下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法
【課題】下痢性毒ＯＡ（オカダ酸）・ＤＴＸ（ジノフィシストキシン）群または脂溶性毒ＰＴＸ（脂溶性毒ペクテノトキシン）群の製造方法の提供。
【解決手段】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養またはＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件により、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを原料とする下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法を提供する。更に、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓのいずれかである下痢性毒オカダ酸群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【解決手段】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養またはＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件により、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを原料とする下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法を提供する。更に、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓのいずれかである下痢性毒オカダ酸群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下痢性毒オカダ酸（ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ；以下、ＯＡと示すことがある）・ジノフィシストキシン（Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓｔｏｘｉｎ；以下、ＤＴＸと示すことがある）群または脂溶性毒ペクテノトキシン（Ｐｅｃｔｅｎｏｔｏｘｉｎ；以下、ＰＴＸと示すことがある）群の製造方法に関する。さらに詳しくは、有毒渦鞭毛藻Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを大量培養することによる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二枚貝による食中毒である下痢性貝中毒は、わが国をはじめ世界的に問題になっている。これは、二枚貝が有毒渦鞭毛藻Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを含むプランクトンを餌として摂取した場合に、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが生産する下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群及び脂溶性毒ＰＴＸ群によって毒化されることによる。
この食中毒を避けるために、現在、二枚貝の貝毒検査として動物試験が実施されている。しかし、実験動物を用いるため倫理的な問題等により、近年、非動物試験による検査が導入されようとしている。
【０００３】
このような非動物試験として、ＯＡが有するタンパク脱リン酸化酵素２Ａ（ＰＰ２Ａ）等の酵素活性を阻害する性質を利用し、ＯＡによる酵素活性阻害の度合いを検出することで試料中の毒の存在および量を検出する方法（例えば、特許文献１参照）や、ＯＡに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて下痢性毒を免疫学的に検出する方法（例えば、特許文献２参照）等が開発されている。
また、貝毒の原因となるＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量発生の早期予測を目的とする有毒渦鞭毛藻類検出用核酸断片及びそれを用いた有毒渦鞭毛藻類の検出法（例えば、特許文献３参照）等が得られている。また、非動物試験のひとつとして機器分析等も行われているが、分析において必須とされる分析用標準毒が、二枚貝を原料に精製されてきているために、大量に確保できないという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明者らは、有毒渦鞭毛藻Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを原料として、分析用標準毒を製造する方法を検討してきた。本発明者らは、２００６年に韓国で開発されたＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ａｃｕｍｉｎａｔａ（以下、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａと示すことがある）の培養方法（例えば、非特許文献１参照）を利用し，Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ培養株を用いた本属の毒生産能を世界で初めて確認した（例えば、非特許文献２参照）。また、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンのうち、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｃａｕｄａｔａ（以下、Ｄ．ｃａｕｄａｔａと示すことがある）、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｆｏｒｔｉｉ（以下、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉと示すことがある）、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓ（以下、Ｄ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓと示すことがある）の培養方法（例えば、非特許文献３〜５参照）を確立した。しかし、これらの培養方法においては、分析用標準毒の製造において十分な量の毒を得るために、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件等の検討がされておらず、また、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを大量に培養することもできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０２１６８２号
【特許文献２】特許第３５７６１８４号
【特許文献３】特開２００４−２９８１０３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．，４５，１０１−１０６
【非特許文献２】Ｋａｍｉｙａｍａ ＆ Ｓｕｚｕｋｉ ２００９，Ｈａｒｍｆｕｌ Ａｌｇａｅ ８，３１２−３１７
【非特許文献３】Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｐｌａｎｋｔｏｎ＆Ｂｅｎｔｈｏｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：７８−８５
【非特許文献４】Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，４４：９０９−９２２
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００８．Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．，５２：２０９−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法の提供を課題とする。更に詳しくは、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを大量培養することによる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養を可能とし、また、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件を見出したことにより、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを原料とする下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を極めて高い量で製造できる製造方法を完成するに至った。
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養には、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの餌となる生物である繊毛虫Ｍｙｒｉｏｎｅｃｔａ ｒｕｂｒａ（以下、Ｍ．ｒｕｂｒａと示すことがある）を大量に得ることが必要となるが、本発明において、Ｍ．ｒｕｂｒａの高密度培養および継代培養を可能としたことから、この点を解決することができた。
Ｍ．ｒｕｂｒａの培養においては、Ｍ．ｒｕｂｒａの餌となる小型クリプト藻Ｔｅｌｅａｕｌａｘ ａｍｐｈｉｏｘｅｉａ（以下、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａと示すことがある）を加えて培養を行う必要がある。しかし、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａは増殖速度が著しく速いため、添加量によってはＭ．ｒｕｂｒａを駆逐してしまうという問題があった。また、Ｍ．ｒｕｂｒａにおいても、食欲も不定期に変化する特性を有しているため、植え継ぐ際に、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの添加量を検討する必要があった。
そこで本発明者らは、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの添加量を調整することで、Ｍ．ｒｕｂｒａの高密度培養および継代培養を可能とし、これによって、Ｍ．ｒｕｂｒａを餌とするＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養を可能とした。
さらに、本発明者らは、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件を検討し、これを見出したことにより、１ヶ月程度の培養で、培養液約１０ＬからＰＴＸ２標準毒原料約１０ｍｇという、極めて高い量の毒を得ることも可能とした。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法等に関する。
（１）Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法を用いることによる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法。
（２）Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法において、培養温度を１０〜２２℃とする上記（１）に記載の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法。
（３）Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓのいずれかである上記（１）または（２）に記載の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法によって製造され得る下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群。
（５）上記（４）に記載の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を用いる分析用標準毒。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法によって、大量の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を得ることができ、これらを用いた分析用標準毒の提供が容易となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの培養温度による細胞密度を示した図である（実施例２）。
【図２】Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの培養温度による脂溶性毒ＰＴＸ２の生産能を示した図である（実施例２）。
【図３】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンから精製したＯＡを示した図である（実施例３）。
【図４】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンから精製したＤＴＸ１を示した図である（実施例３）。
【図５】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンから精製したＰＴＸ２を示した図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」は、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法を用いて、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群が製造できる方法であれば、いずれの方法も用いることができる。
ここで、「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法」とは、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を産生し得るＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの藻類を大量に培養できる培養方法のことをいう。
「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法」において、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を大量に生産できる温度でＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを培養することが好ましい。この温度は、これらの毒を大量に産生し得る温度であればいずれの温度でもよいが、例えば、１０〜２２℃とすることが好ましく、特に１８〜２２℃とすることが好ましい。
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」においては、「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法」を用いることによって、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンがその体内に蓄積した下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を抽出し、精製することでこれらの毒を製造することができる。
【００１３】
本発明の培養に用いる「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン」としては、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を産生し得る「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン」に属する藻類であればいずれのものでもよく、例えば、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓ等が挙げられる。
これらの「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン」が産生し得る下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群のうち、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群としてはＯＡ、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、脂溶性毒ＰＴＸ群としてはＰＴＸ２、ＰＴＸ１１等が挙げられる。
【００１４】
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」によって得られたこれらの毒は、「分析用標準毒」等に用いることができる。
この「分析用標準毒」とは、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン等の藻類や、二枚貝を試料として、その中に含まれる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群等の毒を分析するために機器等を用いた場合に、標準として用いる毒のことをいう。
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」によって得られるこれらの毒が、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群および脂溶性毒ＰＴＸ群のうち、複数の毒の混合物として得られる場合には、ＯＡ、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＰＴＸ２、またはＰＴＸ１１のようにそれぞれの毒に分けて調整することもできる。また、使用の目的によっては、複数の毒が混合した物を調整して用いることもできる。
【００１５】
「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」によって得られる毒を精製する方法としては、従来知られているいずれの方法も用いることができる。培養株から毒を精製する場合は、二枚貝から精製する場合と比較して、煩雑な精製手順を省略することができ、例えば次の手順によって、毒を簡単に精製することができる。
即ち、
１）本発明に記載の方法で培養したＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを海水または蒸留水に凍結保存し解凍する。この際、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン内に蓄積された毒が水溶液中に溶出するが、さらに超音波によってＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの細胞を完全に破砕することで、毒を水に溶解させることができる。
２）水溶液に溶出した毒をダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）充填ガラスカラムまたはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラム等に通して固相抽出する。
固相抽出に用いる毒を溶解した水溶液の液量が多いときにはダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）充填ガラスカラムを利用し、少ない場合にはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムを用いることが好ましい。
３）蒸留水で脱塩した後、毒を含水メタノール（２０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール）で順次溶出させる。
４）７０％メタノール画分等の毒を含む画分から高速液体クロマトグラフィーにより各毒を精製する。
精製用カラムとしてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８（１０ｍｍｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）（関東化学株式会社）を用い、移動相溶媒としてアセトニトリル／蒸留水（７１：２９）含０．０５％酢酸を用いる。この条件によりＯＡ、ＤＴＸ１、ＰＴＸ２をそれぞれ単離することができる。毒は５０％メタノール画分や１００％メタノール画分にも含まれるため、これらの画分からも上記の条件で毒を精製する。
５）４）で分画した各毒の画分をロータリーエバポレーターによりアセトニトリルのみを除き、残留した水に溶解している毒をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムで固層抽出する。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する際、水まで除去すると酢酸が濃縮され、酸触媒反応によりＰＴＸ２が異性化し、ＰＴＸ２ｂ等の異性体が生成され毒の回収率が落ちる。したがって、アセトニトリルのみを速やかに除去し、水の濃縮は行わないように注意することにより、ＰＴＸ２の回収率を上げることができる。
６）蒸留水でカラムを洗浄して酢酸を除去した後、毒をメタノールで溶出させ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。
【００１６】
上記のように分離・精製した各毒について、標準毒を調整する方法としては、従来知られているいずれの方法も用いることができるが、例えば次の手順によって、各毒の標準毒を調整することができる。
即ち、上記のように精製して得られた各毒について、液体クロマトグラフィー／質量分析法等により精製した毒の保持時間及びマススペクトルを既存の標準毒と比較することにより、毒を同定する。更に既知量の標準毒のピーク面積との比較により含量を決定する。各毒の純度は、トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）により、混入した不純物含有率（％）を調べることができるため、ここで毒の純度を決定する。また、液体クロマトグラフィー／ダイオードアレイ検出法、核磁気共鳴法等により不純物のスペクトルを検出することにより、純度を確認することもできる。精製した各毒について溶媒を完全に蒸発させた後、化学天秤により重量を測定し、液体クロマトグラフィー／質量分析法等により測定された精製重量との間で齟齬がないことを確認する。
これを、一定量のメタノールに溶解することで、標準毒または標準毒原液を調整することができる。
このように調整され標準毒または標準毒原液は、溶媒を窒素により除去した後に−２０度で保管することができる。
【００１７】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓの大量培養方法
１．Ｍ．ｒｕｂｒａの継代培養方法
１）Ｍ．ｒｕｂｒａの取得
２００７年２月に大分県猪串湾（１３１o５３’Ｅ，３４o４７’Ｎ）からマイクロピペットを用いてＭ．ｒｕｂｒａを分離し、０．５ｍＬの１／３濃度のｆ／２培地（参考文献１、２、以下同じものを用いた）を入れた４８ウェルマイクロプレートに１細胞ずつ入れた。温度１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、１２ｈＬ：１２ｈＤの明暗周期の光条件下で培養し、良好に増殖したものを継代培養した。
２）Ｍ．ｒｕｂｒａの継代培養方法
３００ｍＬ容の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、１００ｍＬのｆ／６培地（参考文献１、２、以下同じものを用いた）に上記１）のＭ．ｒｕｂｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ（７．０−９．０ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５０ｍＬを添加した。これに、餌となる１００μＬのＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａ（１．０−２．０ｘ１０×4ｃｅｌｌｓ）をそれぞれの初期密度（０，２５，５０，１００μＬ）で１００ｍＬのｆ／６培地に添加し継代培養を行った。
継代培養の培養温度は１４−１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、明暗周期１２ｈＬ：１２ｈＤに設定した。また、継代培養のための植え継ぎは、１週間に一回行った。
参考文献
１．Ｇｕｉｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｒ．Ｌ．１９７５．ｐ２６−６０．Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｅｄｓ．Ｗ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ＆Ｍ．Ｈ．Ｃｈａｎｌｅｙ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ．
２．Ｎａｇａｉ Ｓ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｙ，Ｏｈ Ｓｅｏｋ−Ｊｉｎ，Ｉｔａｋｕｒａ Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｃｙｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ ｔａｍａｒｅｎｓｅ（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ Ｂａｙ，Ｊａｐａｎ．Ｐｌａｎｋｔｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆ Ｅｃｏｌｏｇｙ，５１（２）：１０３−１０９（２００４）．
【００１９】
２．Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの継代培養方法
１）Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの取得
２００７年２月に大分県猪串湾（１３１o５３’Ｅ，３４o４７’Ｎ）からマイクロピペットを用いてＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａを分離し、０．５ｍＬのＭ．ｒｕｂｒａ培養細胞（１．５ｘ１０×3ｅｌｌｓ）を入れた４８ウェルマイクロプレートに１細胞ずつ入れた。温度１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、１２ｈＬ：１２ｈＤの明暗周期の光条件下で培養し、良好に増殖したものを継代培養した。
２）Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの継代培養方法
３００ｍＬ容のプラスチック製三角フラスコを用いて、１００ｍＬのｆ／６培地に上記１）のＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａ（７．０−８．０ｘ１０×4ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）０．３ｍＬを添加し培養を行った。培養における培養液の組成、培養温度、光強度、明暗周期条件は、上記１．のＭ．ｒｕｂｒａ培養時の条件と同じであった。
１週間培養した後、新たなフラスコを用いて、増殖したＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａを上記と同じ培養条件で培養した。この操作を２週間ごとに繰り返すことで、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの継代培養を行った。
【００２０】
３．Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの継代培養方法
１）Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの取得
２００７年７月に鳥取県赤崎港（１３３o６６’Ｅ，３５o５１’Ｎ）からマイクロピペットを用いてＤ．ｆｏｒｔｉｉを分離し、０．５ｍＬの１／３濃度のｆ／２培地を入れた４８ウェルマイクロプレートに１細胞ずつ入れた。温度１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、１２ｈＬ：１２ｈＤの明暗周期の光条件下で培養し、良好に増殖したものを継代培養した。
２）Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの継代培養方法
上記１．と同様の方法でＭ．ｒｕｂｒａ（２−３ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を培養しているフラスコ（培養液：１５０ｍＬ）にＤ．ｆｏｒｔｉｉ（３−５ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ程度）２−３ｍＬを添加し培養を行った。培養液の組成、培養温度、光強度、明暗周期条件は、上記１．のＭ．ｒｕｂｒａ培養時の条件と同じであった。
【００２１】
４．Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの大量培養方法
Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの大量培養方法として、上記３．と同様の培養条件で４０本のフラスコを用いて培養を約１ヶ月間行った。または、さらに大きめの５００−１，０００ｍＬ容のプラスチック製三角フラスコ２０本を用いて培養を約１ヶ月間行った。これらの培養液の組成、培養温度、光強度、明暗周期条件は、Ｍ．ｒｕｂｒａの条件と同じである。
培養開始時のＤ．ｆｏｒｔｉｉの細胞密度は２．０ｘ１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬであったが、培養終了時におけるＤ．ｆｏｒｔｉｉの細胞密度は、１．５−４．０ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
【実施例２】
【００２２】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産し得る培養方法
１）Ｍ．ｒｕｂｒａおよびＤ．ｆｏｒｔｉｉの前培養
Ｍ．ｒｕｂｒａおよびＤ．ｆｏｒｔｉｉを１０，１４、１８、２２度の温度条件下で、実施例１と同様の方法でそれぞれ３週間継代培養した。
２）Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの培養
前培養終了後、１００ｍＬのｆ／６培地に上記１）において各温度で培養したＭ．ｒｕｂｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ（６．０ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５０ｍＬをそれぞれ添加し、３００ｍＬ容の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に入れた。
これに、上記１）において各温度で培養したＤ．ｆｏｒｔｉｉを、同じ温度で前培養したＭ．ｒｕｂｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ が添加されたフラスコに２．０ｘ１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬの初期密度となるように１ｍＬ添加し（３ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、それぞれ１０，１４、１８、２２度の温度で、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、明暗周期１２ｈＬ：１２ｈＤの条件下で１ヶ月間、培養を行った。
３日毎に、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ細胞密度（図１）と脂溶性毒ＰＴＸ群の生産量（図２）を測定した結果、図２に示したように、いずれの温度でも高い脂溶性毒ＰＴＸ群の生産を示したが、１８、２２度で培養したＭ．ｒｕｂｒａおよびＤ．ｆｏｒｔｉｉを用いた場合に、特に脂溶性毒ＰＴＸ群の生産量が高くなることが確認された。
【実施例３】
【００２３】
標準毒の調整方法
実施例１．４に記載のＤ．ｆｏｒｔｉｉの大量培養方法によって培養したＤ．ｆｏｒｔｉｉより、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉが生産したＯＡ、ＤＴＸ１およびＰＴＸ２を精製した。
即ち、
１）実施例１．４に記載のＤ．ｆｏｒｔｉｉを海水または蒸留水に凍結保存し解凍した。この際、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ内に蓄積された毒が水溶液中に溶出するが、さらに超音波によってＤ．ｆｏｒｔｉｉの細胞を完全に破砕することで、毒を水に溶解させた。
２）水溶液に溶出した毒をダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）充填ガラスカラムまたはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムに通して固相抽出した。
３）蒸留水で脱塩した後、毒を含水メタノール（２０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール）で順次溶出させた。
４）７０％メタノール画分、５０％メタノール画分や１００％メタノール画分等の毒を含む画分から、次の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりＯＡ、ＤＴＸ１およびＰＴＸ２の各毒を精製した。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８（１０ｍｍｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）（関東化学株式会社）
移動相：Ａ 蒸留水 含０．０５％酢酸
Ｂ アセトニトリル：蒸留水（９５：５ｖ／ｖ）含０．０５％酢酸
移動相溶媒：Ｂ／Ａ（７５：２５）含０．０５％酢酸
流速：５ｍＬ／ｍｉｎ
５）４）で分画した各毒の画分をロータリーエバポレーターによりアセトニトリルのみを除き、残留した水に溶解している毒をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムで固層抽出した。
ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する際、水まで除去すると酢酸が濃縮され、酸触媒反応によりＰＴＸ２が異性化し、毒の回収率が落ちることから、アセトニトリルのみを速やかに除去し、水の濃縮は行わないように注意することで、ＰＴＸ２の回収率を上げた。
６）蒸留水でカラムを洗浄して酢酸を除去した後、各毒をメタノールで溶出させ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。
【００２４】
上記の方法によって精製されたＯＡ、ＤＴＸ１およびＰＴＸ２の各毒について、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルの結果を下記の条件によって調べ、各毒の純度をトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）のピーク面積百分率（％）により求めることで標準毒の調整を行った。その結果、ＯＡ、ＤＴＸ１、ＰＴＸ２ともに９５％以上の高濃度であり、機器分析等に用いるための分析用標準毒として利用可能であることが確認された。
図３にＯＡのＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを、図４にＤＴＸ１のＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを、図５にＰＴＸ２のＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを示した。
いずれの図もＡ：トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）ｍ／ｚ７００−１０００、Ｂ：各毒のアンモニウム付加イオン［Ｍ＋ＮＨ4］+のマスクロマトグラム、Ｃ：各毒のマススペクトルを示したものである。
【００２５】
ＬＣ−ＭＳ条件
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ８（２．１ｍｍｉ．ｄ．ｘ５０ｍｍ）（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：Ａ 蒸留水 含５０ｍＭギ酸、２ｍＭギ酸アンモニウム
Ｂ アセトニトリル：蒸留水（９５：５ｖ／ｖ）含５０ｍＭギ酸、２ｍＭギ酸アンモニウム
グラジエント溶出 ４０％Ｂ〜１００％Ｂ ５分、その後５分間１００％Ｂで溶出
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化法：電子スプレーイオン化法（陽イオンモード）
イオン化電圧：５ｋＶ
イオン源温度：３００℃
検出：ｍ／ｚ７００−１０００ フルスキャン検出
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の製造方法によって得られる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を分析用標準毒として用いることで、分析機器等による二枚貝の貝毒検査が容易となった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下痢性毒オカダ酸（ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ；以下、ＯＡと示すことがある）・ジノフィシストキシン（Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓｔｏｘｉｎ；以下、ＤＴＸと示すことがある）群または脂溶性毒ペクテノトキシン（Ｐｅｃｔｅｎｏｔｏｘｉｎ；以下、ＰＴＸと示すことがある）群の製造方法に関する。さらに詳しくは、有毒渦鞭毛藻Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを大量培養することによる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二枚貝による食中毒である下痢性貝中毒は、わが国をはじめ世界的に問題になっている。これは、二枚貝が有毒渦鞭毛藻Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを含むプランクトンを餌として摂取した場合に、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが生産する下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群及び脂溶性毒ＰＴＸ群によって毒化されることによる。
この食中毒を避けるために、現在、二枚貝の貝毒検査として動物試験が実施されている。しかし、実験動物を用いるため倫理的な問題等により、近年、非動物試験による検査が導入されようとしている。
【０００３】
このような非動物試験として、ＯＡが有するタンパク脱リン酸化酵素２Ａ（ＰＰ２Ａ）等の酵素活性を阻害する性質を利用し、ＯＡによる酵素活性阻害の度合いを検出することで試料中の毒の存在および量を検出する方法（例えば、特許文献１参照）や、ＯＡに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて下痢性毒を免疫学的に検出する方法（例えば、特許文献２参照）等が開発されている。
また、貝毒の原因となるＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量発生の早期予測を目的とする有毒渦鞭毛藻類検出用核酸断片及びそれを用いた有毒渦鞭毛藻類の検出法（例えば、特許文献３参照）等が得られている。また、非動物試験のひとつとして機器分析等も行われているが、分析において必須とされる分析用標準毒が、二枚貝を原料に精製されてきているために、大量に確保できないという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明者らは、有毒渦鞭毛藻Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを原料として、分析用標準毒を製造する方法を検討してきた。本発明者らは、２００６年に韓国で開発されたＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ａｃｕｍｉｎａｔａ（以下、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａと示すことがある）の培養方法（例えば、非特許文献１参照）を利用し，Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ培養株を用いた本属の毒生産能を世界で初めて確認した（例えば、非特許文献２参照）。また、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンのうち、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｃａｕｄａｔａ（以下、Ｄ．ｃａｕｄａｔａと示すことがある）、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｆｏｒｔｉｉ（以下、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉと示すことがある）、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓ（以下、Ｄ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓと示すことがある）の培養方法（例えば、非特許文献３〜５参照）を確立した。しかし、これらの培養方法においては、分析用標準毒の製造において十分な量の毒を得るために、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件等の検討がされておらず、また、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを大量に培養することもできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０２１６８２号
【特許文献２】特許第３５７６１８４号
【特許文献３】特開２００４−２９８１０３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．，４５，１０１−１０６
【非特許文献２】Ｋａｍｉｙａｍａ ＆ Ｓｕｚｕｋｉ ２００９，Ｈａｒｍｆｕｌ Ａｌｇａｅ ８，３１２−３１７
【非特許文献３】Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｐｌａｎｋｔｏｎ＆Ｂｅｎｔｈｏｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：７８−８５
【非特許文献４】Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，４４：９０９−９２２
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００８．Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．，５２：２０９−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法の提供を課題とする。更に詳しくは、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを大量培養することによる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養を可能とし、また、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件を見出したことにより、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを原料とする下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を極めて高い量で製造できる製造方法を完成するに至った。
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養には、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの餌となる生物である繊毛虫Ｍｙｒｉｏｎｅｃｔａ ｒｕｂｒａ（以下、Ｍ．ｒｕｂｒａと示すことがある）を大量に得ることが必要となるが、本発明において、Ｍ．ｒｕｂｒａの高密度培養および継代培養を可能としたことから、この点を解決することができた。
Ｍ．ｒｕｂｒａの培養においては、Ｍ．ｒｕｂｒａの餌となる小型クリプト藻Ｔｅｌｅａｕｌａｘ ａｍｐｈｉｏｘｅｉａ（以下、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａと示すことがある）を加えて培養を行う必要がある。しかし、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａは増殖速度が著しく速いため、添加量によってはＭ．ｒｕｂｒａを駆逐してしまうという問題があった。また、Ｍ．ｒｕｂｒａにおいても、食欲も不定期に変化する特性を有しているため、植え継ぐ際に、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの添加量を検討する必要があった。
そこで本発明者らは、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの添加量を調整することで、Ｍ．ｒｕｂｒａの高密度培養および継代培養を可能とし、これによって、Ｍ．ｒｕｂｒａを餌とするＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養を可能とした。
さらに、本発明者らは、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産する培養条件を検討し、これを見出したことにより、１ヶ月程度の培養で、培養液約１０ＬからＰＴＸ２標準毒原料約１０ｍｇという、極めて高い量の毒を得ることも可能とした。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法等に関する。
（１）Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法を用いることによる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法。
（２）Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法において、培養温度を１０〜２２℃とする上記（１）に記載の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法。
（３）Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓのいずれかである上記（１）または（２）に記載の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法によって製造され得る下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群。
（５）上記（４）に記載の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を用いる分析用標準毒。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法によって、大量の下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を得ることができ、これらを用いた分析用標準毒の提供が容易となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの培養温度による細胞密度を示した図である（実施例２）。
【図２】Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの培養温度による脂溶性毒ＰＴＸ２の生産能を示した図である（実施例２）。
【図３】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンから精製したＯＡを示した図である（実施例３）。
【図４】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンから精製したＤＴＸ１を示した図である（実施例３）。
【図５】Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンから精製したＰＴＸ２を示した図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」は、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法を用いて、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群が製造できる方法であれば、いずれの方法も用いることができる。
ここで、「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法」とは、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を産生し得るＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの藻類を大量に培養できる培養方法のことをいう。
「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法」において、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を大量に生産できる温度でＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを培養することが好ましい。この温度は、これらの毒を大量に産生し得る温度であればいずれの温度でもよいが、例えば、１０〜２２℃とすることが好ましく、特に１８〜２２℃とすることが好ましい。
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」においては、「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法」を用いることによって、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンがその体内に蓄積した下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を抽出し、精製することでこれらの毒を製造することができる。
【００１３】
本発明の培養に用いる「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン」としては、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を産生し得る「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン」に属する藻類であればいずれのものでもよく、例えば、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓ等が挙げられる。
これらの「Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン」が産生し得る下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群のうち、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群としてはＯＡ、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、脂溶性毒ＰＴＸ群としてはＰＴＸ２、ＰＴＸ１１等が挙げられる。
【００１４】
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」によって得られたこれらの毒は、「分析用標準毒」等に用いることができる。
この「分析用標準毒」とは、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン等の藻類や、二枚貝を試料として、その中に含まれる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群等の毒を分析するために機器等を用いた場合に、標準として用いる毒のことをいう。
本発明の「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」によって得られるこれらの毒が、下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群および脂溶性毒ＰＴＸ群のうち、複数の毒の混合物として得られる場合には、ＯＡ、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＰＴＸ２、またはＰＴＸ１１のようにそれぞれの毒に分けて調整することもできる。また、使用の目的によっては、複数の毒が混合した物を調整して用いることもできる。
【００１５】
「下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群の製造方法」によって得られる毒を精製する方法としては、従来知られているいずれの方法も用いることができる。培養株から毒を精製する場合は、二枚貝から精製する場合と比較して、煩雑な精製手順を省略することができ、例えば次の手順によって、毒を簡単に精製することができる。
即ち、
１）本発明に記載の方法で培養したＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンを海水または蒸留水に凍結保存し解凍する。この際、Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトン内に蓄積された毒が水溶液中に溶出するが、さらに超音波によってＤｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの細胞を完全に破砕することで、毒を水に溶解させることができる。
２）水溶液に溶出した毒をダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）充填ガラスカラムまたはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラム等に通して固相抽出する。
固相抽出に用いる毒を溶解した水溶液の液量が多いときにはダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）充填ガラスカラムを利用し、少ない場合にはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムを用いることが好ましい。
３）蒸留水で脱塩した後、毒を含水メタノール（２０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール）で順次溶出させる。
４）７０％メタノール画分等の毒を含む画分から高速液体クロマトグラフィーにより各毒を精製する。
精製用カラムとしてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８（１０ｍｍｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）（関東化学株式会社）を用い、移動相溶媒としてアセトニトリル／蒸留水（７１：２９）含０．０５％酢酸を用いる。この条件によりＯＡ、ＤＴＸ１、ＰＴＸ２をそれぞれ単離することができる。毒は５０％メタノール画分や１００％メタノール画分にも含まれるため、これらの画分からも上記の条件で毒を精製する。
５）４）で分画した各毒の画分をロータリーエバポレーターによりアセトニトリルのみを除き、残留した水に溶解している毒をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムで固層抽出する。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する際、水まで除去すると酢酸が濃縮され、酸触媒反応によりＰＴＸ２が異性化し、ＰＴＸ２ｂ等の異性体が生成され毒の回収率が落ちる。したがって、アセトニトリルのみを速やかに除去し、水の濃縮は行わないように注意することにより、ＰＴＸ２の回収率を上げることができる。
６）蒸留水でカラムを洗浄して酢酸を除去した後、毒をメタノールで溶出させ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。
【００１６】
上記のように分離・精製した各毒について、標準毒を調整する方法としては、従来知られているいずれの方法も用いることができるが、例えば次の手順によって、各毒の標準毒を調整することができる。
即ち、上記のように精製して得られた各毒について、液体クロマトグラフィー／質量分析法等により精製した毒の保持時間及びマススペクトルを既存の標準毒と比較することにより、毒を同定する。更に既知量の標準毒のピーク面積との比較により含量を決定する。各毒の純度は、トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）により、混入した不純物含有率（％）を調べることができるため、ここで毒の純度を決定する。また、液体クロマトグラフィー／ダイオードアレイ検出法、核磁気共鳴法等により不純物のスペクトルを検出することにより、純度を確認することもできる。精製した各毒について溶媒を完全に蒸発させた後、化学天秤により重量を測定し、液体クロマトグラフィー／質量分析法等により測定された精製重量との間で齟齬がないことを確認する。
これを、一定量のメタノールに溶解することで、標準毒または標準毒原液を調整することができる。
このように調整され標準毒または標準毒原液は、溶媒を窒素により除去した後に−２０度で保管することができる。
【００１７】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓの大量培養方法
１．Ｍ．ｒｕｂｒａの継代培養方法
１）Ｍ．ｒｕｂｒａの取得
２００７年２月に大分県猪串湾（１３１o５３’Ｅ，３４o４７’Ｎ）からマイクロピペットを用いてＭ．ｒｕｂｒａを分離し、０．５ｍＬの１／３濃度のｆ／２培地（参考文献１、２、以下同じものを用いた）を入れた４８ウェルマイクロプレートに１細胞ずつ入れた。温度１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、１２ｈＬ：１２ｈＤの明暗周期の光条件下で培養し、良好に増殖したものを継代培養した。
２）Ｍ．ｒｕｂｒａの継代培養方法
３００ｍＬ容の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、１００ｍＬのｆ／６培地（参考文献１、２、以下同じものを用いた）に上記１）のＭ．ｒｕｂｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ（７．０−９．０ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５０ｍＬを添加した。これに、餌となる１００μＬのＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａ（１．０−２．０ｘ１０×4ｃｅｌｌｓ）をそれぞれの初期密度（０，２５，５０，１００μＬ）で１００ｍＬのｆ／６培地に添加し継代培養を行った。
継代培養の培養温度は１４−１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、明暗周期１２ｈＬ：１２ｈＤに設定した。また、継代培養のための植え継ぎは、１週間に一回行った。
参考文献
１．Ｇｕｉｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｒ．Ｌ．１９７５．ｐ２６−６０．Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｅｄｓ．Ｗ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ＆Ｍ．Ｈ．Ｃｈａｎｌｅｙ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ．
２．Ｎａｇａｉ Ｓ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｙ，Ｏｈ Ｓｅｏｋ−Ｊｉｎ，Ｉｔａｋｕｒａ Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｃｙｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ ｔａｍａｒｅｎｓｅ（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ Ｂａｙ，Ｊａｐａｎ．Ｐｌａｎｋｔｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆ Ｅｃｏｌｏｇｙ，５１（２）：１０３−１０９（２００４）．
【００１９】
２．Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの継代培養方法
１）Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの取得
２００７年２月に大分県猪串湾（１３１o５３’Ｅ，３４o４７’Ｎ）からマイクロピペットを用いてＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａを分離し、０．５ｍＬのＭ．ｒｕｂｒａ培養細胞（１．５ｘ１０×3ｅｌｌｓ）を入れた４８ウェルマイクロプレートに１細胞ずつ入れた。温度１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、１２ｈＬ：１２ｈＤの明暗周期の光条件下で培養し、良好に増殖したものを継代培養した。
２）Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの継代培養方法
３００ｍＬ容のプラスチック製三角フラスコを用いて、１００ｍＬのｆ／６培地に上記１）のＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａ（７．０−８．０ｘ１０×4ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）０．３ｍＬを添加し培養を行った。培養における培養液の組成、培養温度、光強度、明暗周期条件は、上記１．のＭ．ｒｕｂｒａ培養時の条件と同じであった。
１週間培養した後、新たなフラスコを用いて、増殖したＴ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａを上記と同じ培養条件で培養した。この操作を２週間ごとに繰り返すことで、Ｔ．ａｍｐｈｉｏｘｅｉａの継代培養を行った。
【００２０】
３．Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの継代培養方法
１）Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの取得
２００７年７月に鳥取県赤崎港（１３３o６６’Ｅ，３５o５１’Ｎ）からマイクロピペットを用いてＤ．ｆｏｒｔｉｉを分離し、０．５ｍＬの１／３濃度のｆ／２培地を入れた４８ウェルマイクロプレートに１細胞ずつ入れた。温度１８℃、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、１２ｈＬ：１２ｈＤの明暗周期の光条件下で培養し、良好に増殖したものを継代培養した。
２）Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの継代培養方法
上記１．と同様の方法でＭ．ｒｕｂｒａ（２−３ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を培養しているフラスコ（培養液：１５０ｍＬ）にＤ．ｆｏｒｔｉｉ（３−５ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ程度）２−３ｍＬを添加し培養を行った。培養液の組成、培養温度、光強度、明暗周期条件は、上記１．のＭ．ｒｕｂｒａ培養時の条件と同じであった。
【００２１】
４．Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの大量培養方法
Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの大量培養方法として、上記３．と同様の培養条件で４０本のフラスコを用いて培養を約１ヶ月間行った。または、さらに大きめの５００−１，０００ｍＬ容のプラスチック製三角フラスコ２０本を用いて培養を約１ヶ月間行った。これらの培養液の組成、培養温度、光強度、明暗周期条件は、Ｍ．ｒｕｂｒａの条件と同じである。
培養開始時のＤ．ｆｏｒｔｉｉの細胞密度は２．０ｘ１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬであったが、培養終了時におけるＤ．ｆｏｒｔｉｉの細胞密度は、１．５−４．０ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
【実施例２】
【００２２】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが毒を効率的に生産し得る培養方法
１）Ｍ．ｒｕｂｒａおよびＤ．ｆｏｒｔｉｉの前培養
Ｍ．ｒｕｂｒａおよびＤ．ｆｏｒｔｉｉを１０，１４、１８、２２度の温度条件下で、実施例１と同様の方法でそれぞれ３週間継代培養した。
２）Ｄ．ｆｏｒｔｉｉの培養
前培養終了後、１００ｍＬのｆ／６培地に上記１）において各温度で培養したＭ．ｒｕｂｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ（６．０ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５０ｍＬをそれぞれ添加し、３００ｍＬ容の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に入れた。
これに、上記１）において各温度で培養したＤ．ｆｏｒｔｉｉを、同じ温度で前培養したＭ．ｒｕｂｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ が添加されたフラスコに２．０ｘ１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬの初期密度となるように１ｍＬ添加し（３ｘ１０×3ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、それぞれ１０，１４、１８、２２度の温度で、光強度１００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、明暗周期１２ｈＬ：１２ｈＤの条件下で１ヶ月間、培養を行った。
３日毎に、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ細胞密度（図１）と脂溶性毒ＰＴＸ群の生産量（図２）を測定した結果、図２に示したように、いずれの温度でも高い脂溶性毒ＰＴＸ群の生産を示したが、１８、２２度で培養したＭ．ｒｕｂｒａおよびＤ．ｆｏｒｔｉｉを用いた場合に、特に脂溶性毒ＰＴＸ群の生産量が高くなることが確認された。
【実施例３】
【００２３】
標準毒の調整方法
実施例１．４に記載のＤ．ｆｏｒｔｉｉの大量培養方法によって培養したＤ．ｆｏｒｔｉｉより、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉが生産したＯＡ、ＤＴＸ１およびＰＴＸ２を精製した。
即ち、
１）実施例１．４に記載のＤ．ｆｏｒｔｉｉを海水または蒸留水に凍結保存し解凍した。この際、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ内に蓄積された毒が水溶液中に溶出するが、さらに超音波によってＤ．ｆｏｒｔｉｉの細胞を完全に破砕することで、毒を水に溶解させた。
２）水溶液に溶出した毒をダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）充填ガラスカラムまたはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムに通して固相抽出した。
３）蒸留水で脱塩した後、毒を含水メタノール（２０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール）で順次溶出させた。
４）７０％メタノール画分、５０％メタノール画分や１００％メタノール画分等の毒を含む画分から、次の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりＯＡ、ＤＴＸ１およびＰＴＸ２の各毒を精製した。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８（１０ｍｍｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）（関東化学株式会社）
移動相：Ａ 蒸留水 含０．０５％酢酸
Ｂ アセトニトリル：蒸留水（９５：５ｖ／ｖ）含０．０５％酢酸
移動相溶媒：Ｂ／Ａ（７５：２５）含０．０５％酢酸
流速：５ｍＬ／ｍｉｎ
５）４）で分画した各毒の画分をロータリーエバポレーターによりアセトニトリルのみを除き、残留した水に溶解している毒をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ｐｌｕｓ（ウォーターズ社）カートリッジカラムで固層抽出した。
ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する際、水まで除去すると酢酸が濃縮され、酸触媒反応によりＰＴＸ２が異性化し、毒の回収率が落ちることから、アセトニトリルのみを速やかに除去し、水の濃縮は行わないように注意することで、ＰＴＸ２の回収率を上げた。
６）蒸留水でカラムを洗浄して酢酸を除去した後、各毒をメタノールで溶出させ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。
【００２４】
上記の方法によって精製されたＯＡ、ＤＴＸ１およびＰＴＸ２の各毒について、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルの結果を下記の条件によって調べ、各毒の純度をトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）のピーク面積百分率（％）により求めることで標準毒の調整を行った。その結果、ＯＡ、ＤＴＸ１、ＰＴＸ２ともに９５％以上の高濃度であり、機器分析等に用いるための分析用標準毒として利用可能であることが確認された。
図３にＯＡのＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを、図４にＤＴＸ１のＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを、図５にＰＴＸ２のＬＣ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを示した。
いずれの図もＡ：トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）ｍ／ｚ７００−１０００、Ｂ：各毒のアンモニウム付加イオン［Ｍ＋ＮＨ4］+のマスクロマトグラム、Ｃ：各毒のマススペクトルを示したものである。
【００２５】
ＬＣ−ＭＳ条件
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ８（２．１ｍｍｉ．ｄ．ｘ５０ｍｍ）（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：Ａ 蒸留水 含５０ｍＭギ酸、２ｍＭギ酸アンモニウム
Ｂ アセトニトリル：蒸留水（９５：５ｖ／ｖ）含５０ｍＭギ酸、２ｍＭギ酸アンモニウム
グラジエント溶出 ４０％Ｂ〜１００％Ｂ ５分、その後５分間１００％Ｂで溶出
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化法：電子スプレーイオン化法（陽イオンモード）
イオン化電圧：５ｋＶ
イオン源温度：３００℃
検出：ｍ／ｚ７００−１０００ フルスキャン検出
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の製造方法によって得られる下痢性毒ＯＡ・ＤＴＸ群または脂溶性毒ＰＴＸ群を分析用標準毒として用いることで、分析機器等による二枚貝の貝毒検査が容易となった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法を用いることによる下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【請求項２】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法において、培養温度を１０〜２２℃とする請求項１に記載の下痢性毒オカダ酸ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【請求項３】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓのいずれかである請求項１または２に記載の下痢性毒オカダ酸群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法によって製造され得る下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群。
【請求項５】
請求項４に記載の下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群を用いる分析用標準毒。
【請求項１】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法を用いることによる下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【請求項２】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンの大量培養方法において、培養温度を１０〜２２℃とする請求項１に記載の下痢性毒オカダ酸ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【請求項３】
Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ属プランクトンが、Ｄ．ｆｏｒｔｉｉ、Ｄ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｄ．ｃａｕｄａｔａまたはＤ．ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｓのいずれかである請求項１または２に記載の下痢性毒オカダ酸群または脂溶性毒ペクテノトキシン群の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法によって製造され得る下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群。
【請求項５】
請求項４に記載の下痢性毒オカダ酸・ジノフィシストキシン群または脂溶性毒ペクテノトキシン群を用いる分析用標準毒。
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１５６７７（Ｐ２０１１−１５６７７Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７５０６３（Ｐ２００９−２７５０６３）
【出願日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
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