説明

ルミネッセンスを生じる化合物およびチトクロムＰ４５０３Ａ酵素を検出するための方法

本発明は、ルシフェリンのアセタール誘導体およびこのような誘導体を酵素活性のアッセイに用いるための方法を提供する。ルシフェリンの誘導体は、所望の酵素に対する基質として作用し、ルシフェラーゼのためのプロサブストレート（プロルシフェリン）である。このように、所望のルシフェラーゼでない酵素のための特定の酵素認識部位（この酵素のための基質として称される分子内の化学的な反応基）がルシフェリン誘導体の骨格（またはルシフェラーゼのための適切な基質を構成する他の化学的な部分）に連結したルシフェリン誘導体を提供することによって、ルシフェラーゼでない酵素がバイオルミネッセンスのアッセイにて測定され得る。このような誘導体は、例えば、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンのカルボキシル基にて修飾を有し、必要に応じて他の修飾を有する誘導体である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６１／０８９，８１８号明細書（２００８年８月１８日出願）の優先権を主張するものである。米国仮特許出願第６１／０８９，８１８号明細書は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔背景技術〕
ルミネッセンスは、ルシフェラーゼが媒介する酸化反応の結果として特定の生物中にて生成される。多種多様な種に由来するルシフェラーゼ遺伝子、特に、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓおよびＰｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ（北アメリカのホタル）のルシフェラーゼ遺伝子、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ（ジャマイカンクリックビートル（Ｊａｍａｉｃａｎ ｃｌｉｃｋ ｂｅｅｔｌｅ））のルシフェラーゼ遺伝子、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（シーパンジー（ｓｅａ ｐａｎｓｙ））のルシフェラーゼ遺伝子、ならびに数種の細菌（例えば、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓおよびＶｉｂｒｉｏ ｓｐｐ）のルシフェラーゼ遺伝子は、非常に一般的なルミネッセンスのレポーター遺伝子である。また、ホタルのルシフェラーゼは、ＡＴＰの濃度を決定するための一般的なレポーターであり、このような役割に基づき、バイオマスを決定するために広く用いられている。また、ルミネッセンスは、他の酵素が特定の合成基質（例えば、アルカリホスファターゼとアダマンチルジオキセタンホスフェート、または西洋わさびペルオキシダーゼとルミノール）と混合されたときにも、生成される。
【０００３】
ルシフェラーゼ遺伝子は、放射能を有しておらず、感度がよく、ルミネッセンスのアッセイにおける直線の範囲が極めて広いため、遺伝子のレポーターとして広く用いられている。例えば、わずか１０〜２０モルのホタルのルシフェラーゼを検出することができる。このため、遺伝子の活性のルシフェラーゼアッセイは、実験用の生物学的なシステム（原核生物の細胞培養物、真核生物の細胞培養物、トランスジェニック植物、トランスジェニック動物、無細胞の発現システムが挙げられる。）のほぼ全てに用いられている。同様に、ＡＴＰの濃度を決定するために用いられるルシフェラーゼアッセイは感度が高く、１０〜１６モル未満の検出を可能にする。
【０００４】
ルシフェラーゼは、この酵素に特異的な基質（例えばルシフェリン）を酸化することによって光を発生させることができる。ホタルのルシフェラーゼおよび他の全てのビートルのルシフェラーゼに関し、光の発生は、ルシフェリン、マグネシウムイオン、酸素およびＡＴＰの存在下にて起こる。花虫類のルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼを含む。）に関し、基質であるセレンテラジンと一緒に必要とされるものは酸素のみである。一般に、遺伝子の活性を決定するためのルミネッセンスアッセイでは、反応の基質および他のルミネッセンスを活性化する試薬を、レポーターの酵素を発現することを推測される生物学的な系に導入する。次いで、その結果としてルミネッセンスが生じたのであれば、そのルミネッセンスをルミノメーターまたは放射エネルギーを測定する任意の適切なデバイスを用いて測定する。このアッセイは、非常に迅速であり、感度がよく、遺伝子発現のデータを素早く容易に、放射性試薬を必要とせずに提供する。
【０００５】
ほとんどの酵素反応はルシフェラーゼと同一の成果をもたらさない。このため、細胞の分析およびハイスループットスクリーニングへ応用するに有用な酵素反応に、ルシフェラーゼによって媒介されるアッセイを利用できることを当業者は希望している。しかし、上述した酵素アッセイまたは生物学的アッセイを基礎とするこのようなルシフェラーゼによって媒介される反応の開発は制限されていた。ルシフェラーゼによって媒介される反応は、数多の他の分子（例えばＡＴＰまたは乳酸デヒドロゲナーゼ）の検出に用いられていた。これらの反応のいくつかに関し、天然に存在する基質の誘導体が用いられている。多数の複素環を有する有機酸であるネイティブなホタルのルシフェリン（Ｄ−（−）−２−（６’ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ２−チアゾリン−４−カルボン酸）を図１に示す。例えば、プロテアーゼのような酵素の認識部位を有する、プロサブストレート（ｐｒｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてのルシフェリン誘導体を用いる方法が、Ｍｉｓｋａ ｅｔ ａｌ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２５：２３ （１９８７））によって記載されている。このルシフェリン誘導体と適切な酵素（例えばプロテアーゼ）とを特定の時間、インキュベートし、次いで、この混合物のアリコートをルシフェラーゼを含んでいる溶液に移すことによって、不均一なアッセイが実施されている。Ｍａｓｕｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．， ３０：１３０ （２０００））は、ルシフェリンで修飾されたガラクトシダーゼ基質を用いた、シングルチューブの（均一な）アッセイの使用を報告した。これらのルシフェリン誘導体では、ルシフェラーゼでない酵素の活性に対する反応基として機能する誘導体の部分が、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの骨格に連結されており、ルシフェラーゼでない酵素が作用した際に、ルシフェラーゼのための基質としての役割を果たすべく、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの分子が反応の直接的な産物として生成されていた。ルシフェラーゼによって媒介される反応を他の酵素アッセイに広く適用することの主な障害は、ルシフェリン分子を修飾してルシフェラーゼでない酵素の基質として機能させるためには、ルシフェラーゼでない酵素の活性によって、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの分子がルシフェラーゼのための基質としての機能を保持するように直接的に生成されなければならない、という考えであった。
【０００６】
〔要旨〕
本発明は、ルシフェリンのアセタール誘導体を提供する。また、本発明は、このような誘導体を酵素活性のアッセイに用いるための方法を提供する。この酵素活性のアッセイにおいて、ルシフェリン誘導体は、所望の酵素の基質としての役割を果たすものであり、ルシフェラーゼのプロサブストレート（プロルシフェリン）である。したがって、所望のルシフェラーゼでない酵素のための特定の酵素認識部位（この酵素のための基質として称される分子内の化学的な反応基）がルシフェリン骨格（またはルシフェラーゼのための適切な基質を構成する他の化学的な部分）に連結されているルシフェリン誘導体を提供することによって、ルシフェラーゼでない酵素がバイオルミネッセンスのアッセイにて測定され得る。このような誘導体は、例えば、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンのカルボキシル基にて修飾を有し、必要に応じて他の修飾を有する誘導体である。
【０００７】
本発明の誘導体の範囲内におけるルシフェリンの修飾としては、環の原子の１つ以上の置換、環の原子に結合した置換基（原子または基）の１つ以上の置換、および／または環への１つ以上の原子の付加（例えば環の拡張または付加）あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。Ｄ−ルシフェリンにおける環の原子のいくつかに番号を付して図１に示す。ネイティブなホタルのルシフェリンは、３つの連結した環、すなわち、６位にＯＨ基を有する６員環（以下では「環Ａ」または「Ａ環」と称する。）、この６員環に連結した５員環のチアゾール環（以下では「環Ｂ」または「Ｂ環」と称する。）、および５位がカルボキシル基で修飾された５員環のチアゾール環（以下では「環Ｃ」または「Ｃ環」と称する。）を有している。本発明のルシフェリン誘導体は、このＣ環におけるカルボキシル基をアセタール基と置換する修飾を少なくとも１つ含んでいる。例えば、Ａ環の修飾を有するルシフェリン誘導体は、Ａ環におけるＣ原子を別の原子と置換すること、環の付加、環の原子に結合した置換基を異なる原子または基と置換すること、またはこれらの任意の組み合わせを有していてもよい。Ｂ環の修飾を有するルシフェリン誘導体は、この５員環を例えば６員環に拡張するように、この５員環に原子を付加するかまたはこの５員環内の原子を置換すること（例えば１つ以上の原子の挿入）、この環内のＮまたはＳを異なる原子（例えばＣまたはＯ）と置換すること、環の原子に結合した置換基の原子または基を置換すること、あるいはこれらの任意の組み合わせを有していてもよい。Ｃ環の修飾を有するルシフェリン誘導体は、この環内の原子を別の原子と置換すること、環の原子に結合した置換基を異なる原子または基と置換すること、あるいはこれらの任意の組み合わせを有していてもよい。本発明の誘導体は、１つよりも多い位置にて修飾されていてもよい。例えば、誘導体は、２つ（またはそれ以上）のＡ環の修飾、２つ（またはそれ以上）のＢ環の修飾、２つ（またはそれ以上）のＣ環の修飾、あるいはこれらの任意の組み合わせを有していてもよい。
【０００８】
一実施形態において、アセタール基に加えて、ルシフェリンは、ルシフェリンの骨格がその環の構造において修飾されているもの（例えば、キノリルルシフェリンまたはナフチルルシフェリン）を含んでいるか、または環Ａにおいてハロゲンを含んでいる。アセタールの修飾を有する誘導体を使用すれば、例えば、シグナルの増加、バックグラウンドの低減、選択性の増加、および／またはＫｍの低減によって、特定のルシフェラーゼでない酵素または分子が提供されるか、あるいはこのような酵素または分子のためのアッセイが改善される。よって、本発明のルシフェリン誘導体を用いるバイオルミネッセンスの方法を、１つ以上の分子（例えば、酵素、酵素反応のための補助因子、酵素の基質、酵素の阻害物質または酵素の活性化物質）を検出するために用いることができる。
【０００９】
本明細書に記載したように、本発明の化合物は、シグナルが増加しており、バックグラウンドがより低く、基底レベルを検出する際により感度のよいアッセイを提供し、他のルミネッセンスを生じるＣＹＰ３Ａ４の基質と比べてＣＹＰ３Ａ４の活性に対する選択性（２μＭにて使用された場合のＫｍ）が向上されていた。さらに、本発明の化合物との反応におけるＣＹＰ３Ａ４の活性は、テストステロン、ケトコナゾール、ニフェジピン、およびミダゾラムによって阻害された。このような化合物は、ＣＹＰ３Ａの阻害物質のための範囲の広いプローブであり、範囲のより狭いプローブによって３Ａの活性を阻害しない作用物質を検出するに有用である。さらに、本発明の化合物を上述した方法に使用した場合、反応がより迅速に進行した（例えば、約１．４／分のＫｃａｔ対約１５／分のＫｃａｔ）（Ｃａｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ Ａｓｓａｙｓ． Ｅｘｐ． Ｏｐ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． （２００６） ２（４）：６２９−６４５参照）。
【００１０】
Ｃ環のカルボキシル基がアセタール基で置換された修飾を少なくとも１つ有する本発明のルシフェリン誘導体は、チトクロムＰ４５０酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）、ペルオキシダーゼまたは他の酵素、あるいは活性酸素種（酸素イオンまたは酸素ラジカルを有する化合物など）のための基質であり得る。さらに、ルシフェリン誘導体は、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）、または他のチトクロムＰ４５０酵素、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、デアルキラーゼ、デアセチラーゼ、デホルミラーゼ、ホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ））、スルファターゼ、ベータラクタマーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、プロテアーゼ（例えば、プロテオソーム、カテプシン、カルパイン、βセクレターゼ、トロンビンまたはグランザイム）のための基質を産生する修飾も含んでいてもよいし、活性酸素種（ＲＯＳ）、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））および酸化還元の状態を検出するに有用でもある。例えば、米国特許出願第２００７／００１５７９０号明細書参照。なお、この文献の開示は、参照によって本明細書に援用される。これらのさらなる修飾は、上記にて記載したようなＡ環またはＢ環への修飾である。
【００１１】
一実施形態において、本発明は以下の式（Ｉ）の化合物を提供する。
【００１２】
【化１】

【００１３】
（Ｉ）
上記式（Ｉ）において、
Ｙは、Ｎ、Ｎ‐オキシド、Ｎ‐（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはＣＨであり；
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨまたはＣＨ＝Ｎであり；
Ｘ＊はそれぞれ独立してＯまたはＳであり；
Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立して、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、ハロアリールもしくは複素環であるか、または、Ｒ’およびＲ”は共に環式部分を形成しており；
Ｒ’およびＲ”は、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルコキシ、オキシ、アミノ、ハロ、カルボキシル、チオ、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、ハロアリールまたは複素環で任意に置換されていてもよく、
Ｚは、Ｈ、ＯＲ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲであり；
Ｗ１はＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、ヒドロキシルもしくは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、ｎは１、２または３であるか、または
Ｗ１およびＺは、環Ａにおいて共にケト基を形成しており、環Ａにおいて任意の結合を示す破線の少なくとも１つが存在せず；
Ｗ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルケニル、ヒドロキシルまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり;
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４はそれぞれ独立して、ＣＨ、Ｎ、Ｎ‐オキシド、またはＮ‐（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｋ１とＫ２との間およびＫ３とＫ４との間の破線は、任意の結合を示し、何れかのＣＨの炭素が置換されているとき、Ｈは存在せず、
環Ｂにおける破線は、任意の二重結合であり、
Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルコキシ、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、ハロアリール、複素環、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルスルホニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールスルホニル、ハロアリールスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルスルフィニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールスルフィニル、ハロアリールスルフィニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２、トリ（Ｃ１〜Ｃ２０）アンモニウム（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、ハロアリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、第４級窒素を有するハロアリール、第４級窒素を有するハロアリールカルボニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールチオ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルリン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールリン酸塩、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはサッカライドあるか、または、ＺがＮＲＲであるとき、Ｎと共にＲＲは任意にハロアリール基または複素環基を形成しており；
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ハロアリールまたは複素環基は何れも、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、‐ＣＯＯＲｘ、‐Ｓ（Ｏ）Ｒｘ、‐ＳＯ２Ｒｘ、‐ＳＯ３Ｒｘ、ニトロ、アミノ、リン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルリン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル）２、メルカプト、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルチオ、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ハロアリールまたは複素環から選ばれる１、２、３、４または５の置換基によって任意に置換されていてもよく、
上記ＲｘがＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、複素環もしくはハロアリールまたはこれらの塩であり、上記それぞれの置換基は１〜３のＲ基によって任意に置換されていてもよく；
上記Ｚが窒素部分を含むとき、Ｚの窒素部分の水素の１または両方は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは置換基Ｌによって置き換えられていてもよく；
上記置換基Ｌは、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアミノ酸ラジカル、２０以下のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルまたはその他の低分子であり；
上記Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の水素または窒素部分が、（ＨＯ）２Ｐ（Ｏ）‐ＯＣＨ２‐、スルホ、‐ＰＯ３Ｈ２または１〜約１２の炭素原子の炭素鎖を介してＺ基に連結しているセファロスポラニン酸によって置き換えられていてもよく、
上記Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の１つの水素または窒素部分が、Ｌ’基‐リンカーによって置き換えられていてもよく；
上記Ｌ’基は、リンカーを固定しない酵素によって除去可能であり、リンカーは自己切断性を有し、１または複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、任意で置換されている芳香族環またはペプチド結合によって任意に割り込まれていてもよい炭素鎖であり；
上記リンカーは、リンカーの１つの末端にて、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ’基と連結されており、リンカーの他の末端は、Ｚ基とエーテル、エステルまたはアミド結合を形成しており；
上記ＺがＯＲであるとき、式Ｉは任意で、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して２つの環Ａに結合されたダイマーであってもよく；
上記リンカーは、式Ｉのダイマー間において、架橋を形成する１〜４の酸素原子、窒素原子または任意で置換されていてもよいアリール、ハロアリールまたは複素環基によって割り込まれていてもよく、式Ｉのダイマーに結合している上記それぞれのＺ基のＲ基は、架橋によって置き換えられている化合物。
【００１４】
本明細書に記載のルシフェリン誘導体を使用すれば、ルシフェラーゼでない分子との相互作用によって光学特性の測定可能な変化をもたらすアッセイを用いることができる。この相互作用はルシフェリン誘導体の構造を変えることもある。本明細書に記載したように、ルシフェリン誘導体とルシフェラーゼでない酵素または目的の他の酵素との間の反応の産物は、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンである必要がない。例えば、ルシフェリン誘導体は、ルシフェリンまたはアミノルシフェリンに化学的なリンカーを介して連結された、ルシフェラーゼでない酵素のための化学的な反応基を含んでいる基質を含んでいてもよい。ルシフェラーゼでない酵素による誘導体の化学的な反応基の変形は、この基質の一部、化学的なリンカーの一部、化学的なリンカー、またはこの基質と化学的なリンカーとの一部を含んでいる（保持している）産物を生成し得る。この産物は、ルシフェラーゼのための基質またはプロサブストレートである。
【００１５】
一実施形態において、１つ以上のルシフェラーゼでない酵素を検出するためにバイオルミネッセンスをアッセイする方法が提供される。この方法は、１つ以上のルシフェラーゼでない酵素、反応のための基質または補助因子を有していると推測されるサンプルを、ルシフェラーゼでない酵素のための基質である本発明のルシフェリンの誘導体またはアミノルシフェリンの誘導体を含んでいる対応する反応混合物と接触させる工程を包含している。
【００１６】
さらに、ルシフェラーゼによって媒介されるアッセイにルシフェリン誘導体と一緒にチオール化合物を含ませることによって、反応のルミネッセンスが効果的に安定化し得る。これによって、「グロー」カイネティクス（ｇｌｏｗ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を提供することができる。すなわち、ルシフェラーゼによって媒介される反応のルミネッセンスの強度が、誘導体を添加した後の期間において比較的一定になる。このような化合物は、ルシフェラーゼでない酵素の存在または活性、あるいは酵素を用いない生物学的反応をモニターする、バイオルミネッセンスを生じるアッセイに用いてもよい。
【００１７】
誘導体が、ルシフェラーゼのためのプロサブストレートである場合（すなわち、誘導体とルシフェラーゼでない酵素との間の反応の産物がルシフェラーゼのための基質である場合）、ルシフェラーゼでない酵素とルシフェラーゼとのための連続して行われるまたは同時に行われる反応を実施してもよい。例えば、ルシフェラーゼのためのプロサブストレートであるルシフェリン誘導体を含んでいる、ルシフェラーゼでない酵素のためのアッセイを単一の反応容器にて実施してもよい。そして、ビートルのルシフェラーゼの反応混合物をこの反応容器に添加してもよい。別の実施形態では、ルシフェラーゼのためのプロサブストレートであるルシフェリン誘導体を含んでいるルシフェラーゼでない酵素のためのアッセイのための反応混合物を単一の反応容器にて実施し、この反応物の一部を、ビートルのルシフェラーゼの反応混合物を有する、異なる容器に添加してもよい。また、非ルシフェラーゼの反応およびルシフェラーゼの反応を同一の容器にて同時に実施してもよい。
【００１８】
このように、本発明は、一実施形態において、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の、サンプル中の存在または量を検出または決定する方法を提供する。この方法は、サンプル、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための第１の反応混合物、およびルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体を接触させて、ルシフェラーゼのための基質である、ルミネッセンスを生じる産物を含んでいる第１の混合物を生成する工程を包含している。一実施形態において、この誘導体は、式Ｉの化合物である。第１の混合物の少なくとも１部を、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための第２の反応混合物と接触させて、第２の混合物を生成する。次いで、第２の反応におけるルミネッセンスを検出または決定し、これによって、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の、サンプル中の（例えば、コントロールと比較した）存在または量を検出または決定する。いくつかの実施形態において、第２のルシフェラーゼでない酵素を用いて、第１のルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応の産物をさらに化学的に変形し、ルシフェラーゼのための基質を生成してもよい。例えば、サンプル、非ルシフェラーゼの反応混合物、またはルシフェラーゼの反応混合物は、エステラーゼを含んでいてもよい。あるいは、エステラーゼは別に添加されてもよい。
【００１９】
代わりの実施形態において、第１のルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の、サンプル中の存在または量を検出または決定する方法が提供される。この方法は、サンプル、ルシフェラーゼでないものによって媒介される酵素反応およびルシフェラーゼによって媒介される反応のための反応混合物、ならびにルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体を接触させて、混合物を生成する工程を包含している。ルシフェラーゼでない酵素とこの誘導体との間の反応によって、ルシフェラーゼのための基質である、ルミネッセンスを生じる産物が生成する。上記混合物におけるルミネッセンスを検出または決定し、これによって、ルシフェラーゼでないものによって媒介される反応のための分子の、サンプル中の存在または量を検出または決定する。
【００２０】
また、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のモジュレーターを同定する方法も提供する。この方法は、１つ以上の作用物質、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための第１の反応混合物、およびルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体を接触させて、第１の混合物を生成する工程、またはこのような混合物を提供する工程を包含している。１つ以上の作用物質が存在していない第１の混合物は、ビートルのルシフェラーゼのための基質である、ルミネッセンスを生じる産物を含んでいる。第１の混合物の少なくとも一部とビートルのルシフェラーゼによって媒介される反応のための第２の反応混合物とを混合して、第２の混合物を生成する。第２の混合物におけるルミネッセンスをコントロールの混合物と比較し、これによって、１つ以上の作用物質がルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応を調節するか否かを特定する。
【００２１】
本発明は、本発明のルシフェリン誘導体を１つ以上有している組成物またはキットを提供する。このキットは、必要に応じて、他の試薬（例えば、酵素および反応混合物など）を含んでいてもよい。本発明のバイオルミネッセンスを生じる反応混合物、組成物およびキットは、必要に応じて、反応速度を遅くする作用物質（例えば、アミノメチルベンゾチアゾール（ＡＭＢＴ）またはアミノフェニルメチルベンゾチアゾール（ＡＰＭＢＴ）（米国特許出願第２００４／０１７１０９９号明細書参照））、および／または光の生成を安定化させる作用物質（例えばチオールまたはコエンザイムＡ）を含んでいてもよい。上述の反応速度を遅くする作用物質は、グローカイネティクスをもたらす。
【００２２】
〔図面の簡単な説明〕
以下の図面にて、本発明の特定の実施形態および／または種々の態様をさらに実証する。必要に応じて、添付の図面を本明細書に示した詳細な説明と組み合わせて参照すれば、本発明の実施形態を最もよく理解することができる。この説明および添付の図面は特定の具体的な例または本発明の特定の態様を強調することがあるが、当業者は、この例または態様の部分を本発明の他の例または態様と組み合わせて用いてもよいことを理解するだろう。
【００２３】
図１は、ビートルのルシフェリン（Ｄ−ルシフェリン）の６員環（「Ａ環」または「環Ａ」）内の環の原子、中心の５員環（「Ｂ環」または「環Ｂ」）内の環の原子、およびチアゾールの５員環（「Ｃ環」または「環Ｃ」）内の環の原子の番号を示す図である。
【００２４】
図２は、化合物３３９１のＰ４５０酵素に対する選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３９１またはアセタールでないプロルシフェリン誘導体（ルシフェリン−ＢＥ、ルシフェリン−ＰＦＢＥまたはルシフェリン−ＰＰＸＥ）を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。３つ組（ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００２５】
図３は、ニフェジピンによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【００２６】
図４は、ケトコナゾールによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【００２７】
図５は、テストステロンによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【００２８】
図６は、ミダゾラムによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【００２９】
図７は、ＣＹＰ３Ａ４の３３９１に対する活性の用量依存性を示す図である。
【００３０】
図８は、化合物３３２０のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３２０を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３１】
図９は、化合物３３６６のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６６を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３２】
図１０は、化合物３３６４のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６４を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３３】
図１１は、化合物３３６５のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６５を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３４】
図１２は、化合物３３７７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３７７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３５】
図１３は、化合物３３８７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３８７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３６】
図１４は、化合物３３５７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３５７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３７】
図１５は、化合物３３５８のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３５８を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３８】
図１６は、化合物３３５９のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３５９を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００３９】
図１７は、化合物３３６３のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６３を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００４０】
図１８は、化合物３３９７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３９７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００４１】
図１９は、化合物３４０３のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３４０３を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【００４２】
図２０は、化合物３３９１のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３９１を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。この図は実施例１およびその「材料および方法」の項に記載したような図２と異なる。
【００４３】
図２１は、ヒトの肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の誘導を示す図である。１０μＭのケトコナゾール（Ｋｅｔｏ）を有しているまたは有していない、５００μＭのフェノバルビタール（ＰＢ）またはＰＢのビヒクル（０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＡＯ））で処理した後の培養肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の活性を検出するためのバイオルミネッセンスのプローブとして、化合物３３９１を用いた。４つ組のウェルからの測定の平均値および標準偏差を示す。バックグラウンドは、培地および化合物３３９１を含んでいるが、細胞を含んでいないウェルからのシグナルである。基底（Ｂａｓａｌ）は、培地、０．１％ＤＭＳＯおよび細胞を含んでいるウェルからのシグナルである。バックグラウンドの値（グラフ上のバーとして確認することができない。）は９９０±７１ＲＬＵである。基底＋ｋｅｔｏの値（これも、グラフ上のバーとして確認することができない。）は３６１３±２４４ＲＬＵである。
【００４４】
〔詳細な説明〕
＜Ｉ．定義＞
本明細書で用いるに際し、以下の用語および表現は示された意味を持つ。本発明に係る化合物は、非対称の置換された炭素原子群を含み、光学活性またはラセミ体にて単離され得る。ラセミ体の分割または光学活性な出発原料からの合成など、どのように光学活性体を調製する手法は公知である。構造の、全てがキラル型、ジアステレオマー体、ラセミ体および全ての幾何異性体は、本発明の一部である。ラジカル、置換基および範囲に関する特定値は、説明に関するもののみ記載している。これらは、ラジカルおよび置換基に係る範囲において、他の規定された値または他の値を排除するものではない。
【００４５】
本明細書で用いるに際し、用語“置換された”とは、以下の事項を示す意図である。すなわち、“置換された”が使用された表現にて示された置換基上の１または複数（例えば、１、２、３、４、５または６である。ある実施形態では、１、２または３であり、他の実施形態では、１または２である）の水素が、望ましい１もしくは複数の置換基から選択された置換基、または、公知の適切な置換基に置き換えられることを意味する。上述の原子の原子価は超過せず、置換の結果、安定した化合物が得られる。
【００４６】
置換基に係る安定な置換には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ハロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アセチルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ハロアリールスルフィニル、ハロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、リン酸塩、硫酸塩、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミンおよびシアノによる置換が含まれる。
【００４７】
さらに、安定な望ましい置換基には、例えば、‐Ｘ、‐Ｒ、‐Ｏ−、‐ＯＲ、‐ＳＲ、‐Ｓ−、‐ＮＲ２、‐ＮＲ３、＝ＮＲ、‐ＣＸ３、‐ＣＮ、‐ＯＣＮ、‐ＳＣＮ、‐Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、‐ＮＣＳ、‐ＮＯ、‐ＮＯ２、＝Ｎ２、‐Ｎ３、‐ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、‐Ｓ（＝Ｏ）２Ｏ−、‐Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、‐Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、‐ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、‐Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、‐ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ２ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ｏ２ＲＲ、‐Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）２、‐Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、‐Ｃ（Ｓ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）Ｏ−、‐Ｃ（Ｓ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＳＲ、‐Ｃ（Ｓ）ＳＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、‐Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、‐Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが含まれる。
【００４８】
上記Ｘはそれぞれ独立してハロゲン（“ハロ”）であり、ハロゲンにはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。また、Ｒはそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ハロアリール、複素環、保護基またはプロドラッグ部分である。当業者の知識によれば、ケト（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）などにより置換がなされ、その後、２つの水素原子が置換された原子に置き換わると速やかに理解されるであろう。
【００４９】
“安定な化合物”および“安定な構造”とは、反応混合物から有効な程度の純度で単離されて存在するほど充分に強固である化合物を意味する。安定な化合物は熟考されたものであり、本発明において特許請求の範囲に記載されている。しかしながら、ある種の不安定な化合物、例えば、容易に単離できない化合物も本明細書に係る方法に用いられる。
【００５０】
あるジアステレオマーは、他のジアステレオマーに比較して、優れた特性または活性を示し得る。必要であれば、Tuckerらの J. Med. Chem., 37:2437 (1994)に記載されているように、キラルカラムによって、またはカンファークロリドなどの分割剤を用いて分割することによって、ラセミ物質の分離を行うことができる。キラル化合物は、キラル触媒またはキラル配位子を用いて直接合成してもよい。例えば、Huffman et al., J. Org. Chem., 60:1590 (1995)が挙げられる。
【００５１】
本明細書で用いるに際し、用語“アルキル”は、分岐のある、分岐のないまたは環式の炭化水素に係るものであり、例えば、１〜３０の炭素原子、多くは、１〜１２または１〜約６の炭素原子を有する。これらに限定されないが、メチル、エチル、１‐プロピル、２‐プロピル、１‐ブチル、２‐メチル‐１‐プロピル、２‐ブチル、２‐メチル‐２‐プロピル（ｔ‐ブチル）、１‐ペンチル、２‐ペンチル、３‐ペンチル、２‐メチル‐２‐ブチル、３‐メチル‐２‐ブチル、３‐メチル‐１‐ブチル、２‐メチル‐１‐ブチル、１‐ヘキシル、２‐ヘキシル、３‐ヘキシル、２‐メチル‐２‐ペンチル、３‐メチル‐２‐ペンチル、４‐メチル‐２‐ペンチル、３‐メチル‐３‐ペンチル、２‐メチル‐３‐ペンチル、２，３‐ジメチル‐２‐ブチル、３，３‐ジメチル‐２‐ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが一例として含まれる。
【００５２】
上記アルキルは、置換されていなくともよいし、置換されていてもよい。例えば、置換されたアルキル基は以下に示すハロアルキル基であってもよい。上記アルキルは、任意で部分的なまたは完全な不飽和化合物であってもよい。アルキル基は詳細には、アルケニル基およびアルキニル基の両方を含む。アルキルは、上述し、例示した化合物の一価の炭化水素ラジカルであってもよく、または、２価の炭化水素ラジカルであってもよい（すなわち、アルキレン）。用語“割り込み”にて説明したように、アルキル基は任意に割り込まれていてもよい。
【００５３】
用語“アルケニル”は、分岐のある、または、分岐のない部分的に不飽和な炭化水素鎖のモノラジカルに係るものである（すなわち、炭素‐炭素、ｓｐ２二重結合）。
【００５４】
一実施形態において、アルケニル基は、２〜１０の炭素原子または２〜６の炭素原子を有してもよい。他の実施形態において、アルケニル基は、２〜４の炭素原子を有する。限定されるわけではないが、エチレンまたはビニル、アリル、シクロペンテニル、５‐ヘキセニルなどが一例に含まれる。上記アルケニルは、置換されていなくともよいし、置換されていてもよい。
【００５５】
用語“アルキニル”は、完全に不飽和な点を有する（すなわち、炭素‐炭素、ｓｐ三重結合）、分岐のある、または、分岐のない炭化水素鎖のモノラジカルに係るものである。一実施形態において、アルキニル基は２〜１０の炭素原子または２〜６の炭素原子を有していてもよい。また、他の実施形態において、アルキニル基は、２〜４の炭素原子を有していてもよい。
【００５６】
この用語アルキニルは、エチニル、１‐プロピニル、２‐プロピニル、１‐ブチニル、２‐ブチニル、３‐ブチニル、１‐ヘキセニル、２‐ヘキセニル、３‐ヘキセニル、１‐オクチニなどによって例示される。アルキニルは、置換されていなくともよいし、置換されていてもよい。
【００５７】
用語“シクロアルキル”は、単式環または複式の縮合環を有する、３〜１０の炭素原子の環式アルキル基に係るものである。このようなシクロアルキル基は、以下のようなものが含まれ、単環として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなど、または、複数環構造として、アダマンタニルなどが知られている。上記シクロアルキルは、置換されていなくともよいし、置換されていてもよい。
【００５８】
上記シクロアルキル基は、一価または二価であってもよく、上述したアルキル基によって任意に置換されていてもよい。シクロアルキル基は１または複数の不飽和箇所を任意に含んでいてもよい。例えば、シクロアルキル基は、１または複数の炭素‐炭素二重結合を含んでいてもよく、シクロヘキサン、１，３‐シクロヘキサジエン、１，４‐シクロヘキサジエンなどが例示される。
【００５９】
用語“アルコキシ基”は、アルキル‐Ｏ‐に係るものであると規定される。一実施形態において、アルコキシ基として、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ‐ブトキシ、tert‐ブトキシ、sec‐ブトキシ、ｎ‐ペントオキシ、ｎ‐ヘキシルオキシ、１，２‐ジメチルブトキシなどが挙げられる。アルコキシ基は置換されていなくとも、置換されたものであってもよい。
【００６０】
本明細書で用いるに際し、“アリール”は、親の芳香環系の１つの炭素原子から１つの水素原子を除去した構造に由来する芳香族炭化水素基に係るものである。ラジカルは、飽和または不飽和の親の環系の炭素原子である。上記アリール基は、６〜３０の炭素原子、６〜２０の炭素原子、６〜１４の炭素原子または６〜１０の炭素原子を有していてもよい。上記アリール基は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合（融合）環を有していてもよい。上記アリール基において、少なくとも１つの環は、芳香性を有する（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントリジン、フルオレニルまたはアントリル）。代表的なアリール基には、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどに由来するラジカルが含まれる。上記アリールは、アルキル基について説明したように、置換されてもよく、または、任意に置換されていてもよい。例えば、アリール基は、種々の置換されたアリール基を提供するために、１または複数の置換基（上述した置換基）、一例として、ペンタフルオロフェニルまたはパラ‐トリフルオロメチルフェニルなどによって置換されていてもよい。
【００６１】
用語“ハロ”は、フッ化、塩化、臭化およびヨウ化に係るものであり、類似の用語“ハロゲン”は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素に係るものである。
【００６２】
用語“ハロアルキル”は、本明細書にて上述した１または複数のハロ基によって置換されたものと規定される。上記ハロ基は、同一または異なっていてもよい。一実施形態において、ハロアルキルは、１、２、３、４または５のハロ基によって置換されていてもよい。また、他の実施形態において、ハロアルキルは、１、２または３のハロ基によって置換されていてもよい。用語ハロアルキルは、ペルフルオロ‐アルキル基も含む。
【００６３】
代表的なハロアルキル基としては、トリフルオロメチル、３‐フルオロドデシル、１２，１２，１２‐トリフルオロドデシル、２‐ブロモオクチル、３‐ブロモ‐６‐クロロヘプチル、１Ｈ，１Ｈ‐ペルフルオロオクチルなどが一例として含まれ得る。ハロアルキルは、アルキル基について上述したように、任意に置換されていてもよい。
【００６４】
用語“ハロアリール”は、本明細書において、単環式、二環式または三環式の環系として規定される。上記環系は、１、２または３の芳香族環を含み、芳香族環において少なくとも１つの窒素、酸素または硫黄原子を含む。上記環系は、例えば、１または複数、特に１〜３の置換基によって置換されていてもよいし、置換されていなくともよい。上記置換基は、“置換された”の規定において上述した通りである。
【００６５】
代表的なハロアリール基は、１または複数のヘテロ原子に加えて、２〜２０の炭素原子を含んでいる。ハロアリール基の一例としては、これらに限定されないが、２Ｈ‐ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ‐キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、□‐カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリルおよびキサンテニルが挙げられる。
【００６６】
一実施形態において、用語“ハロアリール”は、５または６員環原子を含む単環式の芳香族環を示す。上記５または６員環原子は、炭素、および、過酸化されていない酸素、硫黄および窒素（Ｚ）から独立して選択された１、２、３または４つのヘテロ原子を含む。上記Ｚは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、アルキル、アリールまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアリールである。
【００６７】
他の実施形態において、ハロアリールは以下の誘導体に由来する８〜１０員環原子のオルソ位で縮合した二環式を示し、以下の誘導体は、特に、ベンゼン誘導体またはプロピレン、トリメチレンまたはテトラメチレンジラジカルを縮合することに由来する１つの誘導体である。
【００６８】
用語“複素環”は、飽和のまたは部分的に不飽和の環系に係るものである。上記複素環は、酸素、窒素および硫黄からなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を含み、用語“置換された”において規定したように、１または複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００６９】
複素環は、１または複数のヘテロ原子を含む単環式、二環式または三環式の基であってもよい。また、複素環基は、環に連結するオキソ基（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）基を含んでいてもよい。
【００７０】
複素環基は、以下の例示に限定されないが、１，３‐ジヒドロベンゾフラン、１，３‐ジオキソラン、１，４‐ジオキサン、１，４‐ジチアン、２Ｈ‐ピラン、２‐ピラゾリン、４Ｈ‐ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルフォリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジンおよびチオモルフォリンを含んでいる。
【００７１】
用語“複素環”はこれらの例に限定されないが、Paquette, Leo A.; Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に、チャプター１、３、４、６、７および９; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950から現在)、特に、Volumes １３、１４、１６、１９および２８; J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 5566.において記載された複素環のモノラジカルが含まれる。
【００７２】
一実施形態において、“複素環”は、本明細書で規定される“炭素環”を含む。上記炭素環は、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）によって置き換えられている１または複数の（例えば、１、２、３または４の）炭素原子を有する。
【００７３】
複素環の例示には、これらに限定されないが、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２‐ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ‐１，２，５‐チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ‐１，５，２‐ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサンテニル、２Ｈ‐ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ‐インドリル、１Ｈ‐インダゾリ、プリニル、４Ｈ‐キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β‐カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ゼンゾキサゾリニル、イサチノイルおよびビス‐テトラヒドロフラニルが含まれる。
【００７４】
一例として知られており、これらに限定されないが、複素環に結合した炭素は、ピリジンの２、３、４、５または６位、ピリダジンの３，４，５または６位、ピリミジンの２、４、５または６位、ピラジンの２、３、５または６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールもしくはテトラヒドロピロールの２、３、４または５位、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの２、４または５位、イソオキサゾール、ピラゾールもしくはイソチアゾールの３、４または５位、アジリジンの２または３位、アゼチジンの２、３または４位、キノリンの２、３、４、５、６、７または８位、イソキノリンの１、３、４、５、６、７または８位において結合されている。
【００７５】
複素環に結合した炭素には、２‐ピリジル、３‐ピリジル、４‐ピリジル、５‐ピリジル、６‐ピリジル、３‐ピリダジニル、４‐ピリダジニル、５‐ピリダジニル、６‐ピリダジニル、２‐ピリミジニル、４‐ピリミジニル、５‐ピリミジニル、６‐ピリミジニル、２‐ピラジニル、３‐ピラジニル、５‐ピラジニル、６‐ピラジニル、２‐チアゾリル、４‐チアゾリル、５‐チアゾリルなどが含まれる。
【００７６】
一例として知られ、これらに限定されないが、複素環に結合した窒素は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２‐ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２‐イミダゾリン、３‐イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２‐ピラゾリン、３‐ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリンもしくは１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドールもしくはイソインドリンの２位、モルフォリンの４位およびカルバゾールもしくはβ‐カルボリンの９位に結合していてもよい。
【００７７】
一実施形態において、複素環に結合した窒素には、１‐アジリジル、１‐アゼテジル、１‐ピロリル、１‐イミダゾリル、１‐ピラゾリルおよび１‐ピペリジニルが含まれる。
【００７８】
用語“炭素環”は、単環として３〜８の炭素原子、二環として７〜１２の炭素原子および多環として３０以下の炭素原子を有する飽和の、不飽和のまたは芳香族の環に係るものである。単環式の炭素環は、典型的には３〜６員環原子を有しており、さらに典型的には５〜６員環原子を含んでいる。２環式の炭素環は、例えば、７〜１２員環原子を有しており、上記７〜１２員環原子は例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］または［６，６］系として配列されたものである。または、２環式の炭素環は、ビシクロ［５，６］または［６，６］系として配列された９もしくは１０員環原子を有している。
【００７９】
炭素環の一例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ‐１‐エニル、１‐シクロペンタ‐２‐エニル、１‐シクロペンタ‐３‐エニル、シクロヘキシル、１‐シクロヘキサン‐１‐エニル、１−シクロヘキサン‐２‐エニル、１‐シクロヘキサン‐３‐エニル、フェニル、スピリルおよびナフチルが含まれる。上記炭素環は、アルキル基について上述したように、任意に置換されていてもよい。
【００８０】
用語“アルカノイル”または“アルキルカルボニル”は‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒに係るものである。上記Ｒはすでに規定したアルキル基である。
【００８１】
用語“アシルオキシ”または“アルキルカルボキシ”は、‐Ｏ‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒに関するものである。上記Ｒはすでに規定したアルキル基である。アシルオキシ基の例には、これらに限定されないが、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシおよびペンタノイルオキシが含まれる。上記規定した何れのアルキル基であっても、アシルオキシ基を形成するために使用することができる。
【００８２】
用語“アルコキシカルボニル”は、‐Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（または“ＣＯＯＲ”）である。上記Ｒはすでに規定したアルキル基である。
【００８３】
用語“アミノ”は‐ＮＨ２に係るものである。アミノ基は、用語“置換された”として明細書で規定されるように、任意に置換されたものであってもよい。用語“アルキルアミノ”は、‐ＮＲ２に係るものである。少なくとも１つのＲは、アルキルであり、２つ目のＲは、アルキルまたは水素である。用語“アシルアミノ”は、‐Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒに係るものである。上記Ｒはそれぞれ独立して、水素、アルキルまたはアリールである。
【００８４】
用語“アミノ酸”には、合成されたアミノ酸（例えば、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ-カルボキシグルタミン酸塩；馬尿酸、オクタヒドロインドール‐２‐カルボン酸、スタチン、１，２，３，４‐テトラヒドロイソキノリン‐３‐カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α‐メチル‐アラニン、パラ‐ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシンおよびtert‐ブチルグリシン）と同様に、ＤまたはＬ体である天然アミノ酸の残基（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）が含まれる。
【００８５】
また、カルボキシ末端（例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、フェニルエーテル、フェニルエステル、フェニルアミド、ベンジルエーテル、ベンジルエステル、ベンジルアミドまたはα‐メチルベンジルアミドとしてのカルボキシ末端）が保護された天然のおよび合成されたアミノ酸と同様に、従来のアミノ保護基（例えば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を生じる天然のおよび合成されたアミノ酸が上記用語に含まれる。
【００８６】
他の適切なアミノ保護基およびカルボキシ保護基は、従来公知である（例えば、Greene, T.W.; Wutz, P.G.M. Protecting Groups In Organic Synthesis, 2ndedition, John Wiley & Sons, Inc., New York (1991) および当該文献の参照文献を参照）
用語“ペプチド”は、２〜３５のアミノ酸（例えば、上記規定された）の配列またはペプチド残基にて説明される。上記配列は、直鎖式または環式であってもよい。例えば、環式ペプチドが調製されてもよく、または、配列における２つのシステイン残基間において、ジスルフィドの架橋の形成から生じたものであってもよい。
【００８７】
ペプチドは３〜２０または５〜１５のアミノ酸を含んでいてもよい。ペプチド誘導体は、米国特許第４，６１２，３０２、４，８５３，３７１および４，６８４，６２０または本発明の実施例に開示された方法に従って調製されてもよい。特に、本明細書にて列挙されるペプチド配列は、アミノ末端を左に、カルボキシ末端を右に記載したものである。
【００８８】
用語“サッカライド”は糖または炭化水素に係るものであり、特に、単糖に係るものである。上記サッカライドは、Ｃ６‐ポリヒドロキシ化合物であり、典型的には、Ｃ６‐ペンタヒドロキシおよび通常、環式グリカールである。上記用語には、２または複数のモノサッカライド残基を有するポリサッカライドと同様に、公知の単糖およびそれらの誘導体が含まれる。
【００８９】
上記サッカライドは、アミノ酸の規定において上述したように、ヒドロキシル基上に保護基を含んでいてもよい。上記サッカライドのヒドロキシル基は、１または複数のハロまたはアミノ基によって置き換えられていてもよい。さらに、上記炭素原子の１または複数は、例えば、ケトまたはカルボキシル基に酸化されていてもよい。
【００９０】
用語“割り込まれた”とは、特定の炭素鎖の２つの隣接する炭素原子（および、それらが連結する水素原子（例えば、メチル（ＣＨ３）、メチレン（ＣＨ２）またはメチン（ＣＨ）））間に他の基が挿入されたことをいう。上記特定の炭素鎖は、用語“割り込まれた”を使用した表現に適用される。特定の原子の通常の原子価はそれぞれ、割り込みの結果生じる安定した化合物の原子化を超えない。
【００９１】
炭素鎖を割り込むことができる適切な置換基には、例えば、１または複数の非過酸化酸素（‐Ｏ‐）、チオ（‐Ｓ‐）、イミノ（‐Ｎ（Ｈ）‐）、メチレンジオキシ（‐ＯＣＨ２Ｏ‐）、カルボニル（‐Ｃ（＝Ｏ）‐）、カルボキシ（‐Ｃ（＝Ｏ）Ｏ‐）、カルボニルジオキシ（‐ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ‐）、カルボキシラート（‐ＯＣ（＝Ｏ）‐）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）およびスルホニル（ＳＯ２）を有する置換基が含まれる。アルキル基は、上記適切な置換基の１または複数（例えば、１、２、３、４、５または約６）によって割り込まれていてもよい。割り込みの箇所は、アルキル基の炭素原子と、アルキル基が連結している炭素原子との間とすることができる。
【００９２】
上記置換基の何れかに関し、１または複数の置換基が含まれていると理解される。もちろん、そのような置換基は、立体的に非現実的なおよび／または合成的に不可能な何れの置換基または置換パターンを含まない。さらに、本発明に係る化合物には、化合物の置換から生じる立体化学的な異性体を全て含む。
【００９３】
本明細書に記載された化合物において選択された置換基は、繰り返し利用可能な程度に存在する。この文において、“繰り返し利用可能な置換基”とは、置換基がそれ自体を他の例を列挙してもよいことを意味する。
【００９４】
医薬品化学および有機化学の当業者であれば、特定の化合物の所望の特性によって、そのような置換基の総数が合理的に制限されると理解できる。
【００９５】
そのような特性には、以下の例が含まれ、これらに制限されるものではないが、分子量、溶解性またはｌｏｇＰなどの物理物性、特定の標的に対する活性などの応用性、および、合成の容易さなどの実用性が挙げられる。
【００９６】
繰り返し利用可能な置換基は、本発明に係る所望の形態となっている。医薬品化学および有機化学の当業者であれば、そのような置換基の汎用性を理解できる。また、繰り返し利用可能な置換基が、本発明に係る請求項において存在する程度については、その総数は、上述したように決定されるであろう。
【００９７】
本明細書にて用いられる場合、用語「リンカー」は、２つの化学基を一緒に共有結合する炭素鎖である。この炭素鎖は、必要に応じて、自己切断することができるか、酵素のための基質に共有結合している場合、この酵素または別の分子によって切断され得る。このリンカーの炭素鎖は、必要に応じて、窒素原子、酸素原子、カルボニル基、（必要に応じて置換された）芳香環、またはペプチド結合が割り込んでいてもよい。
【００９８】
用語「ルシフェラーゼ」は、特に断りの無い限り、天然に存在するルシフェラーゼまたは変異ルシフェラーゼをいう。ルシフェラーゼは、天然に存在する場合、当業者によって生物から容易に取得され得る。ルシフェラーゼが天然に存在するものである場合、または天然に存在するルシフェラーゼとルシフェリンとの反応における活性を保持する天然に存在するルシフェラーゼの変異体である場合、これらのルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞などの培養物から容易に取得することができるか、あるいはこれらのルシフェラーゼをコードする核酸から当該ルシフェラーゼを作製するためのインビトロの無細胞系から容易に取得することができる。ルシフェラーゼは、プロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（マディソン、ＷＩ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））から入手することができる。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「バイオルミネッセンスを生じるアッセイ」または「バイオルミネッセンスを生じる反応」は、ルシフェラーゼでない酵素とルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体との間の反応の産物がルシフェラーゼのための基質である反応、あるいはルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体を有する非酵素的な反応の産物がルシフェラーゼのための基質である反応、あるいはルシフェラーゼとルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体との間の反応が、バイオルミネッセンスを生じる（すなわち、測定可能な量の光を生成する）反応を含んでいる。
【０１００】
本明細書で用いる場合、「バイオルミネッセンス」は、酵素と基質との間の光を発生させる反応の結果として生成された光である。このような酵素（バイオルミネッセンスの酵素）の例としては、ホタルのルシフェラーゼ、クリックビートルのルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ、ウミホタルのルシフェラーゼ、発光タンパク質であるエクオリン、および発光タンパク質であるオベリン（ｏｂｅｌｉｎ）などが挙げられる。
【０１０１】
本明細書で用いる場合、「バイオルミネッセンスを生じるアッセイの試薬」は、バイオルミネッセンスを生じる反応のための、基質、ならびに補助因子または他の分子（タンパク質（例えば酵素）など）を含んでいてもよい。
【０１０２】
「反応混合物」は、特定の反応のための全ての試薬を含んでいてもよいし、この反応のための上記試薬の少なくとも１つを欠いていてもよい。例えば、ルシフェラーゼの反応混合物は、ルシフェラーゼのための基質を除いた、反応のための試薬を含んでいてもよい。このような反応混合物は、例えば、テストサンプルがルシフェラーゼのための基質を有するか否かを決定するに有用な反応混合物である。ルシフェラーゼでない酵素のための反応混合物は、検出される分子を除いた、上記反応のための全ての試薬を含んでいてもよい。例えば、このような混合物は、ルシフェラーゼでない酵素のための補助因子を除いた、全ての試薬を含んでいる。それ故、この混合物を、テストサンプル中の補助因子の存在を検出するに有用であり得る。
【０１０３】
本明細書で用いる場合、「ルシフェリンの誘導体」または「アミノルシフェリンの誘導体」は、ルシフェラーゼでない酵素のための基質かつルシフェラーゼのプロサブストレートである分子、ルシフェラーゼのための基質である分子、ルシフェラーゼでない酵素のための基質かつルシフェラーゼのための基質である分子であるか、あるいは非酵素的な反応において生成された分子を検出するに有用な分子である。本発明の誘導体は、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの骨格（図１参照）の３つの環の１つ以上に対する修飾を１つ以上有しているか、および／または、これらの環の１つ以上に結合した置換基を有している。アセタールルシフェリン誘導体またはアセタールアミノルシフェリン誘導体は、Ｃ４のカルボキシル部分が修飾されてアセタール部分を形成している、ルシフェリンまたはアミノルシフェリンをいう。また、このような誘導体は、上記環の１つ以上に対する修飾、Ｃ６’のヒドロキシル基またはアミノ基に対する修飾、Ｃ６’のヒドロキシル基またはアミノ基上の置換、および／あるいは５、４’、５’または７’の位置の１つ以上における置換を含んでいてもよい。Ｂ環が修飾されて６員環を形成している場合、生じたＡ環またはＢ環上の任意の位置が、本発明のアセタール誘導体を提供するように、置換基を含んでいてもよい。Ｃ環のＣ４にアセタール部分を含んでいるこれらの誘導体の全ては、アセタールルシフェリン誘導体またはアセタールアミノルシフェリン誘導体であるとみなされる。
【０１０４】
細胞または組織に対して「ネイティブ」である酵素は、細胞または組織中に天然に存在する酵素をいう。
【０１０５】
＜ＩＩ．本発明の方法＞
本発明は、アセタールルシフェリン誘導体またはアセタールアミノルシフェリン誘導体を用いて、１つ以上の分子（例えば、酵素、酵素反応のための補助因子、酵素の基質、酵素の阻害物質、酵素の活性化物質）を検出する、バイオルミネッセンスを生じる方法を提供する。よって、本発明は、サンプル中の分子の量、活性または存在を検出するバイオルミネッセンスを生じるアッセイを提供する。
【０１０６】
上記方法は、例えば、サンプル中の少なくとも１つの分子（例えば、ルシフェラーゼでない酵素、ルシフェラーゼでない酵素のレギュレーター、ルシフェラーゼでない酵素の基質、および／または反応の補助因子）の存在または量を決定するために用いてもよいし、サンプルにおける状態を決定するための用いてもよい。このサンプルとしては、動物（例えば脊椎動物）、生理学的な流体（血液、血漿、尿および粘膜の分泌物など）、細胞、細胞溶解物、細胞懸濁液、または細胞の精製された画分（例えば細胞成分分画）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明に係る方法は、単一のサンプル（細胞または細胞溶解物のアリコートなど）中の１つ以上の分子を検出するための迅速な方法を提供する。一実施形態において、上記発明は、バイオルミネッセンスを生じるアッセイにおいて、分子（酵素、基質または補助因子）の存在、量または特異的な活性を定量化する工程を包含している。バイオルミネッセンスを生じるシグナルの強度は、それぞれの分子の存在または量の関数である。さらに、反応は、１つ以上のテスト用の作用物質（例えば、酵素の阻害物質、酵素の活性化物質）を含んでいてもよいし、および／あるいは異なる濃度の阻害物質または活性化物質を含んでいてもよい。一実施形態において、上記方法は、少なくとも２つの異なる反応を使用し、この場合、第１の反応がルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応であり、第２の反応がビートルのルシフェラーゼによって媒介される反応である。
【０１０７】
したがって、バイオルミネッセンスを生じるアッセイは、例えば、酵素によって媒介される反応のための補助因子、酵素、酵素の基質、酵素の阻害物質、または酵素の活性化物質の量、存在または特異的な活性を直接的にまたは間接的に検出してもよい（例えば測定してもよい）。例えば、一実施形態において、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアセタールルシフェリン誘導体（例えば、ＣＹＰ３Ａの基質である誘導体）は、ビートルのルシフェラーゼのための基質である産物を生成し、ＣＹＰ３Ａを検出するバイオルミネッセンスを生じるアッセイにおいて使用され得る。一実施形態において、この誘導体はビートルのルシフェラーゼのプロサブストレートであり、このプロサブストレートとは、ルシフェラーゼの基質である産物を生成するが、ビートルのルシフェラーゼとの反応においてそれ自体が相当な量の光を生成しないものである。
【０１０８】
一実施形態において、本発明は、１つ以上のルシフェラーゼでない酵素を検出するバイオルミネッセントアッセイの方法を提供する。この方法は、１つ以上のルシフェラーゼでない酵素、およびルシフェラーゼでないものによって媒介される反応のための基質または補助因子を有していると推定されるサンプルを、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体またはアミノルシフェリンの誘導体を含んでいる対応する反応混合物と接触させる工程を包含している。一実施形態において、この誘導体は、ルシフェラーゼでない酵素（例えばＣＹＰ３Ａ）のための認識部位を含んでいるＤ−ルシフェリンのＣ環に修飾を有しているものである。また、この誘導体は、必要に応じて、Ｄ−ルシフェリンのＢ環にも修飾を含んでおり、このような誘導体はルシフェラーゼのためのプロサブストレートである。このように、誘導体は、目的の酵素のための認識部位を含んでいる修飾を上述した環の１つに有していてもよいだけでなく、さらなる修飾をこの環または１つ以上の他の環に有していてもよい。さらなる修飾は、別の目的の酵素または分子のための認識部位を有していてもよいし、有していなくてもよい。
【０１０９】
誘導体が、ルシフェラーゼのためのプロサブストレートである場合（すなわち、誘導体とルシフェラーゼでない酵素との間の反応の産物がルシフェラーゼのための基質である場合）、ルシフェラーゼでない酵素とルシフェラーゼとのための連続して行われるまたは同時に行われる反応を実施してもよい。例えば、このプロサブストレートを含んでいる、ルシフェラーゼでない酵素のための反応を単一のウェルにて実施してもよい。そして、ビートルのルシフェラーゼの反応混合物をこのウェルに添加することができる。別の実施形態では、このプロサブストレートを含んでいるルシフェラーゼでない酵素のための反応混合物を単一のウェルにて実施し、そして、この反応物の一部をビートルのルシフェラーゼの反応混合物を有する、異なるウェルに添加する。また、反応を同一のウェルにて同時に実施してもよい。
【０１１０】
このように、本発明は、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の、サンプル中の存在または量を、検出または決定する方法を提供する。この方法は、サンプル、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための第１の反応混合物、およびルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体を接触させて、第１の混合物を生成する工程、またはルシフェラーゼのための基質である、ルミネッセンスを生じる産物を含んでいるこのような第１の混合物を提供する工程、またはこのような第１の混合物を提供する工程を包含している。一実施形態において、誘導体は式Ｉの化合物である。第１の混合物の少なくとも１部を、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための第２の反応混合物と接触させて、第２の混合物を生成する。次いで、第２の混合物におけるルミネッセンスを検出または決定し、これによって、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の、サンプル中の（例えば、コントロールと比較した）存在または量を検出または決定する。いくつかの実施形態において、例えば、誘導体とルシフェラーゼでない酵素との反応の産物がエステル基を有しており、この産物がルシフェラーゼのプロサブストレートである場合、サンプル、非ルシフェラーゼの反応混合物、またはルシフェラーゼの反応混合物は、エステラーゼを含んでいてもよい。エステラーゼは、第１の反応混合物と一緒に含まれていてもよいし、ルシフェラーゼの反応混合物の開始前に添加されてもよいし、ルシフェラーゼの反応混合物に含まれていてもよい。
【０１１１】
さらに、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の、サンプル中の存在または量を、検出または決定する方法が提供される。この方法は、サンプル、ルシフェラーゼでないものによって媒介される酵素反応のための反応混合物、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための反応混合物、ならびにルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体を接触させて、混合物を生成する工程を包含している。ルシフェラーゼでない酵素とこの誘導体との反応は、ルシフェラーゼのための基質である、ルミネッセンスを生じる産物を生成する。一実施形態において、この誘導体は式Ｉの化合物である。この混合物におけるルミネッセンスを検出または決定し、これによって、ルシフェラーゼでないものによって媒介される反応のための分子の、サンプル中の存在または量を、検出または決定する。
【０１１２】
本明細書に記載した、ルシフェリン誘導体を使用するバイオルミネッセンスを生じるアッセイはバックグラウンドがより低いので、より少ない量の（またはより多い量の）誘導体を使用することができ、これらの誘導体は例えばルシフェラーゼでない酵素との反応性が向上されていてもよい。さらに、本明細書に記載したバイオルミネッセンスを生じるアッセイの何れかに関し、他の試薬を反応混合物に添加してもよい。このような他の試薬としては、限定されないが、ルシフェラーゼの活性化を阻害するまたは防ぐ試薬、あるいはルミネッセンスのシグナルを拡大または増強する試薬が挙げられる。
【０１１３】
また、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のモジュレーターを同定するか、またはこのモジュレーターの効力を測定する方法も提供する。この方法は、１つ以上の作用物質、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための第１の反応混合物、およびルシフェラーゼでない酵素のための基質であるルシフェリンの誘導体を接触させて、第１の混合物を生成する工程、またはこのような混合物を提供する工程を包含している。１つ以上の作用物質が存在していない第１の混合物は、ビートルのルシフェラーゼのための基質である、ルミネッセンスを生じる産物を含んでいる。第１の混合物の少なくとも一部とビートルのルシフェラーゼによって媒介される反応のための第２の反応混合物とを混合して、第２の混合物を生成する。第２の混合物におけるルミネッセンスをコントロールの混合物と比較し、これによって、１つ以上の作用物質がルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応を調節するか否か、ならびに／または程度および効力がどのくらいであるのかを特定する。
【０１１４】
本発明の一実施形態において、本発明のルシフェリン誘導体を用いることによる酵素反応の、基質、補助因子、レギュレーター、阻害物質または活性化物質としての活性について、テスト化合物をスクリーニングし、その活性を評価することができる。反応混合物を誘導体およびテスト化合物と接触させることによって、候補となる化合物が反応のレギュレーターまたは基質であると決定してもよい。反応混合物を誘導体およびテスト化合物と接触させることは、テスト化合物が存在しない場合に、バイオルミネッセンスを生じるか、バイオルミネッセンスを生じる産物を生成する条件にて行う。
【０１１５】
本発明の一態様において、反応の基質と阻害物質とを区別する方法が提供される。例えば、化合物を少なくとも１つの酵素と一緒にインキュベートする。これは、該酵素の阻害物質または基質が存在しない場合に、ルシフェリン誘導体と該酵素とが相互作用するに適切な条件で、ルシフェリン誘導体を提供する前に、上記化合物の代謝を可能にする条件にて行う。一実施形態において、この反応の産物はルシフェラーゼの基質であり、ルシフェラーゼの存在下にて光を発する第２の反応をもたらす。もたらされた光を発する反応を、上記酵素の阻害剤が存在しない場合にルシフェリン誘導体とこの酵素とが相互作用するに適切な条件にてこの酵素を化合物および誘導体と接触したことによって得られた反応と比較する。上記化合物がこの酵素によって代謝されれば、アッセイの媒体中のこの化合物の濃度が低減し、この化合物が代謝されない条件と比べて、阻害活性が明らかに失われ得る。このことは、この化合物が酵素のための基質であったことを示す。代謝されない阻害性の化合物は、基質を追加した時間に関係なく、同じ効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を示す。
【０１１６】
本発明の一態様において、上記化合物を、まず、上記酵素と第１の所定の期間接触させることが好ましい。その後、この混合物をルシフェリン誘導体およびバイオルミネッセンスの酵素（例えばルシフェラーゼ）と同時にまたは同時期に接触させる。そして、この混合物を第２の所定の期間インキュベートする。
【０１１７】
本発明の別の態様において、上記化合物を上記酵素と、第１の所定の期間インキュベートして、第１の混合物を形成する。その後、第１の混合物をルシフェリン誘導体と接触させて、第２の混合物を形成し、第２の所定の期間インキュベートする。次いで、第２の混合物をバイオルミネッセンスの酵素（例えばルシフェラーゼ）と接触させて、第３の混合物を形成し、第３の所定の期間インキュベートする。その後、第３の所定の期間の間および／またはこの期間の後のルミネッセンスを、コントロール（例えば、化合物のない）反応と比較して測定することによって、上記酵素と上記化合物との相互作用に起因する活性を決定する。このようにして、例えば、第１の酵素の阻害物質に基づくメカニズムを特定することができ、阻害物質に基づかないメカニズムと区別することができる。これは、テスト化合物を用いるが、ルシフェリン誘導体を用いない第１のインキュベーションが、第１のインキュベーションを行わないときに比べて、阻害物質に基づくメカニズムによる深刻な阻害をもたらすか、あるいは、第１の反応の基質の基質の場合、阻害が低減されることを示すからである。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、細胞の酵素活性に対する化合物の効果を決定するための化合物をスクリーニングするための、細胞を基礎とする方法が提供される。テスト化合物を、上記酵素を天然に有する細胞または上記酵素を組換え発現によって有する細胞、ルシフェリン誘導体、およびバイオルミネッセンスの酵素（例えばルシフェラーゼ）と、所定の期間接触させるか、あるいは上記酵素とルシフェラーゼとを有する細胞、および上記誘導体と、所定の期間、接触させる。よって、一実施形態において、組換え酵素（バイオルミネッセンスの酵素（例えばルシフェラーゼ）など）を一過的にまたは安定に発現する細胞を使用してもよい。一過的にまたは安定にトランスフェクトされた細胞を作製するための任意の従来の方法を使用してもよい。一実施形態において、ルシフェリン誘導体を、細胞と接触させて、細胞内に導入する。そして、適切な分子が存在する場合、ルシフェラーゼのための基質である産物が生成する。ルシフェラーゼが細胞内に存在する場合、ルミネッセンスを検出することができる。また、ルシフェラーゼを欠いている細胞では、上記産物が細胞の外へ流出し、培地へ流入する。この培地にルシフェラーゼの反応混合物を添加する。その後、細胞と化合物との相互作用から生じた活性を、ルシフェラーゼの反応混合物のルミネッセンスをコントロール（テスト化合物を含んでいない）の反応混合物と比べて測定することによって決定する。
【０１１９】
本発明の一態様では、まず、化合物を細胞と所定の期間接触させることが好ましい。その後、この細胞を、ルシフェリン誘導体およびルシフェラーゼと同時にまたは同時期に接触させる。そして、混合物を第２の所定の期間、インキュベートする。反応混合物から生成したルミネッセンスの量をコントロールの反応混合物（例えばテスト化合物を含んでいないもの）と比べて測定することによって、酵素活性を決定する。本発明の別の態様では、まず、テスト化合物を細胞と所定の期間接触させることが好ましい。その後、この曝露した細胞をルシフェリン誘導体と接触させて、第２の所定の期間、インキュベートする。次いで、細胞をルシフェラーゼと接触させて、第３の混合物を形成する。この第３の化合物を第３の所定の期間インキュベートする。その後、細胞とテスト化合物との相互作用から生じた細胞の活性を、反応混合物のルミネッセンスをコントロールの反応混合物（例えばテスト化合物を含んでいないもの）と比較して測定することによって決定する。細胞の培地に存在する分子のための、細胞を基礎としてルミネッセンスを検出するアッセイは、ルシフェリン誘導体を有する反応混合物を細部の培地に添加する工程、または細胞の培地を、ルシフェリン誘導体を有する反応混合物に添加する工程と、ルミネッセンスを検出する工程とを包含している。細胞の培地に存在する分子は、例えば、細胞の培地に能動的に（ａｃｔｉｖｅｌｙ）または非能動的な機構（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を介して存在する分子である。
【０１２０】
本発明の細胞を基礎とするアッセイのさらに別の実施形態では、細胞を適切な溶解用の緩衝液にて溶解してもよい。例えば、界面活性剤を添加することによって、細胞を破裂させて、細胞の内容物を放出させることができる。動物細胞の場合、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００またはテルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）など）を０．１〜１．０％有する緩衝液であれば、通常、十分である。細菌細胞、植物細胞、真菌細胞または酵母細胞は一般に溶解させることがより困難である。界面活性剤、凍結融解のサイクル、低浸透圧性の緩衝液、超音波処理、キャビテーション（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）、またはこれらの方法の組み合わせを用いてもよい。溶解物を生成する溶解の方法は、ルシフェラーゼまたは他の酵素、あるいは他の分子または条件の検出に適合している。
【０１２１】
ルシフェラーゼでない酵素の存在または活性は、培養液にて増殖した細胞、または動物（例えば、生きている動物）内の細胞にて測定してもよい。動物内の細胞での測定のために、ルシフェリン誘導体を動物に投与してもよい（例えば、動物内に注入するか、動物が摂取する水溶液（例えば水）または食物に添加してもよい）。誘導体のルシフェラーゼの基質である産物への変換は、動物内の細胞（例えば、トランスジェニック細胞）にて発現したルシフェラーゼ、または動物に投与した（例えば動物内に注入した）ルシフェラーゼ、によって媒介されるルミネッセンスによって検出してもよいし、生理学的な流体（例えば、血液、血漿および尿など）または組織サンプルを回収し、この流体をルシフェラーゼの試薬と組み合わせることによって生じるルミネッセンスによって検出してもよい。
【０１２２】
１つ以上の部分または状態を検出するために、２つの反応を使用するアッセイを同時に（１つの工程で）行ってもよいし、連続的に（２つの工程で）行ってもよい。この部分としては、酵素などのタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）、基質、補助因子、あるいは酵素反応のための阻害物質または活性化物質が挙げられる。上記状態は例えば、酸化還元の状態である。連続的な反応を同一の容器（例えば、マルチウェルプレートのウェル）にて行ってもよい。二段階のアッセイに関し、第１の反応混合物は、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための試薬を全て含んでいてもよいし、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための試薬を全て含んでいなくてもよい。含まれない試薬の１つは、サンプル（例えば細胞溶解液）中にて検出されるものである。例えば、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応は、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であり、かつルシフェラーゼの基質であるルシフェリン誘導体を、ルシフェラーゼの基質である産物に変換するに効果的な条件下にて行う。第１の反応を、ルシフェラーゼの反応混合物の添加の時点、またはこの添加の前に停止してもよい。例えば、第１の反応のクエンチャーが、ルシフェラーゼの反応混合物中に存在してもよい。ルシフェラーゼの反応混合物は、ルシフェラーゼのための基質を実質的に欠いていることが好ましい。例えば、ルシフェラーゼのための基質の唯一の供給源は、ルシフェラーゼでない酵素と誘導体との間の反応によって提供される。第１の反応のための試薬の全てが第１の反応混合物に存在する場合、反応を変える部分（例えば、反応の阻害物質またはエンハンサー）を特定するためにアッセイを使用してもよい。反応を行った後に、同時にまたは連続的に、１つ以上の分子あるいは反応の１つ以上の阻害物質または活性化物質の存在または量を検出または決定する、ならびに／あるいは程度および／または効力がどれくらいであるのかを検出または決定する。
【０１２３】
一段階のアッセイの場合、反応混合物は、２つの反応のための試薬を含んでいてもよい。このような２つの反応のための試薬は、例えば、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための試薬およびルシフェラーゼによって媒介される反応のための試薬であるか、あるいは、非酵素的な反応のための試薬およびルシフェラーゼによって媒介される反応のための試薬である。
【０１２４】
２つの反応を使用するアッセイの場合、アッセイのための分子を添加する順番を変更することができる。反応が開始され、連続的に行われた場合（同一の容器内であってもよいし、同一の容器内でなくてもよい。）、反応条件（例えば、試薬の濃度、温度またはさらなる試薬）を調整してもよい。例えば、反応停止剤（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または反応促進剤（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を反応と反応との間に添加してもよい（例えば、米国特許第５，７４４，３２０号明細書（Ｓｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．）および米国特許第６，５８６，１９６号明細書（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）参照、なお、これらの文献の開示は参考として本明細書に特に援用される。）。一実施形態では、２つ以上の反応を単一の反応混合物にて同時に実施する。必要に応じて、アッセイは均一なアッセイである。例えば、成分は、混合物をサンプルに添加する前に混合されている。試薬をさらに移動することなく結果を読んでもよい。
【０１２５】
したがって、本発明のアッセイは、サンプル中の１つ以上の分子または状態の検出を可能にする。例えば、このサンプルは、真核細胞、原核細胞、２つ以上の異なる生物からの細胞、細胞溶解物またはその上清を含んでいるか、または標準曲線を作成するに有用な精製された形態の分子を含んでいる。真核細胞は、例えば、酵母細胞、鳥類細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞としては、限定されないが、ヒトの細胞、サルの細胞、マウスの細胞、イヌの細胞、ウシの細胞、ウマの細胞、ネコの細胞、ヒツジの細胞、ヤギの細胞、またはブタの細胞が挙げられる。精製された形態の分子は、例えば、精製されたルシフェラーゼでない酵素である。
【０１２６】
細胞は、組換え技術によって遺伝学的に変更されていなくてもよいし（非組換え細胞）、組換えＤＮＡおよびを一過的にトランスフェクトされた組換え細胞であってもよいし、ならびに／またはゲノムが組換えＤＮＡによって安定に増加した細胞であってもよい。また、このゲノムは、遺伝子が破壊されるように修飾されたゲノム、例えば、プロモーター、イントロンまたはオープンリーディングフレームが破壊されるように修飾されたゲノムであるか、あるＤＮＡフラグメントを別のものと置換したゲノムである。組換えＤＮＡまたは置換されるＤＮＡのフラグメントは、本発明の方法によって検出される分子をコードしていてもよいし、検出される分子のレベルまたは活性を変更する部分をコードしていてもよいし、および／あるいはこの分子に関係のない遺伝子産物、またはこの分子のレベルもしくは活性を変更する部分に関係のない遺伝子産物をコードしていてもよい。
【０１２７】
本発明の誘導体は、他の反応を検出するために使用することができる化合物を含んでいる。例えば、本方法によって検出される分子または状態としては、限定されないが、酵素によって媒介される反応の酵素、基質、阻害物質、補助因子または活性化物質、活性酸素種、還元状態（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、転写制御因子、または遺伝子の転写の制御因子が挙げられる。上記酵素としては、例えば、デメチラーゼ、オキシダーゼ（例えばＭＡＯ）、デアセチラーゼ、デホルミラーゼ、プロテアーゼ（プロテオソーム、カルパイン、ベータセクレターゼ、カテプシン、カルパイン、トロンビン、グランザイムＢ）、ホスファターゼ、キナーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスフェラーゼ（例えばＧＳＴ）、スルホターゼ（ｓｕｌｆｏｔａｓｅ）、ベータラクタマーゼ、チトクロムＰ４５０酵素、エステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ）、デヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼが挙げられる。
【０１２８】
本方法において使用される酵素（検出される酵素であってもよいし、基質または補助因子を検出するに有用な酵素であってもよい。）は、組換え酵素および内因性の酵素（ネイティブな酵素）を含んでいる酵素の任意の組み合わせから選択することができる。一実施形態において、検出される酵素は内因性の酵素である。他の実施形態において、この酵素は組換え酵素である。当業者にとって自明な他の組み合わせを、本明細書の教示にしたがって、本アッセイおよび本方法に使用することができる。酵素としては、限定されないが、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ、デアルキラーゼ、デホルミラーゼおよびグリコシダーゼが挙げられる。酵素は、ヒドロラーゼ、オキシドレクターゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ（例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ）、イソメラーゼ、リガーゼ、シンターゼ、アルカリホスファターゼまたは酸性ホスファターゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、またはβ−Ｄ−グルコシドゥロナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｕｒｏｎａｓｅ）であってもよい。生理学的意義を有する種類の酵素は特に関心がある。これらの酵素としては、プロテインペプチダーゼ、エステラーゼ、プロテインホスファターゼ、グリコシラーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ、メチラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ（ｓｕｌｐｈａｔａｓｅｓ）、ウレアーゼ（酸性ホスファターゼが挙げられる。）、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびカルボキシエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）などが挙げられる。関心のある酵素としては、エステルを作製することに関与する酵素、またはエステルを加水分解することに関与する酵素、グリコシル化に関与する酵素、およびアミドを加水分解することに関与する酵素が挙げられる。なお、エステルは有機エステルおよび無機エステルの両方である。任意の種類において、さらなる細分化があり得る。
【０１２９】
＜ＩＩＩ．ルシフェリン誘導体＞
本発明に係るバイオルミネッセンスの基質は、ルシフェリンのまたはアミノルシフェリンのアセタール誘導体を含む。このような化合物には、以下の一般式で示す化合物が含まれる。
【０１３０】
一実施形態において、本発明は式Ｉの化合物を提供する。
【０１３１】
【化２】

(I)
【０１３２】
上記式（Ｉ）において、
Ｙは、Ｎ、Ｎ‐オキシド、Ｎ‐（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはＣＨであり；
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨまたはＣＨ＝Ｎであり；
Ｘ＊はそれぞれ独立してＯまたはＳであり；
Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立して、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、ハロアリールもしくは複素環であるか、または、Ｒ’およびＲ”は共に環式部分を形成しており；
Ｒ’およびＲ”は、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルコキシ、オキシ、アミノ、ハロ、カルボキシル、チオ、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、ハロアリールまたは複素環で任意に置換されていてもよく、
Ｚは、Ｈ、ＯＲ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲであり；
Ｗ１はＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、ヒドロキシルもしくは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、ｎは１、２または３であるか、または
Ｗ１およびＺは、環Ａにおいて共にケト基を形成しており、環Ａにおいて任意の結合を示す破線の少なくとも１つが存在せず；
Ｗ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルケニル、ヒドロキシルまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり;
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４はそれぞれ独立して、ＣＨ、Ｎ、Ｎ‐オキシド、またはＮ‐（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｋ１とＫ２との間およびＫ３とＫ４との間の破線は、任意の結合を示し、何れかのＣＨの炭素が置換されているとき、Ｈは存在せず、
環Ｂにおける破線は、任意の二重結合であり、
Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルコキシ、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、ハロアリール、複素環、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルスルホニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールスルホニル、ハロアリールスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルスルフィニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールスルフィニル、ハロアリールスルフィニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２、トリ（Ｃ１〜Ｃ２０）アンモニウム（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、ハロアリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、第４級窒素を有するハロアリール、第４級窒素を有するハロアリールカルボニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールチオ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルリン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールリン酸塩、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはサッカライドあるか、または、ＺがＮＲＲであるとき、Ｎと共にＲＲは任意にハロアリール基または複素環基を形成しており；
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ハロアリールまたは複素環基は何れも、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、‐ＣＯＯＲｘ、‐Ｓ（Ｏ）Ｒｘ、‐ＳＯ２Ｒｘ、‐ＳＯ３Ｒｘ、ニトロ、アミノ、リン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルリン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル）２、メルカプト、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルチオ、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ハロアリールまたは複素環から選ばれる１、２、３、４または５の置換基によって任意に置換されていてもよく、
上記ＲｘがＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、複素環もしくはハロアリールまたはこれらの塩であり、上記それぞれの置換基は１〜３のＲ基によって任意に置換されていてもよく；
上記Ｚが窒素部分を含むとき、Ｚの窒素部分の水素の１または両方は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは置換基Ｌによって置き換えられていてもよく；
上記置換基Ｌは、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアミノ酸ラジカル、２０以下のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルまたはその他の低分子であり；
上記Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の水素または窒素部分が、（ＨＯ）２Ｐ（Ｏ）‐ＯＣＨ２‐、スルホ、‐ＰＯ３Ｈ２または１〜約１２の炭素原子の炭素鎖を介してＺ基に連結しているセファロスポラニン酸によって置き換えられていてもよく、
上記Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の１つの水素または窒素部分が、Ｌ’基‐リンカーによって置き換えられていてもよく；
上記Ｌ’基は、リンカーを固定しない酵素によって除去可能であり、リンカーは自己切断性を有し、１または複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、任意で置換されている芳香族環またはペプチド結合によって任意に割り込まれていてもよい炭素鎖であり；
上記リンカーは、リンカーの１つの末端にて、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ’基と連結されており、リンカーの他の末端は、Ｚ基とエーテル、エステルまたはアミド結合を形成しており；
上記ＺがＯＲであるとき、式Ｉは任意で、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して２つの環Ａに結合されたダイマーであってもよく；
上記リンカーは、式Ｉのダイマー間において、架橋を形成する１〜４の酸素原子、窒素原子または任意で置換されていてもよいアリール、ハロアリールまたは複素環基によって割り込まれていてもよく、式Ｉのダイマーに結合している上記それぞれのＺ基のＲ基は、架橋によって置き換えられている化合物。
【０１３３】
第４級窒素または他のカチオン種が式Ｉにおいて存在するとき、Ａ−のようなアニオンが存在してもよい。アニオンＡ−は好適な対イオンとなり得るものであり、アニオンＡ−としてハロゲン、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩または炭酸塩などの有機アニオンなどが挙げられる。
【０１３４】
ある実施形態において、本発明の方法に係る化合物には、ルシフェリンまたはアミノルシフェリンなどのルミネッセンスの基質が含まれる。また、他の実施形態において、式Ｉは、ルシフェリンまたはアミノルシフェリンを排除している、および／または、一例としてＲ基の規定にて列挙された１または複数の特定の置換基を排除することもできる。
【０１３５】
式Ｉによって示されるように、環Ａおよび環Ｂの核となる構造は、多数の異なる環系であってもよい。環Ｂの変形例として、核となる構造は、Ｎ‐オキシドおよびＮ−アルキル誘導体を含む、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾキサゾール、ナフタレン、キノリン、イソキノリン、キナゾリンおよびキノキシリン環系を含むことが許容される。
【０１３６】
また、環Ｂの変形例は、ベンゾ［ｄ］チアゾールのＮ‐オキシドおよびＮ‐アルキル誘導体へ接触することができる。
【０１３７】
さらには、Ｎ、Ｎ‐オキシドまたはＮ‐アルキルを備える式Ｉにおいて、環Ａの炭素原子を置換することによって（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３またはＫ４の値を他の値に置換する）、他の環系を得ることができる。例えば、１，８‐ナフチリジン、１，７‐ナフチリジン、１，６‐ナフチリジンおよび１，５−ナフチリジン環系；ピリド［３，２‐ｂ］ピラジン、ピリド［４，３‐ｂ］ピラジン、ピリド［３，４‐ｂ］ピラジンおよびピリド［２，３‐ｂ］ピラジン環系；ピリド［２，３‐ｄ］ピリミジン、ピリド［３，４‐ｄ］ピリミジン、ピリド［４，３‐ｄ］ピリミジンおよびピリド［３，２‐ｄ］ピリミジン環系；ベンゾ［ｄ］オキサゾール、オキサゾロ［４，５‐ｂ］ピリジン、オキサゾロ［４，５‐ｃ］ピリジン、オキサゾロ［５，４‐ｃ］ピリジンおよびオキサゾロ［５，４‐ｂ］ピリジン環系；並びにチアゾロ［４，５‐ｂ］ピリジン、チアゾロ［４，５‐ｃ］ピリジン、チアゾロ［５，４‐ｃ］ピリジンおよびチアゾロ［５，４‐ｂ］ピリジン環系を得ることができる。
【０１３８】
Ｎ、Ｎ‐オキシドまたはＮ‐アルキルを有する環Ａの第２炭素を置換することによって、対応するピラジン、ピリミジンおよびピリダジン環Ａ誘導体が上述の環系のそれぞれが得られることも式Ｉは示している。
【０１３９】
Ｎ、Ｎ‐オキシドまたはＮ‐アルキルを有する環Ａの第３炭素の置換により、対応する１，２，４‐トリアジン環系誘導体を得ることができる。式Ｉには、さらに、それ自体の環系のそれぞれの種々のジヒドロ、テトラヒドロおよびヘキサヒドロ誘導体が含まれる。
【０１４０】
また、式Ｉには、種々のアセタール、チオアセタールおよび混合アセタール種が含まれる。したがって、ある実施形態において、Ｘ＊はそれぞれＯである。また、Ｘ＊の両方がＳであってもよい。また、ある実施形態において、一方のＸ＊がＯであり、他方のＸ＊のがＳである。
【０１４１】
式Ｉの化合物の追加例には、式II〜式IVの化合物が含まれる。一実施形態において、本発明に係る化合物には、式IIの化合物式が含まれる：
【０１４２】
【化３】

【０１４３】
(II)
上記式(II)において、
Ｙは、ＮまたはＣＨであり；ＸはＳまたは‐ＣＨ＝ＣＨ‐であり；Ｗ１はＨまたはハロであり、４つ以下のＷ１置換基が存在してもよく；
Ｚ、Ｒ’およびＲ”は式Ｉにて規定される通りである。ある実施形態において、Ｗ１はＦであり、Ａ環において、１，２，３または４のＦ基が存在していてもよい。
【０１４４】
本発明の化合物には、式IIIの化合物も含まれる：
【０１４５】
【化４】

【０１４６】
(III)
上記式(III)において、
Ｗ１はＨまたはハロであり、４つ以下のＷ１置換基が存在してもよく、Ｚ、Ｒ’およびＲ”は式Ｉにて規定される通りである。
【０１４７】
本発明の化合物には、式IVの化合物も含まれる：
【０１４８】
【化５】

【０１４９】
(IV)
上記式(IV)において、
Ｒ’およびＲ”は式Ｉにて規定される通りである。式Ｉ〜式IVのそれぞれに係るＲ’およびＲ”、または共になったＲ’およびＲ”の一例には、任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールが含まれる。
【０１５０】
例えば、上記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルは、直鎖の、分岐のまたは環式の（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基であってもよい。上記アルキル基としては、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルが挙げられる。
【０１５１】
上記（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール基は、例えば、ベンジルまたはフェニルエチルであってもよい。置換基の規定において上述したように、Ｒ’またはＲ”基は、１または複数（例えば、１〜約５）の置換基にて置換されていてもよい。
【０１５２】
一例には、例えば、アルキル-アミノおよびジアルキル-アミノ基、並びに／または、フェニルおよびナフチルを含むアリール基を含むハロまたはアミノ基が含まれる。
【０１５３】
共になったＲ’およびＲ”は、環式アセタールが形成されていてもよい。上記環式アセタールとしては、（Ｃ１〜Ｃ１２）ジオールまたはジアルコキシアリール化合物から形成されたものが挙げられ、１，２‐ジメトキシベンゼン（ベラトロール）が挙げられる。環式アセタールには、上記環において、Ｏ、ＳまたはＮのような、（アセタールヘテロ原子以外の）１〜約３つのヘテロ原子が含まれていてもよい。上記環は、例えば、メチルまたはフェニル基などの種々の置換基によって、置換されていてもよい。
【０１５４】
式I-IVの代表的な化合物は、以下の何れかを含む；
【０１５５】
【化６】

【０１５６】
【化７】

【０１５７】
【化８】

【０１５８】
他の誘導体およびルミネッセンスを生じるアッセイにおける上記誘導体の使用については、以下に説明する。
【０１５９】
本明細書に記載のルシフェリン誘導体を使用すれば、ルシフェラーゼでない分子との相互作用によって光学特性の測定可能な変化をもたらすアッセイを用いることができる。この相互作用はルシフェリン誘導体の構造を変えることもある。本明細書に記載したように、ルシフェリン誘導体とルシフェラーゼでない酵素または目的の他の酵素との間の反応の産物は、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンである必要がない。例えば、ルシフェリン誘導体は、ルシフェリンまたはアミノルシフェリンに化学的なリンカーを介して連結された、ルシフェラーゼでない酵素のための化学的な反応基を含んでいる基質を含んでいてもよい。ルシフェラーゼでない酵素による誘導体の化学的な反応基の変形は、この基質の一部、化学的なリンカーの一部、化学的なリンカー、またはこの基質と化学的なリンカーとの一部を含んでいる（保持している）産物を生成し得る。この産物は、ルシフェラーゼのための基質である。
【０１６０】
ルシフェリン誘導体に対する向上した特性を提供するため、上述したようにチアゾール環のカルボキシ位において修飾を行うと同様に、環構造においてルシフェリン骨格がさらに修飾されるルシフェリン誘導体が供給され、例えば、キノリルまたはナフチルルシフェリンである。
【０１６１】
ある修飾を有する誘導体は、あるルシフェラーゼでない酵素または分子を規定し、または、あるルシフェラーゼでない酵素または分子に対するアッセイを改善する。よって、本発明のルシフェリン誘導体を用いるバイオルミネッセンスの方法を、１つ以上の分子（例えば、酵素、酵素反応のための補助因子、酵素の基質、酵素の阻害物質または酵素の活性化物質）を検出するために用いることができる。
【０１６２】
本発明に係る誘導体は、ある種のルシフェリン、キノリニルルシフェリン、アミノキノリニルルシフェリン、ナフチルルシフェリンおよびこれらのフッ素化された誘導体を含む。例えば、上記アミノキノリニルルシフェリンのフッ素化された誘導体の光学特性は、フッ素の電子吸引力により変化させられ得る。フッ素化された誘導体は、式Vおよび式VIの化合物を含む：
【０１６３】
【化９】

【０１６４】
（Ｖ）
上記式(V)において、
Ｘ＝ＯまたはＮＨであり；Ｙ＝ＮまたはＣＨであり；Ｆが、３’、４’、５’、７’または８’位に存在してもよい；
【０１６５】
【化１０】

【０１６６】
（VI）
上記（VI）において、Ｘ＝ＯまたはＮＨであり；Ｆが、４’、５’または７’；Ｒは、式Ｉで規定された通りであってもよい。
【０１６７】
一実施形態において、本発明はキノリニル誘導体（式VII〜式XIの化合物）を提供する：
【０１６８】
【化１１】

【０１６９】
上記式式VII〜式XIにおいて、ＯＲまたはＮＲ２は、キノリニル環上の何れかの水素に置き換えられてもよく、ある実施形態では、６’および／または８’位において置き換えられ、Ｒは、式Ｉで規定された通りであってもよい。
【０１７０】
一実施形態において、Ｋ１〜Ｋ４のそれぞれはＣＨまたはＣ（例えば、置換された場合、Ｃであり、置換されていない場合、ＣＨである。）である。いくつかの実施形態において、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、またはＫ４の１つはＮ−オキシドであり、ＺはＨ、ＯＨ、またはアミノである。また、ＺはＯＲであってもよいし、任意に置換されたアミノであってもよい。いくつかの実施形態において、１、２、３、または４のＷ１基が存在している。各Ｗ１は独立して例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであってもよい。
【０１７１】
一実施形態において、各Ｘ＊はＯである。別の実施形態において、少なくとも１のＸ＊はＳである。一実施形態において、Ｒ’およびＲ’’は互いに独立して、任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである。一実施形態において、Ｒ’およびＲ’’は、これらが結合する−Ｘ＊−ＣＨ−Ｘ＊−と一緒に、５員環〜１２員環の任意に置換された複素環基を形成する。５員環〜１２員環の任意に置換された複素環基の１以上のメンバーは、Ｘ＊に加えて、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであってもよい。なお、ＲはＨまたは（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである。一実施形態において、Ｒ’およびＲ’’は、オルソに融合されたベンゾ基によって任意に置換された環式のアセタールを形成する。
【０１７２】
一実施形態において、Ｙは、ＮまたはＣＨであり；ＸはＳまたはＯであり；環Ｂにおける破線は二重結合を形成するように存在している。いくつかの実施形態において、環Ｂは６員環であり：ＹはＮまたはＣＨであり；ＸはＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨ、またはＣＨ＝Ｎであり；環Ｂにおける破線は二重結合を形成するように存在している。
【０１７３】
一実施形態において、ＺはＯＨまたはＯＲであり、上記Ｒは、任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールまたは（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル‐（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール基である。ある実施形態では、ＺはＯＲであり、Ｒは、１〜５のハロ、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、リン酸塩、アルキル、アルキルカルボキシルまたはアルコキシカルボニル基によって任意に置換されたフェニルまたはベンジルである。
【０１７４】
一実施形態において、ＺはＮＲＲであり、Ｒはそれぞれ、Ｈ、任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルまたは窒素保護基である。
【０１７５】
一実施形態において、Ｘ＊はそれぞれＯであり、Ｚは、ＯＲであり、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである。
【０１７６】
一実施形態において、Ｘ＊はそれぞれＯであり、ＺＺはＮＲＲであり、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである。
【０１７７】
一実施形態において、ＹはＮであり；ＸはＳまたは‐ＣＨ＝ＣＨ‐であり；Ｗ１がＨ、ＦまたはＣｌであり、３以下のＷ１置換基が存在し；Ｗ２がＨであり；Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４全てＣまたはＣＨであり；Ｚ’、Ａ’およびＢ’がそれぞれ存在しない。
【０１７８】
一実施形態において、ＹがＮであり；ＸがＳであり；Ｘ＊がＯである。
【０１７９】
一実施形態において、上記Ｚが環Ａの６’位に存在し、上記Ｚが、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＭｅ２またはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；上記Ｗ１が上記環Ａの５’位におけるＨ、ＦまたはＣｌである。
【０１８０】
また、ある実施形態において、Ｒは、２‐ヒドロキシエチル、３‐ヒドロキシプロピル、４‐ヒドロキシブチル、５‐ヒドロキシペンチル、６‐ヒドロキシヘキシル、８−ヒドロキシオクチルまたは１０‐ヒドロキシデシルなどのヒドロキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキル基であってもよい。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ４〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ１２）アルキル、または（Ｃ８〜Ｃ１２）アルキルであってもよい。具体的な例は、上述したアルキルの定義にて示されている。アルキル基は、種々の基（他のＲ基またはさらなるＲ基が挙げられる。）で置換されていてもよい。例えば、アルキル基の末端の炭素は、ヒドロキシ基またはアルコキシ基および／あるいはオキソ基によって置換されていてもよい。したがって、Ｒ基は、酢酸メチルまたは酢酸などのアルキルカルボン酸塩であってもよい（例えば、アルキル基が末端の炭素において酸化されている。）。他の末端のカルボン酸のＲ基は、Ｃ４およびＣ６の誘導体を含む。他のＲ基は、アミノ基、アンモニウム基、アジド基、またはアセチルアミノ基で終了するアルキル基であってもよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、Ｒは、アラルキル基（例えば、アリール（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル）であってもよい。例としては、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチル、フェニルヘキシル、フェニルオクチル、およびフェニルデシルなどが挙げられる。フェニル基および／またはアルキル基は、例えば１以上の置換基によって置換されていてもよい。置換基は他のＲ基であってもよいし、さらなるＲ基であってもよい。アリールまたはフェニルの置換基の例としては、１、２、または３の−ＮＲａＲｂ基が挙げられる。ＲａおよびＲｂは互いに独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アリール（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシカルボニル、または窒素保護基（ベンジル、ベンゾイル、またはカルボニルベンジルオキシ）である。フェニル基は、上記式の残りの部分に結合するこのフェニル基のポイントに対してオルソ、メタ、またはパラで置換されていてもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、式Ｉは、ダイマーを提供するように、第２の式Ｉに連結されていてもよい。ダイマーは、例えば、各アセタール誘導体のＡ環に結合したＺ基によって一緒に連結されたものであっても。Ｚ基は、２つのアセタール誘導体の間のリンカーであり得る。例えば、Ｚは、ＯＲであってもよい。Ｒは、式Ｉの部分の間の架橋を形成するための二価のリンカーであり、例えば、任意に置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルジラジカルなどである。この二価のリンカーは、必要に応じて、１〜４のＯ原子またはＮ原子によって割り込まれているか、あるいは必要に応じて、アリール基、ハロアリール基、または複素環基によって置換されている。いくつかの実施形態において、リンカー（（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルなど）は、１〜４のオキソ基および／または１〜４のヒドロキシル基、あるいは他の適切な任意の置換基によって置換されていてもよい。このように、式Ｉの二量体のうちの式Ｉの部分を接続するＺ基のＲ基は、リンカー（架橋と称することもできる。）によって置き換えられている。本発明のアセールのダイマーの例には、以下の化合物が含まれる。
【０１８４】
【化１２】

【０１８５】
【化１３】

【０１８６】
【化１４】

【０１８７】
および
【０１８８】
【化１５】

【０１８９】
Ｒ’およびＲ’’は式Ｉについて規定されたものである。これらのダイマーは、環化工程において、Ｄ−システインの代わりにアセタールアミノチオールを用いて、モノマーの式Ｉの化合物と類似する技術によって調製することができる。いくつかの実施形態において、アセタールの酸素原子の１以上（例えば、１、２、３または４）が、硫黄原子と個々に置換されていてもよい。
【０１９０】
＜ＩＶ．ルシフェラーゼによって媒介される反応における光の発生を安定化するに有用な作用物質＞
有機的な作用物質は、本明細書に記載した特定の反応（ルシフェラーゼによって媒介される反応が挙げられる。）における光の発生を安定化するに有用であり得る。有機的な作用物質としては、特定の有機化合物（すなわち、１つ以上の炭素原子を含んでいる化合物）が挙げられる。このような作用物質は、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応またはルシフェラーゼによって媒介される反応の開始の前、開始時、および／またはこれらの反応の間に添加してもよい。適切な有機化合物およびそれを使用する方法としては、米国特許第７，１１８，８７８号明細書（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されているものが挙げられる。なお、この文献の開示は、参考として本明細書に援用される。
【０１９１】
本発明の別の態様において、ルミネッセンスに基づく反応を安定化するための試薬、方法およびキットが提供される。特定のルシフェラーゼを安定化する分子（ルシフェラーゼの可逆的な阻害物質など）は、ルシフェラーゼ酵素の自身が触媒する公知の自動的な分解に対する保護効果を発揮し得る。これによって、ルミネッセンスのシグナルを延長させて、反応混合物のバッチ処理を容易にする。ルミネッセンスに基づく反応を安定化するために適切な試薬、方法およびキットは、米国特許出願公開第２００４／０１７１０９９号明細書（Ｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。この文献の開示は参考として本明細書に援用される。
【０１９２】
＜Ｖ．キット＞
本発明は、サンプル中の１つ以上の分子の存在または活性を検出するためのキット、あるいはサンプルにおける状態を検出するためのキットも提供する。これらの分子は、反応のための試薬であるか、反応を増強または阻害するものである。これらのサンプルとしては、インタクトな細胞（ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ）、細胞溶解物（例えば、少なくとも部分的に精製された溶解物）、または細胞の上清が挙げられる。一実施形態において、このキットは本発明の化合物を備えている。以下のルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体（例えば、本明細書に記載されたようなアセタール化合物）、別の基質、酵素（例えばエステラーゼ）、または反応混合物の２つ以上を備えている本発明のキットに関し、それぞれは別々の容器に備えられていることができる。いくつかの成分は、いくつかの容器内にて組み合わせられていてもよいし、これらは単一の容器に備えられていてもよい。
【０１９３】
キットは、必要に応じて、アッセイに使用するに適切な緩衝溶液、および化合物または酵素を備えていてもよい。緩衝溶液は必要に応じて単一の容器に備えられていてもよい。誘導体および緩衝溶液は必要に応じて単一の容器に備えられていてもよい。また、キットは必要に応じてバイオルミネッセンスを生じない反応のための消光剤（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を備えていてもよい。キットは、必要に応じて、必要なまたは任意の補助因子のいくつかまたは全てと一緒にアッセイされるルシフェラーゼでない酵素をさらに備えていてもよい。また、キットは、本明細書に記載した化合物による第１の反応の産物を検出するための、ルシフェラーゼの反応混合物を備えていてもよい。さらに、キットは、使用のためのプロトコールまたは説明書を備えていてもよい。
【０１９４】
本発明を以下の限定しない実施例によって説明する。
【０１９５】
〔実施例〕
＜材料および方法＞
以下の材料および方法を実施例１および２に記載した実験に用いた。
【０１９６】
（材料）
プロルシフェリンアセタールである化合物を調製した。実施例１および２にて試験したこれらの化合物に、任意の数字表示３３２０、３３５７、３３５８、３３５９、３３６３、３３６４、３３６５、３３６６、３３７７、３３８７、３３９１、３３９７および３４０３を与えた。これらの化合物の構造を図２および図８〜２０に示す。
【０１９７】
ルシフェリン−ＰＰＸＥ：（Ｓ）−２−（６−（３−（（４−フェニルピペラジン−１−イル）メチル）ベンジルオキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、ルシフェリン−ＰＦＢＥ：（Ｓ）−２−（６−（ペルフルオロベンジルオキシ）−ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、およびルシフェリン−ＢＥ：（Ｓ）−２−（６−（ベンジルオキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸をプロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手した。Ｐ４５０酵素は、Ｐ４５０レダクターゼと一緒にＰ４５０酵素が共発現した、昆虫細胞の発現系からの膜画分として提供される（スーパーソーム（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標））；ディスカバリーラボウェア（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ））。ＣＹＰ２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｅ１、２Ｊ２、３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７、４Ｆ２、４Ｆ３Ａ、４Ｆ３Ｂおよび４Ｆ１２の膜画分も、共発現されたチトクロムｂ５を含んでいる。コントロールの細胞は、Ｐ４５０酵素を発現しない膜調製物であり、Ｐ４５０酵素と同じ昆虫細胞発現系から調製される（コントロールスーパーソーム（ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標））；ディスカバリーラボウェア（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ））。
【０１９８】
２つの成分からなるルシフェリンの検出試薬（ＬＤＲ）はプロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて市販されている。すなわち、第１の成分は、組換えのホタルのルシフェラーゼの、凍結乾燥した調製物からなる。第１の成分は、第２の成分（ルシフェラーゼの反応緩衝剤）によって復元される。ルシフェラーゼの反応緩衝剤は、ＡＴＰ、ルシフェリンエステルとＰ４５０との反応産物を処理するための活性なエステラーゼ、およびＰ４５０酵素の活性を停止するための界面活性剤を含んでいるＬＤＲは、プロルシフェリンをルシフェリンにＰ４５０依存的に変換することを検出するために用いる。
【０１９９】
１６歳のヒトのドナーから採取されたヒト肝細胞は、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）から購入した。
【０２００】
（方法）
二段階のスキームに従って、組換えＰ４５０酵素を用いるアッセイを行った。第１のステップでは、ルシフェリン誘導体をＰ４５０によって酸化する。第２のステップでは、Ｐ４５０の反応混合物にＬＤＲを添加して、Ｐ４５０の活性を停止させ、グロースタイルのルシフェラーゼ反応を開始する。この反応において、ルミネッセンスのシグナルの強度は、第１のステップにてＰ４５０によって酸化されたルシフェリン誘導体の量に依存する。
【０２０１】
第１のステップのＰ４５０酵素の反応のための反応緩衝液を、用いるＰ４５０酵素に依存して変更した。緩衝液は酵素の製造業者の提言に従って用いた。特に示さない限り、以下の緩衝液と酵素との組み合わせを用いた。ＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、１Ｂ１、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ５、３Ａ７、２Ｊ２、４Ｆ１２、１９およびコントロールのサンプルについて１００ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、ＣＹＰ２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ１９、４Ｆ２、４Ｆ３Ａ、４Ｆ３Ｂについて５０ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、ＣＹＰ２Ｃ９について２５ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、ＣＹＰ３Ａ４について２００ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、ＣＹＰ２Ａ６、２Ｃ１８、４Ａ１１について１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）。
【０２０２】
図２および図８〜１９において、ルシフェリン誘導体を、ヒトの組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団およびコントロールのミクロソーム（スーパーソーム（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）））に対してスクリーニングした。
【０２０３】
プロルシフェリンのアセタール化合物の高濃度のストック溶液を以下のように調製した。５０ｍＭの３３２０のアセトニトリル溶液、５０ｍＭの３３５７のアセトニトリル溶液、５０ｍＭの３３６４のアセトニトリル溶液、５０ｍＭの３３６６のアセトニトリル溶液、５０ｍＭの３３９１のアセトニトリル溶液、５０ｍＭの３３５９のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、５０ｍＭの３３６５のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、５０ｍＭの３３９７のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、５０ｍＭの３４０３のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、５０ｍＭの３３７７の水溶液（Ｈ２Ｏ）、および１０ｍＭの３３６３の水溶液（Ｈ２Ｏ）。ルシフェリン−ＰＰＸＥ、ルシフェリン−ＰＦＢＥおよびルシフェリン−ＢＥを、それぞれ５０ｍＭのルシフェリン−ＰＰＸＥのＤＭＳＯ溶液、２ｍＭのルシフェリン−ＰＦＢＥの２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）溶液、および５ｍＭのルシフェリン−ＢＥの１００ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）として提供した。光を通さない白色のポリスチレンの平底の９６ウェルプレートにてアッセイを行った。１ピコモルのＰ４５０酵素またはこれに相当する量のコントロールの膜とＮＡＤＰＨの再生系（１．３ｍＭのＮＡＤＰ＋、３．３ｍＭのグルコース−６−リン酸、３．３ｍＭのＭｇＣｌ２および０．４Ｕ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）とを含んでいる適切なＰ４５０反応緩衝液（５０μＬ）に、各化合物を５０μＭになるように希釈した。反応を、ＮＡＤＰＨの再生系の添加によって開始し、３７℃にて３０分間インキュベートした。インキュベートの後に、等量（５０μＬ）のＬＤＲを添加して、２０分後に、ベリタス（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標））ルミノメーターにて、室温でルミネッセンスを読んだ。
【０２０４】
化合物３３９１を用いた図２０では、図２および図８〜１９に用いた方法を以下の変更を加えて用いた：０．１ピコモルの各Ｐ４５０酵素またはこれに相当する量のコントロールの膜を、反応毎に用いた；全ての反応に関し、２μＭの化合物３３９１を用いた；１００ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）をＰ４５０反応緩衝液として用いた；反応を３７℃にて１０分間インキュベートした。
【０２０５】
図３〜図６において、ＣＹＰ３Ａ４酵素をチトクロムｂ５およびチトクロムＰ４５０レダクターゼと一緒に膜画分にて共発現させた（スーパーソーム（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）））。各反応（５０μＬ）に関し、０．１ピコモルのＣＹＰ３Ａ４酵素を、２００ｍＭのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）にて、２．０μＭの化合物３３９１およびＮＡＤＰＨの再生系（１．３ｍＭのＮＡＤＰ＋、３．３ｍＭのグルコース−６−リン酸、３．３ｍＭのＭｇＣｌ２および０．４Ｕ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）および図３〜６に示した量の各阻害物質（ニフェジピン、ケトコナゾール、テストステロンまたはミダゾラム）と組み合わせた。反応を、ＮＡＤＰＨの再生系の添加によって開始し、３７℃にて１０分間インキュベートした。インキュベートの後に、等量（５０μＬ）のＬＤＲを添加して、２０分後に、ベリタス（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標））ルミノメーターにて、室温でルミネッセンスを読んだ。シグナルを「活性の％」として表した。なお、１００％は、阻害物質が存在しない場合に観察されるルミネッセンスを表す。ＩＣ５０は反応を５０％阻害する阻害物質の濃度である。カーブフィッティングおよびＩＣ５０の算出をプログラム グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標））によって行った。
【０２０６】
図７に示すように、ＣＹＰ３Ａ４と３３９１との反応が用量依存的であることを実証した。この反応は、反応において阻害物質が存在しないことおよび図７に示すように化合物３３９１の濃度を変更したことを除いて図３〜６について記載したように実施した。シグナルを、正味の相対的なルミネッセンスのユニット（ＲＬＵ）として表した。正味の相対的なルミネッセンスのユニット（ＲＬＵ）は、ＣＹＰ３Ａ４の反応のＲＬＵの値からＣＹＰ３Ａ４酵素を欠いているコントロールの反応混合物のバックグラウンドのＲＬＵの値を除することによって算出した。カーブフィッティングをプログラム グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標））によって行った。
【０２０７】
図２１において、ヒトの肝細胞をロンザ（Ｌｏｎｚａ）から購入した。すなわち、この細胞は、１６歳の女性のドナーの患者から採取され、コラーゲンがコーティングされた９６ウェルの組織培養プレートにてほぼコンフルエントになるように播種され、可溶化された基底膜のマトリックスの調製物（マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））によって覆われた。細胞は、周囲温度の封止されたプレートにて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにて維持されて製造業者から輸送された。細胞を受け取った際に、輸送に用いた培地を、１００μＬ／ウェルのインビトログロヘパトサイトプレーティングメディウム（ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ（登録商標） Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（セルシス（Ｃｅｌｓｉｓ）））に置換した。細胞を受け取った１日後に、５００μＭのフェノバルビタールまたはそのビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）を含んでいるインビトログロヘパトサイトプレーティングメディウム（１００μＬ／ウェル）を用いて細胞を処理した。
【０２０８】
２４時間後に、処理を新たに行い、合計で４８時間、維持した。４８時間の処理の終わりに、処理を取り除き、４μＭの化合物３３９１を含んでいるかまたは４μＭの化合物３３９１と１０μＭのケトコナゾールとを含んでいる、インキュベーション用の培地（６０μＬ／ウェル）と置換し、３７℃のインキュベーターにて１時間インキュベートした。バックグラウンドを測定するために、４μＭの化合物３３９１を含んでいるインキュベーション用の培地（６０μＬ）を、別の９６ウェルの組織培養プレートの細胞を有していないウェルにアプライし、処置した細胞を含んでいるプレートと同時に３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーションの後に、各ウェルから５０μＬの培地を、光を通さない白色のポリスチレンのプレートに移して、５０μＬのＬＤＲと組み合わせた。そして、２０分後に、ベリタス（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標））ルミノメーターにてルミネッセンスを読んだ。
【０２０９】
＜実施例１＞
Ａ．ルシフェリン誘導体を用いた、ヒトのチトクロムＰ４５０酵素の活性の測定
二段階のルミネッセンスのアプローチによって、プロルシフェリンアセタールを用いたＰ４５０の活性の測定を行った（Ｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｏｐ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． （２００６） ｖｏｌ．２（４）， ６２９−６４５； Ｃａｌｉ， Ｃｅｌｌ Ｎｏｔｅｓ． ７：２ （２００３）； Ｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｎｏｔｅｓ， １３：８ （２００５ａ）； および Ｃａｌｉ， Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐ４５０ ａｓｓａｙｓ ｔｈａｔ ｕｓｅ Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ＣＹＰ１Ａ１， １Ａ２， １Ｂ１， ２Ｃ８， ２Ｃ９， ２Ｊ２， ３Ａ４， ３Ａ７， ４Ａ１１， ４Ｆ３Ｂ， ４Ｆ１２ ａｎｄ １９， Ｐｒｏｃ． １４ｔｈ Ｉｎｔ． Ｃｏｎｆ． Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０， Ｍｅｄｉｍｏｎｄ Ｉｎｔ． Ｐｒｏｃ． （２００５ｂ））。すなわち、第１のステップにおいて、本発明のプロルシフェリンアセタールをＰ４５０酵素によって最初に酸化する。次いで、酸化された産物は、非酵素的な変換を経験してプロルシフェリンエステルになると考えられる。第２のステップでは、プロルシフェリンエステルをルシフェリンに変換するエステラーゼ酵素を含んでいるルシフェラーゼの反応混合物を添加することによって、プロルシフェリンエステルを検出する。ルシフェリンはルシフェラーゼと反応し、ルシフェリンの量に比例する量の光を生成する。それ故、ルシフェリンはＰ４５０酵素の活性の量に比例する量の光を生成する。活性なＰ４５０酵素を含んでいるサンプルは、通常、Ｐ４５０の活性を欠いているコントロールと比較する。コントロールを顕著に超過するルミネッセンスのシグナルを与えるＰ４５０を含んでいるサンプルは、示唆される反応のメカニズムに縛られることなく、活性であると記録される。
【０２１０】
図２の結果は、２１個の組換えヒトチトクロムＰ４５０酵素の一団のサブセットが、プロルシフェリンアセタールの化合物３３９１の変換を確かに媒介し、その結果、Ｐ４５０酵素の活性を欠いたコントロールのサンプルを顕著に超過するルミネッセンスのシグナルがルシフェラーゼによって生成されることを実証する。さらに、Ｐ４５０を含んでいないコントロール反応のより低いシグナル（バックグラウンドのシグナル）に対するＣＹＰ３Ａ４のシグナルは、化合物３３９１を用いた場合の方がＣＹＰ３Ａ４の基質であるアセタールでないルシフェリン誘導体（ルシフェリン−ＰＰＸＥ：（Ｓ）−２−（６−（３−（（４−フェニルピペラジン−１−イル）メチル）−ベンジルオキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、ルシフェリン−ＰＦＢＥ：（Ｓ）−２−（６−（ペルフルオロベンジルオキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、およびルシフェリン−ＢＥ：（Ｓ）−２−（６−（ベンジルオキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸）を用いた場合よりも明るいことが観察された。よって、化合物３３９１を用いた場合、顕著により高いシグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比および感度のより高いアッセイが観察される。
【０２１１】
例えば、化合物３３９１に関するＳ／Ｂが１６９９であることに対して、ルシフェリン−ＢＥ、ルシフェリン−ＰＰＸＥおよびルシフェリン−ＰＦＢＥに関するＳ／Ｂは、それぞれ５５、５６および９２であった。アッセイの感度が高くなれば、反応毎のＰ４５０酵素の使用量をより少なくすることができるし、サンプル中のＰ４５０がより少量であっても検出することができる。このことは、ＣＹＰ３Ａ４の活性が非常に低いことがある細胞を基礎とするアッセイに特に関係する。さらに、図２に示すように、化合物３３９１は、アセタールでないルシフェリン基質と比べて、他のＣＹＰ３Ａのサブファミリーのメンバー（ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７）よりもＣＹＰ３Ａ４に対する選択性が優れている。この向上した選択性は、化合物３３９１と反応するＣＹＰ３Ａ４のための最適な条件にて組換えＰ４５０酵素の一団がスクリーニングされた図２０においてより決定的に実証されている。より選択的な基質は、複数のＰ４５０酵素が共発現するサンプル（肝臓のミクロソーム、培養された肝細胞、および肝細胞に類似する細胞株など）中の他のＣＹＰ３Ａ４酵素からＣＹＰ３Ａ４の活性を区別するに有利である。
【０２１２】
Ｂ．種々の阻害物質の存在下におけるＣＹＰ３Ａ４の活性の測定
種々の阻害物質の存在下にて、ＣＹＰ３Ａ４を用いて化合物３３９１から発生したシグナルを決定した（図３〜６）。ＣＹＰ３Ａ４と３３９１との反応は、ＣＹＰ３Ａ４の基質であるテストステロン、ミダゾラム、ニフェジピン、および標準的な３Ａ４の阻害物質であるケトコナゾールによって阻害された。対照的に、アセタールでないルシフェリン誘導体（ルシフェリン−ＢＥおよびルシフェリン−ＰＦＢＥ）を用いたＣＹＰ３Ａ４のアッセイはミダゾラムによって阻害され、ニフェジピンおよびテストステロンによって促進された。アセタールでないルシフェリン誘導体（ルシフェリン−ＰＰＸＥ）を用いたＣＹＰ３Ａ４のアッセイはミダゾラムおよびニフェジピンによって阻害され、テストステロンによって促進される（Ｓｏｂｏｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ， ２００７， ｖｏｌ． ９６， ｐａｇｅｓ １５−１８）。このように、化合物３３９１は、アセタールでないルミネッセンスを生じる基質よりも、ＣＹＰ３Ａ４の阻害物質を検出するためのプローブとしての使用範囲が広い。なお、このような阻害物質のいくつかは、競合阻害物質としての役割を果たすＣＹＰ３Ａ４の基質であり得る。
【０２１３】
Ｃ．ＣＹＰ３Ａ４の濃度依存性の測定
図７において、ＣＹＰ３Ａ４の化合物３３９１との反応の濃度依存性を説明する。このデータは、活性が濃度依存的に増加し、化合物３３９１が１２．５μＭのときに最大速度に達し、化合物３３９１の濃度がより高いときには観察されたこの最大値からわずかに低減することを示している。データは、方程式Ｙ＝（Ｖｍａｘ・Ｘ）／（Ｋｍ＋Ｘ＋（Ｘ・Ｘ／Ｋｉ））によって記述された基質の阻害モデルに上手く適合する（Ｒ２＝０．９９）。Ｘは基質濃度である。Ｙは相対的な光のユニット（ＲＬＵ）における活性である。Ｋｍは最大半量の速度である。Ｋｉは基質の阻害定数である。化合物３３９１に関して算出されたＫｍおよびＫｉの値はそれぞれ２μＭおよび１７１μＭである。このＫｍ値は、図２にて用いたアセタールでないルシフェリン誘導体（ＣＹＰ３Ａ４の基質）よりも低い（ルシフェリン−ＢＥ：Ｋｍ＝５０μＭ、ルシフェリン−ＰＦＢＥ：Ｋｍ＝５０μＭ、ルシフェリン−ＰＰＸＥ：Ｋｍ＝２５μＭ）（Ｃａｌｉ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ． Ｏｐ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｔｏｘｉｃｏｌ （２００６） ｖｏｌ．２（４）， ６２９−６４５）。
【０２１４】
Ｄ．他のプロルシフェリンアセタールを用いたヒトＣＹＰ４５０酵素の活性の測定
２１個の組換えＰ４５０酵素の一団とＰ４５０酵素の活性を欠いたコントロールに対する、二段階のアッセイのスキームを用いた、いくつかのプロルシフェリンアセタールのスクリーニングを図８〜１９に示す。１ピコモルの各酵素を必要な補助因子および緩衝液と一緒に、５０μＭのプロルシフェリンアセタールの存在下にて３７℃で３０分間インキュベートした。この条件は、さらに適度な活性の検出を可能にする。各プロルシフェリンアセタールは２１個の酵素の種々のサブセットによる活性を示した。この活性は、Ｐ４５０を含んでいないコントロールと比べたときのルミネッセンスの増加として測定された。プロルシフェリンアセタールは、Ｐ４５０酵素のＣＹＰ３Ａのサブファミリー（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７が挙げられる。）に対する強い選択性を示した。
【０２１５】
Ｅ．ＣＹＰ３Ａ４に対する化合物３３９１の選択性の実証
図２０において、図２に示した実験を改良し、ＣＹＰ３Ａ４に対する化合物の選択性を実証した。この酵素の重要な役割が薬物代謝であるので、ＣＹＰ３Ａ４に対して選択的なアッセイは特に関心を集めている。他のＣＹＰ３Ａ４のサブファミリーのメンバーであるＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７よりもＣＹＰ３Ａ４について選択的であるアッセイを設計することは、特にやりがいのある仕事である。図２において用いた条件は、特定の酵素が有利になるようにバイアスをかけることなくスクリーニングされた、Ｐ４５０酵素のいずれかによる化合物３３９１を用いた活性を検出するために設計された。この条件において、化合物３３９１はＣＹＰ３Ａに対する非常に優れた選択性を示したが、ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７と比べた場合、ＣＹＰ３Ａ４に対する選択性は適度なものであった（ＣＹＰ３Ａ５と比べた場合、ＣＹＰ３Ａ４に対する選択性は１．４倍であり、ＣＹＰ３Ａ７と比べた場合ＣＹＰ３Ａ４に対する選択性は８．５倍である。）。図２０において、化合物３３０１がＣＹＰ３Ａ４と反応するための最適な条件にて、酵素の一団を再度スクリーニングした：すなわち、２μＭの化合物３３９１を０．１ピコモルの各Ｐ４５０酵素と一緒に反応緩衝液（１００ｍＭのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４））に存在させ、３７℃で１０分間インキュベートした。ＣＹＰ３Ａ４の反応のＫｍの濃度は２μＭであり、１００ｍＭのＫＰＯ４は化合物３３９１によるＣＹＰ３Ａ４の活性についての最適な緩衝液である。ＣＹＰ３Ａ４による産物は少なくとも１０分間、直線的に蓄積する。そして、０．１ピコモルのＣＹＰ３Ａ４を用いた場合、１０％未満の化合物３３９１が１０分間のインキュベーションで酸化される。これらの条件はＰ４５０の阻害剤のためのスクリーニングに究極的に用いられるアッセイにとって理想的である。これらの条件下にて、化合物３３９１の反応性は、ＣＹＰ３Ａ４に対して非常に選択的であり、ＣＹＰ３Ａ５と比較した場合、ＣＹＰ３Ａ４に対する選択性は８．０倍を示し、ＣＹＰ３Ａ７と比較した場合、ＣＹＰ３Ａ４に対する選択性は４８．５倍を示し、スクリーニングされた他のＰ４５０酵素を用いた活性は無視できるものである。
【０２１６】
ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７と比べたときのＣＹＰ３Ａ４の選択性に関して図２および２０に見られる差異は、図２０における条件がインキュベーションの間中、定常状態の反応速度論（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を可能にする一方、図２における条件は、基質の欠乏に起因して、時間とともに反応速度が減少することを可能にするという事実で説明することができる。図２０のバーの高さは、異なる反応速度を表す。これに対して、インキュベーションをより長く行い、酵素を１０倍にしたことによって得られた図２のバーの高さは、基質が利用される範囲を表す。
【０２１７】
＜実施例２＞
化合物３３９１を用いた実験を培養されたヒトの肝細胞に適用した。この実験を行い、インタクトな細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を測定した。図２１に、ヒトの肝細胞における、バックグラウンド、基底およびフェノバルビタールによって誘導されたルミネッセンスの活性、ならびに基底およびフェノバルビタールによって誘導された活性のケトコナゾールによる阻害を示す。アセタールでないルシフェリン誘導体を用いたバイオルミネッセントなＰ４５０酵素のアッセイ（Ｓｏｂｏｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ， ２００７， ｖｏｌ． ９６， ｐａｇｅｓ １５−１８； Ｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｏｐ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｔｏｘｉｃｏｌ （２００６） ｖｏｌ．２ （４）， ６２９−６４５）について以前に記載されたようにして、アッセイを行った。すなわち、化合物３３９１を肝細胞の培養液に溶解し、公知のＣＹＰ３Ａ４の誘導物質であるフェノバルビタールまたはそのビヒクル（ＤＭＳＯ）で４８時間処置した後の細胞にアプライした。また、公知のＣＹＰ３Ａ４の阻害物質であるケトコナゾールも、化合物３３９１と組み合わせて、いくつかのウェルにアプライした。化合物に短期間曝露した後、細胞から培地のサンプルを取り出し、別のプレートにおいてルシフェリンを検出する試薬（ＬＤＲ）と組み合わせて、ルミネッセンスを読んだ。ＣＹＰ３Ａ４の選択性の予想は、図２０に示した組換え酵素の一団のスクリーニングに基づいている。
【０２１８】
化合物３３９１とケトコナゾールとが細胞によって取り込まれることが予期された。細胞内では、細胞内に存在する酵素ＣＹＰ３Ａ４がこの３３９１のいくつかを酸化して、ルシフェリンエステルへの変換を促進する。このルシフェリンエステルは、次いで、細胞内に存在する酵素エステラーゼによってルシフェリンへ変換される。ＣＹＰ３Ａ４によって酸化された化合物３３９１の量は、存在する酵素ＣＹＰ３Ａ４の量と、ケトコナゾールを用いたときのまたは用いていないときの反応速度とに依存する。ルシフェリンおよび／またはルシフェリンエステルは、次いで、培養液に拡散して戻り得る。残存する任意のルシフェリンエステルは、ＬＤＲに存在するエステラーゼによってルシフェリンに変換される。
【０２１９】
図２１におけるデータは、本明細書に記載した方法を用いた場合に、アッセイのバックグラウンドを顕著に超過するルミネッセンスのシグナルとしての基底の活性を検出することが可能であり、この活性がＣＹＰ３Ａ４の阻害剤であるケトコナゾールによる阻害に感受性があったことを実証している。さらに、この基底の活性は、公知のＣＹＰ３Ａ４の誘導物質であるフェノバルビタールによって１８倍に誘導された。この誘導された活性も、ケトコナゾールによる阻害に感受性があった。よって、基底の活性がＣＹＰ３Ａ４によって誘導され、ＣＹＰ３Ａ４の阻害物質によって阻害されることを考慮すると、化合物３３９１は、肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の活性を測定するための効果的なプローブである。さらに、このデータは、図２０に示されたＣＹＰ３Ａ４の選択性の予想と一致している。
【０２２０】
＜実施例３＞
２‐（４‐（ジイソプロポキシメチル）‐４，５‐ジヒドロチアゾール‐２‐イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール‐６‐オールの調製
Ａ．tert‐ブチル ４‐（メトキシ（メチル）カルバモイル）‐２，２‐ジメチルチアゾリジン‐３‐カルボン酸塩
【０２２１】
【化１６】

【０２２２】
３−（tert−ブトキシカルボニル）−２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸（Suaifanら、Tetrahedron 62, 11245-11266 (2006); Kemp and Carey, J. Org. Chem. 54, 3640 (1989)を参照）（４ｇ、０．０１５ｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（７．３ｇ、０．０１９ｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（０．６Ｍの２８ｍｌ、０．０１７ｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ‐ジメチルヒドロキシルアミン‐ＨＣｌ（２．９２ｇ、０．０３ｍｏｌ）、ジエチルイソプロピルアミン（５．１Ｌ、０．０３ｍｏｌ）およびＤＭＦ（２０ｍＬ）を収容したフラスコを室温で１７時間攪拌した。
【０２２３】
溶媒をエバポレーションにて蒸発させ、残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）および水（３００ｍＬ）に分けた。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）にて抽出し、合わせた有機層を３０％のクエン酸溶液（２×１００ｍＬ）、飽和炭酸水素塩（２×１００ｍＬ）および食塩水（１×５０ｍＬ）にて洗浄した。エバポレーション後、粗残渣を順相シリカにてクロマトグラフィーを行い、ヘプタン／酢酸エチル（２／１）にて溶出させ、３．８４ｇの固体を得た（８４%）。
【０２２４】
Ｂ．tert-ブチル ４−ホルミル−２，２−ジメチルチアゾリジン−３−カルボン酸塩
０．９１８ｇ、３ｍｍｏｌのtert-ブチル ４−（メトキシ（メチル）カルバモイル）−２，２−ジメチルチアゾリジン−３−カルボン酸塩（２）およびジエチルエーテル（２０ｍＬ）を収容したフラスコをアイスバス中で冷却した。
【０２２５】
冷却した溶液に、水素化アルミニウムリチウム（１６０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、エーテル（２０ｍＬ）をさらに添加した。さらに１時間後、水（１ｍＬ）に溶解させた、硫酸水素カリウム（３１５ｍｇ）溶液を反応物に添加した。セライトを添加し、反応物をろ過し、追加のエーテルで固体を洗浄した。集めたエーテルを、０．１ＮのＨＣｌ（ａｑ）（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（１５ｍＬ）および食塩水（１５ｍｌ）で洗った。
【０２２６】
さらに精製を行うことなく、上記エーテルをＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、エバポレーターにて蒸発させた。収量６８４ｍｇ（９２％）
Ｃ．２−（４−（ジイソプロポキシメチル）−４，５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール
tert−ブチル ４−ホルミル−２，２−ジメチルチアゾリジン−３−カルボン酸塩（７５０ｍｇ、３．０６ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（２０ｍＬ）中に懸濁させ、室温にて窒素雰囲気下で攪拌した。ＨＣｌ（２．３ｍＬ、４．０Ｍジオキサン溶液）を滴下し、反応物を１６時間攪拌した。水５ｍＬに溶解させたＴＣＥＰ（１．４９ｇ、５．２ｍｍｏｌ）溶液を反応混合物に添加した。飽和炭酸ナトリウムにて反応物のｐＨを約８に調整した。６−ヒドロキシ−ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（５９０ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）を上記反応物に滴下により添加し、反応物を２０時間攪拌した。
【０２２７】
ＨＰＬＣ分析により進行がないことが示されたときに、反応を停止させた。溶媒を真空下、蒸発させ、得られた黄色残渣をアセトニトリル：水（１：１）に取り、逆相クロマトグラフィーにて、３０分以上かけて、５０ｍＭのＴＥＡＡ／ＡＣＮを９０／１０から１００％のＡＣＮまでの勾配にて用いて黄色残渣の精製を行った。
【０２２８】
溶媒を蒸発させ、３００ｍｇの目的生成物を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD2Cl2) ・: 7.94 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.05 (dd, 1H, J = 8.7 Hz, 2.4 Hz), 4.95 (d, 1H, J = 4.5 Hz), 4.79 (1H, m), 3.90 (2H, m), 3.48 (2H, m), 1.2 (12H, m); mass spectrum, calculated for C17H23N2O3S2(MH+) 367.1, Found 367.2.
＜実施例４＞
ジメトキシメチルチアゾリルベンゾチアゾール誘導体の調製
【０２２９】
【化１７】

【０２３０】
【化１８】

【０２３１】
【化１９】

【０２３２】
【化２０】

【０２３３】
Ａ．４−（ジメトキシメチル）−２，２−ジメチルチアゾリジン
tert-ブチル ４−ホルミル−２，２−ジメチルチアゾリジン−３−カルボン酸塩（６８４ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびメタノール（４ｍＬ）を収容したフラスコに、４ＭのＨＣｌジオキサン（５００μＬ）溶液を添加した。
【０２３４】
室温で４８時間後、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加した。溶液を冷蔵庫に置き、ろ過した後、２付加結晶物を収量１４５ｍｇ（２１％）の固体にて回収した。
【０２３５】
Ｂ．２−（４−（ジメトキシメチル）−４，５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（方法Ａ）（化合物３２８７）
ｐＨを７．５に調整するために、メタノール（１ｍＬ）における４−（ジメトキシメチル）−２，２−ジメチルチアゾリジン（４０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を収容したガラス瓶へ、充分に飽和させた炭酸水素ナトリウムを添加した。
【０２３６】
メタノール（１ｍＬ）の２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（３１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）溶液を反応物に添加し、さらに、ＴＣＥＰ水溶液（４３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、ｐＨ８に調整されており、ｗ／飽和Ｎａ２ＣＯ３）を上記反応物に添加した。
【０２３７】
２時間後、飽和Ｎａ２ＣＯ３（水溶液）を３滴、上記反応物に添加した。７２時間後、反応物は、水（２０ｍＬ）および酢酸エチル（２０ｍＬ）に分け、酢酸エチル（２０ｍＬ）を抽出し、水１×１０ｍＬ、飽和クエン酸溶液１×１０ｍＬ、食塩水１×１０ｍＬおよび乾燥された硫酸ナトリウムにて洗浄した有機層と合わせた。
【０２３８】
エバポレーションによる蒸発後、残渣を、調製用のＲＰ−ＨＰＬＣにて精製し、最終的に３１ｍｇの固体を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 10.13 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 2.7, 8.8, 1H), 7.39 (d, J = 2.4, 1H), 7.01 (dd, J = 2.5, 8.9, 1H), 4.84 (td, J = 5.5, 9.3, 1H), 4.60 (d, J = 5.0, 1H), 3.54 ‐ 3.20 (m, 11H(includes water peak)).
Ｃ．２−（４−（ジメトキシメチル）−４，５−ジヒドロチアゾール−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｄ］チアゾール−６−アミン（化合物３３５７）
方法Ａを使用し、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを６−（Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノ）−２−シアノベンゼンチアゾール（６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールをヨウ化メチルにて完全メチル化することにより合成される）に置換する合成を行った。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.97 (d, J = 9.1, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.02 (d, J = 9.0, 1H), 4.86 (dd, J = 5.2, 9.3, 1H), 4.63 (d, J = 4.8, 1H), 3.50 (dd, J = 2.8, 14.8, 8H), 3.08 (t, J = 4.6, 7H); mass spectrum, calculated (MH+) 338, found 338.
Ｄ．２−（４−（ジメトキシメチル）−４，５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−アミン（化合物３３５９）
方法Ａを使用し、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを６−アミノ−２−シアノベンゼンチアゾール（O'Brienら、U.S. Patent No. 7,148,030）に置換する合成を行った。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.85 (d, J = 8.8, 1H), 7.04 (d, J = 2.3, 1H), 6.82 (dd, J = 2.3, 8.8, 1H), 4.84 (td, J = 5.1, 9.0, 1H), 4.59 (d, J = 5.1, 1H), 3.55 ‐ 3.33 (m, 9H), 1.97 (d, J = 0.6, 2H). mass spectrum, calculated (MH+) 310, found 310.
Ｅ．３−（２−（４−（ジメトキシメチル）−４，５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イルアミノ）プロパン−１−オール（化合物３３６６）
方法Ａを使用し、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールにより、６−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−２−シアノベンゼンチアゾール（Daily, Hawkinsら、ＷＯ ２００６／１３０５５１）を置換する合成を行った。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.85 (dd, J = 2.4, 8.9, 1H), 6.97 (d, J = 2.3, 1H), 6.80 (dd, J = 2.4, 8.9, 1H), 4.86 (dt, J = 6.9, 13.9, 1H), 4.61 (dd, J = 2.5, 5.0, 1H), 3.91 ‐ 3.75 (m, 2H), 3.59 ‐ 3.38 (m, 9H), 3.36 ‐ 3.25 (m, 2H), 2.16 (d, J = 2.6, 1H), 2.02 ‐ 1.82 (m, 2H). mass spectrum, calculated (MH+) 368, found 368.
【０２３９】
＜実施例５＞
混合アセタール誘導体の調製
【０２４０】
【化２１】

【０２４１】
Ａ.２−（４−（（２−ブロモエトキシ）（メトキシ）メチル）−４,５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（方法Ｂ）（化合物３３５８）
２‐（４‐（ジメトキシメチル）‐４，５‐ジヒドロチアゾール‐２‐イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール‐６‐オール（５０ｍｇ）を収容したガラス瓶に、２‐ブロモエタノール（１ｍＬ）およびＨＣｌのジオキサン溶液（４Ｍの１２５ｕＬ）を添加した。
【０２４２】
室温にて４時間後、トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）（１Ｍの１ｍＬ）の水溶液を反応物に添加した。ろ過後、３０分以上、溶液を調製用のＲＰ−ＨＰＬＣにて、５０ｍＭのＴＥＡＡをアセトニトリルに徐々に移行させ、溶出することにより、溶液を精製した。収量２６ｍｇ
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 8.9, 1H), 7.33 (d, J = 2.4, 1H), 7.06 (dd, J = 2.3, 8.9, 1H), 4.88 (dt, J = 6.8, 13.2, 1H), 4.79 ‐ 4.67 (m, 1H), 4.16 ‐ 3.73 (m, 3H), 3.64 ‐ 3.38 (m, 8H), 1.36 (dd, J = 2.4, 5.3, 1H). mass spectrum, calculated (MH+) 304/306, found 304/306
Ｂ.２−（４−（（３−ブロモプロポキシ）（メトキシ）メチル）−４,５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（化合物３３６４）および２−（４−（ビス（３−ブロモプロポキシ）メチル）−４,５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（化合物３３６５）
方法Ｂを使用し、２−（４−（ジメトキシメチル）−４,５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（２００ｍｇ）、３−ブロモプロパノール（２ｍＬ）およびＨＣｌのジオキサン溶液（４Ｍの４８０ｕＬ）を出発原料として合成を行った。生成物を調製用のＲＰ−ＨＰＬＣにて分離し、混合アセタールを７０ｍｇ得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.97 (d, J = 8.9, 1H), 7.29 (d, J = 2.2, 1H), 7.05 (dd, J = 2.2, 8.9, 1H), 5.00 ‐ 4.64 (m, 2H), 3.99 ‐ 3.64 (m, 2H), 3.62 ‐ 3.40 (m, 7H), 2.26 ‐ 1.99 (m, 2H). mass (MH+) calc and found 416/418;
また、対称アセタールを２０ｍｇ得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 8.9, 1H), 7.33 (d, J = 2.4, 1H), 7.06 (dd, J = 2.5, 8.9, 1H), 4.90 (ddd, J = 4.7, 11.2, 18.2, 2H), 3.91 (td, J = 5.5, 9.1, 2H), 3.72 (ddd, J = 5.7, 9.6, 20.4, 2H), 3.60 ‐ 3.41 (m, 6H), 2.13 (ddd, J = 6.1, 12.2, 19.4, 4H). mass (MH+) calc and found 523/525/527.
Ｃ.２−（４−（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）（メトキシ）メチル）−４,５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（化合物３３６３）
ＤＭＦ（２００ｕＬ）中の２−（４−（（２−ブロモエトキシ）（メトキシ）メチル）−４,５−ジヒドロチアゾール−２−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オール（１６ｍｇ）を収容したガラス瓶へ、ジメチルアミン（ＴＨＦ溶液、２Ｍの４０ｕＬ）を添加した。室温で４８時間後、反応物を調製用のＲＰ−ＨＰＬＣにて分離し、８ｍｇを得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, J = 9.2, 1H), 7.14 (d, J = 2.2, 1H), 6.97 (d, J = 8.9, 1H), 4.74 ‐ 4.59 (m, 2H), 4.12 ‐ 3.78 (m, 1H), 3.21 (dd, J = 7.2, 14.9, 1H), 3.10 (s, 2H), 2.63 (s, 5H), 1.29 (t, J = 7.3, 1H). mass (MH+) calc and found 368.
【０２４３】
＜実施例６＞
ルシフェリンのキノリンアセタール誘導体の調製
【０２４４】
【化２２】

【０２４５】
【化２３】

【０２４６】
実施例４に記載の４−（ジメトキシメチル）−２，２−ジメチルチアゾリジンを調製し、キノリンルシフェリンの誘導体である２−（２−（４−（ジメトキシメチル）−４，５−ジヒドロチアゾール−２−イル）−６−ヒドロキシキノリンを実施例４における方法に従って調製可能である。上記方法Ａは、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを２−シアノ−６−ヒドロキシキノリン（WO2006/130551（Daily, Hawkinsら）を参照）に置換する方法である。実施例３〜５に記載の技術を使用して、種々の他のキノリンアセタールを調製することができる。
【０２４７】
適切なキノリンニトリルは商業的に得られ、または、従来公知の方法によって調製可能である。例えば、キノリンの６位が置換されたキノリンの出発原料を使用することによってキノリン誘導体を調製してもよい。一例として、６位が酸素置換または６位が窒素置換されたキノリンが含まれる。上記キノリンでは、置換体として例えば、本明細書に記載された種々のベンゾチアゾールおよびルシフェリン誘導体を示すことができる。一例として、実施例５に記載の技術を使用して、他のアセタールおよび混合アセタールをさらに調製可能である。
【０２４８】
全ての刊行物、特許および特許出願は本発明に参照することにより組み込まれる。一方、上述した明細書において、当該発明は特定の好ましい形態に関して記載したものであり、説明のために詳細を述べてきた。しかし、本発明がさらなる実施形態を許容可能であり、本発明の基本原理から離れることなく、本明細書に記載された詳細の一部を大幅に変更できることは、当業者にとって明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】ビートルのルシフェリン（Ｄ−ルシフェリン）の６員環（「Ａ環」または「環Ａ」）内の環の原子、中心の５員環（「Ｂ環」または「環Ｂ」）内の環の原子、およびチアゾールの５員環（「Ｃ環」または「環Ｃ」）内の環の原子の番号を示す図である。
【図２】化合物３３９１のＰ４５０酵素に対する選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３９１またはアセタールでないプロルシフェリン誘導体（ルシフェリン−ＢＥ、ルシフェリン−ＰＦＢＥまたはルシフェリン−ＰＰＸＥ）を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。３つ組（ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図３】ニフェジピンによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【図４】ケトコナゾールによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【図５】テストステロンによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【図６】ミダゾラムによるＣＹＰ３Ａ４の活性の阻害を示す図である。
【図７】ＣＹＰ３Ａ４／３３９１の活性の用量依存性を示す図である。
【図８】化合物３３２０のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３２０を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図９】化合物３３６６のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６６を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１０】化合物３３６４のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６４を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１１】化合物３３６５のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６５を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１２】化合物３３７７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３７７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１３】化合物３３８７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３８７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１４】化合物３３５７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３５７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１５】化合物３３５８のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３５８を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１６】化合物３３５９のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３５９を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１７】化合物３３６３のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３６３を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１８】化合物３３９７のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３９７を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図１９】化合物３４０３のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３４０３を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。
【図２０】化合物３３９１のＰ４５０酵素の選択性を示すグラフである。グラフでは、組換えチトクロムＰ４５０酵素の一団に対してスクリーニングした、アセタールプロルシフェリン誘導体である化合物３３９１を含んでいる反応についてのルミネッセンスを、相対的な光の単位（ＲＬＵ）で示した。各Ｐ４５０酵素による３つ組の反応からの測定の平均値および標準偏差を示す。この図は実施例１およびその「材料および方法」の項に記載したような図２と異なる。
【図２１】ヒトの肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の誘導を示す図である。１０μＭのケトコナゾール（Ｋｅｔｏ）を有しているまたは有していない、５００μＭのフェノバルビタール（ＰＢ）またはＰＢのビヒクルである０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＡＯ）で処理した後の培養肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の活性を検出するためのバイオルミネッセンスのプローブとして、化合物３３９１を用いた。４つ組のウェルからの測定の平均値および標準偏差を示す。バックグラウンドは、培地および化合物３３９１を含んでいるが、細胞を含んでいないウェルからのシグナルである。基底（Ｂａｓａｌ）は、培地、０．１％ＤＭＳＯおよび細胞を含んでいるウェルからのシグナルである。バックグラウンドの値（グラフ上のバーとして確認することができない。）は９９０±７１ＲＬＵである。基底＋ｋｅｔｏの値（これも、グラフ上のバーとして確認することができない。）は３６１３±２４４ＲＬＵである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で示される化合物であって、
【化１】

(I)

上記式（Ｉ）において、
Ｙは、Ｎ、Ｎ‐オキシド、Ｎ‐（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはＣＨであり；
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨまたはＣＨ＝Ｎであり；
Ｘ＊はそれぞれ独立してＯまたはＳであり；
Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立して、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、ハロアリールもしくは複素環であるか、または、Ｒ’およびＲ”は共に環式部分を形成しており；
Ｒ’およびＲ”は、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルコキシ、オキシ、アミノ、ハロ、カルボキシル、チオ、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、ハロアリールまたは複素環で任意に置換されていてもよく；
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲであり；
Ｗ１はＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、ヒドロキシルもしくは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、ｎは１、２または３であるか、または
Ｗ１およびＺは、環Ａにおいて共にケト基を形成しており、環Ａにおいて任意の結合を示す破線の少なくとも１つが存在せず；
Ｗ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルケニル、ヒドロキシルまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり；
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４はそれぞれ独立して、ＣＨ、Ｎ、Ｎ‐オキシド、またはＮ‐（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｋ１とＫ２との間およびＫ３とＫ４との間の破線は、任意の結合を示し、何れかのＣＨの炭素が置換されているとき、Ｈは存在せず；
環Ｂにおける破線は、任意の結合であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルコキシ、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、ハロアリール、複素環、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルスルホニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールスルホニル、ハロアリールスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルスルフィニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールスルフィニル、ハロアリールスルフィニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２、トリ（Ｃ１〜Ｃ２０）アンモニウム（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、ハロアリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、第４級窒素を有するハロアリール、第４級窒素を有するハロアリールカルボニル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールチオ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルリン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールリン酸塩、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはサッカライドであるか、または、ＺがＮＲＲであるとき、Ｎと共にＲＲは任意にハロアリール基または複素環基を形成するよう連結しており；
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ハロアリールまたは複素環基は何れも、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシ、‐ＣＯＯＲｘ、‐Ｓ（Ｏ）Ｒｘ、‐ＳＯ２Ｒｘ、‐ＳＯ３Ｒｘ、ニトロ、アミノ、リン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルリン酸塩、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル）２、メルカプト、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルチオ、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ハロアリールまたは複素環から選ばれる１、２、３、４または５の置換基によって任意に置換されていてもよく、
上記ＲｘがＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、複素環もしくはハロアリールまたはこれらの塩であり、上記それぞれの置換基は１〜３のＲ基によって任意に置換されていてもよく；
上記Ｚが窒素部分を含むとき、Ｚの窒素部分の水素の１または両方は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは置換基Ｌによって置き換えられていてもよく；
上記置換基Ｌは、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアミノ酸ラジカル、２０以下のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルまたはその他の低分子であり；
上記Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の水素または窒素部分 が、（ＨＯ）２Ｐ（Ｏ）‐ＯＣＨ２‐、スルホ、‐ＰＯ３Ｈ２または１〜約１２の炭素原子の炭素鎖を介してＺ基に連結しているセファロスポラニン酸によって置き換えられていてもよく、
上記Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の１つの水素または窒素部分が、Ｌ’基‐リンカーによって置き換えられていてもよく；
上記Ｌ’基は、リンカーを固定しない酵素によって除去可能であり、リンカーは自己切断性を有し、１または複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、任意で置換されている芳香族環またはペプチド結合によって任意に割り込まれていてもよい炭素鎖であり；
上記リンカーは、リンカーの１つの末端にて、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ’基と連結されており、リンカーの他の末端は、Ｚ基とエーテル、エステルまたはアミド結合を形成しており；
上記ＺがＯＲであるとき、式Ｉは任意で、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して２つの環Ａに結合されたダイマーであってもよく；
上記リンカーは、式Ｉのダイマー間において、架橋を形成する１〜４の酸素原子、窒素原子または任意で置換されていてもよいアリール、ハロアリールまたは複素環基によって割り込まれていてもよく、式Ｉのダイマーに結合している上記それぞれのＺ基のＲ基は、架橋によって置き換えられている化合物。
【請求項２】
下記ａ）〜ｊ）の何れかを満たす請求項１に記載の化合物。
ａ）Ｋ１〜Ｋ４がそれぞれＣＨまたはＣである
ｂ）Ｗ１がそれぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、またはＣｌであり、ｎが１または２であり；Ｗ２がそれぞれＨである
ｃ）ＹがＮであり、ＸがＳまたは‐ＣＨ＝ＣＨ‐である
ｄ）ＸがＳである
ｅ）Ｘ＊がＯである
ｆ）Ｒ’およびＲ”がそれぞれ独立して、任意で置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである
ｇ）Ｒ’およびＲ”が、‐Ｘ＊‐ＣＨ‐Ｘ＊‐と共に、５１２員環の任意で置換された複素環基を形成するように連結されている
ｈ）ＺがＮＲＲであり、上記Ｒがそれぞれ独立して、Ｈまたは任意で置換された（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである
ｉ）ＺがＯＨまたはＯＲであり、上記Ｒが任意で置換された（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ３０）アリールまたは（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール基である
ｊ）ａ）〜ｈ）の組み合わせ
【請求項３】
上記ＹがＮであり、ＸがＳまたは‐ＣＨ＝ＣＨ‐であり；
Ｘ＊がそれぞれＯであり；
Ｗ１がＨ、ＦまたはＣｌであり；ｎが１または２であり；
Ｗ２がＨであり；
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４が全てＣまたはＣＨである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
上記Ｚが環Ａの６’位に存在し、
上記Ｚが、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＭｅ２またはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；
上記Ｗ１が、上記環Ａの５’位におけるＨ、ＦまたはＣｌである請求項４の化合物。
【請求項５】
下記の化合物群から選ばれた何れかの請求項５の化合物。
【化２】

【請求項６】
以下の何れかの構造を有する化合物。
【化３】

【請求項７】
ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の存在または量を検出または決定する方法であって、
混合物中のルミネッセンスを検出または決定して、該分子の存在または量を検出または決定する工程を包含しており、
該混合物はサンプル、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための反応混合物、および請求項１に記載の化合物を含んでいる、方法。
【請求項８】
前記ルシフェラーゼでない酵素が、チトクロムＰ４５０酵素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物におけるＲ’およびＲ’’が（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であり、かつビートルのルシフェラーゼのためのプロサブストレートである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物が、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための反応混合物をさらに含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
検出または決定される前記分子が、ルシフェラーゼでない酵素、または該ルシフェラーゼでない酵素のための補助因子である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、インタクトな細胞の調製物、細胞溶解物、細胞成分分画、組織、組織画分、または精製された酵素の調製物もしくは部分的に精製された酵素の調製物を含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ルシフェラーゼでない酵素の活性に対する作用物質の効果を決定するための方法であって、混合物中のルミネッセンスを検出または決定して、該ルシフェラーゼでない酵素の活性に対する作用物質の効果を決定する工程を包含しており、
該混合物は１つ以上の作用物質、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための反応混合物、および請求項１に記載の化合物を含んでいる、方法。
【請求項１５】
前記化合物が、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であり、かつビートルのルシフェラーゼのためのプロサブストレートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合物が、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための反応混合物をさらに含んでいる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ルシフェラーゼでない酵素が、チトクロムＰ４５０酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ、またはチトクロムＰ４５０ ３Ａ 酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
動物中のチトクロムＰ４５０の酵素活性に対する化合物の効果を決定するための方法であって、
該動物中のルミネッセンスを検出または決定して、該動物中のチトクロムＰ４５０の酵素活性を決定する工程を包含しており、
該動物はテスト化合物および請求項１に記載の化合物に曝露されたものである、方法。
【請求項１９】
前記化合物が、チトクロムＰ４５０酵素であり、かつビートルのルシフェラーゼのためのプロサブストレートである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物が、バイオルミネッセンスの酵素の導入遺伝子を有するトランスジェニック動物である、請求項１７に記載の方法。
【図１】
image rotate

【図２】
image rotate

【図３】
image rotate

【図４】
image rotate

【図５】
image rotate

【図６】
image rotate

【図７】
image rotate

【図８】
image rotate

【図９】
image rotate

【図１０】
image rotate

【図１１】
image rotate

【図１２】
image rotate

【図１３】
image rotate

【図１４】
image rotate

【図１５】
image rotate

【図１６】
image rotate

【図１７】
image rotate

【図１８】
image rotate

【図１９】
image rotate

【図２０】
image rotate

【図２１】
image rotate

【公表番号】特表２０１２−５００２５８（Ｐ２０１２−５００２５８Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３８０１（Ｐ２０１１−５２３８０１）
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００４６９６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２１６８６
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５９３０８９１４９）プロメガ　コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】

[ Back to top ]