一酸化窒素産生抑制組成物および慢性関節炎抑制組成物
【課題】 安全性の高い天然物を原料に用いた、新規な一酸化窒素産生抑制組成物および慢性関節炎抑制組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】 タイ料理で香辛料として使用されているコブミカン葉をはじめとする柑橘類の葉からの抽出物、特に柑橘類の葉を熱水抽出した残さを用いてエタノール等の有機溶媒を用いて得られる抽出物は、優れた一酸化窒素産生抑制作用および慢性関節炎抑制活性を有しており、一酸化窒素の過剰産生が関与する疾病の予防または治療効果を有する食品、飼料、医薬品等への添加物として極めて有用である。
【解決手段】 タイ料理で香辛料として使用されているコブミカン葉をはじめとする柑橘類の葉からの抽出物、特に柑橘類の葉を熱水抽出した残さを用いてエタノール等の有機溶媒を用いて得られる抽出物は、優れた一酸化窒素産生抑制作用および慢性関節炎抑制活性を有しており、一酸化窒素の過剰産生が関与する疾病の予防または治療効果を有する食品、飼料、医薬品等への添加物として極めて有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の植物抽出物を有効成分とする一酸化窒素産生抑制組成物および、関節炎抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（以下ＮＯと略す。）は１９８０年代に内皮細胞由来平滑筋弛緩因子として、はじめて生体内で産生されることが解明された。それ以来、様々な研究が進められ、ＮＯは、血管拡張因子、神経伝達物質としての作用のみならず、感染、炎症、免疫反応のメディエーターとしてＮＯそのものまたはＮＯから生成されるペルオキシナイトライトを介しての細胞障害性など、善悪両面の作用を持つことが知られてきた。
【０００３】
生体内でＮＯは、Ｌ−アルギニンを基質として酵素により産生されることが知られている。その反応を触媒する酵素は、神経型のｎＮＯＳ、血管内皮型のｅＮＯＳおよび誘導型のｉＮＯＳの３種類が存在することが確認されている。ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳの産生するＮＯは、生体の恒常性維持のために利用されているが、感染や炎症に伴って誘導されるｉＮＯＳによって過剰に産生されるＮＯは、生理機能よりもむしろ様々な疾患に深く関与している。
【０００４】
現在、過剰に産生されたＮＯの関与することが知られている疾患は、慢性炎症を伴う各種消化器系疾患や、関節炎、リウマチなどの疾患、１型糖尿病および糖尿病合併症、気管支喘息などの呼吸器疾患、ＤＮＡ障害による癌の発生などである。（非特許文献１参照。）
【０００５】
リウマチなどの慢性関節炎においては、増殖した関節滑膜で産生される炎症性メディエーターが軟骨および骨破壊を進展させることが知られている。近年では、関節炎症局所においてNO産生が亢進していることが報告されており、ＮＯが慢性関節炎の発症および進展に深く関与していることが知られている。（非特許文献２参照。）
【０００６】
そのため、過剰なNO産生を抑制することが、様々な疾病を予防する上で、非常に有用であり、近年、合成物や天然物由来のNO産生抑制剤が多数提案されている。天然物由来ものとしては、例えばサラシア属植物に由来するもの（特許文献１参照。）、各種生薬、ハーブ類に由来のもの（特許文献２参照。）、インドネシア民間伝承薬植物に由来するもの（特許文献３参照。）などがあげられる。
【０００７】
また、柑橘類であるコブミカン葉の抽出物は、リノール酸の自動酸化における抗酸化性（特許文献４参照。）および発癌プロモーション抑制作用（特許文献５参照。）を有することが知られている。しかし、ＮＯ産生抑制作用および関節炎抑制作用を有することは全く知られていなかったことである。
【特許文献１】特開２００３−０６３９７４号公報
【特許文献２】特開２００２−０８７９７５号公報
【特許文献３】特開２００２−０４７１８１号公報
【特許文献４】特開平１１−１９９４２７号公報
【特許文献５】特許第３２９８７２３号公報
【非特許文献１】イラスト医学＆サイエンスシリーズ「ＮＯの生理作用と疾患」、羊土社、１９９９年
【非特許文献２】最新医学別冊「リウマチ２０００」、最新医学社、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
安全性の高い天然物を利用して、生体内で過剰に産生されるNOを抑制することで、様々な疾病、特にリウマチなどの慢性関節炎を予防または治療できる組成物を見出し、食品、特に健康補助食品あるいは医薬等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、安全性の高い天然物である植物素材を用いて、NO産生抑制作用および慢性関節炎抑制作用の検討を行った。その結果、コブミカン葉をはじめとする柑橘類の葉抽出物に強いＮＯ産生抑制作用および慢性関節炎抑制作用があることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
さらに本発明では、特にコブミカン葉等の柑橘類の葉を熱水抽出した残さを、エタノール等の有機溶媒で抽出して得られる抽出物がNO産生抑制剤および慢性関節炎抑制剤として有効であることを見出した。
【発明の効果】
【００１１】
食品、飼料および医薬品等へ配合することにより、マクロファージのNO産生を効果的に抑制し、過剰なNO産生が関連する様々な疾病、例えば慢性炎症を伴う各種消化器系疾患、１型糖尿病および糖尿病合併症、気管支喘息などの呼吸器疾患等、また特にリウマチ等の慢性関節炎の治療および予防に有用である。また天然物を用いることで、人体及び動物に対し有害な作用を示さず、きわめて安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いられる柑橘類の葉とは、カンキツ属（ミカン属）、キンカン属、カラタチ属植物の葉を示し、例えば、ウンシュウミカン、ナツミカン、キンカン、ユズ、ハッサク、イヨカン、ネーブル、ポンカン、オレンジ、ダイダイ、グレープフルーツ、ライム、レモン、コブミカン、スダチ、カボス、カラタチ等の葉が挙げられる。さらに好ましくは、コブミカン、ナツミカン、ユズ、キンカンの葉が挙げられる。これら柑橘類の葉は、生葉をそのまま抽出に用いることができるが、常法に従って、破砕、乾燥、粉末化等の加工を施したものを用いてもよい。
【００１４】
本発明における、熱水抽出処理した柑橘類の葉とは、４０℃以上の水を使って、数秒から数日間、好ましくは、数分から数時間、抽出処理を行った後に抽出液から回収された柑橘類の葉である。抽出に使用する溶媒量は、乾燥原材料１重量部当たり１〜１００００重量部が適当であり、さらに好ましくは１〜１０００重量部である。熱水抽出処理後の柑橘類の葉は、公知の方法で抽出液中から回収することができる。例えば、布、紙等を用いた濾過や遠心分離等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、上述の熱水抽出処理後の柑橘類の葉を、有機溶媒等を用いて抽出操作を行うことで、目的とする抽出物を得ることができる。有機溶媒による抽出に使用できる溶媒とは、熱水抽出処理後の柑橘類の葉に含まれる、水に難溶性または不溶性の成分を溶解させることのできるものであれば特に限定はないが、例えば低級アルコールであるメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等、あるいはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、アセトン、ジオキサン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ブチルメチルケトン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、キシレン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、ベンゼン、クロロホルムおよびトルエン等が挙げられる。
【００１６】
上記の溶媒を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよく、水と有機溶媒を併用してもよい。上記の低級アルコールおよび多価アルコールを含水アルコールとして使用する場合は、水分含量６０％以下が好ましい。特に、エタノールおよび含水エタノールが好ましい。
【００１７】
上述の有機溶媒による抽出の条件は、１０℃以上の温度で、数分から数日間、好ましくは、数十分から数十時間撹拌または超音波処理等することで、効率よく抽出を行うことができる。抽出に使用する溶媒量は、乾燥原材料１重量部当たり１〜１００００重量部が適当であり、さらに好ましくは１〜１０００重量部である。抽出処理後の抽出液は、公知の方法で抽出液から回収することができる。例えば、布、紙等を用いた濾過や遠心分離等が挙げられる。
【００１８】
このようにして得られた抽出液を濃縮して、次いで乾燥することによって抽出物を得ることができる。また、使用する溶媒によっては抽出液をそのまま使用することが可能であり、例えばエタノール等による抽出液はそのまま溶媒を除去せずに使用することができる。
【００１９】
本発明における過剰なNOが関与する疾病とは、ｉＮＯＳによって過剰に産生されるＮＯそのものまたは、ＮＯから生成されるペルオキシナイトライトを介しての細胞障害に起因する症状を伴う疾病を示し、例えば、リウマチ等の慢性関節炎、慢性炎症を伴う各種消化器系疾患、１型糖尿病および糖尿病合併症、気管支喘息などの呼吸器疾患、ＤＮＡ障害に伴う癌などが挙げられる。
【００２０】
本発明のＮＯ産生抑制剤の活性は、公知の方法である株化マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を用いたｉＮＯＳ誘導試験で確認することができる。ＲＡＷ２６４．７細胞にリポポリサッカライドおよびインターフェロン−γを作用させることにより誘導されたｉＮＯＳが産生するＮＯを、亜硝酸イオンとしてグリース法によって定量する。このとき被検物質の存在下で、抑制されるNO産生量を測定し抑制剤の活性を測ることができる。
【００２１】
本発明における慢性関節炎への効果の確認は、公知の慢性関節リウマチの動物モデル実験系であるアジュバント関節炎抑制試験で確認することができる。この試験では、ラットのフットパットに結核死菌より調製したアジュバントを皮下注射することで、リウマチ様の関節炎症状をおこし、被検物質による症状の改善または緩和状態をスコア化して測定する。
【００２２】
本発明の組成物は、NO産生抑制組成物又は関節炎抑制組成物として用いるいずれの場合においても、植物体の抽出物をそのまま服用してもよいが、これに賦形剤（白糖、乳糖、糖アルコール、デンプン、デキストリン、ゼラチン、セルロース類など）を添加して、錠剤、顆粒、カプセル剤等の固形剤として服用してもよい。更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することができる。
【００２３】
本発明のNO産生抑制組成物又は関節炎抑制組成物の投与量は、投与経路、疾患の程度、被投与者の年齢等によって異なるが、一般には経口摂取の場合、成人１日あたり、抽出物乾量で１ｍｇ〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ程度とすればよい。服用回数はとくに限定を要しないが、１日所要量を１〜５回程度に分けて摂取してもよい。
【００２４】
さらに、本発明においては、上記の植物体の抽出物を各種の食品、飼料、医薬品等へ常法に従って添加してもよい。
上記のような食品、飼料、医薬品等、とくに原料配合工程において、上記の植物体の抽出物を適量添加し、混合撹拌して原料を調整することにより、通常の製造工程と同一に、本発明の薬剤を含有する加工品を得ることができる。その添加量は、前記の経口投与量を目安として、食品の風味を悪化させない範囲内でその一部を置換するように適宜選択すればよい。
【００２５】
次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
抽出原料に凍結乾燥後粉砕したコブミカン葉粉末5gを用いて、クロロホルム／メタノール（２：１）混合溶液２５０ｍｌを加え、３０分間超音波処理による抽出を行い上清を回収した。残さは、４５ｍｌの同溶媒を加え、もう一度超音波処理して再び上清を回収した。回収した上清を合わせて減圧乾固して、０．４ｇの抽出物Aを得た。
【実施例２】
【００２７】
実施例１の抽出方法で、クロロホルム／メタノール混合溶液をエタノールに代えて同様の操作を行い、０．２ｇの抽出物Bを得た。
【実施例３】
【００２８】
凍結乾燥コブミカン葉粉末5gに対して、蒸留水を２５０ｍｌ加え、８０℃に加温して６０分間、撹拌抽出してから上清を回収した。残さに４５ｍｌの蒸留水を加え８０℃、５分間洗ってから、再び上清を回収した。回収した上清は、合わせて減圧乾固して、１．６ｇの抽出物Cを得た。
【実施例４】
【００２９】
実施例３における熱水抽出の残さを抽出原料に用いて、実施例２と同様のエタノールによる抽出を行い、０．２ｇの抽出物Dを得た。
【実施例５】
【００３０】
抽出条件の異なるコブミカン葉抽出物のＮＯ産生抑制活性を比較した。ＮＯ産生抑制活性の測定には、マウスマクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を用いた。２ｘ１０５ｃｅｌｌｓのＲＡＷ２６４．７細胞を２４ウェルマイクロプレートに植えて炭酸ガスインキュベーター内で５％ＣＯ２条件下、３７℃、約１６時間培養してから、培地を１ｍｌの無色Ｄ−ＭＥＭに培地交換して、被検サンプルのＤＭＳＯ溶液5μｌ、Ｌ−アルギニン（終濃度２ｍＭ）、誘導剤として、インターフェロン−γ（終濃度１００U／ｍｌ）およびリポ多糖（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、再び炭酸ガスインキュベーター内で５％ＣＯ２条件下、３７℃、２４時間培養した。培養後、培養液中に生じたＮＯを、亜硝酸塩としてグリース法で比色定量し比較した。Ａｓｓａｙに用いた細胞の生存率は、ＭＴＴ法によって測定した。ＮＯ産生抑制率及び細胞生存率は、以下の式より求めた。
【００３１】
ＮＯ産生抑制率（％）＝｛（（Ｘ−Ｃ）−（Ｙ−Ｃ））／（Ｘ−Ｃ）｝ｘ１００
細胞生存率（%）＝（Ｙ／Ｘ）ｘ１００
Ｘ：誘導剤のみ加えた場合（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定値
Ｙ：誘導剤および被検サンプルを加えた場合の測定値
Ｃ：細胞のみ培養した場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定値
【００３２】
実施例１〜４で得られる抽出物A、B、CおよびDのＮＯ産生抑制活性を上記の方法で比較した。図１に示すように、抽出物Dが特に高い活性を有することが認められた。
【実施例６】
【００３３】
実施例４の抽出方法において、前処理である水抽出時の温度を４５℃にして抽出操作を行い、その残さを回収して、同様にエタノール抽出を行った。コブミカン乾燥葉５ｇあたり０．２４ｇの抽出物D−２を得た。
【実施例７】
【００３４】
実施例４の抽出方法において、前処理である水抽出時の温度を２０℃にして抽出操作を行い、その残さを回収して、同様にエタノール抽出を行った。コブミカン乾燥葉５ｇあたり０．２４ｇの抽出物D−３を得た。
【実施例８】
【００３５】
実施例４における抽出方法で、前処理である水抽出時の温度が与えるＮＯ産生抑制活性への影響を比較するため、実施例４、６および７の抽出物のＮＯ産生抑制活性を実施例５の方法で比較した。図２に示すように、エタノール抽出の前処理である水による抽出を４５℃以上で処理した抽出物Ｄおよび抽出物Ｄ−２のＮＯ産生抑制活性が高いことを確認した。
【実施例９】
【００３６】
キンカンの葉を抽出原料として、実施例４の方法で抽出物を調製した。生葉１ｇあたり１８ｍｇの抽出物１を得た。
【実施例１０】
【００３７】
ユズの葉を抽出原料として、実施例４の方法で抽出物を調製した。生葉１ｇあたり１１ｍｇの抽出物２を得た。
【実施例１１】
【００３８】
ナツミカンの葉を抽出原料として、実施例４の方法で抽出物を調製した。生葉１ｇあたり１２ｍｇの抽出物３を得た。
【実施例１２】
【００３９】
実施例４、９、１０および１１で得た抽出物Ｄ、１、２および３のＮＯ産生抑制活性の比較を、実施例５の方法で行った。図３に示すように、どの柑橘類の葉抽出物もほぼ同程度のNO産生抑制活性を有することを確認した。
【実施例１３】
【００４０】
実施例４の方法で調製した抽出物Ｄを用いて、ラット−アジュバント関節炎に対する抑制効果を確認した。Ｌｅｗｉｓ系雌性ラット（８週齢、ＳＰＦ）を１群５匹として、７日間予備飼育して実験に供した。感作アジュバントは、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ死菌微粉末を２ｍｇ／ｍｌの流動パラフィン懸濁液として調製した。ラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、作製したアジュバントの０．１ｍｌを右後肢の足蹠皮内に注射し関節炎を誘発した。
被検サンプルとして、０．５％（Ｖ／Ｗ）カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）水溶液に抽出物Ｄが３０ｍｇ／ｍｌ含有する組成物を調製した。試験群には、この組成物を感作日をｄａｙ０としてｄａｙ２１まで（２２日間）１週間のうち６日間、午前中に１ｍｌ／１００ｇ ｂ．ｗ．の割合で強制経口投与を行った。一方、対照群には、０．５％ＣＭＣ水溶液のみを同様に強制経口投与した。
【００４１】
試験期間中、ｄａｙ０、３、８、１３、１６および２１に体重、足容積および関節炎スコアを測定した。関節炎スコアとは、感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢および左後肢の発赤、腫脹および強直の程度を肉眼的に観察し、以下に示す基準に従った0〜4点のスコアを付け、最高１２点の合計で評価した。
０：ｎｉｌ
１：ｍｉｌｄ
２：ｍｏｄｅｒａｔｅ
３：ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ−ｓｅｖｅｒｅ
４：ｓｅｖｅｒｅ
【００４２】
得られた体重、関節炎スコアおよび足容積は群毎の平均値±標準誤差で示した。各群間の統計的有意差を検定するため、解析ソフト（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ、Ａｂａｃｕｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて統計処理を行った。体重および容積データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い等分散であることを確認した後、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。また、スコアデータはＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて群間の比較を行った。いずれの場合もｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意であると判定した。
【００４３】
感作後２１日目の結果から、抽出物Ｄを含む組成物を投与した試験群は、関節炎スコア（表２）と感作肢（右肢）容積（表３）の有意な抑制および非感作肢（左肢）容積（表４）の抑制傾向を示した。
【００４４】
以上の結果より、コブミカン葉抽出物は慢性関節リウマチの動物モデルの一つとされているラットアジュバント関節炎に対して有効性を示すことが示唆された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
以上、実施例５、８および１２の結果から、本発明の抽出物がNO産生抑制作用を有することが証明された。また、実施例１３の結果から本発明の組成物が、慢性関節炎抑制効果を有することが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】コブミカン葉抽出方法において、抽出溶媒および抽出操作が、抽出物の一酸化窒素産生抑制活性に及ぼす影響を比較した図。（実施例５）
【図２】コブミカン葉抽出方法における、前処理での水の温度が、抽出物の一酸化窒素産生抑制活性に及ぼす影響を比較した図。（実施例８）
【図３】各種柑橘類の葉抽出物の一酸化窒素産生抑制活性を確認した図。（実施例１２）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の植物抽出物を有効成分とする一酸化窒素産生抑制組成物および、関節炎抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（以下ＮＯと略す。）は１９８０年代に内皮細胞由来平滑筋弛緩因子として、はじめて生体内で産生されることが解明された。それ以来、様々な研究が進められ、ＮＯは、血管拡張因子、神経伝達物質としての作用のみならず、感染、炎症、免疫反応のメディエーターとしてＮＯそのものまたはＮＯから生成されるペルオキシナイトライトを介しての細胞障害性など、善悪両面の作用を持つことが知られてきた。
【０００３】
生体内でＮＯは、Ｌ−アルギニンを基質として酵素により産生されることが知られている。その反応を触媒する酵素は、神経型のｎＮＯＳ、血管内皮型のｅＮＯＳおよび誘導型のｉＮＯＳの３種類が存在することが確認されている。ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳの産生するＮＯは、生体の恒常性維持のために利用されているが、感染や炎症に伴って誘導されるｉＮＯＳによって過剰に産生されるＮＯは、生理機能よりもむしろ様々な疾患に深く関与している。
【０００４】
現在、過剰に産生されたＮＯの関与することが知られている疾患は、慢性炎症を伴う各種消化器系疾患や、関節炎、リウマチなどの疾患、１型糖尿病および糖尿病合併症、気管支喘息などの呼吸器疾患、ＤＮＡ障害による癌の発生などである。（非特許文献１参照。）
【０００５】
リウマチなどの慢性関節炎においては、増殖した関節滑膜で産生される炎症性メディエーターが軟骨および骨破壊を進展させることが知られている。近年では、関節炎症局所においてNO産生が亢進していることが報告されており、ＮＯが慢性関節炎の発症および進展に深く関与していることが知られている。（非特許文献２参照。）
【０００６】
そのため、過剰なNO産生を抑制することが、様々な疾病を予防する上で、非常に有用であり、近年、合成物や天然物由来のNO産生抑制剤が多数提案されている。天然物由来ものとしては、例えばサラシア属植物に由来するもの（特許文献１参照。）、各種生薬、ハーブ類に由来のもの（特許文献２参照。）、インドネシア民間伝承薬植物に由来するもの（特許文献３参照。）などがあげられる。
【０００７】
また、柑橘類であるコブミカン葉の抽出物は、リノール酸の自動酸化における抗酸化性（特許文献４参照。）および発癌プロモーション抑制作用（特許文献５参照。）を有することが知られている。しかし、ＮＯ産生抑制作用および関節炎抑制作用を有することは全く知られていなかったことである。
【特許文献１】特開２００３−０６３９７４号公報
【特許文献２】特開２００２−０８７９７５号公報
【特許文献３】特開２００２−０４７１８１号公報
【特許文献４】特開平１１−１９９４２７号公報
【特許文献５】特許第３２９８７２３号公報
【非特許文献１】イラスト医学＆サイエンスシリーズ「ＮＯの生理作用と疾患」、羊土社、１９９９年
【非特許文献２】最新医学別冊「リウマチ２０００」、最新医学社、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
安全性の高い天然物を利用して、生体内で過剰に産生されるNOを抑制することで、様々な疾病、特にリウマチなどの慢性関節炎を予防または治療できる組成物を見出し、食品、特に健康補助食品あるいは医薬等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、安全性の高い天然物である植物素材を用いて、NO産生抑制作用および慢性関節炎抑制作用の検討を行った。その結果、コブミカン葉をはじめとする柑橘類の葉抽出物に強いＮＯ産生抑制作用および慢性関節炎抑制作用があることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
さらに本発明では、特にコブミカン葉等の柑橘類の葉を熱水抽出した残さを、エタノール等の有機溶媒で抽出して得られる抽出物がNO産生抑制剤および慢性関節炎抑制剤として有効であることを見出した。
【発明の効果】
【００１１】
食品、飼料および医薬品等へ配合することにより、マクロファージのNO産生を効果的に抑制し、過剰なNO産生が関連する様々な疾病、例えば慢性炎症を伴う各種消化器系疾患、１型糖尿病および糖尿病合併症、気管支喘息などの呼吸器疾患等、また特にリウマチ等の慢性関節炎の治療および予防に有用である。また天然物を用いることで、人体及び動物に対し有害な作用を示さず、きわめて安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いられる柑橘類の葉とは、カンキツ属（ミカン属）、キンカン属、カラタチ属植物の葉を示し、例えば、ウンシュウミカン、ナツミカン、キンカン、ユズ、ハッサク、イヨカン、ネーブル、ポンカン、オレンジ、ダイダイ、グレープフルーツ、ライム、レモン、コブミカン、スダチ、カボス、カラタチ等の葉が挙げられる。さらに好ましくは、コブミカン、ナツミカン、ユズ、キンカンの葉が挙げられる。これら柑橘類の葉は、生葉をそのまま抽出に用いることができるが、常法に従って、破砕、乾燥、粉末化等の加工を施したものを用いてもよい。
【００１４】
本発明における、熱水抽出処理した柑橘類の葉とは、４０℃以上の水を使って、数秒から数日間、好ましくは、数分から数時間、抽出処理を行った後に抽出液から回収された柑橘類の葉である。抽出に使用する溶媒量は、乾燥原材料１重量部当たり１〜１００００重量部が適当であり、さらに好ましくは１〜１０００重量部である。熱水抽出処理後の柑橘類の葉は、公知の方法で抽出液中から回収することができる。例えば、布、紙等を用いた濾過や遠心分離等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、上述の熱水抽出処理後の柑橘類の葉を、有機溶媒等を用いて抽出操作を行うことで、目的とする抽出物を得ることができる。有機溶媒による抽出に使用できる溶媒とは、熱水抽出処理後の柑橘類の葉に含まれる、水に難溶性または不溶性の成分を溶解させることのできるものであれば特に限定はないが、例えば低級アルコールであるメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等、あるいはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、アセトン、ジオキサン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ブチルメチルケトン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、キシレン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、ベンゼン、クロロホルムおよびトルエン等が挙げられる。
【００１６】
上記の溶媒を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよく、水と有機溶媒を併用してもよい。上記の低級アルコールおよび多価アルコールを含水アルコールとして使用する場合は、水分含量６０％以下が好ましい。特に、エタノールおよび含水エタノールが好ましい。
【００１７】
上述の有機溶媒による抽出の条件は、１０℃以上の温度で、数分から数日間、好ましくは、数十分から数十時間撹拌または超音波処理等することで、効率よく抽出を行うことができる。抽出に使用する溶媒量は、乾燥原材料１重量部当たり１〜１００００重量部が適当であり、さらに好ましくは１〜１０００重量部である。抽出処理後の抽出液は、公知の方法で抽出液から回収することができる。例えば、布、紙等を用いた濾過や遠心分離等が挙げられる。
【００１８】
このようにして得られた抽出液を濃縮して、次いで乾燥することによって抽出物を得ることができる。また、使用する溶媒によっては抽出液をそのまま使用することが可能であり、例えばエタノール等による抽出液はそのまま溶媒を除去せずに使用することができる。
【００１９】
本発明における過剰なNOが関与する疾病とは、ｉＮＯＳによって過剰に産生されるＮＯそのものまたは、ＮＯから生成されるペルオキシナイトライトを介しての細胞障害に起因する症状を伴う疾病を示し、例えば、リウマチ等の慢性関節炎、慢性炎症を伴う各種消化器系疾患、１型糖尿病および糖尿病合併症、気管支喘息などの呼吸器疾患、ＤＮＡ障害に伴う癌などが挙げられる。
【００２０】
本発明のＮＯ産生抑制剤の活性は、公知の方法である株化マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を用いたｉＮＯＳ誘導試験で確認することができる。ＲＡＷ２６４．７細胞にリポポリサッカライドおよびインターフェロン−γを作用させることにより誘導されたｉＮＯＳが産生するＮＯを、亜硝酸イオンとしてグリース法によって定量する。このとき被検物質の存在下で、抑制されるNO産生量を測定し抑制剤の活性を測ることができる。
【００２１】
本発明における慢性関節炎への効果の確認は、公知の慢性関節リウマチの動物モデル実験系であるアジュバント関節炎抑制試験で確認することができる。この試験では、ラットのフットパットに結核死菌より調製したアジュバントを皮下注射することで、リウマチ様の関節炎症状をおこし、被検物質による症状の改善または緩和状態をスコア化して測定する。
【００２２】
本発明の組成物は、NO産生抑制組成物又は関節炎抑制組成物として用いるいずれの場合においても、植物体の抽出物をそのまま服用してもよいが、これに賦形剤（白糖、乳糖、糖アルコール、デンプン、デキストリン、ゼラチン、セルロース類など）を添加して、錠剤、顆粒、カプセル剤等の固形剤として服用してもよい。更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することができる。
【００２３】
本発明のNO産生抑制組成物又は関節炎抑制組成物の投与量は、投与経路、疾患の程度、被投与者の年齢等によって異なるが、一般には経口摂取の場合、成人１日あたり、抽出物乾量で１ｍｇ〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ程度とすればよい。服用回数はとくに限定を要しないが、１日所要量を１〜５回程度に分けて摂取してもよい。
【００２４】
さらに、本発明においては、上記の植物体の抽出物を各種の食品、飼料、医薬品等へ常法に従って添加してもよい。
上記のような食品、飼料、医薬品等、とくに原料配合工程において、上記の植物体の抽出物を適量添加し、混合撹拌して原料を調整することにより、通常の製造工程と同一に、本発明の薬剤を含有する加工品を得ることができる。その添加量は、前記の経口投与量を目安として、食品の風味を悪化させない範囲内でその一部を置換するように適宜選択すればよい。
【００２５】
次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
抽出原料に凍結乾燥後粉砕したコブミカン葉粉末5gを用いて、クロロホルム／メタノール（２：１）混合溶液２５０ｍｌを加え、３０分間超音波処理による抽出を行い上清を回収した。残さは、４５ｍｌの同溶媒を加え、もう一度超音波処理して再び上清を回収した。回収した上清を合わせて減圧乾固して、０．４ｇの抽出物Aを得た。
【実施例２】
【００２７】
実施例１の抽出方法で、クロロホルム／メタノール混合溶液をエタノールに代えて同様の操作を行い、０．２ｇの抽出物Bを得た。
【実施例３】
【００２８】
凍結乾燥コブミカン葉粉末5gに対して、蒸留水を２５０ｍｌ加え、８０℃に加温して６０分間、撹拌抽出してから上清を回収した。残さに４５ｍｌの蒸留水を加え８０℃、５分間洗ってから、再び上清を回収した。回収した上清は、合わせて減圧乾固して、１．６ｇの抽出物Cを得た。
【実施例４】
【００２９】
実施例３における熱水抽出の残さを抽出原料に用いて、実施例２と同様のエタノールによる抽出を行い、０．２ｇの抽出物Dを得た。
【実施例５】
【００３０】
抽出条件の異なるコブミカン葉抽出物のＮＯ産生抑制活性を比較した。ＮＯ産生抑制活性の測定には、マウスマクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を用いた。２ｘ１０５ｃｅｌｌｓのＲＡＷ２６４．７細胞を２４ウェルマイクロプレートに植えて炭酸ガスインキュベーター内で５％ＣＯ２条件下、３７℃、約１６時間培養してから、培地を１ｍｌの無色Ｄ−ＭＥＭに培地交換して、被検サンプルのＤＭＳＯ溶液5μｌ、Ｌ−アルギニン（終濃度２ｍＭ）、誘導剤として、インターフェロン−γ（終濃度１００U／ｍｌ）およびリポ多糖（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、再び炭酸ガスインキュベーター内で５％ＣＯ２条件下、３７℃、２４時間培養した。培養後、培養液中に生じたＮＯを、亜硝酸塩としてグリース法で比色定量し比較した。Ａｓｓａｙに用いた細胞の生存率は、ＭＴＴ法によって測定した。ＮＯ産生抑制率及び細胞生存率は、以下の式より求めた。
【００３１】
ＮＯ産生抑制率（％）＝｛（（Ｘ−Ｃ）−（Ｙ−Ｃ））／（Ｘ−Ｃ）｝ｘ１００
細胞生存率（%）＝（Ｙ／Ｘ）ｘ１００
Ｘ：誘導剤のみ加えた場合（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定値
Ｙ：誘導剤および被検サンプルを加えた場合の測定値
Ｃ：細胞のみ培養した場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定値
【００３２】
実施例１〜４で得られる抽出物A、B、CおよびDのＮＯ産生抑制活性を上記の方法で比較した。図１に示すように、抽出物Dが特に高い活性を有することが認められた。
【実施例６】
【００３３】
実施例４の抽出方法において、前処理である水抽出時の温度を４５℃にして抽出操作を行い、その残さを回収して、同様にエタノール抽出を行った。コブミカン乾燥葉５ｇあたり０．２４ｇの抽出物D−２を得た。
【実施例７】
【００３４】
実施例４の抽出方法において、前処理である水抽出時の温度を２０℃にして抽出操作を行い、その残さを回収して、同様にエタノール抽出を行った。コブミカン乾燥葉５ｇあたり０．２４ｇの抽出物D−３を得た。
【実施例８】
【００３５】
実施例４における抽出方法で、前処理である水抽出時の温度が与えるＮＯ産生抑制活性への影響を比較するため、実施例４、６および７の抽出物のＮＯ産生抑制活性を実施例５の方法で比較した。図２に示すように、エタノール抽出の前処理である水による抽出を４５℃以上で処理した抽出物Ｄおよび抽出物Ｄ−２のＮＯ産生抑制活性が高いことを確認した。
【実施例９】
【００３６】
キンカンの葉を抽出原料として、実施例４の方法で抽出物を調製した。生葉１ｇあたり１８ｍｇの抽出物１を得た。
【実施例１０】
【００３７】
ユズの葉を抽出原料として、実施例４の方法で抽出物を調製した。生葉１ｇあたり１１ｍｇの抽出物２を得た。
【実施例１１】
【００３８】
ナツミカンの葉を抽出原料として、実施例４の方法で抽出物を調製した。生葉１ｇあたり１２ｍｇの抽出物３を得た。
【実施例１２】
【００３９】
実施例４、９、１０および１１で得た抽出物Ｄ、１、２および３のＮＯ産生抑制活性の比較を、実施例５の方法で行った。図３に示すように、どの柑橘類の葉抽出物もほぼ同程度のNO産生抑制活性を有することを確認した。
【実施例１３】
【００４０】
実施例４の方法で調製した抽出物Ｄを用いて、ラット−アジュバント関節炎に対する抑制効果を確認した。Ｌｅｗｉｓ系雌性ラット（８週齢、ＳＰＦ）を１群５匹として、７日間予備飼育して実験に供した。感作アジュバントは、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ死菌微粉末を２ｍｇ／ｍｌの流動パラフィン懸濁液として調製した。ラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、作製したアジュバントの０．１ｍｌを右後肢の足蹠皮内に注射し関節炎を誘発した。
被検サンプルとして、０．５％（Ｖ／Ｗ）カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）水溶液に抽出物Ｄが３０ｍｇ／ｍｌ含有する組成物を調製した。試験群には、この組成物を感作日をｄａｙ０としてｄａｙ２１まで（２２日間）１週間のうち６日間、午前中に１ｍｌ／１００ｇ ｂ．ｗ．の割合で強制経口投与を行った。一方、対照群には、０．５％ＣＭＣ水溶液のみを同様に強制経口投与した。
【００４１】
試験期間中、ｄａｙ０、３、８、１３、１６および２１に体重、足容積および関節炎スコアを測定した。関節炎スコアとは、感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢および左後肢の発赤、腫脹および強直の程度を肉眼的に観察し、以下に示す基準に従った0〜4点のスコアを付け、最高１２点の合計で評価した。
０：ｎｉｌ
１：ｍｉｌｄ
２：ｍｏｄｅｒａｔｅ
３：ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ−ｓｅｖｅｒｅ
４：ｓｅｖｅｒｅ
【００４２】
得られた体重、関節炎スコアおよび足容積は群毎の平均値±標準誤差で示した。各群間の統計的有意差を検定するため、解析ソフト（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ、Ａｂａｃｕｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて統計処理を行った。体重および容積データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い等分散であることを確認した後、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。また、スコアデータはＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて群間の比較を行った。いずれの場合もｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意であると判定した。
【００４３】
感作後２１日目の結果から、抽出物Ｄを含む組成物を投与した試験群は、関節炎スコア（表２）と感作肢（右肢）容積（表３）の有意な抑制および非感作肢（左肢）容積（表４）の抑制傾向を示した。
【００４４】
以上の結果より、コブミカン葉抽出物は慢性関節リウマチの動物モデルの一つとされているラットアジュバント関節炎に対して有効性を示すことが示唆された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
以上、実施例５、８および１２の結果から、本発明の抽出物がNO産生抑制作用を有することが証明された。また、実施例１３の結果から本発明の組成物が、慢性関節炎抑制効果を有することが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】コブミカン葉抽出方法において、抽出溶媒および抽出操作が、抽出物の一酸化窒素産生抑制活性に及ぼす影響を比較した図。（実施例５）
【図２】コブミカン葉抽出方法における、前処理での水の温度が、抽出物の一酸化窒素産生抑制活性に及ぼす影響を比較した図。（実施例８）
【図３】各種柑橘類の葉抽出物の一酸化窒素産生抑制活性を確認した図。（実施例１２）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０℃以上に加温した水で抽出処理した後の柑橘類の葉を、エタノール等の有機溶媒で抽出することで得られる抽出物を有効成分とする一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項２】
柑橘類の葉が、コブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ）の葉であることを特徴とする請求項１記載の一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は、２記載の一酸化窒素産生抑制剤を有効成分とする、一酸化窒素の過剰産生が関与する疾病の治療用又は予防用の組成物。
【請求項４】
一酸化窒素の過剰産生が関与する疾病が、慢性関節炎である請求項３記載の治療用又は予防用の組成物。
【請求項１】
４０℃以上に加温した水で抽出処理した後の柑橘類の葉を、エタノール等の有機溶媒で抽出することで得られる抽出物を有効成分とする一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項２】
柑橘類の葉が、コブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ）の葉であることを特徴とする請求項１記載の一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は、２記載の一酸化窒素産生抑制剤を有効成分とする、一酸化窒素の過剰産生が関与する疾病の治療用又は予防用の組成物。
【請求項４】
一酸化窒素の過剰産生が関与する疾病が、慢性関節炎である請求項３記載の治療用又は予防用の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２２００２（Ｐ２００６−２２００２Ａ）
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９８７４５（Ｐ２００４−１９８７４５）
【出願日】平成１６年７月６日（２００４．７．６）
【出願人】（０００２２６７６９）日新製糖株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月６日（２００４．７．６）
【出願人】（０００２２６７６９）日新製糖株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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