
5’-TCATGCGTACGGCTCGAACAG-3’
【０１０８】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ノンラジオシステムＤＮＡ検出キット（ロシュ）を用いて行った。ハイブリダイゼーションは、０．０２％ＳＤＳおよび３０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて、６５℃で３０分間を２回行った。そして、約２４万プラークをスクリーニングし、フリージアのｃＤＮＡライブラリーから４５個、スイトピーのｃＤＮＡライブライリーから４１個のポジティブシグナルを得た。しかしながら、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により、塩基配列を解析した結果、前記ＬａＬＩＳ遺伝子と有意な相同性を有するクローンは得られなかった。
【０１０９】
（２）スクリーニング２（フリージア由来ＬＩＳ遺伝子ｃＤＮＡ）
前記（１）において、既知のＬＩＳ遺伝子の配列に基づく相同性を利用したスクリーニングでは、フリージアのＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡがクローニングできないことが明らかとなった。そこで、以下に示すディジェネレートプライマーを作製した。プライマーの組合せは、（ｉ）ＬＩＳｄｐＦ１とＬＩＳｄｐＲ１、（ｉｉ）ＬＩＳｄｐＦ２とＬＩＳｄｐＲ１、（ｉｉｉ）ＬＩＳｄｐＦ３とＬＩＳｄｐＲ１、（ｉｖ）ＬＩＳｄｐＦ１とＬＩＳｄｐＲ２、（ｖ）ＬＩＳｄｐＦ２とＬＩＳｄｐＲ２、（ｖｉ）ＬＩＳｄｐＦ３とＬＩＳｄｐＲ２の合計６通りとした。下記配列において、「I」はイノシンである。
（プライマー）
ＬＩＳｄｐＦ１（配列番号１５）
5’-GA(C/T)GA(C/T)GTITA(C/T)GA(C/T)AT(A/C/T)-3’
ＬＩＳｄｐＦ２（配列番号１６）
5’-GA(C/T)GA(C/T)GTITA(C/T)GA(C/T)GTITA(C/T)-3’
ＬＩＳｄｐＦ３（配列番号１７）
5’-GA(C/T)GA(C/T)AT(A/C/T)TT(C/T)GTITA(C/T)-3’
ＬＩＳｄｐＲ１（配列番号１８）
5’-IGTICCIA(A/G)(A/G)TC(A/G)TCIGG-3’
ＬＩＳｄｐＲ２（配列番号１９）
5’-ICCIA(A/G)(A/G)TC(A/G)TCCCA-3’
【０１１０】
フリージア（品種アラジン）の花弁より、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、トータルＲＮＡを抽出し、このうち１μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者が推奨する方法でｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡ １μｌを鋳型とし、前記組合せのディジェネレートプライマー２種類（各０．２μｍｏｌ／Ｌ）およびＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）１．２５Ｕを用いて、製造業者の推奨する方法により、計５０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分反応させた後、９４℃で３０秒、４０℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとし、合計４０サイクル繰り返した後、７２℃で７分間保持した。
【０１１１】
ＰＣＲ反応後、前記反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した。その結果、フリージアについて、前記（ｖ）ＬＩＳｄｐＦ２とＬＩＳｄｐＲ２のプライマーに用いた反応液において、約０．５ｋｂの増幅断片が得られた。前記増幅断片を回収し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このプラスミドを、ｐＣＲ２．１−ＦＡＦ２Ｒ２＃３８とし、その塩基配列を決定した。
【０１１２】
前記クローンＦＡＦ２Ｒ２＃３８の完全長ｃＤＮＡを取得するために、前記クローンをプローブとして、前記（１）のフリージア由来のｃＤＮＡ ライブラリーを用いてスクリーニングを行った。
【０１１３】
前記プローブは、以下のようにして作製した。まず、ＰＣＲにより、前記クローンの全長領域のオリゴヌクレオチドを増幅すると共に、ＤＩＧ標識システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、製造者が推奨する条件に従って、前記オリゴヌクレオチドにラベルした。ＰＣＲには、鋳型として、１０ｎｇのそれぞれの前記クローンｃＤＮＡを含むプラスミド １０ｎｇ、プライマーとして、以下に示す２種類のオリゴヌクレオチド各０．２μｍｏｌ／Ｌを使用した。ＰＣＲの条件は、９５℃で２分反応させた後、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の反応を１サイクルとして合計３５サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。ＰＣＲ後の反応物を、Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ロシュ）で精製し、精製物をスクリーニングのプローブとした。
（プライマー）
ＤＩＧ−ＦＡ＃３８Ｆ（配列番号２０）
5’-GATGATGTGTATGATGTGTATGGCTCCTT-3’
ＤＩＧ−ＦＡ＃３８Ｒ（配列番号２１）
5’-TGCCGAGGTCGTCCCATAACC-3’
【０１１４】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ノンラジオシステムＤＮＡ検出キット（ロシュ）を用いて行った。ハイブリダイゼーションは、０．０２％ＳＤＳおよび３０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、メンブレンは、２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを用いて６５℃で３０分間洗浄した後、０．５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを用いて６５℃で３０分間洗浄した。そして、約２４万プラークをスクリーニングした。後述する実施例２と同様の方法により、得られたポジティブクローンについてタンパク質を発現させ、目的のＬＩＳ合成活性を確認したところ、配列番号１の塩基配列からなるＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡ（ＦＡ２５ ｃＤＮＡ）および配列番号５の塩基配列からなるＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡ（ＦＡ２６ ｃＤＮＡ）が取得できた。
【０１１５】
（３）スクリーニング３（スイトピー由来ＬＩＳ遺伝子ｃＤＮＡ）
前述のように、前記（１）において、既知のＬIＳ遺伝子の配列に基づく相同性を利用したスクリーニングでは、スイトピーのＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡがクローニングできないことが明らかとなった。そこで、前記（２）と同じディジェネレートプライマーを作製した。
【０１１６】
前記（２）と同様にして、スイトピー（品種スイートスノー）の花弁よりトータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ反応、電気泳動を行った。その結果、スイトピーについて、前記（２）のフリージアとは異なり、前記（ｖｉ）ＬＩＳｄｐＦ３とＬＩＳｄｐＲ３のプライマーに用いた反応液において、約０．５ｋｂの増幅断片が得られた。この増幅断片を回収し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このプラスミドを、ｐＣＲ２．１−ＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２−０６およびｐＣＲ２．１−ＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２−３８とした。そして、得られたクローンＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃０６およびＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃３８の塩基配列を決定した。
【０１１７】
前記ＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃０６およびＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃３８の完全長ｃＤＮＡを取得するために、前記クローンをプローブとして前記（１）のスイトピー由来のｃＤＮＡライブラリーを用いて、スクリーニングを行った。スクリーニングの方法は、下記プライマーを使用した以外は、前記（２）と同様とした。
（プライマー）
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃３８Ｆ（配列番号２２）
5’-GATGATATTTTCGTGTATGGAAAATTTGATG-3’
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃３８Ｒ（配列番号２３）
5’-GCCTATGGGACGACCTCGGC-3’
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃０６Ｆ（配列番号２４）
5’-GACGATATTTTTGTGTACGGCACATTAGAT-3’
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃０６Ｒ（配列番号２５）
5’-GCCGAGGTCGTCCCATAATCG-3’
【０１１８】
そして、約２４万プラークをスクリーニングした。後述する実施例２と同様の方法により、得られたポジティブクローンについてタンパク質を発現させ、目的のＬＩＳ合成活性を確認した。その結果、配列番号９の塩基配列からなるＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡ（ＳＳ１９ ｃＤＮＡ）が取得できた。
【０１１９】
［実施例２］
フリージアおよびスイトピーのＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡを、大腸菌に導入し、組換えＬＩＳタンパク質を発現させた。そして、基質としてゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を用いて、リナロール合成活性を確認した。
【０１２０】
（１）発現用ベクターの構築
シグナルペプチドのコード配列を含む配列番号１の塩基配列からなるＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）を発現するための発現用ベクターｐＳＰＢ５０２５を、以下の方法により構築した。前記発現ベクターは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて構築し、発現は、ｐＥＴ発現システム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１２１】
大腸菌タンパク発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｔｕｒｂｏ ｋｉｔ（フナコシ株式会社）で精製した。
【０１２２】
次に、配列番号１に示す前記ＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−ＦおよびＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−Ｒを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２５用プライマー）
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号２６）
5’-CGCGGCAGCCATATGGCTCTCTTGCCGTGT-3’
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号２７）
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAGAGGGGAATGGGTTCA-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5025 100pg
1x PrimeSTAR buffer（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
PrimeSTAR HS DNA polymerase（Takara社） 1.25U
総体積 25μl
【０１２３】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μｌ、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで処理した前記ｐＥＴ１５ｂベクター １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μｌを添加して、総体積１０μｌに調整した。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させ、さらに、ＴＥ４０μｌを添加した。この混合液のうち３μｌを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１２４】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列、終始コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列がそれぞれ導入された、配列番号１に示す前記ＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有していたクローンを、発現用ベクターｐＳＰＢ５０２５とした。
【０１２５】
上記と同じ方法により、シグナルペプチドのコード配列を含む、配列番号５の塩基配列からなるＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）および配列番号９の塩基配列からなるＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）を発現するための発現用ベクターｐＳＰＢ５０２６（ＦＡ２６ ｃＤＮＡ）およびｐＳＰＢ５０４６（ＳＳ１９ ｃＤＮＡ）を、それぞれ構築した。なお、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列を導入するためのプライマーは、各ｃＤＮＡについて、それぞれ以下のプライマーを使用した。
（ＦＡ２６用プライマー）
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２６ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号２８）
5’-CGCGGCAGCCATATGGCTTTCTTGCCGTGT-3’
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２６ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号２９）
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAGAGGGGAATGGGTTCAATAAGT-3’
（ＳＳ１９用プライマー）
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＳＳ１９ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号３０）
5’-CGCGGCAGCCATATGGCTGTTACTTCTCAACTAC-3’
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＳＳ１９ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号３１）
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAATGGCTAGTGGGTAATGAT-3’
【０１２６】
そして、得られた各４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、前述と同様に全塩基配列を決定した。その結果、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列がそれぞれ導入された、目的のｃＤＮＡのコーディング配列を有していたクローンを、発現用ベクターｐＳＰＢ５０２６（ＦＡ２６ ｃＤＮＡ）、ｐＳＰＢ５０４６（ＳＳ１９ ｃＤＮＡ）とした。
【０１２７】
（２）組換えＬＩＳタンパク質の発現誘導
前記（１）で得られた各形質転換体を用いて、以下の方法により、組換えＬＩＳタンパク質の発現を誘導した。タンパク質の発現誘導は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１２８】
前記（１）の形質転換株を、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）４０μｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）１００μｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社）２μｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび０．０５％グルコースを含むＬＢ培地５ｍｌにより、３７℃で４時間振とう培養した。そして、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ ２ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２ ５ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ １００μｌおよびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 １００ｍｌに前記培養液の全量を加え、２０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液を遠心（５０００×ｇ、５分間、４℃）して、大腸菌を集菌した。前記菌体を、菌体１ｇあたり５ｍｌの緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ アスコルビン酸ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に懸濁した。前記懸濁液を超音波処理して、前記大腸菌を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、得られた上清を、粗酵素液とした。
【０１２９】
次に、前記粗酵素液を、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて、緩衝液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に置換後、以下の酵素反応に用いた。
【０１３０】
（３）ＬＩＳタンパク質の活性測定
前記粗酵素液に、試薬［１０μｍｏｌ／Ｌ ＧＰＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＷＯ４、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ］を添加し、全量３ｍｌの反応液に調整した。そして、この反応液を３０℃で３時間反応させた。なお、反応中、容器内の上部にヘッドスペース成分の捕集剤としてＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８（ジーエルサイエンス社）を１枚吊るしておき、前記ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で採集した。
【０１３１】
次に、前記捕集剤を回収し、前記捕集剤に、ジクロロメタン ２ｍｌを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出して回収した。ジクロロメタン中に抽出された、揮発成分を濃縮乾固し、さらに、ジクロロメタン ５０μｌに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、ＧＣ−ＭＳで分析した。分析条件は、以下の通りとした。下記条件下において、リナロールは、保持時間３２．８分に検出され、ＭＳスペクトルで、ｍ／ｚ １５４，１２１，９３，７１の特徴的なフラグメントイオンが検出されることを、標品により確認した。
キャピラリーカラム：ＨＰ ＩＮＮＯＷａｘ
（６０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ、Agilent社)
キャリアガス：Ｈｅ
温度条件：４０℃で１０分間保持後、５℃／ｍｉｎで２４０℃まで昇温し、最後に２４０℃で３０分間保持
注入口温度：２５０℃
トランスファーライン温度：２３０℃
試料：スプリットレスモードで１μl注入
【０１３２】
その結果、保持時間３２．８分のみに、リナロールのピークが認められ、リナロールのみが生成成分として検出された。この結果から、前記各種ＬＩＳ遺伝子は、リナロール合成活性を示すことが確認された。
【０１３３】
［実施例３］
前記実施例２における、フリージア由来およびスイトピー由来のＬＩＳ ｃＤＮＡを発現させた組換えＬＩＳタンパク質と、公知のラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）由来のリナロール合成酵素（（Ｒ）−ＬＩＳ）ｃＤＮＡから発現させた組換えリナロール合成酵素とについて、それぞれの粗酵素タンパク質を用いてリナロール合成活性を比較した。
【０１３４】
前記実施例２と同様にして、フリージア由来のＬＩＳ遺伝子として、ＦＡ２５ ｃＤＮＡおよびＦＡ２６ ｃＤＮＡを、スイトピー由来のＬＩＳ遺伝子として、ＳＳ１９ ｃＤＮＡを、大腸菌に導入し、それぞれ、組換えＬＩＳタンパク質を発現させ、粗酵素液を調製した。
【０１３５】
他方、ラベンダー由来の（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子を発現するための発現ベクターとして、配列番号３２の前記（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡの配列を含む発現ベクターｐＳＰＢ５０４５を構築した。前記（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡにコードされる（Ｒ）−ＬＩＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。そして、前記ｃＤＮＡの開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列を導入し、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列を導入するためのプライマーとして、以下のプライマーを使用した以外は、前記実施例２と同様にして、前記発現ベクターを構築した。そして、前記実施例２と同様にして、形質転換株の取得、組換えタンパク質の発現誘導、粗酵素液の調製を行った。
【０１３６】
（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ
１６９５ｂｐ（配列番号３２）
ATGTCGATCAATATCAACATGCCTGCAGCCGCCGTCCTCCGCCCTTTTCGCTGCTCACAACTACATGTCGATGAAACCCGACGCTCCGGAAACTACCGCCCCTCGGCTTGGGATTCCAACTACATCCAATCTCTCAATTCTCAGTATAAGGAAAAGAAGTGCTTGACAAGGCTAGAAGGGCTGATTGAGCAAGTGAAGGAACTGAAGGGGACAAAAATGGAGGCTGTTCAACAATTGGAGTTGATTGATGACTCGCAGAATCTGGGATTATCATATTATTTTCAAGATAAAATTAAACATATCTTGAATTTGATATATAATGATCACAAATATTTTTACGATAGTGAAGCTGAAGGAATGGATTTGTATTTTACAGCTCTTGGATTTAGACTCTTTAGACAACATGGTTTTAAAGTCTCCCAAGAAGTATTTGATCGTTTCAAGAACGAGAATGGTACGTATTTCAAGCACGACGATACAAAGGGATTGTTGCAGCTCTACGAAGCATCATTCCTAGTGCGAGAAGGCGAAGAGACACTCGAACAAGCACGAGAATTTGCCACCAAATCCCTACAAAGAAAACTTGATGAGGATGGTGATGGAATTGACGCCAATATCGAATCATGGATCCGCCACTCTCTGGAGATCCCACTTCATTGGAGGGCTCAGAGGCTAGAGGCGAGATGGTTCCTAGATGCTTATGCGAGAAGGCCCGACATGAACCCCGTTATCTTCGAGCTTGCTAAACTCAACTTCAATATTGTCCAAGCAACACAACAAGAAGAATTGAAAGCTCTCTCGAGGTGGTGGAGTAGTTTAGGCCTAGCTGAAAAACTCCCATTTGTGAGGGATAGGCTTGTGGAAAGCTACTTTTGGGCTATTCCACTCTTTGAGCCTCATCAATATGGATATCAAAGAAAAGTGGCCACCAAGATCATAACCCTAATCACATCTTTAGACGATGTTTACGATATCTATGGCACGTTAGATGAATTGCAACTATTTACGAACTTATTTGAAAGATGGGATAATGCATCAATCGGCCGACTTCCTGAATACTTGCAATTGTTCTATTTCGCAATCCACAACTTTGTTTCCGAGGTGGCTTACGACATTCTCAAAGAAAAGGGTTTCACTAGTATTGTATATTTACAGAGATCGTGGGTGGATTTGCTAAAAGGATACCTAAAAGAGGCAAAGTGGTACAATAGTGGATACACGCCAAGCCTCGAGGAATATTTCGACAACGCATTCATGACAATAGGGGCCCCTCCGGTACTATCGCAAGCTTATTTCACATTAGGAAGCTCGATGGAGAAACCGATCATCGAGAGCATGTACGAATATGACAACATACTTCGCGTTTCGGGAATGCTCGTGAGGCTTCCCGATGACCTAGGAACATCATCGTTCGAGATGGAGAGAGGCGACGTGCCGAAATCGGTCCAGCTATACATGAAGGAAACAAATGCTACGGAGGAGGAGGCGGTGGAGCACGTGAGGTTTTTGAATCGGGAGGCGTGGAAGAAGATGAACACGGCGGAGGCGGCCGGTGATTCTCCGTTAGTGAGTGACGTGGTGGCGGTGGCGGCGAATCTTGGAAGGGCGGCGCAGTTTATGTATTTCGACGGAGATGGTAACCAGTCTAGTTTGCAGCAGTGGATTGTGAGCATGCTGTTCGAGCCGTACGCATGA
（Ｒ）−ＬＩＳ タンパク質
５６４ａａ（配列番号３３）
MSININMPAAAVLRPFRCSQLHVDETRRSGNYRPSAWDSNYIQSLNSQYKEKKCLTRLEGLIEQVKELKGTKMEAVQQLELIDDSQNLGLSYYFQDKIKHILNLIYNDHKYFYDSEAEGMDLYFTALGFRLFRQHGFKVSQEVFDRFKNENGTYFKHDDTKGLLQLYEASFLVREGEETLEQAREFATKSLQRKLDEDGDGIDANIESWIRHSLEIPLHWRAQRLEARWFLDAYARRPDMNPVIFELAKLNFNIVQATQQEELKALSRWWSSLGLAEKLPFVRDRLVESYFWAIPLFEPHQYGYQRKVATKIITLITSLDDVYDIYGTLDELQLFTNLFERWDNASIGRLPEYLQLFYFAIHNFVSEVAYDILKEKGFTSIVYLQRSWVDLLKGYLKEAKWYNSGYTPSLEEYFDNAFMTIGAPPVLSQAYFTLGSSMEKPIIESMYEYDNILRVSGMLVRLPDDLGTSSFEMERGDVPKSVQLYMKETNATEEEAVEHVRFLNREAWKKMNTAEAAGDSPLVSDVVAVAANLGRAAQFMYFDGDGNQSSLQQWIVSMLFEPYA
【０１３７】
そして、各粗酵素液を用いて、前記実施例２と同様にして、活性測定を行った。なお、活性測定の反応液（３ｍｌ）における前記粗酵素のタンパク質使用量は、５〜５．５ｍｇとした。
【０１３８】
これらの結果を、図１〜図３に示す。図１〜図３は、それぞれ、生成成分のガスクロマトグラムであり、図１は、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２５）、図２は、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２６）、図３は、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ子由来の組換えタンパク質の結果（ＳＳ１９）を示し、それぞれ、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＬａＬＩＳ）を合わせて示す。図１〜図３に示すように、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来およびＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によれば、既知の（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質よりも、リナロール生成量が多く、有意に強い活性を示した。また、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質は、既知の（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質と同等の生成量であり、同等の活性を示した。
【０１３９】
［実施例４］
リナロールは３位に不斉炭素をもち、（３Ｓ）−リナロールおよび（３Ｒ）−リナロールの１組の光学異性体が存在する。そこで、本発明のＬＩＳタンパク質により生成したリナロールがいずれの光学異性体であるかを確認した。
【０１４０】
前記実施例２で得られた、反応後に回収した抽出液を、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。分析条件は、以下の通りとした。下記条件下、（３Ｓ）−リナロールは、保持時間２３．８分に、（３Ｒ）−リナロールは、保持時間２４．０分に、それぞれ検出されることを、標品で確認した。
キャピラリーカラム：ＩｎｅｒｔＣａｐ ＣＨＩＲＡＭＩＸ
（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ、ジーエルサイエンス社）
キャリアガス：Ｈｅ
温度条件：５０℃で１分間保持後、３℃／ｍｉｎで１８０℃まで昇温し、最後に１８０℃で１分間保持
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２５０℃
試料：スプリットモード１０：１で１μｌ注入
【０１４１】
これらの結果を図４〜図６に示す。図４〜図６は、それぞれ、生成成分のガスクロマトグラムであり、図４は、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２５）、図５は、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２６）、図６は、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＳＳ１９）を示し、それぞれ、コントロールとして、（３Ｒ）−リナロールおよび（３Ｓ）−リナロールの標品（ＳＴＤ）の結果を合わせて示す。図４〜図６に示すように、いずれの組換えタンパク質を使用した抽出液においても、（３Ｒ）−リナロールと保持時間が一致するシグナルが得られた。この結果から、フリージア由来のＦＡ２５タンパク質およびＦＡ２６タンパク質、スイトピー由来のＳＳ１９タンパク質は、いずれも、（３Ｒ）−リナロール合成活性を有することが確認できた。
【０１４２】
［実施例５］
フリージア由来のＬＩＳ ｃＤＮＡを発現させた組換えＬＩＳタンパク質と、公知のラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）由来のリナロール合成酵素（（Ｒ）−ＬＩＳ） ｃＤＮＡを発現させた組換えリナロール合成酵素とについて、それぞれの精製酵素タンパク質を用いてリナロール合成活性を比較した。
【０１４３】
（１）組換えＬＩＳタンパク質の発現誘導
前記実施例２および実施例３と同様にして、フリージア由来のＬＩＳ遺伝子としてＦＡ２６ ｃＤＮＡと、前記ラベンダー由来の（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入した。これらの形質転換体を用いて、以下の方法により、組換えＬＩＳタンパク質の発現を誘導した。タンパク質の発現誘導は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１４４】
前記の形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび０．０５％グルコースを含むＬＢ培地１０ｍｌにより、３７℃で４時間振とう培養した。そして、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ ２ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２ ５ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ １００μｌおよびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 １００ｍｌに前記培養液のうち２ｍｌを加え、１６℃で２４時間振とう培養した。これを各５本準備し、各合計５００ｍｌを培養した。得られた培養液を遠心（５０００×ｇ、５分間、４℃）し、大腸菌を集菌した。前記菌体を、菌体１ｇあたり１０ｍｌの緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ アスコルビン酸ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に懸濁した。前記懸濁液を超音波処理して、前記大腸菌を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、さらに、０．４５μｍ ＭＩＬＬＥＸ−ＨＰフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でろ過後、得られた上清を、粗酵素液とした。
【０１４５】
次に、前記粗酵素を、Ｐｒｏｆｉｎｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ １ｍｌ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）でＨｉｓ Ｔａｇ精製後、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ １０ｍｌ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）にて脱塩した。
【０１４６】
次に、脱塩後の前記精製酵素液を、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて、緩衝液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に置換後、以下の酵素反応に用いた。
【０１４７】
（２）ＬＩＳタンパク質の活性測定
前記精製酵素液に、試薬［１０μｍｏｌ／Ｌ ＧＰＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＷＯ４、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ］を添加し、全量３ｍｌの反応液に調整した。なお、精製タンパク質の使用量は、０．３ｍｇとした。そして、この反応液を３０℃で３時間あるいは１０時間反応させた。なお、反応中、容器内の上部にヘッドスペース成分の捕集剤としてMonoTrap DCC18（ジーエルサイエンス社）を１枚吊るしておき、前記ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で採集した。
【０１４８】
次に、前記捕集剤を回収し、前記捕集剤に、ジクロロメタン ２ｍｌを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出し、回収した。ジクロロメタン中に抽出された揮発成分を濃縮乾固し、さらに、ジクロロメタン ５０μlに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、ＧＣ−ＭＳで分析した。分析条件は、以下の通りとした。下記条件下において、リナロールは、保持時間３２．８分に検出され、ＭＳスペクトルで、ｍ／ｚ １５４，１２１，９３，７１の特徴的なフラグメントイオンが検出されることを、標品により確認した。
キャピラリーカラム：ＨＰ ＩＮＮＯＷａｘ
（６０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ、Agilent社)
キャリアガス：Ｈｅ
温度条件：４０℃で１０分間保持後、５℃／ｍｉｎで２４０℃まで昇温し、最後に２４０℃で３０分間保持
注入口温度：２５０℃
トランスファーライン温度：２３０℃
試料：スプリットレスモードで１μl注入
【０１４９】
これらの結果を、図７に示す。図７は、生成成分のガスクロマトグラムであり、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質（ＦＡ２６）と、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＬａＬＩＳ）を合わせて示す。図７に示すように、３時間反応させた場合、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によれば、既知のラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質よりも、リナロール生成量が約７．２倍多く、有意に強い活性を示した。さらに、図８に示すように、１０時間反応させた場合、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によるリナロール生成量は、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によるリナロール生成量の約３０．８倍であった。一方、１０時間反応したラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によるリナロール生成量は、３時間反応した場合とほとんど変化がなかった。このことから、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質に比べ、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質は、安定性が高く、高い反応性を有することが明らかとなった。なお、ｃＤＮＡを挿入していない空ベクターｐＥＴ１５ｂを導入した大腸菌では、リナロール活性は確認できなかった（図７、８におけるｐＥＴ１５ｂ）。
【０１５０】
［実施例６］
フリージアおよびスイトピー由来のＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡを、それぞれバイナリーベクターに導入し、トレニアに形質転換した。そして、得られた組換え体におけるリナロール合成活性を確認した。また、対照として、既知のラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡについても、同様に形質転換およびリナロール合成活性の確認を行った。
【０１５１】
１．各種バイナリーベクターの構築
（１）pSPB5083（El235Sp：：FA25：：Nost）の構築
植物においてＦＡ２５遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０８３は、以下の方法で構築した。
【０１５２】
配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）コーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＳａｌＩ認識配列を、それぞれ導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＦＡ２５ＦＷおよびｔｒＦＡ／ｎｏｓ＿ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で1分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２５用プライマー）
ｔｒＦＡ２５＿ＦＷ（配列番号３４）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTCTCTTGCCGTGT-3’
ｔｒＦＡ２５／ｎｏｓ＿ＲＶ（配列番号３５）
5’-GAAATTCGGGTCGACTTAGAGGGGAATGGGTTCAAA-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5025 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１５３】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μｌ、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μｌを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＢ３５９３は、ｐＵＣＰＰ（ＷＯ２００５／０１７１４７）上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ラベンダー由来リナロール合成酵素（ＬａＬＩＳ）遺伝子およびＮｏｓターミネーターを有するベクターであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μｌを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α （ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１５４】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、終始コドンの３’側にＳａｌＩ認識配列がそれぞれ導入された、配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０７９とした。
【０１５５】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０７９をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２５遺伝子、アグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０８３とした。
【０１５６】
（２）pSPB5082（El235Sp：：FA25：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２５遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０８２は、以下の方法で構築した。
【０１５７】
配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＦＡ２５＿ＦＷおよびｔｒＦＡ２５／ＨＳＰ＿ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。そして、さらに、植物体における目的遺伝子産物の高発現のため、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター配列に対して、終止コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列を導入すべく、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す２種類のプライマーＨＳＰ／ＦＡ２５＿ＦＷおよびＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。これらのＰＣＲは、それぞれ、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２５用プライマー）
ｔｒＦＡ２５ ＦＷ（配列番号３４）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTCTCTTGCCGTGT-3’
ｔｒＦＡ２５／ＨＳＰ＿ＲＶ（配列番号３６）
5’-ATCTTCATCTTCATATTAGAGGGGAATGGGTTCAAAAAG-3’
（ＨＳＰターミネーター用プライマー）
ＨＳＰ／ＦＡ２５＿ＦＷ（配列番号３７）
5’-CCCATTCCCCTCTAATATGAAGATGAAGAT-3’
ＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２（配列番号３８）
5’-GTTAATTAAGAATTCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5025あるいはpRI201-AN-GUS 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１５８】
得られた各ＰＣＲ産物５μｌについて、それぞれＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１５９】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、ＨＳＰターミネーター配列の終始コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列およびＨＳＰターミネーター配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０７８とした。
【０１６０】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０７８をＰａｃIとＤｒａIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２５遺伝子、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０８２とした。
【０１６１】
（３）pSPB5091（Mac1p：：AmGPPS．SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS．LSU：：Nost；El235Sp：：FA25：：Nost）の構築
植物において、ＦＡ２５遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９１は、以下の方法で構築した。
【０１６２】
まず、キンギョソウ由来ゲラニルピロリン酸合成酵素について、スモールサブユニット（ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ）遺伝子およびラージサブユニット（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ）遺伝子の取得を行った。
【０１６３】
キンギョソウ（品種メリーランドトゥルーピンク、株式会社ムラカミシード）の花から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。前記トータルＲＮＡのうち１μgから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者が推奨する方法により、ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡ １μlを鋳型とし、プライマーおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）１．２５Ｕを用いて、製造業者の推奨する方法により計２５μlの反応液でＰＣＲを行った。スモールサブユニット遺伝子の増幅には、その既知配列（ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３４６８６．１)に基づいて作製した２種類のスモールサブユニット増幅用プライマー ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｆ２とＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｒ２を、各０．２μｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した。また、ラージサブユニット遺伝子の増幅には、その既知配列（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５３４６８７．１)に基づいて作製した２種類のラージサブユニット増幅用プライマー ＡｍＧＰＰＳ・LＳＵ−ＦとＡｍＧＰＰＳ・LＳＵ−Ｒを、各０．２μｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した。ＰＣＲは、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１サイクルとして合計３０サイクル繰り返した後、７２℃で４分間保持した。
【０１６４】
得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動で分離した。そして、約０．９５ｋｂおよび１．３ｋｂのバンドをそれぞれ回収し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者が推奨する方法で、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。得られたプラスミドの塩基配列を決定したところ、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵのアミノ酸配列（配列番号５４）をコードする塩基配列（配列番号５３）およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵのアミノ酸配列（配列番号５６）をコードする塩基配列（配列番号５５）を含むプラスミドが得られた。前者のプラスミドをｐＳＰＢ３５０６、後者のプラスミドをｐＳＰＢ１４００とした。ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５３４６８６．１に登録されており、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５３４６８７．１に登録されている。
ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｆ２（配列番号３９）
5’-AAATGGCCCACGGCCTCAC-3’
ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｒ２（配列番号４０）
5’-CATCAGGGTTGTAGGTCTAATTACCCCT-3’
ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ−Ｆ（配列番号４１）
5’-TCAACAACAATGAGCCTGGTAAATC-3’
ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ−Ｒ（配列番号４２）
5’-TCACAAATGAAGTTGTGTTATACATGACAT-3’
【０１６５】
ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ 遺伝子
８９４ｂｐ（配列番号５１）
ATGGCCCACGGCCTCACCCATTTCAACACCAAATCGGGTTTATTCCCATCTATCACCAAATCAAAAACAACCCGTCCATCAACCCGACCCGTGATTCTCGCCATGACCCGGACCCAAACTTACCGGGCCACCATTGAATCCGACATTGAATCTTATCTCAAGAAGGCCATCCCAATCCGGGCACCTGAATCCGTATTCGAGCCCATGCACCACCTCACGTTTGCCGCCCCAAGAACCAGCGCATCGGCTTTATGCGTGGCAGCGTGCGAGCTCGTTGGCGGCGACCGAAGCGATGCCATGGCGGCGGCGGCGGCGGTGCATCTCATGCACGTGGCGGCGTACACACACGAGAACCTTCCTCTTACCGACGGGCCCATGTCCAAATCGGAAATCCAACACAAGTTCGATCCGAATATCGAACTTTTGACAGGAGACGGAATCATACCATTCGGGCTGGAGTTGATGGCGAGATCAATGGATCCGACCCGGAACAACCCGGATAGGATCCTAAGAGCGATAATCGAACTCACCCGGGTCATGGGCTCAGAGGGAATTGTAGAAGGGCAATACCATGAACTTGGTCTAAATCAATTAAACGATTTAGAACTCATCGAGTATGTTTGCAAGAAAAAAGAAGGGACACTACATGCATGTGGGGCCGCTTGTGGAGCAATTTTAGGTGGATGTGATGAAGATAAAATAGAAAAGTTGAGAAGATTCGGACTTTATGTGGGTACGGTTCAAGGGTTGTTGGGTAAAAATAGATCCGGATTTGAAGGAAGAATTAAGGAATTGAAGGAATTGGCTGTTAAGGAACTGGAGAGCTTTGGTGGTGAGAAAATTGAGCTGATTAGGGGCGTTTTTGAGCTAGAGCATAGTCTTGCTGGTGTTTAA
ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ タンパク質
２９７ａａ（配列番号５２）
MAHGLTHFNTKSGLFPSITKSKTTRPSTRPVILAMTRTQTYRATIESDIESYLKKAIPIRAPESVFEPMHHLTFAAPRTSASALCVAACELVGGDRSDAMAAAAAVHLMHVAAYTHENLPLTDGPMSKSEIQHKFDPNIELLTGDGIIPFGLELMARSMDPTRNNPDRILRAIIELTRVMGSEGIVEGQYHELGLNQLNDLELIEYVCKKKEGTLHACGAACGAILGGCDEDKIEKLRRFGLYVGTVQGLLGKNRSGFEGRIKELKELAVKELESFGGEKIELIRGVFELEHSLAGV
【０１６６】
ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ 遺伝子
１１１９ｂｐ（配列番号５３）
ATGAGCCTGGTAAATCCCATTACAACCTGGTCAACAACAACAACCTCAAAATCCCCAAAAAATGTCCAAACCACCACCAGATCCAGATCCATCATTCTCCCTCACAAAATCTCCCTTTTCCCATCAAACCCCAAATCAAAATCAAAAACCCACCTCAGATTCTCAATATCATCAATCCTGACGAAGAACCCACAAGAATCAAGCCAAAAAACCTCCAAAGATCCAACCTTTACCCTCGATTTCAAAACCTACATGCTAGAAAAAGCCAGCTCTGTTAACAAAGCCTTAGAACAAGCTGTTTTACTCAAAGAGCCCTTAAAAATCCACGAATCGATGAGGTACTCGCTTCTAGCCGGGGGCAAAAGGGTCAGACCAATGCTCTGCATCGCCGCTTGTGAGCTAGTTGGTGGGCTGGAATCCACTGCGATGCCCTCAGCTTGTGCTGTTGAAATGATCCATACCATGTCTTTGATCCACGATGATTTGCCCTGTATGGATAACGACGATTTACGACGTGGAAAGCCCACAAACCACAAGATTTATGGCGAAGACGTGGCGGTTTTAGCCGGGGATGCCCTGTTAGCGTTCTCGTTCGAGCACGTGGCAAAATCGACGAAAGGGGTGTCGTCGGATAGGATTGTTAGGGTGATTGGTGAATTGGCTAAGTGTATTGGCTCTGAGGGTTTAGTTGCAGGCCAAGTGGTTGATATAAGTTCTGAAGGAATGACTGAAGTTGGATTGGAGCATTTGGAGTTTATCCACGTGCACAAGACCGCGGCGTTGTTGGAGGCTTCGGTGGTTTTGGGCGCGATTGTGGGTGGTGCGGATGATGAGGATGTTGAGAAGTTGAGGAAATTCGCGAGGTGTATCGGGCTTTTGTTTCAAGTGGTTGATGATATTTTGGATGTTACTAAGTCTTCGCAAGAATTGGGGAAGACGGCGGGTAAAGACTTGGTTGCGGATAAGACTACGTATCCGAAGCTGCTTGGGATTGAGAAGTCGAGGGAGTTTGCGGAGAAGTTGAATAGGGAGGCGCAGGAGCAGCTCGAGGGGTTCGATTCGGTTAAGGCTGCGCCGTTGATCGCGTTGGCTAACTACATCGCTTATAGAGATAATTGA
ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ タンパク質
３７２ａａ（配列番号５４）
MSLVNPITTWSTTTTSKSPKNVQTTTRSRSIILPHKISLFPSNPKSKSKTHLRFSISSILTKNPQESSQKTSKDPTFTLDFKTYMLEKASSVNKALEQAVLLKEPLKIHESMRYSLLAGGKRVRPMLCIAACELVGGLESTAMPSACAVEMIHTMSLIHDDLPCMDNDDLRRGKPTNHKIYGEDVAVLAGDALLAFSFEHVAKSTKGVSSDRIVRVIGELAKCIGSEGLVAGQVVDISSEGMTEVGLEHLEFIHVHKTAALLEASVVLGAIVGGADDEDVEKLRKFARCIGLLFQVVDDILDVTKSSQELGKTAGKDLVADKTTYPKLLGIEKSREFAEKLNREAQEQLEGFDSVKAAPLIALANYIAYRDN
【０１６７】
次に、ｐＵＣＡＡ（ＷＯ２００４／０１８６８２参照）上に、Ｍａｃ1プロモーター、カーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子およびｍａｓターミネーターを有する、ｐＳＰＢ１４７７を準備した。前記ｐＳＰＢ１４７７を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して、カーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子を除き、これに、前記（３）のｐＳＰＢ３５０６をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子）を連結した。得られたプラスミドは、そのｐＵＣＡＡ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、およびｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１３とした。
【０１６８】
さらに、前記ｐＳＰＢ１４００をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子）を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化したｐＳＰＢ２３１１（ＷＯ２００７／０４９８１６参照）に連結した。得られたプラスミドは、そのｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子およびｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１４とした。次に、前記ｐＳＰＢ３５１３をＡｓｃIで消化し、得られる約３ｋｂのＤＮＡ断片を、前記ｐＳＰＢ３５１４のＡｓｃI部位に連結した。このプラスミドを、ｐＳＰＢ３５３３とした。
【０１６９】
前記ｐＳＰＢ３５３３をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに、ｐＳＰＢ３５６０をＰａｃIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。前記ｐＳＰＢ３５６０は、ｐＵＣＰＰ(ＷＯ２００５／０１７１４７)上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、クラーキア由来ＬＩＳ遺伝子およびＮｏｓターミネーターを有するプラスミドである。前記ＤＮＡ断片の連結により得られたプラスミドは、そのｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子およびクラーキア由来ＬＩＳ遺伝子を有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５６２とした。
【０１７０】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳのマルチクローニングサイトにＳｇｆIとＦｓｅIを付加したｐＳＰＢ１８４０を、ＡｓｃIとＰａｃIで消化した。そして、ｐＳＰＢ３５６２をＡｓｃIで消化後、ＰａｃIで部分消化して得られた約９．５ｋｂのＤＮＡ断片を、前記ｐＢＩＮＰＬＵＳの消化物に連結した。このプラスミドをｐＳＰＢ５００７とした。
【０１７１】
最後に、前記ｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（１）のｐＳＰＢ５０７９をＰａｃIとＤｒａIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子およびフリージア由来ＦＡ２５遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０９１とした。
【０１７２】
（４）pSPB5090（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：FA25：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２５遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９０は、以下の方法で構築した。
【０１７３】
前記（３）のｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（２）のｐＳＰＢ５０７８をＰａｃIとＤｒａIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、フリージア由来ＦＡ２５遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０９０とした。
【０１７４】
（５）pSPB5074（El235Sp：：FA26：：Nost）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７４は、以下の方法で構築した。
【０１７５】
配列番号５に示すＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＳａｌI認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２およびｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｎｏｓ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２６用プライマー）
ｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２（配列番号４３）
5’-CATTCGGAGAGGTACCATGGCTTTCTTGCCGTGTC-3’
ｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｎｏｓ２（配列番号４４）
5’-GAAATTCGGGTCGACTTAGAGGGGAATGGGTTCAATAA-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5026 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１７６】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＰＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１７７】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、終始コドンの３’側にＳａｌI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号５に示すＦＡ２６ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０７０とした。
【０１７８】
次に、ｐＳＰＢ５００１をＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これに、ｐＳＰＢ５０７０をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。前記ｐＳＰＢ５００１は、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ラベンダー由来ＬＩＳ遺伝子およびＮｏｓターミネーターを有するプラスミドである。前記ｐＳＰＢ５００１への前記ＤＮＡ断片の連結により、前記ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子およびアグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有するプラスミドが得られた。これをｐＳＰＢ５０７４とした。
【０１７９】
（６）pSPB5073（El235Sp：：FA26：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７３は、以下の方法で構築した。
【０１８０】
配列番号５に示すＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、以下に示す２種類のプライマーｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２およびｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｈｓｐを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。そして、さらに、植物体における目的遺伝子産物の高発現のため、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター配列に対して、終止コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列を導入すべく、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す各２種のプライマーｔｒＨＳＰｔ＿ＦＷおよびｔｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。これらのｐＣＲは、それぞれ、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２６用プライマー）
ｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２（配列番号４３）
5’-CATTCGGAGAGGTACCATGGCTTTCTTGCCGTGTC-3’
ｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｈｓｐ（配列番号４５）
5’-TCTTCATATTAGAGGGGAATGGGTTCAATAAG-3’
（ＨＳＰターミネーター用プライマー）
ｔｒＨＳＰｔ＿ＦＷ（配列番号４６）
5’-CCCTCTAATATGAAGATGAAGATGAAATATTT-3’
ｔｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２（配列番号３８）
5’-GTTAATTAAGAATTCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5026あるいはpRI201-AN-GUS 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１８１】
得られた各ＰＣＲ産物５μｌに、それぞれＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ 各２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１８２】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、ＨＳＰターミネーター配列の終始コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号５に示すＦＡ２６−ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列およびＨＳＰターミネーター配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０６９とした。
【０１８３】
次に、前記（５）と同様にして、ｐＳＰＢ５００１をＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これに、前記ｐＳＰＢ５０６９をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。これにより得られるプローブは、前記ｓＰＢ５００１のｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子およびシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ５０７３とした。
【０１８４】
（７）pSPB5075（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp ：：FA26：：Nost）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７５は、以下の方法で構築した。
【０１８５】
前記（３）のｐＳＰＢ５００７をＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（５）のｐＳＰＢ５０７０をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０７５とした。
【０１８６】
（８）pSPB5072（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：FA26：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７２は、以下の方法で構築した。
【０１８７】
前記（３）のｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（６）のｐＳＰＢ５０６９をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０７２とした。
【０１８８】
（９）バイナリーベクターpSPB5084（El235S：：SS19：：Nost）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０８４は、以下の方法で構築した。
【０１８９】
配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＳａｌI認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＳＳ１９＿ＦＷおよびｔｒＳＳ１９／ｎｏｓ＿ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＳＳ１９用プライマー）
ｔｒＳＳ１９＿ＦＷ（配列番号４７）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTGTTACTTCTCAACTAC-3’
ｔｒＳＳ１９／ｎｏｓ＿ＲＶ（配列番号４８）
5’-GAAATTCGGGTCGACTTAATGGCTAGTGGGTAAT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5046 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１９０】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＰＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１９１】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、終始コドンの３’側にＳａｌI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０８１とした。
【０１９２】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０８１をＰａｃＩとＳｃａＩで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子およびアグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０８４とした。
【０１９３】
（１０）pSPB5097（El235S：：SS19：：HSPt）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９７は、以下の方法で構築した。
【０１９４】
配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す各２種のプライマーｔｒＳＳ１９＿ＦＷおよびｔｒＳＳ１９／ＨＳＰ_ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。そして、さらに、植物体における目的遺伝子産物の高発現のため、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター配列に対して、終止コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す各２種のプライマーＨＳＰ／ＳＳ１９＿ＦＷおよびＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。これらのＰＣＲ反応は、それぞれ、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＳＳ１９用プライマー）
ｔｒＳＳ１９＿ＦＷ（配列番号４７）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTGTTACTTCTCAACTAC-3’
ｔｒＳＳ１９／ＨＳＰ_ＲＶ（配列番号４９）
5’-ATCTTCATCTTCATATTAATGGCTAGTGGGTAATGATGAG-3’
（ＨＳＰターミネーター用プライマー）
ＨＳＰ／ＳＳ１９＿ＦＷ（配列番号５０）
5’-CCCACTAGCCATTAATATGAAGATGAAGAT-3’
ＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２（配列番号３８）
5’-GTTAATTAAGAATTCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5046あるいはpRI201-AN-GUS 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１９５】
得られた各ＰＣＲ産物５μｌに、それぞれＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ 各２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＰＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１９６】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、ＨＳＰターミネーター配列の終始コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号９に示すＳＳ１９ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列およびＨＳＰターミネーター配列を有していたクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０８０とした。
【０１９７】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０８０をＰａｃIとＳｃａIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーターを有する発現ベクターｐＳＰＢ５０９７を得た。
【０１９８】
（１１）バイナリーベクターpSPB5619（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：SS19：：Nost）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５６１９は、以下の方法で構築した。
【０１９９】
（３）で作製したｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに（９）で作製したｐＳＰＢ５０８１をＰａｃIとＳａｃIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５６１９とした。
【０２００】
（１２）バイナリーベクターpSPB5098（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost;El235Sp：：SS19：：HSPt）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９８は、以下の方法で構築した。
【０２０１】
（３）で作製したｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに（１０）で作製したｐＳＰＢ５０８０をＰａｃＩとＳｃａＩで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０９８とした。
【０２０２】
（１３）pSPB5001（El235S：：LaLIS：：Nost）の構築
植物において、ラベンダー由来ＬＩＳ（ＬａＬＩＳ）遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５００１は、以下の方法で構築した。
【０２０３】
前記（３）のｐＳＰＢ３５６０をＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することによりクラーキア由来ＬＩＳ遺伝子を除いた。他方、ｐＳＰＢ３５９１をＫｐｎＩとＳａｌＩで消化して、ＬａＬＩＳ遺伝子を有する約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。そして、クラーキア由来ＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５６０に、前記ＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＵＣＰＰ上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ＬａＬＩＳ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５９３とした。
【０２０４】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに、前記ｐＳＰＢ３５９３をＰａｃIで消化して得られる約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、前記ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ラベンダー由来ＬＩＳ遺伝子、アグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５００１とした。
【０２０５】
（１４）pSPB5003(Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：LaLIS：：Nost）の構築
植物において、ＬａＬＩＳ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５００３は、以下の方法で構築した。
【０２０６】
前記（３）と同じ、ｐＵＣＡＡ(ＷＯ２００４／０１８６８２参照)上に、Ｍａｃ1プロモーターおよびカーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ１４７７を使用した。前記ｐＳＰＢ１４７７を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して、カーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子を除き、これに、前記（３）のｐＳＰＢ３５０６をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子）を連結した。得られたプラスミドは、そのｐＵＣＡＡ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１３とした。
【０２０７】
さらに、前記（３）のｐＳＰＢ１４００をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子）を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化したｐＳＰＢ２３１１(ＷＯ２００７／０４９８１６参照)に連結した。得られたプラスミドは、そのｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１４とした。
【０２０８】
前記ｐＳＰＢ３５１４をＡｓｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（３）のｐＳＰＢ３５１３をＡｓｃIで消化して得られる約３ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドをｐＳＰＢ３５３３とした。
【０２０９】
前記ｐＳＰＢ３５３３をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに、前記（１３）のｐＳＰＢ３５９３をＰａｃIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、ラベンダー由来ＬＩＳ遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５００３とした。
【０２１０】
２．形質転換トレニアの作製
トレニア品種サマーウェーブブルー（SWB）の葉片を用い、国際公開公報ＷＯ２００９／０７２５４２に記載された方法に基づき、形質転換を行った。得られた形質転換体は、それぞれ導入した発現ベクターごとに、以下に示す系統名とした。
pSPB5091（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA25::Nost）：TT175
pSPB5090（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA25::HSPt）：TT174
pSPB5074（El235Sp::FA26::Nost）：TT166
pSPB5073（El235Sp::FA26::HSPt）：TT165
pSPB5075（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA26::Nost）：TT164
pSPB5072（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA26::HSPt）：TT162
pSPB5001（El235Sp::LaLIS::Nost）：TT144
pSPB5003（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::LaLIS::Nost）：TT143
【０２１１】
３．各組換え体におけるリナロール合成量の測定
前記「２．」で取得した組換え体から開花した花５つをランダムに選択した。そして、これらの花弁の上に、１花あたり、ヘッドスペース成分の捕集剤ＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８（ジーエルサイエンス社）１枚、つまり、１個体あたり計５枚の捕集剤を設置し、ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で２４時間採集した。
【０２１２】
翌日、前記捕集剤を各個体から5枚まとめて回収し、前記捕集剤にジクロロメタン ２ｍｌを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出し、回収した。ジクロロメタン中に抽出された揮発成分を濃縮乾固し、さらにジクロロメタン １００μlに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、ＧＣ−ＭＳで分析した。分析条件は、前記実施例２（３）のＧＣ−ＭＳと同様とした。
【０２１３】
これらの結果を、下記表１に示す。下記表は、各組換え体について、各５つの花の結果およびその平均値を示す。下記表１に示すように、既知のラベンダー由来のリナロール合成酵素遺伝子を導入した組換え体ＴＴ１４４およびＴＴ１４３では、いずれもリナロールの合成が認められなかった。これに対して、フリージア由来ＬＩＳ遺伝子を導入した組換え体は、いずれも、保持時間３２．８分にピークが認められ、リナロールが生成成分として検出された。一方、宿主であるSWBからはリナロールが検出されなかった。これらの結果から、前記フリージア由来ＬＩＳ遺伝子は、植物体においてリナロール合成活性を示すことが確認された。
【０２１４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
以上のように、本発明のポリヌクレオチドによれば、遺伝子工学的手法によりリナロール合成酵素の発現が可能である。このため、前記本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物に導入して形質転換体を作製することで、前記形質転換体において、リナロール合成酵素を発現し、これにより香気成分であるリナロールの合成が可能となる。このため、本発明によれば、例えば、植物に芳香性を付与したり、その芳香性の改変を行うことができるため、生花等の園芸植物の栽培において、商品価値の高い園芸植物を提供できることから、極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドに関し、さらに、これを用いた形質転換体、植物体の芳香性の改変方法および芳香性改変植物体の製造方法等の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
花において、香りは、色および形と並ぶ花の魅力の1つである。特に、野生種には、香りを有するものが多いが、品種改良の過程において、色、形、耐病性および日持ち等が優先された結果、その代償に、本来の香りが弱くなったものや、香りを失ったものも多く存在する。香りの感じ方および嗜好には、個人差があり、また、栽培による香りのバラつきも大きいことから、色や形に比べて特にその取り扱いが難しい。この理由から、これまで、色および形と比較して、芳香性品種の育種についての試みは、ほとんど報告されていない。
【０００３】
しかしながら、近年、ニーズの多様化に伴って、香りに対する理解および消費が高まってきており、香りは、生花における大きな魅力の一つとして捉えられている。また、香りは、人の感性にとって、重要な役割も有している。このような状況において、色、形および日持ち性に加えて、優れた芳香性を示す園芸植物は、高い商品価値を有することが期待され、その開発が望まれている。これまでに、ツバキやスイトピー、シクラメン等に関して、交雑育種による芳香性品種の開発が行われている。この場合、通常、片親には香りの強い野生種または比較的野生種に近い品種が使用されるが、これら野生種またはこれに近い品種は、一般に、園芸種に比べて花が小さく、花色も限られている。このため、得られる交雑種では、花の大きさが既存の品種よりも小さくなる傾向にあり、色のバリエーションも制限されるという問題があった。
【０００４】
他方、花の香りは、多種類の香気成分の混合物であり（非特許文献１）、前記香気成分は、大きく、芳香族化合物、テルペノイド、脂肪族化合物、含窒素化合物等に分類される。花は、例えば、含有される香気成分の違いだけなく、含有される香気成分が同じであっても、その割合によって、香りの質が大きく変化する。このように、様々な香気成分がブレンドされることで、多様な花の香りが生まれている。中でも、リナロールは、バラおよびスズラン等の甘いフローラルな香りを有する花の多くに含まれている。
【０００５】
また、これら植物の主要な香気成分であるリナロールは、花の香気成分としての利用に限定されず、例えば、これらの植物を原料とする食品、酒類等のフレーバーや、化粧品および香水に至る工業製品にまで、幅広く利用されている。
【０００６】
前記リナロールの生合成経路は、植物の場合、細胞質に存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路と、プラスチドに存在するメチルエリトリトール（ＭＥＰ）経路の２種類が知られている。前記メバロン酸経路では、アセチルＣｏＡが他の２分子のアセチルＣｏＡと反応し、還元されて生じるメバロン酸を介して、モノテルペンが合成される。具体的には、メバロン酸が脱炭酸して、イソペンテニルピロリン酸（以下、ＩＰＰと表す）およびジメチルアリルピロリン酸（以下、ＤＭＡＰＰと表す）となり、これら２つが、テルペノイド芳香性化合物の基本構造であるイソプレン骨格の起源となる。一方、メチルエリトリトール経路では、３−ホスホグリセルアルデヒドとピルビン酸から、脱炭酸および異性化を経て生じる２−メチル−エリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）を介して、ＩＰＰとＤＭＡＰＰが合成される。そして、ゲラニルピロリン酸合成酵素（以下、ＧＰＰＳと表す）の作用により、ＤＭＡＰＰに、一分子のＩＰＰが付加することで、ゲラニルピロリン酸（以下、ＧＰＰと表す）となり、ＧＰＰにリナロール合成酵素（以下、ＬＩＳと表す）等のモノテルペン合成酵素が作用し、リナロールが生成する。
【０００７】
前記ＬＩＳ遺伝子は、以下に示すように、これまでに多数の植物から取得されている。前記ＬＩＳ遺伝子は、例えば、Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ由来（Ｓ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献２)、アルテミシア由来（３Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献３)、オウシュウトウヒ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献４)、ラベンダー由来（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献５)、トマト由来（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子（非特許文献６)、キンギョソウ由来ＮＥＳ／ＬＩＳ遺伝子１，２（非特許文献７)、サルナシ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献８)、トラノオジソ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献９)、マタタビ由来ＬＩＳ遺伝子（非特許文献１０)、シトカトウヒ由来ＬＩＳ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＨＱ４２６１６４．１)、カナダトウヒ由来ＬＩＳ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＨＱ４２６１５１．１）等がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｕｄａｒｅｖａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．．１８１−１８９， ２００８
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８， １１３７−１１４８， １９９６
【非特許文献３】Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３７２， １４３−１４９， １９９９
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １３５， １９０８−１９２７， ２００４
【非特許文献５】Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ４６５， ４１７−４２９， ２００７
【非特許文献６】Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． ｂｉｏｌ．， ６４， ２５１−２６３， ２００７
【非特許文献７】Ｐｌａｎｔ Ｊ， ５５， ２２４−２３９， ２００８
【非特許文献８】Ｆｕｎｃｔ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．， ３７， ２３２−２４３， ２０１０
【非特許文献９】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，７１，１０６８−１０７５，２０１０
【非特許文献１０】Ｆｕｎｃｔ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，３７，２３２−２４３，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、交雑育種によると、種々の問題が生じるため、優良な形質を維持したまま、芳香性の付与または改変を行うには、遺伝子組換え技術の適用が有用と考えられる。そこで、本発明は、植物への芳香性の付与または芳香性の改変に利用できる、新たな遺伝子、より詳細には、リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明のポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであることを特徴とする。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１１】
本発明の発現ベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターが導入された非ヒト宿主であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することを特徴とする。
【００１４】
本発明の加工品は、前記本発明の形質転換体、または、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織もしくは細胞の加工品であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の芳香性の改変方法は、非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明の芳香性非ヒト宿主の製造方法は、前記本発明の芳香性の改変方法により、非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明のタンパク質は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドによれば、遺伝子工学的手法によりリナロール合成酵素の発現が可能である。このため、前記本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物に導入して形質転換体を作製することで、前記形質転換体において、リナロール合成酵素が発現し、これによって香気成分であるリナロールの合成が可能となる。このため、本発明によれば、例えば、植物に芳香性を付与したり、その芳香性の改変を行うことができるため、生花等の園芸植物の栽培において、商品価値の高い園芸植物を提供できることから、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の実施例３における、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図２】図２は、本発明の実施例３における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図３】図３は、本発明の実施例３における、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図４】図４は、本発明の実施例４における、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図５】図５は、本発明の実施例４における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図６】図６は、本発明の実施例４における、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図７】図７は、本発明の実施例５における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【図８】図８は、本発明の実施例５における、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質による生成成分のガスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであることを特徴とする。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２１】
これらのポリヌクレオチドは、例えば、後述するように、フリージアおよびスイトピーより取得できる。これまで取得されたリナロール合成酵素遺伝子は、いずれも双子葉植物由来であり、単子葉植物由来のリナロール合成酵素遺伝子については、本発明により初めて明らかにされたものである。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードする。このため、例えば、前記ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることで、リナロール合成活性を有するタンパク質を製造できる。前記タンパク質の発現は、例えば、非ヒト宿主への導入によって行ってもよいし、いわゆる無細胞タンパク質合成系において行ってもよい。また、前記ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させ、発現した前記タンパク質のリナロール合成活性によって、リナロールを合成できる。前記リナロールは、例えば、前記発現したタンパク質を基質として含む反応系に添加して、合成することができ、また、前記非ヒト宿主に前記ポリヌクレオチドを導入し、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質の発現および発現した前記タンパク質によるリナロール合成を行うこともできる。前記非ヒト宿主内で前記リナロール合成を行うことによって、前記非ヒト宿主について、例えば、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等が可能となる。前記ポリヌクレオチドによって芳香性を改変する場合、後述するように、前記非ヒト宿主は、例えば、植物体またはその部分が好ましい。
【００２３】
本発明において、以下、リナロール合成活性をＬＩＳ活性という。本発明のポリヌクレオチドは、ＬＩＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることから、リナロール合成酵素遺伝子（以下、「ＬＩＳ遺伝子」ともいう）と表わすこともできる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、後述する本発明のタンパク質であり、ＬＩＳ活性を有することから、リナロール合成酵素（以下、「ＬＩＳ」または「ＬＩＳタンパク質」ともいう）と表わすこともできる。
【００２４】
前記ＬＩＳ活性は、基質からのリナロールの生成を触媒する活性である。前記基質は、特に制限されず、例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）があげられる。
【００２５】
前記ＬＩＳ活性により生成される前記リナロールは、例えば、他の酵素の働きや自動的な化学変換により、配糖体やアルデヒド体、ケトン体、エステル体等に変換できる。
【００２６】
リナロールは、３位に不斉炭素をもち、（３Ｓ）−リナロールと（３Ｒ）−リナロールとの１組の光学異性体が存在する。（３Ｓ）−リナロールは、例えば、プチグレイン、ラベンダー様香気を有し、（３Ｒ）−リナロールは、例えば、フローラル、ラベンダーおよびウッディ様香気を有する。特に、(３Ｒ)−リナロールは、(３Ｓ)−リナロールに比べて、におい閾値が約８０倍低いことから、微量でも香ることが知られている。このため、本発明において、前記リナロール合成活性は、例えば、（３Ｒ）−リナロール合成活性および（３Ｓ）−リナロール合成活性のいずれでもよく、また、両方でもよく、好ましくは、（３Ｒ）−リナロール合成活性である。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、例えば、ＬＩＳ活性のみを有してもよいし、さらに、その他の触媒機能を有してもよい。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。後者の場合、例えば、センス鎖として、前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドと、アンチセンス鎖として、前記ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを含む。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドから構成されるＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドから構成されるＲＮＡでもよい。後者の場合、例えば、ＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列、具体的には、塩基Ｔが塩基Ｕに置換された塩基配列からなるＲＮＡがあげられる。
【００３０】
前記（ａ）において、配列番号１および配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ）から得られ、具体的には、品種アラジン（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ ｃｖ． Ａｌａｄｄｉｎ）から得られる。配列番号１の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列であり、１〜２３４位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、２３５〜１７７９位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号１の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で表わされ、１〜７８位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、７９〜５９２位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド（ｃＴＰ）配列として存在する。また、配列番号３の塩基配列は、配列番号１において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号３の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４で表わされる。
【００３１】
ＦＡ２５遺伝子（ｓ＋：シグナルペプチドのコード配列を含む）
１７７９ｂｐ（配列番号１）
ATGGCTCTCTTGCCGTGTCTTCCATCTCAGTTTCCATGTTCTCCAGTAACAGGCTTCGTGCGATTGCCTCTTCTCTCTTCCCGTAGGTCATCCAAAGGAGTTCAAAGCTCTAACTATCGTTTTCGCTGTTGTATCAACACTGGAACTTCAGTGTCTCAGCCTTTGCGACGGGCGGCAAGCTATCCACAGAACATATGGGATGATAGCTACATTCAAGCACTCAATTGTGGCTACATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGAAGTGGGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTCTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGAGAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAGTCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCAGAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGAATGATATGGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCGGTGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACATCTGTCAGAGTCATTAGTGGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTTTAGGATGTCGAGGTTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTGCAGAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATTTGGGTCTTGGACAAAAACTGAGCTTTGCTAGAGACAGGTTGGTGGAGAATTACTTGTTTGTTATAGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATGGCAAAATAGGGAAGCAATGACAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAACTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAGCTTCCAGATTATATGAAGACATGCATTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCAACAAAATTATGTACTCGAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAGCGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACTGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTACTGTACAAGTGAGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTAGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACGTCAACGGCCGAAATGGAGAGGGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATGATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCCATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAATATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGACATCAAAAGAGGGAACAAGTCATCTCATTACTTTTTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２５タンパク質（ｓ＋：シグナルペプチドを含む）
５９２ａａ（配列番号２）
MALLPCLPSQFPCSPVTGFVRLPLLSSRRSSKGVQSSNYRFRCCINTGTSVSQPLRRAASYPQNIWDDSYIQALNCGYMGDEQVNEIRKLKEEVGQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMENDLKATSLVFRLLREHGFHASADIFNNFRENKGNFKSCLKNDMEGMINLYEASFFAVEGENQLDEARVFATEHLRHLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLWQNREAMTMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKTCIMALFNTTNLTANKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTSENITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDMIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQYEDGYGEQGHQKREQVISLLFEPIPL
【００３２】
ＦＡ２５遺伝子（ｓ−：シグナルペプチドのコード配列を含まない）
１５４５ｂｐ（配列番号３）
ATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGAAGTGGGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTCTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGAGAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAGTCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCAGAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGAATGATATGGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCGGTGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACATCTGTCAGAGTCATTAGTGGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTTTAGGATGTCGAGGTTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTGCAGAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATTTGGGTCTTGGACAAAAACTGAGCTTTGCTAGAGACAGGTTGGTGGAGAATTACTTGTTTGTTATAGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATGGCAAAATAGGGAAGCAATGACAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAACTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAGCTTCCAGATTATATGAAGACATGCATTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCAACAAAATTATGTACTCGAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAGCGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACTGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTACTGTACAAGTGAGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTAGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACGTCAACGGCCGAAATGGAGAGGGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATGATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCCATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAATATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGACATCAAAAGAGGGAACAAGTCATCTCATTACTTTTTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２５タンパク質（ｓ−：シグナルペプチドを含まない）
５１４ａａ（配列番号４）
MGDEQVNEIRKLKEEVGQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMENDLKATSLVFRLLREHGFHASADIFNNFRENKGNFKSCLKNDMEGMINLYEASFFAVEGENQLDEARVFATEHLRHLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLWQNREAMTMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKTCIMALFNTTNLTANKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTSENITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDMIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQYEDGYGEQGHQKREQVISLLFEPIPL
【００３３】
前記（ａ）において、配列番号５および配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ）から得られ、具体的には、品種アラジン（Ｆｒｅｅｓｉａ ｒｅｆｒａｃｔａ ｃｖ． Ａｌａｄｄｉｎ）から得られる。配列番号５の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列であり、１〜２３４位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、２３５〜１７７９位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号５の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６で表わされ、１〜７８位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、７９〜５９２位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド（ｃＴＰ）配列として存在する。また、配列番号７の塩基配列は、配列番号５において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号７の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８で表わされる。
【００３４】
ＦＡ２６遺伝子（ｓ＋：シグナルペプチドのコード配列を含む）
１７７９ｂｐ（配列番号５）
ATGGCTTTCTTGCCGTGTCTTCCATCTCAGTTTTCATGTTCTCCAGTAACGGGCTTCGTCCGATTGCCTCTTCTCTCTACCCGTAGGTCATCCCAAGGAGTTCAAAGCTCTAACTATCGTTTTCACTGTTGTATCAACACTGGAACTTCAGTGTCTCAGCCTTTGCGACGGACGGCAAGCTATCCACAGAACATATGGGATGATAGCTACATTCAAGCACTCAATTGTGGCTACATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGACGTGAGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTTTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGACAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAATCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCATAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGGATGATATAGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCCATGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACAATTGTCGGAGTCATTAGTAGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTGCATTTTAGGATGTCGAGGCTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTTCAAAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATCTGGGTCTTGGACAAAAGCTGAGCTTTGCTAGAGATAGGTTGGTGGAAAATTACTTGTTTGTTATTGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATCGCAAAATAGGGAAGCAATGGCAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAGCTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAACTTCCAGATTATATGAAGATATGCTTTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCTACAAAATTATGTACTCAAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAACGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACGGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTATTGTACAAATGGGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTCGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACCTCAACGGCCGAAATGGAGAGAGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATCATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCAATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAAAATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGAAATGAAAAAAGGAAACAAGTCATCTCATTACTTATTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２６タンパク質（ｓ＋：シグナルペプチドを含む）
５９２ａａ（配列番号６）
MAFLPCLPSQFSCSPVTGFVRLPLLSTRRSSQGVQSSNYRFHCCINTGTSVSQPLRRTASYPQNIWDDSYIQALNCGYMGDEQVNEIRKLKEDVRQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMDNDLKATSLIFRLLREHGFHASADIFNNFIENKGNFKSCLKDDIEGMINLYEASFFAMEGENQLDEARVFATEHLRQLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLSQNREAMAMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKICFMALFNTTNLTAYKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHNGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTNGNITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDIIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQNEDGYGEQGNEKRKQVISLLIEPIPL
【００３５】
ＦＡ２６遺伝子（ｓ−：シグナルペプチドのコード配列を含まない）
１５４５ｂｐ（配列番号７）
ATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGACGTGAGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTTTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATCAAGGATAAATTATCCACCATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGACAATGATCTTAAGGCAACATCCCTAATCTTTAGGCTTCTAAGGGAGCATGGTTTTCATGCCTCAGCAGATATATTCAACAACTTCATAGAAAACAAAGGAAATTTCAAGTCTTGCCTAAAGGATGATATAGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCCATGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACAATTGTCGGAGTCATTAGTAGAGGCATCACTTAGGGAACGCGTGGCTCATGCCTTGGAGCTTCCACTGCATTTTAGGATGTCGAGGCTGCATACTCGTTGGTTCATAGATTGGTATGAGAAGAAGGTGGACAAGAATTCCAACTTGTGTAGATTGGCCAAGCTAGATTTCAACTTTGTTCAAAACATTTACAAGAGAGAGTTGAAGGAATTGTCAAGGTGGTGGACCAATCTGGGTCTTGGACAAAAGCTGAGCTTTGCTAGAGATAGGTTGGTGGAAAATTACTTGTTTGTTATTGGTTGGGCCTTCGAGCCGAAACTATCGCAAAATAGGGAAGCAATGGCAATGGCAAATTGTTTGGTAACAACATTAGATGACATTTATGACGTCTATGGCTCCTTGGATGAACTAGAGCTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATGCAGAAGCAATTGAACAACTTCCAGATTATATGAAGATATGCTTTATGGCACTCTTCAACACTACAAACCTTACCGCCTACAAAATTATGTACTCAAAGGGTGTCAACATAATTCCACAACTAAGGAGATCGTGGGCAGATCTTTGTAAAGCATACCTAGTGGAGGCCAAGTGGTATCACAACGGATACATGCCTACTCTCGAGGAATATCTAGACACGGCATGGATATCAATATCAGGTCCTGTGGTACTAACTCAGGCTTATTGTACAAATGGGAATATAACAGATGAAGCCCTCAAATGCTACAACTTTTATCCAGATGTCGTACGCCAGTCCTCCATGATTTCTCGGTTATGGAACGATTTGGCAACCTCAACGGCCGAAATGGAGAGAGGTGATGTTCCAAAATCAATTCAATGCTACATGCACGAGAAAGGAGTTTCAGAAGAAGTAGCCAGAGAGCACATAAGGGACATCATTGTTTCCATTTCAAAGAAGTTCGATTATGATTGCATTTCTAATTCCTCAATTGCCGAATCACTGAAATCGGTAGCACTTGATGTCCATAGAATGTCACAATGCGTATATCAAAATGAAGATGGATATGGAGAACAGGGAAATGAAAAAAGGAAACAAGTCATCTCATTACTTATTGAACCCATTCCCCTCTAA
ＦＡ２６タンパク質（ｓ−：シグナルペプチドを含まない）
５１４ａａ（配列番号８）
MGDEQVNEIRKLKEDVRQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMDNDLKATSLIFRLLREHGFHASADIFNNFIENKGNFKSCLKDDIEGMINLYEASFFAMEGENQLDEARVFATEHLRQLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRWWTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLSQNREAMAMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRWDAEAIEQLPDYMKICFMALFNTTNLTAYKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKWYHNGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTNGNITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLWNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDIIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQNEDGYGEQGNEKRKQVISLLIEPIPL
【００３６】
前記（ａ）において、配列番号９および配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、スイトピー（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｏｄｏｒａｔｕｓ）から得られ、具体的には、品種スイートスノー（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｏｄｏｒａｔｕｓ ｃｖ．Ｓｗｅｅｔ Ｓｎｏｗ）から得られる。配列番号９の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列であり、１〜２５２位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、２５３〜１６９２位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号９の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０で表わされ、１〜８４位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、８５〜５６３位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記スイトピーにおいては、クロロプラスト トランジット（ｃＴＰ）配列として存在する。また、配列番号１１の塩基配列は、配列番号９において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号１１の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２で表わされる。
【００３７】
ＳＳ１９遺伝子（ｓ＋：シグナルペプチドのコード配列を含む）
１６９２ｂｐ（配列番号９）
ATGGCTGTTACTTCTCAACTACGAGTTTCATATCTCACAAACTCAATTCCTCGTTGCAACTCTTGGACTTCTACGTATCACTCACGGAATTTGTCGCTTAAAACTTCAAATTCAAGGATGGTTCATATTAAGTCCATTGCTTTTAATGATAAGTTGCCACCTTTACAGAAAGTTGACAAGACAAGAAGTTTGGAGCAAGTCAAACGAAGAAGCCGAGACTCATTGTTAAATTCGAGTGATCCTATTGAAACGATGAAGATGATTGACTCAATCCAAGGGCTAGGAATTAGCCACCATTTGGAAGATGAGGTCAATATACAACTTGAGAGGATATGTGATTGGGATGCTTCTACAAACCTCTTTGCAACATCTCTTCAATTTCGTTTACTTAGGCATAATGGTTGGCCTACATGTTCTGACATATTCAGAGACTTCTTGGACAAAAGTGGCAATTTCAAAGAATCACTCGCCAAAGACATTTTTGGTATGTTGAGCCTATATGAGGCATCATATTTAGGGACAGAAGATGAAGAAATATTAAAGAAGGCCATGCAATTTTCTAAGGATCATTTAAATGAGTCAATCCCACACCTTAGTCCTGAAGTTGGTAAACATATTGATAGAGCTTTAACACTTCCAAAGCACCTAAGAATGGCAAGGTTAGAAGCTAGAAACTACATGGATGAATATAGACATGCAAGTAAGCAAATACCAGCTCTTTGGGAATTGGCAAAGTTAGACAATGACATGATTCAATCACTACATCAGACAGAATTAAGAGAAATATGCAGGTGGTGGAAAGAGTTGGGACTTGTGGAAAAACTAAGTTTTGCCAGAGATAGACCAACAGAGTGCTTCTTATGGACAGTTGGAATTTTTCCAGAACCATGTTATACAAATTGTCGAATCGAACTTACAAAAACTATATGCATTTTGGATGTTATTGATGACATCTTTGACAATTACGGCACATTAGATGAACTTATTCTTTTCACAAATGCAATCAAAAGGTGGGACCTTGATTCAATGGAGCAACTTCCTGAGTATATGAAGATATGTTACATGGCATTATATAACACCACAAATGAAATTTCCTATAAAATTCAAACAGTGCATGGGATAAATGGTCTTTCATACTTAAAAAGAACATGGATGGACATGTTTGATGCATATTTGGAAGAAGCGAAATGGTTCAATAGTGGATATGTGCCAAGTTTTAGGACATATTTGGATAATGGAACAATTTCTGTTGGATCATGCATGGCTATGGTGCATGCTACTTTCCTCATTGGTAATGGTTTATCAAAGGAAACTATTTCCATGATGAGGCCATATCCTAGACTCTTCACTTGTACCGGAGAAATTCTTCGATTATGGGATGACTTAGGAACATCAACGGAGGAACGTGAAAGAGGGGATAATGCTTCTAGCATAGAATGCTTGATGGAAGAGAATAATATTTTGGATGAAAATGAGAGTAGGAAACACATAAGACTGTTAATAAGGAACTTGTGGCGAGAACTCAATGGCCTTGCCATGAACAAAACCATGCCATTGTCTGTTGTTAAATCTTCTCTTAACATGGCTAGAACTGCTCAAGTTATTTATCAACATGGAGATGATCAAAGCACTTTTACTGTTGATGATTATGTGCAAACACTGATTTTCTCATCATTACCCACTAGCCATTAA
ＳＳ１９タンパク質（ｓ＋：シグナルペプチドを含む）
５６３ａａ（配列番号１０）
MAVTSQLRVSYLTNSIPRCNSWTSTYHSRNLSLKTSNSRMVHIKSIAFNDKLPPLQKVDKTRSLEQVKRRSRDSLLNSSDPIETMKMIDSIQGLGISHHLEDEVNIQLERICDWDASTNLFATSLQFRLLRHNGWPTCSDIFRDFLDKSGNFKESLAKDIFGMLSLYEASYLGTEDEEILKKAMQFSKDHLNESIPHLSPEVGKHIDRALTLPKHLRMARLEARNYMDEYRHASKQIPALWELAKLDNDMIQSLHQTELREICRWWKELGLVEKLSFARDRPTECFLWTVGIFPEPCYTNCRIELTKTICILDVIDDIFDNYGTLDELILFTNAIKRWDLDSMEQLPEYMKICYMALYNTTNEISYKIQTVHGINGLSYLKRTWMDMFDAYLEEAKWFNSGYVPSFRTYLDNGTISVGSCMAMVHATFLIGNGLSKETISMMRPYPRLFTCTGEILRLWDDLGTSTEERERGDNASSIECLMEENNILDENESRKHIRLLIRNLWRELNGLAMNKTMPLSVVKSSLNMARTAQVIYQHGDDQSTFTVDDYVQTLIFSSLPTSH
【００３８】
ＳＳ１９遺伝子（ｓ−：シグナルペプチドのコード配列を含まない）
１４４０ｂｐ（配列番号１１）
ATGAAGATGATTGACTCAATCCAAGGGCTAGGAATTAGCCACCATTTGGAAGATGAGGTCAATATACAACTTGAGAGGATATGTGATTGGGATGCTTCTACAAACCTCTTTGCAACATCTCTTCAATTTCGTTTACTTAGGCATAATGGTTGGCCTACATGTTCTGACATATTCAGAGACTTCTTGGACAAAAGTGGCAATTTCAAAGAATCACTCGCCAAAGACATTTTTGGTATGTTGAGCCTATATGAGGCATCATATTTAGGGACAGAAGATGAAGAAATATTAAAGAAGGCCATGCAATTTTCTAAGGATCATTTAAATGAGTCAATCCCACACCTTAGTCCTGAAGTTGGTAAACATATTGATAGAGCTTTAACACTTCCAAAGCACCTAAGAATGGCAAGGTTAGAAGCTAGAAACTACATGGATGAATATAGACATGCAAGTAAGCAAATACCAGCTCTTTGGGAATTGGCAAAGTTAGACAATGACATGATTCAATCACTACATCAGACAGAATTAAGAGAAATATGCAGGTGGTGGAAAGAGTTGGGACTTGTGGAAAAACTAAGTTTTGCCAGAGATAGACCAACAGAGTGCTTCTTATGGACAGTTGGAATTTTTCCAGAACCATGTTATACAAATTGTCGAATCGAACTTACAAAAACTATATGCATTTTGGATGTTATTGATGACATCTTTGACAATTACGGCACATTAGATGAACTTATTCTTTTCACAAATGCAATCAAAAGGTGGGACCTTGATTCAATGGAGCAACTTCCTGAGTATATGAAGATATGTTACATGGCATTATATAACACCACAAATGAAATTTCCTATAAAATTCAAACAGTGCATGGGATAAATGGTCTTTCATACTTAAAAAGAACATGGATGGACATGTTTGATGCATATTTGGAAGAAGCGAAATGGTTCAATAGTGGATATGTGCCAAGTTTTAGGACATATTTGGATAATGGAACAATTTCTGTTGGATCATGCATGGCTATGGTGCATGCTACTTTCCTCATTGGTAATGGTTTATCAAAGGAAACTATTTCCATGATGAGGCCATATCCTAGACTCTTCACTTGTACCGGAGAAATTCTTCGATTATGGGATGACTTAGGAACATCAACGGAGGAACGTGAAAGAGGGGATAATGCTTCTAGCATAGAATGCTTGATGGAAGAGAATAATATTTTGGATGAAAATGAGAGTAGGAAACACATAAGACTGTTAATAAGGAACTTGTGGCGAGAACTCAATGGCCTTGCCATGAACAAAACCATGCCATTGTCTGTTGTTAAATCTTCTCTTAACATGGCTAGAACTGCTCAAGTTATTTATCAACATGGAGATGATCAAAGCACTTTTACTGTTGATGATTATGTGCAAACACTGATTTTCTCATCATTACCCACTAGCCATTAA
ＳＳ１９タンパク質（ｓ−：シグナルペプチドを含まない）
４７９ａａ（配列番号１２）
MKMIDSIQGLGISHHLEDEVNIQLERICDWDASTNLFATSLQFRLLRHNGWPTCSDIFRDFLDKSGNFKESLAKDIFGMLSLYEASYLGTEDEEILKKAMQFSKDHLNESIPHLSPEVGKHIDRALTLPKHLRMARLEARNYMDEYRHASKQIPALWELAKLDNDMIQSLHQTELREICRWWKELGLVEKLSFARDRPTECFLWTVGIFPEPCYTNCRIELTKTICILDVIDDIFDNYGTLDELILFTNAIKRWDLDSMEQLPEYMKICYMALYNTTNEISYKIQTVHGINGLSYLKRTWMDMFDAYLEEAKWFNSGYVPSFRTYLDNGTISVGSCMAMVHATFLIGNGLSKETISMMRPYPRLFTCTGEILRLWDDLGTSTEERERGDNASSIECLMEENNILDENESRKHIRLLIRNLWRELNGLAMNKTMPLSVVKSSLNMARTAQVIYQHGDDQSTFTVDDYVQTLIFSSLPTSH
【００３９】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、塩基は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換および／または付加されてもよい。付加は、例えば、配列内への挿入の意味も含む。本発明において、塩基数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３個」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００４０】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００４１】
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイ、プラークハイブリダイゼーションアッセイ等の公知の方法があげられる。ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００４２】
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００４３】
前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｅ）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。具体的として、配列番号２または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（ａ）における配列番号１または３の塩基配列があげられる。配列番号６または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（ａ）における配列番号５または７の塩基配列があげられる。配列番号１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（ａ）における配列番号９または１１の塩基配列があげられる。
【００４４】
前記（ｆ）において、アミノ酸に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ酸は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換および／または付加されてもよい。
【００４５】
前記（ｇ）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｇ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、前述のように、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドの使用目的は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにコードされる本発明のＬＩＳタンパク質の製造、前記ＬＩＳタンパク質を発現する発現ベクターの製造、前記ＬＩＳタンパク質を発現する形質転換体の製造、前記ＬＩＳタンパク質のリナロール合成活性によるリナロールの合成等である。前記本発明のポリヌクレオチドから本発明のＬＩＳタンパク質を製造する場合、前記ポリヌクレオチドは、例えば、無細胞タンパク質合成系に使用してもよいし、前記非ヒト宿主に導入して使用してもよい。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドの使用方法は、特に制限されず、例えば、非ヒト宿主（以下、宿主ともいう）に導入することが好ましい。前記宿主に前記ポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明のＬＩＳタンパク質の製造、前記本発明のＬＩＳタンパク質を発現する形質転換体の製造、本発明のＬＩＳタンパク質を発現してリナロールを合成する形質転換体の製造等が可能である。前記宿主は、特に制限されず、例えば、前述した本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて、適宜選択できる。前記宿主は、例えば、植物体またはその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等があげられる。
【００４９】
本発明において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体を意味し、「植物体の部分」は、前記植物個体の部分であり、例えば、器官、組織または細胞等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎（地下茎）、根、むかご等があげられる。前記茎は、例えば、球根等の鱗茎、塊茎、球茎、根茎、ライナー等があげられ、前記根は、例えば、塊根、横走根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記植物体の部分は、例えば、一種類の器官、組織および／または細胞でもよいし、二種類以上の器官、組織および／また細胞でもよい。
【００５０】
前記本発明のポリヌクレオチドによって、前記非ヒト宿主の芳香性を改変する場合、前記非ヒト宿主は、例えば、前記植物体またはその部分が好ましい。前記植物体の種類および前記植物体の部分の種類は、特に制限されない。前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入することによって、例えば、前記非ヒト宿主の非芳香性を芳香性に改変したり、リナロールに由来する芳香性をより増強できる。また、導入前の非ヒト宿主が本来有する芳香化合物とは異なる芳香化合物としてリナロールを合成し、異なる芳香性に改変したり、リナロールのさらなる合成によって、異なる芳香性に改変することが可能である。前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドを導入することにより得られる形質転換体は、後述する本発明の形質転換体であり、芳香性改変形質転換体ともいう。また、前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、芳香性改変植物体ともいう。
【００５１】
芳香性の改変の対象となる植物は、特に制限されず、例えば、ナス科植物（例えば、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、ゴマノハグサ科植物（トレニア等）、ベンケイソウ科植物（カランコエ）、ユリ科植物（チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ等）、アジサイ科植物（アジサイ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）等があげられる。前記芳香性植物は、特に制限されず、例えば、バラ、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ等）、ナス科植物（例えば、ペチュニア等）、バラ科植物（例えば、バラ等）、ラン科植物（ラン等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ユリ科植物（ユリ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）等があげられる。これらの中でも、好ましくは、カーネーションおよびトレニアである。
【００５２】
前記本発明のポリヌクレオチドによって、前記本発明のＬＩＳタンパク質を製造する場合、前記非ヒト宿主は、特に制限されない。前記非ヒト宿主は、前述と同様であるが、中でも、微生物、動物細胞、昆虫細胞、またはこれらの培養細胞等が好ましい。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明のＬＩＳタンパク質を製造できる。前記非ヒト宿主に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより得られる形質転換体は、前述と同様に、本発明の形質転換体である。
【００５３】
前記本発明のポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
【００５４】
前記導入方法は、例えば、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、中でも、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、後述するような本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【００５５】
前記宿主が、植物体またはその部分の場合、前記ポリヌクレオチドの導入は、例えば、前記植物体およびその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは、前記植物体の部分であり、より好ましくは、前記組織または細胞であり、さらに好ましくは細胞である。前記組織は、例えば、前記植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【００５６】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを容易に前記宿主へ導入でき、また、前記宿主における前記本発明のポリヌクレオチドの発現を、容易に制御できる。
【００５７】
本発明の発現ベクターの使用目的および使用方法は、特に制限されず、前述の本発明のポリヌクレオチドと同様である。
【００５８】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記宿主において、前記本発明のポリヌクレオチドがコードする前記本発明のＬＩＳタンパク質を発現可能なように、前記本発明のポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記宿主は、特に制限されず、前述のように、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて、適宜選択できる。前記宿主は、前記本発明のポリヌクレオチドの説明と同様に、例えば、植物体またはその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等があげられる。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記本発明のポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合、例えば、バイナリーベクターが好ましく、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＰＺＰ２０２、ｐＢＩＮＰＬＵＳおよびｐＢＩＮ１９等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（Merck社）、ｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ株式会社）、ＰＱＥベクター（QIAGEN社）等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられ、また、ｐＹＥＳ（Invitrogen社)、ｐＥＳＣ(Stratagene社)等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。
【００６０】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明のＬＩＳタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等があげられる。前記プロモーターは、この他に、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター等があげられる。本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記本発明のＬＩＳタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００６１】
本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００６２】
本発明の発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、宿主の種類、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。
【００６３】
前記導入方法は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの説明と同様であり、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記宿主が植物体またはその部分の場合、例えば、中でも、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。
【００６４】
前記発現ベクターの導入は、例えば、本発明のポリヌクレオチドの説明と同様である。前記宿主は、例えば、前述の通りである。前記宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、植物体およびその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは前記植物体の部分であり、より好ましくは前記組織または前記細胞であり、さらに好ましくは細胞である。前記組織は、例えば、前記植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。本発明の発現ベクターの導入により得られる形質転換体は、後述する本発明の形質転換体であり、芳香性改変形質転換体または芳香性改変植物体ともいう。
【００６５】
前記本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入して得られる形質転換体は、例えば、さらに、生育させてもよい。本発明において、「形質転換体」は、例えば、さらに、これらを生育させた生育体の意味も含む。例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを、前記非ヒト宿主に導入して前記形質転換体を得た場合、前記非ヒト宿主を生育させて、さらに、組織、器官または個体に再生させてもよい。このようにして得られた、培養細胞、組織、器官または個体は、本発明において、前述のように、形質転換体に含まれる。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、さらに、組織、器官または植物個体に再生することが好ましい。
【００６６】
＜形質転換体等＞
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主であることを特徴とする。また、本発明の形質転換体は、前記ポリヌクレオチドを有する前記本発明の発現ベクターが導入された非ヒト宿主でもよい。以下、「本発明のポリヌクレオチドの導入」は、特に示さない限り、「本発明の発現ベクターの導入」の意味も含む。
【００６７】
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された非ヒト宿主であればよく、その他の構成は、何ら制限されない。「ポリヌクレオチドが発現可能」は、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能であるとの意味を含む。前記非ヒト宿主に対する、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記本発明の発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記本発明の発現ベクターにおける説明を引用できる。
【００６８】
本発明の形質転換体の使用方法は、特に制限されない。前記本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドの発現によって、前記本発明のＬＩＳタンパク質を発現可能である。このため、前記形質転換体は、本発明のＬＩＳタンパク質の製造に使用できる。前記形質転換体により製造された本発明のＬＩＳタンパク質は、リナロール合成活性を示すことから、前述のようにリナロール合成に使用できる。前記リナロールは、例えば、前記形質転換体から回収した前記ＬＩＳタンパク質を、基質を含む反応液に添加して、合成することもできるし、前記形質転換体において、前記ＬＩＳタンパク質の発現および前記ＬＩＳタンパク質によるリナロール合成を行うこともできる。前記形質転換体内で前記リナロール合成を行うことによって、例えば、前記形質転換体について、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等が可能となる。このような形質転換体は、例えば、芳香性改変形質転換体ということもできる。
【００６９】
前記本発明の形質転換体は、例えば、前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターを導入した後、さらに生育させて得られた生育体でもよい。具体例として、前記本発明のポリヌクレオチドを、前記細胞に導入して前記形質転換体を得た場合、例えば、前記細胞を生育させて、さらに、組織、器官または個体に再生させてもよい。このようにして得られた組織、器官または個体は、本発明において、前述のように、形質転換体に含まれる。
【００７０】
本発明の形質転換体は、導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、ＬＩＳ活性を有する前記本発明のＬＩＳタンパク質が発現されていることが好ましい。また、本発明の形質転換体は、例えば、さらに生育させることで、前記導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、前記本発明のＬＩＳタンパク質が発現されてもよい。
【００７１】
芳香性を改変する場合、前記形質転換体は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された植物体またはその部分が好ましい。前記形質転換体は、例えば、芳香性改変植物体ということもできる。前記形質転換体は、より好ましくは、前記植物体の部分であり、さらに好ましくは、組織または細胞であり、特に好ましくは細胞である。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、さらに、組織、器官または植物個体に再生することが好ましい。
【００７２】
本発明の形質転換体において、前記リナロールが合成される部位は、特に制限されない。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記合成される部位は、例えば、花弁、花冠、花、葉、茎、根等があげられる。
【００７３】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに繁殖させることができる。この際、本発明の形質転換体は、前記繁殖材料として使用できる。前記繁殖材料は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の全体でもよいし、部分でもよい。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記繁殖材料は、例えば、種子、果実、シュート、塊茎等の茎、塊根等の根、株、カルス、プロトプラスト等があげられる。
【００７４】
本発明の形質転換体の繁殖方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記繁殖方法は、例えば、有性生殖および無性生殖のいずれでもよく、好ましくは無性生殖である。前記無性生殖による繁殖は、例えば、栄養繁殖（vegetative propagation）があげられ、栄養生殖（vegetative reproduction）ともいう。前記栄養繁殖の方法は、特に制限されず、前記植物体またはその部分の場合、例えば、挿し芽、挿し木による繁殖、器官からの植物個体への細分化、カルスによる増殖等があげられる。前記器官は、例えば、前述したような葉、茎、根等が利用できる。
【００７５】
前記形質転換体を栄養繁殖することにより得られる繁殖体を、以下、本発明の栄養繁殖体という。本発明の栄養繁殖体は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の栄養繁殖体は、前記形質転換体と同様に、特に制限されず、例えば、植物体またはその部分があげられる。
【００７６】
また、前記形質転換体を有性生殖した場合、例えば、種子、これから生育した生育体等の子孫が得られる。本発明の子孫は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を得ることが好ましい。本発明の子孫は、例えば、前記形質転換体と同様に、例えば、植物体またはその部分のいずれでもよい。
【００７７】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに加工してもよい。加工する前記形質転換体の種類は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等があげられる。前記形質転換体の加工品は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等を乾燥させたポプリ、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、樹脂密封品等があげられる。また、本発明の加工品は、例えば、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品でもよい。
【００７８】
＜非ヒト宿主の芳香性の改変方法および芳香性改変非ヒト宿主の製造方法＞
本発明の非ヒト宿主の芳香性の改変方法は、前述のように、前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入する工程を含むことを特徴とする。また、本発明の非ヒト宿主の芳香性の改変方法は、前記非ヒト宿主に、前記ポリヌクレオチドを含む前記本発明の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴としてもよい。
【００７９】
本発明によれば、例えば、前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入することで、前述した本発明の形質転換体が得られる。前記形質転換体は、前述のように、ＬＩＳ活性を有する前記本発明のタンパク質が発現することによって、リナロールを合成できる。このため、本発明の改変方法によれば、例えば、前記非ヒト宿主の芳香性を、未導入の場合と比較して、非芳香性から芳香性に改変、未導入よりも芳香性を増強、未導入とは異なる芳香性等に改変できる。本発明の改変方法により得られる本発明の形質転換体は、前述のように、例えば、前記芳香性改変形質転換体ということもできる。
【００８０】
本発明において、前記非ヒト宿主は、特に制限されず、前述のものがあげられるが、中でも前記植物体またはその部分が好ましい。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、前記芳香性改変植物体ということもできる。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前述と同様に、植物体およびその部分のいずれに導入してもよく、好ましくは、前記植物体の部分であり、より好ましくは、組織および細胞であり、さらに好ましくは、細胞である。前記本発明のポリヌクレオチドを導入する方法は、何ら制限されず、前述の方法が引用できる。
【００８１】
本発明の改変方法は、前記導入工程の後、さらに、前記ポリヌクレオチドが導入された前記非ヒト宿主、すなわち、前記本発明の形質転換体を生育する工程を有することが好ましい。前記導入工程で得られる前記形質転換体が前記器官、前記組織または細胞の場合、この生育工程において、前記器官は個体に、前記組織は器官または個体に、前記細胞は組織、器官または個体に、再生することが好ましい。前記生育の条件は、特に制限されず、前記形質転換体の種類に応じて、適宜設定できる。前記形質転換体が、例えば、前記植物体の部分、具体的に、前記器官、前記組織または細胞の場合、この生育工程において、前記器官は植物個体に、前記組織は器官または植物個体に、前記細胞は組織、器官または植物個体に、再生することが好ましい。
【００８２】
前記形質転換体は、前述のように、導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、ＬＩＳ活性を有する前記本発明のタンパク質が発現されていることが好ましい。また、前記形質転換体は、例えば、前記生育工程において生育させることで、前記導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、前記本発明のタンパク質が発現されてもよい。
【００８３】
前記芳香性が改変する部位は、特に制限されない。前記形質転換体が植物体またはその部分の場合、例えば、植物体全体でもよいし、花弁、花冠、花、葉、茎、根等でもよい。
【００８４】
次に、本発明の芳香性改変非ヒト宿主の製造方法は、前述のように、前記本発明の芳香性の改変方法により、前記非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の芳香性の改変方法を実施することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法は、特に示さない限り、前記本発明の芳香性の改変方法を引用できる。
【００８５】
本発明において、芳香性の改変は、例えば、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等のいずれでもよい。
【００８６】
＜ＬＩＳタンパク質＞
本発明のタンパク質は、前述のように、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＩＳ活性を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＬＩＳ活性を有するタンパク質
【００８７】
本発明のタンパク質は、前述のように、ＬＩＳ活性を有するタンパク質であり、ＬＩＳまたはＬＩＳタンパク質ということもできる。本発明のＬＩＳタンパク質は、特に示さない限り、前記本発明のポリヌクレオチドの説明を引用できる。本発明のＬＩＳタンパク質は、前述のようにＬＩＳ活性を有していればよく、例えば、ポリペプチドでもよい。
【００８８】
前記（Ａ）において、配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、前述の通りである。
【００８９】
前記（Ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｂ）のアミノ酸配列からなるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記（Ａ）のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ酸は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換および／または付加されてもよい。
【００９０】
前記（Ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｃ）のアミノ酸配列からなるタンパク質が、前記ＬＩＳ活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、塩基配列の同一性と同様であり、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【００９１】
本発明のＬＩＳタンパク質は、例えば、食品、酒類、化粧品および香水等の工業製品の香料として使用できるリナロールの合成に使用できる。
【００９２】
＜ＬＩＳタンパク質の製造方法＞
本発明のタンパク質の製造方法は、リナロール合成活性を有するタンパク質の製造方法であり、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させることにより、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする。
【００９３】
本発明の製造方法は、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させて、前記本発明のＬＩＳタンパク質を合成することが特徴であり、その他の方法および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法において、前記本発明のポリヌクレオチドの発現は、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
【００９４】
前記タンパク質合成工程は、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程があげられる。前記非ヒト宿主は、例えば、前述と同様であり、好ましくは、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等である。前記非ヒト宿主への導入方法は、特に制限されず、前述の記載が引用できる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより導入されてもよく、前記非ヒト宿主は、例えば、前記発現ベクターが導入された非ヒト宿主があげられる。前記培養の方法は、特に制限されず、前記非ヒト宿主の種類に応じて適宜設定できる。
【００９５】
また、前記タンパク質合成工程は、前述のように、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程でもよい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、前記本発明の発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、市販の試薬キットが使用できる。
【００９６】
本発明の製造方法は、例えば、さらに、前記ＬＩＳタンパク質を精製する工程を含んでもよい。前記ＬＩＳタンパク質の精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００９７】
＜リナロールの製造方法＞
本発明のリナロールの製造方法は、前記本発明のＬＩＳタンパク質を使用し、前記ＬＩＳタンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成するリナロール合成工程を含むことを特徴とする。
【００９８】
本発明の製造方法は、前記本発明のＬＩＳタンパク質を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法により得られるリナロールは、例えば、（３Ｒ）−リナロールおよび（３Ｓ）−リナロールがあげられ、好ましくは、（３Ｒ）−リナロールである。
【００９９】
本発明の製造方法において、前記ＬＩＳタンパク質は、例えば、予め製造したＬＩＳタンパク質を使用してもよいし、前記本発明のポリヌクレオチドの発現により合成してもよい。
【０１００】
前者の場合、前記ＬＩＳタンパク質は、例えば、本発明のＬＩＳタンパク質の製造方法により得ることができる。前記ＬＩＳタンパク質は、例えば、非精製タンパク質でもよいが、精製タンパク質が好ましい。
【０１０１】
後者の場合、本発明の製造方法は、例えば、前記ＬＩＳタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含み、前記リナロール合成工程において、前記合成したＬＩＳタンパク質を使用することが好ましい。前記タンパク質合成工程は、特に制限されず、例えば、前記本発明のＬＩＳタンパク質の製造方法によりタンパク質を合成する工程があげられる。具体的には、例えば、前記タンパク質合成工程において、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された前記非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成することが好ましい。この際、前記非ヒト宿主において合成した前記ＬＩＳタンパク質を単離して、前記リナロール合成工程に使用できる。また、例えば、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質合成工程と前記リナロール合成工程とを行ってもよい。つまり、前記タンパク質合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記ＬＩＳタンパク質を合成する工程であり、前記リナロール合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記合成したＬＩＳタンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成する工程でもよい。
【０１０２】
このようにして得られたリナロールは、例えば、食品、酒類、化粧品および香水等の工業製品の香料として使用できる。
【実施例】
【０１０３】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【０１０４】
［実施例１］
単子葉植物フリージア花弁および双子葉植物スイトピー花弁から、ＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡのクローニングを行った。
【０１０５】
（１）スクリーニング１
フリージア（品種アラジン）およびスイトピー（品種スイートスノー）の新鮮な花弁約２〜３ｇから、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、製造業者が推奨する方法で、トータルＲＮＡを取得し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（ｓｕｐｅｒ）ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、ｐｏｌｙＡを付加したｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。前記ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ−４ ＲＸＮ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、それぞれ、７．２×１０４ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔおよび７．１×１０４ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔであった。
【０１０６】
そして、既知のラベンダー由来（Ｒ）−リナロール合成酵素（ＬａＬＩＳ）のｃＤＮＡ（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． ４６５， ２００７）をプローブとして、前記ｃＤＮＡライブラリーを用いてスクリーニングを行った。
【０１０７】
前記プローブは、以下のようにして作製した。まず、ＰＣＲにより、ＬａＬＩＳ ｃＤＮＡの全長領域のオリゴヌクレオチドを増幅するとともに、ＤＩＧ標識システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者が推奨する条件に従って、前記オリゴヌクレオチドにラベルした。ＰＣＲには、鋳型として、ＬａＬＩＳ ｃＤＮＡを含むプラスミド１０ｎｇ、プライマーとして、以下に示す２種類のオリゴヌクレオチド各０．２μｍｏｌ／Ｌを使用した。ＰＣＲの条件は、９５℃で２分反応させた後、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の反応を１サイクルとして、合計３５サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。ＰＣＲ後の反応物を、Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ロシュ）で精製し、精製物をスクリーニングのプローブとした。
（プライマー）
ＬａＬＩＳＤＩＧ−Ｆ（配列番号１３）
5’-ATGTCGATCAATATCAACATGCCTGC-3’
ＬａＬＩＳＤＩＧ−Ｒ（配列番号１４）
5’-TCATGCGTACGGCTCGAACAG-3’
【０１０８】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ノンラジオシステムＤＮＡ検出キット（ロシュ）を用いて行った。ハイブリダイゼーションは、０．０２％ＳＤＳおよび３０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて、６５℃で３０分間を２回行った。そして、約２４万プラークをスクリーニングし、フリージアのｃＤＮＡライブラリーから４５個、スイトピーのｃＤＮＡライブライリーから４１個のポジティブシグナルを得た。しかしながら、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により、塩基配列を解析した結果、前記ＬａＬＩＳ遺伝子と有意な相同性を有するクローンは得られなかった。
【０１０９】
（２）スクリーニング２（フリージア由来ＬＩＳ遺伝子ｃＤＮＡ）
前記（１）において、既知のＬＩＳ遺伝子の配列に基づく相同性を利用したスクリーニングでは、フリージアのＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡがクローニングできないことが明らかとなった。そこで、以下に示すディジェネレートプライマーを作製した。プライマーの組合せは、（ｉ）ＬＩＳｄｐＦ１とＬＩＳｄｐＲ１、（ｉｉ）ＬＩＳｄｐＦ２とＬＩＳｄｐＲ１、（ｉｉｉ）ＬＩＳｄｐＦ３とＬＩＳｄｐＲ１、（ｉｖ）ＬＩＳｄｐＦ１とＬＩＳｄｐＲ２、（ｖ）ＬＩＳｄｐＦ２とＬＩＳｄｐＲ２、（ｖｉ）ＬＩＳｄｐＦ３とＬＩＳｄｐＲ２の合計６通りとした。下記配列において、「I」はイノシンである。
（プライマー）
ＬＩＳｄｐＦ１（配列番号１５）
5’-GA(C/T)GA(C/T)GTITA(C/T)GA(C/T)AT(A/C/T)-3’
ＬＩＳｄｐＦ２（配列番号１６）
5’-GA(C/T)GA(C/T)GTITA(C/T)GA(C/T)GTITA(C/T)-3’
ＬＩＳｄｐＦ３（配列番号１７）
5’-GA(C/T)GA(C/T)AT(A/C/T)TT(C/T)GTITA(C/T)-3’
ＬＩＳｄｐＲ１（配列番号１８）
5’-IGTICCIA(A/G)(A/G)TC(A/G)TCIGG-3’
ＬＩＳｄｐＲ２（配列番号１９）
5’-ICCIA(A/G)(A/G)TC(A/G)TCCCA-3’
【０１１０】
フリージア（品種アラジン）の花弁より、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、トータルＲＮＡを抽出し、このうち１μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者が推奨する方法でｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡ １μｌを鋳型とし、前記組合せのディジェネレートプライマー２種類（各０．２μｍｏｌ／Ｌ）およびＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）１．２５Ｕを用いて、製造業者の推奨する方法により、計５０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分反応させた後、９４℃で３０秒、４０℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとし、合計４０サイクル繰り返した後、７２℃で７分間保持した。
【０１１１】
ＰＣＲ反応後、前記反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した。その結果、フリージアについて、前記（ｖ）ＬＩＳｄｐＦ２とＬＩＳｄｐＲ２のプライマーに用いた反応液において、約０．５ｋｂの増幅断片が得られた。前記増幅断片を回収し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このプラスミドを、ｐＣＲ２．１−ＦＡＦ２Ｒ２＃３８とし、その塩基配列を決定した。
【０１１２】
前記クローンＦＡＦ２Ｒ２＃３８の完全長ｃＤＮＡを取得するために、前記クローンをプローブとして、前記（１）のフリージア由来のｃＤＮＡ ライブラリーを用いてスクリーニングを行った。
【０１１３】
前記プローブは、以下のようにして作製した。まず、ＰＣＲにより、前記クローンの全長領域のオリゴヌクレオチドを増幅すると共に、ＤＩＧ標識システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、製造者が推奨する条件に従って、前記オリゴヌクレオチドにラベルした。ＰＣＲには、鋳型として、１０ｎｇのそれぞれの前記クローンｃＤＮＡを含むプラスミド １０ｎｇ、プライマーとして、以下に示す２種類のオリゴヌクレオチド各０．２μｍｏｌ／Ｌを使用した。ＰＣＲの条件は、９５℃で２分反応させた後、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の反応を１サイクルとして合計３５サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。ＰＣＲ後の反応物を、Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ロシュ）で精製し、精製物をスクリーニングのプローブとした。
（プライマー）
ＤＩＧ−ＦＡ＃３８Ｆ（配列番号２０）
5’-GATGATGTGTATGATGTGTATGGCTCCTT-3’
ＤＩＧ−ＦＡ＃３８Ｒ（配列番号２１）
5’-TGCCGAGGTCGTCCCATAACC-3’
【０１１４】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ノンラジオシステムＤＮＡ検出キット（ロシュ）を用いて行った。ハイブリダイゼーションは、０．０２％ＳＤＳおよび３０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、メンブレンは、２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを用いて６５℃で３０分間洗浄した後、０．５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを用いて６５℃で３０分間洗浄した。そして、約２４万プラークをスクリーニングした。後述する実施例２と同様の方法により、得られたポジティブクローンについてタンパク質を発現させ、目的のＬＩＳ合成活性を確認したところ、配列番号１の塩基配列からなるＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡ（ＦＡ２５ ｃＤＮＡ）および配列番号５の塩基配列からなるＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡ（ＦＡ２６ ｃＤＮＡ）が取得できた。
【０１１５】
（３）スクリーニング３（スイトピー由来ＬＩＳ遺伝子ｃＤＮＡ）
前述のように、前記（１）において、既知のＬIＳ遺伝子の配列に基づく相同性を利用したスクリーニングでは、スイトピーのＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡがクローニングできないことが明らかとなった。そこで、前記（２）と同じディジェネレートプライマーを作製した。
【０１１６】
前記（２）と同様にして、スイトピー（品種スイートスノー）の花弁よりトータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ反応、電気泳動を行った。その結果、スイトピーについて、前記（２）のフリージアとは異なり、前記（ｖｉ）ＬＩＳｄｐＦ３とＬＩＳｄｐＲ３のプライマーに用いた反応液において、約０．５ｋｂの増幅断片が得られた。この増幅断片を回収し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このプラスミドを、ｐＣＲ２．１−ＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２−０６およびｐＣＲ２．１−ＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２−３８とした。そして、得られたクローンＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃０６およびＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃３８の塩基配列を決定した。
【０１１７】
前記ＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃０６およびＳＳＳｔ４Ｆ３Ｒ２＃３８の完全長ｃＤＮＡを取得するために、前記クローンをプローブとして前記（１）のスイトピー由来のｃＤＮＡライブラリーを用いて、スクリーニングを行った。スクリーニングの方法は、下記プライマーを使用した以外は、前記（２）と同様とした。
（プライマー）
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃３８Ｆ（配列番号２２）
5’-GATGATATTTTCGTGTATGGAAAATTTGATG-3’
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃３８Ｒ（配列番号２３）
5’-GCCTATGGGACGACCTCGGC-3’
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃０６Ｆ（配列番号２４）
5’-GACGATATTTTTGTGTACGGCACATTAGAT-3’
ＤＩＧ−ＳＳｓｔ４＃０６Ｒ（配列番号２５）
5’-GCCGAGGTCGTCCCATAATCG-3’
【０１１８】
そして、約２４万プラークをスクリーニングした。後述する実施例２と同様の方法により、得られたポジティブクローンについてタンパク質を発現させ、目的のＬＩＳ合成活性を確認した。その結果、配列番号９の塩基配列からなるＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡ（ＳＳ１９ ｃＤＮＡ）が取得できた。
【０１１９】
［実施例２］
フリージアおよびスイトピーのＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡを、大腸菌に導入し、組換えＬＩＳタンパク質を発現させた。そして、基質としてゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を用いて、リナロール合成活性を確認した。
【０１２０】
（１）発現用ベクターの構築
シグナルペプチドのコード配列を含む配列番号１の塩基配列からなるＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）を発現するための発現用ベクターｐＳＰＢ５０２５を、以下の方法により構築した。前記発現ベクターは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて構築し、発現は、ｐＥＴ発現システム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１２１】
大腸菌タンパク発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｔｕｒｂｏ ｋｉｔ（フナコシ株式会社）で精製した。
【０１２２】
次に、配列番号１に示す前記ＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−ＦおよびＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−Ｒを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２５用プライマー）
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号２６）
5’-CGCGGCAGCCATATGGCTCTCTTGCCGTGT-3’
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２５ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号２７）
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAGAGGGGAATGGGTTCA-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5025 100pg
1x PrimeSTAR buffer（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
PrimeSTAR HS DNA polymerase（Takara社） 1.25U
総体積 25μl
【０１２３】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μｌ、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで処理した前記ｐＥＴ１５ｂベクター １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μｌを添加して、総体積１０μｌに調整した。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させ、さらに、ＴＥ４０μｌを添加した。この混合液のうち３μｌを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１２４】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列、終始コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列がそれぞれ導入された、配列番号１に示す前記ＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有していたクローンを、発現用ベクターｐＳＰＢ５０２５とした。
【０１２５】
上記と同じ方法により、シグナルペプチドのコード配列を含む、配列番号５の塩基配列からなるＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）および配列番号９の塩基配列からなるＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）を発現するための発現用ベクターｐＳＰＢ５０２６（ＦＡ２６ ｃＤＮＡ）およびｐＳＰＢ５０４６（ＳＳ１９ ｃＤＮＡ）を、それぞれ構築した。なお、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列を導入するためのプライマーは、各ｃＤＮＡについて、それぞれ以下のプライマーを使用した。
（ＦＡ２６用プライマー）
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２６ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号２８）
5’-CGCGGCAGCCATATGGCTTTCTTGCCGTGT-3’
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＦＡ２６ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号２９）
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAGAGGGGAATGGGTTCAATAAGT-3’
（ＳＳ１９用プライマー）
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＳＳ１９ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号３０）
5’-CGCGGCAGCCATATGGCTGTTACTTCTCAACTAC-3’
ＩｎＦ−ｐＥＴ−ＳＳ１９ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号３１）
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAATGGCTAGTGGGTAATGAT-3’
【０１２６】
そして、得られた各４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、前述と同様に全塩基配列を決定した。その結果、開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列がそれぞれ導入された、目的のｃＤＮＡのコーディング配列を有していたクローンを、発現用ベクターｐＳＰＢ５０２６（ＦＡ２６ ｃＤＮＡ）、ｐＳＰＢ５０４６（ＳＳ１９ ｃＤＮＡ）とした。
【０１２７】
（２）組換えＬＩＳタンパク質の発現誘導
前記（１）で得られた各形質転換体を用いて、以下の方法により、組換えＬＩＳタンパク質の発現を誘導した。タンパク質の発現誘導は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１２８】
前記（１）の形質転換株を、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）４０μｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）１００μｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社）２μｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび０．０５％グルコースを含むＬＢ培地５ｍｌにより、３７℃で４時間振とう培養した。そして、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ ２ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２ ５ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ １００μｌおよびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 １００ｍｌに前記培養液の全量を加え、２０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液を遠心（５０００×ｇ、５分間、４℃）して、大腸菌を集菌した。前記菌体を、菌体１ｇあたり５ｍｌの緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ アスコルビン酸ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に懸濁した。前記懸濁液を超音波処理して、前記大腸菌を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、得られた上清を、粗酵素液とした。
【０１２９】
次に、前記粗酵素液を、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて、緩衝液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に置換後、以下の酵素反応に用いた。
【０１３０】
（３）ＬＩＳタンパク質の活性測定
前記粗酵素液に、試薬［１０μｍｏｌ／Ｌ ＧＰＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＷＯ４、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ］を添加し、全量３ｍｌの反応液に調整した。そして、この反応液を３０℃で３時間反応させた。なお、反応中、容器内の上部にヘッドスペース成分の捕集剤としてＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８（ジーエルサイエンス社）を１枚吊るしておき、前記ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で採集した。
【０１３１】
次に、前記捕集剤を回収し、前記捕集剤に、ジクロロメタン ２ｍｌを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出して回収した。ジクロロメタン中に抽出された、揮発成分を濃縮乾固し、さらに、ジクロロメタン ５０μｌに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、ＧＣ−ＭＳで分析した。分析条件は、以下の通りとした。下記条件下において、リナロールは、保持時間３２．８分に検出され、ＭＳスペクトルで、ｍ／ｚ １５４，１２１，９３，７１の特徴的なフラグメントイオンが検出されることを、標品により確認した。
キャピラリーカラム：ＨＰ ＩＮＮＯＷａｘ
（６０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ、Agilent社)
キャリアガス：Ｈｅ
温度条件：４０℃で１０分間保持後、５℃／ｍｉｎで２４０℃まで昇温し、最後に２４０℃で３０分間保持
注入口温度：２５０℃
トランスファーライン温度：２３０℃
試料：スプリットレスモードで１μl注入
【０１３２】
その結果、保持時間３２．８分のみに、リナロールのピークが認められ、リナロールのみが生成成分として検出された。この結果から、前記各種ＬＩＳ遺伝子は、リナロール合成活性を示すことが確認された。
【０１３３】
［実施例３］
前記実施例２における、フリージア由来およびスイトピー由来のＬＩＳ ｃＤＮＡを発現させた組換えＬＩＳタンパク質と、公知のラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）由来のリナロール合成酵素（（Ｒ）−ＬＩＳ）ｃＤＮＡから発現させた組換えリナロール合成酵素とについて、それぞれの粗酵素タンパク質を用いてリナロール合成活性を比較した。
【０１３４】
前記実施例２と同様にして、フリージア由来のＬＩＳ遺伝子として、ＦＡ２５ ｃＤＮＡおよびＦＡ２６ ｃＤＮＡを、スイトピー由来のＬＩＳ遺伝子として、ＳＳ１９ ｃＤＮＡを、大腸菌に導入し、それぞれ、組換えＬＩＳタンパク質を発現させ、粗酵素液を調製した。
【０１３５】
他方、ラベンダー由来の（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子を発現するための発現ベクターとして、配列番号３２の前記（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡの配列を含む発現ベクターｐＳＰＢ５０４５を構築した。前記（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡにコードされる（Ｒ）−ＬＩＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。そして、前記ｃＤＮＡの開始コドンの５’側にＮｄｅＩ認識配列を導入し、終止コドンの３’側にＸｈｏＩ認識配列を導入するためのプライマーとして、以下のプライマーを使用した以外は、前記実施例２と同様にして、前記発現ベクターを構築した。そして、前記実施例２と同様にして、形質転換株の取得、組換えタンパク質の発現誘導、粗酵素液の調製を行った。
【０１３６】
（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ
１６９５ｂｐ（配列番号３２）
ATGTCGATCAATATCAACATGCCTGCAGCCGCCGTCCTCCGCCCTTTTCGCTGCTCACAACTACATGTCGATGAAACCCGACGCTCCGGAAACTACCGCCCCTCGGCTTGGGATTCCAACTACATCCAATCTCTCAATTCTCAGTATAAGGAAAAGAAGTGCTTGACAAGGCTAGAAGGGCTGATTGAGCAAGTGAAGGAACTGAAGGGGACAAAAATGGAGGCTGTTCAACAATTGGAGTTGATTGATGACTCGCAGAATCTGGGATTATCATATTATTTTCAAGATAAAATTAAACATATCTTGAATTTGATATATAATGATCACAAATATTTTTACGATAGTGAAGCTGAAGGAATGGATTTGTATTTTACAGCTCTTGGATTTAGACTCTTTAGACAACATGGTTTTAAAGTCTCCCAAGAAGTATTTGATCGTTTCAAGAACGAGAATGGTACGTATTTCAAGCACGACGATACAAAGGGATTGTTGCAGCTCTACGAAGCATCATTCCTAGTGCGAGAAGGCGAAGAGACACTCGAACAAGCACGAGAATTTGCCACCAAATCCCTACAAAGAAAACTTGATGAGGATGGTGATGGAATTGACGCCAATATCGAATCATGGATCCGCCACTCTCTGGAGATCCCACTTCATTGGAGGGCTCAGAGGCTAGAGGCGAGATGGTTCCTAGATGCTTATGCGAGAAGGCCCGACATGAACCCCGTTATCTTCGAGCTTGCTAAACTCAACTTCAATATTGTCCAAGCAACACAACAAGAAGAATTGAAAGCTCTCTCGAGGTGGTGGAGTAGTTTAGGCCTAGCTGAAAAACTCCCATTTGTGAGGGATAGGCTTGTGGAAAGCTACTTTTGGGCTATTCCACTCTTTGAGCCTCATCAATATGGATATCAAAGAAAAGTGGCCACCAAGATCATAACCCTAATCACATCTTTAGACGATGTTTACGATATCTATGGCACGTTAGATGAATTGCAACTATTTACGAACTTATTTGAAAGATGGGATAATGCATCAATCGGCCGACTTCCTGAATACTTGCAATTGTTCTATTTCGCAATCCACAACTTTGTTTCCGAGGTGGCTTACGACATTCTCAAAGAAAAGGGTTTCACTAGTATTGTATATTTACAGAGATCGTGGGTGGATTTGCTAAAAGGATACCTAAAAGAGGCAAAGTGGTACAATAGTGGATACACGCCAAGCCTCGAGGAATATTTCGACAACGCATTCATGACAATAGGGGCCCCTCCGGTACTATCGCAAGCTTATTTCACATTAGGAAGCTCGATGGAGAAACCGATCATCGAGAGCATGTACGAATATGACAACATACTTCGCGTTTCGGGAATGCTCGTGAGGCTTCCCGATGACCTAGGAACATCATCGTTCGAGATGGAGAGAGGCGACGTGCCGAAATCGGTCCAGCTATACATGAAGGAAACAAATGCTACGGAGGAGGAGGCGGTGGAGCACGTGAGGTTTTTGAATCGGGAGGCGTGGAAGAAGATGAACACGGCGGAGGCGGCCGGTGATTCTCCGTTAGTGAGTGACGTGGTGGCGGTGGCGGCGAATCTTGGAAGGGCGGCGCAGTTTATGTATTTCGACGGAGATGGTAACCAGTCTAGTTTGCAGCAGTGGATTGTGAGCATGCTGTTCGAGCCGTACGCATGA
（Ｒ）−ＬＩＳ タンパク質
５６４ａａ（配列番号３３）
MSININMPAAAVLRPFRCSQLHVDETRRSGNYRPSAWDSNYIQSLNSQYKEKKCLTRLEGLIEQVKELKGTKMEAVQQLELIDDSQNLGLSYYFQDKIKHILNLIYNDHKYFYDSEAEGMDLYFTALGFRLFRQHGFKVSQEVFDRFKNENGTYFKHDDTKGLLQLYEASFLVREGEETLEQAREFATKSLQRKLDEDGDGIDANIESWIRHSLEIPLHWRAQRLEARWFLDAYARRPDMNPVIFELAKLNFNIVQATQQEELKALSRWWSSLGLAEKLPFVRDRLVESYFWAIPLFEPHQYGYQRKVATKIITLITSLDDVYDIYGTLDELQLFTNLFERWDNASIGRLPEYLQLFYFAIHNFVSEVAYDILKEKGFTSIVYLQRSWVDLLKGYLKEAKWYNSGYTPSLEEYFDNAFMTIGAPPVLSQAYFTLGSSMEKPIIESMYEYDNILRVSGMLVRLPDDLGTSSFEMERGDVPKSVQLYMKETNATEEEAVEHVRFLNREAWKKMNTAEAAGDSPLVSDVVAVAANLGRAAQFMYFDGDGNQSSLQQWIVSMLFEPYA
【０１３７】
そして、各粗酵素液を用いて、前記実施例２と同様にして、活性測定を行った。なお、活性測定の反応液（３ｍｌ）における前記粗酵素のタンパク質使用量は、５〜５．５ｍｇとした。
【０１３８】
これらの結果を、図１〜図３に示す。図１〜図３は、それぞれ、生成成分のガスクロマトグラムであり、図１は、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２５）、図２は、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２６）、図３は、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ子由来の組換えタンパク質の結果（ＳＳ１９）を示し、それぞれ、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＬａＬＩＳ）を合わせて示す。図１〜図３に示すように、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来およびＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によれば、既知の（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質よりも、リナロール生成量が多く、有意に強い活性を示した。また、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質は、既知の（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質と同等の生成量であり、同等の活性を示した。
【０１３９】
［実施例４］
リナロールは３位に不斉炭素をもち、（３Ｓ）−リナロールおよび（３Ｒ）−リナロールの１組の光学異性体が存在する。そこで、本発明のＬＩＳタンパク質により生成したリナロールがいずれの光学異性体であるかを確認した。
【０１４０】
前記実施例２で得られた、反応後に回収した抽出液を、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。分析条件は、以下の通りとした。下記条件下、（３Ｓ）−リナロールは、保持時間２３．８分に、（３Ｒ）−リナロールは、保持時間２４．０分に、それぞれ検出されることを、標品で確認した。
キャピラリーカラム：ＩｎｅｒｔＣａｐ ＣＨＩＲＡＭＩＸ
（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ、ジーエルサイエンス社）
キャリアガス：Ｈｅ
温度条件：５０℃で１分間保持後、３℃／ｍｉｎで１８０℃まで昇温し、最後に１８０℃で１分間保持
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２５０℃
試料：スプリットモード１０：１で１μｌ注入
【０１４１】
これらの結果を図４〜図６に示す。図４〜図６は、それぞれ、生成成分のガスクロマトグラムであり、図４は、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２５）、図５は、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＦＡ２６）、図６は、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＳＳ１９）を示し、それぞれ、コントロールとして、（３Ｒ）−リナロールおよび（３Ｓ）−リナロールの標品（ＳＴＤ）の結果を合わせて示す。図４〜図６に示すように、いずれの組換えタンパク質を使用した抽出液においても、（３Ｒ）−リナロールと保持時間が一致するシグナルが得られた。この結果から、フリージア由来のＦＡ２５タンパク質およびＦＡ２６タンパク質、スイトピー由来のＳＳ１９タンパク質は、いずれも、（３Ｒ）−リナロール合成活性を有することが確認できた。
【０１４２】
［実施例５］
フリージア由来のＬＩＳ ｃＤＮＡを発現させた組換えＬＩＳタンパク質と、公知のラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）由来のリナロール合成酵素（（Ｒ）−ＬＩＳ） ｃＤＮＡを発現させた組換えリナロール合成酵素とについて、それぞれの精製酵素タンパク質を用いてリナロール合成活性を比較した。
【０１４３】
（１）組換えＬＩＳタンパク質の発現誘導
前記実施例２および実施例３と同様にして、フリージア由来のＬＩＳ遺伝子としてＦＡ２６ ｃＤＮＡと、前記ラベンダー由来の（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入した。これらの形質転換体を用いて、以下の方法により、組換えＬＩＳタンパク質の発現を誘導した。タンパク質の発現誘導は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１４４】
前記の形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび０．０５％グルコースを含むＬＢ培地１０ｍｌにより、３７℃で４時間振とう培養した。そして、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ ２ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２ ５ｍｌ、ＯｎＥｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ １００μｌおよびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 １００ｍｌに前記培養液のうち２ｍｌを加え、１６℃で２４時間振とう培養した。これを各５本準備し、各合計５００ｍｌを培養した。得られた培養液を遠心（５０００×ｇ、５分間、４℃）し、大腸菌を集菌した。前記菌体を、菌体１ｇあたり１０ｍｌの緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ アスコルビン酸ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に懸濁した。前記懸濁液を超音波処理して、前記大腸菌を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、さらに、０．４５μｍ ＭＩＬＬＥＸ−ＨＰフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でろ過後、得られた上清を、粗酵素液とした。
【０１４５】
次に、前記粗酵素を、Ｐｒｏｆｉｎｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ １ｍｌ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）でＨｉｓ Ｔａｇ精製後、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ １０ｍｌ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）にて脱塩した。
【０１４６】
次に、脱塩後の前記精製酵素液を、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて、緩衝液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール］に置換後、以下の酵素反応に用いた。
【０１４７】
（２）ＬＩＳタンパク質の活性測定
前記精製酵素液に、試薬［１０μｍｏｌ／Ｌ ＧＰＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＷＯ４、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ］を添加し、全量３ｍｌの反応液に調整した。なお、精製タンパク質の使用量は、０．３ｍｇとした。そして、この反応液を３０℃で３時間あるいは１０時間反応させた。なお、反応中、容器内の上部にヘッドスペース成分の捕集剤としてMonoTrap DCC18（ジーエルサイエンス社）を１枚吊るしておき、前記ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で採集した。
【０１４８】
次に、前記捕集剤を回収し、前記捕集剤に、ジクロロメタン ２ｍｌを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出し、回収した。ジクロロメタン中に抽出された揮発成分を濃縮乾固し、さらに、ジクロロメタン ５０μlに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、ＧＣ−ＭＳで分析した。分析条件は、以下の通りとした。下記条件下において、リナロールは、保持時間３２．８分に検出され、ＭＳスペクトルで、ｍ／ｚ １５４，１２１，９３，７１の特徴的なフラグメントイオンが検出されることを、標品により確認した。
キャピラリーカラム：ＨＰ ＩＮＮＯＷａｘ
（６０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ、Agilent社)
キャリアガス：Ｈｅ
温度条件：４０℃で１０分間保持後、５℃／ｍｉｎで２４０℃まで昇温し、最後に２４０℃で３０分間保持
注入口温度：２５０℃
トランスファーライン温度：２３０℃
試料：スプリットレスモードで１μl注入
【０１４９】
これらの結果を、図７に示す。図７は、生成成分のガスクロマトグラムであり、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質（ＦＡ２６）と、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質の結果（ＬａＬＩＳ）を合わせて示す。図７に示すように、３時間反応させた場合、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によれば、既知のラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質よりも、リナロール生成量が約７．２倍多く、有意に強い活性を示した。さらに、図８に示すように、１０時間反応させた場合、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によるリナロール生成量は、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によるリナロール生成量の約３０．８倍であった。一方、１０時間反応したラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質によるリナロール生成量は、３時間反応した場合とほとんど変化がなかった。このことから、ラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質に比べ、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ由来の組換えタンパク質は、安定性が高く、高い反応性を有することが明らかとなった。なお、ｃＤＮＡを挿入していない空ベクターｐＥＴ１５ｂを導入した大腸菌では、リナロール活性は確認できなかった（図７、８におけるｐＥＴ１５ｂ）。
【０１５０】
［実施例６］
フリージアおよびスイトピー由来のＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡを、それぞれバイナリーベクターに導入し、トレニアに形質転換した。そして、得られた組換え体におけるリナロール合成活性を確認した。また、対照として、既知のラベンダー（Ｒ）−ＬＩＳ遺伝子のｃＤＮＡについても、同様に形質転換およびリナロール合成活性の確認を行った。
【０１５１】
１．各種バイナリーベクターの構築
（１）pSPB5083（El235Sp：：FA25：：Nost）の構築
植物においてＦＡ２５遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０８３は、以下の方法で構築した。
【０１５２】
配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）コーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＳａｌＩ認識配列を、それぞれ導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＦＡ２５ＦＷおよびｔｒＦＡ／ｎｏｓ＿ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で1分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２５用プライマー）
ｔｒＦＡ２５＿ＦＷ（配列番号３４）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTCTCTTGCCGTGT-3’
ｔｒＦＡ２５／ｎｏｓ＿ＲＶ（配列番号３５）
5’-GAAATTCGGGTCGACTTAGAGGGGAATGGGTTCAAA-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5025 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１５３】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μｌ、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μｌを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＢ３５９３は、ｐＵＣＰＰ（ＷＯ２００５／０１７１４７）上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ラベンダー由来リナロール合成酵素（ＬａＬＩＳ）遺伝子およびＮｏｓターミネーターを有するベクターであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μｌを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α （ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１５４】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、終始コドンの３’側にＳａｌＩ認識配列がそれぞれ導入された、配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０７９とした。
【０１５５】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０７９をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２５遺伝子、アグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０８３とした。
【０１５６】
（２）pSPB5082（El235Sp：：FA25：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２５遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０８２は、以下の方法で構築した。
【０１５７】
配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＦＡ２５＿ＦＷおよびｔｒＦＡ２５／ＨＳＰ＿ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。そして、さらに、植物体における目的遺伝子産物の高発現のため、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター配列に対して、終止コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列を導入すべく、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す２種類のプライマーＨＳＰ／ＦＡ２５＿ＦＷおよびＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。これらのＰＣＲは、それぞれ、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２５用プライマー）
ｔｒＦＡ２５ ＦＷ（配列番号３４）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTCTCTTGCCGTGT-3’
ｔｒＦＡ２５／ＨＳＰ＿ＲＶ（配列番号３６）
5’-ATCTTCATCTTCATATTAGAGGGGAATGGGTTCAAAAAG-3’
（ＨＳＰターミネーター用プライマー）
ＨＳＰ／ＦＡ２５＿ＦＷ（配列番号３７）
5’-CCCATTCCCCTCTAATATGAAGATGAAGAT-3’
ＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２（配列番号３８）
5’-GTTAATTAAGAATTCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5025あるいはpRI201-AN-GUS 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１５８】
得られた各ＰＣＲ産物５μｌについて、それぞれＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１５９】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、ＨＳＰターミネーター配列の終始コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号１に示すＦＡ２５ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列およびＨＳＰターミネーター配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０７８とした。
【０１６０】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０７８をＰａｃIとＤｒａIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２５遺伝子、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０８２とした。
【０１６１】
（３）pSPB5091（Mac1p：：AmGPPS．SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS．LSU：：Nost；El235Sp：：FA25：：Nost）の構築
植物において、ＦＡ２５遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９１は、以下の方法で構築した。
【０１６２】
まず、キンギョソウ由来ゲラニルピロリン酸合成酵素について、スモールサブユニット（ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ）遺伝子およびラージサブユニット（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ）遺伝子の取得を行った。
【０１６３】
キンギョソウ（品種メリーランドトゥルーピンク、株式会社ムラカミシード）の花から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。前記トータルＲＮＡのうち１μgから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者が推奨する方法により、ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡ １μlを鋳型とし、プライマーおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）１．２５Ｕを用いて、製造業者の推奨する方法により計２５μlの反応液でＰＣＲを行った。スモールサブユニット遺伝子の増幅には、その既知配列（ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３４６８６．１)に基づいて作製した２種類のスモールサブユニット増幅用プライマー ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｆ２とＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｒ２を、各０．２μｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した。また、ラージサブユニット遺伝子の増幅には、その既知配列（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５３４６８７．１)に基づいて作製した２種類のラージサブユニット増幅用プライマー ＡｍＧＰＰＳ・LＳＵ−ＦとＡｍＧＰＰＳ・LＳＵ−Ｒを、各０．２μｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した。ＰＣＲは、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１サイクルとして合計３０サイクル繰り返した後、７２℃で４分間保持した。
【０１６４】
得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動で分離した。そして、約０．９５ｋｂおよび１．３ｋｂのバンドをそれぞれ回収し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者が推奨する方法で、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。得られたプラスミドの塩基配列を決定したところ、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵのアミノ酸配列（配列番号５４）をコードする塩基配列（配列番号５３）およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵのアミノ酸配列（配列番号５６）をコードする塩基配列（配列番号５５）を含むプラスミドが得られた。前者のプラスミドをｐＳＰＢ３５０６、後者のプラスミドをｐＳＰＢ１４００とした。ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５３４６８６．１に登録されており、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５３４６８７．１に登録されている。
ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｆ２（配列番号３９）
5’-AAATGGCCCACGGCCTCAC-3’
ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｒ２（配列番号４０）
5’-CATCAGGGTTGTAGGTCTAATTACCCCT-3’
ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ−Ｆ（配列番号４１）
5’-TCAACAACAATGAGCCTGGTAAATC-3’
ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ−Ｒ（配列番号４２）
5’-TCACAAATGAAGTTGTGTTATACATGACAT-3’
【０１６５】
ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ 遺伝子
８９４ｂｐ（配列番号５１）
ATGGCCCACGGCCTCACCCATTTCAACACCAAATCGGGTTTATTCCCATCTATCACCAAATCAAAAACAACCCGTCCATCAACCCGACCCGTGATTCTCGCCATGACCCGGACCCAAACTTACCGGGCCACCATTGAATCCGACATTGAATCTTATCTCAAGAAGGCCATCCCAATCCGGGCACCTGAATCCGTATTCGAGCCCATGCACCACCTCACGTTTGCCGCCCCAAGAACCAGCGCATCGGCTTTATGCGTGGCAGCGTGCGAGCTCGTTGGCGGCGACCGAAGCGATGCCATGGCGGCGGCGGCGGCGGTGCATCTCATGCACGTGGCGGCGTACACACACGAGAACCTTCCTCTTACCGACGGGCCCATGTCCAAATCGGAAATCCAACACAAGTTCGATCCGAATATCGAACTTTTGACAGGAGACGGAATCATACCATTCGGGCTGGAGTTGATGGCGAGATCAATGGATCCGACCCGGAACAACCCGGATAGGATCCTAAGAGCGATAATCGAACTCACCCGGGTCATGGGCTCAGAGGGAATTGTAGAAGGGCAATACCATGAACTTGGTCTAAATCAATTAAACGATTTAGAACTCATCGAGTATGTTTGCAAGAAAAAAGAAGGGACACTACATGCATGTGGGGCCGCTTGTGGAGCAATTTTAGGTGGATGTGATGAAGATAAAATAGAAAAGTTGAGAAGATTCGGACTTTATGTGGGTACGGTTCAAGGGTTGTTGGGTAAAAATAGATCCGGATTTGAAGGAAGAATTAAGGAATTGAAGGAATTGGCTGTTAAGGAACTGGAGAGCTTTGGTGGTGAGAAAATTGAGCTGATTAGGGGCGTTTTTGAGCTAGAGCATAGTCTTGCTGGTGTTTAA
ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ タンパク質
２９７ａａ（配列番号５２）
MAHGLTHFNTKSGLFPSITKSKTTRPSTRPVILAMTRTQTYRATIESDIESYLKKAIPIRAPESVFEPMHHLTFAAPRTSASALCVAACELVGGDRSDAMAAAAAVHLMHVAAYTHENLPLTDGPMSKSEIQHKFDPNIELLTGDGIIPFGLELMARSMDPTRNNPDRILRAIIELTRVMGSEGIVEGQYHELGLNQLNDLELIEYVCKKKEGTLHACGAACGAILGGCDEDKIEKLRRFGLYVGTVQGLLGKNRSGFEGRIKELKELAVKELESFGGEKIELIRGVFELEHSLAGV
【０１６６】
ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ 遺伝子
１１１９ｂｐ（配列番号５３）
ATGAGCCTGGTAAATCCCATTACAACCTGGTCAACAACAACAACCTCAAAATCCCCAAAAAATGTCCAAACCACCACCAGATCCAGATCCATCATTCTCCCTCACAAAATCTCCCTTTTCCCATCAAACCCCAAATCAAAATCAAAAACCCACCTCAGATTCTCAATATCATCAATCCTGACGAAGAACCCACAAGAATCAAGCCAAAAAACCTCCAAAGATCCAACCTTTACCCTCGATTTCAAAACCTACATGCTAGAAAAAGCCAGCTCTGTTAACAAAGCCTTAGAACAAGCTGTTTTACTCAAAGAGCCCTTAAAAATCCACGAATCGATGAGGTACTCGCTTCTAGCCGGGGGCAAAAGGGTCAGACCAATGCTCTGCATCGCCGCTTGTGAGCTAGTTGGTGGGCTGGAATCCACTGCGATGCCCTCAGCTTGTGCTGTTGAAATGATCCATACCATGTCTTTGATCCACGATGATTTGCCCTGTATGGATAACGACGATTTACGACGTGGAAAGCCCACAAACCACAAGATTTATGGCGAAGACGTGGCGGTTTTAGCCGGGGATGCCCTGTTAGCGTTCTCGTTCGAGCACGTGGCAAAATCGACGAAAGGGGTGTCGTCGGATAGGATTGTTAGGGTGATTGGTGAATTGGCTAAGTGTATTGGCTCTGAGGGTTTAGTTGCAGGCCAAGTGGTTGATATAAGTTCTGAAGGAATGACTGAAGTTGGATTGGAGCATTTGGAGTTTATCCACGTGCACAAGACCGCGGCGTTGTTGGAGGCTTCGGTGGTTTTGGGCGCGATTGTGGGTGGTGCGGATGATGAGGATGTTGAGAAGTTGAGGAAATTCGCGAGGTGTATCGGGCTTTTGTTTCAAGTGGTTGATGATATTTTGGATGTTACTAAGTCTTCGCAAGAATTGGGGAAGACGGCGGGTAAAGACTTGGTTGCGGATAAGACTACGTATCCGAAGCTGCTTGGGATTGAGAAGTCGAGGGAGTTTGCGGAGAAGTTGAATAGGGAGGCGCAGGAGCAGCTCGAGGGGTTCGATTCGGTTAAGGCTGCGCCGTTGATCGCGTTGGCTAACTACATCGCTTATAGAGATAATTGA
ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ タンパク質
３７２ａａ（配列番号５４）
MSLVNPITTWSTTTTSKSPKNVQTTTRSRSIILPHKISLFPSNPKSKSKTHLRFSISSILTKNPQESSQKTSKDPTFTLDFKTYMLEKASSVNKALEQAVLLKEPLKIHESMRYSLLAGGKRVRPMLCIAACELVGGLESTAMPSACAVEMIHTMSLIHDDLPCMDNDDLRRGKPTNHKIYGEDVAVLAGDALLAFSFEHVAKSTKGVSSDRIVRVIGELAKCIGSEGLVAGQVVDISSEGMTEVGLEHLEFIHVHKTAALLEASVVLGAIVGGADDEDVEKLRKFARCIGLLFQVVDDILDVTKSSQELGKTAGKDLVADKTTYPKLLGIEKSREFAEKLNREAQEQLEGFDSVKAAPLIALANYIAYRDN
【０１６７】
次に、ｐＵＣＡＡ（ＷＯ２００４／０１８６８２参照）上に、Ｍａｃ1プロモーター、カーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子およびｍａｓターミネーターを有する、ｐＳＰＢ１４７７を準備した。前記ｐＳＰＢ１４７７を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して、カーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子を除き、これに、前記（３）のｐＳＰＢ３５０６をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子）を連結した。得られたプラスミドは、そのｐＵＣＡＡ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、およびｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１３とした。
【０１６８】
さらに、前記ｐＳＰＢ１４００をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子）を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化したｐＳＰＢ２３１１（ＷＯ２００７／０４９８１６参照）に連結した。得られたプラスミドは、そのｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子およびｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１４とした。次に、前記ｐＳＰＢ３５１３をＡｓｃIで消化し、得られる約３ｋｂのＤＮＡ断片を、前記ｐＳＰＢ３５１４のＡｓｃI部位に連結した。このプラスミドを、ｐＳＰＢ３５３３とした。
【０１６９】
前記ｐＳＰＢ３５３３をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに、ｐＳＰＢ３５６０をＰａｃIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。前記ｐＳＰＢ３５６０は、ｐＵＣＰＰ(ＷＯ２００５／０１７１４７)上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、クラーキア由来ＬＩＳ遺伝子およびＮｏｓターミネーターを有するプラスミドである。前記ＤＮＡ断片の連結により得られたプラスミドは、そのｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子およびクラーキア由来ＬＩＳ遺伝子を有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５６２とした。
【０１７０】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳのマルチクローニングサイトにＳｇｆIとＦｓｅIを付加したｐＳＰＢ１８４０を、ＡｓｃIとＰａｃIで消化した。そして、ｐＳＰＢ３５６２をＡｓｃIで消化後、ＰａｃIで部分消化して得られた約９．５ｋｂのＤＮＡ断片を、前記ｐＢＩＮＰＬＵＳの消化物に連結した。このプラスミドをｐＳＰＢ５００７とした。
【０１７１】
最後に、前記ｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（１）のｐＳＰＢ５０７９をＰａｃIとＤｒａIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子およびフリージア由来ＦＡ２５遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０９１とした。
【０１７２】
（４）pSPB5090（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：FA25：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２５遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９０は、以下の方法で構築した。
【０１７３】
前記（３）のｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（２）のｐＳＰＢ５０７８をＰａｃIとＤｒａIで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、フリージア由来ＦＡ２５遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０９０とした。
【０１７４】
（５）pSPB5074（El235Sp：：FA26：：Nost）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７４は、以下の方法で構築した。
【０１７５】
配列番号５に示すＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＳａｌI認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２およびｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｎｏｓ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２６用プライマー）
ｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２（配列番号４３）
5’-CATTCGGAGAGGTACCATGGCTTTCTTGCCGTGTC-3’
ｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｎｏｓ２（配列番号４４）
5’-GAAATTCGGGTCGACTTAGAGGGGAATGGGTTCAATAA-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5026 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１７６】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＰＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１７７】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、終始コドンの３’側にＳａｌI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号５に示すＦＡ２６ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０７０とした。
【０１７８】
次に、ｐＳＰＢ５００１をＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これに、ｐＳＰＢ５０７０をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。前記ｐＳＰＢ５００１は、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ラベンダー由来ＬＩＳ遺伝子およびＮｏｓターミネーターを有するプラスミドである。前記ｐＳＰＢ５００１への前記ＤＮＡ断片の連結により、前記ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子およびアグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有するプラスミドが得られた。これをｐＳＰＢ５０７４とした。
【０１７９】
（６）pSPB5073（El235Sp：：FA26：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７３は、以下の方法で構築した。
【０１８０】
配列番号５に示すＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、以下に示す２種類のプライマーｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２およびｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｈｓｐを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。そして、さらに、植物体における目的遺伝子産物の高発現のため、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター配列に対して、終止コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列を導入すべく、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す各２種のプライマーｔｒＨＳＰｔ＿ＦＷおよびｔｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。これらのｐＣＲは、それぞれ、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＦＡ２６用プライマー）
ｔｒＦＡ２６＿ＦＷ２（配列番号４３）
5’-CATTCGGAGAGGTACCATGGCTTTCTTGCCGTGTC-3’
ｔｒＦＡ２６＿ＲＶ−ｈｓｐ（配列番号４５）
5’-TCTTCATATTAGAGGGGAATGGGTTCAATAAG-3’
（ＨＳＰターミネーター用プライマー）
ｔｒＨＳＰｔ＿ＦＷ（配列番号４６）
5’-CCCTCTAATATGAAGATGAAGATGAAATATTT-3’
ｔｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２（配列番号３８）
5’-GTTAATTAAGAATTCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5026あるいはpRI201-AN-GUS 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１８１】
得られた各ＰＣＲ産物５μｌに、それぞれＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ 各２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１８２】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＦＡ２６ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、ＨＳＰターミネーター配列の終始コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号５に示すＦＡ２６−ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列およびＨＳＰターミネーター配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０６９とした。
【０１８３】
次に、前記（５）と同様にして、ｐＳＰＢ５００１をＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これに、前記ｐＳＰＢ５０６９をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。これにより得られるプローブは、前記ｓＰＢ５００１のｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子およびシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ５０７３とした。
【０１８４】
（７）pSPB5075（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp ：：FA26：：Nost）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７５は、以下の方法で構築した。
【０１８５】
前記（３）のｐＳＰＢ５００７をＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（５）のｐＳＰＢ５０７０をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０７５とした。
【０１８６】
（８）pSPB5072（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：FA26：：HSPt）の構築
植物において、ＦＡ２６遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０７２は、以下の方法で構築した。
【０１８７】
前記（３）のｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（６）のｐＳＰＢ５０６９をＰａｃＩとＤｒａＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、フリージア由来ＦＡ２６遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０７２とした。
【０１８８】
（９）バイナリーベクターpSPB5084（El235S：：SS19：：Nost）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０８４は、以下の方法で構築した。
【０１８９】
配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を、終止コドンの３’側にＳａｌI認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、下記に示す２種のプライマーｔｒＳＳ１９＿ＦＷおよびｔｒＳＳ１９／ｎｏｓ＿ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用し、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＳＳ１９用プライマー）
ｔｒＳＳ１９＿ＦＷ（配列番号４７）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTGTTACTTCTCAACTAC-3’
ｔｒＳＳ１９／ｎｏｓ＿ＲＶ（配列番号４８）
5’-GAAATTCGGGTCGACTTAATGGCTAGTGGGTAAT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5046 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１９０】
得られたＰＣＲ産物５μｌに、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ ２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＰＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１９１】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、終始コドンの３’側にＳａｌI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列を有するクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０８１とした。
【０１９２】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０８１をＰａｃＩとＳｃａＩで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子およびアグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０８４とした。
【０１９３】
（１０）pSPB5097（El235S：：SS19：：HSPt）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９７は、以下の方法で構築した。
【０１９４】
配列番号９に示すＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列に対して、開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す各２種のプライマーｔｒＳＳ１９＿ＦＷおよびｔｒＳＳ１９／ＨＳＰ_ＲＶを含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。そして、さらに、植物体における目的遺伝子産物の高発現のため、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター配列に対して、終止コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列を導入するため、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、下記に示す各２種のプライマーＨＳＰ／ＳＳ１９＿ＦＷおよびＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２を含む下記組成のＰＣＲ反応液を使用した。これらのＰＣＲ反応は、それぞれ、９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の反応を１サイクルとし、合計２５サイクル行った。
（ＳＳ１９用プライマー）
ｔｒＳＳ１９＿ＦＷ（配列番号４７）
5’-ATTCGGAGAGGTACCATGGCTGTTACTTCTCAACTAC-3’
ｔｒＳＳ１９／ＨＳＰ_ＲＶ（配列番号４９）
5’-ATCTTCATCTTCATATTAATGGCTAGTGGGTAATGATGAG-3’
（ＨＳＰターミネーター用プライマー）
ＨＳＰ／ＳＳ１９＿ＦＷ（配列番号５０）
5’-CCCACTAGCCATTAATATGAAGATGAAGAT-3’
ＴｒＨＳＰｔ＿ＲＶ２（配列番号３８）
5’-GTTAATTAAGAATTCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGT-3’
（ＰＣＲ反応液）
pSPB5046あるいはpRI201-AN-GUS 10pg
1x PrimeSTAR MasterMix（Takara社）
0.2mmol/L dNTPs（Takara社）
プライマー 各0.2μmol/L
総体積 20μl
【０１９５】
得られた各ＰＣＲ産物５μｌに、それぞれＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μｌを加え、３７℃で１５分反応後、さらに８０℃で１５分反応させた。この反応液に、１ｘＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社） １μl、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５９３ １００ｎｇ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｔｒｅａｔｅｄ ＰＣＲ Ｉｎｓｅｒｔ 各２μlを添加して、総体積１０μｌに調整した。前記ｐＳＰＢ３５９３は、前記（１）と同じであり、ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することにより、ＬａＬＩＳ遺伝子を除いた。そして、３７℃で１５分反応させた後、５０℃で１５分反応させた。この混合液の全量２．５μlを、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）に形質転換した。
【０１９６】
そして、得られた４種の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により全塩基配列を決定した。その結果、ＳＳ１９ ｃＤＮＡ（ｓ＋）配列の開始コドンの５’側にＫｐｎＩ認識配列、ＨＳＰターミネーター配列の終始コドンの３’側にＥｃｏＲI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号９に示すＳＳ１９ｃＤＮＡ（ｓ＋）のコーディング配列およびＨＳＰターミネーター配列を有していたクローンが得られた。このクローンを、ｐＳＰＢ５０８０とした。
【０１９７】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ５０８０をＰａｃIとＳｃａIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にカリフラワーモザイクウイルス由来カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子、シロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーターを有する発現ベクターｐＳＰＢ５０９７を得た。
【０１９８】
（１１）バイナリーベクターpSPB5619（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：SS19：：Nost）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５６１９は、以下の方法で構築した。
【０１９９】
（３）で作製したｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに（９）で作製したｐＳＰＢ５０８１をＰａｃIとＳａｃIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５６１９とした。
【０２００】
（１２）バイナリーベクターpSPB5098（Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost;El235Sp：：SS19：：HSPt）の構築
植物において、ＳＳ１９遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０９８は、以下の方法で構築した。
【０２０１】
（３）で作製したｐＳＰＢ５００７をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに（１０）で作製したｐＳＰＢ５０８０をＰａｃＩとＳｃａＩで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、スイトピー由来ＳＳ１９遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５０９８とした。
【０２０２】
（１３）pSPB5001（El235S：：LaLIS：：Nost）の構築
植物において、ラベンダー由来ＬＩＳ（ＬａＬＩＳ）遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５００１は、以下の方法で構築した。
【０２０３】
前記（３）のｐＳＰＢ３５６０をＫｐｎＩとＳａｌＩで消化することによりクラーキア由来ＬＩＳ遺伝子を除いた。他方、ｐＳＰＢ３５９１をＫｐｎＩとＳａｌＩで消化して、ＬａＬＩＳ遺伝子を有する約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。そして、クラーキア由来ＬＩＳ遺伝子を除いたｐＳＰＢ３５６０に、前記ＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＵＣＰＰ上に、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ＬａＬＩＳ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５９３とした。
【０２０４】
次に、ｐＢＩＮＰＬＵＳをＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに、前記ｐＳＰＢ３５９３をＰａｃIで消化して得られる約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、前記ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、カリフラワーモザイクウイルス由来Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、ラベンダー由来ＬＩＳ遺伝子、アグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーターを有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５００１とした。
【０２０５】
（１４）pSPB5003(Mac1p：：AmGPPS.SSU：：Nost；Mac1p：：AmGPPS.LSU：：Nost；El235Sp：：LaLIS：：Nost）の構築
植物において、ＬａＬＩＳ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５００３は、以下の方法で構築した。
【０２０６】
前記（３）と同じ、ｐＵＣＡＡ(ＷＯ２００４／０１８６８２参照)上に、Ｍａｃ1プロモーターおよびカーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ１４７７を使用した。前記ｐＳＰＢ１４７７を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して、カーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子を除き、これに、前記（３）のｐＳＰＢ３５０６をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子）を連結した。得られたプラスミドは、そのｐＵＣＡＡ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１３とした。
【０２０７】
さらに、前記（３）のｐＳＰＢ１４００をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子）を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化したｐＳＰＢ２３１１(ＷＯ２００７／０４９８１６参照)に連結した。得られたプラスミドは、そのｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、Ｍａｃ1プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するプラスミドであり、ｐＳＰＢ３５１４とした。
【０２０８】
前記ｐＳＰＢ３５１４をＡｓｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに前記（３）のｐＳＰＢ３５１３をＡｓｃIで消化して得られる約３ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドをｐＳＰＢ３５３３とした。
【０２０９】
前記ｐＳＰＢ３５３３をＰａｃIで消化後、脱リン酸化処理し、これに、前記（１３）のｐＳＰＢ３５９３をＰａｃIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上に、ラベンダー由来ＬＩＳ遺伝子、キンギョソウ由来ＡｍＧＰＰＳ.ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ.ＬＳＵ遺伝子を有する発現ベクターであり、ｐＳＰＢ５００３とした。
【０２１０】
２．形質転換トレニアの作製
トレニア品種サマーウェーブブルー（SWB）の葉片を用い、国際公開公報ＷＯ２００９／０７２５４２に記載された方法に基づき、形質転換を行った。得られた形質転換体は、それぞれ導入した発現ベクターごとに、以下に示す系統名とした。
pSPB5091（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA25::Nost）：TT175
pSPB5090（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA25::HSPt）：TT174
pSPB5074（El235Sp::FA26::Nost）：TT166
pSPB5073（El235Sp::FA26::HSPt）：TT165
pSPB5075（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA26::Nost）：TT164
pSPB5072（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::FA26::HSPt）：TT162
pSPB5001（El235Sp::LaLIS::Nost）：TT144
pSPB5003（Mac1p::AmGPPS.SSU::Nost;Mac1p::AmGPPS.LSU::Nost;El235Sp::LaLIS::Nost）：TT143
【０２１１】
３．各組換え体におけるリナロール合成量の測定
前記「２．」で取得した組換え体から開花した花５つをランダムに選択した。そして、これらの花弁の上に、１花あたり、ヘッドスペース成分の捕集剤ＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８（ジーエルサイエンス社）１枚、つまり、１個体あたり計５枚の捕集剤を設置し、ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で２４時間採集した。
【０２１２】
翌日、前記捕集剤を各個体から5枚まとめて回収し、前記捕集剤にジクロロメタン ２ｍｌを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出し、回収した。ジクロロメタン中に抽出された揮発成分を濃縮乾固し、さらにジクロロメタン １００μlに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、ＧＣ−ＭＳで分析した。分析条件は、前記実施例２（３）のＧＣ−ＭＳと同様とした。
【０２１３】
これらの結果を、下記表１に示す。下記表は、各組換え体について、各５つの花の結果およびその平均値を示す。下記表１に示すように、既知のラベンダー由来のリナロール合成酵素遺伝子を導入した組換え体ＴＴ１４４およびＴＴ１４３では、いずれもリナロールの合成が認められなかった。これに対して、フリージア由来ＬＩＳ遺伝子を導入した組換え体は、いずれも、保持時間３２．８分にピークが認められ、リナロールが生成成分として検出された。一方、宿主であるSWBからはリナロールが検出されなかった。これらの結果から、前記フリージア由来ＬＩＳ遺伝子は、植物体においてリナロール合成活性を示すことが確認された。
【０２１４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
以上のように、本発明のポリヌクレオチドによれば、遺伝子工学的手法によりリナロール合成酵素の発現が可能である。このため、前記本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物に導入して形質転換体を作製することで、前記形質転換体において、リナロール合成酵素を発現し、これにより香気成分であるリナロールの合成が可能となる。このため、本発明によれば、例えば、植物に芳香性を付与したり、その芳香性の改変を行うことができるため、生花等の園芸植物の栽培において、商品価値の高い園芸植物を提供できることから、極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項２】
前記リナロール合成活性が、（３Ｒ）−リナロール合成活性である、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドからなることを特徴とするリナロール合成酵素遺伝子。
【請求項４】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドまたは請求項４記載の発現ベクターが導入された非ヒト宿主であることを特徴する形質転換体。
【請求項６】
前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記植物が、カーネーションまたはトレニアである、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか一項に記載の形質転換体と同一の性質を有することを特徴とする、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞。
【請求項９】
請求項５から８のいずれか一項に記載の形質転換体、もしくは、形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品。
【請求項１０】
非ヒト宿主に、請求項１または２記載のポリヌクレオチドまたは請求項４記載の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴とする非ヒト宿主の芳香性の改変方法。
【請求項１１】
前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分である、請求項１０記載の改変方法。
【請求項１２】
前記植物が、カーネーションまたはトレニアである、請求項１１記載の改変方法。
【請求項１３】
さらに、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現ベクターが導入された前記非ヒト宿主を、生育させる工程を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の改変方法。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の芳香性の改変方法により、非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする、芳香性改変非ヒト宿主の製造方法。
【請求項１５】
請求項５から７のいずれか一項に記載の形質転換体を、栄養繁殖する工程を含むことを特徴とする芳香性改変非ヒト宿主の製造方法。
【請求項１６】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質
【請求項１７】
前記リナロール合成活性が、（３Ｒ）−リナロール合成活性である、請求項１６記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドを発現させることにより、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする、リナロール合成活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１９】
前記タンパク質合成工程が、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程である、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
前記タンパク質合成工程において、前記非ヒト宿主が、請求項４記載の発現ベクターが導入された非ヒト宿主である、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
前記タンパク質合成工程が、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程である、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１６または１７記載のタンパク質を使用し、前記タンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成するリナロール合成工程を含むことを特徴とするリナロールの製造方法。
【請求項２３】
前記リナロールが、（３Ｒ）−リナロールである、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
さらに、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法により、前記タンパク質を合成するタンパク質合成工程を含み、
前記リナロール合成工程において、前記合成したタンパク質を使用する、請求項２２または２３記載の製造方法。
【請求項２５】
前記タンパク質合成工程が、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成する工程であり、
前記リナロール合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成する工程である、請求項２４記載の製造方法。
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）前記（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項２】
前記リナロール合成活性が、（３Ｒ）−リナロール合成活性である、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドからなることを特徴とするリナロール合成酵素遺伝子。
【請求項４】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドまたは請求項４記載の発現ベクターが導入された非ヒト宿主であることを特徴する形質転換体。
【請求項６】
前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記植物が、カーネーションまたはトレニアである、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか一項に記載の形質転換体と同一の性質を有することを特徴とする、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞。
【請求項９】
請求項５から８のいずれか一項に記載の形質転換体、もしくは、形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品。
【請求項１０】
非ヒト宿主に、請求項１または２記載のポリヌクレオチドまたは請求項４記載の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴とする非ヒト宿主の芳香性の改変方法。
【請求項１１】
前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分である、請求項１０記載の改変方法。
【請求項１２】
前記植物が、カーネーションまたはトレニアである、請求項１１記載の改変方法。
【請求項１３】
さらに、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現ベクターが導入された前記非ヒト宿主を、生育させる工程を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の改変方法。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の芳香性の改変方法により、非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする、芳香性改変非ヒト宿主の製造方法。
【請求項１５】
請求項５から７のいずれか一項に記載の形質転換体を、栄養繁殖する工程を含むことを特徴とする芳香性改変非ヒト宿主の製造方法。
【請求項１６】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リナロール合成活性を有するタンパク質
【請求項１７】
前記リナロール合成活性が、（３Ｒ）−リナロール合成活性である、請求項１６記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドを発現させることにより、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする、リナロール合成活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１９】
前記タンパク質合成工程が、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程である、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
前記タンパク質合成工程において、前記非ヒト宿主が、請求項４記載の発現ベクターが導入された非ヒト宿主である、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
前記タンパク質合成工程が、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程である、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１６または１７記載のタンパク質を使用し、前記タンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成するリナロール合成工程を含むことを特徴とするリナロールの製造方法。
【請求項２３】
前記リナロールが、（３Ｒ）−リナロールである、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
さらに、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法により、前記タンパク質を合成するタンパク質合成工程を含み、
前記リナロール合成工程において、前記合成したタンパク質を使用する、請求項２２または２３記載の製造方法。
【請求項２５】
前記タンパク質合成工程が、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記ポリヌクレオチドがコードするリナロール合成活性を有するタンパク質を合成する工程であり、
前記リナロール合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質のリナロール合成活性により、リナロールを合成する工程である、請求項２４記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−１３４０６（Ｐ２０１３−１３４０６Ａ）
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３１２５０（Ｐ２０１２−１３１２５０）
【出願日】平成２４年６月８日（２０１２．６．８）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月８日（２０１２．６．８）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
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