レーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置
【課題】レーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供する。
【解決手段】試料導入口が形成されており、試料導入口を介して試料と磁性ビーズを収容する細胞溶解チップ１２０と、細胞溶解チップ１２０を固定して所定方向に振動力を与える振動部１３０と、細胞溶解チップ１２０にレーザーを供給するレーザー発生部１４０と、振動部１３０及びレーザー発生部１４０の駆動を制御する制御部１５０とを含む。
【解決手段】試料導入口が形成されており、試料導入口を介して試料と磁性ビーズを収容する細胞溶解チップ１２０と、細胞溶解チップ１２０を固定して所定方向に振動力を与える振動部１３０と、細胞溶解チップ１２０にレーザーを供給するレーザー発生部１４０と、振動部１３０及びレーザー発生部１４０の駆動を制御する制御部１５０とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置に関するもので、より詳細には、レーザーを用いて細胞またはウイルスを速かに溶解させてＤＮＡを効果的に抽出できる携帯用レーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、特定病原菌の分子学的診断は４ステップ、すなわち細胞溶解、ＤＮＡ分離、ＤＮＡ増幅、及びＤＮＡ検出を含む。
【０００３】
ＤＮＡ増幅には、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、核酸基材増幅、修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ヘリカーゼ連鎖反応、ＱＢ複製酵素増幅、及び連結が活性化された転写が含まれる。
【０００４】
細胞からＤＮＡを分離する方法は、ＤＮＡを結合する傾向を有する物質を用いて行う。ＤＮＡの分離のための物質の例は、シリカ、ガラスファイバ、陰イオン交換樹脂、及び磁性ビーズなどがある（非特許文献１、非特許文献２参照）。細胞溶解は通常、機械的、化学的、熱的、電気的、超音波、及びマイクロウェーブ方法で行う（非特許文献３参照）。
【０００５】
化学的方法は、細胞を破壊してＤＮＡを放出するために溶解剤を用いる。カオトロピック試薬を用いた細胞抽出物の付加的な処理ステップが、蛋白質を変性させるために必要である。化学的溶解方法の短所は、細胞を破壊するために粗い化学物質を用いることである。それらは、連続的に行うＰＣＲ反応を妨害しうるため、ＰＣＲ反応前にＤＮＡを精製することが不可避である。この化学的方法は、労働集約的であり、時間を必要とし、高価な消耗品を必要とし、時折ＤＮＡ収率が低い問題点がある。また熱的方法は、引続いた凍結／融解サイクルが関与するが、時折細胞内の多くの構造物を破壊できない短所がある。
【０００６】
加熱は、細胞壁または細胞膜を破壊する代替的な方法である。簡単な加熱の短所は、放出されたＤＮＡに付着しうる蛋白質を変性させることである。それらは、ＤＮＡ増幅を妨害しうる。物理的な方法は、その体積が大きくて、高価な圧力装置を利用するが、それはＬＯＣ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）への適用に適さない。
【０００７】
超音波処理は、代替的な物理的方法であり、一般的には超音波水槽に設けられたチャンバー内に細胞溶液または懸濁液を収納して行う。しかし、超音波破壊は、細胞溶解において多くの短所を有する。第一に、超音波のエネルギー分布は、均一でない。超音波エネルギーの不均一な分布は、また一貫性のない結果を招く。第二に、超音波水槽は容器にエネルギーを集中することができないため、細胞を完全に破壊させるためには、時折数分かかってしまう。最後に、超音波方法は、人間の耳に不快な音を感じさせる。
【０００８】
レーザーは、細胞を破壊するのに多くの長所を有し、ＬＯＣに容易に適用できる（非特許文献４参照）。一方、特許文献１には、レーザー誘導された細胞溶解システムが開示されている。しかし、レーザーだけを用いたとき、細胞を効果的に溶解できない。透明度の高い溶液に大腸菌を入れて実験した結果、レーザーだけを照射した場合に、低い細胞溶解効率しか得られないことを確認した。また、１５０秒間レーザーを照射した後のＤＮＡ濃度は、３．７７ｎｇ／μｌであったが、９５℃で５分間煮沸した後のＤＮＡ濃度は、６．１５ｎｇ／μｌであった。これは、レーザーエネルギーが効果的に細胞に伝達されていないためである。
【０００９】
さらに、このような従来のレーザー細胞溶解システムは、サイズの大きいレーザー発生装置及び収斂レンズなどを備えるため、装備の製造コストが高く、携帯が不可能な問題点があった。これを改善するために低容量のレーザー発生装置を用いる技術が試みられたが、この場合も溶解対象細胞またはウイルスの反応面積に比べて光照射面積が小さいため、均一且つ効率的な細胞溶解ステップを行うことができない問題点が通常存在する。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／９６４２９Ａ１号明細書
【非特許文献１】Ｒｕｄｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ ２２，ｐｐ．５０６〜５１１（１９９７）
【非特許文献２】Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ ２２，ｐｐ．５５４〜５５７（１９９７）
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，ｐｐ．４９２〜４９６（２００１）
【非特許文献４】Ｈｕａｉｎａ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，ｐｐ．４６２５〜４６３１（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、前述の従来技術の問題点を解決するためになされた本発明は、安価のレーザーダイオードを用いた細胞破壊技術を活用し、携帯が可能な小型のレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供することにその目的がある。
【００１１】
本発明の他の目的は、細胞溶解チップをレーザー光の照射方向と垂直に振動するようにするホルダー構造を備えることによって、別途に拡散レンズなどを使用しなくても低容量のレーザーを活用して広い光照射面積を確保することができるレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、レーザーと磁性ビーズを共に用いて振動させることによって、細胞またはウイルスを迅速且つ効率的に破壊できるレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような目的を達成するための本発明に係るレーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置は、レーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置において、試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を介して試料と前記磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、前記細胞溶解チップを固定して所定方向に振動力を与える振動部と、前記細胞溶解チップにレーザーを供給するレーザー発生部と、前記振動部及びレーザー発生部の駆動を制御する制御部と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
ここで、前記振動部は、振動モーターと、前記振動モーターを内設し、前記細胞溶解チップを固定して振動力を伝達するホルダーと、前記ホルダーを前記振動部に移動可能に連結するシャフトと、及び前記シャフトに外嵌されて前記ホルダーの動きを弾性力で制限するスプリングと、を含むことが好ましい。
【００１５】
また、前記振動モーターの振動方向はレーザーの照射方向と垂直であることが好ましい。
【００１６】
また、前記レーザー発生部は光源としてレーザーダイオード（ＬＤ）を含むことが好ましい。
【００１７】
また、前記レーザーダイオードから供給されるレーザーは垂直方向と水平方向との発散角度が相異なることが好ましい。
【００１８】
また、前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生した熱を吸収して分散させるヒートシンクを含むことが好ましい。
【００１９】
また、前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生する温度を検知し、検知した温度データを前記制御部に伝達する温度センサーを含むことが好ましい。
【００２０】
また、前記レーザー発生部の一側には前記制御部により稼動されて装置内部から発生した熱を空冷させる冷却ファンが設けられることが好ましい。
【００２１】
また、前記細胞溶解チップは、上方に開口した反応チャンバーが中央部に形成されたチップボディー部と、前記チップボディー部の上面に付着して前記反応チャンバーの上部を密閉させ、前記反応チャンバー内にレーザーが貫通するようにし、前記反応チャンバーに向かって貫通するように試料導入口及び導出口が形成されたチップカバー部と、を含むことが好ましい。
【００２２】
また、前記反応チャンバーは前記レーザー供給部により供給されるレーザーの照射面積より広いことが好ましい。
【００２３】
また、前記制御部は前記レーザーダイオード及び前記駆動モーターを指定時間の間稼動させるタイマーを含むことが好ましい。
【００２４】
また、前記レーザー稼動に必要とする各種因数値を格納して前記制御部に印加する補助メモリをさらに含むことが好ましい。
【００２５】
また、前記補助メモリはＥＥＰＲＯＭ、ＵＶＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリのうちいずれかであることが好ましい。
【００２６】
さらに、前記振動部及びレーザー発生部の駆動電源としてバッテリーをさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置によれば、安価のレーザーダイオードを用いて小型化が可能であり、バッテリーだけで駆動できる独立システムを構築することによって、携帯が可能である。
【００２８】
また、本発明によれば、細胞溶解チップをレーザー光の照射方向と垂直に振動するようにするホルダー構造を備えるので、別の拡散レンズなどを使用しなくても低容量のレーザーを活用して広い光照射面積を確保して細胞溶解効率が増大できる。
【００２９】
さらに、本発明によれば、レーザーと磁性ビーズを共に用いて振動させることによって、細胞またはウイルスを迅速且つ効率的に破壊できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３１】
図１Ａは本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の外形を示した斜視図であり、図１Ｂは振動部を開放した状態の外形を示した斜視図である。図２は図１Ａに示したレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の内部構成を示した斜視図である。
【００３２】
図１Ａないし図２を参照すると、本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置１００は、試料と磁性ビーズを収容する細胞溶解チップ１２０と、本体１１０から開放可能なようにヒンジにより本体に結合され、細胞溶解チップ１２０を固定して所定方向に振動力を与える振動部１３０と、細胞溶解チップ１２０にレーザーを供給するレーザー発生部１４０、及び振動部１３０とレーザー発生部１４０の駆動を制御する制御部１５０を含んでなる。
【００３３】
レーザー発生部１４０は、光源として使われるレーザーダイオード（ｌａｓｅｒ ｄｉｏｄｅ：ＬＤ）１４１と、レーザー稼動により発生した熱を吸収して分散させるヒートシンク１４２と、ヒートシンク１４２の一側に付着してレーザー稼動により加熱された温度を検知する温度センサー１４３とを含む。
【００３４】
レーザー発生部１４０の一側には装置内部から発生した熱を空冷させる冷却ファン１６０が設けられ、振動部１３０の下段には装置に電力を供給する駆動電源１７０が入替え可能に装着される。ここで、駆動電源はバッテリーの形態であることが好ましい。
【００３５】
本体１１０の上面部には装置の駆動に必要なスイッチ１１０ａが設けられ、前面部には装置の駆動状態を表示するＬＥＤランプ１１０ｂが装着される。
【００３６】
このような一連の構成によって、本発明は独立駆動及び携帯が可能な細胞またはウイルス破壊装置を具現するようになる。
【００３７】
図３Ａは本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップの構成を示した斜視図であり、図３Ｂはそれについての実際の平面写真である。
【００３８】
図３Ａ及び図３Ｂを参照すると、本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップ１２０は、上方に開口した反応チャンバー１２１ａが中央部に形成されたチップボディー部１２１と、チップボディー部１２１の上部に付着して反応チャンバー１２１ａの上部を密閉させ、反応チャンバー１２１ａに向かって貫通するように試料導入口１２２ａ及び導出口１２２ｂが形成されたチップカバー部１２２を含んでなる。
【００３９】
チップボディー部１２１の材質は、ガラス、重合体、シリコンを含むことができ、好ましくは、１００℃以上で耐えることができるシリコンウエハーを用いて作ることが良い。チップボディー部１２１の内部はチャンバー１２１ａの気泡発生を抑制するためにシグマコート（Ｓｉｇｍａｃｏａｔ（登録商標））によりコーティングすることによって、疏水性の条件を満たすことが好ましい。
【００４０】
チップカバー部１２２はチップボディー部１２１の上面に付着して反応チャンバー１２１ａの上部を密閉させ、試料導入口１２２ａ及び導出口１２２ｂが反応チャンバー１２１ａに向かって貫通するように形成される。チップカバー部１２２はチップ内にレーザーが通過できるように透過率９０％以上の材質が適合し、ガラス、重合体、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラスを含むことが良い。条件に最も適合したガラスとしては、ホウケイ酸ガラス（Ｐｙｒｅｘ ７７４０（登録商標））を用いることが好ましい。レーザーの透過率を増加させるためには、チップカバー部１２２にレーザーの反射防止コーティングを施すことが好ましい。
【００４１】
このような構成の細胞溶解チップ１２０には、試料導入口１２２ａを介して試料と磁性ビーズ（不図示）が混ざり合って投入される。
【００４２】
磁性ビーズはレーザー光を吸収して熱及び運動エネルギーを細胞に伝達する。レーザーにより加熱された磁性ビーズは、間接的には水溶液の温度を上げ、直接的には加熱された高温の磁性ビーズが細胞と直接接触しながら細胞表面を破壊する。
【００４３】
磁性ビーズの大きさは５０ｎｍないし１，０００μｍであることが好ましく、より好ましくは１μｍないし５０μｍである。これは、磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ未満では物理的及び機械的な強度が不十分であるため衝撃に弱い問題があり、１，０００μｍを超えればＬＯＣに効果的な大きさの制限の問題が生じるためである。磁性ビーズは磁性を帯びるものならば、いかなるものでも用いることができ、特に、強磁性を帯びるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒなどの金属、及びそれらの酸化物からなる群より選択される１つ以上の物質を含むことが好ましい。磁性ビーズの表面は重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスに強磁性を帯びる金属でコーティングすることができ、その表面は、ＤＮＡが付着していないように負電荷を帯びる構造であることが好ましい。これは、連続的な精製工程のためにも好ましい。
【００４４】
前述した構成の細胞溶解チップ１２０は振動部１３０により固定されてレーザーの照射方向と垂直に振動力の伝達を受けるようになる。
【００４５】
図４は本発明の一実施形態に係る振動部の構成を示した斜視図である。
【００４６】
本発明の一実施形態に係る振動部１３０は、図４に示したように、振動モーター１３１と、振動モーター１３１を内設し、細胞溶解チップ１２０を固定して振動力を伝達するホルダー１３２と、ホルダー１３２を外部フレーム１３５に対して移動可能に連結するシャフト１３３と、シャフト１３３に外嵌されてホルダー１３２の動きを弾性力で制限するスプリング１３４を含む。
【００４７】
振動モーター１３１はレーザーの照射方向と垂直をなして振動し、その振動力はシャフト１３３に外嵌されたスプリング１３４の弾性力で制限する。それによって、振動モーター１３１の上段に載置したチップをシャフト１３３の軸方向に直線往復運動させる。この時、振幅は振動モーター１３１の駆動電圧とスプリング１３４のスプリング定数により定められる。
【００４８】
ホルダー１３２の一側にはチップ吐出ピン１３２ａが垂直に挿設される。これは反応の完了後、ホルダー１３２の上面に載置したチップを効率的に除去するために使用するもので、指で押圧して反対側（チップ載置面）に突出させる。それによって、ホルダー１３２とチップを離間させることができる。
【００４９】
レーザーはシャフト１３３の軸方向と垂直に細胞溶解チップ１２０上に照射され、前述した細胞溶解チップ１２０の往復運動によりレーザー光は反応チャンバー１２１ａに受容された試料に広く均一に照射される。また、細胞溶解チップ１２０に伝えられた振動は反応チャンバー１２１ａ内部の試料と磁性ビーズを効率的に混ぜる役割を担うと共に、レーザーに露出しない部位の細胞などを中央の照射部位に移動させる機能を有する。
【００５０】
このような構成の振動部１３０はヒンジにより本体１１０に結合され、細胞溶解チップ１２０の入替えのために本体１１０から回転して開放することができ（図１Ｂ参照）、細胞の溶解過程を行う時には閉鎖して、フック１３６と板スプリング１３７により本体１１０に固設される。これは振動によりレーザーの稼動中に振動部１３０が任意に開放することを阻止するためである。一方、このような振動部１３０の開閉過程は、内部の駆動手段により自動で行うことができる。
【００５１】
図５は本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップにレーザーが照射される状態を示した図面であり、図６は本発明の一実施形態に係るレーザーダイオードから供給されるレーザーの指向性をレーザーの出力による照射角で示したグラフであり、図７は図６のレーザーの照射距離によるビームプロファイルを示した写真である。
【００５２】
本発明の一実施形態に用いるレーザーの出力は、細胞を破壊するのに十分なエネルギーを伝達するため、連続波動（ＣＷ）方式の場合１００ｍＷ以上、パルス方式の場合、３ｍＪ／パルス以上のエネルギーを伝達しなければならない。ところが、このような条件を満たすと共にバッテリーにより具現できる小型の細胞破壊装置を具現するために、本発明の一実施形態に係るレーザーダイオード１４１は、約１Ｗ級のレーザーの出力を有することが好ましい。
【００５３】
レーザーダイオード１４１は、図５に示したように、ホルダー１３２の上部に載置した細胞溶解チップ１２０を所定距離をおいて照射することによって、細胞またはウイルスを破壊できる出力の光エネルギーを伝達するようになる。この時、レーザーダイオード１４１から転写されるレーザーは両軸に相異なる発散角度を有することが好ましい。これはチャンネル状の反応チャンバー１２１ａに照射される面積を最大に確保するためである。
【００５４】
本発明の一実施形態に適合したレーザーダイオード１４１の照射特性は、図６の指向性グラフから確認することができる。すなわち、レーザーダイオード１４１の照射特性は、ＦＷＨＭ（Ｆｕｌｌ Ｗｉｄｔｈ ａｔ Ｈａｌｆ Ｍａｘｉｍｕｍ）基準のレーザーパワーにおいて、水平方向には８°、垂直方向には３２°の転写角度を有する。
【００５５】
ＦＷＨＭ基準のレーザーパワーにおいて、レーザーダイオード１４１の実際照射距離による照射面積の相対的比較は、図７のビームプロファイルから確認することができる。図７を参照すれば、本発明の一実施形態における実験値で採択した６ｍｍの照射距離では、２．８９ｍｍ２の照射面積を有するようになって、１５ｍｍ２広さの反応チャンバー１２１ａを備えた細胞溶解チップ１２０を採択する場合、約１９％程度の直接照射面積を確保するようになる。
【００５６】
この時、前述した原理でホルダー１３２を振動させて細胞溶解チップ１２０の移動距離を±０．８ｍｍに調節すると、レーザー光が照射される面積は１５ｍｍ２広さの反応チャンバー１２１ａの約５６％をカバーするようになる。それによって、振動のない場合に比べて、約３倍程度照射面積が増加する効果が得られる。
【００５７】
以下、図８のブロック図を参照して本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の作動を詳細に説明する。
【００５８】
制御部１５０は所定の入力手段によりレーザーダイオード１４１と振動モーター１３１及び冷却ファン１６０を指定時間の間に動作させるようにプログラムされ、スイッチ１１０ａから入力される信号に基づいてプログラムを実行する。このためにレーザーダイオード１４１及び振動モーター１３１を指定時間の間稼動させることができるタイマー（不図示）を内設することが好ましい。
【００５９】
制御部１５０から電流制御信号が送出されると、駆動電源１７０を介して電流が供給されるようになって、設定した光量分レーザーダイオード１４１からレーザーが転写されるようになる。ヒートシンク１４２はレーザーの駆動により上昇する熱を吸収・分散して低減させる。ヒートシンク１４２の一側に付着された温度センサー１４３は発熱による上昇温度を測定し、当該温度値はＡ／Ｄコンバーター１９０によりデジタル信号に変換して制御部１５０に送出する。
【００６０】
それと同時に、レーザーダイオード１４１に流れる電流や電圧値は、Ａ／Ｄコンバーター１９０によりデジタル信号に変換して制御部１５０に送出する。
【００６１】
制御部１５０においては、モニター信号で入力したレーザーダイオード１４１の電流や電圧値を初期設定値と比較して、レーザーダイオード１４１が所定時間の間に一定光量を維持するように制御すると共に、入力された温度データに基づいて冷却ファン１６０を駆動する。この時、設定した所定の温度限界値を超過する場合は、レーザー光量を非常制御するようになる。また、制御部１５０においては、設定値により振動モーターの作動や振幅を制御する。
【００６２】
一方、制御部１５０は別の補助メモリ１８０を備えるので、電源オフの状態などであっても設定値や測定値などを格納することができる。この時、補助メモリ１８０はプログラミング可能な読み出し専用メモリとして、コスト節減や簡便性の面においては、電気的信号で消去可能なＥＥＰＲＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ｅｒａｓａｂｌｅ ＰＲＯＭ）を使用することが好ましい。また、ＵＶＥＰＲＯＭやフラッシュメモリを使用することも可能である。
【００６３】
装置を作動させるために必要とする各種の因数値はコンピュータから有線または無線通信網を通じて入力され、補助メモリ１８０、好ましくはＥＥＰＲＯＭに格納されて電源オフの状態においても、その値を維持することができる。それによって、コンピュータとの連結が切れた後にも独立的な駆動が可能になる。
【００６４】
一方、冷却ファン１６０の駆動条件は、前述したようにヒートシンク１４２の温度値に基づいて駆動を制御することができるが、駆動条件を任意に変更してスイッチングにより常に駆動したり、レーザーの動作時にだけ駆動したりすることも可能である。
【００６５】
［実験例１］
レーザーによる細胞溶解効率
本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置１００による細胞溶解効率を調べるために、グラム陰性細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を濃度別（２×１０４、２×１０３、２×１０２、２×１０細胞／μｌ）に分類してＰＣＲ分析を施した。レーザーパワーは０．８Ｗ、レーザー照射時間は４０秒であり、照射距離は６ｍｍである。投入した磁性ビーズの濃度は１０７ｂｅａｄｓ／μｌであり、ビードサイズは１μｍである。対照群のうちコントロールは、大腸菌細胞を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清液だけを選別してＰＣＲしたものであり、ボイリングは大腸菌細胞を９５°Ｃで、５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡを用いてＰＣＲしたものである。
【００６６】
図９は前述の条件下で溶解した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から放出されたＤＮＡを濃度別にＰＣＲ分析した結果を示したグラフであり、図１０は図９の結果をコントロール状態とボイリング状態におけるＰＣＲ分析結果を比較して相対的に示したグラフである。この時、棒は増幅されたＤＮＡ濃度のＣｐ（Ｃｒｏｓｓ Ｐｏｉｎｔ）値を表し、誤差の棒は３回繰り返した時の標準偏差を表す。
【００６７】
図９及び図１０によると、本発明装置１００を用いてレーザーによる細胞溶解効率は、濃度変化量に比例して一定に増加するようになり、いかなる濃度状態においてもボイリングやコントロールに比べて細胞溶解効率が格段に高いことを確認することができる。したがって、本発明の装置１００によれば、低出力（０．８Ｗ）のレーザーパワーを用いても細胞濃度と無関係にグラム陰性細菌を含む各種の細胞を効率的に溶解できることが分かる。
【００６８】
［実験例２］
レーザーの照射による細胞の生存能
本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置１００によるレーザー照射後の細胞の生存能を調べるために、グラム陰性細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をレーザーで溶解してＰｅｔｒｉｆｉｌｍ（３Ｍ製造、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃｏｌｉｆｏｒｍ Ｃｏｕｎｔ ｐｌａｔｅ）で１２時間以上培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）計数した。培養液の濃度は１０５細胞／μｌである。レーザーパワーは１．０Ｗ以下、照射時間は４０秒であり、照射距離は６ｍｍである。投入した磁性ビーズの濃度は１０７ｂｅａｄｓ／μｌで、ビードサイズは１μｍである。
【００６９】
図１１は前述の条件下で溶解した大腸菌の培養液をコロニー計数した結果を示したグラフである。振動は、振動モーターを稼動した時を表し、誤差の棒は３回繰り返した時の標準偏差を表す。
【００７０】
図１１から分かるように、レーザーパワーを０．４Ｗ以上増加させて細胞溶解チップ１２０を振動した場合、細胞のコロニー数値が急激に減ることを確認することができる。すなわち、レーザー照射だけで行った場合に比べて振動モーター１３１を使用した場合、より低いレーザーパワーで細胞がより一層迅速に破壊されて死ぬことを確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上のように、本発明に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置は、安価のレーザーダイオードを用いて小型化が可能であり、バッテリーだけで駆動できる独立システムを構築することによって、携帯が可能である。
【００７２】
また、細胞溶解チップをレーザー光の照射方向と垂直に振動するようにするホルダー構造を備えるので、別の拡散レンズなどを使用しなくても低容量のレーザーを活用して広い光照射面積を確保して細胞溶解効率が増大できる。
【００７３】
さらに、レーザーと磁性ビーズを共に用いて振動させることによって、細胞またはウイルスを迅速且つ効率的に破壊できる。
【００７４】
従って、本発明の産業利用性はきわめて高いものといえる。
【００７５】
一方、本発明は図面に示した実施形態を参照して説明したが、これは例示的なものにすぎず、当業者ならばそれから多様な変形及び均等な実施形態が可能である点を理解できるはずであり、本発明の真の技術的な保護範囲は本発明の特許請求範囲によって定められるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の外形を示した斜視図である。
【図１Ｂ】振動部を開放した状態の外形を示した斜視図である。
【図２】図１Ａに示したレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の内部構成を示した斜視図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップの構成を示した斜視図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示した細胞溶解チップの実際写真である。
【図４】本発明の一実施形態に係る振動部の構成を示した斜視図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップにレーザーが照射される状態を示した図面である。
【図６】本発明の一実施形態に係るレーザーダイオードから供給されるレーザーの指向性をレーザーの出力による照射角で示したグラフである。
【図７】図６のレーザーの照射距離によるビームプロファイルを示した写真である。
【図８】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の作動を説明するためのブロック図である。
【図９】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置により溶解した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から放出されたＤＮＡを、濃度別にＰＣＲ分析した結果を示したグラフである。
【図１０】図９のＰＣＲ分析結果を、コントロール状態とボイリング状態におけるＰＣＲ分析結果と比較して相対的に示したグラフである。
【図１１】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置により溶解した大腸菌の培養液をコロニー計数した結果を示したグラフである。
【符号の説明】
【００７７】
１００ 細胞またはウイルスの破壊装置、
１１０ 本体、
１２０ 細胞溶解チップ、
１３０ 振動部、
１３１ 振動モーター、
１３２ ホルダー、
１３３ シャフト、
１３４ スプリング、
１４０ レーザー発生部、
１４１ レーザーダイオード、
１４２ ヒートシンク、
１４３ 温度センサー、
１５０ 制御部、
１６０ 冷却ファン、
１７０ 駆動電源、
１８０ 補助メモリ、
１９０ Ａ／Ｄコンバーター。
【技術分野】
【０００１】
本発明はレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置に関するもので、より詳細には、レーザーを用いて細胞またはウイルスを速かに溶解させてＤＮＡを効果的に抽出できる携帯用レーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、特定病原菌の分子学的診断は４ステップ、すなわち細胞溶解、ＤＮＡ分離、ＤＮＡ増幅、及びＤＮＡ検出を含む。
【０００３】
ＤＮＡ増幅には、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、核酸基材増幅、修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ヘリカーゼ連鎖反応、ＱＢ複製酵素増幅、及び連結が活性化された転写が含まれる。
【０００４】
細胞からＤＮＡを分離する方法は、ＤＮＡを結合する傾向を有する物質を用いて行う。ＤＮＡの分離のための物質の例は、シリカ、ガラスファイバ、陰イオン交換樹脂、及び磁性ビーズなどがある（非特許文献１、非特許文献２参照）。細胞溶解は通常、機械的、化学的、熱的、電気的、超音波、及びマイクロウェーブ方法で行う（非特許文献３参照）。
【０００５】
化学的方法は、細胞を破壊してＤＮＡを放出するために溶解剤を用いる。カオトロピック試薬を用いた細胞抽出物の付加的な処理ステップが、蛋白質を変性させるために必要である。化学的溶解方法の短所は、細胞を破壊するために粗い化学物質を用いることである。それらは、連続的に行うＰＣＲ反応を妨害しうるため、ＰＣＲ反応前にＤＮＡを精製することが不可避である。この化学的方法は、労働集約的であり、時間を必要とし、高価な消耗品を必要とし、時折ＤＮＡ収率が低い問題点がある。また熱的方法は、引続いた凍結／融解サイクルが関与するが、時折細胞内の多くの構造物を破壊できない短所がある。
【０００６】
加熱は、細胞壁または細胞膜を破壊する代替的な方法である。簡単な加熱の短所は、放出されたＤＮＡに付着しうる蛋白質を変性させることである。それらは、ＤＮＡ増幅を妨害しうる。物理的な方法は、その体積が大きくて、高価な圧力装置を利用するが、それはＬＯＣ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）への適用に適さない。
【０００７】
超音波処理は、代替的な物理的方法であり、一般的には超音波水槽に設けられたチャンバー内に細胞溶液または懸濁液を収納して行う。しかし、超音波破壊は、細胞溶解において多くの短所を有する。第一に、超音波のエネルギー分布は、均一でない。超音波エネルギーの不均一な分布は、また一貫性のない結果を招く。第二に、超音波水槽は容器にエネルギーを集中することができないため、細胞を完全に破壊させるためには、時折数分かかってしまう。最後に、超音波方法は、人間の耳に不快な音を感じさせる。
【０００８】
レーザーは、細胞を破壊するのに多くの長所を有し、ＬＯＣに容易に適用できる（非特許文献４参照）。一方、特許文献１には、レーザー誘導された細胞溶解システムが開示されている。しかし、レーザーだけを用いたとき、細胞を効果的に溶解できない。透明度の高い溶液に大腸菌を入れて実験した結果、レーザーだけを照射した場合に、低い細胞溶解効率しか得られないことを確認した。また、１５０秒間レーザーを照射した後のＤＮＡ濃度は、３．７７ｎｇ／μｌであったが、９５℃で５分間煮沸した後のＤＮＡ濃度は、６．１５ｎｇ／μｌであった。これは、レーザーエネルギーが効果的に細胞に伝達されていないためである。
【０００９】
さらに、このような従来のレーザー細胞溶解システムは、サイズの大きいレーザー発生装置及び収斂レンズなどを備えるため、装備の製造コストが高く、携帯が不可能な問題点があった。これを改善するために低容量のレーザー発生装置を用いる技術が試みられたが、この場合も溶解対象細胞またはウイルスの反応面積に比べて光照射面積が小さいため、均一且つ効率的な細胞溶解ステップを行うことができない問題点が通常存在する。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／９６４２９Ａ１号明細書
【非特許文献１】Ｒｕｄｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ ２２，ｐｐ．５０６〜５１１（１９９７）
【非特許文献２】Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ ２２，ｐｐ．５５４〜５５７（１９９７）
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，ｐｐ．４９２〜４９６（２００１）
【非特許文献４】Ｈｕａｉｎａ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，ｐｐ．４６２５〜４６３１（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、前述の従来技術の問題点を解決するためになされた本発明は、安価のレーザーダイオードを用いた細胞破壊技術を活用し、携帯が可能な小型のレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供することにその目的がある。
【００１１】
本発明の他の目的は、細胞溶解チップをレーザー光の照射方向と垂直に振動するようにするホルダー構造を備えることによって、別途に拡散レンズなどを使用しなくても低容量のレーザーを活用して広い光照射面積を確保することができるレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、レーザーと磁性ビーズを共に用いて振動させることによって、細胞またはウイルスを迅速且つ効率的に破壊できるレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような目的を達成するための本発明に係るレーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置は、レーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置において、試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を介して試料と前記磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、前記細胞溶解チップを固定して所定方向に振動力を与える振動部と、前記細胞溶解チップにレーザーを供給するレーザー発生部と、前記振動部及びレーザー発生部の駆動を制御する制御部と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
ここで、前記振動部は、振動モーターと、前記振動モーターを内設し、前記細胞溶解チップを固定して振動力を伝達するホルダーと、前記ホルダーを前記振動部に移動可能に連結するシャフトと、及び前記シャフトに外嵌されて前記ホルダーの動きを弾性力で制限するスプリングと、を含むことが好ましい。
【００１５】
また、前記振動モーターの振動方向はレーザーの照射方向と垂直であることが好ましい。
【００１６】
また、前記レーザー発生部は光源としてレーザーダイオード（ＬＤ）を含むことが好ましい。
【００１７】
また、前記レーザーダイオードから供給されるレーザーは垂直方向と水平方向との発散角度が相異なることが好ましい。
【００１８】
また、前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生した熱を吸収して分散させるヒートシンクを含むことが好ましい。
【００１９】
また、前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生する温度を検知し、検知した温度データを前記制御部に伝達する温度センサーを含むことが好ましい。
【００２０】
また、前記レーザー発生部の一側には前記制御部により稼動されて装置内部から発生した熱を空冷させる冷却ファンが設けられることが好ましい。
【００２１】
また、前記細胞溶解チップは、上方に開口した反応チャンバーが中央部に形成されたチップボディー部と、前記チップボディー部の上面に付着して前記反応チャンバーの上部を密閉させ、前記反応チャンバー内にレーザーが貫通するようにし、前記反応チャンバーに向かって貫通するように試料導入口及び導出口が形成されたチップカバー部と、を含むことが好ましい。
【００２２】
また、前記反応チャンバーは前記レーザー供給部により供給されるレーザーの照射面積より広いことが好ましい。
【００２３】
また、前記制御部は前記レーザーダイオード及び前記駆動モーターを指定時間の間稼動させるタイマーを含むことが好ましい。
【００２４】
また、前記レーザー稼動に必要とする各種因数値を格納して前記制御部に印加する補助メモリをさらに含むことが好ましい。
【００２５】
また、前記補助メモリはＥＥＰＲＯＭ、ＵＶＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリのうちいずれかであることが好ましい。
【００２６】
さらに、前記振動部及びレーザー発生部の駆動電源としてバッテリーをさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置によれば、安価のレーザーダイオードを用いて小型化が可能であり、バッテリーだけで駆動できる独立システムを構築することによって、携帯が可能である。
【００２８】
また、本発明によれば、細胞溶解チップをレーザー光の照射方向と垂直に振動するようにするホルダー構造を備えるので、別の拡散レンズなどを使用しなくても低容量のレーザーを活用して広い光照射面積を確保して細胞溶解効率が増大できる。
【００２９】
さらに、本発明によれば、レーザーと磁性ビーズを共に用いて振動させることによって、細胞またはウイルスを迅速且つ効率的に破壊できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３１】
図１Ａは本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の外形を示した斜視図であり、図１Ｂは振動部を開放した状態の外形を示した斜視図である。図２は図１Ａに示したレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の内部構成を示した斜視図である。
【００３２】
図１Ａないし図２を参照すると、本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置１００は、試料と磁性ビーズを収容する細胞溶解チップ１２０と、本体１１０から開放可能なようにヒンジにより本体に結合され、細胞溶解チップ１２０を固定して所定方向に振動力を与える振動部１３０と、細胞溶解チップ１２０にレーザーを供給するレーザー発生部１４０、及び振動部１３０とレーザー発生部１４０の駆動を制御する制御部１５０を含んでなる。
【００３３】
レーザー発生部１４０は、光源として使われるレーザーダイオード（ｌａｓｅｒ ｄｉｏｄｅ：ＬＤ）１４１と、レーザー稼動により発生した熱を吸収して分散させるヒートシンク１４２と、ヒートシンク１４２の一側に付着してレーザー稼動により加熱された温度を検知する温度センサー１４３とを含む。
【００３４】
レーザー発生部１４０の一側には装置内部から発生した熱を空冷させる冷却ファン１６０が設けられ、振動部１３０の下段には装置に電力を供給する駆動電源１７０が入替え可能に装着される。ここで、駆動電源はバッテリーの形態であることが好ましい。
【００３５】
本体１１０の上面部には装置の駆動に必要なスイッチ１１０ａが設けられ、前面部には装置の駆動状態を表示するＬＥＤランプ１１０ｂが装着される。
【００３６】
このような一連の構成によって、本発明は独立駆動及び携帯が可能な細胞またはウイルス破壊装置を具現するようになる。
【００３７】
図３Ａは本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップの構成を示した斜視図であり、図３Ｂはそれについての実際の平面写真である。
【００３８】
図３Ａ及び図３Ｂを参照すると、本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップ１２０は、上方に開口した反応チャンバー１２１ａが中央部に形成されたチップボディー部１２１と、チップボディー部１２１の上部に付着して反応チャンバー１２１ａの上部を密閉させ、反応チャンバー１２１ａに向かって貫通するように試料導入口１２２ａ及び導出口１２２ｂが形成されたチップカバー部１２２を含んでなる。
【００３９】
チップボディー部１２１の材質は、ガラス、重合体、シリコンを含むことができ、好ましくは、１００℃以上で耐えることができるシリコンウエハーを用いて作ることが良い。チップボディー部１２１の内部はチャンバー１２１ａの気泡発生を抑制するためにシグマコート（Ｓｉｇｍａｃｏａｔ（登録商標））によりコーティングすることによって、疏水性の条件を満たすことが好ましい。
【００４０】
チップカバー部１２２はチップボディー部１２１の上面に付着して反応チャンバー１２１ａの上部を密閉させ、試料導入口１２２ａ及び導出口１２２ｂが反応チャンバー１２１ａに向かって貫通するように形成される。チップカバー部１２２はチップ内にレーザーが通過できるように透過率９０％以上の材質が適合し、ガラス、重合体、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラスを含むことが良い。条件に最も適合したガラスとしては、ホウケイ酸ガラス（Ｐｙｒｅｘ ７７４０（登録商標））を用いることが好ましい。レーザーの透過率を増加させるためには、チップカバー部１２２にレーザーの反射防止コーティングを施すことが好ましい。
【００４１】
このような構成の細胞溶解チップ１２０には、試料導入口１２２ａを介して試料と磁性ビーズ（不図示）が混ざり合って投入される。
【００４２】
磁性ビーズはレーザー光を吸収して熱及び運動エネルギーを細胞に伝達する。レーザーにより加熱された磁性ビーズは、間接的には水溶液の温度を上げ、直接的には加熱された高温の磁性ビーズが細胞と直接接触しながら細胞表面を破壊する。
【００４３】
磁性ビーズの大きさは５０ｎｍないし１，０００μｍであることが好ましく、より好ましくは１μｍないし５０μｍである。これは、磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ未満では物理的及び機械的な強度が不十分であるため衝撃に弱い問題があり、１，０００μｍを超えればＬＯＣに効果的な大きさの制限の問題が生じるためである。磁性ビーズは磁性を帯びるものならば、いかなるものでも用いることができ、特に、強磁性を帯びるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒなどの金属、及びそれらの酸化物からなる群より選択される１つ以上の物質を含むことが好ましい。磁性ビーズの表面は重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスに強磁性を帯びる金属でコーティングすることができ、その表面は、ＤＮＡが付着していないように負電荷を帯びる構造であることが好ましい。これは、連続的な精製工程のためにも好ましい。
【００４４】
前述した構成の細胞溶解チップ１２０は振動部１３０により固定されてレーザーの照射方向と垂直に振動力の伝達を受けるようになる。
【００４５】
図４は本発明の一実施形態に係る振動部の構成を示した斜視図である。
【００４６】
本発明の一実施形態に係る振動部１３０は、図４に示したように、振動モーター１３１と、振動モーター１３１を内設し、細胞溶解チップ１２０を固定して振動力を伝達するホルダー１３２と、ホルダー１３２を外部フレーム１３５に対して移動可能に連結するシャフト１３３と、シャフト１３３に外嵌されてホルダー１３２の動きを弾性力で制限するスプリング１３４を含む。
【００４７】
振動モーター１３１はレーザーの照射方向と垂直をなして振動し、その振動力はシャフト１３３に外嵌されたスプリング１３４の弾性力で制限する。それによって、振動モーター１３１の上段に載置したチップをシャフト１３３の軸方向に直線往復運動させる。この時、振幅は振動モーター１３１の駆動電圧とスプリング１３４のスプリング定数により定められる。
【００４８】
ホルダー１３２の一側にはチップ吐出ピン１３２ａが垂直に挿設される。これは反応の完了後、ホルダー１３２の上面に載置したチップを効率的に除去するために使用するもので、指で押圧して反対側（チップ載置面）に突出させる。それによって、ホルダー１３２とチップを離間させることができる。
【００４９】
レーザーはシャフト１３３の軸方向と垂直に細胞溶解チップ１２０上に照射され、前述した細胞溶解チップ１２０の往復運動によりレーザー光は反応チャンバー１２１ａに受容された試料に広く均一に照射される。また、細胞溶解チップ１２０に伝えられた振動は反応チャンバー１２１ａ内部の試料と磁性ビーズを効率的に混ぜる役割を担うと共に、レーザーに露出しない部位の細胞などを中央の照射部位に移動させる機能を有する。
【００５０】
このような構成の振動部１３０はヒンジにより本体１１０に結合され、細胞溶解チップ１２０の入替えのために本体１１０から回転して開放することができ（図１Ｂ参照）、細胞の溶解過程を行う時には閉鎖して、フック１３６と板スプリング１３７により本体１１０に固設される。これは振動によりレーザーの稼動中に振動部１３０が任意に開放することを阻止するためである。一方、このような振動部１３０の開閉過程は、内部の駆動手段により自動で行うことができる。
【００５１】
図５は本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップにレーザーが照射される状態を示した図面であり、図６は本発明の一実施形態に係るレーザーダイオードから供給されるレーザーの指向性をレーザーの出力による照射角で示したグラフであり、図７は図６のレーザーの照射距離によるビームプロファイルを示した写真である。
【００５２】
本発明の一実施形態に用いるレーザーの出力は、細胞を破壊するのに十分なエネルギーを伝達するため、連続波動（ＣＷ）方式の場合１００ｍＷ以上、パルス方式の場合、３ｍＪ／パルス以上のエネルギーを伝達しなければならない。ところが、このような条件を満たすと共にバッテリーにより具現できる小型の細胞破壊装置を具現するために、本発明の一実施形態に係るレーザーダイオード１４１は、約１Ｗ級のレーザーの出力を有することが好ましい。
【００５３】
レーザーダイオード１４１は、図５に示したように、ホルダー１３２の上部に載置した細胞溶解チップ１２０を所定距離をおいて照射することによって、細胞またはウイルスを破壊できる出力の光エネルギーを伝達するようになる。この時、レーザーダイオード１４１から転写されるレーザーは両軸に相異なる発散角度を有することが好ましい。これはチャンネル状の反応チャンバー１２１ａに照射される面積を最大に確保するためである。
【００５４】
本発明の一実施形態に適合したレーザーダイオード１４１の照射特性は、図６の指向性グラフから確認することができる。すなわち、レーザーダイオード１４１の照射特性は、ＦＷＨＭ（Ｆｕｌｌ Ｗｉｄｔｈ ａｔ Ｈａｌｆ Ｍａｘｉｍｕｍ）基準のレーザーパワーにおいて、水平方向には８°、垂直方向には３２°の転写角度を有する。
【００５５】
ＦＷＨＭ基準のレーザーパワーにおいて、レーザーダイオード１４１の実際照射距離による照射面積の相対的比較は、図７のビームプロファイルから確認することができる。図７を参照すれば、本発明の一実施形態における実験値で採択した６ｍｍの照射距離では、２．８９ｍｍ２の照射面積を有するようになって、１５ｍｍ２広さの反応チャンバー１２１ａを備えた細胞溶解チップ１２０を採択する場合、約１９％程度の直接照射面積を確保するようになる。
【００５６】
この時、前述した原理でホルダー１３２を振動させて細胞溶解チップ１２０の移動距離を±０．８ｍｍに調節すると、レーザー光が照射される面積は１５ｍｍ２広さの反応チャンバー１２１ａの約５６％をカバーするようになる。それによって、振動のない場合に比べて、約３倍程度照射面積が増加する効果が得られる。
【００５７】
以下、図８のブロック図を参照して本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の作動を詳細に説明する。
【００５８】
制御部１５０は所定の入力手段によりレーザーダイオード１４１と振動モーター１３１及び冷却ファン１６０を指定時間の間に動作させるようにプログラムされ、スイッチ１１０ａから入力される信号に基づいてプログラムを実行する。このためにレーザーダイオード１４１及び振動モーター１３１を指定時間の間稼動させることができるタイマー（不図示）を内設することが好ましい。
【００５９】
制御部１５０から電流制御信号が送出されると、駆動電源１７０を介して電流が供給されるようになって、設定した光量分レーザーダイオード１４１からレーザーが転写されるようになる。ヒートシンク１４２はレーザーの駆動により上昇する熱を吸収・分散して低減させる。ヒートシンク１４２の一側に付着された温度センサー１４３は発熱による上昇温度を測定し、当該温度値はＡ／Ｄコンバーター１９０によりデジタル信号に変換して制御部１５０に送出する。
【００６０】
それと同時に、レーザーダイオード１４１に流れる電流や電圧値は、Ａ／Ｄコンバーター１９０によりデジタル信号に変換して制御部１５０に送出する。
【００６１】
制御部１５０においては、モニター信号で入力したレーザーダイオード１４１の電流や電圧値を初期設定値と比較して、レーザーダイオード１４１が所定時間の間に一定光量を維持するように制御すると共に、入力された温度データに基づいて冷却ファン１６０を駆動する。この時、設定した所定の温度限界値を超過する場合は、レーザー光量を非常制御するようになる。また、制御部１５０においては、設定値により振動モーターの作動や振幅を制御する。
【００６２】
一方、制御部１５０は別の補助メモリ１８０を備えるので、電源オフの状態などであっても設定値や測定値などを格納することができる。この時、補助メモリ１８０はプログラミング可能な読み出し専用メモリとして、コスト節減や簡便性の面においては、電気的信号で消去可能なＥＥＰＲＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ｅｒａｓａｂｌｅ ＰＲＯＭ）を使用することが好ましい。また、ＵＶＥＰＲＯＭやフラッシュメモリを使用することも可能である。
【００６３】
装置を作動させるために必要とする各種の因数値はコンピュータから有線または無線通信網を通じて入力され、補助メモリ１８０、好ましくはＥＥＰＲＯＭに格納されて電源オフの状態においても、その値を維持することができる。それによって、コンピュータとの連結が切れた後にも独立的な駆動が可能になる。
【００６４】
一方、冷却ファン１６０の駆動条件は、前述したようにヒートシンク１４２の温度値に基づいて駆動を制御することができるが、駆動条件を任意に変更してスイッチングにより常に駆動したり、レーザーの動作時にだけ駆動したりすることも可能である。
【００６５】
［実験例１］
レーザーによる細胞溶解効率
本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置１００による細胞溶解効率を調べるために、グラム陰性細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を濃度別（２×１０４、２×１０３、２×１０２、２×１０細胞／μｌ）に分類してＰＣＲ分析を施した。レーザーパワーは０．８Ｗ、レーザー照射時間は４０秒であり、照射距離は６ｍｍである。投入した磁性ビーズの濃度は１０７ｂｅａｄｓ／μｌであり、ビードサイズは１μｍである。対照群のうちコントロールは、大腸菌細胞を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清液だけを選別してＰＣＲしたものであり、ボイリングは大腸菌細胞を９５°Ｃで、５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡを用いてＰＣＲしたものである。
【００６６】
図９は前述の条件下で溶解した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から放出されたＤＮＡを濃度別にＰＣＲ分析した結果を示したグラフであり、図１０は図９の結果をコントロール状態とボイリング状態におけるＰＣＲ分析結果を比較して相対的に示したグラフである。この時、棒は増幅されたＤＮＡ濃度のＣｐ（Ｃｒｏｓｓ Ｐｏｉｎｔ）値を表し、誤差の棒は３回繰り返した時の標準偏差を表す。
【００６７】
図９及び図１０によると、本発明装置１００を用いてレーザーによる細胞溶解効率は、濃度変化量に比例して一定に増加するようになり、いかなる濃度状態においてもボイリングやコントロールに比べて細胞溶解効率が格段に高いことを確認することができる。したがって、本発明の装置１００によれば、低出力（０．８Ｗ）のレーザーパワーを用いても細胞濃度と無関係にグラム陰性細菌を含む各種の細胞を効率的に溶解できることが分かる。
【００６８】
［実験例２］
レーザーの照射による細胞の生存能
本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置１００によるレーザー照射後の細胞の生存能を調べるために、グラム陰性細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をレーザーで溶解してＰｅｔｒｉｆｉｌｍ（３Ｍ製造、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃｏｌｉｆｏｒｍ Ｃｏｕｎｔ ｐｌａｔｅ）で１２時間以上培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）計数した。培養液の濃度は１０５細胞／μｌである。レーザーパワーは１．０Ｗ以下、照射時間は４０秒であり、照射距離は６ｍｍである。投入した磁性ビーズの濃度は１０７ｂｅａｄｓ／μｌで、ビードサイズは１μｍである。
【００６９】
図１１は前述の条件下で溶解した大腸菌の培養液をコロニー計数した結果を示したグラフである。振動は、振動モーターを稼動した時を表し、誤差の棒は３回繰り返した時の標準偏差を表す。
【００７０】
図１１から分かるように、レーザーパワーを０．４Ｗ以上増加させて細胞溶解チップ１２０を振動した場合、細胞のコロニー数値が急激に減ることを確認することができる。すなわち、レーザー照射だけで行った場合に比べて振動モーター１３１を使用した場合、より低いレーザーパワーで細胞がより一層迅速に破壊されて死ぬことを確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上のように、本発明に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置は、安価のレーザーダイオードを用いて小型化が可能であり、バッテリーだけで駆動できる独立システムを構築することによって、携帯が可能である。
【００７２】
また、細胞溶解チップをレーザー光の照射方向と垂直に振動するようにするホルダー構造を備えるので、別の拡散レンズなどを使用しなくても低容量のレーザーを活用して広い光照射面積を確保して細胞溶解効率が増大できる。
【００７３】
さらに、レーザーと磁性ビーズを共に用いて振動させることによって、細胞またはウイルスを迅速且つ効率的に破壊できる。
【００７４】
従って、本発明の産業利用性はきわめて高いものといえる。
【００７５】
一方、本発明は図面に示した実施形態を参照して説明したが、これは例示的なものにすぎず、当業者ならばそれから多様な変形及び均等な実施形態が可能である点を理解できるはずであり、本発明の真の技術的な保護範囲は本発明の特許請求範囲によって定められるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の外形を示した斜視図である。
【図１Ｂ】振動部を開放した状態の外形を示した斜視図である。
【図２】図１Ａに示したレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の内部構成を示した斜視図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップの構成を示した斜視図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示した細胞溶解チップの実際写真である。
【図４】本発明の一実施形態に係る振動部の構成を示した斜視図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る細胞溶解チップにレーザーが照射される状態を示した図面である。
【図６】本発明の一実施形態に係るレーザーダイオードから供給されるレーザーの指向性をレーザーの出力による照射角で示したグラフである。
【図７】図６のレーザーの照射距離によるビームプロファイルを示した写真である。
【図８】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置の作動を説明するためのブロック図である。
【図９】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置により溶解した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から放出されたＤＮＡを、濃度別にＰＣＲ分析した結果を示したグラフである。
【図１０】図９のＰＣＲ分析結果を、コントロール状態とボイリング状態におけるＰＣＲ分析結果と比較して相対的に示したグラフである。
【図１１】本発明の一実施形態に係るレーザー及び磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置により溶解した大腸菌の培養液をコロニー計数した結果を示したグラフである。
【符号の説明】
【００７７】
１００ 細胞またはウイルスの破壊装置、
１１０ 本体、
１２０ 細胞溶解チップ、
１３０ 振動部、
１３１ 振動モーター、
１３２ ホルダー、
１３３ シャフト、
１３４ スプリング、
１４０ レーザー発生部、
１４１ レーザーダイオード、
１４２ ヒートシンク、
１４３ 温度センサー、
１５０ 制御部、
１６０ 冷却ファン、
１７０ 駆動電源、
１８０ 補助メモリ、
１９０ Ａ／Ｄコンバーター。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置において、
試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を介して試料と前記磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、
前記細胞溶解チップを固定して所定方向に振動力を与える振動部と、
前記細胞溶解チップにレーザーを供給するレーザー発生部と、
前記振動部及び前記レーザー発生部の駆動を制御する制御部と、
を含むことを特徴とする細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項２】
前記振動部は、
振動モーターと、
前記振動モーターを内設し、前記細胞溶解チップを固定して振動力を伝達するホルダーと、
前記ホルダーを前記振動部に移動可能に連結するシャフトと、
前記シャフトに外嵌されて前記ホルダーの動きを弾性力で制限するスプリングと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項３】
前記振動モーターの振動方向はレーザーの照射方向と垂直であることを特徴とする請求項２に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項４】
前記レーザー発生部は光源としてレーザーダイオード（ＬＤ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項５】
前記レーザーダイオードから供給されるレーザーは垂直方向と水平方向との発散角度が相異なることを特徴とする請求項４に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項６】
前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生した熱を吸収して分散させるヒートシンクを含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項７】
前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生する温度を検知し、検知した温度データを前記制御部に伝達する温度センサーを含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項８】
前記レーザー発生部の一側には前記制御部により駆動されて装置内部から発生した熱を空冷させる冷却ファンが設けられることを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項９】
前記細胞溶解チップは、
上方に開口した反応チャンバーが中央部に形成されたチップボディー部と、
前記チップボディー部の上面に付着して前記反応チャンバーの上部を密閉させ、前記反応チャンバー内にレーザーが貫通するようにし、前記反応チャンバーに向かって貫通するように試料導入口及び導出口が形成されたチップカバー部と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１０】
前記反応チャンバーは前記レーザー供給部により供給されるレーザーの照射面積より広いことを特徴とする請求項９に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１１】
前記レーザー発生部は光源としてレーザーダイオードを含み、
前記制御部は前記レーザーダイオード及び前記振動モーターを指定時間の間稼動させるタイマーを含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１２】
前記レーザー稼動に必要とする各種因数値を格納して前記制御部に印加する補助メモリをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１３】
前記補助メモリはＥＥＰＲＯＭ、ＵＶＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリのうちいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１４】
前記振動部及び前記レーザー発生部の駆動電源としてバッテリーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１】
レーザーまたは磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの破壊装置において、
試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を介して試料と前記磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、
前記細胞溶解チップを固定して所定方向に振動力を与える振動部と、
前記細胞溶解チップにレーザーを供給するレーザー発生部と、
前記振動部及び前記レーザー発生部の駆動を制御する制御部と、
を含むことを特徴とする細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項２】
前記振動部は、
振動モーターと、
前記振動モーターを内設し、前記細胞溶解チップを固定して振動力を伝達するホルダーと、
前記ホルダーを前記振動部に移動可能に連結するシャフトと、
前記シャフトに外嵌されて前記ホルダーの動きを弾性力で制限するスプリングと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項３】
前記振動モーターの振動方向はレーザーの照射方向と垂直であることを特徴とする請求項２に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項４】
前記レーザー発生部は光源としてレーザーダイオード（ＬＤ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項５】
前記レーザーダイオードから供給されるレーザーは垂直方向と水平方向との発散角度が相異なることを特徴とする請求項４に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項６】
前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生した熱を吸収して分散させるヒートシンクを含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項７】
前記レーザー発生部はレーザー稼動により発生する温度を検知し、検知した温度データを前記制御部に伝達する温度センサーを含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項８】
前記レーザー発生部の一側には前記制御部により駆動されて装置内部から発生した熱を空冷させる冷却ファンが設けられることを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項９】
前記細胞溶解チップは、
上方に開口した反応チャンバーが中央部に形成されたチップボディー部と、
前記チップボディー部の上面に付着して前記反応チャンバーの上部を密閉させ、前記反応チャンバー内にレーザーが貫通するようにし、前記反応チャンバーに向かって貫通するように試料導入口及び導出口が形成されたチップカバー部と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１０】
前記反応チャンバーは前記レーザー供給部により供給されるレーザーの照射面積より広いことを特徴とする請求項９に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１１】
前記レーザー発生部は光源としてレーザーダイオードを含み、
前記制御部は前記レーザーダイオード及び前記振動モーターを指定時間の間稼動させるタイマーを含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１２】
前記レーザー稼動に必要とする各種因数値を格納して前記制御部に印加する補助メモリをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１３】
前記補助メモリはＥＥＰＲＯＭ、ＵＶＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリのうちいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【請求項１４】
前記振動部及び前記レーザー発生部の駆動電源としてバッテリーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞またはウイルスの破壊装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−８２５４８（Ｐ２００７−８２５４８Ａ）
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５７９６２（Ｐ２００６−２５７９６２）
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【Ｆターム（参考）】
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