乳由来のタンパク質
【課題】 本発明は、大量入手可能で、ヒトでの食経験もある乳またはホエーよりカーボニックアンヒドラーゼＶＩを抽出、精製することを課題とした。
【解決手段】本発明は、乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ、乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法、上記活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する口腔用組成物を提供する。本発明の組成物は唾液の緩衝能を向上することから、う蝕の進展を阻止する効果、味覚障害を改善する効果、胃酸の中和効果から胃炎の発生を防ぐことなどが期待できる。
【解決手段】本発明は、乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ、乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法、上記活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する口腔用組成物を提供する。本発明の組成物は唾液の緩衝能を向上することから、う蝕の進展を阻止する効果、味覚障害を改善する効果、胃酸の中和効果から胃炎の発生を防ぐことなどが期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ、その製造方法並びにその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕は、基本的には歯の石灰化組織を侵す微生物による疾患であり、微生物によって産生された酸により歯の表面の無機成分が部分的に脱灰されることで始まり、その後、有機マトリックス部分の分解により進行する（細菌因子）。従って、現在主流をなすところのう蝕治療・予防法はブラッシングを基本とし、抗菌剤、酵素、抗体等を利用することにより如何に効率的に歯垢を除去するかである。一方、食物は糖質を主原料としており、う蝕発生を決定する基本要因となる（食事因子）。また、宿主に対する固有の要因、例えば、歯質、歯形、唾液の組成と流量等は、う蝕罹患性と程度を決定する（宿主要因）。こうようにう蝕は多因性疾患とみなすことができることから、最近ではフッ素やハイドロキシアパタイトによる歯質の改善や、キシリトール等の非発酵性代替味覚料の利用が広く行われるようになってきた。しかしながら、上記の如く様々な検討が行われているにもかかわらず、う蝕治療、予防、診断法は確立されているものとは言えない。
【０００３】
これに対し、唾液の緩衝能を向上させることによりう蝕誘発菌の生産する酸を積極的にしかも持続的に除去する炭酸脱水素酵素を用いたう蝕治療、予防法並びに診断法が提案されている。
【０００４】
カーボニックアンヒドラーゼは、水溶液中で溶存ＣＯ2とＨＣＯ3−の平衡反応を促進するはたらきをする酵素であり、特に植物中においてはルビスコへのＣＯ2供給等、重要な役割を果たしていることが知られている。哺乳類では、６種類のアイソザイムが分離精製されている。このうち口腔内の唾液中には唯一の分泌型であるカーボニックアンヒドラーゼＶＩが存在する。
【０００５】
唾液のｐＨが主に二酸化炭素−重炭酸イオン緩衝系によって制御されていること、う蝕患者又はう蝕経験者ではカーボニックアンヒドラーゼＶＩが減少している傾向にあること（非特許文献１）、カーボニックアンヒドラーゼＶＩは歯のエナメルペリクルに付着し活性を示すこと（非特許文献２）から、本酵素が唾液中、特に歯表面でう蝕誘発菌が産生する酸を中和し、歯の脱灰化を防ぐ主成分である可能性が高いと考えられている。
【０００６】
唾液中に分泌されるこのカーボニックアンヒドラーゼＶＩは、細菌によって産生された水素イオンを速やかに重炭酸イオンと反応させ、二酸化炭素と水にしてしまう作用をもつことから、食後、間食時の酸による歯の侵食を防ぎ、う蝕の防止に役立っていると考えられている。更に、最近、唾液中に存在する亜鉛メタロプロテインであるガスチンとこのカーボニックアンヒドラーゼＶＩが同一であることが示された（非特許文献３）。ガスチンは味覚障害患者で減少していることが知られており、カーボニックアンヒドラーゼＶＩ／ガスチンは味蕾の生長に関与していると考えられている（非特許文献４）。また北欧のグルーブにより唾液中の本酵素量が減少すると胃の消化性潰瘍に発生頻度が高くなると報告されており、何らかの原因によるカーボニックアンヒドラーゼＶＩ又はその活性の減少は、う蝕のみならず、味覚障害や胃炎等の疾病の発症に関与しているものと考えられる（非特許文献５）。
【０００７】
前述の様々な有用な作用を持つカーボニックアンヒドラーゼＶＩは、主に哺乳類の唾液中に含まれることが知られていたが、近年、ウシ乳中にその存在が確認された（非特許文献６）。
【非特許文献１】ケアリーズ リサーチ、３３巻、１７８−１８４頁（１９９９年）
【非特許文献２】ケアリーズ リサーチ、３３巻、１８５−１９０頁（１９９９年）
【非特許文献３】バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、２５０巻、６３５−６４１頁（１９９８年）
【非特許文献４】アメリカン ジャーナル オブ メディカル ソサイエティ、３１８巻、３９２−４０４頁（１９９９年）
【非特許文献５】ダイジェスティブ ディジーズ アンド サイエンス、４２巻、１０１３−１０１９頁（１９９７年）
【非特許文献６】コンパラティブ バイオケミストリー アンド フィジオロジー パートＡ、１３４巻、３４９−３５４頁（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来見いだされた乳カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、微量である上にＣＯ2とＨＣＯ3−の平衡反応の触媒活性は乳中の夾雑タンパク質の影響により不活性化されていることがわかった。
【０００９】
本発明は、商品化を視野にいれ、大量入手可能で、ヒトでの食経験もある乳またはホエーより活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを抽出、精製し、その組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを大量調製する方法を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明が提供するのは以下のとおりである。
（１）乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ。
（２）乳またはホエーが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ由来の乳またはホエーであることを特徴とする（１）のタンパク質。
（３）乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法。
（４）さらにイオン交換カラム、キレートカラム、または抗体吸着カラムで処理する工程を含む（３）記載の製造方法
（５）（１）の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する口腔用組成物。
（６）口腔用組成物が歯磨剤である、（５）の組成物。
（７）口腔用組成物が洗浄用途に使用される、（５）の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、乳またはホエーより得られる活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ、その製造方法、並びにその組成物が提供される。こうして得られた組成物は唾液の緩衝能を向上することから、う蝕の進展を阻止する効果、味覚障害を改善する効果、胃酸の中和効果から胃炎の発生を防ぐことなどが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、乳またはホエーより単離されたものである。本発明でいう乳とは、特にヒトの食経験のあるものであれば制限はないが、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの乳が挙げられる。またホエーとはこれらの乳からチーズ、ヨーグルト、バターなどを作る工程で得られる液状の物質のことを言い、主に乳中のカゼインを除いたほとんどのタンパク質がこれに含まれる。
【００１４】
本発明における活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩとは、分泌型のカーボニックアンヒドラーゼであり、ヒトにおいては主に唾液中でＣＯ2＋Ｈ2Ｏ⇔ＨＣＯ3-＋Ｈ+の可逆反応に関与するタンパク質のことである。活性型であるとは、単離された状態で、上記平衡反応作用を有しているということであり、具体的には後述の実施例のようにｐＨ調整活性を示すことで確認できる。 本発明はまた、乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法を提供する。
【００１５】
本発明でいう酸処理とは、特に制限はないが、乳またはホエーを、ｐＨ５．０以下、好ましくはｐＨ３．０以下となるように処理することをいう。この際添加する物質は、酸性の物質であれば特に制限はないが、塩酸、酢酸、酪酸などの酸、もしくはグリシン緩衝液、酢酸緩衝液などの酸性で働くことのできる緩衝液がこれに含まれる。この酸処理を行うことにより、乳またはホエー中の抗体にトラップされている不活性型のカーボニックアンヒドラーゼＶＩを活性型の形で抽出することができる。
【００１６】
本発明の製造方法においては、上記酸処理後の乳またはホエーから活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを単離・精製するために、好ましくはカラムを用いることができる。絡む処理に用いられる担体は、カーボニックアンヒドラーゼＶＩを吸着できるものであれば特に制限はない。吸着できるものとしては、例えば、イオン交換担体、アフィニティー担体などが挙げられる。イオン交換担体としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡ（クオータナリーアンモニウム）、ＱＡＥ（クオータナリーアミノエチル）などの陰イオン交換、ＣＭ（カルボキシメチル）、ＳＰ（スルホプロピル）などの陽イオン交換が挙げられ、アフィニティー担体としては亜鉛、銅、鉄などの金属キレート、特定の抗体や酵素阻害剤を固定したもの、糖タンパク質の特定の糖を認識するレクチンを固定したものが挙げられる。また、ゲルろ過クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーを利用することも可能である。さらに、酸処理により分離した抗体を除去する目的などで、プロテインＡ、プロテインＧなどの抗体に特異的に結合するタンパク質を付加した担体を用いることもできる。この抗体に特異的に結合するタンパク質は、抗体に結合できるものであれば特に限定は無い。また、カーボニックアンヒドラーゼＶＩの場合、乳やホエー中に抗体などのタンパク質にトラップされていない極微量に単独で存在するものを前述のカラム精製により精製することも可能である。
【００１７】
単離された本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、一般に期待される生理作用、例えばｐＨ調整作用、味覚改善作用、消化管などの上皮粘膜の保護作用などを目的として、飼料、食品、飲料等へ利用できる。一般に口腔内のｐＨが５．５以下になると歯のエナメル質が脱灰して、う蝕が進行する危険性があり、ｐＨ調整作用とはこのｐＨ低下を軽減、または改善し、ｐＨを中性付近に保とうとする作用のことをいう。味覚改善作用とは、様々な味物質に対する感覚が鋭敏になったり、改善することをいう。その味物質とは、例えば、甘味を感じさせる物質としてブドウ糖、ショ糖、果糖などが挙げられ、その他、苦味、旨味、辛味、渋み、酸味等を与える物質が挙げられる。これらの作用は味覚障害をもつ人、または障害をもたない人にも適用される。味覚障害の場合、他の疾患で服用している薬剤によるもの、亜鉛欠乏性によるもの、または原因不明のものなどが挙げられる。さらには、匂いに関する改善作用として臭覚改善も期待できる。このように本酵素は、口内における正常なｐH調整能、味覚能を知る上で重要なファクターとなっており、このタンパク質を定量することで口内環境の評価する検査薬としても使用できる。この場合の測定方法としては、ｐＨ調整能を測定する方法、抗カーボニックアンヒドラーゼＶＩ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
【００１８】
また、これらの作用を目的とした場合、他の同じ作用を示す物質と併用することも可能である。特に限定はないが、ｐＨ調整作用についてはリン酸化オリゴ糖カルシウム、味覚改善については亜鉛や味覚改善作用のあるその他の薬剤、胃炎などの上皮粘膜保護には、胃腸炎に効果のあるその他の薬剤などが挙げられる。更には、ｐＨ調整作用の本来の目的であるう蝕、むし歯予防に効果のあるものとの併用も可能である。特に限定はないが、キシリトール、フッ素、抗菌・除菌用薬剤などが挙げられる。これらの作用の対象は、ヒトのみならず、犬や猫といったペットにも適用される。
【００１９】
さらに、本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、それを含有する口腔用組成物として利用される。本発明の口腔内用組成物とは、口中で咀嚼したり、含嗽したり、もしくはエアゾールやミストの形態で噴霧したりするものをいい、具体的には、歯磨剤、洗浄用組成物の他、含嗽液（洗口剤）、飲料、チューインガム、口中清涼菓子、スプレー等がこれに含まれる。
【００２０】
本発明の口腔用組成物中の、活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの含有量は、その酵素活性を発現する範囲であれば特に限定されない。
【００２１】
本発明の口腔用組成物が歯磨剤である場合、本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの他、歯磨剤として通常使用される成分、具体的には、研磨剤、湿潤剤、水を含有するが、その剤型に応じ、上記必須成分に加えて任意成分としてその他の添加剤を配合できる。
【００２２】
練歯磨の場合は、例えば研磨剤、湿潤剤、粘結剤、上記以外の界面活性剤、甘味剤、防腐剤、カーボニックアンヒドラーゼＶＩ以外の各種有効成分、着色剤等を配合でき、これら成分と水とを混合して製造することができる。
【００２３】
研磨剤としては、シリカゲル、沈降シリカ、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、第２リン酸カルシウム２水和物及び無水和物、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、炭酸マグネシウム、第３リン酸マグネシウム、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、第３リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、第４リン酸カルシウム、合成樹脂系研磨剤等が挙げられるが、特にシリカゲル、沈降シリカ、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤が好ましい。
これらの研磨剤の配合量は、歯磨剤全体の２〜４０質量％、特に１０〜３０質量％とすることが好ましい。
【００２４】
湿潤剤としては、ソルビット、グリセリン、プロピレングリコール、キシリット、マルチット、ラクチット等が挙げられるが、特にソルビット、キシリットが好ましい。
これらの配合量は、歯磨剤全体の５〜５０質量％、特に２０〜４５質量％とすることが好ましい。
【００２５】
粘結剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、グアガム、アルギン酸ナトリウム、カチオン化セルロース、モンモリロナイト、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム等が挙げられる。
これらの配合量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量配合することができる。
【００２６】
界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、上記成分（ｃ）以外の非イオン性界面活性剤等を配合し得、具体的にはラウリル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−アシルサルコシネート、Ｎ−アシルグルタメート、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、Ｎ−アシルタウレート、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロールアマイド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、プルロニック等が挙げられ、特に歯磨剤の発泡性の点からラウリル硫酸ナトリウムが好ましい。これら界面活性剤の配合量は、歯磨剤全体の０．４〜３質量％、特に０．６〜２質量％の範囲であることが好ましい。
【００２７】
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、アスパラテーム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ぺリラルチン等、防腐剤としては、ブチルパラベン、エチルパラベン等のパラベン類、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２８】
香料としては、ペパーミント油、スペアミント油、アニス油、ユーカリ油、ウィンターグリーン油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハッカ油、カルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー油、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、ベイ油、レモングラス油、オリガナム油、パインニードル油、ネロリ油、ローズ油、ジャスミン油、イリスコンクリート、アブソリュートペパーミント、アブソリュートローズ、オレンジフラワー等の天然香料、及び、これら天然香料の加工処理（前留部カット、後留部カット、分留、液液抽出、エッセンス化、粉末香料化等）した香料、及び、メントール、カルボン、アネトール、シネオール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、３−ｌ−メントキシプロパン−１，２−ジオール、チモール、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、Ｎ−置換−パラメンタン−３−カルボキサミド、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒド、エチルアセテート、エチルブチレート、アリルシクロヘキサンプロピオネート、メチルアンスラニレート、エチルメチルフェニルグリシデート、バニリン、ウンデカラクトン、ヘキサナール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブタノール、イソアミルアルコール、ヘキセノール、ジメチルサルファイド、シクロテン、フルフラール、トリメチルピラジン、エチルラクテート、メチルラクテート、エチルチオアセテート等の単品香料、更に、ストロベリーフレーバー、アップルフレーバー、バナナフレーバー、パイナップルフレーバー、グレープフレーバー、マンゴーフレーバー、バターフレーバー、ミルクフレーバー、フルーツミックスフレーバー、トロピカルフルーツフレーバー等の調合香料等、歯磨剤組成物に用いられる公知の香料素材を使用することができ、実施例の香料に限定されない。
【００２９】
また、配合量も特に限定されないが、上記の香料素材は、製剤組成中に０．０００００１〜１質量％使用するのが好ましい。また、上記香料素材を使用した賦香用香料としては、製剤組成中に０．１〜２．０質量％使用するのが好ましい。
【００３０】
カーボニックアンヒドラーゼＶＩ以外の各種有効成分としては、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化第一錫、フッ化ストロンチウム、モノフルオロリン酸ナトリウム等のフッ化物、正リン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等の水溶性リン酸化合物、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、ヒノキチオール、アスコルビン酸、塩化リゾチーム、グリチルリチン酸及びその塩類、塩化ナトリウム、トラネキサム酸、イプシロンアミノカプロン酸、酢酸ｄｌ−トコフェノール、α−ビサボロール、イソプロピルメチルフェノール、クロロヘキシジン塩類、塩化セチルピリジニウム、アズレン、グリチルレチン酸、銅クロロフィリンナトリウム、グルコン酸銅等の銅化合物、乳酸アルミニウム、塩化ストロンチウム、硝酸カリウム、ベルベリン、ヒドロキサム酸及びその誘導体、トリポリリン酸ナトリウム、ゼオライト、アミラーゼ、メトキシエチレン、無水マレイン酸共重合体、ポリビニルピロリドン、エピジヒドロコレステリン、塩化ベンゼトニウム、ジヒドロコレステロール、トリクロロカルバニリド、クエン酸亜鉛、トウキ軟エキス、オウバクエキス、チョウジ、ローズマリー、オウゴン、ベニバナ等の抽出物が挙げられる。なお、上記有効成分は、本発明の効果を妨げない範囲で有効量配合することができる。
【００３１】
着色剤としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタン等を通常量で配合することができる。
【００３２】
また、本発明の口腔用組成物は洗浄用途の組成物としても利用できる。洗浄用途としては、口腔内に関係するものであれば、特に限定は無いが、義歯用洗浄剤や口臭成分洗浄組成物が含まれる。
【００３３】
本発明の口腔用組成物には、その用途に応じ、既に上記記載した成分以外に、分散媒に溶解する通常の口腔用組成物に使用可能な任意成分を添加することができる。任意成分としては、下記に示す界面活性剤、糖分、唾液分泌促進剤等が挙げられ、これらを１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。唾液分泌促進剤は、カーボニックアンヒドラーゼＶＩがその中に含まれていることからもさらなる作用の増進が期待される。
【００３４】
界面活性剤としては、具体的には、アルキル鎖長がＣ12〜Ｃ18からなるα−スルホ脂肪酸アルキルエステル又はその水溶性塩、アルキル硫酸エステル塩、Ｎ？アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルリン酸塩等のアニオン性界面活性剤、アルキル鎖長がＣ12〜Ｃ18からなるアルキルアンモニウム塩、アルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等のカチオン性界面活性剤、アルキルアミノオキサイド等の半極性界面活性剤等が挙げられる。
【００３５】
糖分は基本的に何を用いてもよいが、糖アルコールでう蝕性のないもしくは低いものを用いることが好ましい。具体的には、キシリトール、エリスリトール、マンニトール、マルチトール糖が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３６】
糖分量は、７０質量％以下が好ましく、より好ましくは３〜６０質量％、さらに好ましくは４〜５０質量％である。
【００３７】
唾液分泌促進剤は、口腔衛生及び口腔湿潤を目的として添加するものであり、具体的には味覚刺激成分、口内粘膜刺激成分、唾液腺活性化成分等が挙げられる。
【００３８】
味覚刺激成分としては、架橋剤としても利用できる有機酸類の他、旨味物質等が挙げられる。有機酸類としては、クエン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、酢酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、マレイン酸、フマル酸、アコニット酸、乳酸、酒石酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、アルドン酸、ウロン酸等の有機酸、これらを含有する梅酢、リンゴ酢、レモン、オレンジ、ユズ、夏ミカン等の柑橘類のチップ、粉末、エキス等が挙げられる。旨味物質としては、アミノ酸（塩）、核酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド等が挙げられ、具体的には、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸、グアニル酸等が挙げられる。
【００３９】
口内粘膜刺激成分としては、イソチオシアネート類、アミド系辛味成分、バニリルケトン類等が挙げられ、具体的には、アリルイソチオシアネート、カプサイシン、ピペリン、サンショオール、ジンゲロール等が挙げられる。
【００４０】
唾液腺活性化成分としては、副交換神経興奮剤、コリンエステラーゼ阻害剤、カルシウムイオン遊離放出剤等が挙げられる。具体的には、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ピロカルビン、ムスカリン、アセチルコリン、リアノジン、カフェイン等、コラ・アクミナタ、コラ・ニティダ、ヤボランジ、シラカバ、スイカズラ、セイヨウニンジン、ドクダミ、ニンニク、ハイビスカス、ホップ、マタタビ、リンデン、ローズヒップ、ボウイ、メリッサ、コレウス・フォルスコリ、ペパーミント、チンピ、オレンジ、カンゾウ、バジル等の植物及びこれらの抽出物、ガジュツ水分画抽出物、アオギリ科コーラノキ種子粉末抽出物、羅漢果チップ等が挙げられる。
【００４１】
本発明の口腔用組成物には、上記唾液分泌促進剤以外にも、香気による臭覚刺激を介した唾液促進機能を持つ香料を配合してもよい。具体的にはウメ調、グレープフルーツ調、ベリー調、レモン調等の酸味を連想させるようなものが挙げられる。
【００４２】
その他、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩等の可溶性縮合リン酸塩、炭酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム等の炭酸水素化合物、硫酸水素化合物及び水溶性リン酸水素化合物が挙げられる。また、グリセリン、ソルビット、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール等の保湿剤、フッ化ナトリウム、クロルヘキシジン塩類、第４級アンモニウム塩型カチオン殺菌剤、トリクロサン等のノニオン殺菌剤、トラネキサム酸、ε−アミノカプロン酸、アラントイネート、グリチルリチン酸ジカリウム等の抗炎症剤、デキストラナーゼ等の酵素、スペアミント、ウインターグリーン、チョウジ、ローズマリー、タイム、オウゴン等の植物抽出物、カテキン、イソフラボン、タンニン、アントシアニン、ケルセチン、ルチン等のポリフェノール類等の有効成分、安息香酸、安息香酸塩、パラベン類、ポリリジン等の防腐剤を例示することができる。なお、これら成分の配合量は、本発明の目的を妨げない範囲で通常量とすることができる。
【００４３】
本発明の口腔用組成物として、チューインガム形態の場合、チューインガムは、味ガム及び風船ガムのいずれのチューインガムであってもよい。本発明のチューインガムにおけるガムベースの配合とガム配合は、従来の配合方法に準ずればよい。ガムベースの配合原料としては、天然樹脂、酢酸ビニル樹脂、エステルガム、合成ガム、天然ワックス、乳化剤、及び炭酸カルシウム等が挙げられ、これらを上記チューインガムの種類に応じて選択し配合する。
【００４４】
ガムベースの配合例は、例えば次の通りである。味ガムベースでは、天然樹脂１０〜３０質量％、酢酸ビニル樹脂１０〜３０質量％、合成ゴム１０〜３０質量％、エステルガム５〜２０質量％、ワックス類１０〜４０質量％、乳化剤１〜１０質量％及び充填剤５〜２０質量％等の割合で配合される。風船ガムベースでは、酢酸ビニル樹脂１０〜４０質量％、合成ゴム１０〜３０質量％、エステルガム５〜２０質量％、ワックス類１０〜４０質量％、乳化剤５〜２０質量％、充填剤５〜２０質量％等の割合で配合される。
【００４５】
本発明のチューインガムは、上記のようなガムベースに、本発明のカーボニックアンヒドラーゼＶＩ、砂糖、ブドウ糖、水飴等の糖類、栄養素及び香料などを加え、常法により混合される。
【００４６】
香料としては、天然香料、合成香料などの油脂香料が適当であるが、特に限定されない。例えば、ミント系香料（ペパーミント、スペアミント、メントール等）、フルーツ系香料（シトラス、ミックスフルーツ、ストロベリー、グレープ等）、スパイス系香料（シナモン、クローブ、アネトール、リコリス他）等が挙げられる。
【００４７】
本発明の口腔用組成物として、口中清涼菓子形態の場合、口中清涼菓子は、キャンディーや錠菓などその剤型に応じて、一般的な製法に準じて製造することができる。すなわち、本発明のキャンディーは、本発明のカーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有するキャンディー生地を成型したものであり、キャンディー生地とは糖分に所望により乳製品、油脂、果実、種実、デンプン、小麦粉、酸味料、着香料を配合したものを原料として、飴状に煮詰めたものである。
【００４８】
本発明のキャンディーには、ハードキャンディー、ソフトキャンディーがあり、さらにハードキャンディーには、生地アメ、ドロップ、引きアメ等があり、ソフトキャンディーには、キャラメル、ヌガー等がある。
【００４９】
一方、本発明のカーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する錠菓は、ブドウ糖、果糖、乳糖、などの糖類や還元麦芽糖水飴（マルチトール）、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、パラチニット、マンニトールなどの糖アルコール類をアラビアガムなどの乳化剤と共にデキストリンやデンプンなどの賦形剤で粉末あるいは顆粒にしたものと滑沢剤としてショ糖脂肪酸エステル、及び前記カーボニックアンヒドラーゼＶＩを加えて打錠機にて錠剤とすることで製造できる。
【００５０】
本発明の口腔用組成物を飼料として用いる場合は、飼料とは、ウマ、ウシ、豚、ヤギ、ヒツジ、さらにはニワトリ等の鳥類などの家畜を対象とした餌がそれにあたり、本発明の口腔用組成物を食品、飲料として用いる場合は、食品、飲料は、ヒトのみならず、犬や猫といったペットもその対象に含む。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。この実施例は、本発明を限定するものではない。
【００５２】
（実施例１）ホエーからのカーボニックアンヒドラーゼＶＩ調製。
【００５３】
（１）ホエーの前処理
３ｋｇの牛乳より調製されたホエー（日高乳業社製）を１０，０００×ｇ、１５分間遠心し、その上清（約２．５L）を回収した。その上清をポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）を用いて約６００ｍｌまで濃縮し、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように溶解させて、タンパク質を沈殿させた。この沈殿したタンパク質を１０，０００×ｇ、１５分間遠心することにより回収し、３００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５、１ｍＭ塩化亜鉛）に溶解した。その後、緩衝液Ａで透析を行ないサンプルを回収した。
【００５４】
（２）胃酸条件での処理と精製
（１）のうち７５ｍｌ分を酸溶液（１００ｍｌ当たり、１Ｎ塩酸１．２ｍｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ添加）で透析を行った（４℃、６時間）。その後、緩衝液Ａで一晩透析を行い、プロテインＡカラム（プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社製。容積２ｍｌ）にアプライした。非吸着画分を限外ろ過（マイクロコンＹＭ−１０、アミコン社製）を用いて約６００μｌまで濃縮し、これをサンプルＡとした。
【００５５】
（３）グリシン塩酸緩衝液処理と精製
（１）のうち７４ｍｌをグリシン緩衝液（５０ｍMグリシン塩酸（ｐH２．５）、０．５M塩化ナトリウム）で透析を行った（４℃、６時間）。その後、緩衝液Ａで一晩透析を行い、プロテインＡカラム（プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社製、容積２ｍｌ）にアプライした。非吸着画分を限外ろ過（マイクロコンＹＭ−１０、アミコン社製）を用いて約６００μｌまで濃縮し、これをサンプルＢとした。
【００５６】
（５）ｐＨ調整活性の測定
氷上において二酸化炭素ガスを通気させたフェノールレッド溶液（１２．５ｍｇフェノールレッドを１Ｌの炭酸水素ナトリウムに溶解。赤色）５００μｌに、２０μｌの緩衝液（１Ｍの炭酸ナトリウムを２０．６ｍｌの１Ｍの炭酸水素ナトリウムに加え、１００μｌにしてもの）及び２０μｌのサンプル溶液を加えて、氷上で反応を開始した（緩衝液を加えた時点で反応液は赤色になる）。その後、黄色に変色するまでの時間を測定し、ｐＨ調整活性を判定した。赤→黄色への変色が早ければ早いほどｐＨ調整活性が高いことが考えられる（なお緩衝液のみをコントロールとした）。
【００５７】
その結果を表１に示す
【００５８】
【表１】
これにより、（２）、（３）で酸処理したカーボニックアンヒドラーゼＶＩはｐＨ調整活性を示すことが明らかとなった。
【００５９】
（実施例２）生乳からのカーボニックアンヒドラーゼＶＩ精製。
【００６０】
（１）生乳の前処理
１０L生乳を遠心分離処理（１０，０００ ×g、１５分間）し、脂肪分を除去した乳上清を回収し、ポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）によって、約２．９Lまで濃縮した。次に、乳上清に硫酸アンモニウムを３４％飽和になるように添加し、遠心分離処理（１２，０００×ｇ、２０分間）により上清部分を回収した。この上清（約１．５L）にさらに硫酸アンモニウムを６０％になるように添加し、カーボニックアンヒドラーゼVIを含有する沈殿として回収した。回収した沈殿画分は少量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により懸濁し、さらに２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によって透析を行ない、約１２０ｍｌの溶液を得た。
【００６１】
（２）プロテインＡカラムによる精製
（１）の溶液のｐＨを５Ｎ塩酸によりｐＨ２．５３に調整し、遠心処理（９，０００×ｇ、１０分間）により上清を回収した。その後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）で十分に透析し、再度、遠心分離処理（１４，０００×ｇ、１０分間）後、1 M トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によりホエー溶液を中和した。
【００６２】
プロテインＡカラム（プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社製、容積７ｍｌ）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化後、前記ホエー溶液２０ｍｌをアプライした。その後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、その洗浄液、約４０ｍｌを回収した。その後、４０ｍｌを緩衝液Ａ（実施例１（１）参照）で透析し、ポリエチレングリコールによる濃縮と限外ろ過膜（マイクロコンYM-10、アミコン社製）により約９００μｌまで濃縮した。これをサンプルＤとした。
【００６３】
（４）タンパク質の定量
溶液中のタンパク質量は、マイクロＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース社製）を利用し、操作方法はそのプロトコルに従った。検量線にはキット添付の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、溶液中のタンパク質濃度はＢＳＡ換算値として算出した。
【００６４】
（５）ｐＨ調整活性の測定
実施例１（５）と同様の方法でｐＨ調整活性を測定した。その結果を表２に示す。なお、この際のサンプルのタンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌである。
【００６５】
【表２】
これにより、（２）で酸処理後カラム処理したカーボニックアンヒドラーゼＶＩはｐＨ調整活性を示すことが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ、その製造方法並びにその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕は、基本的には歯の石灰化組織を侵す微生物による疾患であり、微生物によって産生された酸により歯の表面の無機成分が部分的に脱灰されることで始まり、その後、有機マトリックス部分の分解により進行する（細菌因子）。従って、現在主流をなすところのう蝕治療・予防法はブラッシングを基本とし、抗菌剤、酵素、抗体等を利用することにより如何に効率的に歯垢を除去するかである。一方、食物は糖質を主原料としており、う蝕発生を決定する基本要因となる（食事因子）。また、宿主に対する固有の要因、例えば、歯質、歯形、唾液の組成と流量等は、う蝕罹患性と程度を決定する（宿主要因）。こうようにう蝕は多因性疾患とみなすことができることから、最近ではフッ素やハイドロキシアパタイトによる歯質の改善や、キシリトール等の非発酵性代替味覚料の利用が広く行われるようになってきた。しかしながら、上記の如く様々な検討が行われているにもかかわらず、う蝕治療、予防、診断法は確立されているものとは言えない。
【０００３】
これに対し、唾液の緩衝能を向上させることによりう蝕誘発菌の生産する酸を積極的にしかも持続的に除去する炭酸脱水素酵素を用いたう蝕治療、予防法並びに診断法が提案されている。
【０００４】
カーボニックアンヒドラーゼは、水溶液中で溶存ＣＯ2とＨＣＯ3−の平衡反応を促進するはたらきをする酵素であり、特に植物中においてはルビスコへのＣＯ2供給等、重要な役割を果たしていることが知られている。哺乳類では、６種類のアイソザイムが分離精製されている。このうち口腔内の唾液中には唯一の分泌型であるカーボニックアンヒドラーゼＶＩが存在する。
【０００５】
唾液のｐＨが主に二酸化炭素−重炭酸イオン緩衝系によって制御されていること、う蝕患者又はう蝕経験者ではカーボニックアンヒドラーゼＶＩが減少している傾向にあること（非特許文献１）、カーボニックアンヒドラーゼＶＩは歯のエナメルペリクルに付着し活性を示すこと（非特許文献２）から、本酵素が唾液中、特に歯表面でう蝕誘発菌が産生する酸を中和し、歯の脱灰化を防ぐ主成分である可能性が高いと考えられている。
【０００６】
唾液中に分泌されるこのカーボニックアンヒドラーゼＶＩは、細菌によって産生された水素イオンを速やかに重炭酸イオンと反応させ、二酸化炭素と水にしてしまう作用をもつことから、食後、間食時の酸による歯の侵食を防ぎ、う蝕の防止に役立っていると考えられている。更に、最近、唾液中に存在する亜鉛メタロプロテインであるガスチンとこのカーボニックアンヒドラーゼＶＩが同一であることが示された（非特許文献３）。ガスチンは味覚障害患者で減少していることが知られており、カーボニックアンヒドラーゼＶＩ／ガスチンは味蕾の生長に関与していると考えられている（非特許文献４）。また北欧のグルーブにより唾液中の本酵素量が減少すると胃の消化性潰瘍に発生頻度が高くなると報告されており、何らかの原因によるカーボニックアンヒドラーゼＶＩ又はその活性の減少は、う蝕のみならず、味覚障害や胃炎等の疾病の発症に関与しているものと考えられる（非特許文献５）。
【０００７】
前述の様々な有用な作用を持つカーボニックアンヒドラーゼＶＩは、主に哺乳類の唾液中に含まれることが知られていたが、近年、ウシ乳中にその存在が確認された（非特許文献６）。
【非特許文献１】ケアリーズ リサーチ、３３巻、１７８−１８４頁（１９９９年）
【非特許文献２】ケアリーズ リサーチ、３３巻、１８５−１９０頁（１９９９年）
【非特許文献３】バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、２５０巻、６３５−６４１頁（１９９８年）
【非特許文献４】アメリカン ジャーナル オブ メディカル ソサイエティ、３１８巻、３９２−４０４頁（１９９９年）
【非特許文献５】ダイジェスティブ ディジーズ アンド サイエンス、４２巻、１０１３−１０１９頁（１９９７年）
【非特許文献６】コンパラティブ バイオケミストリー アンド フィジオロジー パートＡ、１３４巻、３４９−３５４頁（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来見いだされた乳カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、微量である上にＣＯ2とＨＣＯ3−の平衡反応の触媒活性は乳中の夾雑タンパク質の影響により不活性化されていることがわかった。
【０００９】
本発明は、商品化を視野にいれ、大量入手可能で、ヒトでの食経験もある乳またはホエーより活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを抽出、精製し、その組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを大量調製する方法を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明が提供するのは以下のとおりである。
（１）乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ。
（２）乳またはホエーが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ由来の乳またはホエーであることを特徴とする（１）のタンパク質。
（３）乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法。
（４）さらにイオン交換カラム、キレートカラム、または抗体吸着カラムで処理する工程を含む（３）記載の製造方法
（５）（１）の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する口腔用組成物。
（６）口腔用組成物が歯磨剤である、（５）の組成物。
（７）口腔用組成物が洗浄用途に使用される、（５）の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、乳またはホエーより得られる活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ、その製造方法、並びにその組成物が提供される。こうして得られた組成物は唾液の緩衝能を向上することから、う蝕の進展を阻止する効果、味覚障害を改善する効果、胃酸の中和効果から胃炎の発生を防ぐことなどが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、乳またはホエーより単離されたものである。本発明でいう乳とは、特にヒトの食経験のあるものであれば制限はないが、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの乳が挙げられる。またホエーとはこれらの乳からチーズ、ヨーグルト、バターなどを作る工程で得られる液状の物質のことを言い、主に乳中のカゼインを除いたほとんどのタンパク質がこれに含まれる。
【００１４】
本発明における活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩとは、分泌型のカーボニックアンヒドラーゼであり、ヒトにおいては主に唾液中でＣＯ2＋Ｈ2Ｏ⇔ＨＣＯ3-＋Ｈ+の可逆反応に関与するタンパク質のことである。活性型であるとは、単離された状態で、上記平衡反応作用を有しているということであり、具体的には後述の実施例のようにｐＨ調整活性を示すことで確認できる。 本発明はまた、乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法を提供する。
【００１５】
本発明でいう酸処理とは、特に制限はないが、乳またはホエーを、ｐＨ５．０以下、好ましくはｐＨ３．０以下となるように処理することをいう。この際添加する物質は、酸性の物質であれば特に制限はないが、塩酸、酢酸、酪酸などの酸、もしくはグリシン緩衝液、酢酸緩衝液などの酸性で働くことのできる緩衝液がこれに含まれる。この酸処理を行うことにより、乳またはホエー中の抗体にトラップされている不活性型のカーボニックアンヒドラーゼＶＩを活性型の形で抽出することができる。
【００１６】
本発明の製造方法においては、上記酸処理後の乳またはホエーから活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを単離・精製するために、好ましくはカラムを用いることができる。絡む処理に用いられる担体は、カーボニックアンヒドラーゼＶＩを吸着できるものであれば特に制限はない。吸着できるものとしては、例えば、イオン交換担体、アフィニティー担体などが挙げられる。イオン交換担体としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡ（クオータナリーアンモニウム）、ＱＡＥ（クオータナリーアミノエチル）などの陰イオン交換、ＣＭ（カルボキシメチル）、ＳＰ（スルホプロピル）などの陽イオン交換が挙げられ、アフィニティー担体としては亜鉛、銅、鉄などの金属キレート、特定の抗体や酵素阻害剤を固定したもの、糖タンパク質の特定の糖を認識するレクチンを固定したものが挙げられる。また、ゲルろ過クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーを利用することも可能である。さらに、酸処理により分離した抗体を除去する目的などで、プロテインＡ、プロテインＧなどの抗体に特異的に結合するタンパク質を付加した担体を用いることもできる。この抗体に特異的に結合するタンパク質は、抗体に結合できるものであれば特に限定は無い。また、カーボニックアンヒドラーゼＶＩの場合、乳やホエー中に抗体などのタンパク質にトラップされていない極微量に単独で存在するものを前述のカラム精製により精製することも可能である。
【００１７】
単離された本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、一般に期待される生理作用、例えばｐＨ調整作用、味覚改善作用、消化管などの上皮粘膜の保護作用などを目的として、飼料、食品、飲料等へ利用できる。一般に口腔内のｐＨが５．５以下になると歯のエナメル質が脱灰して、う蝕が進行する危険性があり、ｐＨ調整作用とはこのｐＨ低下を軽減、または改善し、ｐＨを中性付近に保とうとする作用のことをいう。味覚改善作用とは、様々な味物質に対する感覚が鋭敏になったり、改善することをいう。その味物質とは、例えば、甘味を感じさせる物質としてブドウ糖、ショ糖、果糖などが挙げられ、その他、苦味、旨味、辛味、渋み、酸味等を与える物質が挙げられる。これらの作用は味覚障害をもつ人、または障害をもたない人にも適用される。味覚障害の場合、他の疾患で服用している薬剤によるもの、亜鉛欠乏性によるもの、または原因不明のものなどが挙げられる。さらには、匂いに関する改善作用として臭覚改善も期待できる。このように本酵素は、口内における正常なｐH調整能、味覚能を知る上で重要なファクターとなっており、このタンパク質を定量することで口内環境の評価する検査薬としても使用できる。この場合の測定方法としては、ｐＨ調整能を測定する方法、抗カーボニックアンヒドラーゼＶＩ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
【００１８】
また、これらの作用を目的とした場合、他の同じ作用を示す物質と併用することも可能である。特に限定はないが、ｐＨ調整作用についてはリン酸化オリゴ糖カルシウム、味覚改善については亜鉛や味覚改善作用のあるその他の薬剤、胃炎などの上皮粘膜保護には、胃腸炎に効果のあるその他の薬剤などが挙げられる。更には、ｐＨ調整作用の本来の目的であるう蝕、むし歯予防に効果のあるものとの併用も可能である。特に限定はないが、キシリトール、フッ素、抗菌・除菌用薬剤などが挙げられる。これらの作用の対象は、ヒトのみならず、犬や猫といったペットにも適用される。
【００１９】
さらに、本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩは、それを含有する口腔用組成物として利用される。本発明の口腔内用組成物とは、口中で咀嚼したり、含嗽したり、もしくはエアゾールやミストの形態で噴霧したりするものをいい、具体的には、歯磨剤、洗浄用組成物の他、含嗽液（洗口剤）、飲料、チューインガム、口中清涼菓子、スプレー等がこれに含まれる。
【００２０】
本発明の口腔用組成物中の、活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの含有量は、その酵素活性を発現する範囲であれば特に限定されない。
【００２１】
本発明の口腔用組成物が歯磨剤である場合、本発明の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの他、歯磨剤として通常使用される成分、具体的には、研磨剤、湿潤剤、水を含有するが、その剤型に応じ、上記必須成分に加えて任意成分としてその他の添加剤を配合できる。
【００２２】
練歯磨の場合は、例えば研磨剤、湿潤剤、粘結剤、上記以外の界面活性剤、甘味剤、防腐剤、カーボニックアンヒドラーゼＶＩ以外の各種有効成分、着色剤等を配合でき、これら成分と水とを混合して製造することができる。
【００２３】
研磨剤としては、シリカゲル、沈降シリカ、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、第２リン酸カルシウム２水和物及び無水和物、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、炭酸マグネシウム、第３リン酸マグネシウム、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、第３リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、第４リン酸カルシウム、合成樹脂系研磨剤等が挙げられるが、特にシリカゲル、沈降シリカ、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤が好ましい。
これらの研磨剤の配合量は、歯磨剤全体の２〜４０質量％、特に１０〜３０質量％とすることが好ましい。
【００２４】
湿潤剤としては、ソルビット、グリセリン、プロピレングリコール、キシリット、マルチット、ラクチット等が挙げられるが、特にソルビット、キシリットが好ましい。
これらの配合量は、歯磨剤全体の５〜５０質量％、特に２０〜４５質量％とすることが好ましい。
【００２５】
粘結剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、グアガム、アルギン酸ナトリウム、カチオン化セルロース、モンモリロナイト、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム等が挙げられる。
これらの配合量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量配合することができる。
【００２６】
界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、上記成分（ｃ）以外の非イオン性界面活性剤等を配合し得、具体的にはラウリル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−アシルサルコシネート、Ｎ−アシルグルタメート、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、Ｎ−アシルタウレート、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロールアマイド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、プルロニック等が挙げられ、特に歯磨剤の発泡性の点からラウリル硫酸ナトリウムが好ましい。これら界面活性剤の配合量は、歯磨剤全体の０．４〜３質量％、特に０．６〜２質量％の範囲であることが好ましい。
【００２７】
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、アスパラテーム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ぺリラルチン等、防腐剤としては、ブチルパラベン、エチルパラベン等のパラベン類、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２８】
香料としては、ペパーミント油、スペアミント油、アニス油、ユーカリ油、ウィンターグリーン油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハッカ油、カルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー油、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、ベイ油、レモングラス油、オリガナム油、パインニードル油、ネロリ油、ローズ油、ジャスミン油、イリスコンクリート、アブソリュートペパーミント、アブソリュートローズ、オレンジフラワー等の天然香料、及び、これら天然香料の加工処理（前留部カット、後留部カット、分留、液液抽出、エッセンス化、粉末香料化等）した香料、及び、メントール、カルボン、アネトール、シネオール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、３−ｌ−メントキシプロパン−１，２−ジオール、チモール、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、Ｎ−置換−パラメンタン−３−カルボキサミド、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒド、エチルアセテート、エチルブチレート、アリルシクロヘキサンプロピオネート、メチルアンスラニレート、エチルメチルフェニルグリシデート、バニリン、ウンデカラクトン、ヘキサナール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブタノール、イソアミルアルコール、ヘキセノール、ジメチルサルファイド、シクロテン、フルフラール、トリメチルピラジン、エチルラクテート、メチルラクテート、エチルチオアセテート等の単品香料、更に、ストロベリーフレーバー、アップルフレーバー、バナナフレーバー、パイナップルフレーバー、グレープフレーバー、マンゴーフレーバー、バターフレーバー、ミルクフレーバー、フルーツミックスフレーバー、トロピカルフルーツフレーバー等の調合香料等、歯磨剤組成物に用いられる公知の香料素材を使用することができ、実施例の香料に限定されない。
【００２９】
また、配合量も特に限定されないが、上記の香料素材は、製剤組成中に０．０００００１〜１質量％使用するのが好ましい。また、上記香料素材を使用した賦香用香料としては、製剤組成中に０．１〜２．０質量％使用するのが好ましい。
【００３０】
カーボニックアンヒドラーゼＶＩ以外の各種有効成分としては、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化第一錫、フッ化ストロンチウム、モノフルオロリン酸ナトリウム等のフッ化物、正リン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等の水溶性リン酸化合物、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、ヒノキチオール、アスコルビン酸、塩化リゾチーム、グリチルリチン酸及びその塩類、塩化ナトリウム、トラネキサム酸、イプシロンアミノカプロン酸、酢酸ｄｌ−トコフェノール、α−ビサボロール、イソプロピルメチルフェノール、クロロヘキシジン塩類、塩化セチルピリジニウム、アズレン、グリチルレチン酸、銅クロロフィリンナトリウム、グルコン酸銅等の銅化合物、乳酸アルミニウム、塩化ストロンチウム、硝酸カリウム、ベルベリン、ヒドロキサム酸及びその誘導体、トリポリリン酸ナトリウム、ゼオライト、アミラーゼ、メトキシエチレン、無水マレイン酸共重合体、ポリビニルピロリドン、エピジヒドロコレステリン、塩化ベンゼトニウム、ジヒドロコレステロール、トリクロロカルバニリド、クエン酸亜鉛、トウキ軟エキス、オウバクエキス、チョウジ、ローズマリー、オウゴン、ベニバナ等の抽出物が挙げられる。なお、上記有効成分は、本発明の効果を妨げない範囲で有効量配合することができる。
【００３１】
着色剤としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタン等を通常量で配合することができる。
【００３２】
また、本発明の口腔用組成物は洗浄用途の組成物としても利用できる。洗浄用途としては、口腔内に関係するものであれば、特に限定は無いが、義歯用洗浄剤や口臭成分洗浄組成物が含まれる。
【００３３】
本発明の口腔用組成物には、その用途に応じ、既に上記記載した成分以外に、分散媒に溶解する通常の口腔用組成物に使用可能な任意成分を添加することができる。任意成分としては、下記に示す界面活性剤、糖分、唾液分泌促進剤等が挙げられ、これらを１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。唾液分泌促進剤は、カーボニックアンヒドラーゼＶＩがその中に含まれていることからもさらなる作用の増進が期待される。
【００３４】
界面活性剤としては、具体的には、アルキル鎖長がＣ12〜Ｃ18からなるα−スルホ脂肪酸アルキルエステル又はその水溶性塩、アルキル硫酸エステル塩、Ｎ？アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルリン酸塩等のアニオン性界面活性剤、アルキル鎖長がＣ12〜Ｃ18からなるアルキルアンモニウム塩、アルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等のカチオン性界面活性剤、アルキルアミノオキサイド等の半極性界面活性剤等が挙げられる。
【００３５】
糖分は基本的に何を用いてもよいが、糖アルコールでう蝕性のないもしくは低いものを用いることが好ましい。具体的には、キシリトール、エリスリトール、マンニトール、マルチトール糖が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３６】
糖分量は、７０質量％以下が好ましく、より好ましくは３〜６０質量％、さらに好ましくは４〜５０質量％である。
【００３７】
唾液分泌促進剤は、口腔衛生及び口腔湿潤を目的として添加するものであり、具体的には味覚刺激成分、口内粘膜刺激成分、唾液腺活性化成分等が挙げられる。
【００３８】
味覚刺激成分としては、架橋剤としても利用できる有機酸類の他、旨味物質等が挙げられる。有機酸類としては、クエン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、酢酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、マレイン酸、フマル酸、アコニット酸、乳酸、酒石酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、アルドン酸、ウロン酸等の有機酸、これらを含有する梅酢、リンゴ酢、レモン、オレンジ、ユズ、夏ミカン等の柑橘類のチップ、粉末、エキス等が挙げられる。旨味物質としては、アミノ酸（塩）、核酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド等が挙げられ、具体的には、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸、グアニル酸等が挙げられる。
【００３９】
口内粘膜刺激成分としては、イソチオシアネート類、アミド系辛味成分、バニリルケトン類等が挙げられ、具体的には、アリルイソチオシアネート、カプサイシン、ピペリン、サンショオール、ジンゲロール等が挙げられる。
【００４０】
唾液腺活性化成分としては、副交換神経興奮剤、コリンエステラーゼ阻害剤、カルシウムイオン遊離放出剤等が挙げられる。具体的には、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ピロカルビン、ムスカリン、アセチルコリン、リアノジン、カフェイン等、コラ・アクミナタ、コラ・ニティダ、ヤボランジ、シラカバ、スイカズラ、セイヨウニンジン、ドクダミ、ニンニク、ハイビスカス、ホップ、マタタビ、リンデン、ローズヒップ、ボウイ、メリッサ、コレウス・フォルスコリ、ペパーミント、チンピ、オレンジ、カンゾウ、バジル等の植物及びこれらの抽出物、ガジュツ水分画抽出物、アオギリ科コーラノキ種子粉末抽出物、羅漢果チップ等が挙げられる。
【００４１】
本発明の口腔用組成物には、上記唾液分泌促進剤以外にも、香気による臭覚刺激を介した唾液促進機能を持つ香料を配合してもよい。具体的にはウメ調、グレープフルーツ調、ベリー調、レモン調等の酸味を連想させるようなものが挙げられる。
【００４２】
その他、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩等の可溶性縮合リン酸塩、炭酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム等の炭酸水素化合物、硫酸水素化合物及び水溶性リン酸水素化合物が挙げられる。また、グリセリン、ソルビット、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール等の保湿剤、フッ化ナトリウム、クロルヘキシジン塩類、第４級アンモニウム塩型カチオン殺菌剤、トリクロサン等のノニオン殺菌剤、トラネキサム酸、ε−アミノカプロン酸、アラントイネート、グリチルリチン酸ジカリウム等の抗炎症剤、デキストラナーゼ等の酵素、スペアミント、ウインターグリーン、チョウジ、ローズマリー、タイム、オウゴン等の植物抽出物、カテキン、イソフラボン、タンニン、アントシアニン、ケルセチン、ルチン等のポリフェノール類等の有効成分、安息香酸、安息香酸塩、パラベン類、ポリリジン等の防腐剤を例示することができる。なお、これら成分の配合量は、本発明の目的を妨げない範囲で通常量とすることができる。
【００４３】
本発明の口腔用組成物として、チューインガム形態の場合、チューインガムは、味ガム及び風船ガムのいずれのチューインガムであってもよい。本発明のチューインガムにおけるガムベースの配合とガム配合は、従来の配合方法に準ずればよい。ガムベースの配合原料としては、天然樹脂、酢酸ビニル樹脂、エステルガム、合成ガム、天然ワックス、乳化剤、及び炭酸カルシウム等が挙げられ、これらを上記チューインガムの種類に応じて選択し配合する。
【００４４】
ガムベースの配合例は、例えば次の通りである。味ガムベースでは、天然樹脂１０〜３０質量％、酢酸ビニル樹脂１０〜３０質量％、合成ゴム１０〜３０質量％、エステルガム５〜２０質量％、ワックス類１０〜４０質量％、乳化剤１〜１０質量％及び充填剤５〜２０質量％等の割合で配合される。風船ガムベースでは、酢酸ビニル樹脂１０〜４０質量％、合成ゴム１０〜３０質量％、エステルガム５〜２０質量％、ワックス類１０〜４０質量％、乳化剤５〜２０質量％、充填剤５〜２０質量％等の割合で配合される。
【００４５】
本発明のチューインガムは、上記のようなガムベースに、本発明のカーボニックアンヒドラーゼＶＩ、砂糖、ブドウ糖、水飴等の糖類、栄養素及び香料などを加え、常法により混合される。
【００４６】
香料としては、天然香料、合成香料などの油脂香料が適当であるが、特に限定されない。例えば、ミント系香料（ペパーミント、スペアミント、メントール等）、フルーツ系香料（シトラス、ミックスフルーツ、ストロベリー、グレープ等）、スパイス系香料（シナモン、クローブ、アネトール、リコリス他）等が挙げられる。
【００４７】
本発明の口腔用組成物として、口中清涼菓子形態の場合、口中清涼菓子は、キャンディーや錠菓などその剤型に応じて、一般的な製法に準じて製造することができる。すなわち、本発明のキャンディーは、本発明のカーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有するキャンディー生地を成型したものであり、キャンディー生地とは糖分に所望により乳製品、油脂、果実、種実、デンプン、小麦粉、酸味料、着香料を配合したものを原料として、飴状に煮詰めたものである。
【００４８】
本発明のキャンディーには、ハードキャンディー、ソフトキャンディーがあり、さらにハードキャンディーには、生地アメ、ドロップ、引きアメ等があり、ソフトキャンディーには、キャラメル、ヌガー等がある。
【００４９】
一方、本発明のカーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する錠菓は、ブドウ糖、果糖、乳糖、などの糖類や還元麦芽糖水飴（マルチトール）、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、パラチニット、マンニトールなどの糖アルコール類をアラビアガムなどの乳化剤と共にデキストリンやデンプンなどの賦形剤で粉末あるいは顆粒にしたものと滑沢剤としてショ糖脂肪酸エステル、及び前記カーボニックアンヒドラーゼＶＩを加えて打錠機にて錠剤とすることで製造できる。
【００５０】
本発明の口腔用組成物を飼料として用いる場合は、飼料とは、ウマ、ウシ、豚、ヤギ、ヒツジ、さらにはニワトリ等の鳥類などの家畜を対象とした餌がそれにあたり、本発明の口腔用組成物を食品、飲料として用いる場合は、食品、飲料は、ヒトのみならず、犬や猫といったペットもその対象に含む。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。この実施例は、本発明を限定するものではない。
【００５２】
（実施例１）ホエーからのカーボニックアンヒドラーゼＶＩ調製。
【００５３】
（１）ホエーの前処理
３ｋｇの牛乳より調製されたホエー（日高乳業社製）を１０，０００×ｇ、１５分間遠心し、その上清（約２．５L）を回収した。その上清をポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）を用いて約６００ｍｌまで濃縮し、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように溶解させて、タンパク質を沈殿させた。この沈殿したタンパク質を１０，０００×ｇ、１５分間遠心することにより回収し、３００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５、１ｍＭ塩化亜鉛）に溶解した。その後、緩衝液Ａで透析を行ないサンプルを回収した。
【００５４】
（２）胃酸条件での処理と精製
（１）のうち７５ｍｌ分を酸溶液（１００ｍｌ当たり、１Ｎ塩酸１．２ｍｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ添加）で透析を行った（４℃、６時間）。その後、緩衝液Ａで一晩透析を行い、プロテインＡカラム（プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社製。容積２ｍｌ）にアプライした。非吸着画分を限外ろ過（マイクロコンＹＭ−１０、アミコン社製）を用いて約６００μｌまで濃縮し、これをサンプルＡとした。
【００５５】
（３）グリシン塩酸緩衝液処理と精製
（１）のうち７４ｍｌをグリシン緩衝液（５０ｍMグリシン塩酸（ｐH２．５）、０．５M塩化ナトリウム）で透析を行った（４℃、６時間）。その後、緩衝液Ａで一晩透析を行い、プロテインＡカラム（プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社製、容積２ｍｌ）にアプライした。非吸着画分を限外ろ過（マイクロコンＹＭ−１０、アミコン社製）を用いて約６００μｌまで濃縮し、これをサンプルＢとした。
【００５６】
（５）ｐＨ調整活性の測定
氷上において二酸化炭素ガスを通気させたフェノールレッド溶液（１２．５ｍｇフェノールレッドを１Ｌの炭酸水素ナトリウムに溶解。赤色）５００μｌに、２０μｌの緩衝液（１Ｍの炭酸ナトリウムを２０．６ｍｌの１Ｍの炭酸水素ナトリウムに加え、１００μｌにしてもの）及び２０μｌのサンプル溶液を加えて、氷上で反応を開始した（緩衝液を加えた時点で反応液は赤色になる）。その後、黄色に変色するまでの時間を測定し、ｐＨ調整活性を判定した。赤→黄色への変色が早ければ早いほどｐＨ調整活性が高いことが考えられる（なお緩衝液のみをコントロールとした）。
【００５７】
その結果を表１に示す
【００５８】
【表１】
これにより、（２）、（３）で酸処理したカーボニックアンヒドラーゼＶＩはｐＨ調整活性を示すことが明らかとなった。
【００５９】
（実施例２）生乳からのカーボニックアンヒドラーゼＶＩ精製。
【００６０】
（１）生乳の前処理
１０L生乳を遠心分離処理（１０，０００ ×g、１５分間）し、脂肪分を除去した乳上清を回収し、ポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）によって、約２．９Lまで濃縮した。次に、乳上清に硫酸アンモニウムを３４％飽和になるように添加し、遠心分離処理（１２，０００×ｇ、２０分間）により上清部分を回収した。この上清（約１．５L）にさらに硫酸アンモニウムを６０％になるように添加し、カーボニックアンヒドラーゼVIを含有する沈殿として回収した。回収した沈殿画分は少量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により懸濁し、さらに２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によって透析を行ない、約１２０ｍｌの溶液を得た。
【００６１】
（２）プロテインＡカラムによる精製
（１）の溶液のｐＨを５Ｎ塩酸によりｐＨ２．５３に調整し、遠心処理（９，０００×ｇ、１０分間）により上清を回収した。その後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）で十分に透析し、再度、遠心分離処理（１４，０００×ｇ、１０分間）後、1 M トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によりホエー溶液を中和した。
【００６２】
プロテインＡカラム（プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社製、容積７ｍｌ）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化後、前記ホエー溶液２０ｍｌをアプライした。その後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、その洗浄液、約４０ｍｌを回収した。その後、４０ｍｌを緩衝液Ａ（実施例１（１）参照）で透析し、ポリエチレングリコールによる濃縮と限外ろ過膜（マイクロコンYM-10、アミコン社製）により約９００μｌまで濃縮した。これをサンプルＤとした。
【００６３】
（４）タンパク質の定量
溶液中のタンパク質量は、マイクロＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース社製）を利用し、操作方法はそのプロトコルに従った。検量線にはキット添付の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、溶液中のタンパク質濃度はＢＳＡ換算値として算出した。
【００６４】
（５）ｐＨ調整活性の測定
実施例１（５）と同様の方法でｐＨ調整活性を測定した。その結果を表２に示す。なお、この際のサンプルのタンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌである。
【００６５】
【表２】
これにより、（２）で酸処理後カラム処理したカーボニックアンヒドラーゼＶＩはｐＨ調整活性を示すことが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ。
【請求項２】
乳またはホエーが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ由来の乳またはホエーであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法。
【請求項４】
さらにイオン交換カラム、キレートカラム、または抗体吸着カラムで処理する工程を含む請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する口腔用組成物。
【請求項６】
口腔用組成物が歯磨剤である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
口腔用組成物が洗浄用途に使用される、請求項５記載の組成物。
【請求項１】
乳またはホエーより単離された活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩ。
【請求項２】
乳またはホエーが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ由来の乳またはホエーであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
乳またはホエーを酸処理する工程を含む活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩの製造方法。
【請求項４】
さらにイオン交換カラム、キレートカラム、または抗体吸着カラムで処理する工程を含む請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の活性型カーボニックアンヒドラーゼＶＩを含有する口腔用組成物。
【請求項６】
口腔用組成物が歯磨剤である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
口腔用組成物が洗浄用途に使用される、請求項５記載の組成物。
【公開番号】特開２００７−１６７０２２（Ｐ２００７−１６７０２２Ａ）
【公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７１６２８（Ｐ２００５−３７１６２８）
【出願日】平成１７年１２月２６日（２００５．１２．２６）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２６日（２００５．１２．２６）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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