ワサビの検出方法
【課題】ワサビを高感度に検出する方法を提供する。
【解決手段】ワサビのミロシナーゼに共通な配列を同定し、その塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプライマーセット又はプローブを作成した。前記プライマーを用い、ミロシナーゼの遺伝子を検出することにより、ワサビの高感度な検出方法を確立した。
【解決手段】ワサビのミロシナーゼに共通な配列を同定し、その塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプライマーセット又はプローブを作成した。前記プライマーを用い、ミロシナーゼの遺伝子を検出することにより、ワサビの高感度な検出方法を確立した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワサビ（ｗａｓａｂｉ）の検出用プライマー及びプローブ、並びにそれらを用いたワサビの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワサビは、主にその根茎をすりおろして刺身、すし、そばなどの薬味として利用されている。ワサビが栽培されるようになったのは、約４００年前くらいであり、食味や収量のよい品種を得るための品種改良が行われてきた。しかしながら、ワサビは他殖性が強いため、遺伝的な純度を高めると生育や収量が悪くなる傾向があり、経験的に純系分離による育種は困難を伴うと考えられていた（非特許文献１）。そのため、ワサビの実用的品種はある程度雑種性を保つ必要があり、遺伝的には不均一であると考えられている。このワサビの品種は、葉柄色、根茎の太さ及び形状、及び分けつの多少、更に、すりおろしたときの辛味、香り、及び粘り等の特徴により分類されている。例えば、一般に「だるま」と呼ばれている品種の１つである「ふじだるま」は葉柄が太く緑色を呈し、葉は大きく心臓型、草姿は旺盛、分けつは中程度である。一方、和歌山原産の形質の異なる７〜８種の混合集団から選抜されたと言われる「真妻」は、一般的に葉柄が紫色を呈し、葉数は多いが草丈は低く、分けつは少ない。草姿は全体的に小柄な印象を受ける品種で、収穫までに１年半から２年かかる。このようにワサビは品種によって、外見が非常に異なっており、耐暑性や耐寒性などの性質も品種により異なっている。更に、同じ品種であっても、各産地において長年独自に繁殖を繰り返している過程で、その地方及びその栽培されている沢ごとに、環境に適した個体選抜が行なわれてきたため、栄養要求性の異なる様々な系統があると考えられている。このようなワサビについての遺伝的な解析については、数個の遺伝子の報告があるが、品種や系統ごとの遺伝子の解析については、ほとんど研究されていない。
最近、ワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡが分離された（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ１９４９０３）。ミロシナーゼは西洋ナタネ、ホワイトマスタード、ダイコン、カラシナ、シロイヌナズナなどのアブラナ科の植物に存在し、それぞれ異なるミロシナーゼをもっており、ｃＤＮＡの解析からＭＡ、ＭＢ、ＭＣ、及びＴＧＧの４つのサブタイプに分けることができる。例えば、西洋ナタネは、ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣの３種類のミロシナーゼの遺伝子をもっているおり、ＭＢはすべての生活環で発現しているが、ＭＡ及びＭＣは種子でわずかに発現していることが報告されている。今まで分離されたミロシナーゼ遺伝子の多くはＭＢに属するが、例えばハツカダイコンには、ＭＢタイプのミロシナーゼの中にも、ＲＭＢ１とＲＭＢ２の２種類のＭＢが存在することが報告されており、それらのアミノ酸レベルでの相同性は９３％である（非特許文献２）。このようにミロシナーゼ遺伝子は、種間で多様性があり、同じ種でも何種類かのミロシナーゼ遺伝子をもっている。
一方、市販されている加工ワサビ製品は、ワサビ以外の辛み成分として、からしやワサビダイコン（セイヨウワサビ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）を含んでいるものも多い。加工食品は、農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律（ＪＡＳ法）により、原材料の表示が義務づけられているが、加工ワサビ製品中のワサビの含有を確認するために、ワサビを高感度に検出する方法の開発が望まれている。加工ワサビ製品中のワサビの配合比率を分析する方法として、ＥＬＩＳＡ法によって、ワサビタンパク質を分析する方法が報告されている（非特許文献２）が、十分な感度を得られていなかった。
【非特許文献１】足立昭三著、「ワサビ栽培」、第１版、秀潤社、１９８７年８月１日、ｐ．３８−３９
【非特許文献２】「プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（英国）２０００年、第４１巻、第１０号、ｐ．１１０２−１１０９
【非特許文献３】永井雅、他５名「ＥＬＩＳＡによる加工わさび製品中の本わさび配合比率の分析」、日本農芸化学会２００２年度大会（仙台）講演要旨集、ｐ．９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、高感度なワサビの検出方法を開発するために、鋭意研究を重ねた結果、形態やその性質の異なるワサビの２品種からミロシナーゼのｃＤＮＡを単離し、塩基配列を解析した。その結果、この２品種から得られたワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は、クローン間で若干の塩基の置換は見られたが、予想に反して高い相同性を示し、ワサビは同一の型のミロシナーゼを有しており、複数の型は存在しないことがわかった。更に、本発明者らは、この２品種間で保存されているミロシナーゼをコードしている塩基配列に基づいてプライマーを作成し、そのプライマーを用いて、多くの品種のワサビからミロシナーゼ遺伝子の検出を行なったところ、驚くべきことに、検査したすべての品種でワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出することが可能であり、共通のミロシナーゼ遺伝子がワサビの品種間で保存されていることを見出した。
本発明はこのような知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、（Ａ）（１ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー(１ａ)；（１ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ｂ）；（２ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）；（２ｂ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）；（３ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）；及び
（３ｂ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ｂ）；からなる群から選択される第１プライマーと、（Ｂ）（４ａ）配列番号６で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）；
（４ｂ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）；（５ａ）配列番号７で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ａ）；（５ｂ）配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ｂ）；（６ａ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ａ）；及び（６ｂ）配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ｂ）；からなる群から選択される第２プライマーとの組み合わせからなり、前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（１ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（１ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（４ａ）、前記ＤＮＡプライマー（４ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（２ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（２ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、そして、前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（３ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（３ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であることを特徴とする、ワサビの検出用プライマーセットに関する。
本発明によるワサビの検出用プライマーセットの好ましい態様においては、前記第１プライマーが、（Ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーであり、前記第２プライマーが、（Ｂ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーであり、特には、前記第１プライマーが、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、ワサビの検出方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、（Ａ）配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は（Ｂ）前記配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とする、ワサビの検出用プローブに関する。
更に、本発明は前記プローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、ワサビの検出方法に関する。
本明細書では、プラス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるセンスプライマーを第１プライマーと称し、マイナス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるアンチセンスプライマーを第２プライマーと称することがある。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のプローブは、ワサビのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしないため、本発明のプローブを用いた検出方法により、ワサビのゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを特異的に検出することが可能である。また、本発明のプライマーセットもワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするため、ポリメレース重合反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと称する）法により、ワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを特異的に検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明者は、ミロシナーゼのｃＤＮＡの塩基配列の一部が、ワサビの品種間で保存されていることを見出した。その部分配列が配列番号１４に表している塩基配列である。本発明者は、「真妻」から６クローン及び「ふじだるま」から８クローンの塩基配列を決定した。ふじだるまから得られた１クローンでは、配列番号１４の２５０番から２５８番の連続するＡのいずれかのＡの欠失が見られ、他の１クローンでは２５０番から２５８番のＡが連続する部分にＡＡＡ（アデニン三塩基）の挿入（インサーション）が見られた。また各クローン間で若干の塩基の置換は存在したが、驚くべきことに共通の塩基配列が保存されており、ワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子は１つの型である可能性が示唆された。配列番号１４で表される塩基配列は１４クローンの共通の配列を示し、置換のある塩基は混合塩基で示している。本発明者は、この塩基配列の内、プライマーやプローブとして特異的に使用することができる領域として、ワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物には保存されていない領域が４箇所存在することを見出した。これらの４箇所の領域の塩基配列とその相補鎖の塩基配列を示すと、以下の通りである。
【０００９】
ＷＡＹ１−Ｓ〔配列番号１〕：ＡＡＣＴＡＡＡＡＣＡ ＡＴＡＧＹＴＣＣＴＣ ＣＧＧＡＡＭＡＴＣＡ
ＷＡＹ１−ＡＳ（ＷＡＹ１−Ｓの相補鎖）〔配列番号５〕：ＴＧＡＴＫＴＴＣＣＧ ＧＡＧＧＡＲＣＴＡＴ ＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴ
ＷＡＹ２−Ｓ〔配列番号２〕：ＴＧＹＴＴＧＣＧＡＡＡ ＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣ ＣＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＷＡＹ２−ＡＳ（ＷＡＹ２−Ｓの相補鎖）〔配列番号６〕：ＴＴＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣ ＴＴＴＣＧＣＡＡＲＣＡ
ＷＡＹ３−Ｓ〔配列番号３〕：ＧＧＡＴＣＡＣＴＴＣ ＡＧＡＡＳＡＡＧＡＴ ＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣ
ＷＡＹ３−ＡＳ（ＷＡＹ３−Ｓの相補鎖）〔配列番号７〕：ＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴ ＡＴＣＴＴＳＴＴＣＴ ＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣ
ＷＡＹ４−Ｓ〔配列番号４〕：ＴＴＡＡＣＹＧＧＡＭ ＷＧＡＣＳＴＣＡＣＴ ＧＡＴＡＧＡＡＡＣＣ
ＷＡＹ４−ＡＳ（ＷＡＹ４−Ｓの相補鎖）〔配列番号８〕：ＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣ ＡＧＴＧＡＳＧＴＣＷ ＫＴＣＣＲＧＴＴＡＡ
【００１０】
前記塩基配列の記載で、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｋはグアニン又はチミンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｓはグアニン又はシトシンを示し、Ｗはアデニン又はチミンを示す。これらの塩基配列から本発明のプライマー及びプローブを作成する場合、混合塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、広い品種のワサビを検出することが可能となり、検出感度や検出率が上昇すると考えられる。
【００１１】
前記ＷＡＹ１−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第１３０〜１５９番目の塩基配列に相当する。同様に、前記ＷＡＹ２−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第２２８〜２５７番目の塩基配列に相当し、前記ＷＡＹ３−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第２９５〜３２４番目の塩基配列に相当し、前記ＷＡＹ４−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第５４９〜５７８番目の塩基配列に相当する。
【００１２】
本発明のプライマーセットは、ワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法により、特異的に検出するためのプライマーのセットであり、センスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）からなる一対のプライマーのセットである。
【００１３】
本発明のプライマーセットの第１プライマーは、
（１ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）；
（１ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ｂ）；
（２ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）；
（２ｂ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）；
（３ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）；及び
（３ｂ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ｂ）；
からなる群から選択されるＤＮＡプライマーである。
また、第２プライマーは、
（４ａ）配列番号６で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）；
（４ｂ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）；
（５ａ）配列番号７で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ａ）；
（５ｂ）配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ｂ）；
（６ａ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ａ）；及び
（６ｂ）配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ｂ）；
からなる群から選択されるＤＮＡプライマーである。
【００１４】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとして用いるプライマー（１ａ）は、ＷＡＹ１−Ｓ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に、第１プライマーとして用いるプライマー（２ａ）は、ＷＡＹ２−Ｓ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含み、プライマー（３ａ）は、ＷＡＹ３−Ｓ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第１プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、３５塩基より多いと、ワサビ以外のミロシナーゼの遺伝子とハイブリダイズすることがある。
【００１５】
プライマー（１ａ）においては、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（１ａ）の３’末端側は、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、ＷＡＹ１−Ｓ領域の３’末端に隣接する配列番号１４の塩基配列の１〜５塩基を含むことができる。
【００１６】
同様に、プライマー（２ａ）及びプライマー（３ａ）は、それぞれ、ＷＡＹ２−Ｓ領域及びＷＡＹ３−Ｓ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ２−Ｓ領域及びＷＡＹ３−Ｓ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００１７】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとしては、前記のプライマー（１ａ）、プライマー（２ａ）、及びプライマー（３ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（１ｂ）、前記プライマー（２ｂ）、及び前記プライマー（３ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（１ｂ）、プライマー（２ｂ）、及びプライマー（３ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。
【００１８】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとして用いるプライマー（４ａ）は、ＷＡＹ２−ＡＳ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に、第２プライマーとして用いるプライマー（５ａ）は、ＷＡＹ３−ＡＳ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含み、プライマー（６ａ）は、ＷＡＹ４−ＡＳ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第１プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、３５塩基より多いと、ワサビ以外のミロシナーゼの遺伝子とハイブリダイズすることがあるからである。
【００１９】
プライマー（４ａ）においては、ＷＡＹ２−ＡＳ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ２−ＡＳ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（４ａ）の３’末端側は、ＷＡＹ２−ＡＳ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、ＷＡＹ２−ＡＳ領域の３’末端に隣接する配列番号１４の塩基配列の１〜５塩基を含むことができる。
【００２０】
同様に、プライマー（５ａ）及びプライマー（６ａ）は、それぞれ、ＷＡＹ３−ＡＳ領域及びＷＡＹ４−ＡＳ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ３−ＡＳ領域及びＷＡＹ４−ＡＳ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００２１】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとしては、前記のプライマー（４ａ）、プライマー（５ａ）、及びプライマー（６ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（４ｂ）、前記プライマー（５ｂ）、及び前記プライマー（６ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（４ｂ）、プライマー（５ｂ）、及びプライマー（６ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。
【００２２】
本発明のプライマーセットの第１プライマー及び各第２プライマーの長さは、特に限定されないが、それぞれ１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであること好ましく、より好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。
【００２３】
また、配列番号１〜８に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、ワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプライマーは、これらの混合塩基を含むディジェネレイテッドプライマーでもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一の配列からなるプライマーでもよい。
【００２４】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプライマーセットのＤＮＡプライマーのＴｍは、６０〜６８、好ましくは、６５〜６８であることが望ましい。なお、前記Ｔｍを計算する方法は、いくつかの方法が提案されているが、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、下記の式（Ｉ）：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ） （Ｉ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。この式で［Ｎａ＋］＝５０ｍＭで計算すると、１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］は、およそ２１．５９７０９８となりＴｍ値を計算することができる。また、鎖長が１８ヌクレオチドより短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
【００２５】
前記第１プライマー及び第２プライマーは公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン化又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。例えば、各塩基がビオチン化又は発光物質により標識されていてもよい。また、５’末端が公知の任意の態様で修飾されていてもよい。例えば、標識したプライマーを用いることにより、ＴａｑＭａｎ法などのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子の定量を行なうことが可能となる。本発明による前記の第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。
【００２６】
前記第１プライマーと第２プライマーの組み合わせは、ワサビのミロシナーゼを特異的に検出可能な組み合わせであれば、特に限定されない。例えば、第１プライマーとして前記プライマー（１ａ）及び／又はプライマー（１ｂ）を選択した場合は、第２プライマーとしてプライマー（４ａ）及び／又はプライマー（４ｂ）、プライマー（５ａ）及び／又はプライマー（５ｂ）、又はプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）を使用することができる。第１プライマーとして前記プライマー（２ａ）及び／又はプライマー（２ｂ）を選択した場合は、第２プライマーとしてプライマー（５ａ）及び／又はプライマー（５ｂ）、又はプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）を使用することができる。第１プライマーとして前記プライマー（３ａ）及び／又はプライマー（３ｂ）を選択した場合は、第２プライマーとしてプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）を使用することができる。好まししいプライマーの組み合わせは、第１プライマーがプライマー（２ａ）及び／又はプライマー（２ｂ）であり、第２プライマーがプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）の組み合わせである。更に、好ましくは第１プライマーが、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２プライマーが配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。また、第１プライマー及び第２プライマーは、１種のプライマーを用いてもよいし、２種以上のプライマー、例えば、プライマー（２ａ）及びプライマー（２ｂ）を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本発明のプローブは、ワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドである。本発明のプローブには、ＰＣＲに用いる前記第１プライマー及び第２プライマーも含まれる。更に、ＤＮＡプローブのみではなくＲＮＡプローブも含まれる。
【００２８】
本発明のプローブは、（Ａ）配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基、最も好ましくは２０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、Ａプローブと称する）であるか、又は（Ｂ）前記配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは１５ヌクレオチド部分、最も好ましくは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、Ｂプローブと称する）である。
【００２９】
本発明のＡプローブは、１０塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションができず、特異性が低くなるためプローブとして有用でない。それぞれのプローブは、少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むため、例えば、その配列番号で表される塩基配列から選択される任意の連続する１０〜３０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることができる。更に、それぞれのプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外に５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来しない塩基配列）が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。付加される塩基配列は、例えば、タグとして検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列でもよい。また、プローブに含まれるオリゴヌクレオチド分の５’末端が、それぞれの配列番号で表された塩基配列の５’末端に位置する場合、又はオリゴヌクレオチド分の３’末端が、それぞれの配列番号で表された塩基配列の３’末端に位置する場合は、それぞれの配列番号で表された塩基配列に隣接する配列番号１４で表される塩基配列が付加されたものでもよい。しかしながら、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外のミロシナーゼをコードする塩基配列が付加される場合は、塩基配列の長さは５ｍｅｒ以下であることが好ましい。５ｍｅｒより長い場合は、ワサビ以外のアブラナ科のミロシナーゼと相同性の高い塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むことになるため、ワサビ以外のミロシナーゼをコードするＤＮＡとハイブリダイズする可能性が高くなり、特異性が低下するためである。また、配列番号１〜８に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、ワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプローブは、これらの混合塩基を含むプローブの混合物でもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一のプローブでもよい。
【００３０】
本発明のＢプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドを含む。１０ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プローブとして機能しなくなるからである。
【００３１】
本発明のプローブの長さの上限は特に制限されないが、３５ｍｅｒ以下、より好ましくは３０ｍｅｒ以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。３５ｍｅｒを超える場合は、ワサビのミロシナーゼに特異的でない塩基配列を含むことになり、プローブとしての特異性が低くなるからである。
【００３２】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプローブのＴｍは、３００〜６８、好ましくは、４５〜６８、より好ましくは、６０〜６８であることが望ましい。
【００３３】
本発明のプローブの標識は特に限定されず、公知の方法で標識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることができる。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。
【００３４】
本発明によるワサビの検出方法は、例えば、ワサビの植物体の品種を同定する方法、及びワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法を意味する。ワサビ（学名Ｅｕｔｒｅｍａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の品種としては、例えば、真妻、ふじだるま、もちだるま、半原（緑茎種）、半原（赤茎種）、三宝、加茂自交−１３、高光、山崎だるま、豊科在来の一種、信州新町在来の一種、伊豆在来の一種を挙げることができる。
【００３５】
ワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法は、例えば、ワサビの根茎をすりつぶした部分を含む加工食品、例えば、練りワサビや粉ワサビの原料にワサビが含まれているか否かを検出することができる。
【００３６】
本発明のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、ワサビの検出方法（以下、プライマーセット検出方法と称することがある）によって、ワサビのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３７】
本発明のプローブと被検試料を接触させ、プローブに担持した標識からの信号を検出することを特徴とするワサビの検出方法（以下、プローブ検出方法と称することがある）により、ワサビのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３８】
本発明の前記プライマーセット検出方法及びプローブ検出方法で用いる「被検試料」は、ワサビのミロシナーゼをコードしている塩基配列からなる遺伝子を含有している可能性のあるものであれば特に限定されない。ここで遺伝子とは、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ等を挙げることができる。そのため、具体的には「被検試料」はワサビの入っている可能性のある加工食品、例えば、ねりワサビ、粉ワサビなどがある。このような加工食品を液状にしたものや、加工食品から核酸を抽出した核酸溶液も含まれる。また、ワサビの品種を確認する場合は、植物体を構成する細胞を含む分散液や、細胞から抽出した核酸を含む溶液も被検試料となる。
【００３９】
公知の方法によりＤＮＡやＲＮＡを抽出し、被検試料として用いることが可能である。例えばゲノムＤＮＡを抽出する方法は、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。また、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いることも可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合も、公知の方法でＲＮＡを抽出することが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。
【００４０】
ｍＲＮＡは、プローブと直接ハイブリダイズさせて検出する場合は、ｍＲＮＡのまま使用することが可能である。一方、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼと被検試料を混合し、ＰＣＲ法により検出する場合は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しなければならない。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ミロシナーゼに特異的なアンチセンスプライマー、例えば、前記第２プライマーを用いることも可能であるし、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりミロシナーゼをコードする遺伝子配列を検出することができる。
【００４１】
プライマーセットを用いる本発明のプライマーセット検出方法は、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検出工程とからなる。プライマーセット検出方法においては、最初にＤＮＡ増幅工程を行うことが好ましい。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ法を用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１プライマー及び第２プライマーとともに、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することができるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程では、前記のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実施することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）を含有することができる。
【００４２】
プライマーセット検出方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、例えば（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃、約１０秒〜２分間）、（ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃、約３０秒〜３分間）、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃、約３０秒〜５分間）とからなる。
【００４３】
ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を利用する方法、電気泳動後にフィルターに移してサザンブロットハイブリッド法を行う方法、増幅したＤＮＡをそのままフィルターにブロットしてドットブロットハイブリッド法を行う方法、又は、ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用し、分子量により目的のＰＣＲ産物を検出することができる。
【００４４】
ＰＣＲを行った後に、サザンブロットハイブリッド法、ドットブロットハイブリッド法等でＰＣＲ産物を検出する場合には、プライマーに用いた以外のワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列からなる非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は、化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用いることができる。
【００４５】
本発明のプローブ検出法は、プローブと被検試料を接触させプローブからの信号を検出することにより、ワサビの検出を行う。公知の方法で抽出したＤＮＡやＲＮＡを被検試料として、ノザンブロットハイブリダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ミロシナーゼをコードするｍＲＮＡやＤＮＡの存在を解析することができる。また本発明のプローブは、慣用のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いることも可能である。
【００４６】
本発明のプローブと、ワサビの植物体、及びその類縁種の染色体とのハイブリダイゼーション条件は、前記「ストリンジェントな条件」が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件が挙げられる。
【００４７】
また、前記ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃低い温度、好ましくは、２２℃低い温度、より好ましくは、２０℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６０℃以上、好ましくは、６２℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーションを行い、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃低い温度、より好ましくは、３０℃低い温度、さらに好ましくは、２５℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行うことができる。
【００４８】
本発明のプライマーセット及びプローブを含むワサビを検出するための試薬及びキットを調製することも可能である。前記試薬やキットは、本発明のプライマーセット検出方法やプローブ検出方法により、ワサビを検出することが可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
《実施例１：ワサビのミロシナーゼのゲノムＤＮＡの検出》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
ＷＡＹ１：ＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴ ＡＧＹＴＣＣＴＣＣＧ Ｇ（配列番号１１）、
ＷＡＹ２：ＴＴＧＣＧＡＡＡＧＡ ＡＧＡＣＧＡＣＣＣＡ Ａ（配列番号１２）、及び
ＷＡＹ４：ＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣ ＡＧＴＧＡＳＧＴＣＷ Ｋ（配列番号１３）を合成した。
【００５１】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
ワサビの１０品種の真妻、ふじだるま、もちだるま、半原（緑茎種）、半原（赤茎種）、三宝、加茂自交−１３、高光、山崎だるま、豊科在来の一種、信州新町在来の一種、伊豆在来の一種、並びに他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物である西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウからゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、それぞれの植物体を、葉、茎、及び根茎に分離し、液体窒素で凍結し、−７０℃に保存した。保存したサンプルを液体窒素中で粉砕し、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、キットのプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、滅菌蒸留水５０μＬに溶解した。
【００５２】
（３）ＰＣＲによる増幅
ゲノムＤＮＡ溶解液１０μＬ（１μｇ）に１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、第１プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、及び第２プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ（ニッポンジーン社）０．５μＬを加え滅菌蒸留水で５０μＬにした。第１プライマーとしてＷＡＹ１、第２プライマーとしてＷＡＹ４の組み合わせ（ＷＡＹ１−ＷＡＹ４プライマーセット）、及び第１プライマーとしてＷＡＹ２、第２プライマーとしてＷＡＹ４の組み合わせ（ＷＡＹ２−ＷＡＹ４プライマーセット）で反応液を作成した。この反応液を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＴＰ６００（ＴＡＫＡＲＡ）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃で２分保持し、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング４０℃又は６０℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返した。３０サイクル終了後７２℃で１．５分間保持し、４℃に冷却した。
【００５３】
（４）ＰＣＲ産物の解析
ＰＣＲ反応終了した溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。ＷＡＹ１からＷＡ３のプライマーに対応するゲノムＤＮＡにイントロンが存在しない場合は、ＷＡＹ１−ＷＡＹ４プライマーセットによって４４７ｂｐのサイズのＰＣＲ産物が、ＷＡＹ２−ＷＡＹ４プライマーセットによって３４９ｂｐのサイズのＰＣＲ産物が増幅されるはずである。図２に示すように、ＷＡＹ２−ＷＡＹ４プライマーセットを用いた場合、アニーリング温度が４０℃及び６０℃のいずれのＰＣＲプロファイルを用いた場合も、ワサビの１０種類の品種から抽出したＤＮＡから、予測される約３５０ｂｐの位置にＰＣＲ産物を確認することができた。一方、西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウから抽出したＤＮＡを用いた場合は、３５０ｂｐのＰＣＲ産物を確認することはできなかった。また、ＷＡＹ１−ＷＡＹ４プライマーセットを用いたＰＣＲでは、ワサビの１０種類の品種から抽出したゲノムＤＮＡから、予測される４４７ｂｐのＰＣＲ産物は得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のプライマーセット及びプローブを用いたワサビの検出方法は、加工ワサビ食品にワサビの含有の有無を高感度に検出することが可能である。またワサビの品種の同定に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＰＣＲによる、ワサビ及び西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウのゲノムＤＮＡからミロシナーゼ遺伝子を検出したアガロース電気泳動像である。それぞれのレーンは、もちだるま（１）、半原（緑茎種）（２）、半原（赤茎種）（３）、三宝（４）、豊科在来の一種（５）、信州新町在来の一種（６）、加茂自交−１３（７）、高光（８）、伊豆在来の一種（９）、山崎だるま（１０）、西洋ワサビ赤芽（１１）、西洋ワサビ青芽（１２）、カイワレダイコン（１３）、ホウレンソウ（１４）、及びトウミョウ（１５）を示す。ＡはＷＡＹ１とＷＡＹ３のプライマーの組み合わせ、ＢはＷＡＹ２とＷＡＹ３のプライマーの組み合わせを示し、４０はアニーリング温度が４０℃、６０はアニーリング温度が６０℃でＰＣＲを行ったことを示す。ＭはＤＮＡマーカー（Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｈｉ−ＬｏＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ５０ｂｐ−１０，０００ｂｐ：株式会社アベテック）を表している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワサビ（ｗａｓａｂｉ）の検出用プライマー及びプローブ、並びにそれらを用いたワサビの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワサビは、主にその根茎をすりおろして刺身、すし、そばなどの薬味として利用されている。ワサビが栽培されるようになったのは、約４００年前くらいであり、食味や収量のよい品種を得るための品種改良が行われてきた。しかしながら、ワサビは他殖性が強いため、遺伝的な純度を高めると生育や収量が悪くなる傾向があり、経験的に純系分離による育種は困難を伴うと考えられていた（非特許文献１）。そのため、ワサビの実用的品種はある程度雑種性を保つ必要があり、遺伝的には不均一であると考えられている。このワサビの品種は、葉柄色、根茎の太さ及び形状、及び分けつの多少、更に、すりおろしたときの辛味、香り、及び粘り等の特徴により分類されている。例えば、一般に「だるま」と呼ばれている品種の１つである「ふじだるま」は葉柄が太く緑色を呈し、葉は大きく心臓型、草姿は旺盛、分けつは中程度である。一方、和歌山原産の形質の異なる７〜８種の混合集団から選抜されたと言われる「真妻」は、一般的に葉柄が紫色を呈し、葉数は多いが草丈は低く、分けつは少ない。草姿は全体的に小柄な印象を受ける品種で、収穫までに１年半から２年かかる。このようにワサビは品種によって、外見が非常に異なっており、耐暑性や耐寒性などの性質も品種により異なっている。更に、同じ品種であっても、各産地において長年独自に繁殖を繰り返している過程で、その地方及びその栽培されている沢ごとに、環境に適した個体選抜が行なわれてきたため、栄養要求性の異なる様々な系統があると考えられている。このようなワサビについての遺伝的な解析については、数個の遺伝子の報告があるが、品種や系統ごとの遺伝子の解析については、ほとんど研究されていない。
最近、ワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡが分離された（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ１９４９０３）。ミロシナーゼは西洋ナタネ、ホワイトマスタード、ダイコン、カラシナ、シロイヌナズナなどのアブラナ科の植物に存在し、それぞれ異なるミロシナーゼをもっており、ｃＤＮＡの解析からＭＡ、ＭＢ、ＭＣ、及びＴＧＧの４つのサブタイプに分けることができる。例えば、西洋ナタネは、ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣの３種類のミロシナーゼの遺伝子をもっているおり、ＭＢはすべての生活環で発現しているが、ＭＡ及びＭＣは種子でわずかに発現していることが報告されている。今まで分離されたミロシナーゼ遺伝子の多くはＭＢに属するが、例えばハツカダイコンには、ＭＢタイプのミロシナーゼの中にも、ＲＭＢ１とＲＭＢ２の２種類のＭＢが存在することが報告されており、それらのアミノ酸レベルでの相同性は９３％である（非特許文献２）。このようにミロシナーゼ遺伝子は、種間で多様性があり、同じ種でも何種類かのミロシナーゼ遺伝子をもっている。
一方、市販されている加工ワサビ製品は、ワサビ以外の辛み成分として、からしやワサビダイコン（セイヨウワサビ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）を含んでいるものも多い。加工食品は、農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律（ＪＡＳ法）により、原材料の表示が義務づけられているが、加工ワサビ製品中のワサビの含有を確認するために、ワサビを高感度に検出する方法の開発が望まれている。加工ワサビ製品中のワサビの配合比率を分析する方法として、ＥＬＩＳＡ法によって、ワサビタンパク質を分析する方法が報告されている（非特許文献２）が、十分な感度を得られていなかった。
【非特許文献１】足立昭三著、「ワサビ栽培」、第１版、秀潤社、１９８７年８月１日、ｐ．３８−３９
【非特許文献２】「プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（英国）２０００年、第４１巻、第１０号、ｐ．１１０２−１１０９
【非特許文献３】永井雅、他５名「ＥＬＩＳＡによる加工わさび製品中の本わさび配合比率の分析」、日本農芸化学会２００２年度大会（仙台）講演要旨集、ｐ．９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、高感度なワサビの検出方法を開発するために、鋭意研究を重ねた結果、形態やその性質の異なるワサビの２品種からミロシナーゼのｃＤＮＡを単離し、塩基配列を解析した。その結果、この２品種から得られたワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は、クローン間で若干の塩基の置換は見られたが、予想に反して高い相同性を示し、ワサビは同一の型のミロシナーゼを有しており、複数の型は存在しないことがわかった。更に、本発明者らは、この２品種間で保存されているミロシナーゼをコードしている塩基配列に基づいてプライマーを作成し、そのプライマーを用いて、多くの品種のワサビからミロシナーゼ遺伝子の検出を行なったところ、驚くべきことに、検査したすべての品種でワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出することが可能であり、共通のミロシナーゼ遺伝子がワサビの品種間で保存されていることを見出した。
本発明はこのような知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、（Ａ）（１ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー(１ａ)；（１ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ｂ）；（２ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）；（２ｂ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）；（３ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）；及び
（３ｂ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ｂ）；からなる群から選択される第１プライマーと、（Ｂ）（４ａ）配列番号６で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）；
（４ｂ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）；（５ａ）配列番号７で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ａ）；（５ｂ）配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ｂ）；（６ａ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ａ）；及び（６ｂ）配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ｂ）；からなる群から選択される第２プライマーとの組み合わせからなり、前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（１ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（１ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（４ａ）、前記ＤＮＡプライマー（４ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（２ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（２ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、そして、前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（３ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（３ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であることを特徴とする、ワサビの検出用プライマーセットに関する。
本発明によるワサビの検出用プライマーセットの好ましい態様においては、前記第１プライマーが、（Ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーであり、前記第２プライマーが、（Ｂ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーであり、特には、前記第１プライマーが、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、ワサビの検出方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、（Ａ）配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は（Ｂ）前記配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とする、ワサビの検出用プローブに関する。
更に、本発明は前記プローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、ワサビの検出方法に関する。
本明細書では、プラス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるセンスプライマーを第１プライマーと称し、マイナス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるアンチセンスプライマーを第２プライマーと称することがある。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のプローブは、ワサビのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしないため、本発明のプローブを用いた検出方法により、ワサビのゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを特異的に検出することが可能である。また、本発明のプライマーセットもワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするため、ポリメレース重合反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと称する）法により、ワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを特異的に検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明者は、ミロシナーゼのｃＤＮＡの塩基配列の一部が、ワサビの品種間で保存されていることを見出した。その部分配列が配列番号１４に表している塩基配列である。本発明者は、「真妻」から６クローン及び「ふじだるま」から８クローンの塩基配列を決定した。ふじだるまから得られた１クローンでは、配列番号１４の２５０番から２５８番の連続するＡのいずれかのＡの欠失が見られ、他の１クローンでは２５０番から２５８番のＡが連続する部分にＡＡＡ（アデニン三塩基）の挿入（インサーション）が見られた。また各クローン間で若干の塩基の置換は存在したが、驚くべきことに共通の塩基配列が保存されており、ワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子は１つの型である可能性が示唆された。配列番号１４で表される塩基配列は１４クローンの共通の配列を示し、置換のある塩基は混合塩基で示している。本発明者は、この塩基配列の内、プライマーやプローブとして特異的に使用することができる領域として、ワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物には保存されていない領域が４箇所存在することを見出した。これらの４箇所の領域の塩基配列とその相補鎖の塩基配列を示すと、以下の通りである。
【０００９】
ＷＡＹ１−Ｓ〔配列番号１〕：ＡＡＣＴＡＡＡＡＣＡ ＡＴＡＧＹＴＣＣＴＣ ＣＧＧＡＡＭＡＴＣＡ
ＷＡＹ１−ＡＳ（ＷＡＹ１−Ｓの相補鎖）〔配列番号５〕：ＴＧＡＴＫＴＴＣＣＧ ＧＡＧＧＡＲＣＴＡＴ ＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴ
ＷＡＹ２−Ｓ〔配列番号２〕：ＴＧＹＴＴＧＣＧＡＡＡ ＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣ ＣＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＷＡＹ２−ＡＳ（ＷＡＹ２−Ｓの相補鎖）〔配列番号６〕：ＴＴＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣ ＴＴＴＣＧＣＡＡＲＣＡ
ＷＡＹ３−Ｓ〔配列番号３〕：ＧＧＡＴＣＡＣＴＴＣ ＡＧＡＡＳＡＡＧＡＴ ＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣ
ＷＡＹ３−ＡＳ（ＷＡＹ３−Ｓの相補鎖）〔配列番号７〕：ＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴ ＡＴＣＴＴＳＴＴＣＴ ＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣ
ＷＡＹ４−Ｓ〔配列番号４〕：ＴＴＡＡＣＹＧＧＡＭ ＷＧＡＣＳＴＣＡＣＴ ＧＡＴＡＧＡＡＡＣＣ
ＷＡＹ４−ＡＳ（ＷＡＹ４−Ｓの相補鎖）〔配列番号８〕：ＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣ ＡＧＴＧＡＳＧＴＣＷ ＫＴＣＣＲＧＴＴＡＡ
【００１０】
前記塩基配列の記載で、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｋはグアニン又はチミンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｓはグアニン又はシトシンを示し、Ｗはアデニン又はチミンを示す。これらの塩基配列から本発明のプライマー及びプローブを作成する場合、混合塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、広い品種のワサビを検出することが可能となり、検出感度や検出率が上昇すると考えられる。
【００１１】
前記ＷＡＹ１−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第１３０〜１５９番目の塩基配列に相当する。同様に、前記ＷＡＹ２−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第２２８〜２５７番目の塩基配列に相当し、前記ＷＡＹ３−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第２９５〜３２４番目の塩基配列に相当し、前記ＷＡＹ４−Ｓの塩基配列は、配列番号１４の塩基配列において、第５４９〜５７８番目の塩基配列に相当する。
【００１２】
本発明のプライマーセットは、ワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法により、特異的に検出するためのプライマーのセットであり、センスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）からなる一対のプライマーのセットである。
【００１３】
本発明のプライマーセットの第１プライマーは、
（１ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）；
（１ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ｂ）；
（２ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）；
（２ｂ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）；
（３ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）；及び
（３ｂ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ｂ）；
からなる群から選択されるＤＮＡプライマーである。
また、第２プライマーは、
（４ａ）配列番号６で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）；
（４ｂ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）；
（５ａ）配列番号７で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ａ）；
（５ｂ）配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ｂ）；
（６ａ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ａ）；及び
（６ｂ）配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ｂ）；
からなる群から選択されるＤＮＡプライマーである。
【００１４】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとして用いるプライマー（１ａ）は、ＷＡＹ１−Ｓ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に、第１プライマーとして用いるプライマー（２ａ）は、ＷＡＹ２−Ｓ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含み、プライマー（３ａ）は、ＷＡＹ３−Ｓ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第１プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、３５塩基より多いと、ワサビ以外のミロシナーゼの遺伝子とハイブリダイズすることがある。
【００１５】
プライマー（１ａ）においては、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（１ａ）の３’末端側は、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、ＷＡＹ１−Ｓ領域の３’末端に隣接する配列番号１４の塩基配列の１〜５塩基を含むことができる。
【００１６】
同様に、プライマー（２ａ）及びプライマー（３ａ）は、それぞれ、ＷＡＹ２−Ｓ領域及びＷＡＹ３−Ｓ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ２−Ｓ領域及びＷＡＹ３−Ｓ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００１７】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとしては、前記のプライマー（１ａ）、プライマー（２ａ）、及びプライマー（３ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（１ｂ）、前記プライマー（２ｂ）、及び前記プライマー（３ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（１ｂ）、プライマー（２ｂ）、及びプライマー（３ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。
【００１８】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとして用いるプライマー（４ａ）は、ＷＡＹ２−ＡＳ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に、第２プライマーとして用いるプライマー（５ａ）は、ＷＡＹ３−ＡＳ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含み、プライマー（６ａ）は、ＷＡＹ４−ＡＳ領域（３０塩基）に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第１プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、３５塩基より多いと、ワサビ以外のミロシナーゼの遺伝子とハイブリダイズすることがあるからである。
【００１９】
プライマー（４ａ）においては、ＷＡＹ２−ＡＳ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ２−ＡＳ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（４ａ）の３’末端側は、ＷＡＹ２−ＡＳ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、ＷＡＹ２−ＡＳ領域の３’末端に隣接する配列番号１４の塩基配列の１〜５塩基を含むことができる。
【００２０】
同様に、プライマー（５ａ）及びプライマー（６ａ）は、それぞれ、ＷＡＹ３−ＡＳ領域及びＷＡＹ４−ＡＳ領域に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ３−ＡＳ領域及びＷＡＹ４−ＡＳ領域に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００２１】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとしては、前記のプライマー（４ａ）、プライマー（５ａ）、及びプライマー（６ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（４ｂ）、前記プライマー（５ｂ）、及び前記プライマー（６ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（４ｂ）、プライマー（５ｂ）、及びプライマー（６ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。
【００２２】
本発明のプライマーセットの第１プライマー及び各第２プライマーの長さは、特に限定されないが、それぞれ１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであること好ましく、より好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。
【００２３】
また、配列番号１〜８に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、ワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプライマーは、これらの混合塩基を含むディジェネレイテッドプライマーでもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一の配列からなるプライマーでもよい。
【００２４】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプライマーセットのＤＮＡプライマーのＴｍは、６０〜６８、好ましくは、６５〜６８であることが望ましい。なお、前記Ｔｍを計算する方法は、いくつかの方法が提案されているが、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、下記の式（Ｉ）：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ） （Ｉ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。この式で［Ｎａ＋］＝５０ｍＭで計算すると、１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］は、およそ２１．５９７０９８となりＴｍ値を計算することができる。また、鎖長が１８ヌクレオチドより短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
【００２５】
前記第１プライマー及び第２プライマーは公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン化又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。例えば、各塩基がビオチン化又は発光物質により標識されていてもよい。また、５’末端が公知の任意の態様で修飾されていてもよい。例えば、標識したプライマーを用いることにより、ＴａｑＭａｎ法などのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子の定量を行なうことが可能となる。本発明による前記の第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。
【００２６】
前記第１プライマーと第２プライマーの組み合わせは、ワサビのミロシナーゼを特異的に検出可能な組み合わせであれば、特に限定されない。例えば、第１プライマーとして前記プライマー（１ａ）及び／又はプライマー（１ｂ）を選択した場合は、第２プライマーとしてプライマー（４ａ）及び／又はプライマー（４ｂ）、プライマー（５ａ）及び／又はプライマー（５ｂ）、又はプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）を使用することができる。第１プライマーとして前記プライマー（２ａ）及び／又はプライマー（２ｂ）を選択した場合は、第２プライマーとしてプライマー（５ａ）及び／又はプライマー（５ｂ）、又はプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）を使用することができる。第１プライマーとして前記プライマー（３ａ）及び／又はプライマー（３ｂ）を選択した場合は、第２プライマーとしてプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）を使用することができる。好まししいプライマーの組み合わせは、第１プライマーがプライマー（２ａ）及び／又はプライマー（２ｂ）であり、第２プライマーがプライマー（６ａ）及び／又はプライマー（６ｂ）の組み合わせである。更に、好ましくは第１プライマーが、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２プライマーが配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。また、第１プライマー及び第２プライマーは、１種のプライマーを用いてもよいし、２種以上のプライマー、例えば、プライマー（２ａ）及びプライマー（２ｂ）を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本発明のプローブは、ワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドである。本発明のプローブには、ＰＣＲに用いる前記第１プライマー及び第２プライマーも含まれる。更に、ＤＮＡプローブのみではなくＲＮＡプローブも含まれる。
【００２８】
本発明のプローブは、（Ａ）配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基、最も好ましくは２０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、Ａプローブと称する）であるか、又は（Ｂ）前記配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは１５ヌクレオチド部分、最も好ましくは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、Ｂプローブと称する）である。
【００２９】
本発明のＡプローブは、１０塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションができず、特異性が低くなるためプローブとして有用でない。それぞれのプローブは、少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むため、例えば、その配列番号で表される塩基配列から選択される任意の連続する１０〜３０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることができる。更に、それぞれのプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外に５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、ＷＡＹ１−Ｓ領域に由来しない塩基配列）が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。付加される塩基配列は、例えば、タグとして検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列でもよい。また、プローブに含まれるオリゴヌクレオチド分の５’末端が、それぞれの配列番号で表された塩基配列の５’末端に位置する場合、又はオリゴヌクレオチド分の３’末端が、それぞれの配列番号で表された塩基配列の３’末端に位置する場合は、それぞれの配列番号で表された塩基配列に隣接する配列番号１４で表される塩基配列が付加されたものでもよい。しかしながら、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外のミロシナーゼをコードする塩基配列が付加される場合は、塩基配列の長さは５ｍｅｒ以下であることが好ましい。５ｍｅｒより長い場合は、ワサビ以外のアブラナ科のミロシナーゼと相同性の高い塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むことになるため、ワサビ以外のミロシナーゼをコードするＤＮＡとハイブリダイズする可能性が高くなり、特異性が低下するためである。また、配列番号１〜８に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、ワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプローブは、これらの混合塩基を含むプローブの混合物でもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一のプローブでもよい。
【００３０】
本発明のＢプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドを含む。１０ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プローブとして機能しなくなるからである。
【００３１】
本発明のプローブの長さの上限は特に制限されないが、３５ｍｅｒ以下、より好ましくは３０ｍｅｒ以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。３５ｍｅｒを超える場合は、ワサビのミロシナーゼに特異的でない塩基配列を含むことになり、プローブとしての特異性が低くなるからである。
【００３２】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプローブのＴｍは、３００〜６８、好ましくは、４５〜６８、より好ましくは、６０〜６８であることが望ましい。
【００３３】
本発明のプローブの標識は特に限定されず、公知の方法で標識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることができる。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。
【００３４】
本発明によるワサビの検出方法は、例えば、ワサビの植物体の品種を同定する方法、及びワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法を意味する。ワサビ（学名Ｅｕｔｒｅｍａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の品種としては、例えば、真妻、ふじだるま、もちだるま、半原（緑茎種）、半原（赤茎種）、三宝、加茂自交−１３、高光、山崎だるま、豊科在来の一種、信州新町在来の一種、伊豆在来の一種を挙げることができる。
【００３５】
ワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法は、例えば、ワサビの根茎をすりつぶした部分を含む加工食品、例えば、練りワサビや粉ワサビの原料にワサビが含まれているか否かを検出することができる。
【００３６】
本発明のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、ワサビの検出方法（以下、プライマーセット検出方法と称することがある）によって、ワサビのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３７】
本発明のプローブと被検試料を接触させ、プローブに担持した標識からの信号を検出することを特徴とするワサビの検出方法（以下、プローブ検出方法と称することがある）により、ワサビのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３８】
本発明の前記プライマーセット検出方法及びプローブ検出方法で用いる「被検試料」は、ワサビのミロシナーゼをコードしている塩基配列からなる遺伝子を含有している可能性のあるものであれば特に限定されない。ここで遺伝子とは、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ等を挙げることができる。そのため、具体的には「被検試料」はワサビの入っている可能性のある加工食品、例えば、ねりワサビ、粉ワサビなどがある。このような加工食品を液状にしたものや、加工食品から核酸を抽出した核酸溶液も含まれる。また、ワサビの品種を確認する場合は、植物体を構成する細胞を含む分散液や、細胞から抽出した核酸を含む溶液も被検試料となる。
【００３９】
公知の方法によりＤＮＡやＲＮＡを抽出し、被検試料として用いることが可能である。例えばゲノムＤＮＡを抽出する方法は、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。また、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いることも可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合も、公知の方法でＲＮＡを抽出することが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。
【００４０】
ｍＲＮＡは、プローブと直接ハイブリダイズさせて検出する場合は、ｍＲＮＡのまま使用することが可能である。一方、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼと被検試料を混合し、ＰＣＲ法により検出する場合は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しなければならない。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ミロシナーゼに特異的なアンチセンスプライマー、例えば、前記第２プライマーを用いることも可能であるし、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりミロシナーゼをコードする遺伝子配列を検出することができる。
【００４１】
プライマーセットを用いる本発明のプライマーセット検出方法は、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検出工程とからなる。プライマーセット検出方法においては、最初にＤＮＡ増幅工程を行うことが好ましい。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ法を用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１プライマー及び第２プライマーとともに、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することができるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程では、前記のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実施することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）を含有することができる。
【００４２】
プライマーセット検出方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、例えば（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃、約１０秒〜２分間）、（ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃、約３０秒〜３分間）、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃、約３０秒〜５分間）とからなる。
【００４３】
ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を利用する方法、電気泳動後にフィルターに移してサザンブロットハイブリッド法を行う方法、増幅したＤＮＡをそのままフィルターにブロットしてドットブロットハイブリッド法を行う方法、又は、ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用し、分子量により目的のＰＣＲ産物を検出することができる。
【００４４】
ＰＣＲを行った後に、サザンブロットハイブリッド法、ドットブロットハイブリッド法等でＰＣＲ産物を検出する場合には、プライマーに用いた以外のワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列からなる非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は、化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用いることができる。
【００４５】
本発明のプローブ検出法は、プローブと被検試料を接触させプローブからの信号を検出することにより、ワサビの検出を行う。公知の方法で抽出したＤＮＡやＲＮＡを被検試料として、ノザンブロットハイブリダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ミロシナーゼをコードするｍＲＮＡやＤＮＡの存在を解析することができる。また本発明のプローブは、慣用のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いることも可能である。
【００４６】
本発明のプローブと、ワサビの植物体、及びその類縁種の染色体とのハイブリダイゼーション条件は、前記「ストリンジェントな条件」が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件が挙げられる。
【００４７】
また、前記ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃低い温度、好ましくは、２２℃低い温度、より好ましくは、２０℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６０℃以上、好ましくは、６２℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーションを行い、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃低い温度、より好ましくは、３０℃低い温度、さらに好ましくは、２５℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行うことができる。
【００４８】
本発明のプライマーセット及びプローブを含むワサビを検出するための試薬及びキットを調製することも可能である。前記試薬やキットは、本発明のプライマーセット検出方法やプローブ検出方法により、ワサビを検出することが可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
《実施例１：ワサビのミロシナーゼのゲノムＤＮＡの検出》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
ＷＡＹ１：ＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴ ＡＧＹＴＣＣＴＣＣＧ Ｇ（配列番号１１）、
ＷＡＹ２：ＴＴＧＣＧＡＡＡＧＡ ＡＧＡＣＧＡＣＣＣＡ Ａ（配列番号１２）、及び
ＷＡＹ４：ＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣ ＡＧＴＧＡＳＧＴＣＷ Ｋ（配列番号１３）を合成した。
【００５１】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
ワサビの１０品種の真妻、ふじだるま、もちだるま、半原（緑茎種）、半原（赤茎種）、三宝、加茂自交−１３、高光、山崎だるま、豊科在来の一種、信州新町在来の一種、伊豆在来の一種、並びに他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物である西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウからゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、それぞれの植物体を、葉、茎、及び根茎に分離し、液体窒素で凍結し、−７０℃に保存した。保存したサンプルを液体窒素中で粉砕し、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、キットのプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、滅菌蒸留水５０μＬに溶解した。
【００５２】
（３）ＰＣＲによる増幅
ゲノムＤＮＡ溶解液１０μＬ（１μｇ）に１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、第１プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、及び第２プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ（ニッポンジーン社）０．５μＬを加え滅菌蒸留水で５０μＬにした。第１プライマーとしてＷＡＹ１、第２プライマーとしてＷＡＹ４の組み合わせ（ＷＡＹ１−ＷＡＹ４プライマーセット）、及び第１プライマーとしてＷＡＹ２、第２プライマーとしてＷＡＹ４の組み合わせ（ＷＡＹ２−ＷＡＹ４プライマーセット）で反応液を作成した。この反応液を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＴＰ６００（ＴＡＫＡＲＡ）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃で２分保持し、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング４０℃又は６０℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返した。３０サイクル終了後７２℃で１．５分間保持し、４℃に冷却した。
【００５３】
（４）ＰＣＲ産物の解析
ＰＣＲ反応終了した溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。ＷＡＹ１からＷＡ３のプライマーに対応するゲノムＤＮＡにイントロンが存在しない場合は、ＷＡＹ１−ＷＡＹ４プライマーセットによって４４７ｂｐのサイズのＰＣＲ産物が、ＷＡＹ２−ＷＡＹ４プライマーセットによって３４９ｂｐのサイズのＰＣＲ産物が増幅されるはずである。図２に示すように、ＷＡＹ２−ＷＡＹ４プライマーセットを用いた場合、アニーリング温度が４０℃及び６０℃のいずれのＰＣＲプロファイルを用いた場合も、ワサビの１０種類の品種から抽出したＤＮＡから、予測される約３５０ｂｐの位置にＰＣＲ産物を確認することができた。一方、西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウから抽出したＤＮＡを用いた場合は、３５０ｂｐのＰＣＲ産物を確認することはできなかった。また、ＷＡＹ１−ＷＡＹ４プライマーセットを用いたＰＣＲでは、ワサビの１０種類の品種から抽出したゲノムＤＮＡから、予測される４４７ｂｐのＰＣＲ産物は得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のプライマーセット及びプローブを用いたワサビの検出方法は、加工ワサビ食品にワサビの含有の有無を高感度に検出することが可能である。またワサビの品種の同定に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＰＣＲによる、ワサビ及び西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウのゲノムＤＮＡからミロシナーゼ遺伝子を検出したアガロース電気泳動像である。それぞれのレーンは、もちだるま（１）、半原（緑茎種）（２）、半原（赤茎種）（３）、三宝（４）、豊科在来の一種（５）、信州新町在来の一種（６）、加茂自交−１３（７）、高光（８）、伊豆在来の一種（９）、山崎だるま（１０）、西洋ワサビ赤芽（１１）、西洋ワサビ青芽（１２）、カイワレダイコン（１３）、ホウレンソウ（１４）、及びトウミョウ（１５）を示す。ＡはＷＡＹ１とＷＡＹ３のプライマーの組み合わせ、ＢはＷＡＹ２とＷＡＹ３のプライマーの組み合わせを示し、４０はアニーリング温度が４０℃、６０はアニーリング温度が６０℃でＰＣＲを行ったことを示す。ＭはＤＮＡマーカー（Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｈｉ−ＬｏＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ５０ｂｐ−１０，０００ｂｐ：株式会社アベテック）を表している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（１ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー(１ａ)；
（１ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ｂ）；
（２ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）；
（２ｂ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）；
（３ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）；及び
（３ｂ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ｂ）；
からなる群から選択される第１プライマーと、
（Ｂ）（４ａ）配列番号６で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）；
（４ｂ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）；
（５ａ）配列番号７で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ａ）；
（５ｂ）配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ｂ）；
（６ａ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ａ）；及び
（６ｂ）配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ｂ）；
からなる群から選択される第２プライマーとの組み合わせからなり、
前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（１ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（１ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（４ａ）、前記ＤＮＡプライマー（４ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、
前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（２ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（２ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、そして、
前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（３ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（３ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であることを特徴とする、ワサビの検出用プライマーセット。
【請求項２】
前記第１プライマーが、
（Ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーであり、
前記第２プライマーが、
（Ｂ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記第１プライマーが、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、ワサビの検出方法。
【請求項５】
（Ａ）配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は
（Ｂ）前記配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とする、ワサビの検出用プローブ。
【請求項６】
請求項５に記載のプローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、ワサビの検出方法。
【請求項１】
（Ａ）（１ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー(１ａ)；
（１ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ｂ）；
（２ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）；
（２ｂ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）；
（３ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）；及び
（３ｂ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ｂ）；
からなる群から選択される第１プライマーと、
（Ｂ）（４ａ）配列番号６で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）；
（４ｂ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）；
（５ａ）配列番号７で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ａ）；
（５ｂ）配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（５ｂ）；
（６ａ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ａ）；及び
（６ｂ）配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（６ｂ）；
からなる群から選択される第２プライマーとの組み合わせからなり、
前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（１ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（１ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（４ａ）、前記ＤＮＡプライマー（４ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、
前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（２ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（２ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（５ａ）、前記ＤＮＡプライマー（５ｂ）、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であり、そして、
前記第１プライマーが、前記ＤＮＡプライマー（３ａ）又は前記ＤＮＡプライマー（３ｂ）である場合には、前記第２プライマーは、前記ＤＮＡプライマー（６ａ）、又は前記ＤＮＡプライマー（６ｂ）であることを特徴とする、ワサビの検出用プライマーセット。
【請求項２】
前記第１プライマーが、
（Ａ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーであり、
前記第２プライマーが、
（Ｂ）配列番号８で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー、又は配列番号８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマーである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記第１プライマーが、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、ワサビの検出方法。
【請求項５】
（Ａ）配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は
（Ｂ）前記配列番号１〜８で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とする、ワサビの検出用プローブ。
【請求項６】
請求項５に記載のプローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、ワサビの検出方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−２０９２８７（Ｐ２００７−２０９２８７Ａ）
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４４７７（Ｐ２００６−３４４７７）
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【出願人】（０００１１６２９７）ヱスビー食品株式会社 (40)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【出願人】（０００１１６２９７）ヱスビー食品株式会社 (40)
【Ｆターム（参考）】
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