本発明は、新規の、多様な、ハイブリッドおよび作成されたレコンビナーゼ酵素、ならびにＤＮＡ増幅アッセイを行うための、関連組換え因子をともなうそのような蛋白質の使用を、その特色とする。また、本発明は、ＤＮＡ増幅アッセイにおける異なる生化学的活性を有する異なるレコンビナーゼ「系」、ならびに負荷因子、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）、および使用される密集剤の量についての異なる要求も、その特色とする。さらに詳しくは、本発明は、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、およびＫＶＰ４０ハイブリッドおよび作成蛋白質の使用、およびそのような蛋白質のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイにおける使用に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質を、二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一および第二の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成させ、ここに、該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、およびここに、該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質のうちの２以下はＴ４ファージ蛋白質であり；
（ｂ）該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のＤループ構造を作り出し、次いで、該第二のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーが、標的核酸分子を完全に変性することなく、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの３’末端が同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように、該二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のＤループ構造を作り出し；
（ｃ）ストランド変位合成を可能とする１以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰで該第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの３’末端を延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位された核酸のストランドを作り出し；次いで、
（ｄ）所望の程度の増幅に到達するまで、（ｂ）および（ｃ）の反復を通じて反応を継続する；
工程を含む、二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２】
前記第一および第二の変位された核酸のストランドが工程（ｃ）の後に相互にハイブリダイズして、第三の二本鎖標的核酸分子を形成する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２蛋白質が由来するミオウイルス科ファージが：Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１，Ｒｂ１６，Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２が：
（ａ）Ｒｂ６９ ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９ ＵｖｓＹおよびＲｂ６９ ｇｐ３２；
（ｂ）Ａｅｈ１ ＵｖｓＸ、Ａｅｈ１ ＵｖｓＹおよびＲｂ６９ ｇｐ３２；
（ｃ）Ｔ４ ＵｖｓＸ、Ｔ４ ＵｖｓＹおよびＲｂ６９ ｇｐ３２；および
（ｄ）Ｔ４ ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９ ＵｖｓＹおよびＴ４ ｇｐ３２
よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２が、同一または異なるミオウイルス科ファージ源からの天然、ハイブリッドまたは突然変異体蛋白質である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリッド蛋白質がミオウイルス科ファージの２つの異なる種からの１以上のアミノ酸残基を含んで、前記方法において改良された性能特徴を持つ蛋白質を生じる請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ＵｖｓＸが突然変異体ＵｖｓＸである請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異体ＵｖｓＸがＲｂ６９ ＵｖｓＸアミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を含むＲｂ６９ ＵｖｓＸであり、ここに、該突然変異は：
位置６４におけるヒスチジンではないアミノ酸；
位置６４におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；および
その組合せ
よりなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異体ＵｖｓＸがＴ６ ＵｖｓＸアミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を有するＴ６ ＵｖｓＸであり、ここに、該突然変異が：
位置６６においてヒスチジンではないアミノ酸；
位置６６におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；および
その組合せ
よりなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリッド蛋白質が、異なるＵｖｓＸ種からのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの領域を含むＵｖｓＸ蛋白質である請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの領域がＵｖｓＸのＤＮＡ−結合ループ−２領域である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記方法がポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、デキストラン、ＰＶＰ、アルブミンよりなる群から選択される密集剤の存在下で行われる請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記密集剤が２００，０００未満の分子量を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記密集剤が約０．５ｗ／ｖ％ないし約１５ｗ／ｖ％の量で存在する請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼがＥ．Ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｏｌ Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｐｏｌ Ｉ、およびそのホモログよりなる群から選択される大断片ポリメラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記方法がヘパリンの存在下で行われる請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記第一または第二の核酸プライマーがブロックされたプライマーであり、および前記方法がＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶよりなる群から選択されるエンドヌクレアーゼの存在下で行われる請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が約１ｍＭないし約８ｍＭ二価マンガンイオンの存在下で行われる請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記方法がＵｖｓＹの非存在下で行われる請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹまたはｇｐ３２蛋白質の少なくとも１つが配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、および配列番号：１２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質を、二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一のヌクレオ蛋白質プライマーの集団を形成させ、ここに、該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、および該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２蛋白質の２以下はＴ４ファージ蛋白質であり；
（ｂ）該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより、標的核酸分子を完全に変性することなく、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のＤループ構造を形成させ；
（ｃ）ストランド変位合成が可能である１以上のポリメラーゼ、およびｄＮＴＰで該第一のヌクレオ蛋白質プライマーの３’末端を延長して、二本鎖標的核酸分子および変位した核酸分子のストランドを生じさせ；
（ｄ）第二の一本鎖核酸プライマーを該変位した核酸分子のストランドとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを形成させ；
（ｅ）該ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを延長させて、二本鎖標的核酸分子を生じさせ；
（ｆ）所望の程度の増幅に到達するまで、（ｂ）および（ｅ）の反復を通じて反応を継続する；
工程を含む、ＤＮＡの第一および第二のストランドでの二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２２】
野生型Ｒｂ６９ ＵｖｓＸアミノ酸配列において改変を含む突然変異体またはハイブリッドＲｂ６９ ＵｖｓＸ蛋白質であって、野生型アミノ酸配列における改変が：
位置６４においてヒスチジンでないアミノ酸；
位置６４におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；
Ｒｂ６９ ＵｖｓＸではないＵｖｓＸ蛋白質からのＤＮＡ−結合ループ−２領域でのＤＮＡ−結合ループ−２領域の置換；
ヒスチジンタグの付加；および
その組合せ；
よりなる群から選択される蛋白質。
【請求項２３】
前記蛋白質が配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２１、または配列番号：１２２のアミノ酸配列を含む、請求項２２記載の突然変異体またはハイブリッドＲｂ６９ ＵｖｓＸ蛋白質。
【請求項２４】
野生型Ｔ６ ＵｖｓＸアミノ酸配列において改変を含む突然変異体またはハイブリッドＴ６ ＵｖｓＸ蛋白質であって、該野生型アミノ酸配列における改変が：
位置６６におけるヒスチジンではないアミノ酸；
位置６６におけるセリン；
位置１６４におけるバリン；
位置１６６におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；
Ｔ６ ＵｖｓＸではないＵｖｓＸ蛋白質からのＤＮＡ−結合ループ−２領域でのＤＮＡ−結合ループ−２領域の置換；
ヒスチジンタグの付加および
それらの組合せ；
よりなる群から選択される該蛋白質。
【請求項２５】
前記蛋白質が配列番号：１０５または配列番号：１０６のアミノ酸配列を含む請求項２４記載の突然変異体またはハイブリッドＴ６ ＵｖｓＸ蛋白質。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【公表番号】特表２００９−５３５０５３（Ｐ２００９−５３５０５３Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０８５４５（Ｐ２００９−５０８５４５）
【出願日】平成１９年５月４日（２００７．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００３０８８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３５２０５
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０６３９９０８８）エーエスエム　サイエンティフィック，　インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】