一塩基多型を検出する方法および試薬キット
【課題】より信頼性のある検出結果を得ることができるＳＮＰの検出方法、およびＳＮＰを検出するための試薬キットを提供する。
【解決手段】ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法であって、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであるので、偽陽性の発生を抑制することができ、より信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【解決手段】ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法であって、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであるので、偽陽性の発生を抑制することができ、より信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、信頼性のある検出結果を得ることができる一塩基多型を検出する方法、および一塩基多型を検出するための試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；以下「ＳＮＰ」と表記する。）の検出には、リアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法等の核酸を増幅する方法が用いられている。リアルタイムＰＣＲ法は、例えば、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光標識プローブや、目的とするＰＣＲ産物に特異的に結合する蛍光標識プローブを用いて、リアルタイムに核酸の増幅を確認する方法であり、主にTaq Man（登録商標）法およびSYBR（登録商標） Green法が知られている。
【０００３】
これら２つの方法では、信頼性のあるＳＮＰの検出結果を得るために、ＰＣＲの最中においてプライマーを検出対象のＳＮＰが存在するテンプレートに如何に特異的に結合させるかが鍵となる。このため、プライマーの設計ソフトを使用して、ある程度適正なプライマーを一旦設計した後、アレル特異性が最も高くなるようにプライマーの配列やＰＣＲの条件を厳密に最適化することが必要とされる。さらに、このような最適化は、個々のテンプレートについて実施しなければならない。このため、これらの方法を実施する際には、大変な労力を伴う。
【０００４】
そこで、本発明者らは、より簡便に信頼性のあるＳＮＰの検出結果が得られる独自のＰＣＲ法を開発している（特許文献１）。このＰＣＲ法は、５’末端にシトシンバルジ構造を含むヘアピン構造を有するプライマー（以下、「ヘアピンプライマー」と表記する。）を用い、シトシンバルジ構造に結合すると蛍光強度が増大する蛍光分子を共存させてＰＣＲを実施するというＰＣＲ法に、ヘアピンプライマーと競合するコンペティタープライマーを組み合わせた方法である（以下、“コンペティティブヘアピンプライマー法（Competitive Hairpin Primer method:ＣＨＰ法）”と表記する。）。
【０００５】
図５を参照して、このＣＨＰ法の原理をより詳細に説明する。図５の（ａ）に示すように、テンプレート１上に存在するＳＮＰの位置の塩基（Ａ）を、ＣＨＰ法により検出する場合を例に挙げる。なお、野生型のテンプレート４は、図５の（ｄ）に示すように、塩基（Ｇ）である。
【０００６】
まず、図５の（ａ）に示すように、ヘアピンプライマー１１は、テンプレート１に対して相補的な配列と、ヘアピン構造とを備えている。ヘアピンプライマーの３’末端の塩基は、テンプレート１上に存在する検出対象のＳＮＰの位置の塩基（Ａ）と相補的な塩基（Ｔ）になるように設計されている。
【０００７】
一方、コンペティタープライマー１２は、３’末端を除いて、テンプレート１に対して相補的な配列と同一の配列を備えている。コンペティタープライマー１２の３’末端の塩基は、ＳＮＰの位置の塩基と相補的ではなく、図５の（ｄ）に示すように、野生型のテンプレート４の３’末端の塩基（Ｇ）と相補的な塩基（Ｃ）になるように設計されている。すなわち、コンペティタープライマー１２は、ヘアピンプライマー１１と比べて、ヘアピン構造を備えておらず、３’末端の塩基配列が異なるため、テンプレート１に対して相補的な塩基の数が１つ少ない。
【０００８】
ＳＮＰの位置に変異が存在するテンプレート１を用いてＣＨＰ法を実施すると、蛍光分子２０を含むヘアピンプライマー１１がテンプレート１に優先的に結合する。なぜなら、ヘアピンプライマー１１は、テンプレート１と完全に相補的であるため、コンペティタープライマー１２と比べて、テンプレート１に対するアフェニティーが強いからである。次いで、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。
【０００９】
その後、図５の（ｂ）に示すように、図５の（ａ）で合成された一本鎖ＤＮＡ２にリバースプライマー１３が結合し、破線方向、つまり図５の（ａ）と逆方向に相補鎖が合成される。
【００１０】
図５の（ａ）、（ｂ）のようにＰＣＲが進行し、二本鎖ＤＮＡ３が生じた結果、図５の（ｃ）に示すようにフォワード側のヘアピンプライマー１１が形成していたヘアピン構造が伸長され、ヘアピン構造中に存在するシトシンバルジ構造が消失する。これによって、バルジ構造に結合していた蛍光分子２０が解放されるため、蛍光強度は低下する。蛍光分子２０の蛍光強度の低下は、ヘアピンプライマー１１の量と減少と相関しており、ヘアピンプライマー１１は目的の二本鎖ＤＮＡ３の増幅によって減少する。よって、蛍光強度の減少を判定すれば、二本鎖ＤＮＡ３が増幅されたことを確認することができる。このようにして、ＳＮＰを検出することができる。
【００１１】
これに対し、図５の（ｄ）に示すように、野生型のテンプレート（ＳＮＰの位置に変異が存在しないテンプレート）４を用いてＣＨＰ法を実施すると、コンペティタープライマー１２が、野生型のテンプレート４に優先的に結合する。その結果、図５の（ｅ）,（ｆ）に示すように、ＰＣＲが進行し、二本鎖ＤＮＡ３とは別の二本鎖ＤＮＡ５が増幅されたとしても、ヘアピンプライマー１１が消費されないため、蛍光分子２０の蛍光強度は低下しない。
【００１２】
このようにＣＨＰ法によれば、ＳＮＰの位置に変異が存在するテンプレート（検出対象）に対してはヘアピンプライマーが優先的に使用され、ＳＮＰの位置に変異が存在しないテンプレート（野生型、非検出対象）に対してはコンペティタープライマーが優先的に使用される。このため、非検出対象のテンプレートの増幅に、ヘアピンプライマーが用いられることを防ぐことができる。また、コンペティタープライマーによって非検出対象のテンプレートが増幅されたとしても、蛍光分子の蛍光強度をモニタリングしていれば、この増幅は検出されない。これにより、偽陽性（false positive）の発生を防ぐことができる。よって、ヘアピンプライマーのアレル特異性を厳密に最適化しなくても、信頼性のあるＳＮＰの検出を簡便に実施することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第2008/026582号パンフレット（２００８年３月６日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、特許文献１に開示の技術によれば、信頼性のあるＳＮＰの検出を簡便に実施することができる。しかしながら、ＳＮＰの検出技術の向上は、患者のベッドサイド等において最適な治療法および投薬法等を診断するテーラーメード医療の発展につながり、有力なＰＯＣ（Point Of Care）技術がもたらされる。このため、ＳＮＰの検出方法については一層の検出感度の向上が望まれている。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、より信頼性のある検出結果を得ることができるＳＮＰの検出方法、およびＳＮＰを検出するための試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行なった。その結果、ＣＨＰ法において、コンペティタープライマーを５’末端側にわずか１塩基長くすることにより、偽陽性の発生を顕著に抑制できること、すなわち、ヘアピンプライマーのアレル特異性を顕著に向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法であって、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含し、試料核酸には、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれ、ヘアピンプライマーは、試料核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、コンペティタープライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、（１）ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、（２）ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に１塩基〜３塩基長くなるように設計されたものであることが好ましい。
【００１９】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、バルジ構造は、シトシンバルジ構造であることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、バルジ構造結合分子は、ナフチリジン環を有する化合物であることが好ましい。このナフチリジン環を有する化合物は、下記式（１）
【００２１】
【化１】
【００２２】
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であることが好ましい。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基または第３級アミン残基を示すものである。２，７−ジアミノナフチリジン誘導体は、下記式（２）
【００２３】
【化２】
【００２４】
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンであることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、測定工程は、バルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことが好ましい。
【００２６】
また、本発明に係る、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸を含む試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出するための試薬キットは、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、およびコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含し、ヘアピンプライマーは、試料核酸に対して相補的な領域、および領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、コンペティタープライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、（１）ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、（２）ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法および試薬キットによれば、偽陽性の発生を抑制することができる。それ故、本発明に係るＳＮＰを検出する方法および試薬キットは、より信頼性の高い検出結果を得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】テンプレートＧ、テンプレートＴ、ＨＰ−Ｃ、ＣＰ−Ａ１、およびＣＰ−Ａを示す模式図である。
【図２】各実施例および各比較例におけるＰＣＲサイクルの回数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を比較した結果を示す図であり、（ａ）は実施例１，２および比較例１の結果を示す図であり、（ｂ）は実施例３，４および比較例２の結果を示す図であり、（ｃ）は実施例５，６および比較例３の結果を示す図であり、（ｄ）は実施例７，８および比較例４の結果を示す図である。
【図３】実施例１，３，５，７におけるＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図であり、（ａ）は実施例１の結果を示す図であり、（ｂ）は実施例３の結果を示す図であり、（ｃ）は実施例５の結果を示す図であり、（ｄ）は実施例７の結果を示す図である。
【図４】各実施例および各比較例におけるＰＣＲサイクルの回数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を比較した結果を示す図であり、（ａ）は実施例９，１０および比較例５，６の結果を示す図であり、（ｂ）は実施例１１，１２および比較例７，８の結果を示す図であり、（ｃ）は実施例１３，１４および比較例９，１０の結果を示す図である。
【図５】従来のＣＨＰ法の原理を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
〔１．本発明に係るＳＮＰを検出する方法〕
本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法である。この方法は、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含していればよい。試料核酸には、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれる。
【００３０】
ヘアピンプライマーは、試料核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものである。一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。
【００３１】
コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものである。コンペティタープライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。
【００３２】
（１）ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であってもよい。あるいは、（２）ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であってもよい。
【００３３】
本明細書において「プライマーセット」は、核酸増幅反応によって増幅される核酸の領域を挟む関係にあるプライマーの組（所謂、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組）を意味する。従って、ヘアピンプライマーを含むプライマーセットは、ヘアピンプライマーがフォワードプライマーおよびリバースプライマーの何れか一方であればよく、他方のプライマーは任意のプライマーであればよい。同様に、コンペティタープライマーを含むプライマーセットも、コンペティタープライマーがフォワードプライマーおよびリバースプライマーの何れか一方であればよく、他方のプライマーは任意のプライマーであればよい。
【００３４】
ただし、ヘアピンプライマーとコンペティタープライマーとは競合するため、例えば、ヘアピンプライマーがフォワードプライマーである場合、コンペティタープライマーもフォワードプライマーであることが好ましい。同様に、ヘアピンプライマーがリバースプライマーである場合、コンペティタープライマーもリバースプライマーであることが好ましい。また、ヘアピンプライマーを含むプライマーセットにおける任意のプライマーと、コンペティタープライマーを含むプライマーセットにおける任意のプライマーとは、同一のプライマーであってもよいし、異なるプライマーであってもよい。
【００３５】
本明細書において「試料核酸」は、ホモ接合体に由来する核酸（すなわち、野生型核酸または変異型核酸の何れか一方を含む核酸）であってもよいし、ヘテロ接合体に由来する核酸（すなわち、野生型核酸および変異型核酸の両方を含む核酸）であってもよい。試料核酸は、生物学的材料から単離されたものであってもよい。生物学的材料としては、例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便および腹水等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器および骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器および骨等を洗浄した後の洗浄液、ウイルス、植物、ならびに微生物が挙げられる。
【００３６】
本明細書において「野生型核酸」とは、ＳＮＰの位置に高い頻度で現れる塩基を有する核酸をいい、「変異型核酸」とは、ＳＮＰの位置に低い頻度で現れる塩基を有する核酸をいう。野生型核酸と変異型核酸とは、ＳＮＰの位置における塩基が異なる点を除いて、同一の塩基配列を有する核酸である。
【００３７】
本明細書において「核酸」は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ等が挙げられる。ＲＮＡをテンプレートとして使用する場合、本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程を含むことが好ましい。
【００３８】
本明細書において「核酸増幅反応」は、核酸を増幅することができる反応のことをいい、例えば、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ等のＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。特に、ＰＣＲは核酸増幅反応の中でも簡便に行なうことができるため、試料核酸の増幅から、増幅の確認までを迅速かつ簡便に行なうことができる。核酸増幅反応は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、反応条件は、用いる試料やプライマー等に応じて適宜設定すればよい。
【００３９】
以下、ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合を例に挙げて、本発明に係るＳＮＰを検出する方法に使用されるヘアピンプライマー、コンペティタープライマー、バルジ構造結合分子および測定工程について詳細に説明する。なお、これら以外の具体的な材料、条件、工程、ならびに使用する機器および装置等は特に限定されるものではなく、従来公知の方法等を好適に利用可能であり、何ら限定されるものではない。
【００４０】
＜１−１．ヘアピンプライマーおよびコンペティタープライマー＞
ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合、このヘアピンプライマーは、変異型核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるプライマーである。ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。
【００４１】
また、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものである。コンペティタープライマーの３’末端の位置は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とするため、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である。
【００４２】
このように、ヘアピンプライマーでは、その３’末端は、変異型核酸のＳＮＰの位置における塩基に相補的な塩基であり、ヘアピンプライマーの一本鎖ＤＮＡ断片（ヘアピン構造）以外の部分は、変異型核酸と完全に相補的になるように設計されている。
【００４３】
一方、コンペティタープライマーでは、その３’末端は、野生型核酸のＳＮＰの位置における塩基に相補的な塩基であり、３’末端以外は野生型核酸または変異型核酸に対して相補的な塩基配列である。すなわち、コンペティタープライマーは、野生型核酸と完全に相補的になるように設計されている。
【００４４】
さらに、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域よりも５’末端側に長くなっている。すなわち、従来のＣＨＰ法に使用されるコンペティタープライマーの塩基配列は、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域の塩基配列と同数であるのに対し、本発明に係るＳＮＰを検出する方法に使用されるコンペティタープライマーは、５’末端側に長くなっているという特徴がある。
【００４５】
従来のＣＨＰ法では、例えば、変異型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合、野生型核酸における、検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基を３’末端に備えたコンペティタープライマーが優先して野生型核酸に結合して、ヘアピンプライマーが野生型核酸の増幅に利用されないと考えていた。しかし、コンペティタープライマーとヘアピンプライマーとにおいて、テンプレートと相補的な配列の塩基数が同じである場合は、ＰＣＲのサイクル数が増加するにつれ、ヘアピンプライマーもわずかながら野生型核酸の増幅に利用されてしまうことに本発明者らは気付いた。この場合は、偽陽性を検出してしまう。そこで、検出結果の信頼性を高めるべく、鋭意検討した結果、本願の実施例に示すように、コンペティタープライマーの５’末端側に数塩基伸長させることで、ヘアピンプライマーの意図していない利用を顕著に抑制できることを実証した。
【００４６】
一般的に、ＰＣＲ法においてその精度を高めるためには、３’末端の塩基をＡやＴではなくＧやＣにするというように３’末端の構造を工夫するのが技術常識である。しかし、本発明者らは、プライマーの５’末端側において、少なくとも一塩基伸長させることにより、劇的に偽陽性の発生を防ぐことができることを見出した。それ故、本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、従来のＣＨＰ法を用いたＳＮＰを検出する方法よりも、検出結果の信頼性をより劇的に向上させることができる。
【００４７】
コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に１塩基〜３塩基だけ長くなるように設計されたものであることが好ましい。このようなコンペティタープライマーは、合成コストがかからずに簡便に作製することができるため、本発明に係るＳＮＰを検出する方法をより安価に実施することができる。
【００４８】
以下では、このようなヘアピンプライマーおよびコンペティタープライマー等の構成について、図１を用いてより具体的に説明する。図１は、テンプレートＧ（変異型核酸）、テンプレートＴ（野生型核酸）、ＨＰ−Ｃ（ヘアピンプライマー）、ＣＰ−Ａ１（コンペティタープライマー）、およびＣＰ−Ａ（従来のＣＨＰ法に使用されるコンペティタープライマー）を示す模式図である。
【００４９】
図１に示すように、ＨＰ−ＣはテンプレートＧに相補的な領域３０およびヘアピン構造（一本鎖ＤＮＡ断片）４０からなるプライマーであり、その３’末端はテンプレートＧのＳＮＰの位置の塩基Ｇに相補的なＣである。すなわち、ＨＰ−ＣはテンプレートＧと完全に相補的である。
【００５０】
一方、ＣＰ−Ａ１は、テンプレートＴに相補的な領域３２からなるプライマーであり、その３’末端は、テンプレートＴのＳＮＰの位置の塩基Ｔに相補的なＡである。さらに、ＣＰ−Ａ１は、ＨＰ−Ｃの領域３０よりも５’末端側に１塩基Ａだけ長くなっている。また、ＣＰ−Ａは、テンプレートＴに相補的な領域３１からなるプライマーであり、ＣＰ−Ａ１における５’末端側に伸長されたＡが存在しない。
【００５１】
従って、ＣＰ−Ａ１もＣＰ−Ａも、テンプレートＴに対して完全に相補的な塩基配列であるが、ＣＰ−Ａ１はＣＰ−Ａよりも５’末端側に長い。ＨＰ−ＣはテンプレートＴに結合することなく、テンプレートＧにより優先的に結合するので、テンプレートＴからの核酸の非特異的な増幅を防ぐとともに、テンプレートＧからの核酸の特異的な増幅を実現することができる。
【００５２】
ヘアピンプライマーおよびコンペティタープライマーの作製方法としては、特に限定されず、国際公開第2008/026582号パンフレットに開示の方法等の従来公知の方法が挙げられる。
【００５３】
以下では、ヘアピンプライマーに含まれる一本鎖ＤＮＡ断片について説明する。この一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであればよい。より具体的には、一本鎖ＤＮＡ断片が有するヘアピン構造は、一本鎖のＤＮＡが分子内で対合して、ＤＮＡの弧状領域および二本鎖領域が形成されることによりなる。バルジ構造は、形成された二本鎖領域中に存在する。
【００５４】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するヘアピン構造を構成する塩基の数は、ＤＮＡの弧状領域および二本鎖領域を形成し、さらにこの二本鎖領域中にバルジ構造を有する限り、限定されるものではないが、２４〜３３であることが好ましく、さらに好ましくは２４〜２８である。２４以上であれば、ＤＮＡの弧状領域、二本鎖領域およびバルジ構造を好適に形成することができ、３３以下であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。
【００５５】
また、弧状領域のＤＮＡを構成するＤＮＡの塩基配列は、弧状領域の形成が可能である限り、特に限定されるものではないが、構成する塩基の数は、３〜７であることが好ましく、４であることがさらに好ましい。４個の塩基により弧状領域が形成される場合、その配列は、ＴＴＴＴからなる塩基配列であることが好ましい。ＴＴＴＴによる弧状領域を備えるヘアピン構造は、核酸増幅反応において良好に伸長されるからである。
【００５６】
一本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば国際公開第2008/026582号パンフレットに記載の方法に従って設計すればよい。例えばＣＣＡＡＮＮＮＮＴＴＧＧ（Ｎは任意の塩基）（配列番号１２）のように、任意の塩基配列の両端に、互いに対合可能な塩基配列を設計する。そして、ＣＣＡＡまたはＴＴＧＧ中の任意の位置にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計することにより、ＮＮＮＮが湾曲して弧状領域を形成し、ＣＣＡＡとＴＴＧＧとがハイブリダイズして二本鎖領域を形成し、バルジ塩基が含まれることでバルジ構造が形成される。
【００５７】
つまり、弧状領域を形成するＤＮＡに対応する塩基配列の両端に、互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を設計し、ハイブリダイズする領域の塩基配列にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計した塩基配列に基づいてＤＮＡ断片を合成することで本願発明に係るＤＮＡ断片を得ることができる。なお、ＤＮＡ断片の合成は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、例えば化学合成により合成すればよい。
【００５８】
なお、上の例では、一本鎖ＤＮＡ断片が、ＤＮＡの弧状領域と、バルジ構造を含む二本鎖領域とにより形成されるヘアピン構造のみからなる場合について説明した。この例のように、一本鎖ＤＮＡ断片はヘアピン構造のみからなることが最も好ましいが、ヘアピン構造の３’末端および／または５’末端に、さらなる核酸が結合されてもよい。このようなさらなる核酸を含む場合は、その塩基の数は、３’末端、５’末端のそれぞれにおいて、１〜２０であることが好ましい。この範囲であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。
【００５９】
本明細書において「バルジ構造」とは、ＤＮＡの二本鎖領域において、一方の鎖のＤＮＡに、余剰の塩基が存在するために生じるふくらみ（バルジ）をいう。例えば、ＴＣＴ部分とＡＡ部分とを有するＤＮＡ断片が折れ曲がってヘアピン構造を形成し、このＴＣＴ部分とＡＡ部分とが向かい合う位置となった場合、ＴＣＴ部分の二つのＴとＡＡ部分の二つのＡとがそれぞれ対合する。その結果、二つのＴの間に存在するＣは対合する塩基が無いため、Ｃの部分が膨らむこととなる。この膨らんだ構造がバルジ構造である。なお、この例のように余剰の塩基がＣ（シトシン）であることにより形成されるバルジ構造を、本明細書において「シトシンバルジ構造」と表記する。Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）についても同様に、「アデニンバルジ構造」、「グアニンバルジ構造」および「チミンバルジ構造」と表記する。また、本明細書において「バルジ塩基」とは、バルジ構造中の余剰の塩基をいう。
【００６０】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するバルジ構造の数は、１つのみでもよいが、複数であることが好ましく、２〜４つであることがさらに好ましい。バルジ構造を複数備えることで、後述するバルジ構造結合分子が結合可能な部位が増えるため、より高感度なヘアピンプライマーの検出が可能となる。
【００６１】
バルジ構造を複数備える場合、隣り合うバルジ塩基の間には、好ましくは３〜５つ、さらに好ましくは４つの塩基が存在することが好ましい。バルジ構造が近接しすぎると、バルジ構造結合分子がそれぞれのバルジ構造に良好に結合することが妨げられる。バルジ塩基間の間隔が広すぎると、ヘアピン構造が安定になり、ヘアピンの伸長が良好に行われない虞があるし、一本鎖ＤＮＡ断片が大きくなり、合成コストが高くなる。
【００６２】
一本鎖ＤＮＡ断片が備えるバルジ構造は、アデニンバルジ構造、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、グアニンバルジ構造のいずれでもよい。
【００６３】
チミンバルジ構造またはシトシンバルジ構造の場合、バルジ構造結合分子の１種であるナフチリジン環を有する化合物が結合すると、この化合物から発光される蛍光強度の吸収極大波長がシフトする。よって、核酸増幅反応において、シフトした吸収極大波長における蛍光が弱くなれば、核酸が増幅したことを確認できる。また、アデニンバルジ構造およびグアニンバルジ構造の場合、ナフチリジン環を有する化合物が結合すると消光し、結合していない状態で蛍光を発光する。よって、核酸増幅反応において、蛍光強度がより強くなれば核酸が増幅したことを確認できる。
【００６４】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するバルジ構造は、シトシンバルジ構造であることが好ましい。後述する２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは蛍光物質であり、シトシンバルジ構造に結合することで、蛍光の吸収極大波長がシフトし、シフトした波長において強い強度の蛍光を発光する。そのため、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを用いることで、特異的かつ高感度な核酸増幅の確認が可能となるからである。
【００６５】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するシトシンバルジ構造を形成するための塩基配列は、シトシンバルジ構造が形成される限り、限定されるものではないが、一本鎖ＤＮＡ断片中のＴＣＴ配列における二つのＴとＡＡ配列における二つのＡとが、Ｔ−Ａ塩基対で、このＤＮＡ断片の分子内で対合（分子内対合）し、ＴとＴとの間に位置するＣがバルジ塩基となることで、シトシンバルジ構造が形成されることが好ましい。ＤＮＡのＴＣＴ配列とＡＡ配列におけるＴ−Ａ塩基対の対合により形成されるシトシンバルジ構造を含むヘアピン構造は、安定であるためバルジ構造結合分子が良好に結合し、かつ、過度に安定ではないため、核酸増幅反応によるヘアピン構造の伸長が、良好に行なわれるからである。また、ナフチリジン環を有する化合物を用いた場合、得られる蛍光波長が、より長波長となるため、測定感度が向上するからである。
【００６６】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法に使用可能な、ヘアピンプライマーの塩基配列の具体例としては、配列番号４および５に示す塩基配列を挙げることができる。また、コンペティタープライマーの塩基配列の具体例としては、配列番号７、８、１０および１１に示す塩基配列を挙げることができる。
【００６７】
＜１−２．バルジ結合分子＞
本発明に係るＳＮＰを検出する方法に用いるバルジ構造結合分子は、バルジ構造に結合可能である限り限定されるものではないが、蛍光物質であって、バルジ構造と結合することで、蛍光を発光、発光する蛍光の波長がシフト、または、蛍光が消光する等、蛍光の発光状態が変化する物質を用いることが好ましい。これらの蛍光を検出することで、容易にバルジ構造を検出できるからである。なお、蛍光物質ではないバルジ構造結合分子を用いてもよく、この場合、バルジ構造結合分子を別途蛍光物質等により標識化したり、バルジ構造結合分子をアフィニティクロマトグラフィーのカラムに充填したりして用いればよい。
【００６８】
バルジ構造に結合して蛍光の発光状態が変化するバルジ構造結合分子としては、ナフチリジン環を有する化合物を挙げることができる。ナフチリジン環を有する化合物は、アデニンバルジ構造またはグアニンバルジ構造に結合すると、蛍光は消光する。また、ナフチリジン環を有する化合物は、シトシンバルジ構造またはチミンバルジ構造と結合すると、ナフチリジン環を有する化合物が発光する蛍光の吸収極大波長が、異なる波長にシフトする。このため、この消光またはシフトした吸収極大波長における蛍光の検出により、簡便にバルジ構造を検出することができる。
【００６９】
さらに、ナフチリジン環を有する化合物は、核酸増幅反応に用いるＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を阻害しない。このため、ナフチリジン環を有する化合物を混合したまま核酸増幅反応を実施することができる。よって、一つの反応容器に、核酸増幅反応液を調製し、これに予めナフチリジン環を有する化合物を混合することで、反応液の蛍光を測定し、反応液をそのまま核酸増幅反応に供して、増幅反応の前、最中または終了後に、同じ反応液の蛍光を測定することで、蛍光の変化を評価することができる。
【００７０】
従って、バルジ構造結合分子として、ナフチリジン環を有する化合物を用いることで、核酸増幅反応における核酸の増幅の確認を、簡便にリアルタイムで行なうことができる（以下、ナフチリジン環を有する化合物を「バルジ構造結合蛍光分子」と表記する）。
【００７１】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法に用いるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（１）
【００７２】
【化３】
【００７３】
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体を用いることが好ましい。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基または第３級アミン残基を示す。第１級アミン残基としては、−ＮＨ２が挙げられる。また、第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２基、および−ＮＨ（ＣＨ）２ＮＨ（ＣＨ３）基等が挙げられる。第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＮＨ２基等が挙げられる。中でも、Ｒ１およびＲ２の内、少なくとも片方が第２級アミン残基であることが好ましく、Ｒ１およびＲ２の両方が第２級アミン残基であることがさらに好ましい。バルジ構造結合蛍光分子が第２級アミン残基を備えることで、上記バルジ構造との結合がより安定するからである。
【００７４】
２，７−ジアミノナフチリジン誘導体の中でも、下記式（２）
【００７５】
【化４】
【００７６】
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンが特に好ましい。この２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、シトシンバルジ構造に結合すると、発光する蛍光の吸収極大波長がシフトし、シフトした波長において強い強度の蛍光を発光する。このため、高感度かつ特異的に、シトシンバルジ構造、ひいては核酸増幅反応に用いたヘアピンプライマーを検出することが可能となるからである。
【００７７】
２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、従来公知の方法により合成すればよく、例えば文献：特開２００４−２６２８２７号公報に記載の方法に従って合成すればよい。２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の条件下において、単独では吸収極大が３７６ｎｍで検出され、シトシンバルジ構造と結合することにより、３９６ｎｍにシフトする。
【００７８】
なお、式（１）で示されるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（３）
【００７９】
【化５】
【００８０】
で示される２−アミノ−１，８−ナフチリジン誘導体であってもよい。Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子またはアミノ基であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立して１〜６の自然数を示す。また、式（１）で示されるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（４）
【００８１】
【化６】
【００８２】
で示される２，６−ジアミノピリジン誘導体であってもよい。Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子またはアミノ基であり、ｏ、ｐはそれぞれ独立して１〜６の自然数を示す。
【００８３】
バルジ構造結合蛍光分子を用いて、ヘアピンプライマーを検出するときのｐＨ条件は、好ましくはｐＨが５以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは６．５以上である。また、このｐＨの上限は、好ましくは９以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは７．５以下である。ｐＨが５以上、９以下であれば、ＤＮＡは安定であるため、バルジ構造結合蛍光分子は良好にヘアピンプライマー中のバルジ構造に結合する。これにより蛍光の検出を良好に行なうことができる。
【００８４】
バルジ構造結合蛍光分子は、核酸増幅反応に供する反応液に、直接添加してもよいし、例えば、リン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液等の適切な緩衝液で希釈して、反応液に添加してもよい。
【００８５】
バルジ構造結合蛍光分子の使用量は、核酸増幅反応の反応液に予め加えられるヘアピンプライマー１モルに対して、２０モル〜１００モルであることが好ましく、さらに好ましくは４０モル〜６０モルである。２０モル〜１００モルであれば、十分にヘアピンプライマー中のバルジ構造に結合し、さらにバックグラウンドシグナルによる測定誤差等も生じない。
【００８６】
バルジ構造結合蛍光分子が、バルジ構造に結合したときに発光する蛍光の検出は、これを検出可能である限り限定されるものではないが、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの波長が好ましく、さらに好ましくは４３０〜４６０ｎｍである。この蛍光の蛍光強度は、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの蛍光波長において、上記２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンがバルジ構造に結合していない場合に発光する蛍光と明確に区別することができるからである。
【００８７】
以上に述べた蛍光強度の検出は、既存の蛍光プレートリーダー等、公知の方法、装置により行なえばよい。
【００８８】
＜１−３．測定工程＞
測定工程は、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する工程であればよい。
【００８９】
上記にて説明したＣＨＰ法と同様に、バルジ構造結合分子の存在下において、バルジ構造結合分子はヘアピンプライマーのバルジ構造に結合する。核酸増幅反応において、ヘアピンプライマーが変異型核酸に結合し、一本鎖の核酸が増幅される。核酸増幅反応が進行し、この一本鎖の核酸に対する相補鎖が形成されると、ヘアピンプライマーの有するバルジ構造は伸長されるため、バルジ構造に結合していたバルジ構造結合分子は遊離する。この遊離したバルジ構造結合分子の量を測定すれば、ヘアピンプライマーの量を測定することができる。このため、核酸増幅反応の任意の時点の前後における遊離したバルジ結合分子の量を比較することによって、ヘアピンプライマーの量の増減を判定することができる。この判定の結果、ヘアピンプライマーの量が減少していれば、変異型核酸が増幅されたことを確認でき、減少していなければ、変異型核酸が増幅されなかったことを確認できる。
【００９０】
試料核酸に野生型核酸が含まれていたとしても、野生型核酸に対してはヘアピンプライマーよりもコンペティタープライマーが優先的に結合するため、バルジ構造結合分子は遊離しない。コンペティタープライマーによって、野生型核酸が増幅されたとしても、遊離しているバルジ構造結合分子の量は何ら影響を受けない。このため、遊離しているバルジ構造結合分子の量を測定していれば、野生型核酸の増幅を確認することはない。このようにして、本発明に係るＳＮＰを検出する方法では、変異型核酸の増幅を特異的に確認することができる。
【００９１】
本明細書において「核酸増幅反応の任意の時点の前後におけるバルジ結合分子の量を比較する」は、特に限定されず、例えば、核酸増幅反応の前と終了時とにおけるバルジ結合分子の量を比較することであってもよいし、核酸増幅反応の最中の任意の時点の前後におけるバルジ結合分子の量を比較することであってもよい。また、核酸増幅反応中、リアルタイムでバルジ結合分子の量を検出・比較する方法を採用してもよい。
【００９２】
また、バルジ構造結合分子として上述したバルジ構造結合蛍光分子を用いる場合、測定工程は、このバルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことが好ましい。この蛍光分子から発せれる蛍光の強度を測定することによって、遊離した蛍光分子の量、ヘアピンプライマーの量を容易にかつリアルタイムで測定することができるからである。
【００９３】
以下では、バルジ構造結合分子としてバルジ構造結合蛍光分子を用い、バルジ構造としてチミンバルジ構造またはシトシンバルジ構造を用いた場合の測定工程について説明する。核酸増幅反応の前では、バルジ構造結合蛍光分子はヘアピンプライマーのバルジ構造に結合し、シフトした吸収極大波長において蛍光を発する。核酸増幅反応が進行し、ヘアピンプライマーによって変異型核酸が増幅された場合、ヘアピンプライマーのバルジ構造は伸長し、バルジ構造は消失する。これによって、バルジ構造に結合していたバルジ構造結合蛍光分子は遊離し、遊離したバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度は減少する。
【００９４】
従って、核酸増幅反応の任意の時点の前後におけるバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度が減少していれば、ヘアピンプライマーの量が減少しており、変異型核酸が増幅されたことを確認できる。一方、蛍光強度が減少していなければ、ヘアピンプライマーの量は減少しておらず、変異型核酸が増幅されなかったことを確認できる。
【００９５】
また、バルジ構造が、アデニンバルジ構造およびグアニンバルジ構造である場合、バルジ構造結合蛍光分子はバルジ構造に結合すると消光し、遊離の状態で蛍光を発光する。従って、核酸増幅反応の任意の時点の前後におけるバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度が増加していれば、ヘアピンプライマーの量が減少しており、変異型核酸が増幅されたことを確認できる。一方、蛍光強度が増加していなければ、ヘアピンプライマーの量は減少しておらず、変異型核酸が増幅されなかったことを確認できる。
【００９６】
なお、上記の説明では、ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合を例に挙げて、本発明に係るＳＮＰを検出する方法を説明したが、もちろんヘアピンプライマーによる野生型核酸の増幅も可能である。この場合、上述したヘアピンプライマーに対する事項をコンペティタープライマーに当てはめ、コンペティタープライマーに対する事項をヘアピンプライマーに当てはめればよい。
【００９７】
〔２．本発明に係る試薬キット〕
本発明に係る試薬キットは、上述した試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出するための試薬キットであって、上述したヘアピンプライマーを含むプライマーセット、および上述したコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含していればよい。
【００９８】
さらに、本発明に係る試薬キットは、上述したバルジ構造結合分子を含んでもよい。
【００９９】
また、キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ関連試薬・器具（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー、ＰＣＲ用チューブ等）、増幅核酸精製用の試薬・器具を含んでもよいし、ＤＮＡ断片を安定的に保持するための試薬や緩衝液、バルジ構造結合分子またはバルジ構造結合蛍光分子を安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。
【０１００】
上記の何れの構成であっても、核酸増幅反応によって試料核酸の増幅を行い、ＳＮＰを検出するために好ましい薬剤等が含まれている。そのため、本発明に係る試薬キットを用いることで、より信頼性のある検出結果を容易かつ迅速に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【０１０１】
本発明に係る試薬キットの提供形態は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子、その他の試薬の全てを、適切な容量および／または形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係る試薬キットには、本発明に係るＳＮＰを検出する方法の手順等を記載した説明書を含んでもよい。
【０１０２】
なお、上記の説明では、本発明を、ＳＮＰを検出する方法およびＳＮＰを検出するための試薬キットとして記載したが、ウイルスを検出する方法およびウイルスを検出するための試薬キットであってもよい。この場合、核酸増幅反応のためのテンプレートとしてウイルスの核酸を用いればよい。ウイルスの核酸がＲＮＡである場合（ウイルスがＲＮＡウイルスの場合）、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡをテンプレートとすればよい。
【０１０３】
従来のウイルスを検出する方法では、夾雑物が多い検体から得られたウイルスの核酸をテンプレートとして用いるため、夾雑物に由来する核酸が非特異的に増幅されていた。本発明に係るウイルスを検出する方法は、上述したヘアピンプライマーとコンペティタープライマーとを用いるために、目的のウイルスの核酸をヘアピンプライマーによって特異的の増幅することができる。それ故、より信頼性のあるウイルスの検出結果を得ることができる。
【０１０４】
本発明に係る方法および試薬キットに関しては、上述した以外の事項についても、国際公開第2008/026582号パンフレットに記載を適宜参酌・利用することができる。
【実施例】
【０１０５】
本発明について、実施例および比較例を用いてさらに説明する。以下の実施例および比較例においては、ＳＮＰを人工的に作製した２種類のプラスミドをテンプレートとして用い、ＰＣＲによって２種類のテンプレートから増幅された核酸の何れか一方を特異的に確認できるか否かを検証した。
【０１０６】
より具体的には、公知のプラスミドであるｐＵＣ１８（GenBank Accession Number L09136）の４６５位をＳＮＰの位置として想定して、ｐＵＣ１８における４６５位のＧをＴに変異させたプラスミドを作製した。この変異プラスミドは、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）を用いて、マニュアルに沿って作製した。
【０１０７】
このｐＵＣ１８（以下、「テンプレートＧ」と表記する。）、および４６５位がＴであるｐＵＣ１８（以下、「テンプレートＴ」と表記する。）をＰＣＲのためのテンプレートとして用いた。テンプレートＧおよびテンプレートＴの具体的な塩基配列を、配列番号１および２に示す。
【０１０８】
また、ＰＣＲのための、フォワードプライマーとしてＭ１３Ｍ３を用い、リバースプライマー（ヘアピンプライマー）としてＨＰ−Ｃ、ＨＰ−Ａ、またはＨＰ−Ａ１を用いた。ＨＰ−Ｃに対するコンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２を用いた。ＨＰ−Ａに対するコンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２を用いた。ＨＰ−Ａ１に対するコンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いた。
【０１０９】
Ｍ１３Ｍ３、ＨＰ−Ｃ、ＨＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１、ＣＰ−Ａ２、ＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１、ＣＰ−Ｃ２およびＨＰ−Ａ１の塩基配列は、以下の通りである：
Ｍ１３Ｍ３：GTTGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号３）
ＨＰ−Ｃ ：ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCAGGAAACAGCTATGAC（配列番号４）
ＨＰ−Ａ ：ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCAGGAAACAGCTATGAA（配列番号５）
ＣＰ−Ｃ ：CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号６）
ＣＰ−Ｃ１：ACAGGAAACAGCTATGAC（配列番号７）
ＣＰ−Ｃ２：CACAGGAAACAGCTATGAC（配列番号８）
ＣＰ−Ａ ：CAGGAAACAGCTATGAA（配列番号９）
ＣＰ−Ａ１：ACAGGAAACAGCTATGAA（配列番号１０）
ＣＰ−Ａ２：CACAGGAAACAGCTATGAA（配列番号１１）。
【０１１０】
ＨＰ−Ａ１：ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATACAGGAAACAGCTATGAA（配列番号１３）
Ｍ１３Ｍ３は、テンプレートＧまたはテンプレートＴの３７６位〜３９５位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。
【０１１１】
ＨＰ−Ｃは、ヘアピン構造を形成可能な塩基配列（１位〜２８位の塩基配列）と、テンプレートＧの４６５位〜４８１位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列（２９位〜４５位の塩基配列）からなるプライマーである。ＨＰ−Ｃの３’末端の位置は、テンプレートＧにおける４６５位（ＳＮＰの位置）になるように設計されている。
【０１１２】
ＣＰ−Ａは、テンプレートＴの４６５位〜４８１位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。ＣＰ−Ａ１は、テンプレートＴの４６５位〜４８２位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。ＣＰ−ＡテンプレートＴの４６５位〜４８３位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１およびＣＰ−Ａ２の３’末端の位置は、ＳＮＰの位置になるように設計されている。これらの３’末端の塩基はＡであり、テンプレートＧの４６５位のＧと相補的ではなく、テンプレートＴの４６５位のＴと相補的である。また、ＣＰ−Ａは、ＨＰ−Ｃの２９位〜４５位の塩基配列と同じ長さある一方、ＣＰ−Ａ１およびＣＰ−Ａ２はそれぞれ、ＨＰ−Ｃの２９位〜４５位の塩基配列よりも、５’末端側に１塩基および２塩基だけ長い。
【０１１３】
以上のような塩基配列であるため、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２とを組み合わせてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−ＣはテンプレートＧに優先的に結合し、ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２はテンプレートＴに優先的に結合する。
【０１１４】
ＨＰ−Ａは、その３’末端がテンプレートＴの４６５位のＴと相補的な塩基Ａになっている点を除いて、ＨＰ−Ｃと同様である。ＨＰ−Ａ１も、その３’末端がテンプレートＴの４６５位のＴと相補的な塩基Ａになっている。また、ＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１およびＣＰ−Ｃ２は、それらの３’末端がテンプレートＧの４６５位のＧと相補的な塩基Ｃになっている点を除いて、それぞれ、ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１およびＣＰ−Ａ２と同様である。このため、ＨＰ−ＡとＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２とを組み合わせてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−ＡはテンプレートＴに優先的に結合し、ＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２はテンプレートＧに優先的に結合する。同様に、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２とを組み合わせてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−Ａ１はテンプレートＴに優先的に結合し、ＣＰ−Ｃ２はテンプレートＧに優先的に結合する。
【０１１５】
表１に、実施例および比較例において使用した、テンプレートおよびプライマーの組合せを示す。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
以下の実施例１〜１２，比較例１〜８では、試料核酸がホモ接合体に由来する核酸である場合を想定し、ＰＣＲのためのテンプレートとしてテンプレートＧまたはテンプレートＴの何れか一方を用いた。そして、用いたテンプレートから特異的に増幅された核酸を確認できるか否かを検証した。
【０１１８】
また、実施例１３，１４および比較例９，１０では、試料核酸がヘテロ接合体に由来する核酸である場合を想定し、ＰＣＲのためのテンプレートとしてテンプレートＧおよびテンプレートＴの両方を含む混合物を用いた。そして、用いた混合物中のテンプレートのどちらか一方から増幅された核酸を特異的に確認できるか否かについて検証した。
【０１１９】
＜試料核酸がホモ接合体に由来する核酸である場合＞
〔実施例１〕
本実施例におけるＰＣＲには、テンプレートとしてテンプレートＧ、リバースプライマーとしてＨＰ−Ｃ、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ１、フォワードプライマーとしてＭ１３Ｍ３を用いた。
【０１２０】
ＰＣＲのための反応液を全量が４０μＬとなるように調製した。具体的には、テンプレート（４ｎｇ）、フォワードプライマー（終濃度０．５μＭ）、リバースプライマー（終濃度０．５μＭ）、コンペティタープライマー（終濃度０．５μＭ）、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）（２０μＬ）、バルジ構造結合蛍光分子（終濃度２０μＭ）、および反応液の全量が４０μＬになるような量のＨ２Ｏを混合して、反応液を調製した。バルジ構造結合蛍光分子として、式（２）で表される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを用いた。
【０１２１】
ＰＣＲは、まず９５℃で２分間加温した後、９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間のサイクルを繰り返すことによって実施した。
【０１２２】
ＰＣＲに供する前に、調製した反応液の蛍光強度を測定し、次にこの反応液をそのままＰＣＲに供し、その後、５サイクル毎に、反応液の蛍光強度を測定した。ＰＣＲは、４０サイクルまで行なった。蛍光強度の測定は、蛍光プレートリーダー（ベルトールドテクノロジー社製 Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０）を用いて、励起波長４００ｎｍおよび蛍光検出波長４５０ｎｍの条件にて行った。
【０１２３】
このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ａ）において「１」の凡例で示す。なお、図２の（ａ）において、縦軸は相対蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数を表す。
【０１２４】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ａ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、および各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１２５】
〔実施例２〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ２を用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ａ）において「２」の凡例で示す。
【０１２６】
〔実施例３〕
テンプレートとしてテンプレートＴを用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｂ）において「３」の凡例で示す。
【０１２７】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ｂ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１２８】
〔実施例４〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ２を用いたこと以外は、実施例３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｂ）において「４」の凡例で示す。
【０１２９】
〔実施例５〕
テンプレートとしてテンプレートＴ、ヘアピンプライマーとしてＨＰ−Ａ、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ１を用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｃ）において「５」の凡例で示す。
【０１３０】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ｃ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１３１】
〔実施例６〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例５と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｃ）において「６」の凡例で示す。
【０１３２】
〔実施例７〕
テンプレートとしてテンプレートＧを用いたこと以外は、実施例５と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｄ）において「７」の凡例で示す。
【０１３３】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ｄ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１３４】
〔実施例８〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例７と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｄ）において「８」の凡例で示す。
【０１３５】
〔実施例９〕
実施例１と同様の条件にて、ＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「９」の凡例で示す。
【０１３６】
〔実施例１０〕
リバースプライマーとしてＨＰ−Ａ１を用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例９と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「１０」の凡例で示す。
【０１３７】
〔実施例１１〕
実施例３と同様の条件にて、ＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「１１」の凡例で示す。
【０１３８】
〔実施例１２〕
リバースプライマーとしてＨＰ−Ａ１を用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いた以外は、実施例１１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「１２」の凡例で示す。
【０１３９】
〔比較例１〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａを用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ａ）において「１’」の凡例で示す。
【０１４０】
〔比較例２〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａを用いたこと以外は、実施例３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｂ）において「２’」の凡例で示す。
【０１４１】
〔比較例３〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃを用いたこと以外は、実施例５と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｃ）において「３’」の凡例で示す。
【０１４２】
〔比較例４〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃを用いたこと以外は、実施例７と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｄ）において「４’」の凡例で示す。
【０１４３】
〔比較例５〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例９と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「９’」の凡例で示す。
【０１４４】
〔比較例６〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１０と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「６’」の凡例で示す。
【０１４５】
〔比較例７〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「７’」の凡例で示す。
【０１４６】
〔比較例８〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１２と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「８’」の凡例で示す。
【０１４７】
〔実施例１〜４，９，１１と比較例１，２，５，７との対比〕
テンプレートＧから増幅した核酸の特異的な確認について、実施例１〜４，９，１１のＰＣＲの結果と比較例１，２，５，７のＰＣＲの結果とを比較して説明する。
【０１４８】
実施例１，２では、図２の（ａ）に示すように、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１５サイクルにおいて１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２の存在下において、ＨＰ−ＣがテンプレートＧに結合し、テンプレートＧから核酸が増幅したことを示している。よって、これらのコンペティタープライマーの存在下においても、蛍光強度を指標とすることによって、テンプレートＧからの核酸を確認することができる。さらに、図３の（ａ）に示すように、実施例１では、この増幅された核酸（１３４ｂｐ）を電気泳動によって視覚的に確認された。
【０１４９】
また、図２の（ｂ）に示すように、実施例３では、３５サイクルを超えるまで、蛍光強度は１未満にならず、実施例４では、４０サイクルでも蛍光強度は１未満にならなかった。このことは、ＰＣＲが進行したとしても、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２が優先的にテンプレートＴに結合し、ＨＰ−ＣはテンプレートＴに極めて結合しにくいことを示している。図３の（ｂ）に示す電気泳動の結果からも、実施例３では、ＣＰ−Ａ１によって増幅された核酸（１０７ｂｐ）は視覚的に確認されたが、ＨＰ−Ｃによって増幅された核酸（１３４ｂｐ）は視覚的に確認されなかった。
【０１５０】
従って、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２との組合せを用いることによって、テンプレートＧに対してはＨＰ−Ｃを特異的に結合させ、テンプレートＴに対してはＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２を特異的に結合させることができる。このため、テンプレートＧからの核酸の増幅を特異的に確認することができ、テンプレートＴから増幅した核酸の増幅は確認されない。よって、信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【０１５１】
一方、図２の（ａ）に示すように、比較例１も、実施例１，２と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。この結果は、ＣＰ−Ａの存在下において、ＨＰ−Ｃを用いてテンプレートＧからの核酸を確認できることを示している。
【０１５２】
しかし、図２の（ｂ）に示すように、比較例２では、テンプレートＴ、ＨＰ−ＣおよびＣＰ−Ａを用いた場合、蛍光強度は、２０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ａが存在したとしても、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−ＣもテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａとの組合せを用いた場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１５３】
また、実施例１と同様の条件である実施例９についても、実施例１と同様の結果が得られた。実施例３と同様の条件である実施例１１についても、実施例３と同様の結果が得られた。
【０１５４】
一方、図４の（ａ）に示すように、比較例５も、実施例９と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。しかし、図４の（ｂ）に示すように、比較例７では、テンプレートＴおよびＨＰ−Ｃを用いた場合、蛍光強度は、２０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ａが存在しないため、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−ＣがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＣＰ−Ａ１を用いない場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−ＣがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１５５】
〔実施例５〜８，１０，１２と比較例３，４，６，８との対比〕
テンプレートＴから増幅した核酸の特異的な確認について、実施例５〜８，１０，１２のＰＣＲの結果と比較例３，４，６，８のＰＣＲの結果とを比較して説明する。
【０１５６】
図２の（ｃ）に示すように、実施例５，６では、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、実施例５では、蛍光強度は２０サイクルにおいて１未満になり、実施例６では、蛍光強度は２５サイクルにおいて１未満になり、それぞれその後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２の存在下において、ＨＰ−ＡがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。よって、これらのコンペティタープライマーの存在下においても、蛍光強度を指標とすることによって、テンプレートＴからの核酸を確認することができる。さらに、図３の（ｃ）に示すように、実施例５では、この増幅された核酸（１３４ｂｐ）を電気泳動によって視覚的に確認することができた。
【０１５７】
また、実施例７，８では、図２の（ｄ）に示すように、４０サイクルでも蛍光強度は１未満にならなかった。このことは、ＰＣＲが進行したとしても、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２が優先的にテンプレートＧに結合し、ＨＰ−ＡはテンプレートＧに結合しないことを示している。図３の（ｄ）に示す電気泳動の結果からも、実施例７では、ＣＰ−Ｃ１によって増幅された核酸（１０７ｂｐ）は視覚的に確認されたが、ＨＰ−Ｃによって増幅された核酸（１３４ｂｐ）は視覚的に確認されなかった。
【０１５８】
従って、ＨＰ−ＡとＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２との組合せを用いることによって、テンプレートＴに対してはＨＰ−Ａを特異的に結合させ、テンプレートＧに対してはＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２を特異的に結合させることができる。このため、テンプレートＴからの核酸の増幅を特異的に確認することができ、テンプレートＧから増幅した核酸の増幅は確認されない。よって、信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【０１５９】
一方、図２の（ｃ）に示すように、比較例３も実施例５，６と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。この結果は、ＣＰ−Ｃの存在下において、ＨＰ−Ａを用いてテンプレートＴからの核酸を確認できることを示している。
【０１６０】
しかし、図２の（ｄ）に示すように、比較例４では、テンプレートＧ、ＨＰ−ＡおよびＣＰ−Ｃを用いた場合、蛍光強度は、３０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃが存在したとしても、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−ＡもテンプレートＧに結合し、テンプレートＧから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＨＰ−ＡとＣＰ−Ｃとの組合せを用いた場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１６１】
また、図４の（ｂ）に示すように、実施例１２では、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は２０サイクルにおいて１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃ２の存在下において、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。よって、ＣＰ−Ｃ２の存在下においても、ＨＰ−Ａ１を用いれば、蛍光強度を指標とすることによって、テンプレートＴからの核酸を確認することができる。
【０１６２】
実施例１０では、図４の（ａ）に示すように、４０サイクルでも蛍光強度は１未満にならなかった。このことは、ＰＣＲが進行したとしても、ＣＰ−Ｃ２が優先的にテンプレートＧに結合し、ＨＰ−Ａ１はテンプレートＧに結合しないことを示している。
【０１６３】
従って、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２との組合せを用いることによって、テンプレートＴに対してはＨＰ−Ａ１を特異的に結合させ、テンプレートＧに対してはＣＰ−Ｃ２を特異的に結合させることができる。このため、テンプレートＴからの核酸の増幅を特異的に確認することができ、テンプレートＧから増幅した核酸の増幅は確認されない。よって、信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【０１６４】
一方、図４の（ｂ）に示すように、比較例８も実施例１２と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。しかし、図４の（ａ）に示すように、比較例６では、テンプレートＧおよびＨＰ−Ａ１を用いた場合、蛍光強度は、２５サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃ２が存在しないため、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＧに結合し、テンプレートＧから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＣＰ−Ｃ２を用いない場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＧに結合し、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１６５】
＜試料核酸がヘテロ接合体に由来する核酸である場合＞
〔実施例１３〕
テンプレートとしてテンプレートＧとテンプレートＴとの混合物を用い、リバースプライマーとしてＨＰ−Ｃを用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ１を用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。なお、上記混合物中のテンプレートＧとテンプレートＴとの割合は、１：１（各２ｎｇ）であった。
【０１６６】
このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「１３」の凡例で示す。
【０１６７】
〔実施例１４〕
リバースプライマーとしてＨＰ−Ａ１を用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例１３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「１４」の凡例で示す。
【０１６８】
〔比較例９〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「９’」の凡例で示す。
【０１６９】
〔比較例１０〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１４と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「１０’」の凡例で示す。
【０１７０】
〔実施例１３，１４と比較例９，１０との対比〕
テンプレートＧまたはテンプレートＴの何れから一方から増幅した核酸の特異的な確認について、実施例１３，１４のＰＣＲの結果と比較例９，１０のＰＣＲの結果とを比較して説明する。
【０１７１】
実施例１３では、図４の（ｃ）に示すように、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１５サイクルにおいて１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＧから核酸が増幅したことを示している。なぜなら、上記実施例１，３，９，１１の結果から明らかなように、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ１との組合せを用いてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−ＣをテンプレートＴではなくテンプレートＧに特異的に結合させることができるからである。
【０１７２】
したがって、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ１との組合せを用いることによって、テンプレートＧおよびテンプレートＴの混合物から、テンプレートＧからの核酸の増幅のみを特異的に確認することができることが明らかになった。
【０１７３】
一方、比較例９では、図４の（ｃ）に示すように、実施例１３と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＧから核酸が増幅したことを示している。しかし、比較例５，７の結果から明らかなように、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−ＣがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまう。このため、比較例９では、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＧからの核酸の増幅だけでなく、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまう。
【０１７４】
また、実施例１４では、図４の（ｃ）に示すように、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は２０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。なぜなら、上記実施例１０，１２の結果から明らかなように、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２との組合せを用いてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−Ａ１をテンプレートＧではなくテンプレートＴに特異的に結合させることができるからである。
【０１７５】
したがって、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２との組合せを用いることによって、テンプレートＧおよびテンプレートＴの混合物から、テンプレートＴからの核酸の増幅のみを特異的に確認することができることが明らかになった。
【０１７６】
一方、比較例１０では、図４の（ｃ）に示すように、実施例１４と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１５サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。しかし、比較例６，８の結果から明らかなように、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＧに結合し、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまう。このため、比較例１０では、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＴからの核酸の増幅だけでなく、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまう。
【０１７７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明は、テーラーメード医療における臨床検査産業や医薬品産業等に利用可能である。
【符号の説明】
【０１７９】
１ ・・・テンプレート
２ ・・・一本鎖ＤＮＡ
３ ・・・二本鎖ＤＮＡ
４ ・・・野生型のテンプレート
５ ・・・二本鎖ＤＮＡ
１１・・・ヘアピンプライマー
１２・・・コンペティタープライマー
１３・・・リバースプライマー
２０・・・蛍光分子
３０・・・ＨＰ−ＣのテンプレートＧに対して相補的な領域
３１・・・ＣＰ−ＡのテンプレートＴに対して相補的な領域
３２・・・ＣＰ−Ａ１のテンプレートＴに対して相補的な領域
４０・・・ヘアピン構造（一本鎖ＤＮＡ断片）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、信頼性のある検出結果を得ることができる一塩基多型を検出する方法、および一塩基多型を検出するための試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；以下「ＳＮＰ」と表記する。）の検出には、リアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法等の核酸を増幅する方法が用いられている。リアルタイムＰＣＲ法は、例えば、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光標識プローブや、目的とするＰＣＲ産物に特異的に結合する蛍光標識プローブを用いて、リアルタイムに核酸の増幅を確認する方法であり、主にTaq Man（登録商標）法およびSYBR（登録商標） Green法が知られている。
【０００３】
これら２つの方法では、信頼性のあるＳＮＰの検出結果を得るために、ＰＣＲの最中においてプライマーを検出対象のＳＮＰが存在するテンプレートに如何に特異的に結合させるかが鍵となる。このため、プライマーの設計ソフトを使用して、ある程度適正なプライマーを一旦設計した後、アレル特異性が最も高くなるようにプライマーの配列やＰＣＲの条件を厳密に最適化することが必要とされる。さらに、このような最適化は、個々のテンプレートについて実施しなければならない。このため、これらの方法を実施する際には、大変な労力を伴う。
【０００４】
そこで、本発明者らは、より簡便に信頼性のあるＳＮＰの検出結果が得られる独自のＰＣＲ法を開発している（特許文献１）。このＰＣＲ法は、５’末端にシトシンバルジ構造を含むヘアピン構造を有するプライマー（以下、「ヘアピンプライマー」と表記する。）を用い、シトシンバルジ構造に結合すると蛍光強度が増大する蛍光分子を共存させてＰＣＲを実施するというＰＣＲ法に、ヘアピンプライマーと競合するコンペティタープライマーを組み合わせた方法である（以下、“コンペティティブヘアピンプライマー法（Competitive Hairpin Primer method:ＣＨＰ法）”と表記する。）。
【０００５】
図５を参照して、このＣＨＰ法の原理をより詳細に説明する。図５の（ａ）に示すように、テンプレート１上に存在するＳＮＰの位置の塩基（Ａ）を、ＣＨＰ法により検出する場合を例に挙げる。なお、野生型のテンプレート４は、図５の（ｄ）に示すように、塩基（Ｇ）である。
【０００６】
まず、図５の（ａ）に示すように、ヘアピンプライマー１１は、テンプレート１に対して相補的な配列と、ヘアピン構造とを備えている。ヘアピンプライマーの３’末端の塩基は、テンプレート１上に存在する検出対象のＳＮＰの位置の塩基（Ａ）と相補的な塩基（Ｔ）になるように設計されている。
【０００７】
一方、コンペティタープライマー１２は、３’末端を除いて、テンプレート１に対して相補的な配列と同一の配列を備えている。コンペティタープライマー１２の３’末端の塩基は、ＳＮＰの位置の塩基と相補的ではなく、図５の（ｄ）に示すように、野生型のテンプレート４の３’末端の塩基（Ｇ）と相補的な塩基（Ｃ）になるように設計されている。すなわち、コンペティタープライマー１２は、ヘアピンプライマー１１と比べて、ヘアピン構造を備えておらず、３’末端の塩基配列が異なるため、テンプレート１に対して相補的な塩基の数が１つ少ない。
【０００８】
ＳＮＰの位置に変異が存在するテンプレート１を用いてＣＨＰ法を実施すると、蛍光分子２０を含むヘアピンプライマー１１がテンプレート１に優先的に結合する。なぜなら、ヘアピンプライマー１１は、テンプレート１と完全に相補的であるため、コンペティタープライマー１２と比べて、テンプレート１に対するアフェニティーが強いからである。次いで、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。
【０００９】
その後、図５の（ｂ）に示すように、図５の（ａ）で合成された一本鎖ＤＮＡ２にリバースプライマー１３が結合し、破線方向、つまり図５の（ａ）と逆方向に相補鎖が合成される。
【００１０】
図５の（ａ）、（ｂ）のようにＰＣＲが進行し、二本鎖ＤＮＡ３が生じた結果、図５の（ｃ）に示すようにフォワード側のヘアピンプライマー１１が形成していたヘアピン構造が伸長され、ヘアピン構造中に存在するシトシンバルジ構造が消失する。これによって、バルジ構造に結合していた蛍光分子２０が解放されるため、蛍光強度は低下する。蛍光分子２０の蛍光強度の低下は、ヘアピンプライマー１１の量と減少と相関しており、ヘアピンプライマー１１は目的の二本鎖ＤＮＡ３の増幅によって減少する。よって、蛍光強度の減少を判定すれば、二本鎖ＤＮＡ３が増幅されたことを確認することができる。このようにして、ＳＮＰを検出することができる。
【００１１】
これに対し、図５の（ｄ）に示すように、野生型のテンプレート（ＳＮＰの位置に変異が存在しないテンプレート）４を用いてＣＨＰ法を実施すると、コンペティタープライマー１２が、野生型のテンプレート４に優先的に結合する。その結果、図５の（ｅ）,（ｆ）に示すように、ＰＣＲが進行し、二本鎖ＤＮＡ３とは別の二本鎖ＤＮＡ５が増幅されたとしても、ヘアピンプライマー１１が消費されないため、蛍光分子２０の蛍光強度は低下しない。
【００１２】
このようにＣＨＰ法によれば、ＳＮＰの位置に変異が存在するテンプレート（検出対象）に対してはヘアピンプライマーが優先的に使用され、ＳＮＰの位置に変異が存在しないテンプレート（野生型、非検出対象）に対してはコンペティタープライマーが優先的に使用される。このため、非検出対象のテンプレートの増幅に、ヘアピンプライマーが用いられることを防ぐことができる。また、コンペティタープライマーによって非検出対象のテンプレートが増幅されたとしても、蛍光分子の蛍光強度をモニタリングしていれば、この増幅は検出されない。これにより、偽陽性（false positive）の発生を防ぐことができる。よって、ヘアピンプライマーのアレル特異性を厳密に最適化しなくても、信頼性のあるＳＮＰの検出を簡便に実施することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第2008/026582号パンフレット（２００８年３月６日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、特許文献１に開示の技術によれば、信頼性のあるＳＮＰの検出を簡便に実施することができる。しかしながら、ＳＮＰの検出技術の向上は、患者のベッドサイド等において最適な治療法および投薬法等を診断するテーラーメード医療の発展につながり、有力なＰＯＣ（Point Of Care）技術がもたらされる。このため、ＳＮＰの検出方法については一層の検出感度の向上が望まれている。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、より信頼性のある検出結果を得ることができるＳＮＰの検出方法、およびＳＮＰを検出するための試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行なった。その結果、ＣＨＰ法において、コンペティタープライマーを５’末端側にわずか１塩基長くすることにより、偽陽性の発生を顕著に抑制できること、すなわち、ヘアピンプライマーのアレル特異性を顕著に向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法であって、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含し、試料核酸には、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれ、ヘアピンプライマーは、試料核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、コンペティタープライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、（１）ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、（２）ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に１塩基〜３塩基長くなるように設計されたものであることが好ましい。
【００１９】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、バルジ構造は、シトシンバルジ構造であることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、バルジ構造結合分子は、ナフチリジン環を有する化合物であることが好ましい。このナフチリジン環を有する化合物は、下記式（１）
【００２１】
【化１】
【００２２】
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であることが好ましい。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基または第３級アミン残基を示すものである。２，７−ジアミノナフチリジン誘導体は、下記式（２）
【００２３】
【化２】
【００２４】
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンであることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法において、測定工程は、バルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことが好ましい。
【００２６】
また、本発明に係る、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸を含む試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出するための試薬キットは、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、およびコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含し、ヘアピンプライマーは、試料核酸に対して相補的な領域、および領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、コンペティタープライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、（１）ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、（２）ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法および試薬キットによれば、偽陽性の発生を抑制することができる。それ故、本発明に係るＳＮＰを検出する方法および試薬キットは、より信頼性の高い検出結果を得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】テンプレートＧ、テンプレートＴ、ＨＰ−Ｃ、ＣＰ−Ａ１、およびＣＰ−Ａを示す模式図である。
【図２】各実施例および各比較例におけるＰＣＲサイクルの回数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を比較した結果を示す図であり、（ａ）は実施例１，２および比較例１の結果を示す図であり、（ｂ）は実施例３，４および比較例２の結果を示す図であり、（ｃ）は実施例５，６および比較例３の結果を示す図であり、（ｄ）は実施例７，８および比較例４の結果を示す図である。
【図３】実施例１，３，５，７におけるＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図であり、（ａ）は実施例１の結果を示す図であり、（ｂ）は実施例３の結果を示す図であり、（ｃ）は実施例５の結果を示す図であり、（ｄ）は実施例７の結果を示す図である。
【図４】各実施例および各比較例におけるＰＣＲサイクルの回数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を比較した結果を示す図であり、（ａ）は実施例９，１０および比較例５，６の結果を示す図であり、（ｂ）は実施例１１，１２および比較例７，８の結果を示す図であり、（ｃ）は実施例１３，１４および比較例９，１０の結果を示す図である。
【図５】従来のＣＨＰ法の原理を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
〔１．本発明に係るＳＮＰを検出する方法〕
本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法である。この方法は、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含していればよい。試料核酸には、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれる。
【００３０】
ヘアピンプライマーは、試料核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものである。一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。
【００３１】
コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものである。コンペティタープライマーの３’末端の位置は、試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。
【００３２】
（１）ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であってもよい。あるいは、（２）ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であってもよい。
【００３３】
本明細書において「プライマーセット」は、核酸増幅反応によって増幅される核酸の領域を挟む関係にあるプライマーの組（所謂、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組）を意味する。従って、ヘアピンプライマーを含むプライマーセットは、ヘアピンプライマーがフォワードプライマーおよびリバースプライマーの何れか一方であればよく、他方のプライマーは任意のプライマーであればよい。同様に、コンペティタープライマーを含むプライマーセットも、コンペティタープライマーがフォワードプライマーおよびリバースプライマーの何れか一方であればよく、他方のプライマーは任意のプライマーであればよい。
【００３４】
ただし、ヘアピンプライマーとコンペティタープライマーとは競合するため、例えば、ヘアピンプライマーがフォワードプライマーである場合、コンペティタープライマーもフォワードプライマーであることが好ましい。同様に、ヘアピンプライマーがリバースプライマーである場合、コンペティタープライマーもリバースプライマーであることが好ましい。また、ヘアピンプライマーを含むプライマーセットにおける任意のプライマーと、コンペティタープライマーを含むプライマーセットにおける任意のプライマーとは、同一のプライマーであってもよいし、異なるプライマーであってもよい。
【００３５】
本明細書において「試料核酸」は、ホモ接合体に由来する核酸（すなわち、野生型核酸または変異型核酸の何れか一方を含む核酸）であってもよいし、ヘテロ接合体に由来する核酸（すなわち、野生型核酸および変異型核酸の両方を含む核酸）であってもよい。試料核酸は、生物学的材料から単離されたものであってもよい。生物学的材料としては、例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便および腹水等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器および骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器および骨等を洗浄した後の洗浄液、ウイルス、植物、ならびに微生物が挙げられる。
【００３６】
本明細書において「野生型核酸」とは、ＳＮＰの位置に高い頻度で現れる塩基を有する核酸をいい、「変異型核酸」とは、ＳＮＰの位置に低い頻度で現れる塩基を有する核酸をいう。野生型核酸と変異型核酸とは、ＳＮＰの位置における塩基が異なる点を除いて、同一の塩基配列を有する核酸である。
【００３７】
本明細書において「核酸」は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ等が挙げられる。ＲＮＡをテンプレートとして使用する場合、本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程を含むことが好ましい。
【００３８】
本明細書において「核酸増幅反応」は、核酸を増幅することができる反応のことをいい、例えば、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ等のＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。特に、ＰＣＲは核酸増幅反応の中でも簡便に行なうことができるため、試料核酸の増幅から、増幅の確認までを迅速かつ簡便に行なうことができる。核酸増幅反応は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、反応条件は、用いる試料やプライマー等に応じて適宜設定すればよい。
【００３９】
以下、ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合を例に挙げて、本発明に係るＳＮＰを検出する方法に使用されるヘアピンプライマー、コンペティタープライマー、バルジ構造結合分子および測定工程について詳細に説明する。なお、これら以外の具体的な材料、条件、工程、ならびに使用する機器および装置等は特に限定されるものではなく、従来公知の方法等を好適に利用可能であり、何ら限定されるものではない。
【００４０】
＜１−１．ヘアピンプライマーおよびコンペティタープライマー＞
ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合、このヘアピンプライマーは、変異型核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるプライマーである。ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、変異型核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。
【００４１】
また、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものである。コンペティタープライマーの３’末端の位置は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されている。ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とするため、コンペティタープライマーの３’末端は、野生型核酸におけるＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である。
【００４２】
このように、ヘアピンプライマーでは、その３’末端は、変異型核酸のＳＮＰの位置における塩基に相補的な塩基であり、ヘアピンプライマーの一本鎖ＤＮＡ断片（ヘアピン構造）以外の部分は、変異型核酸と完全に相補的になるように設計されている。
【００４３】
一方、コンペティタープライマーでは、その３’末端は、野生型核酸のＳＮＰの位置における塩基に相補的な塩基であり、３’末端以外は野生型核酸または変異型核酸に対して相補的な塩基配列である。すなわち、コンペティタープライマーは、野生型核酸と完全に相補的になるように設計されている。
【００４４】
さらに、コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域よりも５’末端側に長くなっている。すなわち、従来のＣＨＰ法に使用されるコンペティタープライマーの塩基配列は、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域の塩基配列と同数であるのに対し、本発明に係るＳＮＰを検出する方法に使用されるコンペティタープライマーは、５’末端側に長くなっているという特徴がある。
【００４５】
従来のＣＨＰ法では、例えば、変異型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合、野生型核酸における、検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基を３’末端に備えたコンペティタープライマーが優先して野生型核酸に結合して、ヘアピンプライマーが野生型核酸の増幅に利用されないと考えていた。しかし、コンペティタープライマーとヘアピンプライマーとにおいて、テンプレートと相補的な配列の塩基数が同じである場合は、ＰＣＲのサイクル数が増加するにつれ、ヘアピンプライマーもわずかながら野生型核酸の増幅に利用されてしまうことに本発明者らは気付いた。この場合は、偽陽性を検出してしまう。そこで、検出結果の信頼性を高めるべく、鋭意検討した結果、本願の実施例に示すように、コンペティタープライマーの５’末端側に数塩基伸長させることで、ヘアピンプライマーの意図していない利用を顕著に抑制できることを実証した。
【００４６】
一般的に、ＰＣＲ法においてその精度を高めるためには、３’末端の塩基をＡやＴではなくＧやＣにするというように３’末端の構造を工夫するのが技術常識である。しかし、本発明者らは、プライマーの５’末端側において、少なくとも一塩基伸長させることにより、劇的に偽陽性の発生を防ぐことができることを見出した。それ故、本発明に係るＳＮＰを検出する方法は、従来のＣＨＰ法を用いたＳＮＰを検出する方法よりも、検出結果の信頼性をより劇的に向上させることができる。
【００４７】
コンペティタープライマーは、ヘアピンプライマーの変異型核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に１塩基〜３塩基だけ長くなるように設計されたものであることが好ましい。このようなコンペティタープライマーは、合成コストがかからずに簡便に作製することができるため、本発明に係るＳＮＰを検出する方法をより安価に実施することができる。
【００４８】
以下では、このようなヘアピンプライマーおよびコンペティタープライマー等の構成について、図１を用いてより具体的に説明する。図１は、テンプレートＧ（変異型核酸）、テンプレートＴ（野生型核酸）、ＨＰ−Ｃ（ヘアピンプライマー）、ＣＰ−Ａ１（コンペティタープライマー）、およびＣＰ−Ａ（従来のＣＨＰ法に使用されるコンペティタープライマー）を示す模式図である。
【００４９】
図１に示すように、ＨＰ−ＣはテンプレートＧに相補的な領域３０およびヘアピン構造（一本鎖ＤＮＡ断片）４０からなるプライマーであり、その３’末端はテンプレートＧのＳＮＰの位置の塩基Ｇに相補的なＣである。すなわち、ＨＰ−ＣはテンプレートＧと完全に相補的である。
【００５０】
一方、ＣＰ−Ａ１は、テンプレートＴに相補的な領域３２からなるプライマーであり、その３’末端は、テンプレートＴのＳＮＰの位置の塩基Ｔに相補的なＡである。さらに、ＣＰ−Ａ１は、ＨＰ−Ｃの領域３０よりも５’末端側に１塩基Ａだけ長くなっている。また、ＣＰ−Ａは、テンプレートＴに相補的な領域３１からなるプライマーであり、ＣＰ−Ａ１における５’末端側に伸長されたＡが存在しない。
【００５１】
従って、ＣＰ−Ａ１もＣＰ−Ａも、テンプレートＴに対して完全に相補的な塩基配列であるが、ＣＰ−Ａ１はＣＰ−Ａよりも５’末端側に長い。ＨＰ−ＣはテンプレートＴに結合することなく、テンプレートＧにより優先的に結合するので、テンプレートＴからの核酸の非特異的な増幅を防ぐとともに、テンプレートＧからの核酸の特異的な増幅を実現することができる。
【００５２】
ヘアピンプライマーおよびコンペティタープライマーの作製方法としては、特に限定されず、国際公開第2008/026582号パンフレットに開示の方法等の従来公知の方法が挙げられる。
【００５３】
以下では、ヘアピンプライマーに含まれる一本鎖ＤＮＡ断片について説明する。この一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであればよい。より具体的には、一本鎖ＤＮＡ断片が有するヘアピン構造は、一本鎖のＤＮＡが分子内で対合して、ＤＮＡの弧状領域および二本鎖領域が形成されることによりなる。バルジ構造は、形成された二本鎖領域中に存在する。
【００５４】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するヘアピン構造を構成する塩基の数は、ＤＮＡの弧状領域および二本鎖領域を形成し、さらにこの二本鎖領域中にバルジ構造を有する限り、限定されるものではないが、２４〜３３であることが好ましく、さらに好ましくは２４〜２８である。２４以上であれば、ＤＮＡの弧状領域、二本鎖領域およびバルジ構造を好適に形成することができ、３３以下であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。
【００５５】
また、弧状領域のＤＮＡを構成するＤＮＡの塩基配列は、弧状領域の形成が可能である限り、特に限定されるものではないが、構成する塩基の数は、３〜７であることが好ましく、４であることがさらに好ましい。４個の塩基により弧状領域が形成される場合、その配列は、ＴＴＴＴからなる塩基配列であることが好ましい。ＴＴＴＴによる弧状領域を備えるヘアピン構造は、核酸増幅反応において良好に伸長されるからである。
【００５６】
一本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば国際公開第2008/026582号パンフレットに記載の方法に従って設計すればよい。例えばＣＣＡＡＮＮＮＮＴＴＧＧ（Ｎは任意の塩基）（配列番号１２）のように、任意の塩基配列の両端に、互いに対合可能な塩基配列を設計する。そして、ＣＣＡＡまたはＴＴＧＧ中の任意の位置にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計することにより、ＮＮＮＮが湾曲して弧状領域を形成し、ＣＣＡＡとＴＴＧＧとがハイブリダイズして二本鎖領域を形成し、バルジ塩基が含まれることでバルジ構造が形成される。
【００５７】
つまり、弧状領域を形成するＤＮＡに対応する塩基配列の両端に、互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を設計し、ハイブリダイズする領域の塩基配列にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計した塩基配列に基づいてＤＮＡ断片を合成することで本願発明に係るＤＮＡ断片を得ることができる。なお、ＤＮＡ断片の合成は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、例えば化学合成により合成すればよい。
【００５８】
なお、上の例では、一本鎖ＤＮＡ断片が、ＤＮＡの弧状領域と、バルジ構造を含む二本鎖領域とにより形成されるヘアピン構造のみからなる場合について説明した。この例のように、一本鎖ＤＮＡ断片はヘアピン構造のみからなることが最も好ましいが、ヘアピン構造の３’末端および／または５’末端に、さらなる核酸が結合されてもよい。このようなさらなる核酸を含む場合は、その塩基の数は、３’末端、５’末端のそれぞれにおいて、１〜２０であることが好ましい。この範囲であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。
【００５９】
本明細書において「バルジ構造」とは、ＤＮＡの二本鎖領域において、一方の鎖のＤＮＡに、余剰の塩基が存在するために生じるふくらみ（バルジ）をいう。例えば、ＴＣＴ部分とＡＡ部分とを有するＤＮＡ断片が折れ曲がってヘアピン構造を形成し、このＴＣＴ部分とＡＡ部分とが向かい合う位置となった場合、ＴＣＴ部分の二つのＴとＡＡ部分の二つのＡとがそれぞれ対合する。その結果、二つのＴの間に存在するＣは対合する塩基が無いため、Ｃの部分が膨らむこととなる。この膨らんだ構造がバルジ構造である。なお、この例のように余剰の塩基がＣ（シトシン）であることにより形成されるバルジ構造を、本明細書において「シトシンバルジ構造」と表記する。Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）についても同様に、「アデニンバルジ構造」、「グアニンバルジ構造」および「チミンバルジ構造」と表記する。また、本明細書において「バルジ塩基」とは、バルジ構造中の余剰の塩基をいう。
【００６０】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するバルジ構造の数は、１つのみでもよいが、複数であることが好ましく、２〜４つであることがさらに好ましい。バルジ構造を複数備えることで、後述するバルジ構造結合分子が結合可能な部位が増えるため、より高感度なヘアピンプライマーの検出が可能となる。
【００６１】
バルジ構造を複数備える場合、隣り合うバルジ塩基の間には、好ましくは３〜５つ、さらに好ましくは４つの塩基が存在することが好ましい。バルジ構造が近接しすぎると、バルジ構造結合分子がそれぞれのバルジ構造に良好に結合することが妨げられる。バルジ塩基間の間隔が広すぎると、ヘアピン構造が安定になり、ヘアピンの伸長が良好に行われない虞があるし、一本鎖ＤＮＡ断片が大きくなり、合成コストが高くなる。
【００６２】
一本鎖ＤＮＡ断片が備えるバルジ構造は、アデニンバルジ構造、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、グアニンバルジ構造のいずれでもよい。
【００６３】
チミンバルジ構造またはシトシンバルジ構造の場合、バルジ構造結合分子の１種であるナフチリジン環を有する化合物が結合すると、この化合物から発光される蛍光強度の吸収極大波長がシフトする。よって、核酸増幅反応において、シフトした吸収極大波長における蛍光が弱くなれば、核酸が増幅したことを確認できる。また、アデニンバルジ構造およびグアニンバルジ構造の場合、ナフチリジン環を有する化合物が結合すると消光し、結合していない状態で蛍光を発光する。よって、核酸増幅反応において、蛍光強度がより強くなれば核酸が増幅したことを確認できる。
【００６４】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するバルジ構造は、シトシンバルジ構造であることが好ましい。後述する２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは蛍光物質であり、シトシンバルジ構造に結合することで、蛍光の吸収極大波長がシフトし、シフトした波長において強い強度の蛍光を発光する。そのため、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを用いることで、特異的かつ高感度な核酸増幅の確認が可能となるからである。
【００６５】
一本鎖ＤＮＡ断片が有するシトシンバルジ構造を形成するための塩基配列は、シトシンバルジ構造が形成される限り、限定されるものではないが、一本鎖ＤＮＡ断片中のＴＣＴ配列における二つのＴとＡＡ配列における二つのＡとが、Ｔ−Ａ塩基対で、このＤＮＡ断片の分子内で対合（分子内対合）し、ＴとＴとの間に位置するＣがバルジ塩基となることで、シトシンバルジ構造が形成されることが好ましい。ＤＮＡのＴＣＴ配列とＡＡ配列におけるＴ−Ａ塩基対の対合により形成されるシトシンバルジ構造を含むヘアピン構造は、安定であるためバルジ構造結合分子が良好に結合し、かつ、過度に安定ではないため、核酸増幅反応によるヘアピン構造の伸長が、良好に行なわれるからである。また、ナフチリジン環を有する化合物を用いた場合、得られる蛍光波長が、より長波長となるため、測定感度が向上するからである。
【００６６】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法に使用可能な、ヘアピンプライマーの塩基配列の具体例としては、配列番号４および５に示す塩基配列を挙げることができる。また、コンペティタープライマーの塩基配列の具体例としては、配列番号７、８、１０および１１に示す塩基配列を挙げることができる。
【００６７】
＜１−２．バルジ結合分子＞
本発明に係るＳＮＰを検出する方法に用いるバルジ構造結合分子は、バルジ構造に結合可能である限り限定されるものではないが、蛍光物質であって、バルジ構造と結合することで、蛍光を発光、発光する蛍光の波長がシフト、または、蛍光が消光する等、蛍光の発光状態が変化する物質を用いることが好ましい。これらの蛍光を検出することで、容易にバルジ構造を検出できるからである。なお、蛍光物質ではないバルジ構造結合分子を用いてもよく、この場合、バルジ構造結合分子を別途蛍光物質等により標識化したり、バルジ構造結合分子をアフィニティクロマトグラフィーのカラムに充填したりして用いればよい。
【００６８】
バルジ構造に結合して蛍光の発光状態が変化するバルジ構造結合分子としては、ナフチリジン環を有する化合物を挙げることができる。ナフチリジン環を有する化合物は、アデニンバルジ構造またはグアニンバルジ構造に結合すると、蛍光は消光する。また、ナフチリジン環を有する化合物は、シトシンバルジ構造またはチミンバルジ構造と結合すると、ナフチリジン環を有する化合物が発光する蛍光の吸収極大波長が、異なる波長にシフトする。このため、この消光またはシフトした吸収極大波長における蛍光の検出により、簡便にバルジ構造を検出することができる。
【００６９】
さらに、ナフチリジン環を有する化合物は、核酸増幅反応に用いるＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を阻害しない。このため、ナフチリジン環を有する化合物を混合したまま核酸増幅反応を実施することができる。よって、一つの反応容器に、核酸増幅反応液を調製し、これに予めナフチリジン環を有する化合物を混合することで、反応液の蛍光を測定し、反応液をそのまま核酸増幅反応に供して、増幅反応の前、最中または終了後に、同じ反応液の蛍光を測定することで、蛍光の変化を評価することができる。
【００７０】
従って、バルジ構造結合分子として、ナフチリジン環を有する化合物を用いることで、核酸増幅反応における核酸の増幅の確認を、簡便にリアルタイムで行なうことができる（以下、ナフチリジン環を有する化合物を「バルジ構造結合蛍光分子」と表記する）。
【００７１】
本発明に係るＳＮＰを検出する方法に用いるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（１）
【００７２】
【化３】
【００７３】
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体を用いることが好ましい。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基または第３級アミン残基を示す。第１級アミン残基としては、−ＮＨ２が挙げられる。また、第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２基、および−ＮＨ（ＣＨ）２ＮＨ（ＣＨ３）基等が挙げられる。第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＮＨ２基等が挙げられる。中でも、Ｒ１およびＲ２の内、少なくとも片方が第２級アミン残基であることが好ましく、Ｒ１およびＲ２の両方が第２級アミン残基であることがさらに好ましい。バルジ構造結合蛍光分子が第２級アミン残基を備えることで、上記バルジ構造との結合がより安定するからである。
【００７４】
２，７−ジアミノナフチリジン誘導体の中でも、下記式（２）
【００７５】
【化４】
【００７６】
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンが特に好ましい。この２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、シトシンバルジ構造に結合すると、発光する蛍光の吸収極大波長がシフトし、シフトした波長において強い強度の蛍光を発光する。このため、高感度かつ特異的に、シトシンバルジ構造、ひいては核酸増幅反応に用いたヘアピンプライマーを検出することが可能となるからである。
【００７７】
２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、従来公知の方法により合成すればよく、例えば文献：特開２００４−２６２８２７号公報に記載の方法に従って合成すればよい。２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の条件下において、単独では吸収極大が３７６ｎｍで検出され、シトシンバルジ構造と結合することにより、３９６ｎｍにシフトする。
【００７８】
なお、式（１）で示されるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（３）
【００７９】
【化５】
【００８０】
で示される２−アミノ−１，８−ナフチリジン誘導体であってもよい。Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子またはアミノ基であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立して１〜６の自然数を示す。また、式（１）で示されるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（４）
【００８１】
【化６】
【００８２】
で示される２，６−ジアミノピリジン誘導体であってもよい。Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子またはアミノ基であり、ｏ、ｐはそれぞれ独立して１〜６の自然数を示す。
【００８３】
バルジ構造結合蛍光分子を用いて、ヘアピンプライマーを検出するときのｐＨ条件は、好ましくはｐＨが５以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは６．５以上である。また、このｐＨの上限は、好ましくは９以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは７．５以下である。ｐＨが５以上、９以下であれば、ＤＮＡは安定であるため、バルジ構造結合蛍光分子は良好にヘアピンプライマー中のバルジ構造に結合する。これにより蛍光の検出を良好に行なうことができる。
【００８４】
バルジ構造結合蛍光分子は、核酸増幅反応に供する反応液に、直接添加してもよいし、例えば、リン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液等の適切な緩衝液で希釈して、反応液に添加してもよい。
【００８５】
バルジ構造結合蛍光分子の使用量は、核酸増幅反応の反応液に予め加えられるヘアピンプライマー１モルに対して、２０モル〜１００モルであることが好ましく、さらに好ましくは４０モル〜６０モルである。２０モル〜１００モルであれば、十分にヘアピンプライマー中のバルジ構造に結合し、さらにバックグラウンドシグナルによる測定誤差等も生じない。
【００８６】
バルジ構造結合蛍光分子が、バルジ構造に結合したときに発光する蛍光の検出は、これを検出可能である限り限定されるものではないが、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの波長が好ましく、さらに好ましくは４３０〜４６０ｎｍである。この蛍光の蛍光強度は、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの蛍光波長において、上記２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンがバルジ構造に結合していない場合に発光する蛍光と明確に区別することができるからである。
【００８７】
以上に述べた蛍光強度の検出は、既存の蛍光プレートリーダー等、公知の方法、装置により行なえばよい。
【００８８】
＜１−３．測定工程＞
測定工程は、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する工程であればよい。
【００８９】
上記にて説明したＣＨＰ法と同様に、バルジ構造結合分子の存在下において、バルジ構造結合分子はヘアピンプライマーのバルジ構造に結合する。核酸増幅反応において、ヘアピンプライマーが変異型核酸に結合し、一本鎖の核酸が増幅される。核酸増幅反応が進行し、この一本鎖の核酸に対する相補鎖が形成されると、ヘアピンプライマーの有するバルジ構造は伸長されるため、バルジ構造に結合していたバルジ構造結合分子は遊離する。この遊離したバルジ構造結合分子の量を測定すれば、ヘアピンプライマーの量を測定することができる。このため、核酸増幅反応の任意の時点の前後における遊離したバルジ結合分子の量を比較することによって、ヘアピンプライマーの量の増減を判定することができる。この判定の結果、ヘアピンプライマーの量が減少していれば、変異型核酸が増幅されたことを確認でき、減少していなければ、変異型核酸が増幅されなかったことを確認できる。
【００９０】
試料核酸に野生型核酸が含まれていたとしても、野生型核酸に対してはヘアピンプライマーよりもコンペティタープライマーが優先的に結合するため、バルジ構造結合分子は遊離しない。コンペティタープライマーによって、野生型核酸が増幅されたとしても、遊離しているバルジ構造結合分子の量は何ら影響を受けない。このため、遊離しているバルジ構造結合分子の量を測定していれば、野生型核酸の増幅を確認することはない。このようにして、本発明に係るＳＮＰを検出する方法では、変異型核酸の増幅を特異的に確認することができる。
【００９１】
本明細書において「核酸増幅反応の任意の時点の前後におけるバルジ結合分子の量を比較する」は、特に限定されず、例えば、核酸増幅反応の前と終了時とにおけるバルジ結合分子の量を比較することであってもよいし、核酸増幅反応の最中の任意の時点の前後におけるバルジ結合分子の量を比較することであってもよい。また、核酸増幅反応中、リアルタイムでバルジ結合分子の量を検出・比較する方法を採用してもよい。
【００９２】
また、バルジ構造結合分子として上述したバルジ構造結合蛍光分子を用いる場合、測定工程は、このバルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことが好ましい。この蛍光分子から発せれる蛍光の強度を測定することによって、遊離した蛍光分子の量、ヘアピンプライマーの量を容易にかつリアルタイムで測定することができるからである。
【００９３】
以下では、バルジ構造結合分子としてバルジ構造結合蛍光分子を用い、バルジ構造としてチミンバルジ構造またはシトシンバルジ構造を用いた場合の測定工程について説明する。核酸増幅反応の前では、バルジ構造結合蛍光分子はヘアピンプライマーのバルジ構造に結合し、シフトした吸収極大波長において蛍光を発する。核酸増幅反応が進行し、ヘアピンプライマーによって変異型核酸が増幅された場合、ヘアピンプライマーのバルジ構造は伸長し、バルジ構造は消失する。これによって、バルジ構造に結合していたバルジ構造結合蛍光分子は遊離し、遊離したバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度は減少する。
【００９４】
従って、核酸増幅反応の任意の時点の前後におけるバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度が減少していれば、ヘアピンプライマーの量が減少しており、変異型核酸が増幅されたことを確認できる。一方、蛍光強度が減少していなければ、ヘアピンプライマーの量は減少しておらず、変異型核酸が増幅されなかったことを確認できる。
【００９５】
また、バルジ構造が、アデニンバルジ構造およびグアニンバルジ構造である場合、バルジ構造結合蛍光分子はバルジ構造に結合すると消光し、遊離の状態で蛍光を発光する。従って、核酸増幅反応の任意の時点の前後におけるバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度が増加していれば、ヘアピンプライマーの量が減少しており、変異型核酸が増幅されたことを確認できる。一方、蛍光強度が増加していなければ、ヘアピンプライマーの量は減少しておらず、変異型核酸が増幅されなかったことを確認できる。
【００９６】
なお、上記の説明では、ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合を例に挙げて、本発明に係るＳＮＰを検出する方法を説明したが、もちろんヘアピンプライマーによる野生型核酸の増幅も可能である。この場合、上述したヘアピンプライマーに対する事項をコンペティタープライマーに当てはめ、コンペティタープライマーに対する事項をヘアピンプライマーに当てはめればよい。
【００９７】
〔２．本発明に係る試薬キット〕
本発明に係る試薬キットは、上述した試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出するための試薬キットであって、上述したヘアピンプライマーを含むプライマーセット、および上述したコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含していればよい。
【００９８】
さらに、本発明に係る試薬キットは、上述したバルジ構造結合分子を含んでもよい。
【００９９】
また、キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ関連試薬・器具（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー、ＰＣＲ用チューブ等）、増幅核酸精製用の試薬・器具を含んでもよいし、ＤＮＡ断片を安定的に保持するための試薬や緩衝液、バルジ構造結合分子またはバルジ構造結合蛍光分子を安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。
【０１００】
上記の何れの構成であっても、核酸増幅反応によって試料核酸の増幅を行い、ＳＮＰを検出するために好ましい薬剤等が含まれている。そのため、本発明に係る試薬キットを用いることで、より信頼性のある検出結果を容易かつ迅速に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【０１０１】
本発明に係る試薬キットの提供形態は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子、その他の試薬の全てを、適切な容量および／または形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係る試薬キットには、本発明に係るＳＮＰを検出する方法の手順等を記載した説明書を含んでもよい。
【０１０２】
なお、上記の説明では、本発明を、ＳＮＰを検出する方法およびＳＮＰを検出するための試薬キットとして記載したが、ウイルスを検出する方法およびウイルスを検出するための試薬キットであってもよい。この場合、核酸増幅反応のためのテンプレートとしてウイルスの核酸を用いればよい。ウイルスの核酸がＲＮＡである場合（ウイルスがＲＮＡウイルスの場合）、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡをテンプレートとすればよい。
【０１０３】
従来のウイルスを検出する方法では、夾雑物が多い検体から得られたウイルスの核酸をテンプレートとして用いるため、夾雑物に由来する核酸が非特異的に増幅されていた。本発明に係るウイルスを検出する方法は、上述したヘアピンプライマーとコンペティタープライマーとを用いるために、目的のウイルスの核酸をヘアピンプライマーによって特異的の増幅することができる。それ故、より信頼性のあるウイルスの検出結果を得ることができる。
【０１０４】
本発明に係る方法および試薬キットに関しては、上述した以外の事項についても、国際公開第2008/026582号パンフレットに記載を適宜参酌・利用することができる。
【実施例】
【０１０５】
本発明について、実施例および比較例を用いてさらに説明する。以下の実施例および比較例においては、ＳＮＰを人工的に作製した２種類のプラスミドをテンプレートとして用い、ＰＣＲによって２種類のテンプレートから増幅された核酸の何れか一方を特異的に確認できるか否かを検証した。
【０１０６】
より具体的には、公知のプラスミドであるｐＵＣ１８（GenBank Accession Number L09136）の４６５位をＳＮＰの位置として想定して、ｐＵＣ１８における４６５位のＧをＴに変異させたプラスミドを作製した。この変異プラスミドは、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）を用いて、マニュアルに沿って作製した。
【０１０７】
このｐＵＣ１８（以下、「テンプレートＧ」と表記する。）、および４６５位がＴであるｐＵＣ１８（以下、「テンプレートＴ」と表記する。）をＰＣＲのためのテンプレートとして用いた。テンプレートＧおよびテンプレートＴの具体的な塩基配列を、配列番号１および２に示す。
【０１０８】
また、ＰＣＲのための、フォワードプライマーとしてＭ１３Ｍ３を用い、リバースプライマー（ヘアピンプライマー）としてＨＰ−Ｃ、ＨＰ−Ａ、またはＨＰ−Ａ１を用いた。ＨＰ−Ｃに対するコンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２を用いた。ＨＰ−Ａに対するコンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２を用いた。ＨＰ−Ａ１に対するコンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いた。
【０１０９】
Ｍ１３Ｍ３、ＨＰ−Ｃ、ＨＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１、ＣＰ−Ａ２、ＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１、ＣＰ−Ｃ２およびＨＰ−Ａ１の塩基配列は、以下の通りである：
Ｍ１３Ｍ３：GTTGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号３）
ＨＰ−Ｃ ：ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCAGGAAACAGCTATGAC（配列番号４）
ＨＰ−Ａ ：ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCAGGAAACAGCTATGAA（配列番号５）
ＣＰ−Ｃ ：CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号６）
ＣＰ−Ｃ１：ACAGGAAACAGCTATGAC（配列番号７）
ＣＰ−Ｃ２：CACAGGAAACAGCTATGAC（配列番号８）
ＣＰ−Ａ ：CAGGAAACAGCTATGAA（配列番号９）
ＣＰ−Ａ１：ACAGGAAACAGCTATGAA（配列番号１０）
ＣＰ−Ａ２：CACAGGAAACAGCTATGAA（配列番号１１）。
【０１１０】
ＨＰ−Ａ１：ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATACAGGAAACAGCTATGAA（配列番号１３）
Ｍ１３Ｍ３は、テンプレートＧまたはテンプレートＴの３７６位〜３９５位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。
【０１１１】
ＨＰ−Ｃは、ヘアピン構造を形成可能な塩基配列（１位〜２８位の塩基配列）と、テンプレートＧの４６５位〜４８１位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列（２９位〜４５位の塩基配列）からなるプライマーである。ＨＰ−Ｃの３’末端の位置は、テンプレートＧにおける４６５位（ＳＮＰの位置）になるように設計されている。
【０１１２】
ＣＰ−Ａは、テンプレートＴの４６５位〜４８１位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。ＣＰ−Ａ１は、テンプレートＴの４６５位〜４８２位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。ＣＰ−ＡテンプレートＴの４６５位〜４８３位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１およびＣＰ−Ａ２の３’末端の位置は、ＳＮＰの位置になるように設計されている。これらの３’末端の塩基はＡであり、テンプレートＧの４６５位のＧと相補的ではなく、テンプレートＴの４６５位のＴと相補的である。また、ＣＰ−Ａは、ＨＰ−Ｃの２９位〜４５位の塩基配列と同じ長さある一方、ＣＰ−Ａ１およびＣＰ−Ａ２はそれぞれ、ＨＰ−Ｃの２９位〜４５位の塩基配列よりも、５’末端側に１塩基および２塩基だけ長い。
【０１１３】
以上のような塩基配列であるため、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２とを組み合わせてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−ＣはテンプレートＧに優先的に結合し、ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２はテンプレートＴに優先的に結合する。
【０１１４】
ＨＰ−Ａは、その３’末端がテンプレートＴの４６５位のＴと相補的な塩基Ａになっている点を除いて、ＨＰ−Ｃと同様である。ＨＰ−Ａ１も、その３’末端がテンプレートＴの４６５位のＴと相補的な塩基Ａになっている。また、ＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１およびＣＰ−Ｃ２は、それらの３’末端がテンプレートＧの４６５位のＧと相補的な塩基Ｃになっている点を除いて、それぞれ、ＣＰ−Ａ、ＣＰ−Ａ１およびＣＰ−Ａ２と同様である。このため、ＨＰ−ＡとＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２とを組み合わせてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−ＡはテンプレートＴに優先的に結合し、ＣＰ−Ｃ、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２はテンプレートＧに優先的に結合する。同様に、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２とを組み合わせてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−Ａ１はテンプレートＴに優先的に結合し、ＣＰ−Ｃ２はテンプレートＧに優先的に結合する。
【０１１５】
表１に、実施例および比較例において使用した、テンプレートおよびプライマーの組合せを示す。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
以下の実施例１〜１２，比較例１〜８では、試料核酸がホモ接合体に由来する核酸である場合を想定し、ＰＣＲのためのテンプレートとしてテンプレートＧまたはテンプレートＴの何れか一方を用いた。そして、用いたテンプレートから特異的に増幅された核酸を確認できるか否かを検証した。
【０１１８】
また、実施例１３，１４および比較例９，１０では、試料核酸がヘテロ接合体に由来する核酸である場合を想定し、ＰＣＲのためのテンプレートとしてテンプレートＧおよびテンプレートＴの両方を含む混合物を用いた。そして、用いた混合物中のテンプレートのどちらか一方から増幅された核酸を特異的に確認できるか否かについて検証した。
【０１１９】
＜試料核酸がホモ接合体に由来する核酸である場合＞
〔実施例１〕
本実施例におけるＰＣＲには、テンプレートとしてテンプレートＧ、リバースプライマーとしてＨＰ−Ｃ、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ１、フォワードプライマーとしてＭ１３Ｍ３を用いた。
【０１２０】
ＰＣＲのための反応液を全量が４０μＬとなるように調製した。具体的には、テンプレート（４ｎｇ）、フォワードプライマー（終濃度０．５μＭ）、リバースプライマー（終濃度０．５μＭ）、コンペティタープライマー（終濃度０．５μＭ）、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）（２０μＬ）、バルジ構造結合蛍光分子（終濃度２０μＭ）、および反応液の全量が４０μＬになるような量のＨ２Ｏを混合して、反応液を調製した。バルジ構造結合蛍光分子として、式（２）で表される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを用いた。
【０１２１】
ＰＣＲは、まず９５℃で２分間加温した後、９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間のサイクルを繰り返すことによって実施した。
【０１２２】
ＰＣＲに供する前に、調製した反応液の蛍光強度を測定し、次にこの反応液をそのままＰＣＲに供し、その後、５サイクル毎に、反応液の蛍光強度を測定した。ＰＣＲは、４０サイクルまで行なった。蛍光強度の測定は、蛍光プレートリーダー（ベルトールドテクノロジー社製 Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０）を用いて、励起波長４００ｎｍおよび蛍光検出波長４５０ｎｍの条件にて行った。
【０１２３】
このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ａ）において「１」の凡例で示す。なお、図２の（ａ）において、縦軸は相対蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数を表す。
【０１２４】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ａ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、および各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１２５】
〔実施例２〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ２を用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ａ）において「２」の凡例で示す。
【０１２６】
〔実施例３〕
テンプレートとしてテンプレートＴを用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｂ）において「３」の凡例で示す。
【０１２７】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ｂ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１２８】
〔実施例４〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ２を用いたこと以外は、実施例３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｂ）において「４」の凡例で示す。
【０１２９】
〔実施例５〕
テンプレートとしてテンプレートＴ、ヘアピンプライマーとしてＨＰ−Ａ、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ１を用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｃ）において「５」の凡例で示す。
【０１３０】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ｃ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１３１】
〔実施例６〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例５と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｃ）において「６」の凡例で示す。
【０１３２】
〔実施例７〕
テンプレートとしてテンプレートＧを用いたこと以外は、実施例５と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｄ）において「７」の凡例で示す。
【０１３３】
また、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図３の（ｄ）に示す。同図に示されるバンドは、左から順に、分子量マーカー、各サイクル数におけるＰＣＲによって得られたＤＮＡ増幅断片のバンドを示す。
【０１３４】
〔実施例８〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例７と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｄ）において「８」の凡例で示す。
【０１３５】
〔実施例９〕
実施例１と同様の条件にて、ＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「９」の凡例で示す。
【０１３６】
〔実施例１０〕
リバースプライマーとしてＨＰ−Ａ１を用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例９と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「１０」の凡例で示す。
【０１３７】
〔実施例１１〕
実施例３と同様の条件にて、ＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「１１」の凡例で示す。
【０１３８】
〔実施例１２〕
リバースプライマーとしてＨＰ−Ａ１を用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いた以外は、実施例１１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「１２」の凡例で示す。
【０１３９】
〔比較例１〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａを用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ａ）において「１’」の凡例で示す。
【０１４０】
〔比較例２〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａを用いたこと以外は、実施例３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｂ）において「２’」の凡例で示す。
【０１４１】
〔比較例３〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃを用いたこと以外は、実施例５と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｃ）において「３’」の凡例で示す。
【０１４２】
〔比較例４〕
コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃを用いたこと以外は、実施例７と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図２の（ｄ）において「４’」の凡例で示す。
【０１４３】
〔比較例５〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例９と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「９’」の凡例で示す。
【０１４４】
〔比較例６〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１０と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ａ）において「６’」の凡例で示す。
【０１４５】
〔比較例７〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「７’」の凡例で示す。
【０１４６】
〔比較例８〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１２と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｂ）において「８’」の凡例で示す。
【０１４７】
〔実施例１〜４，９，１１と比較例１，２，５，７との対比〕
テンプレートＧから増幅した核酸の特異的な確認について、実施例１〜４，９，１１のＰＣＲの結果と比較例１，２，５，７のＰＣＲの結果とを比較して説明する。
【０１４８】
実施例１，２では、図２の（ａ）に示すように、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１５サイクルにおいて１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２の存在下において、ＨＰ−ＣがテンプレートＧに結合し、テンプレートＧから核酸が増幅したことを示している。よって、これらのコンペティタープライマーの存在下においても、蛍光強度を指標とすることによって、テンプレートＧからの核酸を確認することができる。さらに、図３の（ａ）に示すように、実施例１では、この増幅された核酸（１３４ｂｐ）を電気泳動によって視覚的に確認された。
【０１４９】
また、図２の（ｂ）に示すように、実施例３では、３５サイクルを超えるまで、蛍光強度は１未満にならず、実施例４では、４０サイクルでも蛍光強度は１未満にならなかった。このことは、ＰＣＲが進行したとしても、ＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２が優先的にテンプレートＴに結合し、ＨＰ−ＣはテンプレートＴに極めて結合しにくいことを示している。図３の（ｂ）に示す電気泳動の結果からも、実施例３では、ＣＰ−Ａ１によって増幅された核酸（１０７ｂｐ）は視覚的に確認されたが、ＨＰ−Ｃによって増幅された核酸（１３４ｂｐ）は視覚的に確認されなかった。
【０１５０】
従って、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２との組合せを用いることによって、テンプレートＧに対してはＨＰ−Ｃを特異的に結合させ、テンプレートＴに対してはＣＰ−Ａ１またはＣＰ−Ａ２を特異的に結合させることができる。このため、テンプレートＧからの核酸の増幅を特異的に確認することができ、テンプレートＴから増幅した核酸の増幅は確認されない。よって、信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【０１５１】
一方、図２の（ａ）に示すように、比較例１も、実施例１，２と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。この結果は、ＣＰ−Ａの存在下において、ＨＰ−Ｃを用いてテンプレートＧからの核酸を確認できることを示している。
【０１５２】
しかし、図２の（ｂ）に示すように、比較例２では、テンプレートＴ、ＨＰ−ＣおよびＣＰ−Ａを用いた場合、蛍光強度は、２０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ａが存在したとしても、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−ＣもテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａとの組合せを用いた場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１５３】
また、実施例１と同様の条件である実施例９についても、実施例１と同様の結果が得られた。実施例３と同様の条件である実施例１１についても、実施例３と同様の結果が得られた。
【０１５４】
一方、図４の（ａ）に示すように、比較例５も、実施例９と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。しかし、図４の（ｂ）に示すように、比較例７では、テンプレートＴおよびＨＰ−Ｃを用いた場合、蛍光強度は、２０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ａが存在しないため、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−ＣがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＣＰ−Ａ１を用いない場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−ＣがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１５５】
〔実施例５〜８，１０，１２と比較例３，４，６，８との対比〕
テンプレートＴから増幅した核酸の特異的な確認について、実施例５〜８，１０，１２のＰＣＲの結果と比較例３，４，６，８のＰＣＲの結果とを比較して説明する。
【０１５６】
図２の（ｃ）に示すように、実施例５，６では、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、実施例５では、蛍光強度は２０サイクルにおいて１未満になり、実施例６では、蛍光強度は２５サイクルにおいて１未満になり、それぞれその後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２の存在下において、ＨＰ−ＡがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。よって、これらのコンペティタープライマーの存在下においても、蛍光強度を指標とすることによって、テンプレートＴからの核酸を確認することができる。さらに、図３の（ｃ）に示すように、実施例５では、この増幅された核酸（１３４ｂｐ）を電気泳動によって視覚的に確認することができた。
【０１５７】
また、実施例７，８では、図２の（ｄ）に示すように、４０サイクルでも蛍光強度は１未満にならなかった。このことは、ＰＣＲが進行したとしても、ＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２が優先的にテンプレートＧに結合し、ＨＰ−ＡはテンプレートＧに結合しないことを示している。図３の（ｄ）に示す電気泳動の結果からも、実施例７では、ＣＰ−Ｃ１によって増幅された核酸（１０７ｂｐ）は視覚的に確認されたが、ＨＰ−Ｃによって増幅された核酸（１３４ｂｐ）は視覚的に確認されなかった。
【０１５８】
従って、ＨＰ−ＡとＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２との組合せを用いることによって、テンプレートＴに対してはＨＰ−Ａを特異的に結合させ、テンプレートＧに対してはＣＰ−Ｃ１またはＣＰ−Ｃ２を特異的に結合させることができる。このため、テンプレートＴからの核酸の増幅を特異的に確認することができ、テンプレートＧから増幅した核酸の増幅は確認されない。よって、信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【０１５９】
一方、図２の（ｃ）に示すように、比較例３も実施例５，６と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。この結果は、ＣＰ−Ｃの存在下において、ＨＰ−Ａを用いてテンプレートＴからの核酸を確認できることを示している。
【０１６０】
しかし、図２の（ｄ）に示すように、比較例４では、テンプレートＧ、ＨＰ−ＡおよびＣＰ−Ｃを用いた場合、蛍光強度は、３０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃが存在したとしても、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−ＡもテンプレートＧに結合し、テンプレートＧから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＨＰ−ＡとＣＰ−Ｃとの組合せを用いた場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１６１】
また、図４の（ｂ）に示すように、実施例１２では、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は２０サイクルにおいて１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃ２の存在下において、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＴに結合し、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。よって、ＣＰ−Ｃ２の存在下においても、ＨＰ−Ａ１を用いれば、蛍光強度を指標とすることによって、テンプレートＴからの核酸を確認することができる。
【０１６２】
実施例１０では、図４の（ａ）に示すように、４０サイクルでも蛍光強度は１未満にならなかった。このことは、ＰＣＲが進行したとしても、ＣＰ−Ｃ２が優先的にテンプレートＧに結合し、ＨＰ−Ａ１はテンプレートＧに結合しないことを示している。
【０１６３】
従って、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２との組合せを用いることによって、テンプレートＴに対してはＨＰ−Ａ１を特異的に結合させ、テンプレートＧに対してはＣＰ−Ｃ２を特異的に結合させることができる。このため、テンプレートＴからの核酸の増幅を特異的に確認することができ、テンプレートＧから増幅した核酸の増幅は確認されない。よって、信頼性の高い検出結果を得ることができる。
【０１６４】
一方、図４の（ｂ）に示すように、比較例８も実施例１２と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。しかし、図４の（ａ）に示すように、比較例６では、テンプレートＧおよびＨＰ−Ａ１を用いた場合、蛍光強度は、２５サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。このことは、ＣＰ−Ｃ２が存在しないため、ＰＣＲが進行すると、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＧに結合し、テンプレートＧから核酸が増幅されたことを示している。これによれば、ＣＰ−Ｃ２を用いない場合、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＧに結合し、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまうことを示している。
【０１６５】
＜試料核酸がヘテロ接合体に由来する核酸である場合＞
〔実施例１３〕
テンプレートとしてテンプレートＧとテンプレートＴとの混合物を用い、リバースプライマーとしてＨＰ−Ｃを用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ａ１を用いたこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。なお、上記混合物中のテンプレートＧとテンプレートＴとの割合は、１：１（各２ｎｇ）であった。
【０１６６】
このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「１３」の凡例で示す。
【０１６７】
〔実施例１４〕
リバースプライマーとしてＨＰ−Ａ１を用い、コンペティタープライマーとしてＣＰ−Ｃ２を用いたこと以外は、実施例１３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「１４」の凡例で示す。
【０１６８】
〔比較例９〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１３と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「９’」の凡例で示す。
【０１６９】
〔比較例１０〕
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例１４と同様にＰＣＲを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図４の（ｃ）において「１０’」の凡例で示す。
【０１７０】
〔実施例１３，１４と比較例９，１０との対比〕
テンプレートＧまたはテンプレートＴの何れから一方から増幅した核酸の特異的な確認について、実施例１３，１４のＰＣＲの結果と比較例９，１０のＰＣＲの結果とを比較して説明する。
【０１７１】
実施例１３では、図４の（ｃ）に示すように、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１５サイクルにおいて１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＧから核酸が増幅したことを示している。なぜなら、上記実施例１，３，９，１１の結果から明らかなように、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ１との組合せを用いてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−ＣをテンプレートＴではなくテンプレートＧに特異的に結合させることができるからである。
【０１７２】
したがって、ＨＰ−ＣとＣＰ−Ａ１との組合せを用いることによって、テンプレートＧおよびテンプレートＴの混合物から、テンプレートＧからの核酸の増幅のみを特異的に確認することができることが明らかになった。
【０１７３】
一方、比較例９では、図４の（ｃ）に示すように、実施例１３と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＧから核酸が増幅したことを示している。しかし、比較例５，７の結果から明らかなように、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−ＣがテンプレートＴに結合し、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまう。このため、比較例９では、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＧからの核酸の増幅だけでなく、テンプレートＴからの核酸の増幅も確認してしまう。
【０１７４】
また、実施例１４では、図４の（ｃ）に示すように、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は２０サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。なぜなら、上記実施例１０，１２の結果から明らかなように、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２との組合せを用いてＰＣＲを実施した場合、ＨＰ−Ａ１をテンプレートＧではなくテンプレートＴに特異的に結合させることができるからである。
【０１７５】
したがって、ＨＰ−Ａ１とＣＰ−Ｃ２との組合せを用いることによって、テンプレートＧおよびテンプレートＴの混合物から、テンプレートＴからの核酸の増幅のみを特異的に確認することができることが明らかになった。
【０１７６】
一方、比較例１０では、図４の（ｃ）に示すように、実施例１４と同様に、ＰＣＲのサイクル数の増加に伴って、蛍光強度が減少した。具体的には、蛍光強度は１５サイクルを超えると１未満になり、その後さらに減少した。この蛍光強度の減少は、テンプレートＴから核酸が増幅したことを示している。しかし、比較例６，８の結果から明らかなように、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、ＨＰ−Ａ１がテンプレートＧに結合し、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまう。このため、比較例１０では、ＰＣＲのサイクル数が増加すると、テンプレートＴからの核酸の増幅だけでなく、テンプレートＧからの核酸の増幅も確認してしまう。
【０１７７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明は、テーラーメード医療における臨床検査産業や医薬品産業等に利用可能である。
【符号の説明】
【０１７９】
１ ・・・テンプレート
２ ・・・一本鎖ＤＮＡ
３ ・・・二本鎖ＤＮＡ
４ ・・・野生型のテンプレート
５ ・・・二本鎖ＤＮＡ
１１・・・ヘアピンプライマー
１２・・・コンペティタープライマー
１３・・・リバースプライマー
２０・・・蛍光分子
３０・・・ＨＰ−ＣのテンプレートＧに対して相補的な領域
３１・・・ＣＰ−ＡのテンプレートＴに対して相補的な領域
３２・・・ＣＰ−Ａ１のテンプレートＴに対して相補的な領域
４０・・・ヘアピン構造（一本鎖ＤＮＡ断片）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法であって、
該バルジ構造結合分子を用いて、該ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含し、
該試料核酸には、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれ、
該ヘアピンプライマーは、該試料核酸に対して相補的な領域、および該領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、
該一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、該ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、
該ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
該コンペティタープライマーは、該ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、該コンペティタープライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
（１）該ヘアピンプライマーにより、該野生型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、該変異型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、
（２）該ヘアピンプライマーにより、該変異型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、該野生型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記コンペティタープライマーは、上記ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に１塩基〜３塩基長くなるように設計されたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記バルジ構造は、シトシンバルジ構造であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記バルジ構造結合分子は、ナフチリジン環を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記ナフチリジン環を有する化合物は、下記式（１）
【化１】
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であり、
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基または第３級アミン残基を示すことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体は、下記式（２）
【化２】
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記測定工程は、上記バルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、上記核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことを特徴とする請求項４〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸を含む試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出するための試薬キットであって、
ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、およびコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含し、
該ヘアピンプライマーは、該試料核酸に対して相補的な領域、および該領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、
該一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、該ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、
該ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
該コンペティタープライマーは、該ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、該コンペティタープライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
（１）該ヘアピンプライマーにより、該野生型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、
（２）該ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、該野生型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であることを特徴とする試薬キット。
【請求項１】
ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出する方法であって、
該バルジ構造結合分子を用いて、該ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含し、
該試料核酸には、野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれ、
該ヘアピンプライマーは、該試料核酸に対して相補的な領域、および該領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、
該一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、該ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、
該ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
該コンペティタープライマーは、該ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、該コンペティタープライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
（１）該ヘアピンプライマーにより、該野生型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、該変異型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、
（２）該ヘアピンプライマーにより、該変異型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、該野生型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記コンペティタープライマーは、上記ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に１塩基〜３塩基長くなるように設計されたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記バルジ構造は、シトシンバルジ構造であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記バルジ構造結合分子は、ナフチリジン環を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記ナフチリジン環を有する化合物は、下記式（１）
【化１】
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であり、
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基または第３級アミン残基を示すことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体は、下記式（２）
【化２】
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記測定工程は、上記バルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、上記核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことを特徴とする請求項４〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
野生型核酸および／または野生型核酸に対してＳＮＰの位置において一塩基変異している変異型核酸を含む試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、ＳＮＰを検出するための試薬キットであって、
ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、およびコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含し、
該ヘアピンプライマーは、該試料核酸に対して相補的な領域、および該領域の５’末端に結合された一本鎖ＤＮＡ断片からなるものであって、
該一本鎖ＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成し、該ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、
該ヘアピンプライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
該コンペティタープライマーは、該ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、５’末端側に少なくとも１塩基長いものであり、該コンペティタープライマーの３’末端の位置は、該試料核酸におけるＳＮＰの位置になるように設計されており、
（１）該ヘアピンプライマーにより、該野生型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、変異型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基である、または、
（２）該ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの３’末端は、該野生型核酸における該ＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基であることを特徴とする試薬キット。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１８２７６３（Ｐ２０１１−１８２７６３Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６５８（Ｐ２０１０−５４６５８）
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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