本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患の予防及び／又は治療方法において使用するための、ＨＰＶ特異的Ｅ６及びＥ７オンコプロテインに特異的である新規なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、これらの新規なＴ細胞エピトープを含むペプチド、及びこれらのペプチドを含む（ワクチン）組成物に関する。好ましいエピトープは、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞、又は流入領域リンパ節由来のＴ細胞によって認識され、ＨＬＡ−ＤＱ若しくはＨＬＡ−ＤＰ分子、又はＨＬＡ−Ｂによって提示される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び免疫学の分野に関する。本発明は特に、ＨＰＶ関連疾患の予防、治療及び／又は診断において使用できる新規なＨＰＶエピトープに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は世界で２番目に多い癌である（Bosch et al. 2003）。高リスク型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ，human papilloma virus）の１６型及び１８型は、全患者のおよそ３分の２において子宮頸癌の原因となっている（Bosch et al. 1995、Munoz et al. 2003）。ＨＰＶゲノムは、悪性細胞の表現型の発現及び維持に必要であるため高悪性度子宮頸部病変及び癌において構成的に発現される２種のオンコプロテイン、Ｅ６及びＥ７をコードする（zur Hausen, 1996）。
【０００３】
これらのオンコプロテインの腫瘍特異的発現に加えて、子宮頸癌患者のほぼ半分の末梢血において検出される低レベルの血中Ｅ６及びＥ７特異的Ｔ細胞の存在（de Jong et al. 2004、van der Burg et al. 2001、Welters et al. 2003、Welters et al. 2006、Ressing et al. 1996、Bontkes et al. 2000、Luxton et al. 1996）は、これらのオンコプロテインが腫瘍拒絶抗原としての役割を果たし得ることを示唆した。しかしながら、血中ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の存在は、これらのオンコプロテインが抗腫瘍反応に寄与することを意味しない。疾患を管理するためには、これらのＴ細胞は少なくとも腫瘍部位にホーミングできなくてはならない。実際、子宮頸癌の一部はリンパ球に浸潤される（Bethwaite et al.1996、Chao et al. 1999、Piersma et al. 2007）が、おそらく腫瘍組織からＴ細胞培養を確立するのが比較的困難であるため、これらの子宮頸部腫瘍に浸潤するＴ細胞の特異性及びタイプに関する詳細な知識は今もなお不足している。それにもかかわらず、少数の初期の先駆者は、腫瘍からＨＰＶ特異的腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ，tumor infiltrating lymphocyte）を単離することができ、ＨＰＶ１６の２種の単一のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ（Evans et al. 1997、Oerke et al. 2005）並びに頻度の低い高リスクＨＰＶ５９及びＨＰＶ３３亜型（Hohn et al. 1999、Hohn et al. 2000）に特異的な２種のＣＤ４Ｔ細胞エピトープの同定につながった。しかしながら、子宮頸癌におけるＨＰＶ特異的適応免疫応答の寄与及び役割を理解するために、子宮頸部組織浸潤性リンパ球に関する大規模研究が緊急に必要である。加えて、このことにより、免疫介入戦略を成功させる合理的な設計が可能となるだろう。
【０００４】
最近の研究は、２種のサイトカイン、ＩＬ−７及びＩＬ−１５がＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋エフェクターメモリーＴ細胞の増殖及び生存において重要な役割をもつことを示した。ＩＬ−７はエフェクターＴ細胞に生存シグナルを提供する（Li et al. 2003）。ＩＬ−１５はＴ細胞分裂の開始において不可欠な増殖因子であり、ＴＩＬ培養を増殖させるために一般に使用するＩＬ−２とは対照的に、Ｔ細胞増殖の継続を制限しない（Li et al. 2001）。さらに、ＩＬ−１５は抗原−非依存性のＣＤ８（^＋）メモリーＴ細胞アクチベーターとしても働くことができる（Liu et al. 2002）。総合すると、ＩＬ−７及びＩＬ−１５は非常に高い効率でエフェクターメモリーＴ細胞を増殖させることができるが、これらのサイトカインの刺激に対してセントラルメモリーＴ細胞は反応性が低く、ナイーブＴ細胞は反応しない（Geginat et al. 2001、McKinlay et al. 2007、Bacchetta et al 2002）。
【０００５】
以前の研究の多くは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）由来のＴ細胞による、ＨＰＶ１６ Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質中の配列からなる合成ペプチドのＭＨＣクラスII拘束性認識を報告している。
【０００６】
国際公開第０２／０７０００６号パンフレットは、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２７〜１４２からなるペプチドに対するＤＲ１拘束性応答、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜５０からなるペプチドに対するＤＱ２拘束性応答、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸４３〜７７からなるペプチドに対するＤＲ３拘束性応答、及びＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸５０〜６２からなるペプチドに対するＤＲ１５拘束性応答を開示する。
【０００７】
Strangらは、無症候性個体由来のＰＢＭＣにおける、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質のアミノ酸４２〜５７からなる合成ペプチドに対するＤＲ７拘束性応答を開示する。
【０００８】
Altmannらは、無症候性個体由来のＰＢＭＣにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸５〜１８からなる合成ペプチドに対するＤＲ１／ＤＲ１１タイプの応答、無症候性個体由来のＰＢＭＣにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１７〜３４からなる合成ペプチドに対するＤＲ４／ＤＲ１３タイプの応答、及び無症候性個体由来のＰＢＭＣにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸６９〜８２からなる合成ペプチドに対するＤＲ４／ＤＲ１３タイプの応答を開示する。
【０００９】
国際公開第０２／０９０３８２号パンフレットは、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７タンパク質の一連の重複するペプチドについて、白人人口において最も多く見られるＨＬＡ−ＤＲ分子に対する結合親和性を開示する。国際公開第０２／０９０３８２号パンフレットはさらに、ボーエン様丘疹症患者由来のＣＤ８枯渇ＰＢＭＣにおける多くのＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７ペプチドに対する応答を報告する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／０７０００６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０９０３８２号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bosch, F. X. and de Sanjose, S. Chapter 1: Human papillomavirus and cervical cancer-burden and assessment of causality. J Natl Cancer Inst Monogr: 3-13, 2003
【非特許文献２】Bosch, F. X., Manos, M. M., Munoz, N., Sherman, M., Jansen, A. M., Peto, J., Schiffman, M. H., Moreno, V., Kurman, R., and Shah, K. V. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst, 87: 796-802, 1995
【非特許文献３】Munoz, N., Bosch, F. X., de Sanjose, S., Herrero, R., Castellsague, X., Shah, K. V., Snijders, P. J., and Meijer, C. J. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med, 348: 518-527, 2003
【非特許文献４】zur Hausen, H. Papillomavirus infections--a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta, 9: F55-78, 1996
【非特許文献５】de Jong, A., van Poelgeest, M. I., van der Hulst, J. M., Drijfhout, J. W., Fleuren, G. J., Melief, C. J., Kenter, G., Offringa, R., and van der Burg, S. H. Human papillomavirus type 16-positive cervical cancer is associated with impaired CD4+ T-cell immunity against early antigens E2 and E6. Cancer Res, 64: 5449-5455, 2004
【非特許文献６】van der Burg, S. H., Ressing, M. E., Kwappenberg, K. M., de Jong, A., Straathof, K., de Jong, J., Geluk, A., van Meijgaarden, K. E., Franken, K. L., Ottenhoff, T. H., Fleuren, G. J., Kenter, G., Melief, C. J., and Offringa, R. Natural T-helper immunity against human papillomavirus type 16 (HPV16) E7-derived peptide epitopes in patients with HPV16-positive cervical lesions: identification of 3 human leukocyte antigen class II-restricted epitopes. Int J Cancer, 91: 612-618, 2001
【非特許文献７】Welters, M. J., de Jong, A., van den Eeden, S. J., van der Hulst, J. M., Kwappenberg, K. M., Hassane, S., Franken, K. L., Drijfhout, J. W., Fleuren, G. J., Kenter, G., Melief, C. J., Offringa, R., and van der Burg, S. H. Frequent display of human papillomavirus type 16 E6-specific memory t-Helper cells in the healthy population as witness of previous viral encounter. Cancer Res, 63: 636-641, 2003
【非特許文献８】Welters, M. J., van der Logt, P., van den Eeden, S. J., Kwappenberg, K. M., Drijfhout, J. W., Fleuren, G. J., Kenter, G. G., Melief, C. J., van der Burg, S. H., and Offringa, R. Detection of human papillomavirus type 18 E6 and E7-specific CD4+ T-helper 1 immunity in relation to health versus disease. Int J Cancer, 118: 950-956, 2006
【非特許文献９】Ressing, M. E., van Driel, W. J., Celis, E., Sette, A., Brandt, M. P., Hartman, M., Anholts, J. D., Schreuder, G. M., ter Harmsel, W. B., Fleuren, G. J., Trimbos, B. J., Kast, W. M., and Melief, C. J. Occasional memory cytotoxic T-cell responses of patients with human papillomavirus type 16-positive cervical lesions against a human leukocyte antigen-A *0201-restricted E7-encoded epitope. Cancer Res, 56: 582-588, 1996
【非特許文献１０】Bontkes, H. J., de Gruijl, T. D., van den Muysenberg, A. J., Verheijen, R. H., Stukart, M. J., Meijer, C. J., Scheper, R. J., Stacey, S. N., Duggan-Keen, M. F., Stern, P. L., Man, S., Borysiewicz, L. K., and Walboomers, J. M. Human papillomavirus type 16 E6/E7-specific cytotoxic T lymphocytes in women with cervical neoplasia. Int J Cancer, 88: 92-98, 2000
【非特許文献１１】Luxton, J. C., Rowe, A. J., Cridland, J. C., Coletart, T., Wilson, P., and Shepherd, P. S. Proliferative T cell responses to the human papillomavirus type 16 E7 protein in women with cervical dysplasia and cervical carcinoma and in healthy individuals. J Gen Virol, 77 ( Pt 7): 1585-1593, 1996
【非特許文献１２】Bethwaite, P. B., Holloway, L. J., Thornton, A., and Delahunt, B. Infiltration by immunocompetent cells in early stage invasive carcinoma of the uterine cervix: a prognostic study. Pathology, 28: 321-327, 1996
【非特許文献１３】Chao, H. T., Wang, P. H., Tseng, J. Y., Lai, C. R., Chiang, S. C., and Yuan, C. C. Lymphocyte-infiltrated FIGO Stage IIB squamous cell carcinoma of the cervix is a prominent factor for disease-free survival. Eur J Gynaecol Oncol, 20: 136-140, 1999
【非特許文献１４】Piersma, S. J., Jordanova, E. S., van Poelgeest, M. I., Kwappenberg, K. M., van der Hulst, J. M., Drijfhout, J. W., Melief, C. J., Kenter, G. G., Fleuren, G. J., Offringa, R., and van der Burg, S. H. High number of intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes is associated with the absence of lymph node metastases in patients with large early-stage cervical cancer. Cancer Res, 67: 354-361, 2007
【非特許文献１５】Evans, E. M., Man, S., Evans, A. S., and Borysiewicz, L. K. Infiltration of cervical cancer tissue with human papillomavirus-specific cytotoxic T-lymphocytes. Cancer Res, 57: 2943-2950, 1997
【非特許文献１６】Oerke, S., Hohn, H., Zehbe, I., Pilch, H., Schicketanz, K. H., Hitzler, W. E., Neukirch, C., Freitag, K., and Maeurer, M. J. Naturally processed and HLA-B8-presented HPV16 E7 epitope recognized by T cells from patients with cervical cancer. Int J Cancer, 114: 766-778, 2005
【非特許文献１７】Hohn, H., Pilch, H., Gunzel, S., Neukirch, C., Hilmes, C., Kaufmann, A., Seliger, B., and Maeurer, M. J. CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes in cervical cancer recognize HLA-DR-restricted peptides provided by human papillomavirus-E7. J Immunol, 163: 5715-5722, 1999
【非特許文献１８】Hohn, H., Pilch, H., Gunzel, S., Neukirch, C., Freitag, K., Necker, A., and Maeurer, M. J. Human papillomavirus type 33 E7 peptides presented by HLA-DR*0402 to tumor-infiltrating T cells in cervical cancer. J Virol, 74: 6632-6636, 2000
【非特許文献１９】Li, J., Huston, G., and Swain, S. L. IL-7 promotes the transition of CD4 effectors to persistent memory cells. J Exp Med, 198: 1807-1815, 2003
【非特許文献２０】Li, X. C., Demirci, G., Ferrari-Lacraz, S., Groves, C., Coyle, A., Malek, T. R., and Strom, T. B. IL-15 and IL-2: a matter of life and death for T cells in vivo. Nat Med, 7: 114-118, 2001
【非特許文献２１】Liu, K., Catalfamo, M., Li, Y., Henkart, P. A., and Weng, N. P. IL-15 mimics T cell receptor crosslinking in the induction of cellular proliferation, gene expression, and cytotoxicity in CD8+ memory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 6192-6197, 2002
【非特許文献２２】Geginat, J., Sallusto, F., and Lanzavecchia, A. Cytokine-driven proliferation and differentiation of human naive, central memory, and effector memory CD4(+) T cells. J Exp Med, 194: 1711-1719, 2001
【非特許文献２３】McKinlay, A., Radford, K., Kato, M., Field, K., Gardiner, D., Khalil, D., Burnell, F., Hart, D., and Vuckovic, S. Blood monocytes, myeloid dendritic cells and the cytokines interleukin (IL)-7 and IL-15 maintain human CD4+ T memory cells with mixed helper/regulatory function. Immunology, 120: 392-403, 2007
【非特許文献２４】Bacchetta, R., Sartirana, C., Levings, M. K., Bordignon, C., Narula, S., and Roncarolo, M. G. Growth and expansion of human T regulatory type 1 cells are independent from TCR activation but require exogenous cytokines. Eur J Immunol, 32: 2237-2245, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、ＨＰＶ関連悪性腫瘍における、好ましくはＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５などのより多く見られる高リスク亜型に関して腫瘍浸潤性リンパ球の存在、タイプ及び特異性についての知識が依然として必要である。本発明の目的は、腫瘍浸潤性リンパ球の標的であり、ＨＰＶ関連疾患の予防、治療及び／又は診断において使用できる新規なＨＰＶエピトープを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、子宮頸部悪性腫瘍患者７０名の大規模集団における子宮頸部浸潤性Ｔ細胞の存在及びＨＰＶ１６又は、ＨＰＶ１８特異性に関する本発明者らの分析に基づいて同定した新規なＴ細胞エピトープを提供する。本発明者らは、これらの浸潤性リンパ球がＨＰＶ特異的Ｔ細胞を含むことを発見した。より詳細な分析において、本発明者らは、１７個の新規なＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ、並びにこれらのＨＬＡ拘束エレメントを同定したが、ＨＰＶ特異的免疫応答がＥ６及びＥ７オンコプロテインの全ての部分に対して誘導されることも明らかにした。意外なことに、ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープの大多数は、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ分子が微量に発現されるという状況において提示された。同定されたＴ細胞エピトープは、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８陽性腫瘍に対する免疫応答において生理的標的を構成するので、ＨＰＶ関連疾患患者においてＨＰＶ関連疾患の予防及び免疫療法を最適化するために有益な標的である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一態様において、本発明はしたがって、ＨＰＶ由来合成ペプチドに加え、新たに同定されたＨＰＶのＣＤ４^＋Ｔｈ及びＣＤ８^＋ＣＴＬ細胞エピトープのアミノ酸配列に関し、これらを含む免疫原性組成物もまた本発明の一部である。このようなペプチドは、広範なＨＰＶ関連悪性腫瘍を含むＨＰＶ関連疾患患者において投与時に、大いに改善、増強、及び延長されたＣＤ８^＋ＣＴＬエフェクター及び記憶応答をもたらす。このようなペプチドはまた、このＣＤ４^＋Ｔｈ応答の結果として、エフェクター細胞がより浸潤しやすい、大いに改善された炎症誘発性微小環境を誘導することもできる。
【００１５】
本発明のペプチドは好ましくはワクチン単独として又は免疫原性組成物と組み合わせて若しくはかかる免疫原性組成物の一部として使用されるので、前記ペプチドはワクチンペプチドと呼び、組成物はワクチン組成物と呼ぶことが好ましい。
【００１６】
インビトロで効率良く合成できるので、医療用には比較的短いペプチドの使用が非常に好ましく、約１００アミノ酸よりも大きいネイティブなタンパク質は不可能であるか、又は不経済である。ペプチドの化学合成は日常的な操作であり、種々の適した方法が当業者に知られている。ペプチドの化学合成はまた、標準化が困難であり徹底的な精製及び品質管理手法を要するという無傷のタンパク質の組換え体生産に関連する問題も克服する。ＨＬＡクラスＩ及びクラスIIエピトープの長さを超える長さの（例えば、本明細書において下記に示す長さを有している）ペプチドは、国際公開第０２／０７０００６号パンフレットにおいて説明されたように、プロフェッショナル抗原提示細胞、特にＤＣに取り込まれるのに十分な大きさであり、含有されるＨＬＡクラスＩ及びクラスIIエピトープの細胞表面提示が起こる前にＤＣにおいてプロセシングされるため、ワクチン成分として使用するのに特に有利である。したがって、非抗原提示細胞上の最小ＨＬＡクラスＩエピトープの組織的提示によるＴ細胞寛容の不都合な誘導（Toes et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93:7855及びToes et al., 1996, J. Immunol. 156:3911に示されるように）は、本明細書において示される長さを有する本発明のペプチドの適用によって予防される（Zwaveling et al., 2002, J. Immunol. 169:350において示されるように）。ＣＴＬ及び／又はＴｈ細胞のＴ細胞受容体に提示されることになるエピトープを含むペプチドは、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスIIエピトープの両方を含有するのに十分な長さを有することが好ましい。
【００１７】
本発明の第１の態様において、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質のうちの少なくとも１つの完全長アミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。好ましくは、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質の完全長アミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列は、血清型１６、１８、３１、３３又は４５などの高リスク型ＨＰＶ血清型由来、より好ましくはＨＰＶ Ｅ６及びＥ７血清型１６、１８、３１又は３３のアミノ酸配列由来、最も好ましくは血清型１６又は１８由来であり、その中で１６が最も好ましい。ＨＰＶ血清型１６Ｅ６及びＥ７タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１及び２にそれぞれ示す。ＨＰＶ血清型１８Ｅ６及びＥ７タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３及び４にそれぞれ示す。
【００１８】
ペプチドは、少なくとも１つのＨＬＡクラスIIＴｈ細胞エピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、好ましくは本明細書において下記でより詳細に定義されるエピトープを含むことが好ましい。ペプチドは、１００アミノ酸以下の長さを有し、上記で定義したＨＰＶタンパク質のうちの１つのアミノ酸配列から選択される少なくとも１９個の連続するアミノ酸を含むことが好ましく、このペプチドは好ましくは、ＨＬＡクラスIIエピトープ及びＨＬＡクラスＩエピトープのうちの１つ、より好ましくは少なくとも１つのＨＬＡクラスIIエピトープ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープの両方、並びに最も好ましくは（必ずしも必要ではないが）両方が上記で定義されたＨＰＶタンパク質のうちの１つのアミノ酸配列由来のものを含む。ペプチドにおいて、少なくとも１つのＨＬＡクラスIIエピトープ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープが、上記で定義したＨＰＶタンパク質のうちの１つのアミノ酸配列由来の連続するアミノ配列内に存在することがより好ましい。明確にするためにいえば、本発明のペプチドは、ＨＬＡクラスＩに提示されるエピトープ及び／又はＨＬＡクラスIIに提示されるエピトープを含むことが好ましい。これらのエピトープはそれぞれ、本明細書において記載されるようにプロセシングされた後、提示可能であり、細胞上に存在する対応する特異的ＨＬＡ分子に結合するはずである。そのため本発明の文脈において、ＨＬＡハプロタイプ特異的エピトープはまた、そのＨＬＡハプロタイプに結合し、提示及び／又は拘束されるエピトープと称することもできる。
【００１９】
本発明の文脈において、「ペプチドが１００アミノ酸以下の長さを有する」とは、ＨＰＶタンパク質に由来しており、本明細書に記載のペプチド中に存在する連続的なアミノ酸数が、１００、９８、９６、９４、９２、又は９０以下であることを意味することが好ましい。したがって、本明細書に定義されているペプチドは本質的に、完全長ＨＰＶタンパク質とは異なる。このようなペプチドは、ＨＰＶタンパク質に由来するアミノ酸以外のさらなるアミノ酸を含んでもよく、又は完全にＨＰＶタンパク質に由来するアミノ酸配列でできていても、若しくは同アミノ酸配列からなっていてもよい。ペプチドに含まれる上記で定義したＨＰＶタンパク質のうちの１つ由来の連続したアミノ酸配列の長さは、好ましくは少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５アミノ酸及び／又は好ましくは１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、６０、５０、４５、４０、３５、３３又は３０以下であり、ペプチドに含まれる上記で定義したＨＰＶタンパク質のうちの１つ由来の連続したアミノ酸配列の長さは、より好ましくは１９〜４５、さらにより好ましくは２２〜４０アミノ酸、さらにより好ましくは３０〜３５、最も好ましくは３３〜３５アミノ酸である。別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、本明細書において定義したＨＰＶタンパク質由来の連続したアミノ酸配列のいずれかからなり、それによって、ネイティブなＨＰＶタンパク質配列においてこのアミノ酸配列と隣接していないＨＰＶタンパク質由来の連続したアミノ酸配列のいずれの末端にもアミノ酸は付加されていないことが理解される。本発明のペプチドは、容易に合成することができ、プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれプロテアソームによってプロセシングされるのに十分な大きさであり、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスIIエピトープを含有するために十分な物理容量及び長さを有する。必要に応じ、ペプチドはＮ又はＣ末端伸長を含んでいてもよく、この伸長はアミノ酸、修飾アミノ酸又は例えばバイオアベイラビリティ、細胞取り込み、プロセシング及び／若しくは可溶性を強化できる別の官能基であってもよい。
【００２０】
本発明の好ましいペプチドは、１００、９８、９６、９４、９２アミノ酸以下の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質のうち少なくとも１つのアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続したアミノ酸を含み、この連続したアミノ酸配列は、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞、又は子宮頸部腫瘍性病変から流入している骨盤領域のリンパ節に存在する若しくはそこから単離されたＴ細胞、好ましくは転移性腫瘍細胞を含む流入領域リンパ節に存在する若しくはそこから単離されたＴ細胞によって認識されるエピトープを含む。本発明によるペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導するために使用されることが好ましい。
【００２１】
本発明のさらに好ましいペプチドにおいて、連続したアミノ酸配列は、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１１〜３２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸３７〜６８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２〜６１、ＨＰＶ６タンパク質のアミノ酸５１〜７２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５〜８６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸６１〜８２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７３〜１０５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１１２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１０１〜１２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２１〜１４２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９〜１３８、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸２１〜４２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１〜７２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸７６〜８６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３〜２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸２９〜３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２〜６１、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９〜１３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３７〜１４６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１４９〜１５８、及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１１〜１９からなる群から選択されるエピトープを含む。本発明のなおさらに好ましいペプチドにおいて、連続したアミノ酸配列は配列番号５〜２６からなる群から選択されるエピトープを含む。
【００２２】
本発明の好ましいペプチドは、少なくともＨＰＶ特異的クラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープを含む。本発明によるペプチド中に含まれるクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＰＶ関連疾患ヒト患者及び／又は健常対照においてＣＤ４^＋Ｔｈ細胞を誘導又は活性化できることが好ましい。活性化はエクスビボ又はインビボで、より好ましくは感染細胞及び／又は腫瘍細胞が上記で定義したＨＰＶタンパク質を発現するＨＰＶ関連悪性腫瘍等のＨＰＶ関連疾患ヒト患者において、評価されることが好ましい。ＨＬＡクラスIIエピトープは、ＣＤ４^＋Ｔｈ記憶及び／又はＣＤ４＋Ｔｈエフェクター応答を活性化すること、すなわちＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞の活性化が可能であることが最も好ましい。このことは、ＤＣのＣＤ４０誘発による「殺細胞許可（license to kill）」シグナル（Lanzavecchia, 1998）によって、より強力なＣＤ８^＋エフェクター及び記憶ＣＴＬ応答をもたらすことになる。別の状況において、活性化されたＣＤ４＋Ｔｈ細胞は、免疫系のＨＬＡ非拘束性キラー細胞を活性化することができる。
【００２３】
本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれる好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１１〜３２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸３７〜６８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２〜６１、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５１〜７２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５〜８６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸６１〜８２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７３〜１０５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１１２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１０１〜１２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２１〜１４２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９〜１３８、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸２１〜４２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１〜７２及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸７６〜８６からなる群から選択される。本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれるより好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号５〜２１からなる群から選択される。
【００２４】
本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれる別の好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ１２、ＤＲ１５、ＤＰ１、ＤＰ０２０１、ＤＰ４、ＤＰ１４、ＤＰ１４０１、ＤＰ１７、ＤＱ５、ＤＱ６、ＤＰ１９０１、ＤＱ^＊０３０１、ＤＱ^＊０３０２、ＤＱ^＊０３０８、ＤＱ^＊０５０１からなる群から選択されるハプロタイプによって拘束されるエピトープである。本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれるさらに好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＤＰ又はＤＱハプロタイプによって拘束されるエピトープであり、そのうちＤＰ１、ＤＰ０２０１、ＤＰ４、ＤＰ１４、ＤＰ１４０１、ＤＰ１７、ＤＱ５、ＤＱ６、ＤＰ１９０１、ＤＱ^＊０３０１、ＤＱ^＊０３０２、ＤＱ^＊０３０８及びＤＱ^＊０５０１がより好ましい。１つの以前開示されたＨＬＡ−ＤＱ拘束性エピトープ（国際公開第０２／０７０００６号パンフレット）は、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜５０からなる。しかしながらこのエピトープは、末梢Ｔ細胞によって認識され、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞、又は子宮頸部腫瘍性病変から流入している骨盤領域のリンパ節に存在する若しくはそこから単離されたＴ細胞によって認識されないエピトープである。そのため本発明のペプチド中の連続した配列は、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜５０からなるエピトープを含まないことが好ましい。したがって、本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれる好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＤＰ又はＤＱハプロタイプによって拘束され、ＤＲハプロタイプによって拘束されないエピトープである。ＨＬＡ−ＤＲ分子の発現は、腫瘍細胞上でアップレギュレートされることが知られている。この状況における提示は、ノンプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ，Antigen Presenting Cell）上の抗原提示のように、寛容を誘導する場合がある。ＨＬＡ−ＤＰ又は−ＤＱ分子の発現は非常に低いが、それにもかかわらずＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰエピトープは、例えばＤＣなどのプロフェッショナルＡＰＣ上に提示される場合、効果的な免疫応答をもたらすことができる。
【００２５】
本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれるさらに別の好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＤＰ又はＤＱハプロタイプによって拘束される、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質、より好ましくはＨＰＶ血清型１６、１８、３１、３３又は４５のＥ６又はＥ７タンパク質、最も好ましくはＨＰＶ血清型１６又は１８のＥ６又はＥ７タンパク質のエピトープであり、そのうち１６が最も好ましい。
【００２６】
本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれるなおさらに好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１１〜３２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸３７〜６８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２〜６１、ＨＰＶ６タンパク質のアミノ酸５１〜７２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸６１〜８２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７３〜１０５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１１２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１０１〜１２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２１〜１４２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３２及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１〜７２からなる群から選択されるエピトープである。本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれるより好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１６、１８、１９、２０及び２１からなる群から選択される。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、少なくともＨＰＶ特異的クラスＩＣＤ８^＋ＣＴＬ細胞エピトープを含む。加えて、前記ＨＬＡクラスＩエピトープはＣＤ８^＋ＣＴＬ応答を活性化できることが好ましい。ＣＴＬ活性化能は、エクスビボ及び／又はインビボで、ヒト健常対照個体において、又はさらにより好ましくは感染及び／若しくは腫瘍細胞が上記で定義したＨＰＶタンパク質を発現するＨＰＶ関連悪性腫瘍などのＨＰＶ関連疾患ヒト患者において、実証されていることが最も好ましい。１つのペプチド内にＨＬＡクラスＩ及びクラスIIエピトープ両方が存在することは、効果的なＣＴＬ細胞応答の開始及び維持に相乗効果があるため、特に有利であることが認められている（Zwaveling et al., 2002に示される）。
【００２８】
ＣＴＬ及び／又はＴｈ細胞のＴ細胞受容体に提示されることになるエピトープを含むペプチドは、多くの必要条件を満たすことが好ましい。ペプチドは、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスIIエピトープの両方を含有するのに十分な長さを有することが好ましい。さらにペプチドは、ＨＬＡクラスＩ結合部分内にアンカー残基を含み、それぞれクラスＩ分子に結合可能となることが好ましい。ペプチドと提示ＭＨＣ分子間の相互作用の安定性は、顕著で効果的な免疫応答を引き起こすために十分であることが好ましい。したがって本発明の文脈において、ペプチドと提示ＭＨＣ分子間の相互作用の安定性は、ペプチドが高親和性結合への中間体を有し、それによって約５μＭ以下のＩＣ_５０が高親和性結合とみなされ、約５μＭ超約１５μＭ以下のＩＣ_５０が中親和性結合とみなされ、約１５μＭ超１００μＭ以下のＩＣ_５０が低親和性結合と判断され、約１００μＭ超のＩＣ_５０が結合なしとみなされ、それによってペプチドのＭＨＣ分子への結合親和性がvan den Burg et al., 1995及びKessler et al., 2003に記載の通り決定されるようなものであることが好ましい。
【００２９】
エピトープのＣ末端を生じる特異的プロテアソーム切断部位は、大きい方のペプチドから遊離してＨＬＡクラスＩ分子上に提示されるように、エピトープアミノ酸配列のちょうど後ろに存在することが好ましい。ＨＬＡクラスII提示エピトープの長さの必要条件はそれほど厳しくなく、したがってクラスII結合ペプチドの厳密な酵素的生成が絶対必要というわけではない。こうした必要条件は、完全長ＨＰＶタンパク質配列、特にＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質においてペプチドを局在化及び設計するために本発明において使用され、かかるペプチドは、好ましいＣＴＬ及びＴｈ細胞エピトープ及び／又はこれらの組合せを含み、したがってワクチン接種の目的に非常に適するペプチドである。
【００３０】
さらに、インビトロ及びエクスビボでのＴ細胞実験は、本発明によるペプチドが実質的なＣＤ４^＋Ｔｈ及びＣＤ８^＋ＣＴＬ応答を誘導する能力を確認するために使用されることが好ましい。そのため本発明のペプチドは、最も強力で最も広く適用できるＨＰＶ Ｅ６及びＥ７腫瘍抗原由来のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスII提示Ｔ細胞エピトープを含む化学的に合成可能な比較的短いペプチドの選択において著しい改善をもたらす。ペプチドはプロテアソーム切断に関して個々に最適化され、好ましくはＨＬＡクラスＩ及びクラスIIエピトープのうちの少なくとも１つ、より好ましくはＨＬＡクラスＩ及びクラスIIエピトープ両方を含有する。本発明のペプチド内に含有されるＣＴＬエピトープＣ末端の２０Ｓプロテアソームによる遊離は、ＣＤ８^＋ＣＴＬ刺激能を有するＨＬＡクラスＩ結合断片をもたらす。
【００３１】
本発明のＨＰＶペプチドにおけるＨＬＡクラスＩエピトープは、治療を受けるヒト対象集団において優勢なＨＬＡ対立遺伝子上に提示できることが好ましい。本発明のＨＰＶ由来ペプチドにおいて好ましいＨＬＡクラスＩエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ５７、及びＨＬＡ^＊０２０１に結合できるエピトープである。最も好ましいＨＬＡクラスＩ ＣＴＬエピトープは、ＨＬＡ−Ｂ結合ＨＰＶエピトープであり、そのうちＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ５７が最も好ましい。ＨＬＡクラスＩエピトープは、高いペプチド結合能（約５μＭペプチド未満のＩＣ_５０）又は少なくとも中親和性（５μＭ超、約１５μＭペプチド未満のＩＣ_５０）を有することが好ましい。本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれる好ましいクラスＩ ＣＴＬエピトープは、上記のクラスＩハプロタイプによって拘束される、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質、より好ましくはＨＰＶ血清型１６、１８、３１、３３又は４５のＥ６又はＥ７タンパク質、最も好ましくはＨＰＶ血清型１６又は１８のＥ６又はＥ７タンパク質のエピトープであり、そのうち１６が最も好ましい。
【００３２】
本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれる好ましいクラスＩ ＣＴＬエピトープは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３〜２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸２９〜３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２〜６１、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９〜１３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３７〜１４６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１４９〜１５８及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１１〜１９からなる群から選択される。本発明によるペプチド中（の連続した配列中）に含まれるより好ましいクラスIIＣＤ４^＋Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号７、１４、２２〜２６からなる群から選択される。
【００３３】
本発明によるペプチド中に含まれる好ましいエピトープは、ＨＬＡ−Ｂ分子によって提示されるエピトープである。ＨＬＡ−Ｂ分子は、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７分子であることが好ましい。そのようなエピトープは、配列番号７、２２、２４、２５及び２６からなる群から選択される。
【００３４】
本発明によるペプチド中に含まれる別の好ましいエピトープは、ＨＬＡ−Ａ分子によって提示されるエピトープである。ＨＬＡ−Ａ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、又はＨＬＡ^＊０２０１分子であることが好ましい。そのようなエピトープは、配列番号２３及び２６からなる群から選択される。
【００３５】
より好ましい実施形態によると、本発明のペプチドは、１００、９８、９６、９４、９４、９２アミノ酸以下の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１〜３２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１９〜５０、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸４１〜６５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５〜８０、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸８５〜１０９、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質Ｅ６のアミノ酸１０９〜１４０、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２７〜１５８、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３５、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸２２〜５６、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸４３〜７７、及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸６４〜９８からなる群から選択されるＨＰＶタンパク質由来の連続したアミノ酸配列を含む。本発明のペプチドは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１〜３２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１９〜５０、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸４１〜６５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５〜８０、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸８５〜１０９、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質Ｅ６のアミノ酸１０９〜１４０、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２７〜１５８、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３５、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸２２〜５６、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸４３〜７７及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸６４〜９８からなる群から選択されるＨＰＶタンパク質由来の連続したアミノ酸配列からなることがより好ましい。ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質由来の連続したアミノ酸配列は、好ましくはＨＰＶ血清型１６、１８、３１、３３又は４５、最も好ましくはＨＰＶ血清型１６又は１８のものであり、そのうち１６が最も好ましい。
【００３６】
このエピトープが前記ペプチドに存在していれば、本明細書において定義したペプチドが、前記ペプチドにおけるエピトープ（例えば本発明において、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ分子のうち少なくとも１つによって提示されるエピトープ、及び／又は子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞若しくは流入領域リンパ節由来のＴ細胞によって認識されると同定されるエピトープ）の存在に関係する所望の有利な性質を有するであろうことが当業者にはすぐに明らかである。本発明によるペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導するために使用されることが好ましい。
【００３７】
当業者であれば、本適用が本明細書において同定される所望のエピトープを含むか、又はかかるエピトープからなるように設計可能な各ペプチドを、本明細書で同定していなくても、本発明は本明細書において同定されるエピトープを含む、又はかかるエピトープからなる本明細書に定義されている任意のペプチドを包含することを理解するであろう。好ましい実施形態において、ペプチドはＨＰＶタンパク質とは異なる。別の好ましい実施形態において、ペプチドはＨＰＶ１６ Ｅ７のアミノ酸３５〜５０を含まない、又は同アミノ酸からなるものではない。
【００３８】
例えば、１つの好ましいエピトープは、配列番号５（ＨＰＶ１６ Ｅ６のアミノ酸１１〜３２）である。この段落は、本明細書において同定される各エピトープの説明であり、同エピトープに適用することができる。配列番号５を含む任意のペプチドは、本発明によって包含され、本発明に従って使用することができる。この好ましい実施形態において、ペプチドはＨＰＶタンパク質とは異なる。本発明のペプチドの好ましいアミノ酸長は、本明細書において既に定義されている。本発明のペプチドを設計する場合、ペプチドは、本明細書において同定される所定のエピトープのＮ末端部位から始まってもよく又は本明細書において同定される所定のエピトープのＣ末端部位で終わってもよい。代替として、所定のエピトープ（例えば配列番号５）は、本発明のペプチド内に含まれてもよい。例として配列番号５を使用すると、本発明者らが４５アミノ酸の長さを有するペプチドを設計する場合、このようなペプチドはＨＰＶ１６ Ｅ６の１１〜５６、１〜４５、２〜４６、３〜４７、４〜４８、５〜４９、５〜５０からなってもよく、又はこれらを含んでもよい。本発明のペプチドはさらに、本明細書において定義される又は当業者に既知の任意の別のＨＰＶエピトープを含んでもよい。
【００３９】
この好ましい実施形態（エピトープとして配列番号５）において、ペプチドは、米国特許第２００５／０１４２５４１号明細書に開示されているＨＰＶ１６ Ｅ６のアミノ酸９〜３３を含まないか、又は同アミノ酸からなるものではない。この好ましい実施形態において、ペプチドは、欧州特許第４５１５５０号明細書に開示されているＨＰＶ１６ Ｅ６のアミノ酸１〜３７を含まないか、又は同アミノ酸からなるものではない。この好ましい実施形態において、ペプチドは、米国特許第５６２９１６１号明細書に開示されているＨＰＶ１６ Ｅ６のアミノ酸８〜３７を含まないか、又は同アミノ酸からなるものではない。好ましい実施形態において、配列番号５を含むペプチドは、１０〜３２、１〜３２、１〜４５、１１〜５６、２〜４６、３〜４７、４〜４８、５〜４９、５〜５０（数字はＨＰＶ１６ Ｅ６の開始及び末端アミノ酸を示す）からなるか、又は同アミノ酸を含む。
【００４０】
別の好ましい実施形態（エピトープとして配列番号８、ＨＰＶ１６ Ｅ６のアミノ酸５５〜８６）において、ペプチドは、ユニプロット（uniprot）に開示されている、次の受託番号Ｑ９１９Ｂ２（１〜９９、数字はＨＰＶ１６ Ｅ６の開始及び末端アミノ酸を示す）又はＱ８０８８２（１〜８４）を有するＨＰＶ１６ Ｅ６の断片を含まないか、又は同断片からなるものではない。本実施形態でもまた、配列番号８を含むペプチドは、このエピトープのＮ末端部位から始まってもよく、又はこのエピトープのＣ末端部位で終わってもよく、又はこのエピトープはペプチド内に存在してもよい。例えば、本発明者らが４５アミノ酸の長さを有するペプチドを設計すると、このようなペプチドは５５〜１００、４１〜８６、４５〜９０からなっても又はこれらを含んでもよい。好ましい実施形態において、配列番号８を含むペプチドは、５５〜１００、４１〜８６、４５〜９０からなり又はこれらを含む（数字はＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質アミノ酸配列における開始及び末端アミノ酸を示す）。
【００４１】
本発明のＨＰＶ由来ペプチドは、１又は複数のアミノ酸の欠失又は置換によって、追加のアミノ酸又は官能基を用いたＮ及び／又はＣ末端伸長によって改変することができ、これによりバイオアベイラビリティ、Ｔ細胞標的化を改善でき、又はアジュバント若しくは（共）刺激機能を提供する免疫調節物質を含む若しくは放出することができる。Ｎ及び／又はＣ末端の任意選択の追加のアミノ酸は、ＨＰＶタンパク質のネイティブなアミノ酸配列中の対応する位置に存在しないことが好ましく、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７アミノ酸配列（例えば、配列番号１〜４）のいずれの由来でもないことがより好ましい。当業者であれば、種々のＨＰＶ血清型のＨＰＶアミノ酸配列が本発明に明白に含まれることをよく理解するであろう。
【００４２】
本発明のＨＰＶ由来ペプチドは、化学合成及びその後の精製によって得ることができる（例えば、実施例１参照）。本発明のＨＰＶ由来ペプチドは、３５、２０、１０、５又は０％以下のＤＭＳＯを含む生理学的に許容される水溶液（例えば、ＰＢＳ）に可溶であることが好ましい。このような溶液において、ペプチドは、少なくとも１ｍｌ当たりペプチド０．５、１、２、４、又は８ｍｇの濃度で可溶であることが好ましい。複数の異なる本発明のＨＰＶ由来ペプチドの混合物が、少なくともこのような溶液１ｍｌ当たりペプチド０．５、１、２、４、又は８ｍｇの濃度で可溶であることがより好ましい。
【００４３】
本発明によるペプチドの好ましい使用は、薬物としての使用であり、それによりペプチドがワクチン又はその活性成分として使用されることがより好ましい。各ペプチドは、単独で又は好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１５及び２０までの異なる本発明のペプチドの組合せで、癌の治療及び／又は予防において、薬物、好ましくはＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用ワクチンの製造のために使用することができる。本発明によるこのような薬物及び／又は抗腫瘍ワクチンは、以下の非網羅的なリスト、子宮頸部（ＣＩＮ，cervix）、外陰部（ＶＩＮ，vulva）、膣（ＶａＩＮ，vagina）、肛門（ＡＩＮ，anus）、及び陰茎（ＰＩＮ，penis）の頸部上皮内腫瘍形成、並びに子宮頸部、外陰部、膣、肛門、陰茎及び頭頸部の癌、に罹患しているか、又は発症するリスクのある患者を治療するために使用することができる。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１５及び２０までの異なる上記で定義された本発明のペプチドを含み、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、特にアジュバント及び免疫調節剤を含んでもよい、ヒト対象の治療及び／又はワクチン接種に有用であり得る組成物にさらに関する。組成物は、医薬組成物及び／又は薬物としての使用するためのものであることが好ましい。医薬組成物は、好ましくはワクチン接種を目的とする。医薬組成物は、癌の治療及び／又は予防のために、薬物、好ましくはＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用ワクチンの製造のために使用することが好ましい。ＨＰＶ関連疾患の非網羅的なリストは、本明細書において既に示している。
【００４５】
したがって、一態様において本発明は、ＨＰＶ関連疾患の予防及び／又は治療用薬物の製造のためのペプチドの使用であって、ペプチドが、１００、９８、９６、９４、９２アミノ酸以下の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質のうち少なくとも１つのアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続したアミノ酸を含み、連続したアミノ酸配列が、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ分子のうち少なくとも１つによって提示されるエピトープを含む、使用に関する。エピトープは、ＨＬＡ−ＤＱ２に関連して提示されず、且つ、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜５０からなるエピトープではないことが好ましい。代替として又は別の好ましい実施形態における先の好ましい実施形態と組み合わせて、連続したアミノ酸配列は、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞によって、又は流入領域リンパ節由来のＴ細胞によって認識されるエピトープを含む。ペプチド、連続したアミノ酸配列及びエピトープは、本明細書において上記で定義された通りであることが好ましい。
【００４６】
別の態様において、本発明は、ＨＰＶ関連疾患の予防及び／又は治療用薬物の製造のためのペプチドの使用であって、ペプチドが、１００、９８、９６、９４、９２アミノ酸以下の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質のうち少なくとも１つのアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続したアミノ酸を含み、連続したアミノ酸配列が、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞によって、又は流入領域リンパ節由来のＴ細胞によって認識されるエピトープを含む、使用に関する。ペプチド、連続したアミノ酸配列及びエピトープは、本明細書において上記で定義された通りであることが好ましい。
【００４７】
薬物の処方、投与方法及び薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において既知及び通例であり、例えばRemington; The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition 2005, University of Sciences in Philadelphiaに記載されている。本発明の医薬組成物及び薬物は、静脈内若しくは皮下、又は筋肉内投与に適するように処方されることが好ましいが、粘膜投与又は例えば、注射による真皮内（intradermal）及び／若しくは皮内（intracutaneous）投与などの別の投与経路が想定可能である。本明細書において、真皮内投与が好ましい。真皮内投与に特に関連する利点及び／又は好ましい実施形態は、「真皮内投与」と題する独立した章において追って定義する。
【００４８】
本発明の少なくとも１つのペプチド及び／又は少なくとも１つの組成物の投与を、単一の投与として実施できることが本発明によりさらに包含される。代替として、少なくとも１つのペプチド及び／又は少なくとも１つの組成物の投与を必要に応じて繰り返してもよく、及び／又は本発明の異なるペプチド及び／又は組成物を順次に投与してもよい。
【００４９】
本発明による医薬組成物（薬物とも称する）は、少なくとも１つの免疫応答刺激化合物又はアジュバントを含むことが好ましい。有利には、本発明による医薬組成物は、１又は複数の合成アジュバントをさらに含んでもよい。こうしたアジュバントは、本発明による医薬組成物に混合してもよく、又は治療を受ける哺乳動物又はヒトに別々に投与してもよい。特に好ましいのは、Ｔｏｌｌ様受容体を介して且つ／又はレチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−１，Retinoic acid-Inducible Gene-1）タンパク質を介して且つ／又はエンドセリン受容体を介して作用すると知られているアジュバントである。先天性免疫系を活性化できる免疫修飾化合物は、ＴＬＲ１〜１０を含むＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ，Toll like receptor）を介して特によく活性化することができる。ＴＬＲ受容体並びにその修飾体及び誘導体を活性化できる化合物は、当技術分野において十分に立証されている。ＴＬＲ１は細菌のリポタンパク質及びそのアセチル化体によって活性化でき、加えてＴＬＲ２はグラム陽性細菌の糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、線毛、外膜タンパク質、細菌由来又は宿主由来ヒートショックタンパク質、及びマイコバクテリアの（Mycobacterial）リポアラビノマンナンによって活性化できる。ＴＬＲ３は、特にウイルス起源のｄｓＲＮＡによって、又はポリ（Ｉ：Ｃ）化合物によって活性化できる。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来又は細菌起源のヒートショックタンパク質、ウイルスコート又はエンベロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、オリゴ糖を含有するヒアルロン酸及びフィブロネクチンによって活性化できる。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛又はフラジェリンによって活性化できる。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアのリポタンパク質、及びＢ群連鎖球菌（Streptococcus）易熱性可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ，group B streptococcus heat labile soluble factor）又は連鎖球菌モジュリンによって活性化できる。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリンによって活性化できる。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ又はクロマチン−ＩｇＧ複合体によって活性化できる。特にＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する先天性免疫応答を媒介するのに重要な役割を果たし、これらの受容体を活性化できる化合物は、本発明による治療方法において及び組成物又は薬物において使用するために特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、ｄｓＲＮＡを含む合成的に生成された化合物、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体を誘発する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニスト、Montanide ISA-51、MontanideISA720（フランスのSeppic社 ７により製造されたアジュバント）を含むがこれらに限定されない。ＲＩＧ−１タンパク質は、ＴＬＲ３と同様にｄｓ−ＲＮＡによって活性化されることが知られている（Immunity, (2005), 1:19-28）。別の好ましい実施形態において、合成アジュバント化合物は、本発明のペプチドに物理的に結合している。アジュバント及び共刺激化合物又は官能基の、ペプチドを含むＨＬＡクラスＩ及びクラスIIエピトープとの物理的結合は、抗原提示細胞、特に抗原を取り込み、代謝し提示する樹状細胞の同時刺激によって免疫応答の強化をもたらす。別の好ましい免疫修飾化合物は、ＢＱ−７８８などのエンドセリン受容体の阻害剤である（Buckanovich RJ et al. Nature Medicine (2008), 14:28-36, Ishikawa K, PNAS (1994) 91:4892）。ＢＱ−７８８は、Ｎ−ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−γ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかしながら、任意のＢＱ−７８８誘導体又は修飾ＢＱ−７８８化合物もまた本発明の範囲内に包含される。
【００５０】
さらに、本発明のペプチド及び組成物と組み合わせた、国際公開第９９／６１０６５号パンフレット及び国際公開第０３／０８４９９９号パンフレットに記載の抗原提示細胞（共）刺激分子の使用が好ましい。特に、４−１−ＢＢ及び／又はＣＤ４０リガンド、アゴニスト抗体、ＯＸ４０リガンド又はその機能的断片及び誘導体、加えて同様のアゴニスト活性を有する合成化合物の使用が、対象の最適な免疫応答の開始をさらに刺激するために、治療を受ける対象に別々に、又は本発明のペプチドと併用して投与されることが好ましい。
【００５１】
加えて、好ましい実施形態は、ＴＬＲリガンド及び／又は抗ＣＤ４０／抗４−１ＢＢ抗体などのさらなる免疫刺激剤の存在下又は非存在下での、鉱油（例えば、Montanide ISA 51）又はＰＬＧＡなどの徐放性媒体における、ペプチドの送達を含む。代替として、本発明のペプチドは、免疫刺激剤（アジュバント）の存在下又は非存在下で真皮内へ、例えば注射によって送達してもよい。真皮内送達には、本発明のペプチドは、ペプチド及び１又は複数の免疫学的に不活性で薬学的に許容される担体、例えば、生理学的イオン強度及び／又は浸透圧の緩衝水溶液（例えば、ＰＢＳなど）からなる組成物において投与されることが好ましい。
【００５２】
真皮内投与
好ましい実施形態において、全て本明細書で定義されている本発明において使用されるペプチド又はペプチドを含む組成物又は薬物は、真皮内投与又は適用に適するように処方される。真皮内とは、当業者に既知である。本発明の文脈において、真皮内は皮内と同義であり、皮下とは異なる。物質の最も表面的な適用は、上皮（皮膚上）であり、次いで真皮内適用（皮膚内又は皮膚中へ）、次いで皮下適用（皮膚のすぐ下の組織内）、次いで筋肉内適用（筋肉本体中へ）となる。真皮内適用は通常、注射により投与される。物質の真皮内注射は通常、物質に対して起こり得る反応、アレルギー及び／又は細胞性免疫を試験するために行われる。皮下適用もまた通常、注射により投与され、例えば、皮膚の下の組織内に針を注射する。
【００５３】
別のさらに好ましい実施形態において、本発明において使用される薬物は、Montanide ISA-51などのいかなるアジュバントも含まず、これは薬物の処方がより単純であることを意味し、例えば、使用される薬物中に油−水型エマルジョンが存在しないことが好ましい。したがって、本発明において使用される薬物は、Montanide ISA-51などアジュバントを含まない、及び／又は水中油型エマルジョンを含まない。したがって、好ましい実施形態において、本発明において使用される薬物は、例えば、本明細書において先に定義した１又は複数のペプチドを含む又はからなるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Phosphate Buffer Saline）などの生理学的イオン強度及び／又は浸透圧の緩衝水溶液である。当業者であれば、そのような溶液の調製方法を知っている。
【００５４】
本発明において使用される薬物は、本明細書において先に定義されたペプチド少量の真皮内投与によって、さらに免疫原性効果を達成できるという別の利点を有する。使用する各ペプチドの量は、好ましくは１〜１０００μｇ、より好ましくは５〜５００μｇ、さらにより好ましくは１０〜１００μｇの範囲である。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、薬物は、本明細書において先に定義されたペプチド及び少なくとも１つのアジュバントを含み、前記アジュバントは水中油エマルジョンに処方されず、且つ／又は本明細書において先に定義された水中油エマルジョンタイプのものではない。このタイプの薬物は、単回投与として投与することができる。代替として、本明細書において先に定義されたペプチド及び／又はアジュバントの投与を、必要に応じて繰り返してもよく、且つ／又は異なるペプチド及び／又は異なるアジュバントを順次に投与してもよい。本発明のペプチドは真皮内投与されるが、本明細書において定義されたアジュバントは順次に投与されることが、本発明によりさらに包含される。アジュバントは真皮内投与されてもよい。しかしながら、任意の別の投与方法をアジュバントに使用してもよい。
【００５６】
ワクチン注射は疾患の部位で又は可能な限り近くで実現され、罹患流入領域リンパ節の局所的活性化をもたらし、免疫系のより強い局所的活性化をもたらすので、ペプチドの真皮内投与は非常に魅力的である。特にＶＩＮ、ＶＡＩＮ、ＡＩＮ、ＰＩＮ、陰茎癌、外陰癌、肛門癌、頭頸部癌に関してはそうである。
【００５７】
好ましい実施形態において、真皮内投与は病変又は疾患の部位で直接実施される。本明細書において、病変部位で、とは病変部位から５、２、１、０．５、０．２又は０．１ｃｍ未満の範囲内であると理解される。
【００５８】
本明細書において先に定義された薬物を真皮内投与すると、Ｔｈ２応答だけでなくＴｈ１応答もまた誘発される。遺伝子銃を介した皮膚抗原初回刺激が選択的Ｔｈ２免疫応答を引き起こすことが既に分かっているので、これは驚くべきことである（Alvarez D. et al, 2005）。さらに、観察された免疫応答は、（Alvarez D. et al, 2005）に基づいて予想できたように皮膚に制限されるだけではない。本発明者らは、ＩＦＮγを分泌する特異的Ｔ細胞が、曝露後の末梢血において検出されるように、２次リンパ系を循環することを示す。
【００５９】
本発明の薬物の別の非常に重要な利点は、比較的少量のペプチドを、１回だけの注射で、単純な処方で、Montanide ISA-51などの望ましくない副作用をもたらすことが知られているいかなるアジュバントも用いずに使用できることである。いかなる理論にも拘束されるわけではないが、本発明者らは、本発明において使用されるＨＰＶ真皮内ペプチド（１又は複数）は、上皮に存在する表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ，Langerhans cell）を特異的に直接標的とすると考える。ランゲルハンス細胞は、一次免疫応答を開始する顕著な能力を示すＤＣの特定のサブタイプである（Romani N. et al 1992）。こうしたＬＣは、本発明において使用される薬物によって回復する天然のアジュバントとみなすことができる。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬物の製造のためのＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質由来のペプチドの使用であって、薬物が先に定義された真皮内投与用であり、加えてＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬物の製造のためにＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質由来のペプチドがさらに使用され、薬物が皮下投与用である、使用に関する。
【００６１】
真皮内投与用薬物は、本明細書において既に定義されている。皮下投与用に使用されるペプチドは、真皮内投与用に使用されるものと同じであり、本明細書において既に定義されている。当業者であれば、皮下投与に適する薬物の処方方法を知っている。皮下投与に適する薬物は、アジュバントと組み合わせて、本明細書において既に定義されたペプチドを含むことが好ましい。好ましいアジュバントは、本明細書において既に記載されている。別の好ましいアジュバントは、Freundの不完全アジュバント（ＩＦＡ，incomplete Freund's adjuvant）、Montanide ISA-51又はMontanide ISA 720 (フランスのSeppic社製)などの水中油エマルジョンのものである。さらに好ましい実施形態において、皮下投与に適する薬物は、どちらも本明細書において先に定義された１又は複数のペプチド、アジュバント、及び全て本明細書において先に定義された不活性な薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む。薬物の処方、及び薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において既知及び通例であり、例えばRemington; The Science and Practice of Pharmacy, 21^nd Edition 2005, University of Sciences in Philadelphiaに記載されている。本発明において使用される第２の薬物は、皮下投与に適するように処方される。
【００６２】
好ましい本実施形態において、真皮内投与用に適する薬物は、皮下投与に適する薬物と同時に投与することができる。代替として、両薬物を順次真皮内、続いて皮下投与することもでき、又は逆もまた同様である（まず皮下投与その後に続いて真皮内投与）。好ましい本実施形態において、真皮内投与のために記載された先の好ましい実施形態のように、本明細書において先に定義されたペプチド及び／又はアジュバントの真皮内及び／又は皮下投与を、必要に応じて繰り返してもよく、且つ／又は異なるペプチド及び／又は異なるアジュバントの投与を順次に真皮内及び／又は皮下投与してもよい。本発明のペプチドを真皮内及び／又は皮下投与し、その一方で本明細書において定義されたアジュバントを順次に投与することが、本発明によりさらに包含される。アジュバントは、真皮内及び／又は皮下投与することができる。しかしながら、任意の別の投与方法をアジュバントに使用することができる。
【００６３】
本発明者らは、本発明による薬物の真皮内及び皮下投与の組合せが有利であると推測する。表皮のＤＣは明らかに真皮及び皮下組織のＤＣと異なる。皮内（真皮内）免疫化は、抗原プロセシング、及び樹状ネットワークを通ってケラチン生成細胞と密接に接触する表皮ＤＣ（Langerin陽性ランゲルハンス細胞）の活性化を引き起こすであろう。これはまた、ランゲルハンス細胞及びケラチン生成細胞間の相互作用において炎症経路を最適に活性化し、その後続いて抗原を負荷し活性化したランゲルハンス細胞を皮膚流入領域リンパ節へ輸送する。
【００６４】
皮下投与は、別のＤＣサブセットを活性化し、これもまた抗原を負荷され、皮膚流入領域リンパ節まで独立して移動するであろう。おそらく、真皮内及び皮下の両方に投与できる薬物の使用は、異なるＤＣサブセットによるこうした流入節におけるＴ細胞の相乗的刺激をもたらすことができる。
【００６５】
別の態様において、本発明は、本明細書において上記で定義されたペプチド及び／又はエピトープをコードする核酸に関する。前記核酸は、野生型完全長ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質はコードしないが、本発明のペプチド及び／又はエピトープ自体、又は野生型ＨＰＶ Ｅ６若しくはＥ７タンパク質と隣接していないアミノ酸配列に隣接する本発明のペプチド及び／又はエピトープをコードすることが好ましい。そのような隣接するアミノ酸は、野生型ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質以外のタンパク質由来であってもよく、及び／又はそのアミノ酸が隣接するペプチド／エピトープと隣接していない野生型ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質内の別の場所由来であってもよい。好ましい実施形態において、前記核酸は、数珠状に配置した２つ以上の本発明のペプチド及び／又はエピトープをコードし、それによって本発明のペプチド及び／又はエピトープ（数珠）は直接的に結合するか、並びに／又は野生型ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質以外のタンパク質由来であるか、及び／若しくはそのタンパク質が隣接するペプチド／エピトープと隣接していない野生型ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７タンパク質内の別の場所由来であるリンカー配列を介して結合する。ペプチド／エピトープに隣接又は結合しているアミノ酸配列は、タンパク質分解切断部位を含んでもよい。そのような核酸は、本発明のペプチド／エピトープを種々の方法で送達するために適用できる。そのような核酸は、例えば、そこからそのような核酸を精製できる、適した宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli））における組換えタンパク質の生産に使用できる。代替として、核酸は発現調節配列（プロモーターなど）に作動可能に結合させても、ヒト細胞用の発現構築体に組み込んでもよい。そのような（自己）細胞は、エクスビボでトランスフェクト又は形質導入してそれを必要とする対象に（再）投与してもよい。代替として、発現構築体は適した遺伝子治療ベクターに組み込んでもよい。ウイルスベクター（欠損型ウイルスに基づく）は、非ウイルス性の作用物質と比較してより効率的な遺伝子導入の作用物質である。適したウイルス発現構築体は、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、レトロウイルス又は改変ワクシニアAnkara（ＭＶＡ，modified vaccinia Ankara）に基づくベクターを含む。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ，T cell receptor）分子を、本明細書に記載される本発明のＨＰＶエピトープと相互作用できるＴ細胞から単離する手段を提供する。本発明によるＴＣＲは、好ましくは生細胞においてインビトロ又はインビボでＨＬＡ分子に関連し且つ／又は提示される場合、ペプチドを含むＨＰＶエピトープと相互作用できることが好ましい。Ｔ細胞受容体及び特に本発明によるＴＣＲをコードする核酸は、例えば、そのようなＴＣＲを、そうでなければ本明細書に記載される本発明のＨＰＶエピトープに対するＴ細胞免疫を引き起こすことのできない患者のＴ細胞に導入するために適用できる。このＴＣＲクローニング法によって、Ｔ細胞クローンを用いた治療を受けるレシピエントと本質的に同遺伝子型であり、すなわち、ＴＣＲ発現Ｔ細胞クローンがＨＰＶ関連疾患に罹患している患者の自己由来であるＴ細胞クローンを提供できる。したがって本方法は、それを必要とする対象においてＨＰＶエピトープを発現する腫瘍及び／又はＨＰＶ感染細胞に対して作製でき、特異的に標的とすることができる、本発明によるＨＰＶエピトープを認識できるＴ細胞クローンを提供する。好ましい実施形態において、対象のＴ細胞は、本明細書に記載の本発明のＨＰＶエピトープを認識するＴＣＲを用いて単離及び形質導入される。選択及び増殖に次いで、当業者に既知であるが、ＨＰＶ誘導性腫瘍細胞又はＨＰＶ感染細胞を認識可能な、その時ＴＣＲを発現しているこれらの自己Ｔ細胞を、これらのＴ細胞が腫瘍及びＨＰＶ感染細胞を特異的に標的とする場合、患者に再導入することができる。したがって本発明は、好ましくはＨＬＡ分子に関連して、本明細書において定義されたＨＰＶエピトープと相互作用できるＴ細胞受容体をコード及び発現するＴリンパ球を提供する。前記Ｔリンパ球は組換え又は自然により選択されたＴリンパ球であってよい。本発明のＴリンパ球はまた、本発明の方法用に、及び本発明の医薬組成物において使用してもよい。したがって、本明細書は、免疫応答の誘発を促す条件下で未分化のリンパ球を本発明のＨＰＶエピトープ（又はこのエピトープを含むペプチド）と接触させるステップであって、本発明によるペプチドを使用してインビトロ又はインビボで、例えば移植を受ける患者において行ってもよいステップを含む、本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球を産生するための少なくとも２つの方法を提供する。代替として、以前の方法により得られた細胞から得られる、又はエピトープに対する免疫応答を示す対象から得られる、本発明のＨＰＶエピトープとの相互作用に特異的なＴＣＲをコードする遺伝子を、宿主細胞及び／又は宿主リンパ球、好ましくは自己リンパ球にクローニングすることによって、インビトロで実施してもよく、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ，cytotoxic T lymphocyte）に分化してもよい。本実施形態の方法の詳細は、例えば、De Witte et al. 2006及びSchumacher et al. 2002に記載されている。
【００６７】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のペプチド及び／又はエピトープをコードする核酸、本発明のエピトープを認識するＴ細胞受容体、このようなＴ細胞受容体をコードする核酸、このような核酸を発現するＴ細胞（クローン）の薬物としての使用に関連する。薬物は、ＨＰＶ関連疾患の治療及び／又は予防において使用されることが好ましい。本発明によるこのような薬物は、以下の非網羅的なリスト、子宮頸部（ＣＩＮ）、外陰部（ＶＩＮ）、膣（ＶａＩＮ）、肛門（ＡＩＮ）、及び陰茎（ＰＩＮ）の頸部上皮内腫瘍形成、並びに子宮頸部、外陰部、膣、肛門、陰茎及び頭頸部の癌、に罹患している又は発症するリスクのある患者を治療するために使用してもよい。
【００６８】
本文書において及びその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞及びその活用は、その単語に続く項目が含まれるが、特に記載されていない項目も除外されないことを意味する非限定的な意味において使用される。加えて、「なること（to consist）」という動詞は、本明細書において定義されているペプチド又は組成物が具体的に特定されたもの以外のさらなる構成要素（１又は複数）を含んでもよいことを意味する「から本質的になること」によって置き換えることができ、前記さらなる構成要素（１又は複数）は本発明の特有の特徴を変化させない。加えて、単数表記による要素の言及は、文脈上明らかに１つ及び１つだけの要素があると解すべき場合を除き、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、単数は通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００６９】
本明細書において引用された全ての参考特許及び参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。以下の実施例は例示のみを目的として示され、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】４名の異なる患者の頸部組織から単離した初期Ｔ細胞培養の増殖を示す図である。３日間の増殖アッセイにおいて、ＨＰＶ１６又は１８、Ｅ６又はＥ７ペプチドプール及び組換えタンパク質を用いて刺激すると、全てのＴ細胞培養物が自然にプロセシングされた抗原を認識した。Ｃ２６５はＨＰＶ１６ Ｅ６ペプチドプール１〜９２を、Ｃ３３４はＨＰＶ１６ Ｅ６ペプチドプール７１〜１５８を、Ｃ２８４はＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプール１〜９８を、及びＣ２２８はＨＰＶ１８Ｅ７ペプチドプール１〜１０６を認識した。
【図１Ｂ】単一ペプチドを使用したバルク培養の特異性の精細マッピングを、増殖及びＩＦＮγ産生によって測定した図である。Ｃ２６５はペプチドＨＰＶ１６ Ｅ６ ３７〜６８を、Ｃ３３４はペプチドＨＰＶ１６ Ｅ６ １３７〜１５８を、Ｃ２８４はペプチドＨＰＶ１６ Ｅ７ ７１〜９２を及びＣ２２８はペプチドＨＰＶ１８Ｅ７ ２１〜４２を用いた刺激に応答した。
【図２】細胞内サイトカインＩＦＮγ染色により測定した、ＨＰＶ抗原に応答するＴ細胞のタイプの分析を示す図である。陽性ペプチド及びタンパク質として、Ｃ２６５に関してペプチドＨＰＶ１６ Ｅ６ ４１〜６２及びＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を、Ｃ３３４に関してＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質及びペプチド１３７〜１５８を、Ｃ２８４に関してＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質及びペプチド７１〜９２を、並びにＣ２２８に関してＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質及びペプチド２１〜４２を使用した。ＨＰＶの相当物のペプチド及びタンパク質を、陰性対照として使用した。Ｃ２６５のＴＩＬ培養が、ともにＨＰＶ１６ Ｅ６ ４１〜６２ペプチドに応答したＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を示した。
【図３Ａ】３日間の増殖アッセイにおける、ＨＬＡクラスII抗体によるＣＤ４拘束性応答の遮断を示す図である。Ｃ２６５由来Ｔ細胞はペプチド負荷自己Ｂ−ＬＣＬにより刺激され、Ｃ２８４由来Ｔ細胞はＨＬＡ−ＤＲ１２にのみ適合したペプチド負荷単球により刺激され、Ｃ２２８由来Ｔ細胞はＨＬＡがＤＱ^＊０３０２に適合したペプチド負荷単球により刺激された。
【図３Ｂ】ＴＩＬ培養の精細マッピング及びＨＬＡ拘束性を示す図である。患者Ｃ２６５のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、認識される長い方のペプチドのアミノ酸配列をカバーする、１０ｍｅｒのペプチドでパルス標識した自己Ｂ−ＬＣＬにより刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより試験した。これらのＣＤ４^＋Ｔ細胞の拘束性を決定するために、ＨＬＡ−ＤＰ２のみに適合した単球によりこれらを刺激した。同様に、Ｃ３３４のＣＤ８Ｔ細胞に認識される最小のペプチド−エピトープを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、指定の１０ｍｅｒのペプチドと一緒にこれらのＴ細胞をインキュベートすることによって決定した。Ｃ３３４ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答のＨＬＡ拘束性は、患者のＨＬＡクラスＩ分子と部分的に適合した健常個体から単離したＰＢＭＣをパルス標識されたペプチドを使用して決定した。
【図４Ａ】Ｃ４２７の腫瘍流入領域リンパ節に存在するＴ細胞反応性の分析を示す図である。３日間の増殖アッセイにおいて測定された、自己Ｂ−ＬＣＬをパルス標識されたＨＰＶ１６ Ｅ６ペプチドにより刺激して３週間後のＴ細胞培養の反応性。
【図４Ｂ】Ｃ４２７の腫瘍流入領域リンパ節に存在するＴ細胞反応性の分析を示す図である。上パネル：単一の２２ｍｅｒのペプチドでパルス標識された自己Ｂ−ＬＣＬにより刺激したときのＴ細胞培養の認識パターン。下パネル：初期ＬＮＭＣ培養由来のＴ細胞クローンに認識された最小エピトープのグラフ。ＣＤ４Ｔ細胞クローンＣ４２７．４７を３日間の増殖アッセイにおいて刺激及び試験した（左パネル）。ＣＤ８Ｔ細胞クローンＣ４２７．７８をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験した（右パネル）。
【図４Ｃ】Ｃ４２７の腫瘍流入領域リンパ節に存在するＴ細胞反応性の分析を示す図である。細胞内サイトカイン染色により、応答するＴ細胞のタイプを決定した。ＨＰＶ１６ Ｅ６ペプチド１１〜３２（上パネル）及びペプチド１３７〜１５８（下パネル）を、陽性ペプチドとして使用した。ＨＰＶ１８Ｅ７ペプチド及びタンパク質を、陰性対照として使用した。
【図４Ｄ】Ｃ４２７の腫瘍流入領域リンパ節に存在するＴ細胞反応性の分析を示す図である。クラスIIに部分的に適合するＢ−ＬＣＬ（Ｃ４２７．４７、上パネル）の及びＨＬＡクラスＩに部分的に適合するＢ−ＬＣＬ（Ｃ４２７．７８、下パネル）のＨＬＡクラスII遮断抗体を使用して、拘束エレメントを分析し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答がＨＬＡ−ＤＰ１４により、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ｂ１４により拘束されることを示した。
【図５】１９名の健常なドナー（ＨＤ，healthy donor）群において陽性皮膚反応を誘導した数、出現日、及び注射した抗原の概要を示す図である。皮膚反応は、直径２ｍｍを超える丘疹が注射２日後以降に生じた場合に陽性とみなした。図に示すレイアウトは、８つのペプチドプールに関して使用しており、使用したペプチドプールのタンパク質中の最初及び最後のアミノ酸を示す。太枠で印刷されているレイアウトは、この時間枠内の少なくとも１つの陽性反応を示し、黒塗りの四角は、示されるペプチドプールに対して新たに発生した陽性皮膚反応を表す。
【図６】健常なドナーの事前曝露血液試料におけるＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔによるＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の検出は、認識されたペプチドプール（ｐ＝０．０００３、両側のフィッシャーの正確確立検定）に対する初期（１３日未満）陽性皮膚反応の出現と顕著に相関していることを示す図である。特異的応答を、実験ウェル中の平均スポット数から平均スポット数に培地対照の２×ＳＤを加算したものを引くことによって計算した。１００．０００ＰＢＭＣ当たりの特異的スポット数を示す。応答は、ペプチドプール特異的Ｔ細胞の頻度が１００．０００ＰＢＭＣにおいて５以上である場合に陽性とみなした。
【図７】陽性皮膚反応の出現と健常なドナーの曝露後血液試料における血中ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の同時検出（ＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔ）（ｐ＜０．０００１、両側のフィッシャーの正確確立検定）との関連性を示す図である。合計８８個の皮膚試験のうち、３９個が陽性であった。これらの３９個の反応のうち２５個が、ＥＬＩｓｐｏｔにおける陽性反応と関連していた（１００．０００ＰＢＭＣにおけるＴ細胞の頻度が５以上）。皮膚反応を示さなかった４９個の皮膚試験部位のうち、１０個が陽性ＥＬＩｓｐｏｔと関連していた。
【図８】図８Ａは、陽性皮膚反応を示す健常なドナーの曝露後血液試料におけるＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより検出されたＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞応答を示す図である。１００．０００ＰＢＭＣ当たりの平均スポット数を示す。記憶応答ミックス（ＭＲＭ，Memory response mix）を、陽性対照として使用した。黒塗りのバーは、パンチ生検を採取し培養に入れた陽性皮膚反応部位を示す。 図８Ｂは、パンチ生検外に浸潤したＴリンパ球を、１４〜２８日間のサイトカインによる増殖後、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）（皮膚試験において注射した場合）又はタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をパルス標識した単球による刺激に対して、増殖する能力を試験した結果を示す図である。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，Phytohemagglutinine）が陽性対照の役割を果たした。［^３Ｈ］チミジン取り込みによって増殖を測定し、増殖応答を、刺激指数（ＳＩ，stimulation index）が３以上と定義した。健常なドナー１７（ＨＤ１７）は、非特異的Ｔ細胞からなる陽性皮膚反応部位の一例である。 図８Ｃは、Ｂの増殖応答の上清を、サイトメトリックビーズアレイにより、ＩＦＮγ、インターロイキン４（ＩＬ４）、ＩＬ５及び腫瘍壊死因子α、ＩＬ２、ＩＬ１０（図示せず）の存在について分析した結果を示す図である。カットオフ値は、異なるサイトカイン（ＩＦＮγ１００ｐｇ／ｍｌ、残りのサイトカインについては２０ｐｇ／ｍｌ）の標準曲線に基づいたものである。抗原特異的サイトカイン産生は、サイトカイン濃度がカットオフレベルより高く、培地対照濃度の２倍より大きいと定義した。健常なドナー１５（ＨＤ１５）は、ＩＬ５の高いバックグラウンドレベルを示すが、抗原刺激後２×を超えるまで増加する。
【図９】健常なドナー１５（ＨＤ１５）のプール４（Ｅ６_{４１〜６５}、Ｅ６_{５５〜８０}、Ｅ６_{７１〜９５}）の皮膚生検のＴ細胞培養物が、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方からなることを示す図である。培養の特異性は、注射皮膚試験に対応するタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）及びペプチド（１０μｇ／ｍｌ）に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ，intracellular cytokine staining）において試験した。注目すべきことに、４個のうち３個の生検においてＣＤ８＋ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出された。
【００７１】
［実施例］
【実施例１】
【００７２】
新規なＨＰＶエピトープの同定及び特徴付け
１．方法
１．１ 対象
the Leiden University Medical Centre and Leyenburg Hospital the Hagueの婦人科において組織学的に証明された子宮頸部腫瘍を示す女性を、インフォームドコンセントを与えた後にＨＰＶ１６陽性子宮頸部病変に対する細胞性免疫を調べるＣＩＲＣＬＥ試験に登録した。試験設計は両方の病院の医療倫理委員会（Medical Ethical Committees）によって承認された。外科的切除組織試料から単離したＤＮＡにＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８特異的プライマーを使用して、ＨＰＶ状態に関して対象を試験した（Claas et al. 1989）。ＨＬＡ拘束分析用の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インフォームドコンセント後にＨＬＡタイプの匿名の健常な血液ドナーから得た。
【００７３】
１．２ 抗原
ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７タンパク質の両方にまたがる一組の重複するペプチドを、Ｔ細胞刺激アッセイに使用した。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７は２２ｍｅｒの重複する１２残基からなっていた。初期に記載されたのと同様にペプチドを合成し溶解させた（van der Burg et al. 2001、Welters et al. 2006）。組換え体ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質は、初期に記載されたのと同様に組換え体大腸菌において生成した（van der Burg et al. 2001）。さらに、ＨＰＶ１６ Ｅ６とＥ７の両方の一組の重複する１０ｍｅｒ（重複する９アミノ酸）を生成して、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞によって認識される最小ペプチドエピトープの位置を正確に示した。
【００７４】
１．３ 抗原提示細胞
患者のエプスタインバールウイルス形質転換Ｂ細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）を、１０％のＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中に維持した。単球は初期に記載されたのと同様に末梢血リンパ球から作製した（de Jong et al. 2002）。
【００７５】
１．４ Ｔ細胞の単離及び培養
子宮頸部腫瘍生検を広汎子宮全摘術後に得て、子宮頸部腫瘍組織は生検後にＣＩＮIII患者から得た。新たな頸部組織を約１ｍｍ^３の切片に刻み、１０％のヒトＡＢ血清（Sigma社製、St.Louis MO、USA）、１０％のＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ，T cell growth Factor、Zeptometrix社製、Buffalo NY、USA）及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Peprotech社製、Rocky Hill NJ、USA）を補充したＩＭＤＭ（BioWhittaker社製、Verviers、ベルギー）中で培養した。第１日中、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Peprotech社製）を培養物に加えてＴ細胞増殖を確実にした。２〜３週間後、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＩＬ）培養物の特異性を試験し、照射した自己Ｂ−ＬＣＬと５μｇ／ｍｌの同種ペプチドの混合物を使用して陽性培養物を増殖した。
【００７６】
リンパ節は骨盤領域に由来しており、転移性癌を示す腫瘍細胞を含有していた。リンパ節は切片に切断し、コラゲナーゼ（２００ＩＵ／ｍｌ、Sigma社製）及びＤＮＡｓｅ（５０μｇ／ｍｌ、Sigma社製）の存在下において３７℃で１時間インキュベートし、その後リンパ節単核細胞を細胞濾過器（BD社製、Erebodemgem、ベルギー）に通して、単細胞懸濁液を得た。別のＬＭＮＣ培養物はＨＰＶ１６又は１８のＥ６又はＥ７ペプチドプールで刺激し、２〜３週間培養した。
【００７７】
Ｔ細胞クローンはEvans et al.（Evans et al. 2001）出典のプロトコルに従った限界希釈法を使用して単離し、ＩＬ−２を１０％のＴＣＧＦ及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５に交換し、且つＴ細胞受容体誘発用に０．５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチン（ＰＨＡ、Murex Diagnostics社製、Dartford、UK）を加えた。限界希釈の後、Ｔ細胞クローンをそれらの特異性に関して試験し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ，Fetal Calf Serum、PAA laboratories社製、Pasching、オーストリア）、１０％のＴＣＧＦ及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を含有するＩＭＤＭ中に維持した。培地、３個の異なるドナー由来の照射したＰＢＭＣ、Ｂ−ＬＣＬ及び０．５μｇ／ｍｌのＰＨＡの混合物を使用してＴ細胞クローンを増殖した。
【００７８】
１．５ Ｔ細胞特異性の分析
Ｔ細胞培養物（１ウェル当たり２５，０００〜５０，０００個の細胞）を、３日間の増殖アッセイ中三連でＨＰＶ１６及び１８のＥ６及びＥ７ペプチド（５μｇ／ｍｌ）及びタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）の認識に関して、パルス標識した自己単球又は照射した自己ＥＢＶで試験した。４８時間後、上清を採取し、サイトカイン分析用に−２０℃で保存した。培養の最後の１６時間中に、１ウェル当たり０．５μＣｉの［^３Ｈ］チミジンを加えて増殖を測定した（van der Burg et al. 2001）。抗原特異的ＩＦＮγ産生は初期に記載されたのと同様にＥＬＩＳＡによって測定した（van der Burg et al. 1999）。
【００７９】
ＭＨＣクラスII遮断実験は、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂ８．１１．２）、ＨＬＡ−ＤＱ（ＳＰＶ．Ｌ３）及びＨＬＡ−ＤＰ（Ｂ７／２１）に対するマウスモノクローナル抗体を使用して前に報告されたように実施した（van der Burg et al. 1999）。ペプチドパルス標識ＡＰＣは、Ｔ細胞を加える前に２時間抗ＭＨＣクラスII抗体と共にインキュベートした。
【００８０】
細胞内サイトカイン染色によって測定したＩＦＮγ産生Ｔ細胞の計数は初期に記載されたのと同様に実施した（de Jong et al. 2005）。簡単に言うと、ＡＰＣに同種ペプチド又は組換え体タンパク質を充填し、Ｔ細胞培養物と共にインキュベートした。インキュベーションの１時間後、１０μｇ／ｍｌのBrefeldinA（Sigma社製）を加え、一晩インキュベートした。その後細胞を４％パラホルムアルデヒド（Sigma社製）で固定し、０．１％サポニンで透過処理した。試料は後にＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ及びＩＦＮγ−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８１】
ＣＤ８Ｔ細胞によって認識される最小ペプチドは、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによって分析した（van der Burg et al. 2001、Welters et al. 2006、de Jong et al. 2002）。ＣＤ８Ｔ細胞系は、ＩＦＮγ捕捉抗体（Mabtech社製、Nacha、スウェーデン）でコーティングしたMultiscreen96ウェルプレート（Millipore社製、Etten-Leur、オランダ）に、２×１０４の密度で三連のウェルに接種した。ミクロ培養物は５μｇ／ｍｌの１０ｍｅｒペプチドで刺激し、一晩インキュベートした。ＣＤ８Ｔ細胞のＨＬＡ拘束の分析は、同数のＴ細胞と同時培養した５μｇ／ｍｌの１０ｍｅｒペプチドパルス標識ＰＢＭＣ又はＢ−ＬＣＬを使用して実施した。ＩＦＮγ特異的スポットは製造者（Mabtech社製）の説明書に従い染色した。スポットの数は完全自動化コンピュータ支援ビデオ画像システム（BIOSYS）で分析した。
【００８２】
２．結果
２．１ ＨＰＶ特異的Ｔ細胞は子宮頸部腫瘍浸潤性リンパ球中に存在する
本試験において、本発明者らは、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞がそれらの同種抗原と遭遇しそれらのエフェクター機能を発揮すべき部位である、子宮頸部腫瘍性病変中での、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８特異的Ｔ細胞の存在、タイプ及び特異性を分析した。全体で７４名の患者を分析した。頸部組織は、子宮頸癌を有する６１名の患者から、及びＣＩＮIIIを有する９名の追加的患者から得た。組織の刻んだ切片は、ＩＬ−１５及びＴＣＧＦを含有するサイトカインの混合物の存在下で２〜３週間培養した。腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖の考えられる偏りを妨げるために、外来性ＨＰＶ抗原をこれらの培養物に与えることはなかった。培養の第１４〜２１日以内に、サイトカイン増殖Ｔ細胞を採取し、ＦＡＣＳによって分析した。これらの培養物中に存在するＣＤ３^＋Ｔ細胞の平均率は、第２週の４１％から第３週の６８％まで増大した。一般に、第２週又は第３週（それぞれ３８％±２１％；４８％±２４％）のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（３４％±２２％）とＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（５２％±２２％）の割合によって示されたように、この培養法は１タイプのＴ細胞の選択的増殖に好ましくなかった。個々の培養物は、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞のいずれかのさらに顕著な増殖を示す場合もあった（図示せず）。ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の存在を分析するために、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７タンパク質にまたがる重複するペプチドの異なるプール、及びそれぞれの組換え体タンパク質でパルス標識した自己単球で培養物を刺激した。５１名のＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８陽性患者の１９名中で、本発明者らは増殖によりＨＰＶ特異的Ｔ細胞を検出することができた（表１、図１ａ）。これらの培養物はペプチド及びタンパク質負荷単球の両方に応答し、Ｔ細胞が自然にプロセシングされた抗原を認識したことを示した。８個の培養物においてＥ６特異的Ｔ細胞を検出し、１０個の培養物においてＴ細胞はＥ７に応答し、１個のＴ細胞培養物においてＥ６とＥ７の両方に対する応答を検出した。重要なことに、ＨＰＶ１６及び１８陰性頸部組織（ｎ＝１９）中ではＨＰＶ１６又は１８特異的Ｔ細胞応答は検出せず、これにより観察したＨＰＶ１６及び１８特異的応答はインビトロで誘導されなかったことが示された（表１）。
【表１】



【００８３】
２．２ ＨＰＶ特異的ＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞の両方が腫瘍組織に浸潤する
ＨＰＶ特異的反応性の評価後、１９の応答Ｔ細胞系を同種ペプチド、サイトカイン混合物及びフィーダー細胞での刺激によって増殖した。これらのＨＰＶ特異的培養物の１５個は、さらなる分析用に十分増殖することができた。ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の優れた特異性を、単一のペプチドを使用して短期の刺激アッセイにおいて決定した。５個の培養物が２個以上の異なるペプチドを認識し、一方他の１０個の培養物は単一のペプチドを認識した（図１ｂ、表１）。抗原刺激に応答したＴ細胞のタイプを評価するために、Ｔ細胞培養物をそれらの同種ペプチド及びタンパク質抗原で刺激し、且つ応答は細胞内ＩＦＮγ染色によって分析した（図２）。大部分のＴＩＬ培養物は、ＨＰＶ特異的ＣＤ４＋浸潤性Ｔリンパ球を含有しており（ｎ＝１３名の患者、１３の異なるペプチドを認識した）、一方ＨＰＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤性リンパ球は６個の培養物中に見られた。ＨＰＶ特異的Ｔ細胞系の９個ではＣＤ４^＋Ｔ細胞応答のみを検出し、４個のＴ細胞系ではＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方が反応し、且つ２個のＴ細胞系ではＣＤ８Ｔ細胞の応答のみを検出した（表１、図２）。
【００８４】
２．３ 腫瘍浸潤性リンパ球のＨＬＡ拘束
ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＰＶペプチドの提示と関連するＨＬＡクラスＩ及びII遺伝子座を、遮断抗体及び健常ドナーから単離した部分的ＨＬＡ適合ＡＰＣを使用して試験した。広く様々なＨＬＡクラスII分子は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の抗原Ｅ６及びＥ７の提示と関連することが分かった（表２）。ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰに対する遮断抗体の使用によって、検出した応答のうち３つはＨＬＡ−ＤＲによって拘束され、３つはＨＬＡ−ＤＱによって拘束され、３つはＨＬＡ−ＤＰによって拘束されたことが明らかになった（図３ａ、表２）。ＨＰＶ抗原の提示と関連する正確なＨＬＡ拘束エレメントを決定するために、ただ１つのＨＬＡ対立遺伝子に適合する健常ドナー由来のＡＰＣを使用した（図３）。６例において本発明者らは、拘束エレメントを正確に決定することができなかった。
【表２】

【００８５】
患者Ｃ２６５の場合、ＨＰＶ特異的ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が同じペプチドに応答した（図２）。これら２つのＴ細胞応答を区別するために、限界希釈法によってＴ細胞クローンを樹立した。残念ながら、ＣＤ４^＋Ｔ細胞クローンのみを得て、したがって、ＨＬＡクラスII拘束エレメントのみを樹立することができた。したがって、他の５個の異なるＨＰＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞培養物中の最小ペプチド及び拘束を決定することのみが可能であった（表２）。一例として、図３は最小ペプチド−エピトープの決定及び患者Ｃ３３４から得たＴＩＬ培養物のＣＤ８Ｔ細胞応答の拘束（図３ｃ）を示す。この応答はＨＬＡ−Ｂ２７によって拘束されたが、それは、このＣＤ８Ｔ細胞培養物は、ＨＬＡ−Ｂ２７適合ペプチド負荷ＡＰＣを用いた刺激にのみ応答し、他のドナー由来の他の部分的ＨＬＡクラスＩ適合ＡＰＣを用いた刺激には応答しなかったからである（図３ｃ）。１名の患者（Ｃ２６５）は２つの異なるエピトープに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を示し、２名の患者（Ｃ１７６及びＣ３３４）は同じＨＬＡ−Ｂ２７ＣＴＬエピトープに応答した（表２）。
【００８６】
２．４ 腫瘍流入領域リンパ節中のＨＰＶ特異的Ｔ細胞
腫瘍流入領域リンパ節はＨＰＶ特異的Ｔ細胞が初回抗原刺激及び活性化される部位であり、したがって、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞応答も、６名の異なる子宮頸癌患者由来の腫瘍流入領域リンパ節において試験した。リンパ節単核細胞（ＬＮＭＣ，lymph node mononuclear cell）の単細胞懸濁液は、そのリンパ節の転移を示す子宮頸癌患者から単離した。本発明者らは、新たに単離したＬＮＭＣにおけるＨＰＶ特異的エクスビボ応答を直接検出することはできなかった（データ示さず）。したがって、ＬＭＮＣはＨＰＶ１６又は１８のＥ６及びＥ７ペプチドプールを用いた１ラウンドのインビトロ刺激によって最初に増殖した。４例においてＬＮＭＣはＨＰＶ１６に応答し、１名の患者では、ＨＰＶ１８応答は増殖及びＩＦＮγ産生によって検出した（表１、図４Ａ）。ＴＩＬ培養物と同様に、ＨＰＶ１６陽性腫瘍を有する患者はＨＰＶ１６にのみ反応し、一方ＨＰＶ１８陽性子宮頸癌と診断された患者はＨＰＶ１８に対してのみ反応した。ＬＮＭＣをインビトロでＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８ペプチドを用いて刺激したという事実にもかかわらず（表１）、ＨＰＶ１６／１８陰性患者由来のＬＭＮＣにおいてＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のいずれに対する応答も検出しなかった。これらのＬＮＭＣ培養物から単離したＴ細胞クローンは、それらの優れた特異性及びＨＬＡ拘束エレメントに関して特徴付けした。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の反応性は１０個の異なるペプチドに見られ、そのうちの７個はＴＩＬ培養物中では検出しなかった。これらのエピトープの３個はＨＬＡ−ＤＱによって拘束され、且つ他の４個はＨＬＡ−ＤＰによって拘束された。さらに、１個のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１拘束及び１個のＨＬＡ−Ｂ１４拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定した（表２）。図４はＬＮＭＣ培養物の分析の一例を示す。１ラウンドの刺激後、ＬＮＭＣ培養物はＨＰＶ１６ Ｅ６ペプチド又は組換え体タンパク質のプールを負荷したＡＰＣに特異的に応答した（図４Ａ）。単一のペプチドに対する反応性の分析は広範囲のレパートリーのペプチドの認識を示し（図４Ｂ）、この培養物から単離したＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞クローンは、組換え体タンパク質から自然にプロセシングされたときそれらの同種抗原を認識した（図４Ｃ）。ＨＬＡクラスII遮断抗体及び部分的適合ドナー由来のＡＰＣを使用して拘束をさらに決定した（図４Ｄ）。
【００８７】
総合すると、ＴＩＬと腫瘍流入領域リンパ節細胞の両方の分析により、５４名の異なるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８陽性患者の２３名において、合計２５個の異なるＥ６又はＥ７由来ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答を検出することができることが明らかになった。特に、１３個のＣＤ４＋Ｔ細胞ペプチド−エピトープはＨＬＡ−ＤＱ又はＨＬＡ−ＤＰによって拘束され、３個はＨＬＡ−ＤＲによって拘束され、且つ６例において、本発明者らはＨＬＡ−ＤＱ／ＤＰとＨＬＡ−ＤＲを区別することができなかった（表２）。発見したＣＤ８^＋Ｔ細胞応答のうち、２個はＨＬＡ−Ａによって拘束され、４個はＨＬＡ−Ｂによって拘束され、且つ２個は決定不能であった（表２）。
【００８８】
３．考察
ＨＰＶ１６コードオンコプロテインＥ６及びＥ７は、動物モデル中で腫瘍拒絶抗原として機能することができ（Zwaveling et al. 2002、Peng et al. 2005）、それらは子宮頸癌における腫瘍浸潤性リンパ球の標的抗原として機能することもできることが示唆されるが、これは患者の大規模集団では決して系統的に分析されていない。本発明者らは、子宮頸癌と最も顕著に関連するＨＰＶ型であるＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に対して、反応性がある多数のＴＩＬ及びＣＩＮ浸潤性リンパ球（ＣＩＬ，CIL-infiltrating lymphocyte）培養物を樹立することができた（Bosch et al. 1995、Munoz et al 2003）。使用したサイトカイン混合物は、いずれかのタイプのＴ細胞の増殖に関する明らかな優先傾向なしでＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞の両方の増殖を確実にした。本発明者らの試験の経過中、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８以外のＨＰＶ型に陽性の腫瘍と診断された患者から１９のＴＩＬ培養物を樹立した。これらの培養物はいずれも、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７抗原を用いた刺激に反応しなかった。特に、ＨＰＶ１６陽性患者由来のＴＩＬ及びＣＩＬはＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７に応答せず、逆も然りであった（表１）。したがって、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８陽性患者のＴＩＬ及びＣＩＬにおいて観察したＨＰＶ特異的Ｔ細胞応答は、インビトロで誘導されたＴ細胞応答の結果ではなく、インビボでの抗腫瘍反応を反映するものである。近年本発明者らは、卵巣癌を有する患者の小コホート由来のＴＩＬ培養物の増殖においても、このプロトコルは成功したことを示した（Lambeck et al. 2007）。
【００８９】
同様の数のＴＩＬ培養物がＥ６及びＥ７に応答した（表１）。同種ペプチド−エピトープ及びＨＰＶ特異的免疫応答のＨＬＡ拘束エレメントの同定は、ＨＰＶ特異的免疫は特定の免疫優勢領域に制限されず、Ｅ６及びＥ７オンコプロテインの全ドメインに向けられたものであったことを明らかにし（表２）、ＨＰＶ Ｅ６特異的Ｔ細胞とＥ７特異的Ｔ細胞の両方が抗腫瘍反応に貢献し得ることが示唆された。特筆すべきことに、本発明者らの分析は、大部分のＨＰＶ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答は、ＨＬＡ−ＤＲによってではなくＨＬＡ−ＤＱ又はＤＰによって拘束されたこと（１３／１６）を明らかにした（表２）。これは予想外であったが、それは、ＨＬＡ−ＤＲは、ＡＰＣの細胞表面（Schwartz et al. 1988）及びデノボＨＬＡクラスII発現がある子宮頸癌細胞（Hilders et al. 1994）上に、最も豊富に存在するＨＬＡクラスII分子であるからである。さらに、他の腫瘍抗原では、同定するＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープの大部分は、ＨＬＡ−ＤＲの状況で提示される（８０／９３；http://www.cancerimmunity.orgのデータベースを参照）。しかしながら、子宮頸癌では、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞のより顕著な役割が存在するようであり、ＨＰＶに対する機能的Ｔ細胞応答を同定するためのコンピュータアルゴリズムを組み込んだ戦略は、ＨＬＡ−ＤＲのみに焦点を当てるべきではないと論じられている（Warrino et al. 2004、Facchinetti et al. 2005）。
【００９０】
７名の患者において、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を検出した。３個の新規のＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１４及びＨＬＡ−Ｂ２７拘束ＣＤ８Ｔ細胞エピトープの同定に加えて、本発明者らはＨＰＶ１６ Ｅ７．１１−２０エピトープを認識するＨＬＡ−Ａ^＊０２０１拘束腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞（Evans et al. 1997、Oerke et al. 2005）の存在を確認したが、ただしペプチド配列１１〜１９に対するさらに強い反応性を観察した。さらに、ＨＬＡ−Ｂ５７拘束エピトープＨＰＶ１６ Ｅ６．５２−６１に反応性があるＣＤ８^＋Ｔ細胞を検出した。健常対象の末梢血中のＨＬＡ−Ｂ５７拘束ＨＰＶ１６ Ｅ６．５２−６１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の検出に基づいて、このＣＴＬエピトープはＨＰＶ１６感染を除去する際に重要な役割を果たす可能性があることが示唆されている（Nakagawa et al 2004、Nakagawa et al 2007）。しかしながら、癌患者中のこのエピトープに応答するＣＴＬの検出はこの可能性を低下させる。
【００９１】
本発明者らの試験は、５４名の異なるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８陽性患者の少なくとも２３名において、Ｅ６及び／又はＥ７に対する特異的Ｔ細胞応答を検出することができることを示す（表１）。これは、既存の免疫応答を有する患者中の有効な抗腫瘍反応を回復するための、これらの抗原に対するＴ細胞応答の誘導を目的とするワクチン接種戦略を容易にする。重要なことに、この試験中にＴ細胞によって認識されるＴ細胞エピトープは、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８陽性腫瘍に対する免疫応答における生理的標的を構成する。このようにそれらは、疾患の異なる段階でのＨＰＶ特異的Ｔ細胞サブセットの重要性及び機能の総合分析、並びに免疫療法のモニタリングに有益であり得る。子宮頸癌患者中に頻繁に存在するＨＰＶ特異的Ｔ細胞は、養子Ｔ細胞移入療法中で使用することができる腫瘍特異的Ｔ細胞の貴重な源を構成する可能性もある。
【実施例２】
【００９２】
ペプチドの真皮内投与
材料及び方法
試験設計
上腕中の臨床用ＨＰＶ１６ペプチドのプールの真皮内注射によって測定したＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７特異的Ｔ細胞応答を分析するための横断的（cross-sectional）パイロット試験を、頸部のＨＰＶ関連障害を有する患者及び健常個体において実施した。遅延型過敏反応は記憶Ｔ細胞応答を示すので、分析時にＨＰＶ１６陽性に関する要件は存在しなかった。
【００９３】
対象
インフォームドコンセントを与えた後に、一群の１９名の健常個体（ＨＤ，healthy individual）がこの試験に参加した。この群の健常個体は３１歳の平均年齢（範囲、２０〜５１歳）を示し、８０％の女性及び２０％の男性で構成されていた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、皮膚試験の投与の直前に全ての対象から得た。健常個体における皮膚試験の陽性の後期出現により、１９名の健常ボランティアの１１名から第２の血液試料を単離した。試験設計はthe Leiden University Medical Centreの医療倫理委員会（Medical Ethical Committees）によって承認された。
【００９４】
ＤＴＨ皮膚試験
遅延型過敏反応（ＤＴＨ，Delayed Type Hypersensitivity）に基づく皮膚試験を、ＨＰＶ特異的細胞性免疫応答のインビボ測定用の高感度及び簡潔な方法として使用することができる（Hopfl, 2000、Hopfl, 1991）。皮膚試験用調製物は、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７タンパク質全体及びＨＰＶ１６ Ｅ２タンパク質の大部分の免疫原性領域にまたがる長鎖の臨床用合成ペプチドの８プールからなっていた（de Jong, 2004）。これらの臨床用ペプチドは、ＬＵＭＣの部門間ＧＭＰ施設において生成された。皮膚試験のそれぞれのプールは、ペプチドによって含まれるタンパク質中の領域の最初と最後のアミノ酸によって示される、２又は３の合成ペプチドからなっていた。プール１：Ｅ２_{３１〜６０}、Ｅ２_{４６〜７５}、プール２：Ｅ２_{３０１〜３３０}、Ｅ２_{３１６〜３４５}、プール３：Ｅ６_１〜３１、Ｅ６_{１９〜５０}、プール４：Ｅ６_{４１〜６５}、Ｅ６_{５５〜８０}、Ｅ６_{７１〜９５}、プール５：Ｅ６_{８５〜１０９}、Ｅ６_{９１〜１２２}、プール６：Ｅ６_{１０９〜１４０}、Ｅ６_{１２７〜１５８}、プール７：Ｅ７_１〜３５、Ｅ７_{２２〜５６}、プール８：Ｅ７_{４３〜７７}、Ｅ７_{６４〜９８}。プール３は配列番号５、２２及び２３を含む。プール４は配列番号７〜９を含む。プール５は配列番号１１及び１２を含む。プール６は配列番号１３、１４、２４及び２５を含む。プール７は配列番号１５及び２６を含む。プール８は配列番号１６及び１７を含む。ペプチドプール１つ当たり、１６％ＤＭＳＯを含む２０ｍＭの等張リン酸緩衝液（１０μｇ／ペプチド）に溶かした０．２ｍｇ／ｍｌペプチドの０．０５ｍｌを皮内注射した。ペプチド及び陰性対照（溶媒のみ）のプールを、上腕の個々の皮膚試験部位に別々に注射した。皮膚試験部位は少なくとも３回、ペプチド（Hopfl）の注射後７２時間及び７日、及び第１健常対象の１名における非常に後期の皮膚反応の最初の報告後３週間で調べた。注射後２日以内に直径２ミリメートルを超える丘疹が生じたとき、反応は陽性であると考えた。陽性皮膚反応部位から、パンチ生検（４ｍｍ）を得て、小片に切断し、１０％のヒトＡＢ血清、１０％のＴＣＧＦ及び５ｎｇ／ｎｌのＩＬ７及びＩＬ１５を含有するＩＭＤＭ中で培養して、皮膚組織からのリンパ球の移出を可能にした。培養の２〜４週間後、増殖したＴ細胞を採取し、それらのＨＰＶ特異的反応性に関して試験した。
【００９５】
インビトロ免疫アッセイ用の抗原
皮膚試験中で使用したペプチドと同様の一組のペプチドを、Ｔ細胞刺激アッセイ及びＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。４個のＨＰＶ１６ Ｅ２ペプチドは３０ｍｅｒペプチドの重複する１５残基からなっており、ＨＰＶ１６ Ｅ６は３２ｍｅｒ、ＨＰＶ１６ Ｅ７は３５ｍｅｒ、いずれも重複する１４残基からなっていた。以前に記載されたのと同様に（van der Burg, 1999）ペプチドを合成及び溶解した。特に、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、ペプチドプール４及び５は皮膚試験中で使用したペプチドプールと若干異なっており、プール４はペプチドＥ６_{３７〜６８}、Ｅ６_{５５〜８６}、Ｅ６_{７３〜１０４}を含有し、且つプール５はペプチドＥ６_{７３〜１０４}、Ｅ６_{９１〜１２２}を含んでいた。
【００９６】
破傷風トキソイド（０，７５リムス・フロクレンティウス種／ｍｌ、National Institute of Public Health and Environment、Bilthoven、オランダ）、超音波処理済みヒト型結核菌（５μｇ／ｍｌ、Dr.P.Klatser、Royal Tropical Institute、Amsterdam、オランダによって気前よく寄付された）、及びカンジダ・アルビカンス種（０．１５ｍｇ／ｍｌ、HAL Allergenen Lab.、Haarlem、オランダ）の混合物からなる記憶応答ミックス（ＭＲＭ５０×）を陽性対照として使用した。以前に記載されたように（van der Burg, 2001）、組換え体ＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質を組換え体大腸菌において生成した。
【００９７】
ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的Ｔｈ細胞の分析
以前に記載されたように（van der Burg, 2001）ＥＬＩＳＰＯＴによってＨＰＶ１６特異的Ｔｈ細胞の存在を分析した。簡単に言えば、新たなＰＢＭＣを、示したＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの有無の下で、１０％ヒトＡＢ血清を補充した１ｍｌのＩＭＤＭ（Bio Whittaker社製、Verviers、ベルギー）中、２４ウェルプレート（Costar社製、Cambridge、MA）の１ウェル当たり２×１０^６個細胞の密度で接種した。ペプチドは５μｇ／ｍｌ／ペプチドの濃度で使用した。３７℃でのインキュベーションの４日後、ＰＢＭＣを採取し、洗浄し、ＩＦＮγ捕捉抗体（Mabtech社製、Nacha、スウェーデン）でコーティングしたMultiscreen96ウェルプレート（Millipore社製、Etten-Leur、オランダ）中、１０％ＦＣＳを補充した１００μｌのＩＭＤＭ中、１ウェル当たり１０^５個細胞の密度で四連のウェルに接種した。ＥＬＩＳＰＯＴのさらなる抗体のインキュベーション及び発色は、製造者の説明書（Mabtech社製）に従い実施した。完全自動化コンピュータ支援ビデオ画像システム（Bio Sys）を用いてスポットを計数した。実験ウェル中の平均スポット数から平均スポット数に培地対照の２×ＳＤを加算したものを引くことによって、特異的スポットを計算した（van der Burg, 2001）。
【００９８】
Ｔ細胞増殖アッセイ
皮膚生検のＴ細胞培養物を、３日間の増殖アッセイ中の特異的ペプチド及びタンパク質の認識に関して試験した（van der Burg, 2001）。簡単に言うと、３７℃でのエクスビボ１５培地（Cambrex社製）中での２時間中の平底９６ウェルプレートへの付着によって、ＰＢＭＣから自己単球を単離した。単球はＡＰＣとして使用し、１０μｇ／ｍｌのペプチド及び２０μｇ／ｍｌのタンパク質を一晩負荷した。皮膚試験用浸潤性リンパ球を、１０％ＡＢ血清を補充したＩＭＤＭ中、１ウェル当たり２〜５×１０^４個細胞の密度で接種した。単独培地は陰性対照として採取し、フィトヘマグルチン（０．５μｇ／ｍｌ）は陽性対照として働いた。増殖は［^３Ｈ］チミジン（５μＣｉ／ｍｍｏｌ）の取り込みによって測定した。増殖応答は刺激指数（ＳＩ）が３以上であったとき特異的であると定義した。増殖アッセイの上清を、抗原特異的サイトカイン産生の分析用にインキュベーション後４８時間で採取した。
【００９９】
ＨＰＶ１６特異的増殖応答と関連するサイトカインの分析
６個の異なるＴｈ１及びＴｈ２サイトカイン、ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン２（ＩＬ２）、ＩＬ４、ＩＬ５及びＩＬ１０の同時検出を、製造者の説明書に従いサイトメトリックビーズアレイ（Becton Dickinson社製）を使用して実施した。カットオフ値は、異なるサイトカインの標準曲線（１００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγ、残りのサイトカインに関して２０ｐｇ／ｍｌ）に基づいた。抗原特異的サイトカイン産生は、カットオフレベルを超え培地対照濃度の２倍より大きいサイトカイン濃度として定義した（de Jong, 2004）。
【０１００】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
陽性皮膚反応部位由来のＴ細胞培養物の特異性及び特徴を、前に報告されたように（de Jong, 2005）ＩＣＳによって試験した。簡単に言えば、皮膚試験用浸潤性リンパ球を採取し、洗浄し、１０％ＡＢ血清を含むＩＭＤＭ中に懸濁し、且つ２〜５×１０^４個細胞を、エクスビボ培地において５０μｌのペプチド（１０μｇ／ｍｌ）又はタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で一晩パルス標識した自己単球に加えた。単独培地は陰性対照として採取し、フィトヘマグルチン（０．５μｇ／ｍｌ）は陽性対照として働いた。試料はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩＦＮγ（０．５ｇ／ｍｌ、BD PharMingen社製）、ＰＥ標識マウス抗ヒトＩＬ５（０．２ｍｇ／ｍｌ、BD PharMingen社製）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４（BD Bioscience社製）及びＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ８（BD Bioscience社製）で同時に染色した。４℃でのインキュベーション後、細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（FACSscan、BD Bioscience社製）によって分析した。
【０１０１】
統計分析
フィッシャーの正確確立検定（両側）を使用して、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ産生ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の検出、皮膚試験反応の存在、又は皮膚生検中のＨＰＶ特異的Ｔ細胞の存在の間の関係、並びにこれらの群内の皮膚反応の大きさ又は数に関する患者と健常対照の間の違いを分析した。統計分析はGraphpad Instatソフトウェア（バージョン３．０）及びGraphpad Prism4を使用して実施した。
【０１０２】
結果
ＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６−及びＥ７ペプチドを用いた皮内注射に対する皮膚反応
本発明者らは、ＨＰＶ１６ Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７ペプチドを用いた皮内注射後の健常対照中の皮膚反応を試験した。陽性皮膚反応は直径２〜２０ミリメートルの扁平状赤色丘疹として現れ、注射後２〜２５日以内に生じた。陽性皮膚反応は、皮膚試験中の１５２名の健常ボランティアの４６名において検出した。全体として、皮膚試験中のそれぞれのペプチドプールは陽性皮膚反応をもたらすことができた。最も頻繁に、Ｅ２_{３１〜７５}（対象１９名中１０名）、Ｅ６_{３７〜１０４}（９／１６）及びＥ７_{４３〜９８}（７／１９）に対する反応を対照群中で観察した。この反応パターンは、本発明者らがＰＢＭＣにおいて以前に観察した反応パターンと似ている（de Jong, 2002、Welters, 2003）（図５）。これらの皮膚反応は、これらの個体のＰＢＭＣにおいて検出したのと同様に、ペプチド特異的Ｔ細胞応答の存在に対応した（データ示さず）。
【０１０３】
健常ドナー中の皮膚反応は末梢血中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の高頻度と関連する。
皮膚試験の結果と血中ＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞の存在を比較するために、ＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔアッセイを、真皮内ペプチド曝露を行う前に回収したＰＢＭＣを用いて実施した。１９名の健常ボランティアのうち５名において、本発明者らはＩＦＮγ−ＥＬＩｓｐｏｔによってＨＰＶ１６特異的免疫応答を検出することができた。健常個体の事前曝露血液試料中の、１００．０００個のＰＢＭＣ当たり５個以上の血中ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の検出は、同じペプチド配列に対する初期（１３日以内）の陽性皮膚反応と関係があった（ｐ＝０．０００３、両側のフィッシャーの正確確立検定；図６）。後期の陽性皮膚反応（第１４〜２５日）を誘導したペプチドとの事前曝露血液試料の健常ドナー中で、ＨＰＶ１６特異的血中Ｔ細胞は検出しなかった。これは、血中抗原特異的細胞の頻度は、皮膚反応の遅延時間の出現を決定することを示唆する。
【０１０４】
後期の皮膚反応が現れたときのＨＰＶ特異的Ｔ細胞の頻度を評価するために、１１名の健常ボランティアから追加的血液試料を回収した。これらの個体において、８８の皮膚試験のうちの３９が陽性であった。３９の陽性皮膚反応のうちの２５及び４９の陰性皮膚反応のうちの１０において、１００．０００個のＰＢＭＣ当たり５個以上のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞を検出した。この時点で、曝露後の血液試料中の血中ＨＰＶ特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と皮膚反応の存在の間の、有意な相関関係を見出した（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの正確確立検定；図７）。これは、健常ボランティアの血液中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の頻度は、ＨＰＶ１６ペプチドを用いた真皮内曝露後に有意に高くなることを示し、ペプチド抗原の皮内注射は、健常ボランティアの血液中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の数を増大することを示す。
【０１０５】
陽性皮膚反応部位の生検はＴｈ１／Ｔｈ２−ＣＤ４＋とＣＤ８＋ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の両方からなる。
健常ボランティアの陽性皮膚反応の約２５％は、血中のＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と関係がなく、他の、非ＩＦＮγ産生タイプのＴ細胞が、ＨＰＶ１６ペプチドの真皮内注射後に皮膚に浸潤する可能性があることが示唆された。
【０１０６】
陽性皮膚反応部位中の細胞を特徴付けするために、パンチ生検を採取した。合計８個の生検を７名の健常個体の異なる陽性皮膚反応部位から得て、サイトカインのカクテルと共に培養し、抗原刺激なしのインビトロでのＴ細胞の増殖を可能にした。８例のうちの７例において、Ｔ細胞は組織外に浸潤し、３〜４週間以内に増殖した。増殖したＴ細胞は、短期の増殖アッセイ中のそれらの特異性に関して試験した。図８は、ペプチドのプールでパルス標識し、さらに皮膚試験中にこの部位に注射した自己単球（ＨＤ２、ＨＤ１０、ＨＤ１５）、及びＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質（図８ＡＢ）でパルス標識した単球を用いた刺激によって特異的に増殖したＴ細胞培養物の例を示す。これは、これらのＴ細胞が、抗原が自然にプロセシング及び提示された後に、それらの同種ＨＬＡ−ペプチド複合体を認識することができたことを示す。これらの増殖Ｔ細胞培養物の上清の分析は、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞がＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を産生した混合型Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイルを明らかにした（図８Ｃ）。
【０１０７】
生検培養物（８個中４個）においてＨＰＶ特異的Ｔ細胞を検出したそれぞれの場合、これはＥＬＩｓｐｏｔによる曝露後の血液試料中の血中ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と一致した（図８Ａ及びＢを比較）。他の４個の陽性皮膚反応生検の３個（ＨＤ２、ＨＤ１７、ＨＤ１８）において、Ｔ細胞はＨＰＶ１６ペプチドに応答せず（図８；ＨＤ１７）、一例では、Ｔ細胞は組織外に全く浸潤しなかった（ＨＤ１３）。これらの４例において、本発明者らは、曝露後の血液試料中の血中ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を検出することができなかった。
【０１０８】
ＣＤ４及びＣＤ８細胞表面マーカーによる生検−Ｔ細胞の同時染色は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４^＋だけでなくＨＰＶ１６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞も、ＨＰＶ１６ペプチドでの真皮内曝露によって皮膚部位に浸潤したことを示した（図９）。全体として、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞によって浸潤した４個の生検の３個において、本発明者らは、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を検出することができた。ＨＤ２の生検（プール６）から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞は、注射皮膚試験の両方の重複するペプチド：ＨＰＶ１６ Ｅ６_{１０９〜１４０}とＥ６_{１２７〜１５８}に応答したが（データ示さず）、一方両対象ＨＤ１５及びＨＤ１６のＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＰＶ１６ Ｅ６_{３７〜６８}に応答した（ＨＤ１５に関する実施例、図５を参照）。
【０１０９】
総合すると、ＨＰＶ１６ペプチドを用いた真皮内曝露によって皮膚に移動する免疫細胞の集団は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４^＋Ｔｈｌ−、Ｔｈ２−及びＣＤ８^＋細胞障害性Ｔ細胞を含む。この浸潤は、血液中の血中ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現と平行する。
【０１１０】
考察
皮膚試験は、インビボでの細胞仲介免疫の測定用の簡潔なアッセイとして一般的に使用する。本発明者らは、インビボでの初期抗原Ｅ２、Ｅ６及びＥ７に対するＨＰＶ１６特異的細胞性免疫応答を、これらの結果とインビトロアッセイによるＴ細胞反応性の平行測定の結果を比較することによって測定するための、皮膚試験アッセイの使用を確認した。
【０１１１】
健常ボランティアの群において、初期皮膚反応は皮内抗原曝露後４〜１２日で現れた。インビトロでＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞応答を示すことが知られている（de Jong, 2002、Welters, 2003）、これらの個体において、初期皮膚反応の出現（１３日以内）は、２０．０００個のＰＢＭＣ当たり少なくとも１個の頻度での、ＩＦＮγ産生ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の検出と有意に関係があった（図６、ｐ＜０．００１）。ＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔアッセイ中の陽性反応に関する同じカットオフ基準は、数学的ツールを使用してツベルクリン反応に関するＥＬＩＳＰＯＴの適切なカットオフを定義した、Jeffries et al（Jeffries, 2006）によって推奨される。少数の血中記憶Ｔ細胞（図６）によって、古典的なＤＴＨ試験と比較して何故皮膚反応が幾らか遅れて出現するかを説明することができる。十分な細胞が生成されて局所炎症、陽性皮膚試験を引き起こす前に、Ｔ細胞を追加抗原刺激又は再活性化して分裂を開始させることが必要である。実際、陽性皮膚反応が現れるとき、高頻度のＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を末梢血中で検出することができる（図７）。
【０１１２】
歴史的に、Ｔｈ１細胞はＤＴＨ応答を誘導すると仮定されているが、しかしながら幾つかの試験は、Ｔｈ２細胞も皮膚試験部位に浸潤することを現在示している（Wang, 1999、Woodfolk, 2001）。同様にこの試験は、健常ボランティアの陽性皮膚試験部位は、Ｔｈ１型とＴｈ２型ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の両方を含有することを示す（図８及び９）。さらに、腎細胞癌又はメラノーマを用いた患者のワクチン接種後の特異的免疫応答をアッセイするために使用した、陽性皮膚試験部位の２つの詳細な試験から明らかとなったように（Bleumer, 2007）、陽性皮膚反応は非特異的Ｔ細胞の流入の結果である可能性もある。さらにこの試験は、健常対象由来の幾つかの陽性皮膚試験部位に、注射したＨＰＶ１６抗原に応答しなかったＴ細胞が浸潤したことを示した。これまでのところ、特異的陽性皮膚反応の理由は依然として明らかではない。予想外に本発明者らは、健常個体中の大部分の皮膚反応は、抗原の真皮内注射後２〜３週間現れることを観察した。これらの後期の陽性皮膚反応は、事前曝露血液中の血中ＨＰＶ特異的ＣＤ４^＋記憶Ｔ細胞の検出と相関がなかった一方で（図６）、これらの皮膚試験部位の免疫学的構成は古典的ＤＴＨ試験のそれと同様であり（Platt, 1983、Poulter, 1982）、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ１−及びＴｈ２−細胞並びにＨＰＶ１６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞からなる（図８及び９）。本発明者らは、これらの反応はＴ細胞初回抗原刺激の結果であり得ると仮定する。２ステップのツベルクリン皮膚試験プロトコルを経験し第２試験ラウンドにおいてのみ陽性であった患者の２９％においても、これは記されている（Akcay, 2003）。一般に、ワクチン誘導型Ｔ細胞応答は、３週間ではなくワクチン接種後１０〜１４日でピークに達する。しかしながら、このようなプロトコル中では、高用量の抗原及び強力なアジュバントが注射されることに留意しなければならない。したがって、真皮内曝露によって誘導されるＴ細胞応答はさらにゆっくりと発達し、さらに後期にピークに達すると仮定することが妥当である。健常ボランティアにおける真皮内ペプチド曝露は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方の誘導をもたらすので、したがって、それは単回、低用量ワクチン接種とみなすべきである。
【０１１３】
このパイロット試験の主な目的は、インビボでの１型免疫応答を検出するためのＨＰＶ１６特異的皮膚試験の使用を確認することであった。健常ボランティアにおいて、１３日以内の陽性皮膚反応は、インビトロでのＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔによって検出される血中ＩＦＮγ産生記憶Ｔ細胞の存在と実際に相関がある。重要なことに、本発明者らは、皮膚試験及びＥＬＩｓｐｏｔによって得られた結果の間の相違も観察した。幾つかの場合、ＨＰＶ１６特異的血中ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を、同時皮膚反応なしではあったが曝露後の血液試料中で検出し、逆も然りであり（図７）、これは偽陰性又は偽陽性の結果とみなすことができる。ＨＰＶに対する１型免疫の検出の解釈に対するこの影響を完全に理解するために、本発明者らは、インドネシアにおけるＨＰＶ陽性患者及び健常ボランティアの大規模集団において現地試験を始めている。
【０１１４】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ関連疾患の予防及び／又は治療用薬物の製造のためのペプチドの使用であって、
前記ペプチドが、１００、９８、９６、９４、９２アミノ酸以下の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質のうち少なくとも１つのアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続したアミノ酸を含み、前記連続したアミノ酸配列が、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ分子のうち少なくとも１つによって提示されるエピトープを含み、前記エピトープが、ＨＬＡ−ＤＱ２に関連して提示されず、且つＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜５０からなるエピトープではない、使用。
【請求項２】
連続したアミノ酸配列が、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞、又は流入領域リンパ節由来のＴ細胞によって認識されるエピトープを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
エピトープがＨＰＶ Ｅ６タンパク質のエピトープである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
エピトープがＨＰＶ血清型１６、１８、３１、３３又は４５、好ましくは１６、１８、３１又は３３、より好ましくは１６又は１８のエピトープである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
エピトープが、配列番号６、５、７、９、１０、１１、１２、１３、１６、１８、１９、２０及び２１からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
連続したアミノ酸配列の長さが、１９〜４５アミノ酸、好ましくは２２〜３５アミノ酸、より好ましくは３３〜３５アミノ酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ＨＰＶ関連疾患の予防及び／又は治療用薬物の製造のためのペプチドの使用であって、前記ペプチドが、１００アミノ酸以下の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質のうち少なくとも１つのアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続したアミノ酸を含み、前記連続したアミノ酸配列が、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞、又は流入領域リンパ節由来のＴ細胞によって認識されるエピトープを含む、使用。
【請求項８】
エピトープが、配列番号５〜２６からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
エピトープが、配列番号７、１４、２２〜２６からなる群から選択されるＨＬＡクラスＩ ＣＴＬエピトープである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
連続したアミノ酸配列が、ＨＬＡ−Ｂ分子によって提示されるエピトープを含む、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
ＨＬＡ−Ｂ分子が、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７分子である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
エピトープが、配列番号７、２２、２４、２５及び２６からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
連続したアミノ酸配列が、ＨＬＡ−Ａ分子によって提示されるエピトープを含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
ＨＬＡ−Ａ分子が、ＨＬＡ−Ａ２、又はＨＬＡ^＊０２０１分子である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
エピトープが、配列番号２３及び２６からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
薬物が、請求項１〜８のいずれかに定義される少なくとも２つの異なるペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
薬物が、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
アジュバントが、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
薬物が、静脈内、皮下、筋肉内粘膜、真皮内及び／又は皮内投与用である、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
有効量の請求項１〜１９のいずれかに定義される薬物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＨＰＶ関連疾患の予防及び／又は治療のための方法。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれかに定義されるペプチド。
【請求項２２】
薬物として使用するための、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれかに定義されるペプチド及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２４】
好ましくはＴｏｌｌ様受容体を介して作用する少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれかに定義される少なくとも１つのペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２６】
配列番号５〜２６からなる群から選択されるエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸分子を含む単離Ｔ細胞。
【請求項２８】
配列番号５〜２６からなる群から選択されるエピトープを認識するＴ細胞受容体を含む単離Ｔ細胞。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２０１０−５２７６３０（Ｐ２０１０−５２７６３０Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０２４０（Ｐ２０１０−５１０２４０）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０３２０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７１８７
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０９３２７８４０）
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＳＣＨ　ＺＩＥＫＥＮＨＵＩＳ　ＬＥＩＤＥＮ　Ｈ．Ｏ．Ｄ．Ｎ．　ＬＵＭＣ
【Ｆターム（参考）】