本発明は、抗原；リポソーム；ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド；及び疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物を提供する。前記組成物の製造方法及び使用方法も提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年６月５日出願の米国特許仮出願第６１／０５９，０４３号の利益及び優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、リポソーム、抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド及び疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来のワクチンは、抗原、アジュバント及び製薬上許容される担体を含みうる。ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドがアジュバントとして有用であることは公知である。また、リポソームがワクチン組成物において有用であることも公知である（出願人らの取得した米国特許第６，７９３，９２３号参照）。しかし、出願人らの知る限り、当分野でワクチン組成物中で抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド、リポソーム及び疎水性担体を結合することを教示したものも示唆したものもない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
出願人らはここに、抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド、リポソーム及び疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物が、驚くことに、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドを水性担体中に含有する従来のワクチン組成物か、又はリポソーム、疎水性担体及びミョウバンアジュバントを含む組成物よりも高い抗体力価及び高い割合の活性化又はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらし得ることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）抗原；（ｂ）リポソーム；（ｃ）ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド；及び（ｄ）疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物を提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、組成物を製造するための方法を提供し、前記方法は、任意の順序で、（ａ）抗原；（ｂ）リポソーム；（ｃ）ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド；及び（ｄ）疎水性物質の連続相を含む担体を結合することを含む。一実施形態では、抗原はリポソームの中に封入されている。一実施形態では、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドはリポソームの中に封入されている。
【０００７】
別の態様では、本発明は、上記の方法に従って調製された組成物を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、上記の組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本方法は、被験体において抗原に対する抗体応答又は細胞性免疫応答を誘導するための方法である。
【０００９】
本発明のその他の態様及び特徴は、以下の本発明の具体的な実施形態の記述を添付される図面と併せて再検討することで当業者に明らかとなる。
本発明の実施形態をほんの一例として説明する図を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３つの群のマウス（ｎ＝９又は１０）のワクチン接種の結果を示すグラフである。群１のマウスに、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された３０μｌの用量中１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＢ、本発明）を接種した。群２のマウスを、３０μｌの用量のリポソーム／ミョウバン／疎水性担体製剤中、１μｇのｒＨＡ及び６０μｇのミョウバンを含むワクチンＡで処置した。群３のマウスに、３０μｌの用量の対照ミョウバンワクチンあたり１μｇのｒＨＡ及び６０μｇのミョウバンを接種した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【図２】２つの群のマウス（ｎ＝９又は１０）のワクチン接種の結果を示すグラフである。群１のマウスに、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された３０μｌの用量中１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＢ、本発明）を接種した。群２のマウスを、３０μｌの用量の対照ｐｏｌｙＩ：Ｃワクチンあたり１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃで処置した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【図３】２つの群のマウス（ｎ＝８又は９）のワクチン接種の結果を示すグラフである。群１のマウスに、単回用量の、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された５０μｌの用量中１μｇのｒＨＡ及び１０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＣ、本発明）を接種した。群２のマウスを、５０μｌの用量の対照ミョウバンワクチンあたり１μｇのｒＨＡ及び１００μｇのミョウバンで処置し、ワクチン接種後２１日にマウスを追加免疫した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。
【図４】リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／油担体ワクチン中に処方されたｒＨＡ抗原によるワクチン接種の後の、増強された抗ｒＨＡ抗体応答。２つの群のマウス（ｎ＝９又は１０）を、次の通りワクチン接種した。群１のマウスに、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された３０μｌの用量中１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＢ、本発明）を接種した。群２のマウスを、ワクチンＡ、つまり３０μｌの用量のリポソーム／ミョウバン／疎水性担体製剤中、１μｇのｒＨＡ及び６０μｇのミョウバンで処置した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【図５】リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／油担体ワクチン中に処方されたｒＨＡ抗原によるワクチン接種の後の、増強された抗ｒＨＡ抗体応答。２つの群のマウス（ｎ＝９又は１０）を、次の通りワクチン接種した。群１のマウスに、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された３０μｌの用量中１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＢ、本発明）を接種した。群２のマウスを、３０μｌの用量の対照ｐｏｌｙＩ：Ｃワクチンあたり１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃで処置した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【図６】凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／油担体ワクチン中に処方されたｒＨＡ抗原によるワクチン接種の後の、増強された抗ｒＨＡ抗体応答。２つの群のマウス（ｎ＝９又は１０）を次の通り免疫した。群１のマウスに、単回用量の、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された５０μｌの用量中１．５μｇのｒＨＡ及び１２．５μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＤ、本発明）を接種した。群２のマウスを、５０μｌの用量の対照ミョウバンワクチンあたり１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのミョウバンで処置し、ワクチン接種後２８日（４週）にマウスを追加免疫した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【図７】ワクチン接種の後のＣＤ８陽性(postive)Ｔ細胞集団内の抗原特異的ＣＤ８細胞の数。３つの群のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）を、次の通りワクチン接種した。群１のマウスに、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された５０μｌの用量中１．５μｇのｒＨＡ及び１２．５μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（ワクチンＤ、本発明）を筋肉内に接種した。群２のマウスに、５０μｌのワクチンＤを皮下に接種した。群３のマウスに、５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバントを筋肉内に接種した。すべてのワクチンは追加免疫せずに一度に投与した。ワクチン接種後２２日以内に、三色フローサイトメトリー分析を用いて動物の脾細胞において抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。細胞を、ｒＨＡの免疫優勢エピトープであるI９Ｌを有するＨ２−Ｄｄに特異的な、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ、抗ＣＤ１９−ＦIＴＣ及びＰＥ−ペンタマーで染色した。結果はＣＤ８β陽性／ＣＤ１９陰性細胞集団の集団中のペンタマー陽性細胞の平均の割合、＋／−標準偏差で表される。ナイーブ細胞から単離された脾細胞で検出されたバックグラウンド染色を減算した。群３と比較して、^＊ｐ＝＜０．０２５、^＊＊ｐ＝＜０．００５。
【図８】本発明において処方される、ｒＨＡに対する単一のワクチン接種の後の赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）力価。１つの群のマウス及び１つの群のウサギ（ｎ＝５）を、次の通りワクチン接種した。マウスの群に、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された５０μｌの用量中０．５μｇのｒＨＡ及び１２μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＥ、本発明）を接種した。ウサギの群を、ワクチンＦ（本発明）、つまり２００μｌの用量の凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤中２μｇのｒＨＡ及び５０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃで処置した。本明細書に記載されるように赤血球凝集抑制アッセイにより液性免疫応答を測定した（ワクチン接種より前に（ワクチン接種前）及び、接種後４週（ウサギ）又は５週（マウス））。各動物群について、ＨＡＩ力価のｌｏｇ１０値を平均し、標準偏差を算出した。
【図９】リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／油担体ワクチン中に処方されたβアミロイド及びＦ２１Ｅペプチドの混合物でのワクチン接種の後の、増強された抗βアミロイド抗体応答。２つの群のマウス（ｎ＝９）を、次の通りワクチン接種した。群１のマウスに、リポソーム／ミョウバン／疎水性担体ワクチンとして処方された１００μｌの用量中１０μｇのβアミロイド、２０μｇのＦ２１Ｅ及び２００μｇのミョウバン（ワクチンＧ）を接種した。群２のマウスを、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体として処方された１００μｌの用量あたり１０μｇのβアミロイド、２０μｇのＦ２１Ｅ及び１０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＨ、本発明）で処置した。本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで液性免疫応答を測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【図１０】リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤中に処方されたワクチンは、細胞性免疫応答及び液性免疫応答を上昇させることができる。２つの群のマウス（ｎ＝５）を、次の通りワクチン接種した。群１のマウスに、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ（高）／疎水性担体ワクチンとして処方された５０μｌの用量中０．５μｇのｒＨＡ及び１２μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＥ、本発明）を接種した。群２のマウスを、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ（低）／疎水性担体として処方された５０μｌの用量あたり０．５μｇのｒＨＡ及び２．５μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＩ、本発明）で処置した。液性（ＩｇＧ１）及び細胞性（ＩｇＧ２Ａ）免疫応答の指標を、本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡで測定した。各処置群について、エンドポイント抗体力価のｌｏｇ１０値を平均し、各時点の標準偏差を算出した。
【図１１】ＨＰＶ１６Ｅ７発現Ｃ３細胞を移植し、８日後に次の通りワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍容積を示すグラフである。群１のマウスに、疎水性担体を含む乳濁液中で処方された、１５μｇのＦＰ抗原及び１５０μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する１００μｌ（対照乳濁液ワクチン）を接種した。群２のマウスに、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中で処方された、１５μｇのＦＰ抗原及び１５０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する１００μｌ（ワクチンＫ、本発明）を接種した。群３のマウスには１００μｌのＰＢＳのみを投与した。全ての群には８匹のマウスが含まれた。腫瘍サイズを移植後５週間、週に１回測定した。図１１は、各群について算出した平均腫瘍容積＋／−ＳＥＭを示す。Ｐ値はスチューデントＴ検定を用いて群１及び群２について算出した、^＊ｐ＝＜０．１、^＊＊ｐ＝＜０．０５。
【図１２】ＨＰＶ１６Ｅ７発現Ｃ３細胞を移植し、５日後に次の通りワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍容積を示すグラフである。群１のマウスに、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中で処方された、１０μｇのＦＰ抗原及び２０μｇのＤＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する１００μｌ（ワクチンＬ、本発明）を投与した。群２のマウスに、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中で処方された、１０μｇのＦＰ抗原及び２０μｇのＤＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する５０μｌ（ワクチンＭ、本発明）を投与した。群３のマウスに、凍結乾燥リポソーム／疎水性担体（アジュバント対照）中で処方された、１０μｇのＦＰ抗原を含有する５０μｌを投与した。群４のマウスに、１００μｌのＰＢＳのみを投与した。全ての群には十（１０）匹のマウスが含まれた。腫瘍サイズを移植後５週間、週に１回測定した。図１２は、各群について算出した平均腫瘍容積＋／−ＳＥＭを示す。Ｐ値はスチューデントＴ検定を用いて群２及び群３について算出した、^＊ｐ＝＜０．０５。
【図１３】凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／油担体ワクチン中に処方されたｒＨＡ抗原によるワクチン接種の後の増強された抗ｒＨＡ細胞応答。２つの群のマウス（ｎ＝９又は１０）を次の通り免疫した。群１のマウスに、単回用量の、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンとして処方された５０μｌの用量中１．５μｇのｒＨＡ及び１２．５μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ワクチンＤ、本発明）を接種した。群２のマウスを、５０μｌの用量の対照ミョウバンワクチンあたり１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのミョウバンで処置し、マウスをワクチン接種後２８日（４週）に追加免疫した。抗原特異的細胞応答を、Ｈ２−ＫｄエピトープＩＹＳＴＶＡＳＳＬに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のペンタマー染色、及びフローサイトメトリーにより測定した。記載されるように本発明によってワクチン接種したマウスは、持続性の抗原特異的細胞応答を生じた。スチューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本出願は、リポソーム、抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド及び疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物ならびにそれらの使用に関する。
【００１２】
抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド、リポソーム及び疎水性物質の連続相を含む担体を結合する本発明の組成物は、驚くことに、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドを水性担体中に含有する従来のワクチン組成物か、又はリポソーム、疎水性担体及びミョウバンアジュバントを含む組成物よりも高い抗体力価をもたらした。
【００１３】
本明細書の実施例１及び２に記載されるデータを表１に要約する:
【表１】

【００１４】
上の表（表１）から分かることは、本発明の組成物（３）は、リポソームと疎水性担体の組合せ（１）か、又はｐｏｌｙＩ：Ｃの使用（２）の相加作用よりも高い抗体力価をもたらすことである。（１）と（２）の相加作用は、対数化しない抗体力価の２５６，０００＋１，０２４，０００＝１，２８０，０００となる。代わりに、（３）のミョウバンアジュバントをｐｏｌｙＩ：Ｃに置き換えることにより、予想外に高い対数化しない抗体力価の８，１９２，０００（予測した相加作用の６．４倍）が得られる。さらに、組成物（３）によって生じた抗体応答は長く続き、上記のより早い時点（ワクチン接種後４週）で観察された効果はワクチン接種後１６週に維持された（実施例４及び５）。本明細書の実施例４及び５に記載されるデータを表２に要約する：
【表２】

【００１５】
（１）及び（２）の相加作用は、対数化しない平均抗体力価の１２８，８２４＋１６９，８２４＝２９８，６４８となる。代わりに、（３）のミョウバンアジュバントをｐｏｌｙＩ：Ｃに置き換えることにより、１，６１２，８１０（予測した相加作用の５．４倍）という予想外に高い対数化しない平均抗体力価が得られる。
【００１６】
上記の組成物（３）で観察される結果は、抗原（ｒＨＡ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ、凍結乾燥リポソーム、及び疎水性担体からなる組成物を使用する別個の試験で２回実施され、実施例３に記載された。ワクチン接種後８週のこの組成物で観察される平均抗体力価は、その活性を増強するために２回送達される、標準的なミョウバンをアジュバントとした(alum-adjuvanted)ワクチンで観察される１４７，９１０の（対数化せず）平均力価と比較して、２，８８４，０３１（対数化せず）であった。この１９．４倍の力価の平均増加は、記載される組成物の１回の免疫で観察された。
【００１７】
ｐｏｌｙＩ：Ｃ、リポソーム、及び疎水性担体を含有するワクチン組成物は、広範囲の抗原に対する抗体応答及び／又は細胞応答を生じる可能性を有する。実施例１から６ならびに実施例８及び９は、組成物の全ての成分を組み合わせた場合に、組換えタンパク質（ｒＨＡ）又は短いペプチド（βアミロイド）に対して有意に高い抗体応答を起こす能力を実証する。これらの驚くほど高い抗体力価は、特にワクチン組成物中でｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドを使用しない場合には観察されず（実施例１、４、及び９）、ｐｏｌｙＩ：Ｃを単独で抗原とともに使用しているにもかかわらず、リポソーム及び疎水性担体の不在下でも、観察されなかった（実施例２及び５）。同様に、組成物の全ての成分の組合せは、公知のＣＴＬエピトープを含有する組換えタンパク質又は短いペプチドに対して、実施例７及び実施例１１〜１３に説明される、有意により一層効果的かつより長く持続する細胞の免疫応答を生じた。著しい抗原特異的免疫応答は、少なくとも２つの免疫経路によって前記組成物で免疫する時に検出された（実施例７）。記載される本発明を用いて腫瘍増殖を制御することへの特異な有効性は、特に組成物中でｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドを使用しない場合には観察されず（実施例１２）、また、リポソームを使用しない場合には、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド及び疎水性担体を抗原とともに使用したにもかかわらず、観察されなかった（実施例１１）。記載される組成物の全ての成分（実施例６、７、１０、及び１３）を使用して、少なくとも１つの免疫によって頑丈かつ持続性の液性応答及び細胞応答を同時に起こす能力は、感染症及び癌を含む広い範囲の医学適用における組成物の特定の有用性を説明する。
【００１８】
本明細書に記載される実施例の一群から、二以上の立体化学配置の、抗原、リポソーム、疎水性担体及びイノシン及びシトシン残基を含有するリボもしくはデオキシリボポリヌクレオチドからなるワクチン組成物が、異常に強い免疫応答を誘導することができることは明らかである。また、これらの実施例は、所望の組成物を製造する二以上の方法も記載する。
【００１９】
抗原
本発明の組成物は１又はそれ以上の抗原を含む。本明細書において、用語「抗原」とは、抗体又はＴ細胞受容体に特異的に結合することのできる物質をさす。
【００２０】
本発明の組成物において有用な抗原としては、限定されないが、ポリペプチド、微生物又はその部分、例えば生の、弱毒化された、不活化されたもしくは死滅した、細菌、ウイルス又は原生動物、あるいはその部分が挙げられる。
【００２１】
本明細書及び請求項において、用語「抗原」にはまた、抗原として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。核酸に基づくワクチン接種戦略は公知であり、この際、ポリヌクレオチドを含むワクチン組成物が被験体に投与される。ポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドが最終的に被験体に存在するように、ワクチン組成物自体がポリペプチドを含んでいたかのように、被験体で発現する。本発明の目的において、用語「抗原」は、文脈が指示する場合、抗原として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００２２】
本発明において抗原として有用であり得るポリペプチド又はその断片としては、限定されないが、コレラトキソイド、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、インフルエンザＭタンパク質、ＰｆＨＲＰ２、ｐＬＤＨ、アルドラーゼ、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＡＭＡ１、Ｄｅｒ−ｐ−１、Ｄｅｒ−ｆ−１、アディポフィリン、ＡＦＰ、ＡＩＭ−２、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、αフェトタンパク質、ＢＣＬ−２、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＢＩＮＧ−４、ＣＥＡ、ＣＰＳＦ、ＣＴ、サイクリンＤ１Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥＬＦ−２、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、ゴナドトロピン放出ホルモン、ＨＥＲ−２、腸カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＭ−２、ＭＭＰ−２、ＭＵＣ−１、ＮＹ−ＥＯＳ−１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｐ５３、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＮＦ４３、ＲＵ１、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＡＧＥ−１、ＳＣＲＮ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン(surviving)、テロメラーゼ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＥＲＴ及びＷＴ１に由来するものが挙げられる。
【００２３】
本発明において抗原として有用なウイルス又はその部分としては、限定されないが、牛痘ウイルス、ワクシニアウイルス、偽牛痘ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、サイトメガロウイルス、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、パルボウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス、フラビウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス及び水痘が挙げられる。
【００２４】
本発明において抗原として有用な細菌又はその部分としては、限定されないが、炭疽菌、ブルセラ菌、カンジダ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・シタッシ、コレラ、クロストリジウム・ボツリヌム、コクシジオイデス・イミティス、クリプトコッカス、ジフテリア、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、髄膜炎菌、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコバクテリウム、百日咳、肺炎、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌及びエルシニア・エンテロコリチカが挙げられる。
【００２５】
あるいは、抗原は、原生動物起源、例えばマラリアを引き起こす熱帯熱マラリア原虫のものであってもよい。
【００２６】
用語「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０アミノ酸）又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖を包含し、それには、例えば、天然のタンパク質、合成又は組換えポリペプチド及びペプチド、変性ポリペプチド及びペプチド、エピトープ、ハイブリッド分子、変異体、同族体、類似体、ペプトイド、ペプチドミメティクス、などが含まれる。そのため、変異体又は誘導体には、欠失（トランケーション及び断片を含む）；挿入及び付加、例えば保存的置換、部位特異的変異及び対立遺伝子変異体；ならびにペプチドと共有結合している１又はそれ以上の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質など）を有するペプトイドを含む修飾及び翻訳後修飾が含まれる。本明細書において、用語「保存されたアミノ酸置換」又は「保存的置換」とは、ペプチドの所定の位置での１つのアミノ酸でのもう一つのアミノ酸の置換をさし、ここで、置換は当該機能を実質的に失うことなく行われ得る。そのような変更を行う際に、同様のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて行ってもよく、そのような置換は日常的な試験によりペプチドの機能へのそれらの影響についてアッセイすることができる。保存的置換の具体的な限定されない例としては、次の例が挙げられる。
元の残基 保存的置換
Ａｌａ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
【００２７】
好ましい抗原配列との実質的同一性を有するポリペプチド又はペプチドを使用してもよい。２つの配列は、最適に整列された場合（許容されるギャップを含む）にそれらが少なくとも約５０％の配列同一性を共有するならば、又は、それらの配列が規定された機能モチーフを共有するならば、実質的同一性を有すると考えられる。代替実施形態では、最適に整列された配列は、特定の領域にわたって少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有するならば、実質的に同一である（すなわち実質的同一性を有する）と考えられ得る。用語「同一性」とは、２つのポリペプチド分子間の配列類似性をさす。同一性は、整列された配列での各々の位置を比較することにより決定することができる。アミノ酸配列間の同一性の程度は、例えば、特定の領域にわたってそれらの配列が共有する位置での同一であるか又は匹敵するアミノ酸の数の関数である。同一性の比較のための配列の最適な整列は、当分野で公知のような多様なアルゴリズムを用いて行われてもよく、それには、http://clustalw.genome.ad.jpで利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性探索方法、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなど）が含まれる。配列同一性はまた、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて（公開された初期設定を用いて）決定されてもよい。例えば、米国国立生物工学情報センターを通じて（インターネットのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgiを通じて）利用可能な「ＢＬＡＳＴ２配列」ツールを用いてもよく、次の初期設定：ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ １０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ３；ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １で「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを選択する。もう一つの実施形態では、当業者は所与配列を容易かつ適当に整列させることができ、単なる目視検査により配列同一性及び／又は相同性を推定することができる。
【００２８】
本発明を実行するために使用されるポリペプチド及びペプチドは、天然起源から単離されたものであってもよいし、合成されたものであってもよいし、又は組換え技術によって作製されたポリペプチドであってもよい。ペプチド及びタンパク質は、インビトロ又はインビボで組換えによって発現させることができる。本発明を実行するために使用されるポリペプチド及びペプチドは、当分野で公知の任意の方法を用いて作製及び単離されてもよい。本発明を実行するために使用されるポリペプチド及びペプチドはまた、当分野で周知の化学的方法を用いて全部又は一部を合成してもよい。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Hom (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K,Ｔｈerapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Paを参照されたい。例えば、ペプチド合成は様々な固相技術を用いて行うことができ（例えば、Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13参照）、自動合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造業者により提供される説明書に従って用いて実現することができる。
【００２９】
一部の実施形態では、抗原は、例えば、約２５％〜５０％純粋な、約５０％〜約７５％純粋な、約７５％〜約８５％純粋な、約８５％〜約９０％純粋な、約９０％〜約９５％純粋な、約９５％〜約９８％純粋な、約９８％〜約９９％純粋な、又は９９％を上回って純粋な、精製された抗原であってもよい。
【００３０】
上記のように、用語「抗原」にはまた、抗原として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。核酸に基づくワクチン接種戦略は公知であり、この際、ポリヌクレオチドを含むワクチン組成物が被験体に投与される。ポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドが最終的に被験体に存在するように、ワクチン組成物自体がポリペプチドを含んでいたかのように、被験体で発現する。本発明の目的において、用語「抗原」は、文脈が指示する場合、抗原として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００３１】
本明細書及び請求項において、用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さ（例えば９、１２、１８、２４、３０、６０、１５０、３００、６００、１５００又はそれ以上のヌクレオチド）又は鎖数（例えば一本鎖又は二本鎖）のヌクレオチドの鎖を包含する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）あるいはそれらの組合せであってもよい。それらは天然に存在していてもよいし、合成されていてもよい（例えば化学的に合成されてもよい）。ポリヌクレオチドがヌクレオチド鎖中に１又はそれ以上の窒素含有塩基、ペントース糖又はリン酸基の修飾を含み得ることは企図される。そのような修飾は当分野で周知であり、例えばポリヌクレオチドの安定性の向上のためのものであり得る。
【００３２】
ポリヌクレオチドは、様々な形態で送達されてもよい。一部の実施形態では、線状の形態であるか、又はプラスミド、例えば発現プラスミドなどに挿入された、裸のポリヌクレオチドが使用され得る。その他の実施形態では、ウイルスもしくは細菌ベクターなどの生ベクターが使用され得る。
【００３３】
ＤＮＡのＲＮＡへの転写及び／又はＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を助ける１又はそれ以上の調節配列が存在してもよい。場合によっては（ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である場合など）、転写プロセスに関連する調節配列（例えばプロモーター）は必要でなく、タンパク質発現はプロモーターの不在下で達成され得る。当業者であれば、状況により必要とされる適した調節配列を含めることができる。
【００３４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは発現カセット中に存在し、発現カセットにおいてポリヌクレオチドは、本発明の組成物を投与する被験体においてポリヌクレオチドを発現させる調節配列と作動可能に連結されている。発現カセットの選択は、組成物を投与する被験体ならびに発現するポリペプチドに望まれる特徴によって決まる。
【００３５】
一般に、発現カセットには、被験体において有効であり、構成的又は誘導性であるプロモーター；リボソーム結合部位；必要であれば、開始コドン（ＡＴＧ）；関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；停止コドン；及び所望により３’末端領域（翻訳及び／又は転写ターミネーター）が含まれる。シグナルペプチドをコードする領域などのさらなる配列を含めてもよい。関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現カセット中の他の調節配列のいずれかと相同であっても非相同であってもよい。関心対象のポリペプチドとともに発現する配列、例えばシグナルペプチドコード領域は、一般に、発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに隣接して位置し、適当なリーディングフレームに配置される。発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドによって単独で、又は発現させる任意の他の配列（例えばシグナルペプチド）とともに構成されるオープンリーディングフレームは、組成物を投与する被験体において転写及び翻訳が起こるように、プロモーターの制御下に配置される。
【００３６】
関連実施形態では、抗原は、アレルゲンであってもよく、限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖抱合体、多糖及びその他の分子のペプチド及び非ペプチド模倣物、小分子、脂質、糖脂質、及び植物、動物、真菌、昆虫、食物、薬物、粉塵、及びダニの炭水化物に由来してもよい。アレルゲンとしては、限定されるものではないが、環境空気アレルゲン；植物花粉（例えばブタクサ／季節性鼻アレルギー）；雑草花粉アレルゲン；草花粉アレルゲン；ジョンソングラス；樹木花粉アレルゲン；ライグラス；クモ類アレルゲン（例えばチリダニアレルゲン）；貯蔵ダニ(storage mite)アレルゲン；スギ花粉／季節性鼻アレルギー；カビ／菌類胞子アレルゲン；動物アレルゲン（例えば、イヌ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、マウスなどのアレルゲン）；食物アレルゲン（例えば甲殻類；木の実；柑橘類；小麦粉；コーヒー）；昆虫アレルゲン（例えばノミ、ゴキブリ）；毒液：（ハチ類、スズメバチ(yellow jacket)、ミツバチ、カリバチ(wasp)、スズメバチ(hornet)、ヒアリ）；細菌アレルゲン（例えば連鎖球菌抗原；回虫抗原などの寄生虫アレルゲン）；ウイルス抗原；薬物アレルゲン（例えばペニシリン）；ホルモン（例えばインスリン）；酵素（例えばストレプトキナーゼ）；及び、不完全抗原又はハプテンとして作用する能力のある薬物又は化学物質（例えば酸無水物及びイソシアネート）が挙げられる。
【００３７】
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドは、イノシン酸残基（Ｉ）及びシチジル酸残基（Ｃ）を含有する二重鎖ポリヌクレオチド分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの組合せのいずれか）であり、炎症性サイトカイン、例えばインターフェロンなどの産生を誘導する。それらは一般に、完全にシトシン含有ヌクレオチドからなる１本のストランド及び完全にイノシン含有ヌクレオチドからなる１本のストランドで構成されるが、その他の構成も可能である。例として、各々のストランドは、シトシン含有ヌクレオチドとイノシン含有ヌクレオチドの両方を含んでもよい。場合によっては、ストランドのいずれか又は両方は、１又はそれ以上の非シトシン又は非イノシンヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【００３８】
ｐｏｌｙＩ：Ｃは、そのインターフェロン活性化能への影響なく１６残基ごとに分割することができることが報告されている（Bobst, 1981）。さらに、ウリジン残基を１２反復シチジル酸残基ごとに導入することによりミスマッチさせたｐｏｌｙＩ：Ｃ分子のインターフェロン誘導能（Hendrix, 1993）は、最小の１２残基の二重鎖ｐｏｌｙＩ：Ｃ分子がインターフェロン産生を促進するために十分であることを示唆する。また、他の研究者らは、６〜１２残基程度の小さい領域（二重鎖ポリヌクレオチドの０．５〜１回の螺旋回転に相当）が誘導プロセスを引き起こす能力があることをを示唆した（Greene, 1978）。合成によって作製する場合、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドは、一般に約２０又はそれ以上の残基長である（一般に２２、２４、２６、２８又は３０残基長）。半合成によって作製する場合（例えば酵素を使用）、ストランドの長さは、５００、１０００又はそれ以上の残基であってもよい。
【００３９】
ｐｏｌｙＩ：Ｃは、ウイルスゲノムの模倣物の機能を果たし、インビボで免疫系を調節するために特に有用である。合成ＰｏｌｙＩ:ｐｏｌｙＣホモポリマーは、例えば静脈内又は筋肉内注射によりインビボで全身的に送達される場合、インターフェロンγを非特異的に誘導することにより自然免疫を増強することが報告されている（Krown 1985、Zhu 2007）。ポリイノシン酸及びポリシチジル酸ポリマーのいくつかの変異体は、数年にわたって記載され（de Clercq 1978、Bobst 1981、De Clercq 1975、Guschlbauer 1977、Fukui 1977、Johnston 1975、US3906092 1971、Kamath 2008、Ichinohe 2007）、その一部には共有結合的に修飾された残基の使用、リボ及びデオキシリボイノシン酸及びシチジル酸残基の使用、イノシン酸及びシチジル酸残基を含むホモポリマー及び代替コポリマーの使用、ならびにミスマッチポリマーを作出する特定の残基の導入が含まれていた。
【００４０】
イノシン酸及びシチジル酸を含有する二重鎖ポリヌクレオチドの使用は、多数のウイルス性疾患（Kende 1987、Poast 2002、6,468,558 2002、Sarma 1969、Stephen 1977、Levy 1978）、癌（Durie 1985、Salazar 1996、Theriault 1986、Nakamura 1982、Talmadge 1985、Droller 1987）、多発性硬化症などの自己免疫疾患（Bever 1986）、及びマラリアなどのその他の感染症（Awasthi １９９７、Puri 1996）の治療について報告されている。ｐｏｌｙＩ：Ｃ分子の有効性は、一部の例では分子と正に帯電したポリ−リジン及びカルボキシメチル−セルロースとの錯体を形成し、ポリヌクレオチドをインビボでのヌクレアーゼ分解から効果的に保護することによるか（Stephen 1977、Levy 1985）、又はｐｏｌｙＩ：Ｃと正に帯電した合成ペプチドとの錯体を形成することにより（Schellack 2006）さらに増強された。
【００４１】
その自然免疫の非特異的エンハンサーとしての使用に加えて、ｐｏｌｙＩ：Ｃはまた、ワクチン組成物中のアジュバントとしても有用である。自然免疫の増強は、おそらく、ＮＫ細胞、マクロファージ及び／又は樹状細胞を少なくとも一部分含む機構によって、増強された抗原特異的適応免疫を導き得る（Chirigos 1985、Salem 2006、Alexopoulou 2001、Trumpfheller 2008）。この文脈におけるｐｏｌｙＩ：Ｃ分子の使用の証拠は、感染症を制御するための様々なワクチン研究（Houston 1976、Stephen 1977、Ichinohe 2007、Sloat 2008、Agger 2006、Padalko 2004）、及び多様なワクチン様式による癌の予防又は治療（Zhu 2007、Cui 2006、Salem 2005、Fujimura 2006、Llopiz 2008）が起源である。これらの研究は、特定の感染症抗原に対する増強された抗体応答から明らかなように、ｐｏｌｙＩ：Ｃが液性応答を増強することを実証する。ｐｏｌｙＩ：Ｃはまた抗原特異的細胞応答増強物質でもある（Zhu 2007、Zaks 2006、Cui 2006、Riedl 2008）。ｐｏｌｙＩ：Ｃ分子のアジュバント作用は、少なくとも一部分、トル様受容体（ＴＬＲ）例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９などとのそれらの相互作用によってインターフェロンγを誘導することにより起こると考えられ（Alexopoulou 2001、Trumpfheller 2008、Schellack 2006、Riedl 2008）、ＴＬＲ３は特に大部分のｐｏｌｙＩ：Ｃ分子に関連する。また、証拠は、ｐｏｌｙＩ：Ｃ分子が、少なくとも一部分、ＴＬＲ以外の受容体、例えばＲＮＡヘリカーゼレチノイン酸誘導タンパク質Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）／黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）との相互作用によりその作用を発揮し得ることを示唆する。（Alexopoulou 2001、Yoneyama 2004、Gowen 2007、Dong 2008）。ｐｏｌｙＩ：Ｃ分子の作用機序は、まだ完全に理解されていない。
【００４２】
したがって、本明細書において、「ｐｏｌｙＩ：Ｃ」又は「ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド」は、二本鎖ポリヌクレオチド分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの組合せ）であり、その各々のストランドは、少なくとも６つの隣接するイノシン酸もしくはシチジル酸残基、あるいは任意の順序でイノシン酸及びシチジル酸から選択される６つの隣接する残基（例えばＩＩＣＩＩＣ又はＩＣＩＣＩＣ）を含み、哺乳類被験体において少なくとも１種類の炎症性サイトカイン、例えばインターフェロンなどの産生を誘導又は促進する能力がある。ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドは、一般に約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００又はそれ以上の残基の長さを有する。上限は重要であるとは考えない。好ましいｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドの最小長は、約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０ヌクレオチドであってもよく、最大長は約１０００、５００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５又は４０ヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドの各々のストランドは、イノシン酸又はシチジル酸残基のホモポリマーであってもよいか、又は、各々のストランドは、イノシン酸及びシチジル酸残基を含有するヘテロポリマーであってもよい。いずれの場合も、ポリマーは、上記のように、６個のＩ、６個のＣ又は６個のＩ／Ｃ残基からなる少なくとも１つの隣接する領域があるならば、１又はそれ以上の非イノシン酸又は非シチジル酸残基（例えばウリジン）によって中断されてもよい。一般に、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドの各々のストランドは、６個のＩ／Ｃ残基につき１以下の非Ｉ／Ｃ残基、より好ましくは、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０個のＩ／Ｃ残基ごとに１以下の非Ｉ／Ｃ残基を含む。
【００４４】
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド中のイノシン酸又はシチジル酸（又はその他の）残基は、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドの炎症性サイトカイン、例えばインターフェロンなどの産生を促進する能力が保持されるならば、当分野で公知のように誘導体化又は修飾されてもよい。誘導体又は修飾の限定されない例としては、例えばアジド修飾、フルオロ修飾、又はインビボで安定性を向上させるため天然のホスホジエステル結合の代わりにチオエステル（又は同様の）結合を使用することが挙げられる。ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドはまた、例えばそのインビボでの分解に対する抵抗性を増強するために、例えば、正に帯電したポリ−リジン及びカルボキシメチルセルロースとの、又は正に帯電した合成ペプチドとの分子の錯体形成により、修飾されてもよい。
【００４５】
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドは、一般に本発明の組成物中に組成物の単位用量あたり約０．００１ｍｇ〜１ｍｇの量で含まれる。
【００４６】
リポソーム
リポソームは、封入された水性容積を含有する完全に閉じられた脂質二重層である。リポソームは、単層小胞（単一の二分子膜を有する）であってもよいし、多重膜二重層を特徴とする多層小胞であってもよく、各々の二重層は、隣の二重層と水層で分離されていてもいなくてもよい。リポソームの一般的な考察は、Gregoriadis G. Immunol. Today, 11 :89-97, 1990; 及び Frezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181-189, 1999に見出すことができる。本明細書及び請求項において、用語「リポソーム」は、上記のように全てのそのような小胞構造を包含することが意図され、それには、限定されないが、当分野で「ニオソーム」、「トランスファーソーム」及び「ビロソーム」として記載されるものが含まれる。
【００４７】
本発明では、古細菌脂質から作られるリポソームを含むいずれのリポソームを使用してもよいが、特に有用なリポソームはリポソーム製剤中にリン脂質及び非エステル化コレステロールを使用する。コレステロールは、リポソームを安定化するために使用され、リポソームを安定化する任意のその他の化合物をコレステロールに置き換えてもよい。その他のリポソーム安定化化合物は当業者に公知である。例えば、飽和リン脂質は、安定性の増加を示す高い転移温度を有するリポソームを産生する。
【００４８】
リポソームの調製で好ましく使用されるリン脂質は、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン及びホスホイノシトールからなる群から選択される少なくとも１つの頭部基を有するリン脂質である。より好ましいものは、９４〜１００％ホスファチジルコリンである脂質を含むリポソームである。かかる脂質はレシチンホスホリポン（登録商標）９０Ｇにおいて市販されている。非エステル化コレステロールもリポソーム製剤中で使用する場合、コレステロールはリン脂質の量の約１０％に等しい量で使用する。コレステロール以外の化合物を使用してリポソームを安定化する場合、当業者は、組成物中に必要とされる量を容易に決定することができる。
【００４９】
リポソーム組成物は、例えば、天然脂質、合成脂質、スフィンゴ脂質、エーテル脂質、ステロール、カルジオリピン、陽イオン性脂質ならびにポリ（エチレングリコール）及びその他のポリマーで修飾された脂質を使用することにより、得ることができる。合成脂質としては、次の脂肪酸成分：ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、オレオイル、リノレオイル、エルコイル又はこれらの脂肪酸の組合せを挙げることができる。
【００５０】
担体
組成物の担体は、疎水性物質、好ましくは液体疎水性物質の連続相を含む。連続相は、本質的に純粋な疎水性物質又は疎水性物質の混合物であってもよい。その上、担体は、該疎水性物質が連続相を構成するのであれば、疎水性物質中水型乳濁液又は疎水性物質混合物中水型乳濁液であってもよい。さらに、もう一つの実施形態では、担体はアジュバントとして機能することができる。
【００５１】
本明細書に記載される組成物中で有用な疎水性物質は、製薬上及び／又は免疫学上許容される疎水性物質である。担体は液体であることが好ましいが、大気温度で液体でない特定の疎水性物質を例えば加温により液化してもよく、それも本発明において有用である。一実施形態では、疎水性担体は、リン酸緩衝生理食塩水／フロイント不完全アジュバント（ＰＢＳ／ＦＩＡ）乳濁液であってもよい。
【００５２】
油又は油中水型乳濁液は、本発明での使用に特に適した担体である。油は製薬上及び／又は免疫学上許容されるべきである。適した油としては、例えば、鉱油（特に軽い又は低い粘度の鉱油、例えばＤｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ＶＲなど）、植物油（例えば、ダイズ油）、堅果油（例えば、ピーナッツ油）、又はそれらの混合物が挙げられる。一実施形態では、油は、鉱油溶液中のオレイン酸マンニドであり、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１として市販されている。動物性脂肪及び人工疎水性ポリマー材料、特に大気温度で液体であるか又は比較的簡単に液化できるもの、も使用してもよい。
【００５３】
その他の成分
組成物は、当分野で公知のように、１又はそれ以上の製薬上許容されるアジュバント、賦形剤などをさらに含んでもよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985) 及び１９９９年出版のThe United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 24 NF19) published in 1999を参照されたい。
【００５４】
用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を強化する化合物又は混合物をさす。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポーとしての役割を果たすことができ、かつ免疫応答を非特異的に増強するリンパ様系活性化因子としての役割も果たすことができる（Hood et al, Immunology, 2d ed., Benjamin/Cummings: Menlo Park, C.A., 1984; see Wood and Williams, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 23, pp. 317-323）。多くの場合、アジュバントの不在下での抗原単独による一次抗原投与は、液性免疫応答を引き出すことができない。
【００５５】
適したアジュバントとしては、限定されるものではないが、ミョウバン、アルミニウムのその他の化合物、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｒｉｂｉ（登録商標）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、サポニン、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、コリネバクテリウム・パルバム、ＱＳ−２１、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、ＣｐＧなどのＴＬＲアゴニストファミリーのアジュバント、フラジェリン(falgellin)、リポペプチド、ペプチドグリカン、イミダゾキノリン、一本鎖ＲＮＡ、リポ多糖（ＬＰＳ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ならびにセラミド及びαＧａｌ−ｃｅｒなどの誘導体が挙げられる。適したアジュバントにはまた、サイトカイン又はケモカインがそれらのポリペプチド又はＤＮＡコード形で、例えば、限定されるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などで含まれる。適したミョウバンアジュバントは、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の商標名で販売されており、水酸化アルミニウム（４５ｍｇ／ｍｌ）及び水酸化マグネシウム（４０ｍｇ／ｍｌ）に不活性安定剤を加えたものの水溶液からなる。
【００５６】
用いるアジュバントの量は、抗原の量及びアジュバントの種類によって決まる。当業者であれば、特定の適用に必要とされるアジュバントの量を容易に決定することができる。
【００５７】
本発明の組成物を投与した被験体において引き出される免疫応答は、抗体又は細胞性免疫応答に対する免疫応答に偏って処方することができる。これは、Ｔｈ１又はＴｈ２応答を主に誘導する薬剤、例えばアジュバントなどを使用することにより達成されてもよい。例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）を用いて主にＴｈ１応答を誘導することができる、従って細胞性応答に有利である。
【００５８】
組成物
リポソームを作製する方法は当分野で周知である。例えば、両方とも既に引用したGregoriadis(1990)及びFrezard(1999)を参照されたい。リポソームを作製するための任意の適した方法を本発明の実践に用いてもよく、又は、リポソームを商業的供給源から入手してもよい。リポソームは一般に脂質二重層（例えばリン脂質及びコレステロール）を形成するリポソーム成分を水溶液で水和することにより調製され、その水溶液は、純水又は水に溶解した１又はそれ以上の成分の溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リン酸を含まない生理食塩水、又は任意のその他の生理学的に相溶性の水溶液であってもよい。
【００５９】
一実施形態では、リポソーム成分又はリポソーム成分の混合物、例えばリン脂質（例えばホスホリポン（登録商標）９０Ｇ）及びコレステロールは、有機溶媒、例えばクロロホルムとメタノールの混合物中で可溶化され、それに続いて濾過し（例えばＰＴＦＥ０．２μｍフィルタ）、乾燥させて（例えば回転蒸発により）溶媒を除去することができる。
【００６０】
得られる脂質混合物の水和は、例えば脂質混合物を水溶液に注入することによるか又は脂質混合物と水溶液を超音波処理することにより達成することができる。リポソームの形成の間、リポソーム成分は、リポソーム成分を水和した水溶液の容積を取り囲む単一の二重層（単層）又は多重二重層（多重膜）を形成する。
【００６１】
一部の実施形態では、リポソームは、次に、例えばフリーズドライ又は凍結乾燥により脱水される。
【００６２】
リポソームは連続する疎水相を含む担体と組み合わされる。これは多様な方法で行うことができる。
【００６３】
担体が疎水性物質単独又は疎水性物質の混合物からなる場合（例えば１００％鉱油担体を使用）、リポソームは、単に疎水性物質と混合してもよいし、あるいは複数の疎水性物質が存在する場合は、それらのいずれか又はそれらの組合せと混合してもよい。
【００６４】
代わりに、疎水性物質の連続相を含む担体が不連続の水相を含む場合、担体は一般に疎水相中水相の乳濁液、例えば油中水乳濁液の形態をとる。かかる組成物は、乳濁液を安定化させるため、及びリポソームの均一な分布を促進するために乳化剤を含んでもよい。この点で、乳化剤は、たとえ水を含まない担体を使用したとしても、担体中でのリポソームの均一な分布を促進するために有用であり得る。典型的な乳化剤としては、オレイン酸マンニド（Ａｒｌａｃｅｌ（商標）Ａ）、レシチン、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０、ならびにＳｐａｎｓ（商標）２０、８０、８３及び８５が挙げられる。一般に、疎水性物質の乳化剤に対する容積比（ｖ／ｖ）は、約５：１〜約１５：１の範囲内であり、約１０：１の比が好ましい。
【００６５】
リポソームは完成した乳濁液に添加してもよいし、それらは乳化の前に水相か又は疎水相のいずれかに存在してもよい。
【００６６】
抗原は、製剤プロセスの様々な異なる段階で導入することができる。１種類より多くの抗原を組成物の中に組み込んでもよい（例えば不活化ウイルス、弱毒生ウイルス、タンパク質又はポリペプチド）。
【００６７】
一部の実施形態では、抗原は、リポソームの脂質二重層（例えばリン脂質及びコレステロール）を形成するために用いた成分を水和するために用いた水溶液中に存在する。この場合、抗原はリポソーム内に封入され、その水性の内部に存在する。得られるリポソームが洗浄されていないか又は乾燥している場合（例えば最終的に疎水性物質の連続相を含む担体と混合される残りの水溶液が存在するように）、さらなる抗原が最終生成物中のリポソームの外側に存在することも可能である。関連技術では、水溶液で水和する前に、抗原をリポソームの脂質二重層を形成するために使用する成分と混合することができる。
【００６８】
代替アプローチでは、抗原は、その代わりに、担体をリポソームと結合する前、最中又は後に、疎水性物質の連続相を含む担体と混合してもよい。担体が乳濁液である場合、乳化の前に抗原を水相又は疎水相のいずれか又は両方と混合してもよい。あるいは、乳化後に抗原を担体と混合してもよい。
【００６９】
抗原と担体を結合する技術は、リポソームの内部及び疎水性物質の連続相を含む担体中の両方に抗原が存在するように、上記のリポソーム中の抗原のカプセル封入と一緒に用いてもよい。
【００７０】
上記の抗原を組成物の中に導入するための手順はｐｏｌｙＩ：Ｃにも適用される。つまり、ｐｏｌｙＩ：Ｃは、例えば任意の１又はそれ以上の：（１）リポソームの脂質二重層を形成するために使用する成分を水和するために使用する水溶液；（２）リポソームの脂質二重層を形成するために使用する成分；又は（３）担体をリポソームと結合する前、最中又は後に、疎水性物質の連続相を含む担体に導入されてもよい。担体が乳濁液である場合、乳化の前にｐｏｌｙＩ：Ｃを水相又は疎水相のいずれか又は両方と混合してもよい。あるいは、乳化後にｐｏｌｙＩ：Ｃを担体と混合してもよい。
【００７１】
ｐｏｌｙＩ：Ｃと担体を結合する技術は、ｐｏｌｙＩ：Ｃがリポソームの内部及び疎水性物質の連続相を含む担体中の両方に存在するように、リポソーム中のｐｏｌｙＩ：Ｃのカプセル封入と一緒に用いてもよい。
【００７２】
ｐｏｌｙＩ：Ｃは、抗原と一緒に、同じ処理段階で、又は別々に、異なる処理段階で組成物に組み込むことができる。例として、抗原及びｐｏｌｙＩ：Ｃが両方ともにリポソームに封入されるように、抗原及びｐｏｌｙＩ：Ｃは両方ともに脂質二重層形成リポソーム成分を水和するために使用する水溶液中に存在してもよい。あるいは、抗原をリポソームに封入し、ｐｏｌｙＩ：Ｃを疎水性物質の連続相を含む担体と混合してもよい。多くのかかる組合せが可能であることは当然理解される。
【００７３】
組成物が１又はそれ以上のアジュバントを含む場合、アジュバントは、抗原と一緒に、同じ処理段階で、又は別々に、異なる処理段階で組成物に組み込むことができる。例として、抗原及びアジュバントが両方ともにリポソームに封入されるように、抗原及びアジュバントは両方ともに脂質二重層形成リポソーム成分を水和するために使用する水溶液中に存在してもよい。あるいは、抗原をリポソームに封入し、アジュバントを疎水性物質の連続相を含む担体と混合してもよい。
【００７４】
安定剤、例えば糖、抗酸化剤、又は、生物活性を維持するか又は化学安定性を向上させて、抗原の有効期間を延長する防腐剤など、アジュバント、リポソーム又は連続する疎水性担体を、かかる組成物に添加してもよい。
【００７５】
一部の実施形態では、抗原／ｐｏｌｙＩ：Ｃ混合物が使用されてもよく、その場合該抗原及びｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドは同時に組成物に組み込まれる。「抗原／ｐｏｌｙＩ：Ｃ混合物」とは、少なくとも組成物へ組み込むよりも前に抗原及びｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドが同じ希釈剤中に存在する実施形態をさす。抗原／ｐｏｌｙＩ：Ｃ混合物中の抗原及びｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドは、必ずしも必要ではないが、例えば共有結合などによって化学的に結合されてもよい。
【００７６】
同様に、一部の実施形態では、抗原／アジュバント混合物が使用されてもよく、その場合該抗原及びアジュバントは同時に組成物に組み込まれる。「抗原／アジュバント混合物」とは、少なくとも組成物へ組み込むよりも前に抗原及びアジュバントが同じ希釈剤中に存在する実施形態をさす。抗原／アジュバント混合物中の抗原及びアジュバントは、必ずしも必要ではないが、例えば共有結合などによって化学的に結合されてもよい。
【００７７】
一部の実施形態では、疎水性物質の連続相を含む担体は、それ自体がアジュバント活性(adjuvanting-activity)を有してもよい。不完全フロイントアジュバントは、アジュバント作用(adjuvanting effect)をもつ疎水性担体の一例である。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「アジュバント」が使用される場合、これは疎水性物質の連続相を含む担体により提供されるいずれかのアジュバント活性に加えてアジュバントが存在することを示すことが意図される。
【００７８】
本明細書に記載される組成物は、経口、鼻腔、直腸又は非経口投与に適した形態に処方されてもよい。非経口投与には、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経上皮、肺内、くも膜下腔内、及び局所の投与様式が含まれる。デポー作用を実現するために好ましい経路としては、筋肉内、皮下及び皮内投与が挙げられる。本発明の組成物が癌腫瘍の治療のためのものである実施形態では、組成物は、腫瘍又は腫瘍隣接部への直接注射による送達のために処方されてもよい。一部の実施形態では、組成物は、均一に腫瘍に又は腫瘍全体に送達されて体内分布を増強し、故に治療上の有用性を高め得る。
【００７９】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ＤＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ、ＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ又はＲＮＡ及びＤＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃの混合物とともに処方されてもよい。これに関連して、ＲＮＡ及びＤＮＡ混合物は、ヌクレオチドに（各々のストランドがＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドを含むことができるように）；ストランドに（各々の二重鎖ポリヌクレオチドが１本のＤＮＡストランドと１本のＲＮＡストランドを有するように）；ポリヌクレオチドに（組成物がｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドを含み、その各々は完全にＲＮＡから構成されるか又は完全にＤＮＡから構成されるように）；又はそれらの組合せに関連する。
【００８０】
その他の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープと組み合わせて使用するために処方されてもよい。Ｔ細胞エピトープは、普遍的Ｔ細胞エピトープであってもよく、Ｂ細胞エピトープは、普遍的Ｂ細胞エピトープであってもよい。本明細書において、「普遍的エピトープ」は、広く認識される任意のエピトープ、例えば、多数の系の動物のＴ細胞又はＢ細胞であってもよい。一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、破傷風トキソイドペプチド、例えばＦ２１Ｅなどであってもよい。もう一つの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ、普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープであってもよい。本発明の状況での使用に適し得るその他の普遍的エピトープは当業者に公知であり、通常の技法を用いて容易に同定することができる。
【００８１】
関連実施形態では、本発明の組成物はｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド及び抗原を含み、ここで、ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド及び抗原の存在は重量又は分子数に対して、１：１，０００未満、１：９００未満、１：８００未満、１：７００未満、１：５００未満、１：４００未満、１：３００未満、１：２００未満、１：１００未満、１：５０未満、１：１０未満、１：５未満、１：２未満、約１：１、２：１より大きい、５：１より大きい、１０：１より大きい、５０：１より大きい、１００：１より大きい、２００：１より大きい、３００：１より大きい、４００：１より大きい、５００：１より大きい、６００：１より大きい、７００：１より大きい、８００：１より大きい、９００：１より大きい、１，０００：１より大きい比である。
【００８２】
最適な免疫応答を誘発するためのｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドの抗原に対する最適量は、多数の要素によって決まり、それには、限定されないが、組成物、疾患、被験体が含まれ、かつ、例えば、宿主における抗体力価及びその他の免疫原性応答の観察を含む、標準的な研究を用いて当業者により容易に確認することができる。
【００８３】
キット及び試薬
本発明は、所望により使用者にキットとして提供される。例えば、本発明のキットは１又はそれ以上の本発明の組成物を含む。キットは、１又はそれ以上の追加の試薬、包装材料、キットの成分を保持するための容器、及び、キット成分の好ましい使用方法を詳述する説明書一式又はユーザーマニュアルをさらに含んでもよい。
【００８４】
使用方法
本発明は、抗原を被験体に投与することが望まれるあらゆる場合において適用が見出される。被験体は、脊椎動物、例えば魚類、鳥類又は哺乳類、好ましくはヒトなどであってもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明の組成物は抗原に対する抗体応答を誘発及び／又は増強するために被験体に投与されてもよい。
【００８６】
本明細書において、免疫応答を「誘発する」とは、免疫応答を誘導する、及び／又は可能にすることである。本明細書において、免疫応答を「増強する」とは、従前の免疫応答状態、例えば、本発明の組成物の投与前と比較して、宿主の利益のために免疫応答を高め、改善し又は強化することである。
【００８７】
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子断片により実質的に又は部分的にコードされる１又はそれ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κ又はλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、それは次に免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、４つのポリペプチドを含むタンパク質からなる。各々の抗体構造単位は、２本の同一ポリペプチド鎖対で構成され、各々が１本の「軽」鎖及び１本の「重」鎖を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う可変領域を規定する。抗体構造単位（例えばＩｇＡ及びＩｇＭクラスのもの）も、例えばＪ鎖ポリペプチドと会合しているＩｇＭペンタマーのように、相互に及びさらなるポリペプチド鎖と集まってオリゴマー形態を構築することができる。
【００８８】
抗体は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）と呼ばれる白血球のサブセットの抗原特異的糖タンパク質産物である。抗原とＢ細胞の表面に発現した抗体との結合により、活性化され、有糸分裂を受け、抗原特異的抗体の合成及び分泌に特化した形質細胞に最終分化する、Ｂ細胞の刺激を含む抗体応答を誘導することができる。
【００８９】
本明細書において、用語「抗体応答」とは、被験体の身体への抗原の導入に応答して被験体の身体において抗原特異的抗体の量が増加することをさす。
【００９０】
抗体応答を評価する一方法は、特定の抗原に反応性の抗体の力価を測定することである。これは、多様な当分野で公知の方法、例えば動物から得た抗体含有物質の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いて行うことができる。例えば、特定の抗原に結合する血清抗体の力価は、抗原への曝露前及び曝露後の両方の被験体において測定され得る。抗原曝露後の抗原特異的抗体の力価の統計上有意な増加は、被験体が抗原に対する抗体応答を開始したことを示す。
【００９１】
抗原特異的抗体の存在を検出するために用いることのできるその他のアッセイとしては、限定されないが、免疫学的アッセイ（例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））、免疫沈降アッセイ、及びタンパク質ブロット（例えばウエスタンブロット）アッセイ；及び中和アッセイ（例えば、インビトロ又はインビボアッセイでのウイルス感染性の中和）が挙げられる。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、抗原に対する細胞性免疫応答を誘発及び／又は増強するために被験体に投与することができる。本明細書において、用語「細胞性免疫応答」とは、被験体の身体への抗原の導入に応答して、被験体の身体中の抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又はサイトカインの量が増加することをさす。
【００９３】
歴史的に、免疫系は２つに分類された：体液性免疫（免疫の保護機能が体液（細胞を含まない、抗体を含む体液又は血清）で見出されたため）及び細胞性免疫（免疫の保護機能が細胞に関連していたため）である。細胞性免疫は、「非自己」抗原に応答して、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び様々なサイトカインの放出を伴う免疫応答である。細胞性免疫は、適応免疫応答の重要な構成要素であり、細胞による抗原提示細胞、例えば樹状細胞、Ｂリンパ球及び、程度は低いがマクロファージとの相互作用を通じての抗原認識を受けて、身体は様々な機構、例えば：
１．外来抗原のエピトープをその表面に提示する体細胞、例えばウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、及び腫瘍抗原を提示する癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力のある抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する機構；
２．マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが細胞内病原体を破壊できるようにする機構；及び
３．細胞を刺激して、適応免疫応答及び自然免疫応答に関与するその他の細胞の機能に影響を及ぼす多様なサイトカインを分泌する機構
から保護される。
【００９４】
細胞性免疫はウイルス感染細胞を除去するのに最も効果的であるが、真菌、原生動物、癌、及び細胞内細菌に対する防御にも関与する。また、それは移植拒絶においても重要な役割を果たす。
【００９５】
ワクチン接種後の細胞性免疫応答の検出
細胞性免疫は、様々な細胞種の関与を伴い、異なる機構によって媒介されるので、いくつかの方法を用いてワクチン接種後の免疫性の誘導を実証することができる。これらは、ｉ）特異的抗原提示細胞；ｉｉ）特異的エフェクター細胞及びそれらの機能、及びｉｉｉ）可溶性メディエーター、例えばサイトカインなどの放出の検出：に広く分類することができる。
【００９６】
ｉ）抗原提示細胞：樹状細胞及びＢ細胞（及び程度は低いがマクロファージ）にはＴ細胞の活性化の増強を可能にする特別な免疫賦活性受容体が備わっており、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）と名付けられる。これらの免疫賦活性分子（共刺激分子とも呼ばれる）は、感染又はワクチン接種後、エフェクター細胞、例えばＣＤ４及びＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞などへの抗原提示のプロセスの間にこれらの細胞で上方制御される。かかる共刺激分子（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩなど）は、ＡＰＣを特異的に同定する抗体（例えば樹状細胞に対するＣＤ１１ｃなど）とともに、これらの分子に対して産生された蛍光色素共役抗体を用いるフローサイトメトリーを使用することにより検出することができる。
【００９７】
ｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞：（Ｔｃ、キラーＴ細胞、又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても公知）は、Ｔ細胞のサブグループであり、ウイルス（及びその他の病原体）に感染したか、又は腫瘍抗原を発現している細胞の死を誘導する。これらのＣＴＬは、細胞表面に特定の外来分子又は異常分子を有する他の細胞を直接攻撃する。かかる細胞傷害性の能力は、インビトロ細胞溶解アッセイ（クロム放出アッセイ）を用いて検出することができる。従って、適応的細胞性免疫の誘導は、かかる細胞傷害性Ｔ細胞の存在により実証することができ、この際、抗原を負荷した場合に標的細胞はワクチン接種又は感染後にインビボで産生される特異的ＣＴＬにより溶解される。
【００９８】
ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）がペプチドに結合したＭＨＣクラスＩ分子と強く相互作用する時に活性化する。この親和性は抗原／ＭＨＣ複合体の種類及び配向に依存し、ＣＴＬと感染細胞を一緒に結びつけておくものである。ひとたび活性化するとＣＴＬはクローン増殖と呼ばれるプロセスを受け、そこでＣＴＬは機能性を得、急速に分裂して、「武装した」エフェクター細胞の軍隊を産生する。活性化したＣＴＬは、次に、その特有のＭＨＣクラスＩ＋ペプチドを有する細胞を探して全身を移動する。これは、フローサイトメトリーアッセイにおいてペプチド−ＭＨＣクラスＩ四量体を用いることによりかかるＣＴＬをインビトロで同定するために使用することができる。
【００９９】
これらの感染もしくは機能障害性体細胞に曝露されると、エフェクターＣＴＬは、パーフォリン及びグラニュライシン（標的細胞の細胞膜に孔を形成し、イオン及び水を感染細胞に流入させ、その細胞をバーストさせるか又は溶解する細胞毒素）を放出する。ＣＴＬは、グランザイム（孔を経由して細胞に侵入してアポトーシス（細胞死）を誘導するセリンプロテアーゼ）を放出する。ＣＴＬからのこれらの分子の放出は、ワクチン接種後の細胞の免疫応答の誘導の成功の尺度として用いることができる。これは、ＣＴＬを定量的に測定することのできる酵素結合免疫吸着(immunosorbant)測定法（ＥＬＩＳＡ）又は酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）により行うことができる。ＣＴＬも重要なサイトカイン、例えばＩＦＮ−γを産生する能力があるので、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞の定量的測定は、ＥＬＩＳＰＯＴにより、かつ、これらの細胞での細胞内ＩＦＮ−γのフローサイトメトリー測定により達成することができる。
【０１００】
ＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞：ＣＤ４＋リンパ球すなわちヘルパーＴ細胞は免疫応答メディエーターであり、適応免疫応答の能力を確立及び最大化する際に重要な役割を果たす。これらの細胞は細胞傷害活性又は食作用活性を持たない；さらに、感染細胞を死滅させることも病原体を取り除くこともできないが、他の細胞にこれらの任務を行うよう命令することによって本質的に免疫応答を「管理する」。Ｔｈ１及びＴｈ２と名付けられた、２種類のエフェクターＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答をプロフェッショナルＡＰＣにより誘導することができ、各々は異なる種類の病原体を排除するよう設計されている。
【０１０１】
ヘルパーＴ細胞は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ナイーブヘルパーＴ細胞の活性化は、ヘルパーＴ細胞にサイトカインを放出させ、そのサイトカインはヘルパーＴ細胞を活性化させたＡＰＣを含む多くの細胞種の活性に影響を及ぼす。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞よりもはるかに穏やかな活性化刺激を必要とする。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性細胞を活性化させるのを「助ける(help)」特別の(extra)シグナルをもたらすことができる。Ｔｈ１及びＴｈ２と名付けられた、２種類のエフェクターＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答をプロフェッショナルＡＰＣにより誘導することができ、各々は異なる種類の病原体を排除するよう設計されている。これら２つのＴｈ細胞集団は、産生するエフェクタータンパク質（サイトカイン）のパターンの点で異なる。一般に、Ｔｈ１細胞は、マクロファージ及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化により細胞の免疫応答を補助する；一方、Ｔｈ２細胞は、形質細胞への変換のためのＢ細胞の刺激により、かつ抗体の形成により液性免疫応答を促進する。例えば、Ｔｈ１細胞により調節される応答は、マウスにおいてＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ（ヒトにおいてＩｇＧ１及びＩｇＧ３）を誘導し、抗原に対する細胞性免疫応答を好む可能性がある。抗原に対するＩｇＧ応答がＴｈ２型細胞により調節される場合、それは主にマウスにおけるＩｇＧ１（ヒトにおけるＩｇＧ２）の産生を増強するであろう。Ｔｈ１又はＴｈ２応答に関連するサイトカインの程度(measure)は、首尾よいワクチン接種の尺度(measure)となる。これは、Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αなど、又はＴｈ２サイトカイン、例えば数ある中でもＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ１０のために設計された特異的ＥＬＩＳＡにより達成することができる。
【０１０２】
ｉｉｉ）サイトカインの測定：所属リンパ節からの放出は免疫の成功の良い指標となる。抗原提示ならびにＡＰＣ及び免疫エフェクター細胞、例えばＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の成熟の結果として、数種類のサイトカインがリンパ節細胞により放出される。これらのＬＮＣをインビトロで抗原の存在下で培養することにより、特定の重要なサイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦなどであれば、放出を測定することにより抗原特異的免疫応答を検出することができる。これは、ＥＬＩＳＡにより培養上清及び標準品として組換えサイトカインを用いて行うことができる。
【０１０３】
免疫の成功は、当業者に公知の多数の方法で決定することができ、それには、限定されるものではないが、機能性抗体を検出するための赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）及び血清中和阻害アッセイ；ワクチン接種した被験体に関連する病原体を負荷してワクチン接種の有効性を決定する負荷試験(challenge studies)；及び、例えば活性化リンパ球又は記憶リンパ球の同定において特異的細胞表面マーカーを発現する細胞の集団を決定する、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）の使用が挙げられる。当業者はまた、免疫が本発明の組成物により抗体及び／又は細胞性免疫応答を誘発したかどうかを、その他の公知の方法を用いて決定してもよい。例えば、Current Protocols in Immunology Coligan et al., ed. (Wiley Interscience, 2007)を参照されたい。
【０１０４】
さらなる実施形態では、本発明の組成物を被験体に投与して、抗原に対する抗体及び細胞性免疫応答を誘発する、及び／又は増強することができる。
【０１０５】
本発明は、抗原の投与による予防及び／又は治療に感受性の高いあらゆる疾患の予防及び治療に広い適用が見出される。本発明の代表的な適用としては、癌の治療及び予防、遺伝子療法、アジュバント療法、感染症の治療及び予防、アレルギーの治療及び予防、自己免疫疾患の治療及び予防、ニューロン変性性疾患の治療、及びアテローム性動脈硬化症の治療、薬物依存の治療及び予防、疾患の治療及び予防のためのホルモン制御、避妊を目的とする生物学的プロセスの制御が挙げられる。
【０１０６】
疾患の予防又は治療には、臨床結果を含む、有益であるか又は望ましい結果を得ることが含まれる。有益であるか又は望ましい臨床結果には、限定されるものではないが、１又はそれ以上の症状又は状態の軽減又は寛解、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化、疾患の発症の予防、疾患の転移の予防、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患の発症の遅延又は緩徐化、病原体に対する防御免疫の付与、ならびに疾患状態の寛解又は緩和が含まれる。予防又は治療はまた、治療の不在下で予測される以上に患者の生存を延長させることも意味し得、また、疾患の進行を一時的に阻害することも意味し得るが、より好ましくは、疾患の発生を予防することを含む（例えば被験体において感染を予防することなどによって）。
【０１０７】
当業者は、所望の結果を達成するために、任意の特定の適用に適した治療計画、投与経路、投薬量などを決定することができる。考慮され得る要因としては、例えば：抗原の性質；予防又は治療される疾患状態；被験体の年齢、物理的状態、体重、性別及び食事；ならびにその他の臨床要因が挙げられる。例えば、"Vaccine Handbook", edited by the Researcher's Associates (Gaku-yuu-kai) of The National Institute of Health (1994); "Manual of Prophylactic Inoculation, 8th edition", edited by Mikio Kimura, Munehiro Hirayama, and Harumi Sakai, Kindai Shuppan (2000); "Minimum Requirements for Biological Products", edited by the Association of Biologicals Manufacturers of Japan (1993)を参照されたい。
【０１０８】
免疫応答
本発明の組成物を用いて、組成物中に処方された抗原に対する抗体応答及び／又は細胞性免疫応答を、それを必要とする被験体において誘導することができる。免疫応答は、任意の抗原に対して、及び／又はそれを発現する細胞に対して、それを必要とする被験体において誘発及び／又は増強させることができる。従って、本発明の実施形態では、組成物は、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン又は腫瘍細胞に由来する抗原を含んでもよく、かつ、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン又は腫瘍細胞によりそれぞれ引き起こされる疾患の治療及び／又は予防に使用するために処方されてもよい。
【０１０９】
本発明の組成物は、それを必要とする被験体において癌の治療及び／又は予防に使用するために適し得る。被験体は、癌を有するか、又は癌を発症するリスクがあり得る。本発明の組成物の使用又は投与により治療及び／又は予防することのできる癌としては、限定されないが、癌腫、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、芽細胞腫、骨髄腫、及び胚細胞腫瘍が挙げられる。一実施形態では、癌は、病原体、例えばウイルスにより引き起こされ得る。癌の発症に関係のあるウイルスは当業者に公知であり、それには、限定されるものではないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｊｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）、ヒト疱疹ウイルス８、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１が挙げられる。本発明の組成物は、癌の治療か又は予防のいずれかのために、例えば、癌の重篤度の低下又は癌再発の予防において使用することができる。本発明の組成物から利益を受ける可能性のある癌としては、１又はそれ以上の腫瘍特異的抗原を発現する任意の悪性細胞が挙げられる。
【０１１０】
本発明の組成物は、それを必要とする被験体においてウイルス感染の治療及び／又は予防に使用するために適し得る。被験体は、ウイルスに感染しているか、又はウイルス感染を発症するリスクがあり得る。本発明の組成物の使用又は投与により治療及び／又は予防することのできるウイルス感染としては、限定されないが、牛痘ウイルス、ワクシニアウイルス、偽牛痘ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、サイトメガロウイルス、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、パルボウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス、フラビウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス及び水痘が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の組成物は、それを必要とする被験体においてインフルエンザウイルス感染を治療及び／又は予防するために使用することができる。インフルエンザは、オルトミクソウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスであり、多くの場合、ウイルス粒子の外側にある２つの大型の糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて特徴付けられる。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定されている（Kawaoka et al., Virology (1990) 179:759-767; Webster et al., "Antigenic variation among type A influenza viruses," p. 127-168. In: P. Palese and D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York）。
【０１１２】
本発明の組成物は、それを必要とする被験体において神経変性疾患の治療及び／又は予防に使用するために適し得る（この際、神経変性疾患は抗原の発現に関連している）。被験体は、神経変性疾患を有するか、又は神経変性疾患を発症するリスクがあり得る。本発明の組成物の使用又は投与により治療及び／又は予防することのできる神経変性疾患としては、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。
【０１１３】
一実施形態では、本発明の組成物は、それを必要とする被験体においてアルツハイマー病を治療及び／又は予防するために使用することができる。アルツハイマー病は、アルツハイマー病の患者の脳内のβアミロイド斑及び／又はタウタンパク質の連合を特徴とする（例えば、Goedert and Spillantini, Science, 314: 777-781, 2006参照）。単純ヘルペスウイルス１型も、高感受性型のアポＥ遺伝子を有する人々において原因となる役割を果たすことが提唱されている（Itzhaki and Wozniak, J Alzheimers Dis 13: 393-405, 2008）。
【０１１４】
本発明の組成物を用いて投与又は治療される被験体は、対照組成物で治療した被験体と比較して、抗原に対する抗体及び／又は細胞性免疫応答の増加をもたらし得る。本明細書において、「対照組成物」とは、特許請求される組成物の少なくとも１つの成分も含まないあらゆる組成物をさし得る。従って、対照組成物は、１）抗原、２）リポソーム、３）ｐｏｌｙＩ：Ｃ又は４）疎水性担体の少なくとも１つも含まない。一実施形態では、対照組成物は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含まない。その他の実施形態では、対照組成物は、ｐｏｌｙＩ：Ｃの代わりにミョウバンを含み得る。
【０１１５】
本発明の組成物を用いて投与又は治療される被験体は、対照組成物で治療した被験体と比較して、少なくとも１．５０倍、少なくとも１．７５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、又は少なくとも５倍大きい抗体免疫応答を誘発することができる。一実施形態では、本発明の組成物で治療した被験体の血清の抗体力価（ｌｏｇ１０値に関して表される）は、対照組成物で治療した被験体のものよりも、少なくとも０．０５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１５、少なくとも０．２０、少なくとも０．２５又は少なくとも０．３０大きい。
【０１１６】
本発明の組成物を用いて投与又は治療される被験体は、対照組成物で治療した被験体と比較して、少なくとも１．５０倍、少なくとも１．７５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、又は少なくとも５倍大きい細胞性免疫応答を誘発することができる。
【０１１７】
本発明の組成物を用いて投与又は治療される被験体は、対照組成物で治療した被験体と比較して、少なくとも１．５０倍、少なくとも１．７５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、又は少なくとも５倍大きいメモリーＴ細胞集団を誘発することができる。
【０１１８】
本発明の組成物を用いて投与又は治療される被験体は、対照組成物で治療した被験体と比較して、被験体において腫瘍の発生を予防し、及び／又は腫瘍の発症を遅延させることができる。
【０１１９】
以下の限定されない例により、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１２０】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１２１】
Ｈ５Ｎ１組換え赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質は、約７２，０００ダルトンの分子量を有し、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面に存在する抗原性タンパク質である、赤血球凝集素糖タンパク質に相当する。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、３０μｌの用量あたり１μｇで使用した。
【０１２２】
ワクチンの有効性を、免疫動物の血清中の抗原特異的抗体レベルの検出を可能にする方法である酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。免疫マウスから定期的な間隔で（例えば４週間ごとに）採取した血清でＥＬＩＳＡを行うことは、所与ワクチン製剤に対する抗体応答をモニターするために有用である。手短に言えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを、抗原（ｒＨＡ、１μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コートし、３％ゼラチンで３０分間ブロックし、その後に、一般に１／２０００の希釈から始める血清の段階希釈とともに４℃にて一晩インキュベートする。第二の試薬（アルカリホスファターゼと共役したタンパク質Ｇ、ＥＭＤ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を、次に各ウェルに１／５００希釈で１時間３７℃にて添加する。１ｍｇ／ｍｌ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する溶液とともに６０分インキュベートした後、各ウェルの４０５ｎｍ吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（ＡＳＹＳ Ｈｉｔｅｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて測定する。エンドポイント力価は、Ｆｒｅｙ Ａ．らに記載されるように算出する（Journal of Immunological Methods, 1998, 221 :35-41）。算出した力価は、ナイーブ非免疫対照マウスからの血清試料に対して免疫マウスからの血清試料に統計上有意な吸光度の増加が観察される最大希釈を表す。力価は、エンドポイント希釈のｌｏｇ１０値として表される。
【０１２３】
本明細書に記載されるワクチンを処方するため、Ｓ１００レシチンとコレステロールの１０：１ ｗ：ｗの均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｒＨＡ溶液の存在下リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で水和して封入されたｒＨＡを含むリポソームを形成した。手短に述べると、３３μｇのｒＨＡを最初に３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約４５０μｌのリポソーム懸濁液を形成した。リポソーム調製物は、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）に材料を通過させることにより押出した。ｒＨＡを含有するリポソーム懸濁液４５０μｌごとに、２ｍｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、フロイント不完全アジュバントと等価の等容積の鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１）を添加して、乳濁液の水相の中に含まれるリポソーム懸濁液及び連続する疎水相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ミョウバンアジュバント、及び鉱油担体を含有する上記乳濁液３０μｌからなるものであった。このワクチン製剤を、リポソーム／ミョウバン／疎水性担体と称する。
【０１２４】
本発明に相当するワクチンを処方するため、上記と同じ手順を、以下を除いて使用した：ｒＨＡを封入しているリポソームの形成に続いて、かつ、リポソーム懸濁液を２００ｎｍポリカーボネート膜を通じて押出した後、１３３μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を、４５０μｌのリポソームごとに添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加して、乳濁液の水相中に含まれるリポソーム懸濁液及び連続相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する上記乳濁液３０μｌからなるものであった。この特定の製剤を、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１２５】
上記の２種類の乳濁液製剤の有効性を、３０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中１μｇのｒＨＡ及び６０μｇのミョウバンアジュバントからなる対照ワクチンの有効性と比較した。２つの群のマウス（１群あたり９又は１０匹のマウス）に、リポソームワクチン製剤を１回（追加免疫なし）、次の通り筋肉内注射した：群１のマウスに、上記のように３０μｌのリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１μｇのｒＨＡ抗原を含むワクチンＢを接種した。各々のワクチン用量は、４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを効果的に含んでいた。群２のマウスに、上記のように３０μｌのリポソーム／ミョウバン／疎水性担体中に処方された１μｇのｒＨＡを含むワクチンＡを接種した。各々のワクチン用量は、６０μｇのミョウバンを効果的に含んでいた。対照群のマウス（群３、ｎ＝１０）に、リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁した１μｇのｒＨＡ及び６０μｇのミョウバンからなる対照ミョウバンワクチンを筋肉内注射した。免疫後１８日及び２８日の全てのマウスから血清試料を採取した。これらの血清中の抗体力価を上記のようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１２６】
群３のマウスは、ミョウバンをアジュバントとした対照ワクチンの投与後に予期したとおりの検出可能な抗原特異的抗体応答を生じた。驚くことではないが、リポソーム／ミョウバン／疎水性担体製剤を接種した群２のマウスは、相当に高い抗体応答を生じた。これらの結果は予期されたものであったが、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤（群１マウス）においてミョウバンアジュバントの代わりにｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを使用することにより、いくつかの予期せぬ結果が生じた；抗体力価がリポソーム／ミョウバン／疎水性担体製剤（群２）によって生じた抗体力価よりも有意に高かった。
【０１２７】
上記の水性対照製剤を接種した群３マウスは、ワクチン接種後１８及び２８日に最大１／３２，０００及び１／６４，０００のエンドポイント力価を生じた（ｌｏｇ１０値はそれぞれ４．５１及び４．８１）。群２におけるワクチン接種後１８及び２８日のエンドポイント力価は、最大１／２５６，０００（ｌｏｇ１０値は５．４１）であった。ワクチン接種後１８及び２８日（４週）にそのような抗体応答が存在することは、本物の免疫応答がワクチン接種の結果として生じたことを裏付ける。本発明に相当する製剤を注射した群１マウスは、ワクチン接種後１８日で１／１，０２４，０００（ｌｏｇ１０値は６．０１）及び免疫後４週で１／８，１９２，０００（ｌｏｇ１０値は６．９１）に達するエンドポイント力価で増強された免疫応答を生じることができた。これらの結果は、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有するリポソーム／疎水性担体製剤が、リポソーム／ミョウバン／疎水性担体及び水性／ミョウバン対照の接種と比較して有意に増強されたインビボ免疫応答を生じる能力があることを示す。
【実施例２】
【０１２８】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１２９】
実施例１と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、３０μｌの用量あたり１μｇで使用した。
【０１３０】
本発明に相当するワクチンを処方するため、実施例１に記載されるものと同じ手順を用いた。手短に言えば、３３μｇのｒＨＡを３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約４５０μｌのリポソーム懸濁液を形成した。このリポソーム調製物を、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）にこの材料を通すことにより押出した。ｒＨＡを含有するリポソーム懸濁液４５０μｌごとに、１３３μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加して、乳濁液の水相の中に含まれたリポソーム懸濁液及び連続する疎水相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する上記乳濁液３０μｌからなるものであった。この特定の製剤を、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１３１】
上記のリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンの有効性を、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有する水性対照ワクチンの有効性と比較した。２つの群のマウス（１群あたり９又は１０匹のマウス）に、１用量あたり３０μｌを１回筋肉内注射した。群１のマウスに、上記のように３０μｌのリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含むワクチンＢを接種した。群２のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方された１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含む３０μｌの対照ｐｏｌｙＩ：Ｃワクチンを注射した。免疫後１８日及び２８日の全てのマウスから血清試料を採取した。これらの血清試料中のｒＨＡ抗体力価を実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１３２】
群２のマウスは、ｐｏｌｙＩ：Ｃをアジュバントとした対照ワクチンの投与後に検出可能な抗原特異的抗体応答を生じた。リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤を接種した群１のマウスは、群２のものと比較して有意に増強されたエンドポイント力価を生じた。群２のマウスは、ワクチン接種後１８日で最大１／１２８，０００（ｌｏｇ１０値は５．１１）及びワクチン接種後２８日（４週）で最大１／１，０２４，０００（ｌｏｇ１０は６．０１に等しい）の力価を生じた。実施例１に記したように、そのような抗体応答が存在することは、本物の免疫応答がワクチン接種の結果として生じたことを裏付ける。本発明に相当するワクチンを接種した群１マウスは、ワクチン接種後１８日で１／１，０２４，０００（ｌｏｇ１０値は６．０１）及び免疫後４週で１／８，１９２，０００（ｌｏｇ１０値は６．９１）に達するエンドポイント力価を生じることができた。これらの結果は、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有するリポソーム／疎水性担体製剤が、水性／ｐｏｌｙＩ：Ｃ対照の接種と比較して有意に増強されたインビボ免疫応答を生じる能力があることを示す。
【実施例３】
【０１３３】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１３４】
実施例１及び２と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、５０μｌの用量あたり１μｇで使用した。
【０１３５】
本発明に相当するワクチンを処方するため、Ｓ１００レシチンとコレステロールの１０：１ ｗ：ｗの均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｒＨＡ及びｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）溶液の存在下リン酸緩衝液中で水和して封入されたｒＨＡ及びアジュバントを含むリポソームを形成した。手短に述べると、２０μｇのｒＨＡ及び２００μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを最初に２５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物に添加して、ｒＨＡ抗原及びｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを封入する約４００μｌのリポソーム懸濁液を形成した。このリポソーム調製物を５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて半分に希釈し、次に、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）にこの材料を通すことにより押出した。次に、サイズの揃ったリポソームを、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｉｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて凍結乾燥した。ｒＨＡ及びｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する、８００μｌの最初のリポソーム懸濁液ごとに、フロイント不完全アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１として公知）に等しい１ｍｌの鉱油担体を用いて凍結乾燥リポソームを再構成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体が結合した５０μｌの上記製剤からなるものであった。このワクチン製剤を、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１３６】
上記の凍結乾燥リポソーム製剤の有効性を、５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、１μｇのｒＨＡ及び１００μｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からなる対照ワクチンの有効性と比較した。群１のマウス（Ｎ＝８）に、上記のように５０μｌの凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１μｇのｒＨＡ抗原及び１０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含むワクチンＣを１回（追加免疫なし）注射した。群２のマウス（Ｎ＝９）に、５０ミリモル リン酸緩衝液に懸濁した１μｇのｒＨＡ及び１００μｇのミョウバンアジュバントを含む対照ミョウバンワクチンを２回（０日及び２１日）接種した。免疫後３、４、及び８週のすべてのマウスから血清試料を採取した。これらの血清中のｒＨＡ抗体力価を実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１３７】
群２のマウスは、ミョウバンをアジュバントとした対照ワクチンの投与後に検出可能な抗原特異的抗体応答を生じた。単回用量の凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤を接種した群１のマウスは、群２の動物にワクチン接種を２回（一次免疫に加えて追加免疫）したにもかかわらず、群２のものと比較して有意に増強されたエンドポイント力価を生じた。群２のマウスは、ワクチン接種後３週（追加免疫前）に最大１／１２８，０００（ｌｏｇ１０値は５．１１）、ならびに４及び８週に（追加免疫後）それぞれ最大１／１，０２４，０００（ｌｏｇ１０は６．０１に等しい）及び１／５１２，０００（ｌｏｇ１０は５．７１に等しい）の力価を生じた。実施例１に記したように、そのような抗体応答が存在することは、本物の免疫応答がワクチン接種の結果として生じたことを裏付ける。本発明に相当するワクチンを接種した群１マウスは、ワクチン接種後３週に１／２，０４８，０００（ｌｏｇ１０値は６．３１）ならびに免疫後４及び８週に１／８，１９２，０００（ｌｏｇ１０値は６．９１）に達するエンドポイント力価を生じることができた。これらの結果は、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有する単一用量の凍結乾燥リポソーム／疎水性担体製剤が、追加免疫した水性ミョウバン対照の接種と比較して有意に増強されたインビボ免疫応答を生じることができることを示す。この実施例で生じた免疫応答は、実施例１及び２に示した本発明のワクチンにより生じた免疫応答と同等である。
【実施例４】
【０１３８】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１３９】
前の実施例と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）（以降ｒＨＡと称する）を、ワクチン製剤の有効性を試験するためのモデル抗原として用いた。ｒＨＡは、３０μｌの用量あたり１μｇで使用した。
【０１４０】
本明細書に記載されるワクチンを、実施例１に記載されるように処方した。手短に言えば、３３μｇのｒＨＡを３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、次いで１３２ｍｇの均質な（１０：１、ｗ：ｗ）Ｓ１００レシチン／コレステロール混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約４５０μｌのリポソーム懸濁液を形成した。リポソーム調製物は、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）に材料を通過させることにより押出した。ｒＨＡを含有するリポソーム懸濁液４５０μｌごとに、２ｍｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１）を添加して、乳濁液の水相の中に含まれたリポソーム懸濁液及び連続する疎水相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ミョウバンアジュバント、及び鉱油担体を含有する３０μｌの上記乳濁液からなるものであった。このワクチン製剤を、リポソーム／ミョウバン／疎水性担体と称する。
【０１４１】
本発明に相当するワクチンを処方するため、上記と同じ手順を、以下を除いて使用した：ｒＨＡを封入しているリポソームの形成に続いて、かつ、リポソーム懸濁液を２００ｎｍポリカーボネート膜を通じて押出した後、１３３μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を、４５０μｌのリポソームごとに添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加して、乳濁液の水相中に含まれるリポソーム懸濁液及び連続相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する上記乳濁液３０μｌからなるものであった。この特定の製剤を、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１４２】
上記の２種類の乳濁液製剤の有効性を、実施例１に記載されるものと比較した。２つの群のマウス（１群あたり９又は１０匹のマウス）に、リポソームワクチン製剤を１回（追加免疫なし）、次の通り筋肉内注射した：群１のマウスに、３０μｌのリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１μｇのｒＨＡ抗原及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含むワクチンＢ（本発明）を接種した。群２のマウスに、３０μｌのリポソーム／ミョウバン／疎水性担体中に処方された１μｇのｒＨＡ及び６０μｇのミョウバンアジュバントを接種した。群２のワクチンは、一般的なアジュバントミョウバンを含有する対照製剤（ワクチンＡ）であった。免疫後１８及び２８日に、かつその後４週ごとに合計１６週間、すべてのマウスから血清試料を採取した。これらの血清中の抗体力価を実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１４３】
群２のエンドポイント力価は、８及び１２週で最大１／２５６，０００、ならびに免疫後１６週で１／５１２，０００であった（ｌｏｇ１０値はそれぞれ５．４１及び５．７１）。本発明に相当する製剤を注射した群１マウスは、ワクチン接種後８、１２及び１６週に１／４，０９６，０００（ｌｏｇ１０値は６．６１）に達するエンドポイント力価で増強された免疫応答を生じることができた。これらの結果は、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有するリポソーム／疎水性担体製剤が、ｐｏｌｙＩ：Ｃを欠く対照ワクチンを用いて達成するよりも平均して１０倍大きい、有意に増強されたインビボ免疫応答を生じる能力があることを裏付ける（ワクチン接種後４週〜１６週の間のすべての時点でＰ値＜０．０１）。生じた免疫応答の劇的な改善は、特に抗原／リポソーム／アジュバント／鉱油担体組成物中のミョウバンの代わりにｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを使用した結果であった。本発明のワクチンによって生じた、この強い免疫応答は、最低限の１６週間ミョウバン含有ワクチンと比べて有意に優れたレベルで持続したので、強いものであった。
【実施例５】
【０１４４】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１４５】
前の実施例と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、３０μｌの用量あたり１μｇで使用した。
【０１４６】
本発明に相当するワクチンを処方するため、実施例２に記載されるものと同じ手順を用いた。手短に言えば、３３μｇのｒＨＡを３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約４５０μｌのリポソーム懸濁液を形成した。このリポソーム調製物を、２００ｎｍポリカーボネート膜にこの材料を通過させることにより押出した。ｒＨＡを含有するリポソーム懸濁液４５０μｌごとに、１３３μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加して、乳濁液の水相の中に含まれたリポソーム懸濁液及び連続相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する上記乳濁液３０μｌからなるものであった。この特定の製剤を、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１４７】
上記のリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体ワクチンの有効性を、ｒＨＡ抗原及びＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有する水性対照ワクチンの有効性と比較した。２つの群のマウス（１群あたり９又は１０匹のマウス）に、１用量あたり３０μｌを筋肉内に１回注射した。群１のマウスに、上記のようにリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体として処方された、１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含むワクチンＢを接種した。群２のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方された１μｇのｒＨＡ及び４μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含む対照ｐｏｌｙＩ：Ｃワクチンを注射した。免疫後１８及び２８日に、かつその後４週ごとに合計１６週間、すべてのマウスから血清試料を採取した。これらの血清試料中のｒＨＡ抗体力価を実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１４８】
群２のマウスは、ｐｏｌｙＩ：Ｃをアジュバントとした対照ワクチンの投与後に検出可能な抗原特異的抗体応答を生じた。リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤を接種した群１のマウスは、群２のものと比較して有意に増強されたエンドポイント力価を生じた。群２のマウスは、ワクチン接種後８週に最大１／５１２，０００（ｌｏｇ１０値は５．７１）、ワクチン接種後１２及び１６週に最大１／２，０４８，０００（ｌｏｇ１０は６．３１に等しい）の力価を生じた。既に記載したように、そのような抗体応答が存在することは、本物の免疫応答がワクチン接種の結果として生じたことを裏付ける。本発明に相当するワクチンを接種した群１マウスは、免疫後８、１２及び１６週で１／４，０９６，０００（ｌｏｇ１０値は６．６１）に達するエンドポイント力価を生じることができた。これらの結果は、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有するリポソーム／疎水性担体製剤が、水性／ｐｏｌｙＩ：Ｃ対照の接種と比較して、長く続く実質的に高いインビボ免疫応答を生じる能力があることを裏付ける（ワクチン接種後４週及び１６週でＰ値＜０．０２）。早い時点で（ワクチン接種後４週）平均して７倍高く、遅い時点で（ワクチン接種後１６週）平均して９倍高い抗体力価が、ワクチン中リポソーム及び疎水性担体の存在下で実現された。このことは、リポソーム及び疎水性担体成分が、観察される強い免疫応答を生じるために重要であることを示唆する。
【実施例６】
【０１４９】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１５０】
実施例１から５と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、５０μｌの用量あたり１．５μｇで使用した。
【０１５１】
本発明に相当するワクチンを処方するため、Ｓ１００レシチンとコレステロールの１０：１ ｗ：ｗの均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｒＨＡの存在下リン酸緩衝液中で水和して封入されたｒＨＡを含むリポソームを形成し、それに続いてｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。手短に述べると、３０μｇのｒＨＡを７５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約９００μｌのリポソーム懸濁液を形成した。このリポソーム調製物を、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した半自動式押出機（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）にこの材料を流速１００ｍｌ／分で通過させることにより押出した。５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中２５０μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを、サイズの揃ったリポソームに添加して調製物を１ｍｌに希釈した。次に、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｉｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いてリポソームを凍結乾燥した。ｒＨＡ及びｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する、１ｍｌの最初のリポソーム懸濁液ごとに、８００μｌの鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて凍結乾燥リポソームを再構成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する５０μｌの上記製剤からなるものであった。このワクチン製剤を、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１５２】
上記の凍結乾燥リポソーム製剤の有効性を、５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からなる対照ワクチンの有効性と比較した。群１のマウス（Ｎ＝１０）に、上記のように５０μｌの凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１．５μｇのｒＨＡ抗原及び１２．５μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含むワクチンＤを、筋肉内に１回（追加免疫なし）注射した。群２のマウス（３週及び４週にはＮ＝１０、１匹の動物の予定外のワクチンに関連しない終結により、６週及び９週にはＮ＝９に減少）に、５０ミリモル リン酸緩衝液に懸濁した１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのミョウバンアジュバントを含む対照ミョウバンワクチンを２回接種した（０日及び２８日）。免疫後３、４、６及び９週にすべてのマウスから血清試料を採取した。これらの血清中のｒＨＡ抗体力価を実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１５３】
群２のマウスは、２用量（一次免疫及び追加免疫）のミョウバンをアジュバントとした対照ワクチンの投与後のみ抗原特異的抗体応答を生じた。単回用量の凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤を接種した群１のマウスは、群２の動物が２回ワクチン接種されているにもかかわらず、試験したすべての時点で群２のものと比較して有意に増強されたエンドポイント力価を生じた。群２のマウスは、一次ワクチン接種３週後にバックグラウンド力価を記録し、一匹の個体は４週に１／８，０００（ｌｏｇ１０値は３．３９に等しい）の最大力価を生じた。追加免疫後、群２のマウスは免疫後６及び９週で最大１／６４，０００（ｌｏｇ１０値は４．８１）の力価を生じた。本発明に相当するワクチンを接種した群１マウスは、ワクチン接種後３及び４週に最大１／１２８，０００（ｌｏｇ１０は５．１１）ならびに免疫後６及び９週に１／５１２，０００（ｌｏｇ１０値は５．７１）のエンドポイント力価を生じることができた。これらの結果は、実施例３で使用したマウス種とは異なるマウス種を用いて、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有する単回用量の凍結乾燥リポソーム／疎水性担体製剤が、追加免疫さえした水性／ミョウバン対照の接種と比較して有意に増強されたインビボ液性免疫応答を生じる能力があることを裏付ける。抗体レベルは、ワクチン接種後４週の単回用量の対照ワクチンよりも２４倍高く（Ｐ値＜０．００１）、ワクチン接種後９週の遅い時点での２用量の対照ワクチンよりも９倍高かった（Ｐ値＜０．０１）。さらに、実施例３及び６の結果から、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントが、リポソーム押出の前か又は後のいずれかに凍結乾燥リポソーム／疎水性担体製剤に組み込まれてもよいことが示される。
【実施例７】
【０１５４】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１５５】
実施例１から６と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、５０μｌの用量あたり１．５μｇで使用した。
【０１５６】
この実施例では、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体を筋肉内に１回（追加免疫なし）又は皮下に１回（追加免疫なし）投与して抗原特異的細胞傷害性リンパ球応答の発生を評価した。
【０１５７】
本発明に相当するワクチンを処方するため、実施例６に記載されるものと同じ手順を用いた。手短に言えば、Ｓ１００レシチン及びコレステロールの１０：１（ｗ：ｗ）の均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をｒＨＡの存在下リン酸緩衝液中で水和し、それに続いてＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加することによりリポソームを処方した。このリポソーム懸濁液を凍結乾燥し、鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１（商標）、ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）に再懸濁した。各々のワクチン用量（ワクチンＤ）は、リポソーム（６．６ｍｇのＳ１００／コレステロール脂質）、ｒＨＡ抗原（１．５μｇ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（１２．５μｇ）、及び鉱油担体を含有する５０μｌの上記製剤からなるものであった。このワクチン製剤を、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。群１のマウス（ｎ＝４）に、この製剤を実施例６と同様に筋肉内投与した。群２のマウス（ｎ＝４）に、このワクチンを皮下投与した。
【０１５８】
群３のマウス（ｎ＝４）に、５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からなる対照ミョウバンワクチンを接種した。マウスに１回（追加免疫なし）筋肉内注射した。群４のマウス（ｎ＝２）はナイーブで、免疫処置を受けなかった。
【０１５９】
ワクチン接種後２２日に、二酸化炭素に誘導される窒息により動物を安楽死させた。脾臓を回収し、標準的な手順を用いて個々の単細胞懸濁液を調製した。赤血球を、ＡＣＫ溶解バッファー（蒸留Ｈ２Ｏ中０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）を用いて溶解させた。抗原特異的Ｔ細胞を増大させるため、２０単位／ｍｌの組換え型ヒトＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０μｇ／ｍｌ ｒＨＡを添加した、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、０．１％ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、及び１０％ ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）完全培地中、５％二酸化炭素下で３７℃にて４日間、１×１０＾６細胞／ｍｌで脾細胞を培養した。三色フローサイトメトリー分析を脾細胞について行って、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。室温にて１０分のＦＣブロック（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の処理によって細胞をブロックした。次に、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ（Ｂｒａｄｅｎｔｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ）から得たフィコエリトリン（ＰＥ）標識ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ（Ｉ９Ｌ）／Ｈ２−Ｋｄペンタマーで４℃にて２０分間細胞を染色した。Ｉ９Ｌは、ｒＨＡのＨ２−Ｋｄ免疫優勢エピトープ（５１８−５２８）であり、このペンタマー試薬がマウスによるこのエピトープのＭＨＣＩ提示を検出する。次に、細胞を、抗ＣＤ１９−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ＣＤ８β−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃にて３０分間、光から保護して染色し、洗浄し、０．１％ パラホルムアルデヒドによって５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に固定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で５×１０＾５細胞を取得し、ＷｉｎＬｉｓｔ ６．０ ソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｃ，Ｔｏｐｓｈａｍ，ＭＥ，ＵＳＡ）を用いて解析した。結果を前方及び側方散乱に基づいてゲートし（gated）、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞をペンタマー陽性、ＣＤ８β陽性及びＣＤ１９陰性として規定した。両側スチューデントＴ検定を用いて統計解析を行った。
【０１６０】
対照ミョウバンに基づく製剤を接種したマウスは、小さい抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞集団を生じた（０．０４５％）。本発明の凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤を接種した（筋肉内又は皮下経路により送達された）マウスは、有意に大きい抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞集団を生じた（それぞれ０．２３％及び０．１７％；両方についてミョウバン対照と比較して、ｐ＝＜０．０２５）。これらの結果は、本発明において処方されたｒＨＡが、筋肉内又は皮下に送達され得、ミョウバンを用いる従来のワクチン製剤と比較して有意に高い、細胞性免疫応答の代表である抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を生じることを実証する。
【実施例８】
【０１６１】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ−１マウス、及び体重２〜３ｋｇの雌ニュージーランドシロウサギを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、濾過空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１６２】
実施例１から７と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、マウスにおいて５０μｌの用量あたり０．５μｇで使用し、ウサギにおいて２００μｌの用量あたり２μｇで使用した。
【０１６３】
ワクチンの有効性を、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）により実施された赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）により評価した。手短に言えば、血清試料を受容体破壊酵素で前処理し、ニワトリ赤血球を事前に吸収させて非特異的赤血球凝集抑制反応を回避した。次に、段階希釈の血清を０．７％ ウマ赤血球、０．５％ ウシ血清アルブミン及び８ＨＡ単位のＡ／ベトナム／１２０３／２００４［Ｈ５Ｎ１］インフルエンザウイルスとともにインキュベートした。算出した力価は、血清試料が赤血球の赤血球凝集を完全に阻害することのできる最大希釈を表す。
【０１６４】
本発明に相当する第１のワクチンを処方するため、Ｓ１００レシチン及びコレステロールの１０：１（ｗ：ｗ）の均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｒＨＡの存在下、リン酸緩衝液中で水和して封入されたｒＨＡを含むリポソームを形成し、それに続いてＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。手短に言えば、１０μｇのｒＨＡを最初に６５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約８００μｌのリポソーム懸濁液を形成した。次に、このリポソーム調製物を、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）にこの材料を通すことにより押出した。５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２４０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントをサイズの揃ったリポソームに添加した。次に、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｉｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いてリポソームを凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を、鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１）で元の１ｍｌ容積の可溶化されたリポソームに再構成した。マウスに送達される各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体が結合した５０μｌの上記製剤からなるものであった。これらのワクチン製剤を、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１６５】
これも本発明に相当する第２のワクチンを処方するため、上記と同じ手順を、以下を除いて使用した：ｒＨＡ抗原を封入するリポソームの形成に続いて、２枚の４００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機にこの材料を通過させることによりリポソーム調製物を押出した。５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中２５０μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを、サイズの揃ったリポソームに添加して調製物を１ｍｌに希釈した。次に、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機を用いてリポソームを凍結乾燥し、凍結乾燥した材料を鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて元の１ｍｌに再構成した。ウサギに送達された各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する２００μｌの上記製剤からなるものであった。このワクチン製剤も凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１６６】
上記の凍結乾燥リポソーム製剤の有効性を、２つの異なる動物モデルを用いて試験した。動物に、同程度の製剤を接種した；注入量は動物のサイズに適するように調節した。１つの群のマウス（Ｎ＝５）に、上記のように５０μｌの凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された、０．５μｇのｒＨＡ抗原及び１２μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含むワクチンＦを筋肉内注射した。１つの群のウサギ（Ｎ＝５）に、上記のように２００μｌの凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された２μｇのｒＨＡ抗原及び５０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含むワクチンＥを皮下注射した。全ての動物を注射前に、次いで免疫後４週か又は５週のいずれかに再び出血させた。これらの血清中のＨＡＩ力価を、上記のＨ５Ｎ１赤血球凝集抑制アッセイで調べた。
【０１６７】
凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤の接種後４週又は５週までに、マウス及びウサギは両方ともインフルエンザＨ５Ｎ１に対する保護を示すＨＡＩ力価を生じた。４０のＨＡＩ血清力価（ｌｏｇ１０は１．６０に等しい）は、一般に個体がインフルエンザの特定の株を標的とする保護レベルの抗体を有することを意味すると容認される。ワクチン接種後５週に、マウスは１２８（ｌｏｇ１０は２．１１）から５１２（ｌｏｇ１０は２．７１）の範囲の力価を生じた。免疫後４週に、ウサギは６４（ｌｏｇ１０は１．８１に等しい）から１０２４（ｌｏｇ１０は３．０１）までの範囲のＨＡＩ力価を生じた。上記の投薬量で使用されるｒＨＡの単一のワクチン接種は、全てのワクチン接種した被験体において実現された高いＨＡＩ力価を誘導することができないことが一般に容認される。２つの異なる動物モデルで生じた、この大きさの力価は、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤が、ワクチン接種後４週程度の全てのワクチン接種した被験体において、保護範囲で強い抗体レベルを生じるのに（ＨＡＩ＞２０又はｌｏｇ値＞１．３）特に効果的であることを示す。
【実施例９】
【０１６８】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１６９】
アミロイドβタンパク質断片（１−４３）を、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入し、ワクチン製剤の有効性を試験するためのモデル抗原として用いた。このペプチド（以降、βアミロイドと称する）は、分子量が約４，６００ダルトンであり、アルツハイマー病患者の脳におけるプラーク形成に関連している。βアミロイドは１００μｌの用量あたり１０μｇで使用した。
【０１７０】
２１アミノ酸ペプチドＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（以降、Ｆ２１Ｅを称する）を、ＮｅｏＭＰＳ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。この破傷風トキソイドペプチド（アミノ酸９４７−９６７）は、Ｔヘルパーエピトープであると同定されている。Ｆ２１Ｅを、ワクチン製剤の有効性を試験するためのモデルＴヘルパーエピトープとして用いた；それは１００μｌの用量あたり２０μｇで使用した。
【０１７１】
実施例１から６と同様に、ワクチンの有効性を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。実施例１に記載されるものと同じ手順をβアミロイド特異的抗体の検出を可能にするための変更とともに用いた。手短に言えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを抗原（βアミロイド、１μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コートし、３％ゼラチンで３０分間ブロックし、次いで一般に１／１０００の希釈から始める血清の段階希釈とともに４℃にて一晩インキュベートした。二次試薬（アルカリホスファターゼと共役したタンパク質Ｇ、ＥＭＤ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を、次に各ウェルに１／５００希釈で３７℃にて１時間添加する。１ｍｇ／ｍｌ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する溶液での６０分のインキュベーションの後、各ウェルの４０５ｎｍ吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（ＡＳＹＳ Ｈｉｔｅｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて測定する。エンドポイント力価は、Ｆｒｅｙ Ａ．ら（Journal of Immunological Methods, 1998, 221 :35-41）に記載されるとおり算出する。算出した力価は、ナイーブ非免疫対照マウスからの血清試料に対して免疫マウスからの血清試料に統計上有意な吸光度の増加が観察される最大希釈を表す。力価は、エンドポイント希釈のｌｏｇ１０値として表される。
【０１７２】
本明細書に記載されるワクチンを処方するため、Ｓ１００レシチンとコレステロールの１０：１ ｗ：ｗの均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をβアミロイド及びＦ２１Ｅ溶液の存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で水和して、封入された抗原及びＴヘルパーを含むリポソームを形成した。手短に述べると、１００μｇのβアミロイド及び２００μｇのＦ２１Ｅを最初に３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物に添加して、βアミロイド抗原及びＦ２１Ｅ Ｔヘルパーを封入する約４５０μｌのリポソーム懸濁液を形成した。リポソーム調製物は、４００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）に材料を通過させることにより押出した。βアミロイド及びＦ２１Ｅを含有する４５０μｌのリポソーム懸濁液ごとに、２ｍｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／Ｔヘルパー／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１として公知）を添加して、乳濁液の水相の中に含まれたリポソーム懸濁液及び連続する疎水相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、βアミロイド抗原、Ｆ２１Ｅ Ｔヘルパー、ミョウバンアジュバント、及び鉱油担体を含有する１００μｌの上記乳濁液からなるものであった。このワクチン製剤を、リポソーム／ミョウバン／疎水性担体と称する。
【０１７３】
本発明に相当するワクチンを処方するため、上記と同じ手順を、以下を除いて使用した：βアミロイド及びＦ２１Ｅを封入するリポソームの形成に続いて、リポソーム懸濁液を４００ｎｍポリカーボネート膜を通じて押出した後、１００μｇのＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を、４５０μｌのリポソームごとに添加した。５００μｌのリポソーム／抗原／Ｔヘルパー／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加して、乳濁液の水相中に含まれるリポソーム懸濁液及び連続相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、βアミロイド抗原、Ｆ２１Ｅ Ｔヘルパー、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する１００μｌの上記乳濁液からなるものであった。この特定の製剤を、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１７４】
上記の２種類の乳濁液製剤の有効性を比較した。２つの群のマウス（１群あたり９匹のマウス）に、リポソームワクチン製剤を次の通り腹腔内に注射した：群２のマウスに、上記のように１００μｌのリポソーム／ミョウバン／疎水性担体中に処方された１０μｇのβアミロイド及び２０μｇのＦ２１Ｅを含むワクチンＧを接種した。各々のワクチン用量は、２００μｇのミョウバンを効果的に含んでいた。群１のマウスに、上記のように１００μｌのリポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１０μｇのβアミロイド抗原及び２０μｇのＦ２１Ｅを含むワクチンＨを接種した。各々のワクチン用量は、１０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを効果的に含んでいた。免疫後４、８及び１２週にすべてのマウスから血清試料を採取した。これらの血清中の抗体力価を上記のようにＥＬＩＳＡで調べた。
【０１７５】
単回用量のリポソーム／ミョウバン／疎水性担体製剤を接種した群２のマウスは、予期したとおり検出可能な抗原特異的抗体応答を生じた。ワクチン接種後４及び８週のエンドポイント力価は、最大１／３２，０００（ｌｏｇ１０値は４．５１）であり、１２週には最大１／６４，０００（ｌｏｇ１０は４．８１）であった。このような抗体応答の存在は、本物の免疫応答がワクチン接種の結果として生じたことを裏付ける。本発明に相当する製剤を１回注射した群１のマウスは、ワクチン接種後４、８及び１２週に１／２５６，０００（ｌｏｇ１０値は５．４１）に達するエンドポイント力価で増強された免疫応答を生じることができた。本発明によって生じた力価は、一般的なアジュバントミョウバンを含有する対照製剤により生じる力価と比較して、あらゆる時点で平均して７倍高かった。本発明によって実現された力価の増大は、統計上有意であった（ワクチン接種後８及び１２週でＰ値＜０．０１）。これらの結果は、異なる抗原モデルの使用を通じて、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有するリポソーム／疎水性担体製剤が、リポソーム／ミョウバン／疎水性ワクチン接種と比較して有意に増強されたインビボ免疫応答を生じる能力があることを裏付ける。
【実施例１０】
【０１７６】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＣＤ１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１７７】
Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質は、約７２，０００ダルトンの分子量を有し、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面に存在する抗原性タンパク質である、赤血球凝集素糖タンパク質に相当する。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、５０μｌの用量あたり０．５μｇで使用した。
【０１７８】
液性（ＴＨ１）及び細胞（ＴＨ２）免疫応答の両方を、免疫動物の血清中の抗原特異的抗体レベルの検出を可能にする方法である、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。手短に言えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを、抗原（ｒＨＡ、１μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コートし、３％ゼラチンで３０分間ブロックし、その後に、一般に１／２０００の希釈から始める血清の段階希釈とともに４℃にて一晩インキュベートする。次に、二次抗体、抗ＩｇＧを各ウェルに１／２０００希釈で１時間３７℃にて添加する。ＴＨ１細胞応答の指標である、ＩｇＧ２Ａ抗体の検出のため、ヤギ抗マウスＩｇＧ２Ａ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を使用した。ＴＨ２液性応答の検出のため、ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）二次試薬を使用した。１ｍｇ／ｍｌ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する溶液での６０分のインキュベーションの後、各ウェルの４０５ｎｍ吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（ＡＳＹＳ Ｈｉｔｅｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて測定する。エンドポイント力価は、Ｆｒｅｙ Ａ．ら（Journal of Immunological Methods, 1998, 221 :35-41）に記載されるとおり算出する。算出した力価は、ナイーブ非免疫対照マウスからの血清試料に対して免疫マウスからの血清試料に統計上有意な吸光度の増加が観察される最大希釈を表す。力価は、エンドポイント希釈のｌｏｇ１０値として表される。
【０１７９】
本発明に相当するワクチンを処方するため、実施例８に記載されるように、Ｓ１００レシチンとコレステロールの１０：１ ｗ：ｗの均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｒＨＡ溶液の存在下リン酸緩衝液中で水和して、封入されたｒＨＡを含むリポソームを形成し、それに続いてＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。手短に述べると、１０μｇのｒＨＡを最初に６５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、次いで１３２ｍｇのＳ１００レシチン／コレステロール混合物に添加して、ｒＨＡ抗原を封入する約８００μｌのリポソーム懸濁液を形成した。次に、このリポソーム調製物を、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）にこの材料を通すことにより押出した。５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントをサイズの揃ったリポソームに添加して、調製物を１ｍｌに希釈した。「高用量」のｐｏｌｙＩ：Ｃ製剤のためには、リン酸緩衝液中２４０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを添加し、「低用量」のｐｏｌｙＩ：Ｃ製剤のためには、５０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを添加した。次に、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｉｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いてリポソームを凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を、鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１）で元の１ｍｌ容積の可溶化されたリポソームに再構成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体が結合した５０μｌの上記製剤からなるものであった。これらのワクチン製剤を、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ（高）／疎水性担体及び凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ（低）／疎水性担体と称する。
【０１８０】
ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有する凍結乾燥リポソーム製剤でのワクチン接種の結果として生じたＴＨ１及びＴＨ２応答を比較した。２つの群のマウス（１群あたりＮ＝５）に、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ（高）／疎水性担体として処方された０．５μｇのｒＨＡ及び１２μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含むワクチンＥ（群１）か、又は凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ（低）／疎水性担体として処方された０．５μｇのｒＨＡ及び２．５μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含むワクチンＩ（群２）のいずれか５０μｌを筋肉内注射した。上記のように、免疫後５週に血清試料を採取し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２Ａ抗体力価を調べた。
【０１８１】
群１のマウスは、免疫後５週に、実施例３で使用した類似の凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤の液性応答結果に匹敵する、最大２，０４８，０００（ｌｏｇ１０値は６．３１）ＩｇＧ１力価を生じた。細胞応答の指標であるＩｇＧ２Ａ力価は、ワクチン接種後５週に最大４，０９６，０００（ｌｏｇ１０は６．６１に等しい）であった。より低用量のｐｏｌｙＩ：Ｃを接種した群２のマウスは、ワクチン接種後５週に最大４，０９６，０００（ｌｏｇ１０は６．６１）のＩｇＧ１力価を生じ、また、最大４，０９６，０００のＩｇＧ２Ａ力価も生じた。結果は、凍結乾燥リポソーム／疎水性担体製剤中様々な濃度で処方されたｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントが液性（ＴＨ２）及び細胞（ＴＨ１）免疫応答の両方を生じることができることを示す。これらの結果は、上記の製剤が、ワクチン接種した被験体において細胞及び液性免疫応答を生じる能力があることを示唆する。
【実施例１１】
【０１８２】
病原体をもたない、４〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１８３】
ワクチン製剤中で使用した抗原は、普遍的ＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに融合したＨＰＶ１６Ｅ７（４９−５７；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）のＨ２−Ｄｂ免疫優勢エピトープからなる融合タンパク質であった。この抗原（以降、ＦＰと称する）を、Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で合成した。アジュバントは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により提供されるＲＮＡに基づくポリイノシン−シトシンＲＮＡ分子であった。
【０１８４】
リポソーム、ＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ分子、及び疎水性担体を含む本発明の有効性をＣ３腫瘍負荷モデルを用いてインビボで試験した。Ｃ３細胞は、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）ゲノム及び、結果としてその表面に存在する、ワクチン接種により標的とすることのできるＨＰＶ１６Ｅ７エピトープ（アミノ酸４９−５７；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含んでいた。Ｃ３細胞は皮下に注射した場合に増殖して測定可能な固形腫瘍となった。０日に、３つの群のマウス（１群あたりｎ＝８）に、ＨＰＶ１６Ｅ７発現腫瘍細胞株Ｃ３（５×１０＾５細胞／マウス）を側腹部の皮下に移植した。８日に、群１及び２のマウスの反対側の側腹部の皮下に１００μｌのワクチンを接種した。群３のマウスはＰＢＳのみが投与され、腫瘍増殖対照となった。週に１回、カリパスを用いて腫瘍容積を測定して、移植後５週間の最短の直径と最長の直径を記録した。次式：最長測定値×（最短測定値）＾２÷２、を用いて腫瘍容積を算出した。
【０１８５】
群１を免疫するために用いた対照ワクチン（従来の乳濁液）は、３００μｇのＦＰ抗原及び３ｍｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを１ｍｌのＰＢＳ中で混合することにより処方された。５００μｌの抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１）を添加して、油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、ＦＰ抗原（１５μｇ）及びｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（１５０μｇ）及び鉱油担体を含有する、１００μｌの記載された乳濁液からなるものであった。このワクチン製剤を、ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１８６】
群２のための本発明に相当するワクチン（ワクチンＫ）を処方するため、実施例１に記載されるものと同じ手順を用いた。手短に言えば、１５０μｇのＦＰ抗原を、ｔｅｒｔ−ブタノールに溶解し、凍結乾燥したＤＯＰＣレシチン／コレステロール混合物（１０：１、ｗ：ｗ；Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した。１．５ｍｇのｐｏｌｙＩ：Ｃを含有する１ｍｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加することによりリポソームを処方した。リポソーム調製物は、２００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動小型押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）に材料を通過させることにより押出した。リポソームのサイズをＭａｌｖｅｒｎ粒径アナライザー（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて２００ｎｍで確認した。５００μｌのリポソーム／抗原／アジュバント懸濁液ごとに、等容積の鉱油担体（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより供給されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１）を添加して、乳濁液の水相の中に含まれたリポソーム懸濁液及び連続する疎水相を形成する油を含む油中水乳濁液を形成した。各々のワクチン用量は、リポソーム（１３．２ｍｇのＤＯＰＣ／コレステロール）、ＦＰ抗原（１５μｇ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント（１５０μｇ）、及び鉱油担体を含有する、１００μｌの記載された乳濁液からなるものであった。このワクチン製剤を、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１８７】
この実験の結果を図１１に示す。群１のマウスは、腫瘍増殖から部分的に保護され、移植後４週までに測定可能な腫瘍を形成し始めた。本発明をワクチン接種した群２のマウスは、５週になってやっと検出可能な、有意に小さい腫瘍を形成した（ｐ＜０．１）。対照群のマウスは、予期した速度で、移植後３週から腫瘍を形成した。
【０１８８】
これらの結果は、リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤中に処方された腫瘍特異的抗原が、ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体で処方された場合よりも、マウスにおいて定着腫瘍を治療的に処置するのにより効果的であったことを示す。最適な治療効果は、リポソームが製剤中に存在した場合にのみ実現することができ、リポソームが本発明の決定的に重要な成分であることを明白に示す。
【実施例１２】
【０１８９】
病原体をもたない、４〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１９０】
実施例１１と同様に、ワクチン製剤中で使用した抗原は、普遍的ＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに融合したＨＰＶ１６Ｅ７（４９−５７；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）のＨ２−Ｄｂ免疫優勢エピトープからなる融合タンパク質であった。この抗原（以降、ＦＰと称する）を、Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で合成した。アジュバントは、１３（ＩＣ）反復からなる、ＤＮＡに基づくポリイノシン−シトシンＤＮＡ分子であり、Ｏｐｅｒｏｎ ＭＷＧ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）で合成した。
【０１９１】
リポソーム、ＤＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ及び疎水性担体を含む本発明の有効性を、前に記載したＣ３腫瘍負荷モデルを用いてインビボで試験した。０日に、４つの群のマウス（１群あたりｎ＝８）に、ＨＰＶ１６Ｅ７発現腫瘍細胞株Ｃ３（５×１０＾５細胞／マウス）を側腹部の皮下に移植した。５日に、群１〜３のマウスの反対側の側腹部の皮下にワクチンを接種した。群４のマウスはＰＢＳのみが投与され、腫瘍増殖対照となった。週に１回、カリパスを用いて腫瘍容積を測定して、移植後５週間の最短の直径と最長の直径を記録した。次式：最長測定値×（最短測定値）＾２÷２、を用いて腫瘍容積を算出した。
【０１９２】
群１のマウスに、リポソーム／抗原／ｐｏｌｙＩＣ／疎水性担体を含むワクチンＬを接種した。このワクチンは、実施例１１として処方された。各々の用量容積は１００μｌであり、リポソーム、ＦＰ（１０μｇ）、ｐｏｌｙＩＣ（２０μｇ）を含み、鉱油担体で乳化されていた。群２のマウスに、凍結乾燥リポソーム／抗原／ｐｏｌｙＩＣ／疎水性担体を含むワクチンＭを接種した。手短に言えば、ＤＯＰＣレシチン及びコレステロールの１０：１（ｗ：ｗ）の均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２００μｇのＦＰ及び４００μｇのｐｏｌｙＩＣの存在下、０．５％ ＰＥＧ／水中で水和して、封入された抗原及びアジュバントを含む１ｍｌのリポソームを形成した。このリポソーム調製物を、2つの４００ｎｍポリカーボネート膜を装備した手動押出機（Ａｖａｎｔｉ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）にこの材料を２０回通過させることにより押出した。リポソームのサイズをＭａｌｖｅｒｎ粒径アナライザー（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて２００ｎｍで確認した。抗原及びアジュバントを含有するリポソームを、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｉｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を、油中で、鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）によって元の容積の可溶化されたリポソームに再構成した。各々の用量容積は、５０μｌであり、リポソーム（６．６ｍｇのＤＯＰＣ／コレステロール）、ＦＰ（１０μｇ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（２０μｇ）及び鉱油担体を含んでいた。群３のマウスに、ｐｏｌｙＩＣアジュバントを含まずに群２用として処方された凍結乾燥リポソーム／抗原／疎水性担体（アジュバント対照）を接種した。
【０１９３】
この実験の結果を図１２に示す。群１及び群２のマウスは、実験の期間を通して測定可能な腫瘍を形成しなかった。ＦＰを含むがアジュバントを含まない凍結乾燥リポソーム製剤を接種した群３のマウスは、移植後３週に腫瘍の形成を開始した。ＰＢＳ対照群のマウスは、予期した速度で、移植後３週から腫瘍を形成した。
【０１９４】
これらの結果は、本発明のワクチン製剤が、腫瘍負荷モデルにおいて有効となるためにｐｏｌｙＩＣアジュバントを必要とすることを示す。この実施例では、リポソーム／疎水性担体中又は凍結乾燥リポソーム／疎水性担体製剤中に処方されたＤＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントは、１回程度の少ない免疫で治療効果を有する、効果的な免疫応答を生じた。
【実施例１３】
【０１９５】
病原体をもたない、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、フィルター制御空気循環下、機関のガイドラインに従って水及び食物を自由に与えて飼育した。
【０１９６】
前の実施例と同様に、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素糖タンパク質に相当する、Ｈ５Ｎ１組換え型赤血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）より購入した。この組換えタンパク質（以降、ｒＨＡと称する）をモデル抗原として用いてワクチン製剤の有効性を試験した。ｒＨＡは、５０μｌの用量あたり１．５μｇで使用した。
【０１９７】
ワクチンの有効性を、実施例７に記載される方法に類似する、メモリーＣＤ８細胞の免疫蛍光染色により評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの同系脾細胞を、３７℃にて４８時間、１０μｇ／ｍｌのリポ多糖とともに活性化させ、得られる芽細胞を、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで室温にて２０分間処置した。洗浄を繰り返した後、活性化した芽細胞を、ワクチン接種マウスからのインフルエンザ特異的ＣＤ８メモリー細胞を拡張させるための抗原提示刺激細胞として使用した。ナイーブ又は免疫マウスからの脾臓細胞を芽細胞とともに５：１の比で培養し、培養物を、５パーセント二酸化炭素下、０．１μｇ／ｍｌのｒＨＡで３７℃にて６日間刺激した。収集した細胞を、抗ＣＤ８−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）抗体及びフィコエリトリン（ＰＥ）共役Ｐｒｏ５インフルエンザペンタマー試薬（Ｈ２−Ｋｄ、ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いる免疫蛍光染色に使用した。抗ＣＤ１９−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）も使用してペンタマーとＢ細胞の非特異的結合を排除した。染色細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で収集し、ＷｉｎＬｉｓｔ ６．０ソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｔｏｐｓｈａｍ，ＭＥ，ＵＳＡ）を用いてデータ解析を行った。結果を前方及び側方散乱に基づいてゲートし、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞をペンタマー陽性、ＣＤ８β陽性及びＣＤ１９陰性として規定した。スチューデントＴ検定を用いて統計解析を行った。
【０１９８】
本発明に相当するワクチンを処方するため、実施例６及び７に記載されるものと同じ手順を用いた。手短に言えば、Ｓ１００レシチン及びコレステロールの１０：１（ｗ：ｗ）の均質な混合物（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｒＨＡの存在下、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で水和して、ｒＨＡを封入しているリポソームを形成し、それに続いてＲＮＡに基づくｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加した。このリポソーム懸濁液を半自動式押出機（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に通して押出し、サイズの揃ったリポソームを凍結乾燥し（Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機、ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｉｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）、鉱油担体（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１（商標）、ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）中で再構成した。各々のワクチン用量は、リポソーム、ｒＨＡ抗原、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバント、及び鉱油担体を含有する５０μｌの上記製剤からなるものであった。このワクチン製剤を、凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体と称する。
【０１９９】
上記の凍結乾燥リポソーム製剤の有効性を、５０μｌの５０ミリモル リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からなる対照ワクチンの有効性と比較した。群１のマウス（Ｎ＝５）に、上記のように５０μｌの凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体中に処方された１．５μｇのｒＨＡ抗原及び１２．５μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを１回（追加免疫なし）筋肉内注射した。このワクチンは、実施例６及び７で使用した同じワクチンに相当する（ワクチンＤ、本発明）。群２のマウス（Ｎ＝５）に、５０ミリモル リン酸緩衝液に懸濁した１．５μｇのｒＨＡ及び１００μｇのミョウバンアジュバントからなる対照ワクチンを２回（０日及び２８日）接種した。ワクチン接種後２１週に、二酸化炭素に誘導される窒息により動物を安楽死させ、脾臓を回収し、標準的な手順を用いて個々の単細胞懸濁液を調製した。次にインフルエンザ特異的ＣＤ８メモリーＴ細胞の存在を、上記のインフルエンザペンタマー免疫蛍光染色を用いて評価した。
【０２００】
対照ミョウバンに基づく製剤を接種したマウスは、平均集団サイズが０．０２パーセントの（標準偏差０．０２パーセント）、抗原特異的ＣＤ８メモリーＴ細胞の小集団を生じ、バックグラウンドを考慮した。他方、本発明に相当する凍結乾燥リポソーム／ｐｏｌｙＩ：Ｃ／疎水性担体製剤を接種したマウスは、平均集団サイズが０．５１パーセントの（標準偏差０．１０パーセント）、抗原特異的ＣＤ８メモリーＴ細胞の有意に大きい集団を生じた（Ｐ＜０．０２）。これらの結果は、ｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントを含有する単一用量の凍結乾燥リポソーム／疎水性担体製剤が、大きな持続性の抗原特異的ＣＤ８メモリーＴ細胞集団を生じ、それに対して水性／ミョウバン対照ワクチンが２回の免疫の後でさえも有意かつ持続的な細胞応答を生じることができなかったことを実証するので意義深い。
参考文献
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【０２０１】
本明細書において引用される全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が具体的にかつ個別に本明細書に援用されると示されるかのように、参照により本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示に対するものであり、本発明が従前の発明によってかかる刊行物に先行する権利を与えられないことを承認すると解釈されるべきではない。
【０２０２】
本明細書及び添付される特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への参照が含まれる。別に指定されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２０３】
前述の発明は、理解を明確にするために説明及び実例を目的として多少詳細に記載されたが、添付される特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明の教示に照らしてある種の変更及び修正を本発明に加えてもよいことは、当業者に容易に明らかである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原；
（ｂ）リポソーム；
（ｃ）ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド；及び
（ｄ）疎水性物質の連続相を含む担体
を含む、組成物。
【請求項２】
ｐｏｌｙＩ：ＣポリヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｐｏｌｙＩ：ＣポリヌクレオチドがＲＮＡ及びＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドがホモポリマー又はヘテロポリマーである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドが、ホモポリマー性ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド 及びヘテロポリマー性ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
組成物を製造するための方法であって、前記方法が、任意の順序で：
（ａ）抗原；
（ｂ）リポソーム；
（ｃ）ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチド；及び
（ｄ）疎水性物質の連続相を含む担体
を結合する段階を含む、方法。
【請求項７】
前記抗原が前記リポソームに封入されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドが前記リポソームに封入されている、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐｏｌｙＩ：Ｃポリヌクレオチドが前記リポソームの外側に付加されている、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６から９のいずれか一項に記載の方法に従って調製された組成物。
【請求項１１】
請求項１から５及び１０のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記被験体において前記抗原に対する抗体応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導するための方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン、又は抗原を発現する腫瘍細胞により引き起こされる疾患の治療及び／又は予防のための方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
治療及び／又は予防が、被験体において抗原に対する抗体及び／又は細胞性免疫応答を誘導することを含み、前記被験体がウイルス感染しているか、又はウイルス感染を発症するリスクのある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス感染がインフルエンザウイルス感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療及び／又は予防が、被験体において抗原に対する抗体及び／又は細胞性免疫応答を誘導することを含み、前記被験体が癌であるか、又は癌を発症するリスクのある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法であり、前記神経変性疾患が抗原の発現に関連している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が、被験体において対照組成物により誘導される応答と比較して少なくとも１．５倍高い免疫応答を誘導する、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が、被験体において対照組成物により誘導される応答と比較して少なくとも５倍高い免疫応答を誘導する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、鼻腔、中咽頭、眼球、経口、直腸、舌下、尿生殖器粘膜、鼻腔内、中咽頭、気管内、肺内、経皮、肺内外、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下又は粘膜下の経路を介して投与される、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２０１１−５２３６５３（Ｐ２０１１−５２３６５３Ａ）
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１９４３（Ｐ２０１１−５１１９４３）
【出願日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００６９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６５２３
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０８１０５７４０）イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＶＡＣＣＩＮＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】