本発明は、二重鎖プロモーターの一本鎖をコードするプロモータープライマーを用いて環状の一本鎖DNA転写基質を得ることによる、標的配列に対応する転写産物を産生させるためのRNAポリメラーゼの使用のための方法、組成物およびキットを提供する。本発明には、mRNAに対応するcDNAの調製、センスプローブもしくはアンチセンスプローブの作製、遺伝子特異的もしくは生物特異的な配列の検出、またはRNAiの作製のような、研究用途、診断用途および治療用途のための幅広い適応性がある。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の標的配列に対応する転写産物の産生方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 標的核酸を得る段階;
(b) センス転写プロモーターを含む5'末端部分と標的に相補的な3'末端部分とを含む、センスプロモータープライマーを得る段階;
(c) 標的核酸とセンスプロモータープライマーとの複合体を形成させるため、センスプロモータープライマーを標的核酸とアニーリングさせる段階;
(d) 標的配列に相補的な第一鎖cDNAを得るため、ポリメライゼーション反応条件下で、標的核酸とセンスプロモータープライマーとの複合体をDNAポリメラーゼと接触させる段階;
(e) 第一鎖cDNAを得る段階;
(f) センスプロモーターを含む環状の第一鎖cDNAを得るため、ライゲーション条件下で、第一鎖cDNAをライゲーションする段階;
(g) アンチセンスプロモーターオリゴを得る段階;
(h) 環状の転写基質を得るため、センスプロモーターを含む環状の第一鎖cDNAにアンチセンスプロモーターオリゴをアニーリングさせる段階;
(i) 環状の転写基質を得る段階; および
(j) 転写条件下で、環状の転写基質をRNAポリメラーゼと接触させて、その際に転写産物を得る段階。
【請求項２】
アンチセンスプロモーターオリゴが、固体支持体に固定化されたオリゴを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
試料中のまたは試料由来の分析物を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法:
a) プロモーターを認識するRNAポリメラーゼのための二重鎖プロモーターのアンチセンスプロモーター部分に対する配列を含むオリゴヌクレオチドに連結されたABSを含んだ、分析物結合物質-オリゴヌクレオチド(「ABS-オリゴ」)を得る段階;
b) シグナルプローブを得る段階、その際に、シグナルプローブが鋳型の3'末端に連結されたセンスプロモーターを含み、その際に、センスプロモーターがABS-オリゴのアンチセンスプロモーターに十分に相補的であって、複合体に結合するRNAポリメラーゼを用いた鋳型の転写に使用できる、複合体を形成する段階;
c) 試料中に分析物が存在する場合に分析物を結合させた表面とABS-オリゴを、該表面に分析物が存在する場合に分析物へABS-オリゴが結合可能とする分析物結合条件下で接触させる段階;
d) 結合していないABS-オリゴの除去を可能とする条件下で表面を洗浄する段階;
e) 表面にABS-オリゴが存在する場合にABS-オリゴとのシグナルプローブの複合体化を可能とする複合体化条件下で、表面をシグナルプローブと接触させる段階;
f) 任意で、結合していないシグナルプローブの除去を可能とする条件下で表面を洗浄する段階;
g) ABS-オリゴとシグナルプローブとの間の複合体を用いて、鋳型がコードする産物の転写を可能とする条件下で、表面をRNAポリメラーゼと接触させる段階; および
h) 存在する場合、鋳型がコードする転写産物を検出する段階。
【請求項４】
鋳型に相補的な転写産物の量を増幅させるための方法であって、以下の段階を含む方法:
a) 転写産物を得る段階;
b) 転写産物の3'末端に相補的な3'末端部分および任意で、5'末端にリン酸基またはトポイソメラーゼ部分を含むセンスプロモータープライマーを得る段階;
c) センスプロモータープライマーを転写産物にアニーリングさせる段階;
d) 第一鎖cDNAを得るため、転写産物にアニーリングしたプロモータープライマーをRNA依存性DNAポリメラーゼにより、DNA合成条件下でプライマー伸長させる段階;
e) 任意で、第一鎖cDNAにアニーリングしているRNAを除去する段階;
f) センスプロモーターを含む環状の第一鎖cDNAを得るため、第一鎖cDNAの3'末端にその5'末端を共有結合させる、第一鎖cDNAをライゲーションする段階;
g) 環状の転写基質を得るため、センスプロモーターを含む環状の第一鎖cDNAにアンチセンスプロモーターオリゴをアニーリングさせる段階;
h) さらなる転写産物を得るため、転写条件下で、環状の転写基質をRNAポリメラーゼと接触させる段階; および
i) さらなる転写産物を得る段階。
【請求項５】
センスプロモータープライマーが、さらなる転写産物を産生させるためにRNAポリメラーゼにより使用される擬似プロモーターまたは合成プロモーターからなる群より選択される一本鎖のセンスプロモーターを含み、かつアンチセンスプロモーターオリゴが、さらなる転写産物を得るために使用されない、請求項4記載の方法。
【請求項６】
センスプロモータープライマーがN4プロモーターを含み、かつ転写に使用されるRNAポリメラーゼがN4 vRNAP、ミニvRNAP、および変異型のミニvRNAPのなかから選択され、かつアンチセンスプロモーターオリゴが、さらなる転写産物を得るために使用されない、請求項4記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８】

【公表番号】特表２００６−５０７００３（Ｐ２００６−５０７００３Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５５６３１（Ｐ２００４−５５５６３１）
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８５９６
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１９０７４７）エピセンター　テクノロジーズ (1)
【出願人】（３０５０５３６６２）
【出願人】（３０５０５３６５１）
【Ｆターム（参考）】