本発明はRNAi技術のための構築物を目的とする。本発明は、標的遺伝子のサイレンシングのために遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するリボ核酸（RNA）及びこのようなRNAをコードする核酸構築物を提供する。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、さらにこれら配列の少なくとも1つは、前記標的遺伝子のある領域の予想される転写物と実質的に同一である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子サイレンシング技術において標的遺伝子をサイレンシングするために干渉性RNAとして使用するためのリボ核酸（RNA）であって、5'から3'方向に少なくとも、第１のエフェクター配列、第２のエフェクター配列、前記第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列、および前記第１のエフェクター配列に実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列がそれぞれ対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、前記配列の少なくとも一つは前記標的遺伝子の領域の予想される転写物と実質的に同一である、前記リボ核酸（RNA）。
【請求項２】
更に１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含み、配列のいずれの２つも前記スペーシング配列によって隔てられている、請求項１記載のRNA。
【請求項３】
第１のエフェクター配列が第２のエフェクター配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２記載のRNA。
【請求項４】
第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列が第１のエフェクター配列に実質的に相補的な配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２記載のRNA。
【請求項５】
更に１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列を含み、少なくとも第１のエフェクター配列が第２のエフェクター配列と前記追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項４記載のRNA。
【請求項６】
更に１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列を含み、第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列が第１のエフェクター配列に実質的に相補的な配列と前記追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項３記載のRNA。
【請求項７】
スペーシング配列がアニーリング可能でない、請求項５または６記載のRNA。
【請求項８】
第２のエフェクター配列と前記第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列との間でループを形成する１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のRNA。
【請求項９】
３つのエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な３つの配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１０】
４つのエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な４つの配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１１】
５つのエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な５つの配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１２】
６つ以上のエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な前記と同数の配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１３】
エフェクター配列が長さ10〜200ヌクレオチドである、請求項１〜12のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１４】
エフェクター配列が長さ17〜30ヌクレオチドである、請求項１〜12のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１５】
エフェクター配列が長さ21〜23ヌクレオチドである、請求項１〜12のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１６】
スペーシング配列がAA、UU、UUA、UUAG、UUACAAおよびN₁AAN₂（式中、N₁およびN₂は同一でも異なっていてもよく、C、G、UまたはAのいずれかである）からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２〜15のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１７】
追加的スペーシング配列がAA、UU、UUA、UUAG、UUACAAおよびN₁AAN₂（式中、N₁およびN₂は同一でも異なっていてもよく、C、G、UまたはAのいずれかである）からなる群より選ばれる配列を含む、請求項５〜７のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１８】
請求項１〜17のいずれか１項記載のRNAをコードする核酸構築物。
【請求項１９】
遺伝子サイレンシング技術において標的遺伝子をサイレンシングするために干渉性RNAとして使用するためのリボ核酸（RNA）をコードする配列を含む核酸構築物であって、5'から3'方向に少なくとも、第１のエフェクターコード配列、第２のエフェクターコード配列、前記第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列、および前記第１のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列の転写物はそれぞれ対応するエフェクターコード配列の転写物と二本鎖領域を形成することができ、前記配列の少なくとも一つは前記標的遺伝子の領域と実質的に同一である、前記核酸構築物。
【請求項２０】
更に１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含み、配列のいずれの２つのコード配列も前記スペーシング配列によって隔てられている、請求項19記載の核酸構築物。
【請求項２１】
第１のエフェクターコード配列が第２のエフェクターコード配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２０記載の核酸構築物。
【請求項２２】
第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列が第１のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２０記載の核酸構築物。
【請求項２３】
第１のエフェクターコード配列が第２のエフェクターコード配列と、１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項２２記載の核酸構築物。
【請求項２４】
第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列が少なくとも第１のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列と１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項２１記載の核酸構築物。
【請求項２５】
スペーシング配列の転写物が追加的スペーシング配列の転写物とアニーリング可能でない、請求項２３または２４記載の核酸構築物。
【請求項２６】
第２のエフェクターコード配列と前記第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列との間に、１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２７】
３つのエフェクターコード配列および前記エフェクターコード配列に実質的に相補的な３つの配列を含み、前記エフェクターコード配列の１次転写物が前記エフェクターコード配列に実質的に相補的である配列と二本鎖領域を形成することができる、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２８】
４つのエフェクターコード配列および前記エフェクターコード配列に実質的に相補的な４つの配列を含み、前記エフェクターコード配列の１次転写物が前記エフェクターコード配列に実質的に相補的である配列と二本鎖領域を形成することができる、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２９】
５つのエフェクターコード配列および前記エフェクターコード配列に実質的に相補的な５つの配列を含み、前記エフェクターコード配列の１次転写物が前記エフェクターコード配列に実質的に相補的である配列と二本鎖領域を形成することができる、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３０】
エフェクターコード配列が長さ10〜200ヌクレオチドである、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３１】
エフェクターコード配列が長さ17〜30ヌクレオチドである、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３２】
エフェクターコード配列が長さ21〜23ヌクレオチドである、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３３】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のRNAを細胞に導入することにより標的遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３４】
請求項１９〜３２のいずれか１項記載の核酸構築物を細胞に導入することにより標的遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のRNAを標的遺伝子へ導入することによって前記標的遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３６】
エフェクターコード配列および実質的に相補的はない列に機能可能に連結したプロモーターおよびターミネーターを更に含む、請求項１９〜３２のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３７】
請求項１９〜３０のいずれか１項記載の核酸構築物をポリメラーゼ連鎖反応によって構築する方法であって、ポリヌクレオチドに所定のオリゴヌクレオチドを加えることを含み、前記オリゴヌクレオチドは第１の部分配列および第２の部分配列に分けられており、前記ポリメラーゼ連鎖反応が以下を含む、前記方法：
3'端にポリメラーゼ連鎖反応条件下で前記ポリヌクレオチドの少なくとも第１の部分とハイブリダイズし得る固定化部を有し、5'端に前記第１の部分配列と同一のエフェクター部を有する第１のプライマー、および、3'端に前記ポリヌクレオチドの前記第１の部分に隣接する少なくとも前記ポリヌクレオチドの第２の部分とハイブリダイズし得る固定化部を有し、5'端に前記第２の部分配列と同一のエフェクター部を有する第２のプライマー、を提供する工程；
前記プライマーをポリメラーゼ連鎖反応条件下で各プライマーの前記固定化部が前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように前記ポリヌクレオチドに導入する工程；
ポリメラーゼ連鎖反応を行い、プライマーのエフェクターを二本鎖配列の末端に含む増幅産物を生成させる工程；および、
エフェクター部の末端を連結して結合したポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド配列を形成させる工程。
【請求項３８】
請求項３７記載の方法に適した割合でポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、および連結酵素を含む、請求項３７記載の方法によって核酸構築物を構築するためのキット。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【公表番号】特表２００６−５２６３９４（Ｐ２００６−５２６３９４Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８０８４（Ｐ２００６−５０８０８４）
【出願日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００７５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５１７
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０２３３６４８３）ベニテック　オーストラリア　リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】