レーザ加熱による液体膨張圧を用いたマイクロインジェクション法
【課題】 キャピラリーの外部から熱風を吹き付けることなく、キャピラリーの内部に保持された液体を加熱し、当該液体の熱膨張圧を利用して、キャピラリーの内部に保持された目的の液体を吐出することができる液体吐出法を提供する。
【解決手段】 一端に液体吐出口を有するキャピラリーの内部に、第一の液体層及びレーザ光吸収剤を含有する第二の液体層を、前記第一の液体層が前記液体吐出口側に位置するように保持させ、前記第二の液体層を前記キャピラリーの内部に密閉する密閉部を形成し、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、前記キャピラリーの液体吐出口から前記第一の液体層の液体を吐出させる。
【解決手段】 一端に液体吐出口を有するキャピラリーの内部に、第一の液体層及びレーザ光吸収剤を含有する第二の液体層を、前記第一の液体層が前記液体吐出口側に位置するように保持させ、前記第二の液体層を前記キャピラリーの内部に密閉する密閉部を形成し、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、前記キャピラリーの液体吐出口から前記第一の液体層の液体を吐出させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体吐出法、特にマイクロインジェクション法に適用することができる液体吐出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、タンパク質等の目的物質を細胞内に導入するには、マイクロキャピラリー（マイクロピペットとも呼ばれる）を用いたマイクロインジェクション法が利用されている。従来のマイクロインジェクション法では、先端部が針状となっているマイクロキャピラリーの内部に目的物質を含有する液体を保持し、キャピラリーの先端部を細胞内に挿入し、空気圧又は油圧を利用してキャピラリーの内部に保持された液体を細胞内へ吐出させることにより、目的物質を細胞内にインジェクションする。
【０００３】
キャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下にすると、細胞にダメージを与えることなく、目的物質を含有する液体を細胞内にインジェクションできるとともに、キャピラリーの先端部の内径を、細胞内にインジェクションされる液体量を精密に制御できる大きさとすることができる。
【０００４】
しかしながら、空気圧又は油圧を利用してキャピラリーの内部に保持された液体を吐出させる場合、十分な吐出圧が得られないため、キャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下にすると、キャピラリーの先端部が詰るおそれがある。このため、空気圧又は油圧を利用してキャピラリーの内部に保持された液体を吐出させる場合、細胞にダメージを与えることなく液体を細胞内にインジェクションすること、及び細胞内にインジェクションされる液体量を精密に制御することを実現することは困難である。
【０００５】
このような状況の下、図７に示すように、一端に液体吐出口３１を有し、他端に液体導入口３２を有するガラス製のマイクロキャピラリー３０の内部に、液体導入口３２から、核酸を含有する液体サンプルＬ、液体合金であるガリンスタンＧ及びシリコンオイルＳを順に導入し、エポキシ樹脂Ｅを満たしたガラスキャップ４０で液体導入口３２を封止し、マイクロキャピラリー３０の外部から熱風を吹き付け、ガリンスタンＧの熱膨張圧を発生させ、液体サンプルＬを液体吐出口３１から吐出させる方法が開発されている（非特許文献１）。この方法によれば、ガリンスタンＧの熱膨張により発生する熱膨張圧を利用することで、空気圧又は油圧を利用する場合よりも大きな液体吐出圧を得ることができ、先端部の外径が１μｍ以下であるマイクロキャピラリー３０を用いて液体サンプルＬを吐出させることができる。
【非特許文献１】Knoblauch等，「ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」，1999年，第17巻，pp.906-909
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、マイクロキャピラリー３０の外部から熱風を吹き付けることによりガリンスタンＧを加熱する場合、ガリンスタンＧの温度制御が困難であるとともに、ガリンスタンＧの温度を制御可能な範囲も狭い。
【０００７】
また、熱風を吹き付けることによりガリンスタンＧとともにマイクロキャピラリー３０も熱膨張するため、熱膨張率が大きいガリンスタンという特殊な液体金属の使用が必要となる。
【０００８】
さらに、熱風を吹き付けることによりマイクロキャピラリー３０が振動するおそれがあるため、顕微鏡ステージ上の狭い空間において精密な作業を行うことは困難である。
【０００９】
さらに、ガリスタンＧの一部がマイクロキャピラリー３０の先端部に落下し、先端部が詰るおそれがある。
【００１０】
さらに、エポキシ樹脂Ｅを満たしたガラスキャップ４０で液体導入口３２を封止する作業は煩雑で時間を要するため、作業効率が低下する。
【００１１】
そこで、本発明は、キャピラリーの外部から熱風を吹き付けることなく、キャピラリーの内部に保持された液体を加熱し、当該液体の熱膨張圧を利用して、キャピラリーの内部に保持された目的の液体を吐出することができる液体吐出法、並びに該液体吐出法に利用できるキャピラリーホルダー及びレーザ照射装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、一端に液体吐出口を有するキャピラリーの内部に、第一の液体層及びレーザ光吸収剤を含有する第二の液体層を、前記第一の液体層が前記液体吐出口側に位置するように保持させ、前記第二の液体層を前記キャピラリーの内部に密閉する密閉部を形成し、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、前記キャピラリーの液体吐出口から前記第一の液体層の液体を吐出させることを特徴とする液体吐出法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、キャピラリー保持部と、光ファイバー装着部と、前記光ファイバー装着部に装着された光ファイバーから発せられるレーザ光が、前記キャピラリー保持部に保持されたキャピラリーの外壁面のうち目的の領域に照射されるように、前記レーザ光を案内する光通路とを備えたことを特徴とするキャピラリーホルダーを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明のキャピラリーホルダーと、前記キャピラリーホルダーの光ファイバー装着部に装着された光ファイバーと、前記光ファイバーに接続されたレーザ光源と、前記レーザ光源から発せられるレーザ光の出力をコントロールするコントローラとを備えたことを特徴とするレーザ光照射装置を提供する。
【００１５】
本発明の液体吐出法において、第二の液体層にレーザ光を照射すると、第二の液体層に含有されるレーザ光吸収剤がレーザ光を吸収して発熱し、第二の液体層は加熱されて熱膨張する。第二の液体層は第一の液体層と密閉部との間に挟まれ、キャピラリーの内部に密閉された状態で保持されているので、第二の液体層の熱膨張により熱膨張圧が発生する。密閉部により第二の液体層の密閉部方向への動きは防止されるので、第二の液体層の熱膨張圧は第一の液体層の吐出圧に変換され、第一の液体層の液体はキャピラリーの液体吐出口から吐出される。
【００１６】
本発明の液体吐出法において、レーザ光はキャピラリーを透過して第二の液体層に照射されるが、レーザ光の透過によりキャピラリーが熱膨張することはないので、第二の液体層の熱膨張圧は第一の液体層の吐出圧に迅速かつ効率よく変換され、第二の液体層の体積膨張量とほぼ等しい量の液体がレスポンスよく吐出される。したがって、第二の液体層を構成する液体としてガリンスタン等の特殊な液体金属を使用する必要はない。
【００１７】
本発明の液体吐出法において、第二の液体層の温度上昇は、レーザ光の出力を調節することにより制御することができ、第二の液体層の温度上昇を制御することにより、第一の液体層を構成する液体の吐出量を制御することができる。
【００１８】
本発明の液体吐出法において、レーザ光を照射する際、熱風を吹き付ける場合のようにキャピラリーに振動が生じることはなく、顕微鏡ステージ上の狭い空間においても精密な作業を行うことができる。
【００１９】
本発明の液体吐出法において、キャピラリーに保持された第一の液体層の液体を吐出させると第一の液体層の液量は減少するが、レーザ光の出力を調節して第二の液体層の温度上昇を制御することにより、十分に大きな第一の液体層の吐出圧を得ることができるので、第一の液体層の液量が減少しても第一の液体層の液体を吐出させることができる。したがって、キャピラリーに保持された第一の液体層の液体を繰り返し吐出させることができる。
【００２０】
本発明の液体吐出法の好ましい態様では、前記キャピラリーが他端に有する開口部から前記キャピラリーの内部に、前記第一の液体層を構成する液体、前記第二の液体層を構成する液体、及び硬化可能な液体樹脂を順に導入した後、前記液体樹脂を硬化させ、前記密閉部を形成する。本態様によれば、キャピラリーに強固に固定された密閉部を容易に形成することができる。
【００２１】
上記態様において、前記液体樹脂がエネルギー線硬化性樹脂からなることが好ましい。この場合、エネルギー線の照射により、第二の液体層を熱膨張させることなく、液体樹脂を硬化させることができる。
【００２２】
本発明の液体吐出法の好ましい態様では、前記第一の液体層が目的物質を含有しており、前記キャピラリーの液体吐出口を細胞内に挿入した状態で、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、前記キャピラリーの液体吐出口から前記細胞内に前記第一の液体層の液体を吐出させる。本態様によれば、目的物質を細胞内にインジェクションすることができる。レーザ光の出力を調節して第二の液体層の温度上昇を制御することにより、十分に大きな第一の液体層の吐出圧を得ることができるので、細胞内に挿入されるキャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下としても、キャピラリーの先端部が詰ることなく、目的物質を細胞内にインジェクションすることができる。細胞内に挿入されるキャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下とすることにより、細胞にダメージを与えることなく目的物質を細胞内にインジェクションできるとともに、キャピラリーの先端部の内径を細胞内にインジェクションされる液体量を精密に制御できる大きさとすることができる。
【００２３】
本発明の液体吐出法は、本発明のキャピラリーホルダー又はレーザ光照射装置を使用して実施することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、キャピラリーの外部から熱風を吹き付けることなく、キャピラリーの内部に保持された液体を加熱し、当該液体の熱膨張圧を利用して、キャピラリーの内部に保持された目的の液体を吐出することができる液体吐出法、並びに該液体吐出法に利用できるキャピラリーホルダー及びレーザ照射装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の液体吐出法の一実施形態を図面に基づいて説明する。
本実施形態では、図１（ａ）に示すキャピラリー１を使用する。
キャピラリー１は管状であり、図１（ａ）に示すように、一端に液体吐出口１１を有し、他端に液体吐出口１１と連通する液体導入口１２を有している。図１（ａ）に示すように、キャピラリー１の先端部は針状となっており、キャピラリー１の先端部を細胞に刺すことができるようになっている。キャピラリー１の先端部の外径は、通常０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜０．５μｍであり、細胞に刺したときに細胞へのダメージを抑えることができるようになっている。
【００２６】
キャピラリー１の内径は、液体導入口１２からキャピラリー１内に導入された液体が、毛細管現象によって液体吐出口１１の方向に移動し、キャピラリー１内に保持されるように調節されている。キャピラリー１の液体導入口１２の内径は通常４００〜８００μｍ、好ましくは５００〜７００μｍであり、液体吐出口１１の内径は通常０．０６〜０．６μｍ、好ましくは０．０６〜０．３μｍである。
【００２７】
キャピラリー１は、レーザ光が透過可能な材料から構成されている。レーザ光が透過可能な材料としては、例えば、ガラス、石英等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２８】
キャピラリー１としては、核酸等の物質を細胞に注入するマイクロインジェクション法で一般的に使用されるマイクロキャピラリー又はマイクロピペットを使用することができる。キャピラリー１がガラスで構成される場合、１段引き、２段引き等の公知の方法を使用してガラス管からキャピラリー１を作製することができる。
【００２９】
本実施形態では、まず、キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に、目的物質を含有する親水性の液体を導入する。当該液体は毛細管現象によって液体吐出口１１方向に移動し、図１（ｂ）に示すように、第一の液体層２を形成した状態でキャピラリー１の内部に保持される。
【００３０】
親水性の液体は、水と混じり合う性質（水性）を有する液体である限り特に限定されるものではない。親水性の液体としては、例えば、水、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。目的物質を安定した状態で含有することができ、細胞内にインジェクションされたときに細胞に悪影響を及ぼさない点から、親水性の液体としては、水を使用することが好ましい。
【００３１】
目的物質は、細胞内にインジェクションしようとする物質であり、細胞内へのインジェクションの目的に応じて適宜選択することができる。目的物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、薬物等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。目的物質は、第一の液体層２に溶解、分散等のいずれの状態で含有されていてもよい。
【００３２】
なお、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）等のいずれであってもよい。また、核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
【００３３】
第一の液体層２は、目的物質の他、緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、色素等を含有していてもよい。液体吐出量を目視によりコントロールすることができる点から、第一の液体層２は色素を含有することが好ましい。色素としては、例えば、フルオレセイン；ローダミン；フィコエリスリン；Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy7等のCy系色素；Alexa-488，Alexa-532，Alexa-546，Alexa-633，Alexa-680等のAlexa系色素；BODIPY FL，BODIPY TR等のBODIPY系色素等の蛍光色素が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３４】
本実施形態では、次いで、キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に、レーザ光吸収剤を含有し、第一の液体層２との界面を形成可能な液体を導入する。当該液体は毛細管現象によって液体吐出口１１方向に移動し、第一の液体層２との界面を形成し、図１（ｃ）に示すように、第二の液体層３を形成した状態でキャピラリー１の内部に保持される。キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に当該液体を導入する際、第一の液体層２と第二の液体層３との間に空気が混入しないように注意する。第二の液体層３の熱膨張圧が空気層により吸収されると、第二の液体３の熱膨張圧を第一の液体層２の吐出圧へ変換する際の制御が困難となるからである。
【００３５】
第一の液体層２は親水性の液体から構成されているので、第一の液体層２との界面を形成可能な液体として疎水性の液体を使用することができる。疎水性の液体は、水と混じり合わない性質（水不溶性）を有する液体である限り特に限定されるものではない。疎水性の液体としては、例えば、高級脂肪酸又はそのエステル類（例えば、オレイン酸、オレイン酸メチル、オレイン酸イソブチル、オレイン酸オクチル、オレイン酸２−エチルヘキシル、オレイン酸デシル、オレイン酸ラウリル、オレイン酸オレイル、リノール酸、リノール酸メチル、リノール酸エチル、リノレン酸、リノレン酸メチル、パルミチン酸、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸、ステアリン酸ブチル、ステアリン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸イソトリデシル、ラウリン酸、ラウリン酸メチル、２−エチルヘキサン酸セチル、エルカ酸オクチルドデシル、カプリン酸メチル、ヤシ油脂肪酸メチル、牛脂脂肪酸メチル、パーム油脂肪酸メチル等）、脂肪族又は芳香族多塩基酸エステル類（例えば、アジピン酸ジオレイル、アジピン酸ジイソブチル、アジピン酸ジイソデシル等の脂肪族ジカルボン酸のジアルキルエステル；フタル酸ジデシル、フタル酸ジトリデシル、フタル酸ジ２−エチルヘキシル、フタル酸シクロヘキシル２−エチルヘキシル等の芳香族ジカルボン酸のジアルキルエステル；トリメリツト酸トリ２−エチルヘキシル、トリメリツト酸トリエチル、トリメリツト酸トリｎ−ブチル、トリメリツト酸トリイソデシル等の芳香族ポリカルボン酸のポリアルキルエステル）、グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、オレイン酸モノグリセリド、オレイン酸ジグリセリド、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、カプリン酸モノグリセリド、カプリン酸ジグリセリド、ジアセチルカプリン酸グリセリド、ジアセチルヤシ油脂肪酸グリセリド等）、エポキシ化脂肪酸エステル類（例えば、エポキシ化脂肪酸ブチル、エポキシ化脂肪酸オクチル等）等の油性液体が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。上記油性液体のうち、常温で液体であり、沸点が１００℃以上であり、毒性がなく、無臭で気化しにくいものを使用することが好ましく、このような油性液体としては、例えば、オレイン酸、オレイン酸メチル、リノール酸、リノール酸メチル、リノレン酸等が挙げられる。疎水性の液体としては、液体金属を使用してもよいが、非金属系液体を使用することが好ましい。疎水性の液体としては、上記油性液体の他、ミネラルオイル、流動パラフィン等を使用することができる。
【００３６】
レーザ光吸収剤は、レーザ光を吸収して発熱することができる物質である限り特に限定されるものではない。レーザ光吸収剤としては、例えば、アセチレンブラック、チャネルブラック、ファーネスブラック等のカーボンブラック；Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＯ・Ｆｅ２Ｏ３等の黒色酸化鉄；二酸化チタンを還元して得られるチタンブラック等の黒色系化合物が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。これらの黒色系化合物は、１５０〜１１０００ｎｍの波長のレーザ光を吸収して発熱することができる。レーザ光吸収剤は、第二の液体層３に溶解、分散等のいずれの状態で含有されていてもよい。
【００３７】
本実施形態では、次いで、キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に、硬化可能な液体樹脂を導入する。当該液体樹脂は毛細管現象によって液体吐出口１１方向に移動し、第二の液体層３と界面を形成し、図１（ｄ）に示すように、液体樹脂層４を形成した状態でキャピラリー１の内部に保持される。キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に当該液体樹脂を導入する際、第二の液体層３と液体樹脂層４との間に空気が混入しないように注意する。第二の液体層３の熱膨張圧が空気層により吸収されると、第二の液体３の熱膨張圧を第一の液体層２の吐出圧へ変換する際の制御が困難となるからである。
【００３８】
硬化可能な液体樹脂としては、例えば、活性エネルギー線硬化性樹脂からなる液体樹脂を使用することができる。活性エネルギー線としては、例えば、紫外線、電子線、放射線等が挙げられ、活性エネルギー線硬化性樹脂としては、例えば、活性エネルギーの照射により重合する性質を有するプレポリマー及び／又はモノマーに、必要に応じて、他の単官能性又は多官能性モノマー、各種ポリマー、光重合開始剤、増感剤、帯電防止剤等を配合した樹脂組成物等が挙げられる。活性エネルギーの照射により重合する性質を有するプレポリマーとしては、例えば、ポリエステルポリ（メタ）アクリレート、ウレタンポリ（メタ）アクリレート、エポキシポリ（メタ）アクリレート、ポリオールポリ（メタ）アクリレート等の多価（メタ）アクリレートが挙げられ、活性エネルギーの照射により重合する性質を有するモノマーとしては、例えば、モノアルコールのモノ（メタ）アクリル酸エステル、ポリオールのモノ（メタ）アクリル酸エステル等のモノ（メタ）アクリレートが挙げられる。光開始剤としては、例えば、アセトフェノン類、ベンゾフェノン類、ミヒラーケトン、ベンジル、ベンゾイン、ベンゾインエーテル、ベンジルケタール類、チオキサントン類等が挙げられ、増感剤としては、例えば、アミン類、ジエチルアミノエチルメタクリレート等が挙げられる。
【００３９】
硬化可能な液体樹脂としては、熱硬化性樹脂からなる液体樹脂を使用してもよい。但し、熱硬化性樹脂を硬化させる際、熱硬化性樹脂に加えられた熱が第二の液体層３に伝わり、第二の液体層３の膨張圧が発生するおそれがあるため、活性エネルギー線硬化性樹脂からなる液体樹脂を使用することが好ましい。
【００４０】
硬化可能な液体樹脂としては、硬化の際に生じる体積変化（体積減少）が小さい液体樹脂を使用することが好ましい。硬化の際に生じる体積減少が大きいと、第一の液体層２又は第二の液体層３の液体に気泡が生じるおそれがあるからである。
【００４１】
本実施形態では、次いで、液体樹脂層４を硬化させ、図１（ｄ）に示すように、密閉部５を形成する。
【００４２】
密閉部５は、キャピラリー１に強固に固定されており、第二の液体層３が熱膨張しても、第二の液体層３の密閉部５方向への動きは防止されるようになっている。
【００４３】
図１（ｄ）に示すように、第二の液体層３の一方の液面は第一の液体層２と接触し、液体吐出口１１を通じた第二の液体層３と外気との接触は防止されている。また、図１（ｄ）に示すように、第二の液体層３の他方の液面は密閉部５と接触し、液体導入口１２を通じた第二の液体層３と外気との接触は防止されている。したがって、第二の液体層３は、第一の液体層２と密閉部５との間に挟まれ、キャピラリー１の内部に密閉された状態で保持されている。
【００４４】
キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に液体を導入する際、図２に示すように、液体導入口１２からキャピラリー１内に挿入可能なチップ１００を取り付けたシリンジ２００を使用することができる。液体導入口１２からキャピラリー１内に挿入可能なチップ１００としては、例えば、プラスチック製チップの先端部を引き伸ばして細くしたものを使用することができる。また、市販品（例えばマイクロローダー（エッペンドルフ社製））を使用することもできる。
【００４５】
本実施形態では、次いで、図３に示すように、キャピラリー１の液体吐出口１１を細胞Ｃ内に挿入した状態で、キャピラリー１の内部に保持された第二の液体層３にレーザ光を照射する。
【００４６】
キャピラリー１の液体吐出口１１の細胞Ｃ内への挿入は、例えば、顕微鏡で観察しながら顕微鏡ステージ上で行うことができる。
【００４７】
第二の液体層３に照射されるレーザ光の波長は、第二の液体層３に含有されるレーザ光吸収剤が吸収可能な波長であり、通常１５０〜１１０００ｎｍである。
【００４８】
第二の液体層３にレーザ光が照射されると、第二の液体層３に含有されるレーザ光吸収剤がレーザ光を吸収して発熱し、第二の液体層３は加熱されて熱膨張する。第二の液体層３は第一の液体層２と密閉部５との間に挟まれ、キャピラリー１の内部に密閉された状態で保持されているので、第二の液体層３の熱膨張により熱膨張圧が発生する。密閉部５により第二の液体層３の密閉部５方向への動きは防止されるので、第二の液体層３の熱膨張圧は第一の液体層２の吐出圧に変換され、第一の液体層２の液体はキャピラリー１の液体吐出口１１から細胞Ｃ内に吐出される。こうして、目的物質は細胞Ｃ内にインジェクションされる。１つの細胞Ｃ内への液体吐出量は通常０．０１〜１００ｆＬ（ｆＬ＝１μｍ３）、好ましくは０．０１〜１０ｆＬである。
【００４９】
レーザ光はキャピラリー１を透過して第二の液体層３に照射されるが、レーザ光の透過によりキャピラリー１が熱膨張することはないので、第二の液体層３の熱膨張圧は第一の液体層２の吐出圧に迅速かつ効率よく変換され、第二の液体層３の体積膨張量とほぼ等しい量の液体がレスポンスよく吐出される。
【００５０】
第二の液体層３の温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧（ＭＰａ／℃）は、次式：熱膨張圧（ＭＰａ／℃）＝熱膨張率（ｍ３／℃）／圧縮率（ｍ３／ＭＰａ）により算出される。第二の液体層３の温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧は、好ましくは０．１〜１０ＭＰａ／℃、さらに好ましくは１〜１０ＭＰａ／℃である。第二の液体層３の温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧が上記範囲にあると、十分に大きな第一の液体層２の吐出圧を得ることができる。第二の液体層３を構成する液体としてオレイン酸を使用する場合、温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧は約１ＭＰａ／℃である。
【００５１】
第二の液体層３の温度上昇は、レーザ光の出力を調節することにより制御することができ、第二の液体層３の温度上昇を制御することにより、液体吐出量（目的物質のインジェクション量）を制御することができる。レーザから高出力のレーザ光を発生させ、これを第二の液体層３に照射することにより、第二の液体層３の温度を迅速に上昇させることができる。
【００５２】
第一の液体層２に蛍光色素が含有されている場合には、蛍光顕微鏡で観察することにより、液体吐出量を目視により制御することができる。
【００５３】
レーザ光を照射する際、熱風を吹き付ける場合のようにキャピラリー１に振動が生じることはなく、顕微鏡ステージ上の狭い空間においても精密な作業を行うことができる。
【００５４】
細胞Ｃが由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよい。また、細胞Ｃの種類は特に限定されるものではなく、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等のいずれであってもよい。
【００５５】
１つの細胞Ｃ内に目的物質をインジェクションすると、第一の液体層２の液量は減少するが、レーザ光の出力を調節して第二の液体層３の温度上昇を制御することにより、十分に大きな第一の液体層２の吐出圧を得ることができるので、第一の液体層２の液量が減少しても第一の液体層２の液体を吐出させることができる。したがって、図１（ｅ）に示すキャピラリー１は、複数の細胞Ｃ内への目的物質のインジェクションに繰り返し使用することができる。
【００５６】
第二の液体層３にレーザ光を照射する際、図４及び５に示すレーザ光照射装置６を使用することができる。
【００５７】
図４及び５に示すように、レーザ光照射装置６は、キャピラリーホルダー７と、一端がキャピラリーホルダー７に装着された光ファイバー８と、光ファイバー８の他端に接続されたレーザ９と、レーザ９から発せられるレーザ光の出力をコントロールするコントローラ１０とを備える。
【００５８】
図４、５及び６に示すように、キャピラリーホルダー７は、本体部７１と、キャピラリー保持部材７２と、ネジ７４及び７５によって本体部７１及びキャピラリー保持部材７２に取り付けられた板バネ７３と、本体部７１に取り付けられた把持部７６とを備える。
【００５９】
図４、５及び６に示すように、本体部７１は、光ファイバー装着部７１１と、光ファイバー装着部７１１に装着された光ファイバー８から発せられるレーザ光を案内する光通路７１２と、光ファイバー装着部７１１に装着された光ファイバー８から発せられるレーザ光の照射範囲を拡大するレンズ７１３と、キャピラリー１の液体導入口１２側の部分を挿入可能な挿入孔７１４とを備える。
【００６０】
図４及び６に示すように、キャピラリー保持部材７２は板バネ７３の付勢力によって光通路７１２の方向に付勢されており、キャピラリーホルダー７にキャピラリー１が保持されていない状態において、キャピラリー保持部材７２は本体部７１に当接している。キャピラリーホルダー７にキャピラリー１を保持させる際、キャピラリー保持部材７２に板バネ７３の付勢力と逆方向の力を加え、本体部７１に当接しているキャピラリー保持部材７２を本体部７１から引き離し、キャピラリー１の液体導入口１２側の部分を本体部７１の挿入孔７１４に挿入し、キャピラリー保持部材７２に加えている力（板バネ７３の付勢力と逆方向の力）を解除する。そうすると、図５に示すように、キャピラリー１は、板バネ７３の付勢力によって本体部７１とキャピラリー保持部材７２との間に挟まれた状態で保持される。なお、図５に示すように、キャピラリー１は、液体吐出口１１側の部分がキャピラリーホルダー７から突出するように、キャピラリーホルダー７に保持される。
【００６１】
キャピラリーホルダー７に保持されたキャピラリー１の液体吐出口１１を細胞５内へ挿入する等の作業は、キャピラリーホルダー７の把持部７６を持って行うことができる。
【００６２】
コントローラ１０によって出力がコントロールされたレーザ光がレーザ９から発せられると、レーザ光は光ファイバー８を通じてキャピラリーホルダー７に送られる。キャピラリーホルダー７に送られたレーザ光は、レンズ７１３を通過した後、光通路７１２によって案内され、本体部７１とキャピラリー保持部材７２との間に保持されるキャピラリー１の外壁面のうち目的の領域（すなわち第二の液体層３と接触する壁部の外壁面）に照射される。キャピラリーホルダー７に送られたレーザ光がレンズ７１３を通過すると、レーザ光の照射範囲は拡大され、レーザ光は目的の領域全体にわたって照射されるので、キャピラリー１の内部に保持された第二の液体層３を効率よく加熱することができる。
【００６３】
図５に示すように、光通路７１２によって案内されたレーザ光は、キャピラリー１内の第一の液体層２に照射されないようになっているので、第一の液体層２に含有される目的物質の破壊を防止することができる。また、図４及び５に示すように、光通路７１２は壁部で囲まれており、光通路７１２で案内されたレーザ光はキャピラリーホルダー７から漏れないようになっているので、レーザ光の人体への悪影響を防止することができる。
【００６４】
レーザ９のレーザ媒質としては、例えば、ＣＯ２、エキシマ、希ガス等のガス；ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット単結晶）、ルビー、半導体等の固体等が挙げられるが、ＹＡＧが好ましい。ＹＡＧレーザによって発せられるレーザ光の波長は１０６４ｎｍの近赤外線であり、この波長域のレーザ光は、集光性が高く、石英光ファイバーによる伝送が可能である。また、ＹＡＧレーザは数１００Ｗ〜１ｋＷの出力で高繰り返しパルス、Ｑスイッチパルス、連続発振が可能である。
【００６５】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
【００６６】
本発明の液体吐出法は、微量（通常０．０１〜１００ｆＬ、好ましくは０．０１〜１０ｆＬ）の液体を吐出する際に有用であり、目的物質の細胞内へのインジェクション以外の種々の目的で使用することができる。
【００６７】
本実施形態では、第二の液体層３は一層からなるが、第二の液体層３は複数層からなっていてもよい。第二の液体層３が複数層からなる場合、レーザ光吸収剤はいずれの層に含有されていてもよいが、レーザ光吸収剤は疎水性の液体（特に油性液体）で構成される層に含有されていることが好ましい。レーザ光吸収剤が疎水性の液体（特に油性液体）で構成される層に含有されている場合、十分に大きな熱膨張圧を得ることができる。第二の液体層３が複数層からなる場合、接触し合う２層は界面を形成可能な２種類の液体（例えば、親水性の液体と疎水性の液体）で構成することができる。
【００６８】
本実施形態では、吐出対象液体が親水性の液体であるので第一の液体層２を構成する液体として親水性の液体を使用したが、吐出対象液体が疎水性の液体である場合には、第一の液体層２を構成する液体として疎水性の液体を使用する。
【００６９】
本実施形態では、硬化可能な液体樹脂を硬化させて密閉部５を形成したが、キャップ等の密閉部材をキャピラリー１の液体導入口１２に装着することにより、密閉部５を形成してもよい。但し、この場合、第二の液体層３の熱膨張圧が加えられても離脱しないように、密閉部材を液体導入口１２に強固に装着する必要がある。密閉部材は、例えば、接着剤により液体導入口１２に強固に接着することができる。
【実施例】
【００７０】
〔実施例１〕高等植物トレニアの生殖細胞群へのインジェクション
（１）従来法によるインジェクション
ガラス管（内径：約６００μｍ）を２段引きし、一端に液体吐出口（内径：約０．７μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーを作製した。このキャピラリーの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約１．２μｍである。液体導入口からキャピラリーの内部に、７ｋｂｐのプラスミド及び蛍光色素Alexaを含有する水溶液（液体サンプル）、及びシリコンオイルを順次導入した後、キャピラリーの液体導入口側の部分をホルダー（NARISHIGE製，商品名：HI−７)に差し込み、ねじ式押えでキャピラリーをホルダーに固定した。ホルダーは中空であり、キャピラリーの差込口と反対側にテフロン（登録商標）チューブの一端が接続されており、テフロン（登録商標）チューブの他端にシリンジ（NARISHIGE製，商品名：IM-26-2)が接続されている。シリンジを押し込むと、それにより生じた圧力がテフロン（登録商標）チューブ、ホルダー及びキャピラリーの内部を満たしているシリコンオイルを圧力媒体として伝わり、キャピラリーの先端部から液体が吐出される。このようなシリンジを用いた油圧式インジェクション法により高等植物トレニアの生殖細群胞へのインジェクションを試みた。この際、蛍光顕微鏡の緑色励起光により蛍光色素Alexaの赤色蛍光を観察し、目視により液体吐出量をコントロールした。
【００７１】
卵細胞の隣にある中央細胞にインジェクションした様子を図８（ａ）に示す。中央細胞は比較的大きな細胞であるが、それでも細胞が変形しておりダメージが見られた。また、液体吐出量のコントロールが難しく、過剰量をインジェクションしてしまうことが多かった。また、培地にも液体サンプルが漏出していた。なお、小さい輝点は葉緑体の自家蛍光である。
【００７２】
精密なインジェクションを行うためには、キャピラリーの先端部の外径をより小さくする必要があったが、キャピラリーの先端部の外径をより小さくすると、液体サンプルの吐出が不可能であった。
【００７３】
（２）本発明の方法によるインジェクション
ガラス管（内径：約６００μｍ）の１段引きにより、一端に液体吐出口（内径：約０．０６μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーを作製した。このキャピラリーの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約０．１μｍである。液体導入口からキャピラリーの内部に、７ｋｂｐのプラスミド及び蛍光色素Alexaを含有する水溶液（液体サンプル）、カーボンブラックを含有するオレイン酸、並びに紫外線硬化性樹脂（TESK（株）製，Ａ−１４２８Ｆ）からなる液体樹脂を順に導入した後、紫外線を照射して液体樹脂を硬化させた。キャピラリーの内部に各種液体を導入する際、空気が混入しないように注意した。
【００７４】
図４に示すレーザ照射装置に図５に示すようにキャピラリーを装着し、キャピラリーの液体吐出口を高等植物トレニアの生殖細胞に挿入した状態で、キャピラリーの内部に保持されたオレイン酸にＹＡＧレーザから発せられるレーザ光（１０６４ｎｍ）を照射し、液体サンプルを液体吐出口から吐出させた。この際、蛍光顕微鏡の緑色励起光により蛍光色素Alexaの赤色蛍光を観察し、目視により液体吐出量をコントロールした。
【００７５】
その結果、図８（ｂ）に示すように、キャピラリーの先端部の外径が約０．１μｍであっても液体サンプルを吐出することができ、従来法よりも精密なインジェクションが可能であった。また、図８（ｂ）に示すように、卵細胞へのインジェクションも容易に行うことができた。なお、図８（ｂ）の右図は蛍光色素Alexaを観察した蛍光像、左図は同じ視野の明視野像を示す。
【００７６】
〔実施例２〕トレニアの極核（中央細胞の核）及び助細胞へのインジェクション
実施例１と同様に本発明の方法を用いて、液体サンプルをトレニアの極核（中央細胞の核）及び助細胞へインジェクションした。
【００７７】
トレニアの極核へインジェクションした様子を図９（ａ）に示し、助細胞へインジェクションした様子を図９（ｂ）に示す。なお、図９（ａ）及び（ｂ）の上図は明視野像であり、下図は上図と同じ視野の蛍光像である。
【００７８】
図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、標的となる核や、非常に破裂しやすく弱い助細胞へダメージ無く液体サンプルをインジェクションすることができた。
【００７９】
〔実施例３〕インジェクション効率の比較
ガラス管（内径：約６００μｍ）の２段引きにより一端に液体吐出口（内径：約０．７μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーＡを作製した。キャピラリーＡの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約１．２μｍである。
【００８０】
また、ガラス管（内径：約６００μｍ）の１段引きにより一端に液体吐出口（内径：約０．１８μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーＢを作製した。キャピラリーＢの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約０．３μｍである。
【００８１】
キャピラリーＡ及びＢを用いた油圧式インジェクション法により、液体サンプルを植物培養細胞（ＢＹ−２細胞）にインジェクションした。同じキャピラリーを使ってキャピラリーの先端部が詰まるまでインジェクションし、インジェクションできた回数を調べた。
【００８２】
一方、キャピラリーＢを用いた本発明の方法により、液体サンプルを植物培養細胞（ＢＹ−２細胞）にインジェクションした。同じキャピラリーを使ってキャピラリーの先端部が詰まるまでインジェクションし、インジェクションできた回数を調べた。
【００８３】
その結果、キャピラリーＡを用いた油圧式インジェクション法における平均インジェクション回数は約３回、キャピラリーＢを用いた油圧式インジェクション法における平均インジェクション回数は１回未満であった。これに対して、キャピラリーＢを用いた本発明の方法における平均インジェクション回数は２０回以上であった。
【００８４】
本発明の方法によれば、精密なインジェクションを行うことができるだけでなく、１本のキャピラリーを繰り返し使用して効率よくインジェクションを行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】（ａ）は空のキャピラリー、（ｂ）は第一の液体層が保持されたキャピラリー、（ｃ）は第一の液体層及び第二の液体層が保持されたキャピラリー、（ｄ）は第一の液体層、第二の液体層及び液体樹脂が保持されたキャピラリー、（ｅ）は第一の液体層及び第二の液体層が保持され、密閉部が形成されたキャピラリーを示す一部断面図である。
【図２】キャピラリーの液体導入口からキャピラリー内に挿入可能なチップを取り付けたシリンジを用いて、キャピラリーの液体導入口からキャピラリーの内部に液体を導入する様子を示す一部断面図である。
【図３】キャピラリーの液体吐出口を細胞内に挿入した状態で、キャピラリーの内部に保持された第二の液体層にレーザ光を照射する様子を示す一部断面図である。
【図４】キャピラリー装着前のレーザ光照射装置を示す一部断面図である。
【図５】キャピラリー装着後のレーザ光照射装置を示す一部断面図である。
【図６】（ａ）はキャピラリーホルダーの平面図、（ｂ）はキャピラリーホルダーの側面図、（ｃ）はキャピラリーホルダーの正面図である。
【図７】従来のマイクロインジェクション法で用いられるキャピラリーの一部断面図である。
【図８】（ａ）は従来の油圧式インジェクション法によりトレニア生殖細群胞へインジェクションした様子を示す図であり、（ｂ）は本発明の方法によりトレニア生殖細群胞へインジェクションした様子を示す図である。
【図９】（ａ）は本発明の方法によりトレニア極核へインジェクションした様子を示す図であり、（ｂ）は本発明の方法によりトレニア助細胞へインジェクションした様子を示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
１・・・キャピラリー
１１・・・液体吐出口
１２・・・液体導入口
２・・・第一の液体層
３・・・第二の液体層
４・・・液体樹脂
５・・・密閉部
６・・・レーザ光照射装置
７・・・キャピラリーホルダー
８・・・光ファイバー
９・・・レーザ光源
１０・・・コントローラ
Ｃ・・・細胞
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体吐出法、特にマイクロインジェクション法に適用することができる液体吐出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、タンパク質等の目的物質を細胞内に導入するには、マイクロキャピラリー（マイクロピペットとも呼ばれる）を用いたマイクロインジェクション法が利用されている。従来のマイクロインジェクション法では、先端部が針状となっているマイクロキャピラリーの内部に目的物質を含有する液体を保持し、キャピラリーの先端部を細胞内に挿入し、空気圧又は油圧を利用してキャピラリーの内部に保持された液体を細胞内へ吐出させることにより、目的物質を細胞内にインジェクションする。
【０００３】
キャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下にすると、細胞にダメージを与えることなく、目的物質を含有する液体を細胞内にインジェクションできるとともに、キャピラリーの先端部の内径を、細胞内にインジェクションされる液体量を精密に制御できる大きさとすることができる。
【０００４】
しかしながら、空気圧又は油圧を利用してキャピラリーの内部に保持された液体を吐出させる場合、十分な吐出圧が得られないため、キャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下にすると、キャピラリーの先端部が詰るおそれがある。このため、空気圧又は油圧を利用してキャピラリーの内部に保持された液体を吐出させる場合、細胞にダメージを与えることなく液体を細胞内にインジェクションすること、及び細胞内にインジェクションされる液体量を精密に制御することを実現することは困難である。
【０００５】
このような状況の下、図７に示すように、一端に液体吐出口３１を有し、他端に液体導入口３２を有するガラス製のマイクロキャピラリー３０の内部に、液体導入口３２から、核酸を含有する液体サンプルＬ、液体合金であるガリンスタンＧ及びシリコンオイルＳを順に導入し、エポキシ樹脂Ｅを満たしたガラスキャップ４０で液体導入口３２を封止し、マイクロキャピラリー３０の外部から熱風を吹き付け、ガリンスタンＧの熱膨張圧を発生させ、液体サンプルＬを液体吐出口３１から吐出させる方法が開発されている（非特許文献１）。この方法によれば、ガリンスタンＧの熱膨張により発生する熱膨張圧を利用することで、空気圧又は油圧を利用する場合よりも大きな液体吐出圧を得ることができ、先端部の外径が１μｍ以下であるマイクロキャピラリー３０を用いて液体サンプルＬを吐出させることができる。
【非特許文献１】Knoblauch等，「ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」，1999年，第17巻，pp.906-909
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、マイクロキャピラリー３０の外部から熱風を吹き付けることによりガリンスタンＧを加熱する場合、ガリンスタンＧの温度制御が困難であるとともに、ガリンスタンＧの温度を制御可能な範囲も狭い。
【０００７】
また、熱風を吹き付けることによりガリンスタンＧとともにマイクロキャピラリー３０も熱膨張するため、熱膨張率が大きいガリンスタンという特殊な液体金属の使用が必要となる。
【０００８】
さらに、熱風を吹き付けることによりマイクロキャピラリー３０が振動するおそれがあるため、顕微鏡ステージ上の狭い空間において精密な作業を行うことは困難である。
【０００９】
さらに、ガリスタンＧの一部がマイクロキャピラリー３０の先端部に落下し、先端部が詰るおそれがある。
【００１０】
さらに、エポキシ樹脂Ｅを満たしたガラスキャップ４０で液体導入口３２を封止する作業は煩雑で時間を要するため、作業効率が低下する。
【００１１】
そこで、本発明は、キャピラリーの外部から熱風を吹き付けることなく、キャピラリーの内部に保持された液体を加熱し、当該液体の熱膨張圧を利用して、キャピラリーの内部に保持された目的の液体を吐出することができる液体吐出法、並びに該液体吐出法に利用できるキャピラリーホルダー及びレーザ照射装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、一端に液体吐出口を有するキャピラリーの内部に、第一の液体層及びレーザ光吸収剤を含有する第二の液体層を、前記第一の液体層が前記液体吐出口側に位置するように保持させ、前記第二の液体層を前記キャピラリーの内部に密閉する密閉部を形成し、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、前記キャピラリーの液体吐出口から前記第一の液体層の液体を吐出させることを特徴とする液体吐出法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、キャピラリー保持部と、光ファイバー装着部と、前記光ファイバー装着部に装着された光ファイバーから発せられるレーザ光が、前記キャピラリー保持部に保持されたキャピラリーの外壁面のうち目的の領域に照射されるように、前記レーザ光を案内する光通路とを備えたことを特徴とするキャピラリーホルダーを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明のキャピラリーホルダーと、前記キャピラリーホルダーの光ファイバー装着部に装着された光ファイバーと、前記光ファイバーに接続されたレーザ光源と、前記レーザ光源から発せられるレーザ光の出力をコントロールするコントローラとを備えたことを特徴とするレーザ光照射装置を提供する。
【００１５】
本発明の液体吐出法において、第二の液体層にレーザ光を照射すると、第二の液体層に含有されるレーザ光吸収剤がレーザ光を吸収して発熱し、第二の液体層は加熱されて熱膨張する。第二の液体層は第一の液体層と密閉部との間に挟まれ、キャピラリーの内部に密閉された状態で保持されているので、第二の液体層の熱膨張により熱膨張圧が発生する。密閉部により第二の液体層の密閉部方向への動きは防止されるので、第二の液体層の熱膨張圧は第一の液体層の吐出圧に変換され、第一の液体層の液体はキャピラリーの液体吐出口から吐出される。
【００１６】
本発明の液体吐出法において、レーザ光はキャピラリーを透過して第二の液体層に照射されるが、レーザ光の透過によりキャピラリーが熱膨張することはないので、第二の液体層の熱膨張圧は第一の液体層の吐出圧に迅速かつ効率よく変換され、第二の液体層の体積膨張量とほぼ等しい量の液体がレスポンスよく吐出される。したがって、第二の液体層を構成する液体としてガリンスタン等の特殊な液体金属を使用する必要はない。
【００１７】
本発明の液体吐出法において、第二の液体層の温度上昇は、レーザ光の出力を調節することにより制御することができ、第二の液体層の温度上昇を制御することにより、第一の液体層を構成する液体の吐出量を制御することができる。
【００１８】
本発明の液体吐出法において、レーザ光を照射する際、熱風を吹き付ける場合のようにキャピラリーに振動が生じることはなく、顕微鏡ステージ上の狭い空間においても精密な作業を行うことができる。
【００１９】
本発明の液体吐出法において、キャピラリーに保持された第一の液体層の液体を吐出させると第一の液体層の液量は減少するが、レーザ光の出力を調節して第二の液体層の温度上昇を制御することにより、十分に大きな第一の液体層の吐出圧を得ることができるので、第一の液体層の液量が減少しても第一の液体層の液体を吐出させることができる。したがって、キャピラリーに保持された第一の液体層の液体を繰り返し吐出させることができる。
【００２０】
本発明の液体吐出法の好ましい態様では、前記キャピラリーが他端に有する開口部から前記キャピラリーの内部に、前記第一の液体層を構成する液体、前記第二の液体層を構成する液体、及び硬化可能な液体樹脂を順に導入した後、前記液体樹脂を硬化させ、前記密閉部を形成する。本態様によれば、キャピラリーに強固に固定された密閉部を容易に形成することができる。
【００２１】
上記態様において、前記液体樹脂がエネルギー線硬化性樹脂からなることが好ましい。この場合、エネルギー線の照射により、第二の液体層を熱膨張させることなく、液体樹脂を硬化させることができる。
【００２２】
本発明の液体吐出法の好ましい態様では、前記第一の液体層が目的物質を含有しており、前記キャピラリーの液体吐出口を細胞内に挿入した状態で、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、前記キャピラリーの液体吐出口から前記細胞内に前記第一の液体層の液体を吐出させる。本態様によれば、目的物質を細胞内にインジェクションすることができる。レーザ光の出力を調節して第二の液体層の温度上昇を制御することにより、十分に大きな第一の液体層の吐出圧を得ることができるので、細胞内に挿入されるキャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下としても、キャピラリーの先端部が詰ることなく、目的物質を細胞内にインジェクションすることができる。細胞内に挿入されるキャピラリーの先端部の外径を１μｍ以下とすることにより、細胞にダメージを与えることなく目的物質を細胞内にインジェクションできるとともに、キャピラリーの先端部の内径を細胞内にインジェクションされる液体量を精密に制御できる大きさとすることができる。
【００２３】
本発明の液体吐出法は、本発明のキャピラリーホルダー又はレーザ光照射装置を使用して実施することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、キャピラリーの外部から熱風を吹き付けることなく、キャピラリーの内部に保持された液体を加熱し、当該液体の熱膨張圧を利用して、キャピラリーの内部に保持された目的の液体を吐出することができる液体吐出法、並びに該液体吐出法に利用できるキャピラリーホルダー及びレーザ照射装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の液体吐出法の一実施形態を図面に基づいて説明する。
本実施形態では、図１（ａ）に示すキャピラリー１を使用する。
キャピラリー１は管状であり、図１（ａ）に示すように、一端に液体吐出口１１を有し、他端に液体吐出口１１と連通する液体導入口１２を有している。図１（ａ）に示すように、キャピラリー１の先端部は針状となっており、キャピラリー１の先端部を細胞に刺すことができるようになっている。キャピラリー１の先端部の外径は、通常０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜０．５μｍであり、細胞に刺したときに細胞へのダメージを抑えることができるようになっている。
【００２６】
キャピラリー１の内径は、液体導入口１２からキャピラリー１内に導入された液体が、毛細管現象によって液体吐出口１１の方向に移動し、キャピラリー１内に保持されるように調節されている。キャピラリー１の液体導入口１２の内径は通常４００〜８００μｍ、好ましくは５００〜７００μｍであり、液体吐出口１１の内径は通常０．０６〜０．６μｍ、好ましくは０．０６〜０．３μｍである。
【００２７】
キャピラリー１は、レーザ光が透過可能な材料から構成されている。レーザ光が透過可能な材料としては、例えば、ガラス、石英等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２８】
キャピラリー１としては、核酸等の物質を細胞に注入するマイクロインジェクション法で一般的に使用されるマイクロキャピラリー又はマイクロピペットを使用することができる。キャピラリー１がガラスで構成される場合、１段引き、２段引き等の公知の方法を使用してガラス管からキャピラリー１を作製することができる。
【００２９】
本実施形態では、まず、キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に、目的物質を含有する親水性の液体を導入する。当該液体は毛細管現象によって液体吐出口１１方向に移動し、図１（ｂ）に示すように、第一の液体層２を形成した状態でキャピラリー１の内部に保持される。
【００３０】
親水性の液体は、水と混じり合う性質（水性）を有する液体である限り特に限定されるものではない。親水性の液体としては、例えば、水、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。目的物質を安定した状態で含有することができ、細胞内にインジェクションされたときに細胞に悪影響を及ぼさない点から、親水性の液体としては、水を使用することが好ましい。
【００３１】
目的物質は、細胞内にインジェクションしようとする物質であり、細胞内へのインジェクションの目的に応じて適宜選択することができる。目的物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、薬物等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。目的物質は、第一の液体層２に溶解、分散等のいずれの状態で含有されていてもよい。
【００３２】
なお、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）等のいずれであってもよい。また、核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
【００３３】
第一の液体層２は、目的物質の他、緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、色素等を含有していてもよい。液体吐出量を目視によりコントロールすることができる点から、第一の液体層２は色素を含有することが好ましい。色素としては、例えば、フルオレセイン；ローダミン；フィコエリスリン；Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy7等のCy系色素；Alexa-488，Alexa-532，Alexa-546，Alexa-633，Alexa-680等のAlexa系色素；BODIPY FL，BODIPY TR等のBODIPY系色素等の蛍光色素が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３４】
本実施形態では、次いで、キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に、レーザ光吸収剤を含有し、第一の液体層２との界面を形成可能な液体を導入する。当該液体は毛細管現象によって液体吐出口１１方向に移動し、第一の液体層２との界面を形成し、図１（ｃ）に示すように、第二の液体層３を形成した状態でキャピラリー１の内部に保持される。キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に当該液体を導入する際、第一の液体層２と第二の液体層３との間に空気が混入しないように注意する。第二の液体層３の熱膨張圧が空気層により吸収されると、第二の液体３の熱膨張圧を第一の液体層２の吐出圧へ変換する際の制御が困難となるからである。
【００３５】
第一の液体層２は親水性の液体から構成されているので、第一の液体層２との界面を形成可能な液体として疎水性の液体を使用することができる。疎水性の液体は、水と混じり合わない性質（水不溶性）を有する液体である限り特に限定されるものではない。疎水性の液体としては、例えば、高級脂肪酸又はそのエステル類（例えば、オレイン酸、オレイン酸メチル、オレイン酸イソブチル、オレイン酸オクチル、オレイン酸２−エチルヘキシル、オレイン酸デシル、オレイン酸ラウリル、オレイン酸オレイル、リノール酸、リノール酸メチル、リノール酸エチル、リノレン酸、リノレン酸メチル、パルミチン酸、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸、ステアリン酸ブチル、ステアリン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸イソトリデシル、ラウリン酸、ラウリン酸メチル、２−エチルヘキサン酸セチル、エルカ酸オクチルドデシル、カプリン酸メチル、ヤシ油脂肪酸メチル、牛脂脂肪酸メチル、パーム油脂肪酸メチル等）、脂肪族又は芳香族多塩基酸エステル類（例えば、アジピン酸ジオレイル、アジピン酸ジイソブチル、アジピン酸ジイソデシル等の脂肪族ジカルボン酸のジアルキルエステル；フタル酸ジデシル、フタル酸ジトリデシル、フタル酸ジ２−エチルヘキシル、フタル酸シクロヘキシル２−エチルヘキシル等の芳香族ジカルボン酸のジアルキルエステル；トリメリツト酸トリ２−エチルヘキシル、トリメリツト酸トリエチル、トリメリツト酸トリｎ−ブチル、トリメリツト酸トリイソデシル等の芳香族ポリカルボン酸のポリアルキルエステル）、グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、オレイン酸モノグリセリド、オレイン酸ジグリセリド、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、カプリン酸モノグリセリド、カプリン酸ジグリセリド、ジアセチルカプリン酸グリセリド、ジアセチルヤシ油脂肪酸グリセリド等）、エポキシ化脂肪酸エステル類（例えば、エポキシ化脂肪酸ブチル、エポキシ化脂肪酸オクチル等）等の油性液体が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。上記油性液体のうち、常温で液体であり、沸点が１００℃以上であり、毒性がなく、無臭で気化しにくいものを使用することが好ましく、このような油性液体としては、例えば、オレイン酸、オレイン酸メチル、リノール酸、リノール酸メチル、リノレン酸等が挙げられる。疎水性の液体としては、液体金属を使用してもよいが、非金属系液体を使用することが好ましい。疎水性の液体としては、上記油性液体の他、ミネラルオイル、流動パラフィン等を使用することができる。
【００３６】
レーザ光吸収剤は、レーザ光を吸収して発熱することができる物質である限り特に限定されるものではない。レーザ光吸収剤としては、例えば、アセチレンブラック、チャネルブラック、ファーネスブラック等のカーボンブラック；Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＯ・Ｆｅ２Ｏ３等の黒色酸化鉄；二酸化チタンを還元して得られるチタンブラック等の黒色系化合物が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。これらの黒色系化合物は、１５０〜１１０００ｎｍの波長のレーザ光を吸収して発熱することができる。レーザ光吸収剤は、第二の液体層３に溶解、分散等のいずれの状態で含有されていてもよい。
【００３７】
本実施形態では、次いで、キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に、硬化可能な液体樹脂を導入する。当該液体樹脂は毛細管現象によって液体吐出口１１方向に移動し、第二の液体層３と界面を形成し、図１（ｄ）に示すように、液体樹脂層４を形成した状態でキャピラリー１の内部に保持される。キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に当該液体樹脂を導入する際、第二の液体層３と液体樹脂層４との間に空気が混入しないように注意する。第二の液体層３の熱膨張圧が空気層により吸収されると、第二の液体３の熱膨張圧を第一の液体層２の吐出圧へ変換する際の制御が困難となるからである。
【００３８】
硬化可能な液体樹脂としては、例えば、活性エネルギー線硬化性樹脂からなる液体樹脂を使用することができる。活性エネルギー線としては、例えば、紫外線、電子線、放射線等が挙げられ、活性エネルギー線硬化性樹脂としては、例えば、活性エネルギーの照射により重合する性質を有するプレポリマー及び／又はモノマーに、必要に応じて、他の単官能性又は多官能性モノマー、各種ポリマー、光重合開始剤、増感剤、帯電防止剤等を配合した樹脂組成物等が挙げられる。活性エネルギーの照射により重合する性質を有するプレポリマーとしては、例えば、ポリエステルポリ（メタ）アクリレート、ウレタンポリ（メタ）アクリレート、エポキシポリ（メタ）アクリレート、ポリオールポリ（メタ）アクリレート等の多価（メタ）アクリレートが挙げられ、活性エネルギーの照射により重合する性質を有するモノマーとしては、例えば、モノアルコールのモノ（メタ）アクリル酸エステル、ポリオールのモノ（メタ）アクリル酸エステル等のモノ（メタ）アクリレートが挙げられる。光開始剤としては、例えば、アセトフェノン類、ベンゾフェノン類、ミヒラーケトン、ベンジル、ベンゾイン、ベンゾインエーテル、ベンジルケタール類、チオキサントン類等が挙げられ、増感剤としては、例えば、アミン類、ジエチルアミノエチルメタクリレート等が挙げられる。
【００３９】
硬化可能な液体樹脂としては、熱硬化性樹脂からなる液体樹脂を使用してもよい。但し、熱硬化性樹脂を硬化させる際、熱硬化性樹脂に加えられた熱が第二の液体層３に伝わり、第二の液体層３の膨張圧が発生するおそれがあるため、活性エネルギー線硬化性樹脂からなる液体樹脂を使用することが好ましい。
【００４０】
硬化可能な液体樹脂としては、硬化の際に生じる体積変化（体積減少）が小さい液体樹脂を使用することが好ましい。硬化の際に生じる体積減少が大きいと、第一の液体層２又は第二の液体層３の液体に気泡が生じるおそれがあるからである。
【００４１】
本実施形態では、次いで、液体樹脂層４を硬化させ、図１（ｄ）に示すように、密閉部５を形成する。
【００４２】
密閉部５は、キャピラリー１に強固に固定されており、第二の液体層３が熱膨張しても、第二の液体層３の密閉部５方向への動きは防止されるようになっている。
【００４３】
図１（ｄ）に示すように、第二の液体層３の一方の液面は第一の液体層２と接触し、液体吐出口１１を通じた第二の液体層３と外気との接触は防止されている。また、図１（ｄ）に示すように、第二の液体層３の他方の液面は密閉部５と接触し、液体導入口１２を通じた第二の液体層３と外気との接触は防止されている。したがって、第二の液体層３は、第一の液体層２と密閉部５との間に挟まれ、キャピラリー１の内部に密閉された状態で保持されている。
【００４４】
キャピラリー１の液体導入口１２からキャピラリー１の内部に液体を導入する際、図２に示すように、液体導入口１２からキャピラリー１内に挿入可能なチップ１００を取り付けたシリンジ２００を使用することができる。液体導入口１２からキャピラリー１内に挿入可能なチップ１００としては、例えば、プラスチック製チップの先端部を引き伸ばして細くしたものを使用することができる。また、市販品（例えばマイクロローダー（エッペンドルフ社製））を使用することもできる。
【００４５】
本実施形態では、次いで、図３に示すように、キャピラリー１の液体吐出口１１を細胞Ｃ内に挿入した状態で、キャピラリー１の内部に保持された第二の液体層３にレーザ光を照射する。
【００４６】
キャピラリー１の液体吐出口１１の細胞Ｃ内への挿入は、例えば、顕微鏡で観察しながら顕微鏡ステージ上で行うことができる。
【００４７】
第二の液体層３に照射されるレーザ光の波長は、第二の液体層３に含有されるレーザ光吸収剤が吸収可能な波長であり、通常１５０〜１１０００ｎｍである。
【００４８】
第二の液体層３にレーザ光が照射されると、第二の液体層３に含有されるレーザ光吸収剤がレーザ光を吸収して発熱し、第二の液体層３は加熱されて熱膨張する。第二の液体層３は第一の液体層２と密閉部５との間に挟まれ、キャピラリー１の内部に密閉された状態で保持されているので、第二の液体層３の熱膨張により熱膨張圧が発生する。密閉部５により第二の液体層３の密閉部５方向への動きは防止されるので、第二の液体層３の熱膨張圧は第一の液体層２の吐出圧に変換され、第一の液体層２の液体はキャピラリー１の液体吐出口１１から細胞Ｃ内に吐出される。こうして、目的物質は細胞Ｃ内にインジェクションされる。１つの細胞Ｃ内への液体吐出量は通常０．０１〜１００ｆＬ（ｆＬ＝１μｍ３）、好ましくは０．０１〜１０ｆＬである。
【００４９】
レーザ光はキャピラリー１を透過して第二の液体層３に照射されるが、レーザ光の透過によりキャピラリー１が熱膨張することはないので、第二の液体層３の熱膨張圧は第一の液体層２の吐出圧に迅速かつ効率よく変換され、第二の液体層３の体積膨張量とほぼ等しい量の液体がレスポンスよく吐出される。
【００５０】
第二の液体層３の温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧（ＭＰａ／℃）は、次式：熱膨張圧（ＭＰａ／℃）＝熱膨張率（ｍ３／℃）／圧縮率（ｍ３／ＭＰａ）により算出される。第二の液体層３の温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧は、好ましくは０．１〜１０ＭＰａ／℃、さらに好ましくは１〜１０ＭＰａ／℃である。第二の液体層３の温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧が上記範囲にあると、十分に大きな第一の液体層２の吐出圧を得ることができる。第二の液体層３を構成する液体としてオレイン酸を使用する場合、温度が１℃上昇したときに発生する熱膨張圧は約１ＭＰａ／℃である。
【００５１】
第二の液体層３の温度上昇は、レーザ光の出力を調節することにより制御することができ、第二の液体層３の温度上昇を制御することにより、液体吐出量（目的物質のインジェクション量）を制御することができる。レーザから高出力のレーザ光を発生させ、これを第二の液体層３に照射することにより、第二の液体層３の温度を迅速に上昇させることができる。
【００５２】
第一の液体層２に蛍光色素が含有されている場合には、蛍光顕微鏡で観察することにより、液体吐出量を目視により制御することができる。
【００５３】
レーザ光を照射する際、熱風を吹き付ける場合のようにキャピラリー１に振動が生じることはなく、顕微鏡ステージ上の狭い空間においても精密な作業を行うことができる。
【００５４】
細胞Ｃが由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよい。また、細胞Ｃの種類は特に限定されるものではなく、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等のいずれであってもよい。
【００５５】
１つの細胞Ｃ内に目的物質をインジェクションすると、第一の液体層２の液量は減少するが、レーザ光の出力を調節して第二の液体層３の温度上昇を制御することにより、十分に大きな第一の液体層２の吐出圧を得ることができるので、第一の液体層２の液量が減少しても第一の液体層２の液体を吐出させることができる。したがって、図１（ｅ）に示すキャピラリー１は、複数の細胞Ｃ内への目的物質のインジェクションに繰り返し使用することができる。
【００５６】
第二の液体層３にレーザ光を照射する際、図４及び５に示すレーザ光照射装置６を使用することができる。
【００５７】
図４及び５に示すように、レーザ光照射装置６は、キャピラリーホルダー７と、一端がキャピラリーホルダー７に装着された光ファイバー８と、光ファイバー８の他端に接続されたレーザ９と、レーザ９から発せられるレーザ光の出力をコントロールするコントローラ１０とを備える。
【００５８】
図４、５及び６に示すように、キャピラリーホルダー７は、本体部７１と、キャピラリー保持部材７２と、ネジ７４及び７５によって本体部７１及びキャピラリー保持部材７２に取り付けられた板バネ７３と、本体部７１に取り付けられた把持部７６とを備える。
【００５９】
図４、５及び６に示すように、本体部７１は、光ファイバー装着部７１１と、光ファイバー装着部７１１に装着された光ファイバー８から発せられるレーザ光を案内する光通路７１２と、光ファイバー装着部７１１に装着された光ファイバー８から発せられるレーザ光の照射範囲を拡大するレンズ７１３と、キャピラリー１の液体導入口１２側の部分を挿入可能な挿入孔７１４とを備える。
【００６０】
図４及び６に示すように、キャピラリー保持部材７２は板バネ７３の付勢力によって光通路７１２の方向に付勢されており、キャピラリーホルダー７にキャピラリー１が保持されていない状態において、キャピラリー保持部材７２は本体部７１に当接している。キャピラリーホルダー７にキャピラリー１を保持させる際、キャピラリー保持部材７２に板バネ７３の付勢力と逆方向の力を加え、本体部７１に当接しているキャピラリー保持部材７２を本体部７１から引き離し、キャピラリー１の液体導入口１２側の部分を本体部７１の挿入孔７１４に挿入し、キャピラリー保持部材７２に加えている力（板バネ７３の付勢力と逆方向の力）を解除する。そうすると、図５に示すように、キャピラリー１は、板バネ７３の付勢力によって本体部７１とキャピラリー保持部材７２との間に挟まれた状態で保持される。なお、図５に示すように、キャピラリー１は、液体吐出口１１側の部分がキャピラリーホルダー７から突出するように、キャピラリーホルダー７に保持される。
【００６１】
キャピラリーホルダー７に保持されたキャピラリー１の液体吐出口１１を細胞５内へ挿入する等の作業は、キャピラリーホルダー７の把持部７６を持って行うことができる。
【００６２】
コントローラ１０によって出力がコントロールされたレーザ光がレーザ９から発せられると、レーザ光は光ファイバー８を通じてキャピラリーホルダー７に送られる。キャピラリーホルダー７に送られたレーザ光は、レンズ７１３を通過した後、光通路７１２によって案内され、本体部７１とキャピラリー保持部材７２との間に保持されるキャピラリー１の外壁面のうち目的の領域（すなわち第二の液体層３と接触する壁部の外壁面）に照射される。キャピラリーホルダー７に送られたレーザ光がレンズ７１３を通過すると、レーザ光の照射範囲は拡大され、レーザ光は目的の領域全体にわたって照射されるので、キャピラリー１の内部に保持された第二の液体層３を効率よく加熱することができる。
【００６３】
図５に示すように、光通路７１２によって案内されたレーザ光は、キャピラリー１内の第一の液体層２に照射されないようになっているので、第一の液体層２に含有される目的物質の破壊を防止することができる。また、図４及び５に示すように、光通路７１２は壁部で囲まれており、光通路７１２で案内されたレーザ光はキャピラリーホルダー７から漏れないようになっているので、レーザ光の人体への悪影響を防止することができる。
【００６４】
レーザ９のレーザ媒質としては、例えば、ＣＯ２、エキシマ、希ガス等のガス；ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット単結晶）、ルビー、半導体等の固体等が挙げられるが、ＹＡＧが好ましい。ＹＡＧレーザによって発せられるレーザ光の波長は１０６４ｎｍの近赤外線であり、この波長域のレーザ光は、集光性が高く、石英光ファイバーによる伝送が可能である。また、ＹＡＧレーザは数１００Ｗ〜１ｋＷの出力で高繰り返しパルス、Ｑスイッチパルス、連続発振が可能である。
【００６５】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
【００６６】
本発明の液体吐出法は、微量（通常０．０１〜１００ｆＬ、好ましくは０．０１〜１０ｆＬ）の液体を吐出する際に有用であり、目的物質の細胞内へのインジェクション以外の種々の目的で使用することができる。
【００６７】
本実施形態では、第二の液体層３は一層からなるが、第二の液体層３は複数層からなっていてもよい。第二の液体層３が複数層からなる場合、レーザ光吸収剤はいずれの層に含有されていてもよいが、レーザ光吸収剤は疎水性の液体（特に油性液体）で構成される層に含有されていることが好ましい。レーザ光吸収剤が疎水性の液体（特に油性液体）で構成される層に含有されている場合、十分に大きな熱膨張圧を得ることができる。第二の液体層３が複数層からなる場合、接触し合う２層は界面を形成可能な２種類の液体（例えば、親水性の液体と疎水性の液体）で構成することができる。
【００６８】
本実施形態では、吐出対象液体が親水性の液体であるので第一の液体層２を構成する液体として親水性の液体を使用したが、吐出対象液体が疎水性の液体である場合には、第一の液体層２を構成する液体として疎水性の液体を使用する。
【００６９】
本実施形態では、硬化可能な液体樹脂を硬化させて密閉部５を形成したが、キャップ等の密閉部材をキャピラリー１の液体導入口１２に装着することにより、密閉部５を形成してもよい。但し、この場合、第二の液体層３の熱膨張圧が加えられても離脱しないように、密閉部材を液体導入口１２に強固に装着する必要がある。密閉部材は、例えば、接着剤により液体導入口１２に強固に接着することができる。
【実施例】
【００７０】
〔実施例１〕高等植物トレニアの生殖細胞群へのインジェクション
（１）従来法によるインジェクション
ガラス管（内径：約６００μｍ）を２段引きし、一端に液体吐出口（内径：約０．７μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーを作製した。このキャピラリーの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約１．２μｍである。液体導入口からキャピラリーの内部に、７ｋｂｐのプラスミド及び蛍光色素Alexaを含有する水溶液（液体サンプル）、及びシリコンオイルを順次導入した後、キャピラリーの液体導入口側の部分をホルダー（NARISHIGE製，商品名：HI−７)に差し込み、ねじ式押えでキャピラリーをホルダーに固定した。ホルダーは中空であり、キャピラリーの差込口と反対側にテフロン（登録商標）チューブの一端が接続されており、テフロン（登録商標）チューブの他端にシリンジ（NARISHIGE製，商品名：IM-26-2)が接続されている。シリンジを押し込むと、それにより生じた圧力がテフロン（登録商標）チューブ、ホルダー及びキャピラリーの内部を満たしているシリコンオイルを圧力媒体として伝わり、キャピラリーの先端部から液体が吐出される。このようなシリンジを用いた油圧式インジェクション法により高等植物トレニアの生殖細群胞へのインジェクションを試みた。この際、蛍光顕微鏡の緑色励起光により蛍光色素Alexaの赤色蛍光を観察し、目視により液体吐出量をコントロールした。
【００７１】
卵細胞の隣にある中央細胞にインジェクションした様子を図８（ａ）に示す。中央細胞は比較的大きな細胞であるが、それでも細胞が変形しておりダメージが見られた。また、液体吐出量のコントロールが難しく、過剰量をインジェクションしてしまうことが多かった。また、培地にも液体サンプルが漏出していた。なお、小さい輝点は葉緑体の自家蛍光である。
【００７２】
精密なインジェクションを行うためには、キャピラリーの先端部の外径をより小さくする必要があったが、キャピラリーの先端部の外径をより小さくすると、液体サンプルの吐出が不可能であった。
【００７３】
（２）本発明の方法によるインジェクション
ガラス管（内径：約６００μｍ）の１段引きにより、一端に液体吐出口（内径：約０．０６μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーを作製した。このキャピラリーの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約０．１μｍである。液体導入口からキャピラリーの内部に、７ｋｂｐのプラスミド及び蛍光色素Alexaを含有する水溶液（液体サンプル）、カーボンブラックを含有するオレイン酸、並びに紫外線硬化性樹脂（TESK（株）製，Ａ−１４２８Ｆ）からなる液体樹脂を順に導入した後、紫外線を照射して液体樹脂を硬化させた。キャピラリーの内部に各種液体を導入する際、空気が混入しないように注意した。
【００７４】
図４に示すレーザ照射装置に図５に示すようにキャピラリーを装着し、キャピラリーの液体吐出口を高等植物トレニアの生殖細胞に挿入した状態で、キャピラリーの内部に保持されたオレイン酸にＹＡＧレーザから発せられるレーザ光（１０６４ｎｍ）を照射し、液体サンプルを液体吐出口から吐出させた。この際、蛍光顕微鏡の緑色励起光により蛍光色素Alexaの赤色蛍光を観察し、目視により液体吐出量をコントロールした。
【００７５】
その結果、図８（ｂ）に示すように、キャピラリーの先端部の外径が約０．１μｍであっても液体サンプルを吐出することができ、従来法よりも精密なインジェクションが可能であった。また、図８（ｂ）に示すように、卵細胞へのインジェクションも容易に行うことができた。なお、図８（ｂ）の右図は蛍光色素Alexaを観察した蛍光像、左図は同じ視野の明視野像を示す。
【００７６】
〔実施例２〕トレニアの極核（中央細胞の核）及び助細胞へのインジェクション
実施例１と同様に本発明の方法を用いて、液体サンプルをトレニアの極核（中央細胞の核）及び助細胞へインジェクションした。
【００７７】
トレニアの極核へインジェクションした様子を図９（ａ）に示し、助細胞へインジェクションした様子を図９（ｂ）に示す。なお、図９（ａ）及び（ｂ）の上図は明視野像であり、下図は上図と同じ視野の蛍光像である。
【００７８】
図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、標的となる核や、非常に破裂しやすく弱い助細胞へダメージ無く液体サンプルをインジェクションすることができた。
【００７９】
〔実施例３〕インジェクション効率の比較
ガラス管（内径：約６００μｍ）の２段引きにより一端に液体吐出口（内径：約０．７μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーＡを作製した。キャピラリーＡの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約１．２μｍである。
【００８０】
また、ガラス管（内径：約６００μｍ）の１段引きにより一端に液体吐出口（内径：約０．１８μｍ）を有し、他端に液体導入口（内径：約６００μｍ）を有するキャピラリーＢを作製した。キャピラリーＢの先端部（液体吐出口側の部分）は針状となっており、その外径は約０．３μｍである。
【００８１】
キャピラリーＡ及びＢを用いた油圧式インジェクション法により、液体サンプルを植物培養細胞（ＢＹ−２細胞）にインジェクションした。同じキャピラリーを使ってキャピラリーの先端部が詰まるまでインジェクションし、インジェクションできた回数を調べた。
【００８２】
一方、キャピラリーＢを用いた本発明の方法により、液体サンプルを植物培養細胞（ＢＹ−２細胞）にインジェクションした。同じキャピラリーを使ってキャピラリーの先端部が詰まるまでインジェクションし、インジェクションできた回数を調べた。
【００８３】
その結果、キャピラリーＡを用いた油圧式インジェクション法における平均インジェクション回数は約３回、キャピラリーＢを用いた油圧式インジェクション法における平均インジェクション回数は１回未満であった。これに対して、キャピラリーＢを用いた本発明の方法における平均インジェクション回数は２０回以上であった。
【００８４】
本発明の方法によれば、精密なインジェクションを行うことができるだけでなく、１本のキャピラリーを繰り返し使用して効率よくインジェクションを行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】（ａ）は空のキャピラリー、（ｂ）は第一の液体層が保持されたキャピラリー、（ｃ）は第一の液体層及び第二の液体層が保持されたキャピラリー、（ｄ）は第一の液体層、第二の液体層及び液体樹脂が保持されたキャピラリー、（ｅ）は第一の液体層及び第二の液体層が保持され、密閉部が形成されたキャピラリーを示す一部断面図である。
【図２】キャピラリーの液体導入口からキャピラリー内に挿入可能なチップを取り付けたシリンジを用いて、キャピラリーの液体導入口からキャピラリーの内部に液体を導入する様子を示す一部断面図である。
【図３】キャピラリーの液体吐出口を細胞内に挿入した状態で、キャピラリーの内部に保持された第二の液体層にレーザ光を照射する様子を示す一部断面図である。
【図４】キャピラリー装着前のレーザ光照射装置を示す一部断面図である。
【図５】キャピラリー装着後のレーザ光照射装置を示す一部断面図である。
【図６】（ａ）はキャピラリーホルダーの平面図、（ｂ）はキャピラリーホルダーの側面図、（ｃ）はキャピラリーホルダーの正面図である。
【図７】従来のマイクロインジェクション法で用いられるキャピラリーの一部断面図である。
【図８】（ａ）は従来の油圧式インジェクション法によりトレニア生殖細群胞へインジェクションした様子を示す図であり、（ｂ）は本発明の方法によりトレニア生殖細群胞へインジェクションした様子を示す図である。
【図９】（ａ）は本発明の方法によりトレニア極核へインジェクションした様子を示す図であり、（ｂ）は本発明の方法によりトレニア助細胞へインジェクションした様子を示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
１・・・キャピラリー
１１・・・液体吐出口
１２・・・液体導入口
２・・・第一の液体層
３・・・第二の液体層
４・・・液体樹脂
５・・・密閉部
６・・・レーザ光照射装置
７・・・キャピラリーホルダー
８・・・光ファイバー
９・・・レーザ光源
１０・・・コントローラ
Ｃ・・・細胞
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端に液体吐出口を有するキャピラリーの内部に、第一の液体層及びレーザ光吸収剤を含有する第二の液体層を、前記第一の液体層が前記液体吐出口側に位置するように保持させ、
前記第二の液体層を前記キャピラリーの内部に密閉する密閉部を形成し、
前記第二の液体層にレーザ光を照射し、
前記キャピラリーの液体吐出口から前記第一の液体層の液体を吐出させることを特徴とする液体吐出法。
【請求項２】
前記キャピラリーが他端に有する開口部から前記キャピラリーの内部に、前記第一の液体層を構成する液体、前記第二の液体層を構成する液体、及び硬化可能な液体樹脂を順に導入した後、前記液体樹脂を硬化させ、前記密閉部を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記液体樹脂がエネルギー線硬化性樹脂からなることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第一の液体層が目的物質を含有しており、
前記キャピラリーの液体吐出口を細胞内に挿入した状態で、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、
前記キャピラリーの液体吐出口から前記細胞内に前記第一の液体層の液体を吐出させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
キャピラリー保持部と、
光ファイバー装着部と、
前記光ファイバー装着部に装着された光ファイバーから発せられるレーザ光が、前記キャピラリー保持部に保持されたキャピラリーの外壁面のうち目的の領域に照射されるように、前記レーザ光を案内する光通路と
を備えたことを特徴とするキャピラリーホルダー。
【請求項６】
請求項５記載のキャピラリーホルダーと、
前記キャピラリーホルダーの光ファイバー装着部に装着された光ファイバーと、
前記光ファイバーに接続されたレーザ光源と、
前記レーザ光源から発せられるレーザ光の出力をコントロールするコントローラと
を備えたことを特徴とするレーザ光照射装置。
【請求項１】
一端に液体吐出口を有するキャピラリーの内部に、第一の液体層及びレーザ光吸収剤を含有する第二の液体層を、前記第一の液体層が前記液体吐出口側に位置するように保持させ、
前記第二の液体層を前記キャピラリーの内部に密閉する密閉部を形成し、
前記第二の液体層にレーザ光を照射し、
前記キャピラリーの液体吐出口から前記第一の液体層の液体を吐出させることを特徴とする液体吐出法。
【請求項２】
前記キャピラリーが他端に有する開口部から前記キャピラリーの内部に、前記第一の液体層を構成する液体、前記第二の液体層を構成する液体、及び硬化可能な液体樹脂を順に導入した後、前記液体樹脂を硬化させ、前記密閉部を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記液体樹脂がエネルギー線硬化性樹脂からなることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第一の液体層が目的物質を含有しており、
前記キャピラリーの液体吐出口を細胞内に挿入した状態で、前記第二の液体層にレーザ光を照射し、
前記キャピラリーの液体吐出口から前記細胞内に前記第一の液体層の液体を吐出させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
キャピラリー保持部と、
光ファイバー装着部と、
前記光ファイバー装着部に装着された光ファイバーから発せられるレーザ光が、前記キャピラリー保持部に保持されたキャピラリーの外壁面のうち目的の領域に照射されるように、前記レーザ光を案内する光通路と
を備えたことを特徴とするキャピラリーホルダー。
【請求項６】
請求項５記載のキャピラリーホルダーと、
前記キャピラリーホルダーの光ファイバー装着部に装着された光ファイバーと、
前記光ファイバーに接続されたレーザ光源と、
前記レーザ光源から発せられるレーザ光の出力をコントロールするコントローラと
を備えたことを特徴とするレーザ光照射装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−１６６７５６（Ｐ２００６−１６６７５６Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６１４４８（Ｐ２００４−３６１４４８）
【出願日】平成１６年１２月１４日（２００４．１２．１４）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１４日（２００４．１２．１４）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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