下痢原性大腸菌検出方法
【課題】 複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出する方法を提供する。
【解決手段】 本発明の下痢原性大腸菌検出方法は、菌種特異性を有するプライマー対群を用いて、一本鎖核酸から検査対象としての部分的でかつ連続な一本鎖核酸を増幅する工程と、前記増幅した核酸断片を定量する工程と、定量結果に基づいて、下痢原性大腸菌を特定する工程とを含む。
【解決手段】 本発明の下痢原性大腸菌検出方法は、菌種特異性を有するプライマー対群を用いて、一本鎖核酸から検査対象としての部分的でかつ連続な一本鎖核酸を増幅する工程と、前記増幅した核酸断片を定量する工程と、定量結果に基づいて、下痢原性大腸菌を特定する工程とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種の下痢原性大腸菌を同時に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生、食品工場などの分野において、食中毒の原因となる細菌として多くの種類が知られている。下痢原性大腸菌は、これらの食中毒の原因となる細菌に含まれる。下痢原性大腸菌には、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌などが知られている。
【０００３】
志賀毒素産生性大腸菌に属する大腸菌である、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は、志賀毒素を産生し、激しい出血性下痢を引き起こす。小児および老齢者では、症状が顕著であり、続発症として溶血性尿毒症症候群（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＨＵＳ）や脳症を起こすことが知られている。
【０００４】
志賀毒素産生性大腸菌に属する大腸菌のうち、Ｏ１５７、Ｏ１１１、Ｏ２６などの菌は、１００個以下で経口感染し、発症し、集団感染の原因となる。これらの大腸菌は、特に、腸管出血性大腸菌と呼ばれている。腸管出血性大腸菌、特にＯ１５７を検査する方法は、種々検討されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
特許文献１に記載の方法では、ベロ毒素遺伝子とＯ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子をコードするヌクレオチドの配列を増幅させるプライマーを用いて、標的ヌクレオチドを増幅させ、ベロ毒素遺伝子とＯ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子を検出する。
【特許文献１】特開平１１−３３２５９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）で得られた標的ヌクレオチドは、アガロースゲル電気泳動法を用いて検出する。このような従来の検出方法では、（１）ＰＣＲ工程と検出工程が別になっているため時間を要する、（２）ＰＣＲ産物の大きさによって該当するヌクレオチドが存在するかどうかを判定するため、特異性に問題が残る、などの問題がある。
【０００７】
一方、鑑別検査が困難であるという理由で、Ｏ１５７以外の下痢原性大腸菌については、通常臨床細菌検査は行われていない。このため、他の下痢原性大腸菌による感染の多くを見落としている可能性がある。特に、食品検査などの場合には、多数・多種類の検体を同時に検査する必要がある。したがって、Ｏ１５７を含めた下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出する方法が求められている。
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、下痢原性大腸菌の原因遺伝子を標的遺伝子として、これらの遺伝子を組み合わせて検出することで、複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
本発明の下痢原性大腸菌検出方法は、菌種特異性を有するプライマー対群を用いて、一本鎖核酸から検査対象としての部分的でかつ連続な一本鎖核酸を増幅する工程と、前記増幅した核酸断片を定量する工程と、定量結果に基づいて、下痢原性大腸菌を特定する工程とを含む。
【００１１】
前記菌種特異性を有するプライマー対群が、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０からなる配列対からなる群から選択される配列対の組み合わせであるとよい。
【００１２】
特定される下痢原性大腸菌が、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、または腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の下痢原性大腸菌検出方法は、下痢原性大腸菌の病因因子となる原因遺伝子を標的遺伝子として、これらの遺伝子を組み合わせて同時に検出する。この結果、複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明では、下痢原性大腸菌のうち、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、または腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌を検出する。
【００１５】
［下痢原性大腸菌の病因因子］
（腸管病原性大腸菌：ＥＰＥＣ）
腸管病原性大腸菌は、乳幼児胃腸炎の原因菌として知られている。発展途上国においては、深刻な感染症の原因菌である。ＥＰＥＣの病原因子は、ＥＰＥＣの小腸粘膜への接着および定着の際に見られる細胞骨格障害（ａｔｔａｃｈｉｎｇ−ｅｆｆａｃｔｉｎｇ ｌｅｓｉｏｎ：Ａ／Ｅ障害）である。Ａ／Ｅ障害では、ＥＰＥＣ表面に現れるインチミンが、小腸粘膜細胞への接着に重要な役割を果たしている。インチミンは、ＬＥＥ（ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｃｉｔｅ ｅｆｆａｃｅｍｅｎｔ）遺伝子群の一つであるインチミン遺伝子（ｅａｅ）にコードされている。
【００１６】
（志賀毒素産生性大腸菌：ＳＴＥＣ）
ＳＴＥＣは、志賀毒素（Ｓｔｘ）を産生する。Ｓｔｘには、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２の２種類がある。Ｓｔｘ１は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｃ １の産生する志賀毒素とほぼ一致する。Ｓｔｘ２は、種々の変異型の存在が知られている。ブタの浮腫病原因菌が産生するＳｔｘ２ｅのようにヒトに病原性を示さないものもある。
【００１７】
ＳＴＥＣの一部である腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）は、Ｓｔｘ産生性に加え、インチミン産生性を併せ持つ傾向がある。ＥＨＥＣの産生するインチミンは、ＥＰＥＣの産生するインチミンとは塩基配列が異なる。ＥＨＥＣの産生するインチミンは、ε型やγ型などに型別されている。
【００１８】
（腸管毒素原性大腸菌：ＥＴＥＣ）
ＥＴＥＣは、発展途上国における乳幼児下痢症および旅行者下痢症の主要な原因菌として知られている。ＥＴＥＣは、ＥＴＥＣ上の定着繊毛（ＣＦＡ）により小腸の粘膜上皮細胞に接着し、粘膜面で増殖してエンテロトキシンを産生することにより、下痢を発症する。エンテロトキシンには、６０℃１０分の加熱で活性を失う易熱性腸管毒素（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：ＬＴ）と、１００℃１５分の加熱に耐える耐熱性腸管毒素（ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：ＳＴ）の２種類がある。ＥＴＥＣは、それらのいずれかのまたは両方の毒素を産生する。ヒトのＥＴＥＣが産生するＳＴＩには、遺伝子間の相同性により、ＳＴＩａ（ＳＴｐ）とＳＴＩｂ（ＳＴｈ）の２種類がある。エンテロトキシンの遺伝子（ｅｌｔ、ｅｓｔ）は、通常１個のプラスミド上にある。エンテロトキシンの遺伝子の遺伝学的性状は安定しており、世代を経ても変化しない。
【００１９】
（腸管凝集接着性大腸菌：ＥＡｇｇＥＣ）
ＥＡｇｇＥＣは、ヒトの喉頭癌細胞であるＨＥｐ−２細胞に凝集塊を形成して接着する（ａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ：ＡＡ凝集接着）。ＥＡｇｇＥＣは、既知のエンテロトキシンを産生しない。ＥＡｇｇＥＣの病原性の詳細は明らかでない。ＥＡｇｇＥＣの凝集接着に関与する因子は、ＥＡｇｇＥＣ上のＡＡＦと呼ばれる線毛である。ＡｇｇＲ遺伝子（ａｇｇＲ）は、ＡＡＦの発現を制御している。
【００２０】
（腸管組織侵入性大腸菌：ＥＩＥＣ）
ＥＩＥＣは、大腸粘膜細胞内へ侵入する。そして、おそらくエンテロトキシンを産生する。ＥＩＥＣは、生化学的・血清学的性状に加え、遺伝子学的にも、病原性の上でも、Ｓｈｉｇｅｌｌａと密接に関係する。ＥＩＥＣのプラスミドｐＩｎｖ上のＶｉｒ遺伝子（ｖｉｒＢ）は、細胞侵入に関わる遺伝子を制御している。
【００２１】
（分散接着性大腸菌：ＤＡＥＣ）
ＤＡＥＣは、ＨＥｐ−２細胞に分散接着するグループである。このＤＡＥＣは、病原菌および非病原菌の両者を含む不均一な菌群である。ＤＡＥＣには、非線毛性接着因子（Ａｆａ）を持つものがある。また、下痢症患者から分離されたＤＡＥＣには、マンノース耐性赤血球凝集反応（ＭＲＨＡ）を示す、Ａｆａ／Ｄｒ＋型サブタイプのＡｆａＥ１、ＡｆａＥ２、ＡｆａＥ３（ｄｒａＥ）、ＡｆａＥ５、ＡｆａＥ６（ｄａａＥ）のいずれかを保有するものが多い。このことから、一部のＤＡＥＣの病原機構には、Ａｆａが関与すると考えられている。
【００２２】
（腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌：ＥＡＳＴ１ＥＣ）
ＥＡＳＴ１は、１９９１年にＥＡｇｇＥＣから発見された。その後ＥＡｇｇＥＣ以外の
下痢原性大腸菌からもａｓｔＡが検出され、ＥＡＳＴ１が下痢症に関与していることを示唆する集団事例が報告されている。ただし、ＥＡＳＴ１ＥＣの病原遺伝子は、明らかではない。
【００２３】
［標的遺伝子］
本発明では、上記下痢原性大腸菌の病原遺伝子である、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ、ｅｓｔ（ＳＴｐ）、ｅｓｔ（ＳＴｈ）、ｅｌｔ、ａｇｇＲ、ａｓｔＡ、ｖｉｒＢ、ａｆａＢ（Ａｆａ／Ｄｒ＋）を標的遺伝子として検出する。
【００２４】
［検体］
本発明の検出方法に用いられる検体としては、上記下痢原性大腸菌を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、食品、食品原料、拭き取り検体、ヒトや動物の臨床検査材料、例えば培養した菌体、糞便、吐瀉物、尿、血液、組織などが挙げられる。
【００２５】
上記検体は、検査の前に増菌処理を行ってもよい。増菌処理は公知の方法により行えばよく、例えばＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：食品医薬品局）の二段培養法などを用いることができる。
【００２６】
また、検体からのＤＮＡ抽出方法も特に限定されず、Ｍａｒｍｕｒ法（Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６１）３：２０８−２１８）、酵素法などのその改良法（Ｇ．Ｖｏｏｒｄｏｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｎ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１） ５７：３０７０−３０７８）、ベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９３） ２１：５２７９−５２８０）等の一般的な既知のＤＮＡ抽出法や、市販の各種ＤＮＡ抽出キット［例えば、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｎｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ， ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ）、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＩｓｏｐｌａｎｔＩＩ ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）等］などを用いてもよい。上記のＤＮＡ抽出法によって、ゲノムＤＮＡ及び細胞小器官由来ＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡなど）を、通常、検体から抽出することができる。
【００２７】
［下痢原性大腸菌の検出］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法では、上記ＤＮＡを、所定のプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、検出する。検出は、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物の蛍光強度をイメージアナライザ等を用いて数値化し、定量することも可能であるが、精度に限界があるため、リアルタイムＰＣＲ法を用いることが望ましい。
【００２８】
リアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクラーと蛍光光度計を一体化した機器、例えば
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行うことができる。この機器は、２つの蛍光を同時に検知し測定することができる。このため、マルチプレックス反応が可能である。また、リアルタイムＰＣＲ法により、ＰＣＲ産物の生成量をリアルタイムで検出可能となる。
【００２９】
ＰＣＲの反応条件の例は、始めの熱変性を９５℃１５分行い、９５℃１分、６０℃１分を４０サイクル行うなどである。
【００３０】
［プライマー］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法において、上記得られたＤＮＡは、表１に示す配列のプライマー対（配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０）を用いて標的核酸を増幅する。表１に示すように、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ、ｅｓｔ（ＳＴｐ）、ｅｓｔ（ＳＴｈ）、ｅｌｔ、ａｇｇＲ、ａｓｔＡ、ｖｉｒＢ、ａｆａＢ（Ａｆａ／Ｄｒ＋）のプライマーは、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマーセットである。これらのプライマーは、正常な増幅曲線が認められ、マルチプレックス反応において、他方の遺伝子にミスプライミングしないものである。
【００３１】
上記プライマーは、標的遺伝子上の表1に示す部位を含んでいれば、塩基配列の長さが３０程度まで前後に長く設定してもよく、５’末端側に他の塩基配列を含んでいてもよい。プライマー全体の長さが前記範囲内であり、且つ塩基配列が相補的になっていれば５‘側に伸ばしても３’側に伸ばしても、標的遺伝子の増幅に大きな影響は与えないからである。一方、５’末端側に他の塩基配列を含んでいてもよいのは、３’末端側の塩基配列がＰＣＲの特異的な増幅反応において重要であり、５’末端側の塩基配列が若干異なっていても、ＰＣＲの反応自体への悪影響が小さいからである。
【００３２】
［プローブ］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法において、増幅されたＤＮＡは、表２に示す配列のプローブを用いて検出する。表２に示す配列のプローブは、ＰＣＲ増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズする。
【００３３】
本発明で用いるプローブは、例えば５’末端をフルオレセン系の蛍光物質（レポータ色素として働く）（ＦＡＭ（カルボフルオレセン）、ＶＩＣなど）で、３’末端をローダミン系のクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡ、ＭＧＢ−ＮＦＱなど）で修飾した、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭＧＢプローブとして用いればよい。検出する下痢原性大腸菌の種類に応じて、プローブを修飾するレポータとクエンチャー物質を変えて、使用すればよい。表２には、プローブを修飾するレポータとクエンチャー物質の例が示されている。
【００３４】
表１、２に挙げられたプライマーおよびプローブは、以下の方法を用いて作成された。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｒ．２．０（ＡＢＩ）を用いて、添付のガイドラインに従い設計した。塩基配列は、例えば米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するＧｅｎＢａｎｋより収集した。本発明において設計に用いた配列のＩＤナンバーを表１、２に示す。
【００３５】
また、遺伝子にいくつかの変異型がある場合は，塩基配列のホモロジー比較をＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ．４．０．３（ゼネティックス，東京）を用いて、プライマー設計箇所を特定して設計を行った。設計後のプライマーおよびプローブ、アンプリコンはＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ （ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ）を用いて、標的遺伝子への特異性を確認した。
【００３６】
【表１】
【表２】
【００３７】
本発明で用いるプライマー及びプローブの使用濃度は適宜変更できる。特にマルチプレックスを行う場合は、組み合わせによって、使用濃度を適宜変更すればよい。表３には、ｓｔｘ（Ｓｔｘ１・Ｓｔｘ２）・ｅａｅトリプレックス、ｓｔｘ１・ｓｔｘ２デュプレックス、ｅｓｔ（ＳＴｐ・ＳＴｈ）・ｅｌｔトリプレックス，ｅｓｔ（ＳＴｐ）・ｅｓｔ（ＳＴｈ）デュプレックス，ａｇｇＲ・ａｓｔＡデュプレックス、ｖｉｒＢ・ａｆａＢデュプレックスを組み合わせて、リアルタイムＰＣＴを行った場合のプライマー及びプローブの使用濃度、最終濃度の一例を示す。
【表３】
【００３８】
［下痢原性大腸菌の検出］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法においては、上記下痢原性大腸菌の病原遺伝子である、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ、ｅｓｔ（ＳＴｐ）、ｅｓｔ（ＳＴｈ）、ｅｌｔ、ａｇｇＲ、ａｓｔＡ、ｖｉｒＢ、ａｆａＢ（Ａｆａ／Ｄｒ＋）の検出は、複数の標的遺伝子の組み合わせて行えばよい。例えば、ｓｔｘ（Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２）およびｅｓｔ（ＳＴｐ， ＳＴｈ）についてはデュプレックスＰＣＲで、ｅａｅはｓｔｘ（Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２遺伝子）とのトリプレックスＰＣＲで、ｅｌｔはｅｓｔ（ＳＴｐおよびＳＴｈ遺伝子）とのトリプレックスＰＣＲで行う、などである。
【００３９】
所定濃度の、検体由来のＤＮＡ、プライマー、プローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰなどを有するＰＣＴ反応液を、９６ウェルプレートなどのウェルプレートに入れ、蓋をする。これを用いて、リアルタイムＰＣＲを行う。
【００４０】
各標的遺伝子の検出は、ＰＣＲ産物を精製し、そのＤＮＡ濃度からコピー数を算出してあらかじめ作成しておいた検量線から求める。検量線は、ＰＣＲ反応のサイクル数とＤＮＡ濃度の対数値とをプロットして作成する。また、上記レポータとクエンチャー物質とで標識されたプローブを用いると、ＤＮＡの増幅に従い、標識したレポータがプローブの５’末端から解離される。このレポータの蛍光強度の変化を検出・解析して行う。
【００４１】
ＰＣＲ産物の定量、解析は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ）を用いて行うことができる。
【００４２】
本発明の方法によれば、多種類の下痢原性大腸菌が含まれている、異なる検体から、高い特異性と検出感度で、下痢原性大腸菌を網羅的に検出できる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
【００４４】
以下の実施例において、各病原遺伝子陽性株として、以下の菌株を使用した。これらの菌株は、リアルタイムPCR法による各遺伝子の定量に際して使用する検量線の作成と測定時の陽性対照として用いた。[ ]内は標的病原遺伝子を表す。
【００４５】
１．使用菌株
腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＰＥＣ）
Ｅ２３４８／６９ ［ｅａｅ］
腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＨＥＣ）
９９−１４０−Ａ（９９−２６） ［ｓｔｘ１，ｅａｅ］
Ｖ−８３１ ［ｓｔｘ２，ｅａｅ］
志賀毒素産生性大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＳＴＥＣ）
ＥＣ７２２５ ［ｓｔｘ１］
ＥＣ８２１２ ［ｓｔｘ２］
腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＴＥＣ）
９７−２４５−２４４ ［ｅｓｔ（ＳＴｐ）］
Ｅ７４７６ ［ｅｓｔ （ＳＴｈ）］
Ｅ５７９８ ［ｅｌｔ］
腸管凝集接着性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＡｇｇＥＣ）
Ｅ５９１５２ ［ａｇｇＲ］
腸管組織侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＩＥＣ）
Ｅ３５９９０ ［ｖｉｒＢ］
分散接着性大腸菌（Ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＤＡＥＣ）
Ｖ−６４ ［ａｆａＢ］
腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ １ ｇｅｎｅ−ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＡＳＴ１ＥＣ）
９６−１２７−２３ ［ａｓｔＡ］
【００４６】
２．培地
・トリプトソーヤブイヨン：ＴＳＢ
ＴＲＹＰＴＯＮＥ ＳＯＹＡ ＢＲＯＴＨ（Ｏｘｉｏｄ， Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１２ｇを４００ｍｌの蒸留水に混合し、加温溶解した後８ｍｌずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌（121℃，15分）した。
・トリプトソーヤ寒天平板：ＴＳＡ
ＴＲＹＰＴＯＮＥ ＳＯＹＡ ＡＧＡＲ（Ｏｘｉｏｄ）３２ｇを８００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した後，シャーレに約２０ｍｌずつ分注した。
【００４７】
（実施例１）
（リアルタイムＰＣＲ検量線の作成・各種細菌に対する検出特異性の確認）
（ＤＮＡの抽出）
ＤＮＡの抽出は、ＰＵＲＥＧＥＮＥ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ， ＵＳＡ）を用いて、添付のプロトコールを一部改変して以下の手順で行った。
【００４８】
１）５００μｌの菌懸濁液（ＴＳＢ、３７℃、１８時間培養、約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を１．５ｍｌマイクロチューブにとり、１５，０００×ｇで５分間遠心し，上清を取り除いた。
【００４９】
２）３００μｌのＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ピペッティングして沈殿とよく混合し、８０℃５分インキュベートした。
【００５０】
３）さらに、ときどき転倒混和しながら３７℃で３０分インキュベートした。１分間氷上に置き室温に戻し、軽く遠心して壁に付着した試薬等を落とした。
【００５１】
４）１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ボルテックスでハイスピード２０秒間激しく混和した。
【００５２】
５）タンパク質の沈殿を強固なペレットにするため、１５，０００×ｇで４分間遠心した。
【００５３】
６）上清を３００μｌの１００％イソプロパノール（２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ；和光純薬工業）が入った新しい１．５ｍｌチューブに移し、穏やかに５０回転倒混和した。
【００５４】
７）１５，０００×ｇで１分間遠心し、ペーパーの上に上清を捨て、３００μｌの７０％エタノール（ｖ／ｖ）を加えて数回転倒させＤＮＡを洗浄した。
【００５５】
８）さらに１５，０００×ｇで1分間遠心し、エタノールを注意深く捨て、ペーパーの上にチューブを伏せてペレットを乾燥した。
【００５６】
９）５０μｌのＤＮＡ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、６５℃１分間インキュベートまたは室温で一晩静置し，途中数回タッピングを行った。ＤＮＡは−２０℃で保存した．
【００５７】
なお、培養菌液は段階希釈後スパイラルプレート法でＴＳＡに塗沫し、生菌数を算出した。
【００５８】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲは、ｓｔｘ（Ｓｔｘ１・Ｓｔｘ２）・ｅａｅトリプレックス、ｓｔｘ１・ｓｔｘ２デュプレックス、ｅｓｔ（ＳＴｐ・ＳＴｈ）・ｅｌｔトリプレックス、ｅｓｔ（ＳＴｐ）・ｅｓｔ（ＳＴｈ）デュプレックス、ａｇｇＲ・ａｓｔＡデュプレックス、ｖｉｒＢ・ａｆａＢデュプレックスの組み合わせで行った。リアルタイムＰＣＲで使用したａｆａＢプライマーおよびプローブは、Ａｆａ／Ｄｒ＋のＤＡＥＣが持つａｆａＢのみを標的とする
【００５９】
単一のプライマーを使用する際は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を、マルチプレックスの場合は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【００６０】
添付のプロトコールに従い、反応液は計５０μｌとし、２×マスターミックスを２５μｌ添加した。単一のプライマー・プローブを使用する際は、プライマー各０．３μＭ、プローブ０．１μＭとした。
【００６１】
ＰＣＲ反応液は、９６ウェルプレート（Ｂ−９６−ＡＢ−ＲＴ；イナ・オプティカ、大阪）に分注した。各ウェルにテンプレートＤＮＡ２μｌを添加した。プレートは、ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌ ＲＴ ｆｉｌｍ （５０μｍ−ｔｈｉｃｋ；ＥＸＣＥＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）でシールし、Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ （ＡＢＩ）で覆った。ＰＣＲ条件は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）の場合は、９５℃１分の熱変性ステップの後、９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクル行った。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）の場合は、始めの熱変性を９５℃１５分行い、９５℃１分、６０℃１分を４０サイクル行った。
【００６２】
リアルタイムPCR装置は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ）を使用した。添付のプロトコールに従い、ＰＣＲおよびデータ解析を行った。
【００６３】
（検量線の作成）
定量試験では、各病原遺伝子陽性株のテンプレートＤＮＡを１０倍段階希釈して、１濃度につき３対（競合試験は１点のみ）リアルタイムＰＣＲで測定した。テンプレートＤＮＡは、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ｐｒｏ “Ｓ” ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により吸光度を測定し、濃度をもとめ初期鋳型量を算出した。各ＰＣＲ条件について、初期鋳型濃度とＣｔ値（増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ））から検量線を作成し、各濃度におけるＣｔ値を比較した。ＰＣＲ増幅効率は次の計算式により算出した。
Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１
（Ｘ軸に初期鋳型濃度（Ｌｏｇ１０）をY軸にＣｔ値を取った場合）
また、ＰＣＲに供した菌液の濃度（ｃｆｕ／ｍｌ）から、各条件下での最小検出濃度（検出限界）を算出し比較を行った。
【００６４】
各マルチプレックス・リアルタイムＰＣＲの検量線は，すべての遺伝子においてＩＵＰＡＣの検出限界の定義に基づく決定係数（Ｒ２）が０．９９以上となった。増幅効率は７８−１０８％であった。また、マルチプレックス反応（各病原遺伝子陽性株のテンプレートを１：１の割合で混合）で増幅させ測定した場合においても単一の遺伝子を増幅させ測定した場合と同程度に検出および定量された。さらに、競合条件下（各病原遺伝子陽性株のテンプレートを１：１−１０５：１または１０６：１の割合で混合）においても、すべての遺伝子について、１：１のマルチプレックス反応と同程度に検出および定量された。検出限界値は３．７×１０２−１．２×１０４ｃｆｕ／ｍｌとなり，上記のいずれの条件においても同程度の感度で検出された（表４）。表４は、リアルタイムＰＣＲにおける各条件下での検出限界値を示す表である。
【表４】
【００６５】
（各種細菌に対する検出特異性の確認）
次に、陽性対照群、陰性対照群の大腸菌株を用いて、上記の方法でＤＮＡを抽出して、通常のＰＣＲと、リアルタイムＰＣＲを行い、検出効果を比較した。
【００６６】
なお、以下の実験において、比較例として用いる通常のＰＣＲは、下記表５のプライマーを用いて行った。標的遺伝子は、ｉｎｖＥ、ｓｔｘ、ｅｌｔ、ｅｓｔ、ｅａｅＡ、ａｇｇＲ、ａｆａＣ、ａｓｔＡである。Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を、使用した。
【表５】
【００６７】
表６、７は、本実施例に用いた陽性対照群、陰性対照群の大腸菌株（菌株番号１〜９６）、非大腸菌（菌株番号９７）、赤痢菌（菌株番号９８）、コレラ菌（菌株番号９７、９８）を示す。表６、７において、グループは、上記で示したＤＥＣの種類を意味し、血清型に記号が付されているものは、血清型の毒素を持つものを意味し、保有病原遺伝子は、各菌株において、有している病原遺伝子を意味する。表６、７において、ａは、検量線用陽性対照を、ｂは、秋田県健康環境センター 微生物班 八柳潤先生より分与を、ｃは、大阪市立環境科学研究所 微生物保健課 中村寛美先生より分与を意味する。
【表６】
【表７】
【００６８】
表８、９は、表６、７に示す陽性対照群、陰性対照群の菌株を用いて、上記の方法でＤＮＡを抽出して、通常のＰＣＲと、リアルタイムＰＣＲを行い、標的遺伝子の検出効果を比較した表である。表８、９において、記載されている菌株番号は、表６、７に示す菌株に付された菌株番号と同一である。
【表８】
【表９】
【００６９】
表８、９から、検出したｓｔｘ１陽性１６株（赤痢菌：Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ １株（菌株番号９８）を含む）、ｓｔｘ２陽性２０株（菌株番号１３、１６、１７、１９、２９、２３−２７、３８、４０）、ｅａｅ陽性３５株、ｅｓｔ（ＳＴｐ）陽性４株、ｅｓｔ（ＳＴｈ）陽性６株、ｅｌｔ陽性５株、ａｇｇＲ陽性１４株、ａｓｔＡ陽性２３株、ａｆａＢ陽性６株、ｖｉｒＢ陽性２株については、ＰＣＲのデータと一致していることがわかる。なお、ＰＣＲでは、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｓｔｘ２Ｖｈａは、同じプライマーで検出した。また、ｅｌｔと塩基配列が似ているとされるコレラ毒素遺伝子ｃｔｘ陽性株（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）２株は、リアルタイムＰＣＲでは検出されないことを確認した。
【００７０】
以上から、純培養菌液から抽出を行ったテンプレートＤＮＡを用いたマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法では、すべての組み合わせにおいて本発明で検出対象となる遺伝子を有する大腸菌を、高い特異性と検出感度で検出されることがわかった。これにより、本発明の方法を用いれば、本発明の検出対象となる下痢原性大腸菌を検出できることがわかる。
【００７１】
（実施例２）
（食品中の下痢原性大腸菌検出）
（使用菌株）
実施例１に用いた各病原性遺伝子陽性群を用いた。
【００７２】
（培地・試薬）
・ブレインハートインフュージョンブイヨン：ＢＨＩ
ＢＲＡＩＮ ＨＥＡＲＴ ＩＮＦＵＳＩＯＮ（Ｏｘｉｏｄ）３７ｇを１０００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した。
【００７３】
・トリプトンフォスフェートブイヨン：ＴＰ
Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬株式会社，東京）２０ｇ、りん酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４；和光純薬工業）２ｇ、りん酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４；和光純薬工業）２ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；和光純薬工業）５ｇ、Ｔｗｅｅｎ ８０（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）１．５ｍｌを１０００ｍｌの蒸留水に混合し、５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；和光純薬工業）溶液でｐＨ７．０に調整してオートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した。
【００７４】
・トリコロール寒天平板
トリコロール（株式会社エルメックス，東京）７．８５ｇを２００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した後、シャーレに約２０ｍｌずつ分注した。
【００７５】
・食品希釈用ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
りん酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４；和光純薬工業）３４ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解後、１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；和光純薬工業）溶液１７５ｍｌを加え、蒸留水で全量を１０００ｍｌとして、ｐＨ７．２に修正した。これを原液として冷蔵保管し、使用時には原液１ｍｌを蒸留水８００ｍｌに混合し、０．８５％となるよう塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；和光純薬工業）を加えてオートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した。
【００７６】
（食品の培養方法）
食品の増菌培養法にはＦＤＡの二段培養法を用いて、以下の手順で行った。
滅菌ストマフィルター（Ｓタイプ；株式会社ＧＳＩクレオス理化学機器部，東京）に検体を無菌的に約１０ｇとり、Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｉｌｕｔｅｒ （ＩＵＬ，Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を用いてＢＨＩを１０倍希釈量加えた。マスティケーター（ＩＵＬ，Ｓ．Ａ．）を用いて９０秒間よく混和させ、３７℃３時間静置した。培養後、フィルターを通して残渣を除きながら別の滅菌ストマフィルター（Ｐタイプ；ＧＳＩクレオス）に移し、再びＳｙｓｔｅｍ Ｄｉｌｕｔｅｒを用いて等量のＴＰを加え、混和させてから４４℃の水浴で２０時間培養した。培養後のサンプル液は、トリコロール寒天平板に画線塗沫し、３７℃一晩培養して大腸菌および大腸菌群の有無を調べた。
【００７７】
（食品の増菌培養液の保存）
１０ｍｌのサンプル液を１５ｍｌの遠沈管にとり、１０，０００ｒｐｍ（回転半径８４ｍｍ，４℃）で１０分間遠心した。上清をデカントして捨て、１０％グリセロール（関東化学）添加ＢＨＩを２ｍｌ加えてよく混和した後、１ｍｌずつ凍結保存用バイアル（２ｍｌ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｃｒｅｗｃａｐ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ；旭テクノグラス，東京）に分注し、−８０℃で保存した。
【００７８】
（食品の細菌培養液中のＤＥＣ検出感度）
食品中に存在する様々な細菌や食品由来の物質に影響を受けることなく、目的の細菌を検出および定量できるかを検討した。まず、各病原遺伝子陽性株の増菌培養液（ＴＳＢ，３７℃１８時間培養，約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を食品希釈用ＰＢＳで１０倍段階希釈し、１．５ｍｌのマイクロチューブに食品（牛または豚ミンチ肉）の増菌後の培養液と下記表１０の分量で混合した。ｃｆｕは、コロニーを形成する単位（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を意味する。
【表１０】
【００７９】
実施例１と同様の方法でＤＮＡ抽出を行い、１濃度につき１点としてリアルタイムＰＣＲにて定量した。同時に菌液原液から抽出したテンプレートＤＮＡを１０倍段階希釈してられた検量線（１濃度につき３対）と比較した。ただし、ここではｓｔｘ（Ｓｔｘ１，Ｓｔｘ２）及びｅｓｔ（ＳＴｐ，ＳＴｈ）についてはデュプレックスＰＣＲ、ｅａｅはｓｔｘ（Ｓｔｘ１）とのデュプレックスＰＣＲ（プライマーはそれぞれ０．２μＭ，０．４μＭ，プローブ各０．１μＭ）、ｅｌｔはｅｓｔ（ＳＴｐ）とのデュプレックスＰＣＲ（プライマーはそれぞれ０．３μＭ、０．４μＭ，プローブ各０．１μＭ）を行った。
【００８０】
表１１は、純粋培養をした菌液の検出限界と、食品の増菌培養液における菌液の検出限界を表す表である。検体に測定対象としたすべての遺伝子、また各々の組み合わせにおいて，純培養菌液のテンプレートを段階希釈して作成した検量線とおおむね一致した。また、検出限界は純培養菌液時と同様に約１０３−１０４ｃｆｕ／ｍｌまで検出可能であった（表１１）。リアルタイムPCRではすべての遺伝子について，純培養の菌液を測定した場合と同程度の感度を保っていた。このことから、食品中の常在細菌や食品由来の物質に影響を受けることなく、目的の病原遺伝子を検出および定量できることがわかった。
【表１１】
【００８１】
（食品中のＤＥＣ検出）
ＦＤＡの二段培養法による食品中のＤＥＣ検出感度を、リアルタイムＰＣＲで調べた。
【００８２】
ＤＥＣ（ＥＨＥＣ，ＥＰＥＣ，ＥＡｇｇＥＣ，ＥＡＳＴ１ＥＣ，ＤＡＥＣ，ＥＩＥＣ）汚染食品モデルとして大阪府下の小売店より購入した牛ミンチ肉を、ＥＴＥＣ汚染モデルとして豚ミンチ肉を用いた。各病原遺伝子陽性株の増菌培養液（３７℃１８時間，約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を食品希釈用ＰＢＳで１０倍段階希釈し、ミンチ肉１０ｇにそれぞれ約１，１０，１００ｃｆｕ／ｍｌの菌液を１ｍｌ添加した。陰性対照として、食品希釈用ＰＢＳを１ｍｌ加えた。検体は上記食品の増菌培養法に従って増菌培養を行い、ＤＮＡ抽出後リアルタイムＰＣＲ及びＰＣＲにて遺伝子の有無を調べた。各株とも５種類の検体を用いて検討した。
【００８３】
ＦＤＡの二段培養法による食品中のＤＥＣ検出感度を、表１２に示す。リアルタイムＰＣＲではミンチ肉１０ｇに対し、１０ｃｆｕ以上の添加量では１００％、１ｃｆｕレベルでも７２％の検体で陽性となった（表１２（ｂ））。一方、通常のＰＣＲでは１００、１０、１ｃｆｕ添加でそれぞれ９１、８４、４７％となった（表１２（ａ））。特に、ｅｓｔ，ｅｌｔを対象とするＰＣＲにおいて陽性率の低下が顕著であった。この結果から、本発明の検出方法を用いると、きわめて検出感度に優れることがわかった。
【表１２】
【００８４】
このことから、本発明のリアルタイムＰＣＲを用いると、食品中に少量のＤＥＣが存在する場合であっても、検出できることがわかった。
【００８５】
（スクリーニング試験）
大阪府下を流通する食材１１５検体(肉類２３，野菜類４６，魚介類１７，動物性加工食品１５，植物性加工食品１４)と上記食品中のＤＥＣの検出で作成した陰性対照群３３検体の計１４８検体について、ＦＤＡの二段培養法で増菌し、リアルタイムＰＣＲ法で、ＤＥＣの検索を行った。結果を表１３に示す。陽性となった食品検体については，増菌培養液の当該病原遺伝子保有菌の濃度を、既述の方法で作成した検量線を用いて算出した。また、比較例として、上記ＰＣＲ法を用いて同様にＤＥＣを検出した結果を、下記表１３に、［ ］内に示した。
【表１３】
【００８６】
表１１から、増菌培養を行った食材１１５検体(肉類２３，野菜類４６，魚介類１７，動物性加工食品１５，植物性加工食品１４，表１０)のうち、表１１の大腸菌群の欄に示すように、８０検体がＥＭＢ培地上に細菌コロニーを形成した。コロニーによって細菌の存在が確認された８０検体について、リアルタイムＰＣＲで各病原遺伝子の検索を行ったところ、４１検体が陽性となった（表１１）。
【００８７】
総計１４８検体中、病原性遺伝子陽性となった検体は、リアルタイムＰＣＲでは４１検体（２８％）であった。細菌培養により大腸菌が検出された８０検体中の４１検体に下痢原性大腸菌が存在していることがわかる。一方、ＰＣＲでは、３５検体しか検出できなかった。
【００８８】
このことから、本発明の検出方法を用いると、複数のＤＥＣを精度よく検出できることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種の下痢原性大腸菌を同時に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生、食品工場などの分野において、食中毒の原因となる細菌として多くの種類が知られている。下痢原性大腸菌は、これらの食中毒の原因となる細菌に含まれる。下痢原性大腸菌には、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌などが知られている。
【０００３】
志賀毒素産生性大腸菌に属する大腸菌である、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は、志賀毒素を産生し、激しい出血性下痢を引き起こす。小児および老齢者では、症状が顕著であり、続発症として溶血性尿毒症症候群（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＨＵＳ）や脳症を起こすことが知られている。
【０００４】
志賀毒素産生性大腸菌に属する大腸菌のうち、Ｏ１５７、Ｏ１１１、Ｏ２６などの菌は、１００個以下で経口感染し、発症し、集団感染の原因となる。これらの大腸菌は、特に、腸管出血性大腸菌と呼ばれている。腸管出血性大腸菌、特にＯ１５７を検査する方法は、種々検討されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
特許文献１に記載の方法では、ベロ毒素遺伝子とＯ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子をコードするヌクレオチドの配列を増幅させるプライマーを用いて、標的ヌクレオチドを増幅させ、ベロ毒素遺伝子とＯ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子を検出する。
【特許文献１】特開平１１−３３２５９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）で得られた標的ヌクレオチドは、アガロースゲル電気泳動法を用いて検出する。このような従来の検出方法では、（１）ＰＣＲ工程と検出工程が別になっているため時間を要する、（２）ＰＣＲ産物の大きさによって該当するヌクレオチドが存在するかどうかを判定するため、特異性に問題が残る、などの問題がある。
【０００７】
一方、鑑別検査が困難であるという理由で、Ｏ１５７以外の下痢原性大腸菌については、通常臨床細菌検査は行われていない。このため、他の下痢原性大腸菌による感染の多くを見落としている可能性がある。特に、食品検査などの場合には、多数・多種類の検体を同時に検査する必要がある。したがって、Ｏ１５７を含めた下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出する方法が求められている。
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、下痢原性大腸菌の原因遺伝子を標的遺伝子として、これらの遺伝子を組み合わせて検出することで、複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
本発明の下痢原性大腸菌検出方法は、菌種特異性を有するプライマー対群を用いて、一本鎖核酸から検査対象としての部分的でかつ連続な一本鎖核酸を増幅する工程と、前記増幅した核酸断片を定量する工程と、定量結果に基づいて、下痢原性大腸菌を特定する工程とを含む。
【００１１】
前記菌種特異性を有するプライマー対群が、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０からなる配列対からなる群から選択される配列対の組み合わせであるとよい。
【００１２】
特定される下痢原性大腸菌が、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、または腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の下痢原性大腸菌検出方法は、下痢原性大腸菌の病因因子となる原因遺伝子を標的遺伝子として、これらの遺伝子を組み合わせて同時に検出する。この結果、複数種の下痢原性大腸菌を精度よく迅速に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明では、下痢原性大腸菌のうち、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、または腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌を検出する。
【００１５】
［下痢原性大腸菌の病因因子］
（腸管病原性大腸菌：ＥＰＥＣ）
腸管病原性大腸菌は、乳幼児胃腸炎の原因菌として知られている。発展途上国においては、深刻な感染症の原因菌である。ＥＰＥＣの病原因子は、ＥＰＥＣの小腸粘膜への接着および定着の際に見られる細胞骨格障害（ａｔｔａｃｈｉｎｇ−ｅｆｆａｃｔｉｎｇ ｌｅｓｉｏｎ：Ａ／Ｅ障害）である。Ａ／Ｅ障害では、ＥＰＥＣ表面に現れるインチミンが、小腸粘膜細胞への接着に重要な役割を果たしている。インチミンは、ＬＥＥ（ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｃｉｔｅ ｅｆｆａｃｅｍｅｎｔ）遺伝子群の一つであるインチミン遺伝子（ｅａｅ）にコードされている。
【００１６】
（志賀毒素産生性大腸菌：ＳＴＥＣ）
ＳＴＥＣは、志賀毒素（Ｓｔｘ）を産生する。Ｓｔｘには、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２の２種類がある。Ｓｔｘ１は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｃ １の産生する志賀毒素とほぼ一致する。Ｓｔｘ２は、種々の変異型の存在が知られている。ブタの浮腫病原因菌が産生するＳｔｘ２ｅのようにヒトに病原性を示さないものもある。
【００１７】
ＳＴＥＣの一部である腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）は、Ｓｔｘ産生性に加え、インチミン産生性を併せ持つ傾向がある。ＥＨＥＣの産生するインチミンは、ＥＰＥＣの産生するインチミンとは塩基配列が異なる。ＥＨＥＣの産生するインチミンは、ε型やγ型などに型別されている。
【００１８】
（腸管毒素原性大腸菌：ＥＴＥＣ）
ＥＴＥＣは、発展途上国における乳幼児下痢症および旅行者下痢症の主要な原因菌として知られている。ＥＴＥＣは、ＥＴＥＣ上の定着繊毛（ＣＦＡ）により小腸の粘膜上皮細胞に接着し、粘膜面で増殖してエンテロトキシンを産生することにより、下痢を発症する。エンテロトキシンには、６０℃１０分の加熱で活性を失う易熱性腸管毒素（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：ＬＴ）と、１００℃１５分の加熱に耐える耐熱性腸管毒素（ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：ＳＴ）の２種類がある。ＥＴＥＣは、それらのいずれかのまたは両方の毒素を産生する。ヒトのＥＴＥＣが産生するＳＴＩには、遺伝子間の相同性により、ＳＴＩａ（ＳＴｐ）とＳＴＩｂ（ＳＴｈ）の２種類がある。エンテロトキシンの遺伝子（ｅｌｔ、ｅｓｔ）は、通常１個のプラスミド上にある。エンテロトキシンの遺伝子の遺伝学的性状は安定しており、世代を経ても変化しない。
【００１９】
（腸管凝集接着性大腸菌：ＥＡｇｇＥＣ）
ＥＡｇｇＥＣは、ヒトの喉頭癌細胞であるＨＥｐ−２細胞に凝集塊を形成して接着する（ａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ：ＡＡ凝集接着）。ＥＡｇｇＥＣは、既知のエンテロトキシンを産生しない。ＥＡｇｇＥＣの病原性の詳細は明らかでない。ＥＡｇｇＥＣの凝集接着に関与する因子は、ＥＡｇｇＥＣ上のＡＡＦと呼ばれる線毛である。ＡｇｇＲ遺伝子（ａｇｇＲ）は、ＡＡＦの発現を制御している。
【００２０】
（腸管組織侵入性大腸菌：ＥＩＥＣ）
ＥＩＥＣは、大腸粘膜細胞内へ侵入する。そして、おそらくエンテロトキシンを産生する。ＥＩＥＣは、生化学的・血清学的性状に加え、遺伝子学的にも、病原性の上でも、Ｓｈｉｇｅｌｌａと密接に関係する。ＥＩＥＣのプラスミドｐＩｎｖ上のＶｉｒ遺伝子（ｖｉｒＢ）は、細胞侵入に関わる遺伝子を制御している。
【００２１】
（分散接着性大腸菌：ＤＡＥＣ）
ＤＡＥＣは、ＨＥｐ−２細胞に分散接着するグループである。このＤＡＥＣは、病原菌および非病原菌の両者を含む不均一な菌群である。ＤＡＥＣには、非線毛性接着因子（Ａｆａ）を持つものがある。また、下痢症患者から分離されたＤＡＥＣには、マンノース耐性赤血球凝集反応（ＭＲＨＡ）を示す、Ａｆａ／Ｄｒ＋型サブタイプのＡｆａＥ１、ＡｆａＥ２、ＡｆａＥ３（ｄｒａＥ）、ＡｆａＥ５、ＡｆａＥ６（ｄａａＥ）のいずれかを保有するものが多い。このことから、一部のＤＡＥＣの病原機構には、Ａｆａが関与すると考えられている。
【００２２】
（腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌：ＥＡＳＴ１ＥＣ）
ＥＡＳＴ１は、１９９１年にＥＡｇｇＥＣから発見された。その後ＥＡｇｇＥＣ以外の
下痢原性大腸菌からもａｓｔＡが検出され、ＥＡＳＴ１が下痢症に関与していることを示唆する集団事例が報告されている。ただし、ＥＡＳＴ１ＥＣの病原遺伝子は、明らかではない。
【００２３】
［標的遺伝子］
本発明では、上記下痢原性大腸菌の病原遺伝子である、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ、ｅｓｔ（ＳＴｐ）、ｅｓｔ（ＳＴｈ）、ｅｌｔ、ａｇｇＲ、ａｓｔＡ、ｖｉｒＢ、ａｆａＢ（Ａｆａ／Ｄｒ＋）を標的遺伝子として検出する。
【００２４】
［検体］
本発明の検出方法に用いられる検体としては、上記下痢原性大腸菌を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、食品、食品原料、拭き取り検体、ヒトや動物の臨床検査材料、例えば培養した菌体、糞便、吐瀉物、尿、血液、組織などが挙げられる。
【００２５】
上記検体は、検査の前に増菌処理を行ってもよい。増菌処理は公知の方法により行えばよく、例えばＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：食品医薬品局）の二段培養法などを用いることができる。
【００２６】
また、検体からのＤＮＡ抽出方法も特に限定されず、Ｍａｒｍｕｒ法（Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６１）３：２０８−２１８）、酵素法などのその改良法（Ｇ．Ｖｏｏｒｄｏｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｎ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１） ５７：３０７０−３０７８）、ベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９３） ２１：５２７９−５２８０）等の一般的な既知のＤＮＡ抽出法や、市販の各種ＤＮＡ抽出キット［例えば、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｎｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ， ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ）、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＩｓｏｐｌａｎｔＩＩ ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）等］などを用いてもよい。上記のＤＮＡ抽出法によって、ゲノムＤＮＡ及び細胞小器官由来ＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡなど）を、通常、検体から抽出することができる。
【００２７】
［下痢原性大腸菌の検出］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法では、上記ＤＮＡを、所定のプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、検出する。検出は、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物の蛍光強度をイメージアナライザ等を用いて数値化し、定量することも可能であるが、精度に限界があるため、リアルタイムＰＣＲ法を用いることが望ましい。
【００２８】
リアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクラーと蛍光光度計を一体化した機器、例えば
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行うことができる。この機器は、２つの蛍光を同時に検知し測定することができる。このため、マルチプレックス反応が可能である。また、リアルタイムＰＣＲ法により、ＰＣＲ産物の生成量をリアルタイムで検出可能となる。
【００２９】
ＰＣＲの反応条件の例は、始めの熱変性を９５℃１５分行い、９５℃１分、６０℃１分を４０サイクル行うなどである。
【００３０】
［プライマー］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法において、上記得られたＤＮＡは、表１に示す配列のプライマー対（配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０）を用いて標的核酸を増幅する。表１に示すように、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ、ｅｓｔ（ＳＴｐ）、ｅｓｔ（ＳＴｈ）、ｅｌｔ、ａｇｇＲ、ａｓｔＡ、ｖｉｒＢ、ａｆａＢ（Ａｆａ／Ｄｒ＋）のプライマーは、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマーセットである。これらのプライマーは、正常な増幅曲線が認められ、マルチプレックス反応において、他方の遺伝子にミスプライミングしないものである。
【００３１】
上記プライマーは、標的遺伝子上の表1に示す部位を含んでいれば、塩基配列の長さが３０程度まで前後に長く設定してもよく、５’末端側に他の塩基配列を含んでいてもよい。プライマー全体の長さが前記範囲内であり、且つ塩基配列が相補的になっていれば５‘側に伸ばしても３’側に伸ばしても、標的遺伝子の増幅に大きな影響は与えないからである。一方、５’末端側に他の塩基配列を含んでいてもよいのは、３’末端側の塩基配列がＰＣＲの特異的な増幅反応において重要であり、５’末端側の塩基配列が若干異なっていても、ＰＣＲの反応自体への悪影響が小さいからである。
【００３２】
［プローブ］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法において、増幅されたＤＮＡは、表２に示す配列のプローブを用いて検出する。表２に示す配列のプローブは、ＰＣＲ増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズする。
【００３３】
本発明で用いるプローブは、例えば５’末端をフルオレセン系の蛍光物質（レポータ色素として働く）（ＦＡＭ（カルボフルオレセン）、ＶＩＣなど）で、３’末端をローダミン系のクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡ、ＭＧＢ−ＮＦＱなど）で修飾した、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭＧＢプローブとして用いればよい。検出する下痢原性大腸菌の種類に応じて、プローブを修飾するレポータとクエンチャー物質を変えて、使用すればよい。表２には、プローブを修飾するレポータとクエンチャー物質の例が示されている。
【００３４】
表１、２に挙げられたプライマーおよびプローブは、以下の方法を用いて作成された。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｒ．２．０（ＡＢＩ）を用いて、添付のガイドラインに従い設計した。塩基配列は、例えば米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するＧｅｎＢａｎｋより収集した。本発明において設計に用いた配列のＩＤナンバーを表１、２に示す。
【００３５】
また、遺伝子にいくつかの変異型がある場合は，塩基配列のホモロジー比較をＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ．４．０．３（ゼネティックス，東京）を用いて、プライマー設計箇所を特定して設計を行った。設計後のプライマーおよびプローブ、アンプリコンはＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ （ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ）を用いて、標的遺伝子への特異性を確認した。
【００３６】
【表１】
【表２】
【００３７】
本発明で用いるプライマー及びプローブの使用濃度は適宜変更できる。特にマルチプレックスを行う場合は、組み合わせによって、使用濃度を適宜変更すればよい。表３には、ｓｔｘ（Ｓｔｘ１・Ｓｔｘ２）・ｅａｅトリプレックス、ｓｔｘ１・ｓｔｘ２デュプレックス、ｅｓｔ（ＳＴｐ・ＳＴｈ）・ｅｌｔトリプレックス，ｅｓｔ（ＳＴｐ）・ｅｓｔ（ＳＴｈ）デュプレックス，ａｇｇＲ・ａｓｔＡデュプレックス、ｖｉｒＢ・ａｆａＢデュプレックスを組み合わせて、リアルタイムＰＣＴを行った場合のプライマー及びプローブの使用濃度、最終濃度の一例を示す。
【表３】
【００３８】
［下痢原性大腸菌の検出］
本発明の下痢原性大腸菌検出方法においては、上記下痢原性大腸菌の病原遺伝子である、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ、ｅｓｔ（ＳＴｐ）、ｅｓｔ（ＳＴｈ）、ｅｌｔ、ａｇｇＲ、ａｓｔＡ、ｖｉｒＢ、ａｆａＢ（Ａｆａ／Ｄｒ＋）の検出は、複数の標的遺伝子の組み合わせて行えばよい。例えば、ｓｔｘ（Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２）およびｅｓｔ（ＳＴｐ， ＳＴｈ）についてはデュプレックスＰＣＲで、ｅａｅはｓｔｘ（Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２遺伝子）とのトリプレックスＰＣＲで、ｅｌｔはｅｓｔ（ＳＴｐおよびＳＴｈ遺伝子）とのトリプレックスＰＣＲで行う、などである。
【００３９】
所定濃度の、検体由来のＤＮＡ、プライマー、プローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰなどを有するＰＣＴ反応液を、９６ウェルプレートなどのウェルプレートに入れ、蓋をする。これを用いて、リアルタイムＰＣＲを行う。
【００４０】
各標的遺伝子の検出は、ＰＣＲ産物を精製し、そのＤＮＡ濃度からコピー数を算出してあらかじめ作成しておいた検量線から求める。検量線は、ＰＣＲ反応のサイクル数とＤＮＡ濃度の対数値とをプロットして作成する。また、上記レポータとクエンチャー物質とで標識されたプローブを用いると、ＤＮＡの増幅に従い、標識したレポータがプローブの５’末端から解離される。このレポータの蛍光強度の変化を検出・解析して行う。
【００４１】
ＰＣＲ産物の定量、解析は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ）を用いて行うことができる。
【００４２】
本発明の方法によれば、多種類の下痢原性大腸菌が含まれている、異なる検体から、高い特異性と検出感度で、下痢原性大腸菌を網羅的に検出できる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
【００４４】
以下の実施例において、各病原遺伝子陽性株として、以下の菌株を使用した。これらの菌株は、リアルタイムPCR法による各遺伝子の定量に際して使用する検量線の作成と測定時の陽性対照として用いた。[ ]内は標的病原遺伝子を表す。
【００４５】
１．使用菌株
腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＰＥＣ）
Ｅ２３４８／６９ ［ｅａｅ］
腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＨＥＣ）
９９−１４０−Ａ（９９−２６） ［ｓｔｘ１，ｅａｅ］
Ｖ−８３１ ［ｓｔｘ２，ｅａｅ］
志賀毒素産生性大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＳＴＥＣ）
ＥＣ７２２５ ［ｓｔｘ１］
ＥＣ８２１２ ［ｓｔｘ２］
腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＴＥＣ）
９７−２４５−２４４ ［ｅｓｔ（ＳＴｐ）］
Ｅ７４７６ ［ｅｓｔ （ＳＴｈ）］
Ｅ５７９８ ［ｅｌｔ］
腸管凝集接着性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＡｇｇＥＣ）
Ｅ５９１５２ ［ａｇｇＲ］
腸管組織侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＩＥＣ）
Ｅ３５９９０ ［ｖｉｒＢ］
分散接着性大腸菌（Ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＤＡＥＣ）
Ｖ−６４ ［ａｆａＢ］
腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ １ ｇｅｎｅ−ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ：ＥＡＳＴ１ＥＣ）
９６−１２７−２３ ［ａｓｔＡ］
【００４６】
２．培地
・トリプトソーヤブイヨン：ＴＳＢ
ＴＲＹＰＴＯＮＥ ＳＯＹＡ ＢＲＯＴＨ（Ｏｘｉｏｄ， Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１２ｇを４００ｍｌの蒸留水に混合し、加温溶解した後８ｍｌずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌（121℃，15分）した。
・トリプトソーヤ寒天平板：ＴＳＡ
ＴＲＹＰＴＯＮＥ ＳＯＹＡ ＡＧＡＲ（Ｏｘｉｏｄ）３２ｇを８００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した後，シャーレに約２０ｍｌずつ分注した。
【００４７】
（実施例１）
（リアルタイムＰＣＲ検量線の作成・各種細菌に対する検出特異性の確認）
（ＤＮＡの抽出）
ＤＮＡの抽出は、ＰＵＲＥＧＥＮＥ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ， ＵＳＡ）を用いて、添付のプロトコールを一部改変して以下の手順で行った。
【００４８】
１）５００μｌの菌懸濁液（ＴＳＢ、３７℃、１８時間培養、約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を１．５ｍｌマイクロチューブにとり、１５，０００×ｇで５分間遠心し，上清を取り除いた。
【００４９】
２）３００μｌのＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ピペッティングして沈殿とよく混合し、８０℃５分インキュベートした。
【００５０】
３）さらに、ときどき転倒混和しながら３７℃で３０分インキュベートした。１分間氷上に置き室温に戻し、軽く遠心して壁に付着した試薬等を落とした。
【００５１】
４）１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ボルテックスでハイスピード２０秒間激しく混和した。
【００５２】
５）タンパク質の沈殿を強固なペレットにするため、１５，０００×ｇで４分間遠心した。
【００５３】
６）上清を３００μｌの１００％イソプロパノール（２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ；和光純薬工業）が入った新しい１．５ｍｌチューブに移し、穏やかに５０回転倒混和した。
【００５４】
７）１５，０００×ｇで１分間遠心し、ペーパーの上に上清を捨て、３００μｌの７０％エタノール（ｖ／ｖ）を加えて数回転倒させＤＮＡを洗浄した。
【００５５】
８）さらに１５，０００×ｇで1分間遠心し、エタノールを注意深く捨て、ペーパーの上にチューブを伏せてペレットを乾燥した。
【００５６】
９）５０μｌのＤＮＡ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、６５℃１分間インキュベートまたは室温で一晩静置し，途中数回タッピングを行った。ＤＮＡは−２０℃で保存した．
【００５７】
なお、培養菌液は段階希釈後スパイラルプレート法でＴＳＡに塗沫し、生菌数を算出した。
【００５８】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲは、ｓｔｘ（Ｓｔｘ１・Ｓｔｘ２）・ｅａｅトリプレックス、ｓｔｘ１・ｓｔｘ２デュプレックス、ｅｓｔ（ＳＴｐ・ＳＴｈ）・ｅｌｔトリプレックス、ｅｓｔ（ＳＴｐ）・ｅｓｔ（ＳＴｈ）デュプレックス、ａｇｇＲ・ａｓｔＡデュプレックス、ｖｉｒＢ・ａｆａＢデュプレックスの組み合わせで行った。リアルタイムＰＣＲで使用したａｆａＢプライマーおよびプローブは、Ａｆａ／Ｄｒ＋のＤＡＥＣが持つａｆａＢのみを標的とする
【００５９】
単一のプライマーを使用する際は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を、マルチプレックスの場合は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【００６０】
添付のプロトコールに従い、反応液は計５０μｌとし、２×マスターミックスを２５μｌ添加した。単一のプライマー・プローブを使用する際は、プライマー各０．３μＭ、プローブ０．１μＭとした。
【００６１】
ＰＣＲ反応液は、９６ウェルプレート（Ｂ−９６−ＡＢ−ＲＴ；イナ・オプティカ、大阪）に分注した。各ウェルにテンプレートＤＮＡ２μｌを添加した。プレートは、ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌ ＲＴ ｆｉｌｍ （５０μｍ−ｔｈｉｃｋ；ＥＸＣＥＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）でシールし、Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ （ＡＢＩ）で覆った。ＰＣＲ条件は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）の場合は、９５℃１分の熱変性ステップの後、９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクル行った。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）の場合は、始めの熱変性を９５℃１５分行い、９５℃１分、６０℃１分を４０サイクル行った。
【００６２】
リアルタイムPCR装置は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ）を使用した。添付のプロトコールに従い、ＰＣＲおよびデータ解析を行った。
【００６３】
（検量線の作成）
定量試験では、各病原遺伝子陽性株のテンプレートＤＮＡを１０倍段階希釈して、１濃度につき３対（競合試験は１点のみ）リアルタイムＰＣＲで測定した。テンプレートＤＮＡは、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ｐｒｏ “Ｓ” ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により吸光度を測定し、濃度をもとめ初期鋳型量を算出した。各ＰＣＲ条件について、初期鋳型濃度とＣｔ値（増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ））から検量線を作成し、各濃度におけるＣｔ値を比較した。ＰＣＲ増幅効率は次の計算式により算出した。
Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１
（Ｘ軸に初期鋳型濃度（Ｌｏｇ１０）をY軸にＣｔ値を取った場合）
また、ＰＣＲに供した菌液の濃度（ｃｆｕ／ｍｌ）から、各条件下での最小検出濃度（検出限界）を算出し比較を行った。
【００６４】
各マルチプレックス・リアルタイムＰＣＲの検量線は，すべての遺伝子においてＩＵＰＡＣの検出限界の定義に基づく決定係数（Ｒ２）が０．９９以上となった。増幅効率は７８−１０８％であった。また、マルチプレックス反応（各病原遺伝子陽性株のテンプレートを１：１の割合で混合）で増幅させ測定した場合においても単一の遺伝子を増幅させ測定した場合と同程度に検出および定量された。さらに、競合条件下（各病原遺伝子陽性株のテンプレートを１：１−１０５：１または１０６：１の割合で混合）においても、すべての遺伝子について、１：１のマルチプレックス反応と同程度に検出および定量された。検出限界値は３．７×１０２−１．２×１０４ｃｆｕ／ｍｌとなり，上記のいずれの条件においても同程度の感度で検出された（表４）。表４は、リアルタイムＰＣＲにおける各条件下での検出限界値を示す表である。
【表４】
【００６５】
（各種細菌に対する検出特異性の確認）
次に、陽性対照群、陰性対照群の大腸菌株を用いて、上記の方法でＤＮＡを抽出して、通常のＰＣＲと、リアルタイムＰＣＲを行い、検出効果を比較した。
【００６６】
なお、以下の実験において、比較例として用いる通常のＰＣＲは、下記表５のプライマーを用いて行った。標的遺伝子は、ｉｎｖＥ、ｓｔｘ、ｅｌｔ、ｅｓｔ、ｅａｅＡ、ａｇｇＲ、ａｆａＣ、ａｓｔＡである。Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を、使用した。
【表５】
【００６７】
表６、７は、本実施例に用いた陽性対照群、陰性対照群の大腸菌株（菌株番号１〜９６）、非大腸菌（菌株番号９７）、赤痢菌（菌株番号９８）、コレラ菌（菌株番号９７、９８）を示す。表６、７において、グループは、上記で示したＤＥＣの種類を意味し、血清型に記号が付されているものは、血清型の毒素を持つものを意味し、保有病原遺伝子は、各菌株において、有している病原遺伝子を意味する。表６、７において、ａは、検量線用陽性対照を、ｂは、秋田県健康環境センター 微生物班 八柳潤先生より分与を、ｃは、大阪市立環境科学研究所 微生物保健課 中村寛美先生より分与を意味する。
【表６】
【表７】
【００６８】
表８、９は、表６、７に示す陽性対照群、陰性対照群の菌株を用いて、上記の方法でＤＮＡを抽出して、通常のＰＣＲと、リアルタイムＰＣＲを行い、標的遺伝子の検出効果を比較した表である。表８、９において、記載されている菌株番号は、表６、７に示す菌株に付された菌株番号と同一である。
【表８】
【表９】
【００６９】
表８、９から、検出したｓｔｘ１陽性１６株（赤痢菌：Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ １株（菌株番号９８）を含む）、ｓｔｘ２陽性２０株（菌株番号１３、１６、１７、１９、２９、２３−２７、３８、４０）、ｅａｅ陽性３５株、ｅｓｔ（ＳＴｐ）陽性４株、ｅｓｔ（ＳＴｈ）陽性６株、ｅｌｔ陽性５株、ａｇｇＲ陽性１４株、ａｓｔＡ陽性２３株、ａｆａＢ陽性６株、ｖｉｒＢ陽性２株については、ＰＣＲのデータと一致していることがわかる。なお、ＰＣＲでは、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｓｔｘ２Ｖｈａは、同じプライマーで検出した。また、ｅｌｔと塩基配列が似ているとされるコレラ毒素遺伝子ｃｔｘ陽性株（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）２株は、リアルタイムＰＣＲでは検出されないことを確認した。
【００７０】
以上から、純培養菌液から抽出を行ったテンプレートＤＮＡを用いたマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法では、すべての組み合わせにおいて本発明で検出対象となる遺伝子を有する大腸菌を、高い特異性と検出感度で検出されることがわかった。これにより、本発明の方法を用いれば、本発明の検出対象となる下痢原性大腸菌を検出できることがわかる。
【００７１】
（実施例２）
（食品中の下痢原性大腸菌検出）
（使用菌株）
実施例１に用いた各病原性遺伝子陽性群を用いた。
【００７２】
（培地・試薬）
・ブレインハートインフュージョンブイヨン：ＢＨＩ
ＢＲＡＩＮ ＨＥＡＲＴ ＩＮＦＵＳＩＯＮ（Ｏｘｉｏｄ）３７ｇを１０００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した。
【００７３】
・トリプトンフォスフェートブイヨン：ＴＰ
Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬株式会社，東京）２０ｇ、りん酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４；和光純薬工業）２ｇ、りん酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４；和光純薬工業）２ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；和光純薬工業）５ｇ、Ｔｗｅｅｎ ８０（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）１．５ｍｌを１０００ｍｌの蒸留水に混合し、５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；和光純薬工業）溶液でｐＨ７．０に調整してオートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した。
【００７４】
・トリコロール寒天平板
トリコロール（株式会社エルメックス，東京）７．８５ｇを２００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した後、シャーレに約２０ｍｌずつ分注した。
【００７５】
・食品希釈用ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
りん酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４；和光純薬工業）３４ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解後、１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；和光純薬工業）溶液１７５ｍｌを加え、蒸留水で全量を１０００ｍｌとして、ｐＨ７．２に修正した。これを原液として冷蔵保管し、使用時には原液１ｍｌを蒸留水８００ｍｌに混合し、０．８５％となるよう塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；和光純薬工業）を加えてオートクレーブ滅菌（１２１℃，１５分）した。
【００７６】
（食品の培養方法）
食品の増菌培養法にはＦＤＡの二段培養法を用いて、以下の手順で行った。
滅菌ストマフィルター（Ｓタイプ；株式会社ＧＳＩクレオス理化学機器部，東京）に検体を無菌的に約１０ｇとり、Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｉｌｕｔｅｒ （ＩＵＬ，Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を用いてＢＨＩを１０倍希釈量加えた。マスティケーター（ＩＵＬ，Ｓ．Ａ．）を用いて９０秒間よく混和させ、３７℃３時間静置した。培養後、フィルターを通して残渣を除きながら別の滅菌ストマフィルター（Ｐタイプ；ＧＳＩクレオス）に移し、再びＳｙｓｔｅｍ Ｄｉｌｕｔｅｒを用いて等量のＴＰを加え、混和させてから４４℃の水浴で２０時間培養した。培養後のサンプル液は、トリコロール寒天平板に画線塗沫し、３７℃一晩培養して大腸菌および大腸菌群の有無を調べた。
【００７７】
（食品の増菌培養液の保存）
１０ｍｌのサンプル液を１５ｍｌの遠沈管にとり、１０，０００ｒｐｍ（回転半径８４ｍｍ，４℃）で１０分間遠心した。上清をデカントして捨て、１０％グリセロール（関東化学）添加ＢＨＩを２ｍｌ加えてよく混和した後、１ｍｌずつ凍結保存用バイアル（２ｍｌ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｃｒｅｗｃａｐ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ；旭テクノグラス，東京）に分注し、−８０℃で保存した。
【００７８】
（食品の細菌培養液中のＤＥＣ検出感度）
食品中に存在する様々な細菌や食品由来の物質に影響を受けることなく、目的の細菌を検出および定量できるかを検討した。まず、各病原遺伝子陽性株の増菌培養液（ＴＳＢ，３７℃１８時間培養，約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を食品希釈用ＰＢＳで１０倍段階希釈し、１．５ｍｌのマイクロチューブに食品（牛または豚ミンチ肉）の増菌後の培養液と下記表１０の分量で混合した。ｃｆｕは、コロニーを形成する単位（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を意味する。
【表１０】
【００７９】
実施例１と同様の方法でＤＮＡ抽出を行い、１濃度につき１点としてリアルタイムＰＣＲにて定量した。同時に菌液原液から抽出したテンプレートＤＮＡを１０倍段階希釈してられた検量線（１濃度につき３対）と比較した。ただし、ここではｓｔｘ（Ｓｔｘ１，Ｓｔｘ２）及びｅｓｔ（ＳＴｐ，ＳＴｈ）についてはデュプレックスＰＣＲ、ｅａｅはｓｔｘ（Ｓｔｘ１）とのデュプレックスＰＣＲ（プライマーはそれぞれ０．２μＭ，０．４μＭ，プローブ各０．１μＭ）、ｅｌｔはｅｓｔ（ＳＴｐ）とのデュプレックスＰＣＲ（プライマーはそれぞれ０．３μＭ、０．４μＭ，プローブ各０．１μＭ）を行った。
【００８０】
表１１は、純粋培養をした菌液の検出限界と、食品の増菌培養液における菌液の検出限界を表す表である。検体に測定対象としたすべての遺伝子、また各々の組み合わせにおいて，純培養菌液のテンプレートを段階希釈して作成した検量線とおおむね一致した。また、検出限界は純培養菌液時と同様に約１０３−１０４ｃｆｕ／ｍｌまで検出可能であった（表１１）。リアルタイムPCRではすべての遺伝子について，純培養の菌液を測定した場合と同程度の感度を保っていた。このことから、食品中の常在細菌や食品由来の物質に影響を受けることなく、目的の病原遺伝子を検出および定量できることがわかった。
【表１１】
【００８１】
（食品中のＤＥＣ検出）
ＦＤＡの二段培養法による食品中のＤＥＣ検出感度を、リアルタイムＰＣＲで調べた。
【００８２】
ＤＥＣ（ＥＨＥＣ，ＥＰＥＣ，ＥＡｇｇＥＣ，ＥＡＳＴ１ＥＣ，ＤＡＥＣ，ＥＩＥＣ）汚染食品モデルとして大阪府下の小売店より購入した牛ミンチ肉を、ＥＴＥＣ汚染モデルとして豚ミンチ肉を用いた。各病原遺伝子陽性株の増菌培養液（３７℃１８時間，約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を食品希釈用ＰＢＳで１０倍段階希釈し、ミンチ肉１０ｇにそれぞれ約１，１０，１００ｃｆｕ／ｍｌの菌液を１ｍｌ添加した。陰性対照として、食品希釈用ＰＢＳを１ｍｌ加えた。検体は上記食品の増菌培養法に従って増菌培養を行い、ＤＮＡ抽出後リアルタイムＰＣＲ及びＰＣＲにて遺伝子の有無を調べた。各株とも５種類の検体を用いて検討した。
【００８３】
ＦＤＡの二段培養法による食品中のＤＥＣ検出感度を、表１２に示す。リアルタイムＰＣＲではミンチ肉１０ｇに対し、１０ｃｆｕ以上の添加量では１００％、１ｃｆｕレベルでも７２％の検体で陽性となった（表１２（ｂ））。一方、通常のＰＣＲでは１００、１０、１ｃｆｕ添加でそれぞれ９１、８４、４７％となった（表１２（ａ））。特に、ｅｓｔ，ｅｌｔを対象とするＰＣＲにおいて陽性率の低下が顕著であった。この結果から、本発明の検出方法を用いると、きわめて検出感度に優れることがわかった。
【表１２】
【００８４】
このことから、本発明のリアルタイムＰＣＲを用いると、食品中に少量のＤＥＣが存在する場合であっても、検出できることがわかった。
【００８５】
（スクリーニング試験）
大阪府下を流通する食材１１５検体(肉類２３，野菜類４６，魚介類１７，動物性加工食品１５，植物性加工食品１４)と上記食品中のＤＥＣの検出で作成した陰性対照群３３検体の計１４８検体について、ＦＤＡの二段培養法で増菌し、リアルタイムＰＣＲ法で、ＤＥＣの検索を行った。結果を表１３に示す。陽性となった食品検体については，増菌培養液の当該病原遺伝子保有菌の濃度を、既述の方法で作成した検量線を用いて算出した。また、比較例として、上記ＰＣＲ法を用いて同様にＤＥＣを検出した結果を、下記表１３に、［ ］内に示した。
【表１３】
【００８６】
表１１から、増菌培養を行った食材１１５検体(肉類２３，野菜類４６，魚介類１７，動物性加工食品１５，植物性加工食品１４，表１０)のうち、表１１の大腸菌群の欄に示すように、８０検体がＥＭＢ培地上に細菌コロニーを形成した。コロニーによって細菌の存在が確認された８０検体について、リアルタイムＰＣＲで各病原遺伝子の検索を行ったところ、４１検体が陽性となった（表１１）。
【００８７】
総計１４８検体中、病原性遺伝子陽性となった検体は、リアルタイムＰＣＲでは４１検体（２８％）であった。細菌培養により大腸菌が検出された８０検体中の４１検体に下痢原性大腸菌が存在していることがわかる。一方、ＰＣＲでは、３５検体しか検出できなかった。
【００８８】
このことから、本発明の検出方法を用いると、複数のＤＥＣを精度よく検出できることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌種特異性を有するプライマー対群を用いて、一本鎖核酸から検査対象としての部分的でかつ連続な一本鎖核酸を増幅する工程と、
前記増幅した核酸断片を定量する工程と、
定量結果に基づいて、下痢原性大腸菌を特定する工程と
を含む、下痢原性大腸菌検出方法。
【請求項２】
前記菌種特異性を有するプライマー対群が、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０からなる配列対からなる群から選択される配列対の組み合わせである、請求項１に記載の下痢原性大腸菌検出方法。
【請求項３】
特定される下痢原性大腸菌が、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、または腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌である、請求項１または２に記載の下痢原性大腸菌検出方法。
【請求項１】
菌種特異性を有するプライマー対群を用いて、一本鎖核酸から検査対象としての部分的でかつ連続な一本鎖核酸を増幅する工程と、
前記増幅した核酸断片を定量する工程と、
定量結果に基づいて、下痢原性大腸菌を特定する工程と
を含む、下痢原性大腸菌検出方法。
【請求項２】
前記菌種特異性を有するプライマー対群が、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０からなる配列対からなる群から選択される配列対の組み合わせである、請求項１に記載の下痢原性大腸菌検出方法。
【請求項３】
特定される下痢原性大腸菌が、腸管病原性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、分散接着性大腸菌、または腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素遺伝子保有大腸菌である、請求項１または２に記載の下痢原性大腸菌検出方法。
【公開番号】特開２００８−２８３８９５（Ｐ２００８−２８３８９５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３１０７７（Ｐ２００７−１３１０７７）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【出願人】（５０７１５９６４７）株式会社ＫＡＬＳ (2)
【出願人】（３０２０６６４６７）株式会社三共刃型工業 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【出願人】（５０７１５９６４７）株式会社ＫＡＬＳ (2)
【出願人】（３０２０６６４６７）株式会社三共刃型工業 (5)
【Ｆターム（参考）】
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