五歩蛇毒の線溶酵素およびその使用
本発明は、五歩蛇の線溶酵素遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、およびそのベクターにより形質転換される宿主細胞に関する。
【課題】線溶酵素は、血栓を起因とする疾患の治療に使用する。
【解決手段】五歩蛇の未加工の毒から線溶酵素ＦIIを精製し、これに相当する遺伝子をクローニングする。酵母発現システムにより線溶酵素を生成するのが望ましい。線溶酵素の活性も測定する。本発明の利点は、線溶酵素の発現レベルおよび活性がどちらも高く、品質が安定していることである。
【課題】線溶酵素は、血栓を起因とする疾患の治療に使用する。
【解決手段】五歩蛇の未加工の毒から線溶酵素ＦIIを精製し、これに相当する遺伝子をクローニングする。酵母発現システムにより線溶酵素を生成するのが望ましい。線溶酵素の活性も測定する。本発明の利点は、線溶酵素の発現レベルおよび活性がどちらも高く、品質が安定していることである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の技術分野に関するものであり、特に五歩蛇のフィブリン（フィブリノゲン）溶解遺伝子（２番）、遺伝子ベクター、遺伝子ベクターを用いて遺伝子操作した宿主細胞、および血栓塞栓性疾患を緩和するため遺伝子を用いて作製された薬剤を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
現在、血栓塞栓性疾患、とりわけ心筋梗塞および卒中は、死亡および罹患の主な原因の１つとなっている。感染症の大半を制御するのに成功したことで、中国では生活水準が改善され、一般に寿命は延び、集団構造において高齢者数が増加し、全疾患のなかで心血管性および脳血管性血栓塞栓性疾患の罹患率が１位と２位を占めるようになった。年間３００万人以上が罹患していると推算される。血栓塞栓性疾患の罹患率が今後さらに増加すると予想されるのは当然である。
【０００３】
現在、血栓塞栓性疾患の治療薬は、主に抗血小板薬（例、アスピリン）、抗凝固薬（例、ヘパリン）、および血栓溶解薬（例、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）である。アスピリンおよびヘパリンなどの抗血小板療法および抗凝固療法は、新たなフィブリン形成を予防することにより血栓溶解作用を増強すると考えられている。しかし、これらに既存の血栓に対する作用は認められない。ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ‐ＰＡ）など、臨床使用が可能な血栓溶解薬はプラスミノーゲン活性化因子であり、プラスミノーゲンの活性化により血栓を効果的に溶解する。すなわち、特に大きな血栓に作用する場合、血栓溶解薬の一般的特徴として、血栓溶解作用が間接的かつ緩徐で、弱いことが挙げられる。心血管性および脳血管性血栓症が発症した場合、血流が遮断されてから数分で低酸素により心筋および神経細胞は死滅する。これは血栓溶解薬の血栓溶解作用が間接的だからである。上の３剤は、血栓および出血に関して選択性が低いなど、副作用が認められることがある。スタフィロキナーゼはアナフィラキシーを誘発することがあり、組織プラスミノーゲン活性化因子も高価であるため、広範な応用範囲が制限されている。
【０００４】
特に注目すべきは、血栓溶解薬を他剤と併用投与しても、患者の２５％にとって効果がないことである。さらに、当初血栓溶解薬の投与により治癒した症例の約５〜３０％に再閉塞が生じ、血栓溶解薬に対する感受性が認められない。
【０００５】
結論として、血栓溶解薬は臨床応用の要件を完全には満たしていない。より特異的かつ効果的な血栓溶解薬の開発が急がれる。
【０００６】
蛇毒に関する海外の研究によれば、アメリカマムシおよびセイブヒシモンガラガラヘビ（ニシダイヤガラガラヘビ）の毒は、直接作用する線溶酵素を含有しており、プラスミノーゲンを活性化することはない。これらの研究では、ラットの静脈血栓塞栓症モデルにおいて血栓溶解活性が示された。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで血栓溶解活性を確認したときには、心臓、肝臓、肺、および腎臓の組織切片に関する顕微鏡検査で出血および腐敗が認められなかった。
【０００７】
ａｎｃｏｒｄおよびａｈｙｌｙｓａｎｔｉｎｆａｒｃｔａｓｅなど、中国の診療所で使用される特定の蛇毒から分離したトロンビン様の酵素は、フィブリノゲンをフィブリン類に変換し、血漿粘度を下げ、トロンビンとほぼ同じ機序で抗血栓作用を発揮する。これらの酵素と血栓溶解薬の有効性および機序を比較することはできない。
【０００８】
中国固有の五歩蛇の毒は、プラスミノーゲンを活性化せずにフィブリン／フィブリノゲンを直接分解する成分を含有し、強力な生物活性を持つ。カラムクロマトグラフィーを用いて、１５分画から数種類の線溶タンパク質を採取すると、このなかの分画IIに価値の高い生物学的特徴が認められた。（１）直接血栓を溶解する作用：加熱したプレートを用いることで線溶因子がフィブリンを分解し、プラスミノーゲンを不活化する、（２）迅速な作用：ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、線溶因子の作用はウロキナーゼより２倍速い、（３）有効性が高い：線溶因子の生物活性は、ウロキナーゼよりも高い（線溶因子１３０μｇはウロキナーゼ４５０μｇに相当する）、（４）副作用が少ない：未精製の五歩蛇毒には明らかに出血の副作用が認められるが、用量５００μｇ／ｍｌの線溶因子では出血は認められない。これらの特徴は、五歩蛇毒から得られた線溶因子が、血栓塞栓性疾患を治療する上で魅力的な製剤となり得ることを強力に裏付けている。
【０００９】
しかし、天然由来であることから、五歩蛇毒の組成および生物活性には、地域的および季節的多様性があり、安定した臨床効果を得るのは実際には困難である。さらに、未加工の蛇の成分は複雑であるため、精製しても単一成分を分離することは依然難しく、臨床応用時に毒性および副作用を引き起こす可能性もある。天然蛇毒には、生産量が限定される、コストが高い、市場占有率が低い、という特徴がある。その分子構造や構造と活性との関係は、依然としてタンパク質工学では説明できない。上記の問題を解決することで、五歩蛇毒由来の線溶因子を臨床適応するための科学的根拠を確立することは不可能である。
【００１０】
酵母は増殖が速く、特別な培地がなくとも大量に発酵する。酵母のＤＮＡは比較的単純で、クローニング法を用いたスクリーニングが簡便である。酵母とは真菌であるため、遺伝子発現および遺伝子調節の機序、そして発現産物の修飾処理法は、大腸菌よりも完成されている。例えば、酵母はグリコシル化や、正しいジスルフィド結合を形成すること等が可能である。蛇毒のタンパク質を酵母で発現させるのに成功した前例もある。五歩蛇由来のＦII抗体をプローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＦIIの遺伝子をスクリーニングし、酵母発現ベクターＰＰIＣ９Ｋへクローニングした。次に酵母細胞へと形質転換し、酵母細胞に五歩蛇のＦＩＩを大量に発現させた。ついには、クロマトグラフィーを用いて五歩蛇の組換えＦＩＩを精製し、線溶活性を確認した。われわれの研究では、遺伝子操作により五歩蛇由来の組換えＦＩＩが豊富に得られ、続く薬力学試験およびクラス１の新薬の評価の基礎となっている。
【００１１】
蛇毒研究は、蛇毒からＤＮＡエンドヌクレアーゼを単離して分子生物学的研究を大いに推進させる、サンゴヘビの毒素発見が神経伝達物質受容体の精製において重要な役割を果たすなど、バイオ医薬品開発で主要な役割を果たしてきた。蛇毒由来のあらゆる化学的、あるいは生物学的臨床製剤を比較すると、五歩蛇毒由来組換えＦＩＩが組成面および生物活性面で地域的多様性および化学的不均質性を克服し、生産量および有効性を高め、市場価値の大きい、独自の知的財産権を有する新規の臨床薬となると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
五歩蛇由来の線溶酵素ＦＩＩはフィブリンを直接分解することが可能であり、線溶活性の有効量で出血は認められなかった。しかし、未加工の蛇毒は複雑であるため、精製しても単一成分を分離することは難しい。蛇毒の産生量は限られているため、大量生産は困難である。これら上記の問題は、遺伝子工学技術を用いて五歩蛇由来の組換え線溶酵素ＦＩＩを発現させることで解決できる。われわれは、五歩蛇由来の組換え線溶酵素であるＦＩＩを単離し、ＦＩＩ遺伝子のスクリーニングおよびクローニングを行って、酵母細胞中に組換え線溶酵素を発現させて精製し、その線溶活性について試験を行った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
方法：イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により、五歩蛇毒から天然線溶酵素ＦＩＩを単離した。基質として用いたフィブリンおよびフィブリノゲンにより線溶活性を確認した。フィブリノゲンに対する作用部位は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより観察した。五歩蛇毒のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびｃＤＮＡライブラリーを作製した。プローブとして五歩蛇由来ＦＩＩの抗体を用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＦＩＩの遺伝子をスクリーニングした。これを消化および結合により酵母発現ベクターＰＰIＣ９Ｋへクローニングし、形質転換およびスクリーニングにより大量の酵母菌を発現させた。イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーにより、組換えＦＩＩを精製した。組換えＦＩＩの純度についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥで試験を行い、フィブリン平板法により線溶活性を測定し、IｇＧおよびアルブミンに対する作用について観察した。ｉｎ ｖｉｖｏの線溶活性については、ビーグル犬の肺動脈血栓症モデルを用いて測定した。
【００１４】
結果：３段階の手順を踏んで、単一のバンドとしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上に線溶酵素ＦＩＩを単離した。分子量は２５，５００であった。ＦＩＩは、フィブリノゲンおよびフィブリンの主にＡα鎖およびＢβ鎖を切断し、γ鎖にはほとんど影響を及ぼさなかった。ＦＩＩは、用量依存的にフィブリンを分解した。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、ｃＤＮＡライブラリーからＦＩＩ遺伝子をスクリーニングして、組換えプラスミドＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩを作製した。形質転換後、ＰＣＲで確認した酵母の染色体へ組換えプラスミドを組み込んだ。線溶活性を基準として用いて発現量の多い菌株をスクリーニングしたところ、発現から３日目に線溶活性がピークに達した。２段階の手順を踏んで、単一のバンドとしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上に組換え線溶酵素ＦＩＩを単離した。組換えＦＩＩはフィブリンを強力に分解できるが、IｇＧおよびアルブミンに対しては作用しない。組換えＦＩＩは、右下肺動脈にあらかじめ作製した血栓を効率的に溶解することが可能である。注入から１時間後に測定を行ったところ、右下肺動脈血栓の平均再開通率は、８３．３％であった。結論：組換え線溶酵素ＦＩＩは酵母で大量に発現し、線溶活性が高かった。
【発明の効果】
【００１５】
五歩蛇毒由来の天然ＦＩＩは収量が低く、品質が不安定である。われわれが遺伝子工学技術を用いて酵母に組換えＦＩＩを発現させたところ、天然ＦＩＩよりも線溶活性および収量が高く、品質が安定し、費用を抑えられた。組換えＦＩＩは、動物の血栓溶解モデルにおいて血栓を効率的に溶解し、出血はほとんど認められなかった。組換えＦＩＩが、社会および経済に多大な利益をもたらす有効性の高い、新規の血栓溶解薬となることが強く示唆される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
１． 五歩蛇毒由来ＦＩＩの精製
【００１７】
１．１ ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いたイオン交換クロマトグラフィー
【００１８】
五歩蛇毒（３ｇ）を０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）１０ｍｌで溶解し、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）を用いて２５℃、２４時間で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０カラム（直径３．０ｍ、高さ８０ｃｍ）に上清を移した。開始バッファーとして０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）、溶出バッファーとして１Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ５．０）からなる直線濃度勾配で分画を溶出した。流速１２ｍｌ／時間で３ｍｌ量の分画を回収した。溶出液の吸光度（２８０ｎｍにて）を試験した。ピークを示した分画の線溶活性について試験を行った。次に線溶分画を透析し、凍結乾燥した。
【００１９】
修正したフィブリン平板法（Ａｓｔｒｕｐ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒｔｚ、１９５２）を用いて線溶活性を証明した。各濃度について、３回試験を行った。ペトリ皿（直径９．５ｃｍ）に入れたウシ血漿（０．２％、２０ｍｌ）をトロンビン（８０μｌ、100Ｕ／ｍｌ）で凝血した。線溶活性は、各分画２０μｌより生じた溶解面積、すなわち径の積（ｍｍ２）として表した。各分画をペトリ皿に置き、３７℃で１２時間インキュベートした。
【００２０】
結果：ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いた未加工の毒のイオン交換クロマトグラフィーにより１０分画が生成された（図１）。第２分画（ＦＩＩ）において、線溶活性が高かった。線溶活性は６０．２３±１６．４７ｍｍ２／μｇであった。
【００２１】
１．２ １回目のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５ゲル濾過
【００２２】
ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いたイオン交換クロマトグラフィーで得られたＦＩＩ（８５ｍｇ）を０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）２ｍｌで溶解し、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）を用いて２５℃、２４時間で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５カラム（直径１．１ｃｍ、高さ１００ｃｍ）に上清を移した。０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）で分画を溶出した。流速１２ｍｌ／時間で３ｍｌ量の分画を回収した。溶出液の吸光度（２８０ｎｍにて）ならびにピークを示した分画の線溶活性について試験を行った。次に線溶分画を透析し、凍結乾燥した。
【００２３】
結果：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５カラムにおいて、ゲル濾過によりさらに分取すると、ＦＩＩが２分画得られた（図２）。線溶活性は、第１分画に局在していた。線溶活性は８７．５１±１４．９５ｍｍ２／μｇであった。
【００２４】
１．３ ２回目のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５ゲル濾過
【００２５】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いた１回目のゲル濾過で得られた線溶分画を、上記の方法で再度Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５ゲル濾過カラムに適用した。
【００２６】
結果：単一のピークが得られた（図３）。線溶活性は９０．４９±１２．４１ｍｍ２／μｇであった。
【００２７】
２． 純度および生化学的キャラクタリゼーション
【００２８】
２．１ 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩの純度の確認
【００２９】
Ｌａｅｍｍｌｉ法に従って、ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を実施した（電気泳動バッファーの組成は、１２％分解ゲル［ｐＨ８．８］、４％濃縮ゲル［ｐＨ６．８］、Ｔｒｉｓ‐ｇｌｙｃｉｎｅゲル。電圧２００Ｖ、時間４５分）。分子量の標準は、ＭＢＰ-β-ガラクトシダーゼ１７５，０００、ＭＢＰ‐パラミオシン８３，０００、グルタミン酸脱水素酵素６２，０００、アルドラーゼ４７，５００、トリオースリン酸イソメラーゼ３２，５００、β‐ラクトグロブリンＡ２５，０００、リゾチーム１６，５００であった。タンパク質バンドは、０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
【００３０】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、精製されたＦＩＩが単一のタンパク質バンドとして確認された（図４）。回帰曲線（Ｘ軸はｌｇＭＷ、Ｙ軸は標準移動度に対する相対移動度［Ｒｆ（ｘ）］）に基づき、方程式ｌｇＭＷ＝−１．５５×＋５．５１、ｒ＝０．９５が得られた。算出された分子量は２５，５５０である（図５）。
【００３１】
２．２ 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩのフィブリノゲン溶解活性の確認
【００３２】
ウシフィブリノゲン（７５μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）をピペットで１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移した。ＦＩＩ（２５μｌ、２ｍｇ／ｍｌ）をチューブに添加し、溶液を３７℃で１時間インキュベートした。次に１２５Ｍｍ ＥＤＴＡ１０μｌを添加してチューブ内の反応を中止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー５０μｌを添加した。サンプル２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけて、ＦＩＩによるフィブリノゲン分解がプラスミンによる分解と異なっているかどうかを確認した。ＦＩＩの代わりにプラスミン以外のサンプルを用いて同じ実験を繰り返し行った。
【００３３】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、ＦＩＩはα‐およびβ‐フィブリノゲン分解酵素であり、α鎖およびβ鎖を分解する。γ鎖にはほとんど影響を及ぼさなかった。ＦＩＩによる分解画分の分子量は４５，０００Ｄａであった。フィブリノゲンのα鎖、β鎖、およびγ鎖は、プラスミンにより分解された。プラスミンによる分解画分の分子量は、それぞれ４７，０００Ｄａ、４４，０００Ｄａ、および２３，０００Ｄａであった。ＦＩＩおよびプラスミンによる分解後のバンドは異なっており、これらの切断サイトが異なっていることを示している（図６）。
【００３４】
２．３ 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩの線溶活性の確認
【００３５】
修正したフィブリン平板法を用いて線溶活性を証明した（ＡｓｔｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒｔｚ、１９５２年）。ペトリ皿（直径９．５ｃｍ）に入れたウシフィブリノゲン（０．２％、２０ｍｌ）をトロンビン（８０μｌ、１００Ｕ／ｍｌ）で凝血した。各濃度について、３回試験を行った。線溶活性は、各分画２０μｌより生じた溶解面積、すなわち径の積（ｍｍ２）として表した。各分画をペトリ皿に置き、３７℃で１２時間インキュベートした。陽性対照としてウロキナーゼ５００Ｕ／ｍｌを、陰性対照として生理食塩水を使用した。
【００３６】
結果：２０μｌのＦＩＩを、０．２５、０．５、１、および２ｍｇ／ｍｌの異なる濃度で適用した（表１）。濃度の増加とともに溶解面積も増加することが示された（図７）。
【００３７】
３． 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩ抗体の作製
【００３８】
３．１ ウサギの抗血清ＦＩＩの作製
【００３９】
方法：（１）動物の免疫。ウサギは、ＦＩＩ（３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌおよびフロイントアジュバント１ｍｌを混合した乳化剤を背部にマルチポイント皮下注入することにより免疫化した。１回目注入後、追加抗原を週に数回、計４週間投与した。
【００４０】
（２）抗血清の作製。免疫化されたウサギに対し、塩酸ケタミン３０ｍｇ／ｋｇ筋注により麻酔した。頚動脈に挿入したカテーテルから採血し、４℃で一晩保存した。続いてこの血清を遠心分離し、一部を４℃で保存した。
【００４１】
（３）酵素結合免疫測定法（ＥＬIＳＡ）による抗体価の測定。マイクロプレート（９６穴）は、炭酸水素ナトリウムバッファーに入れたＦＩＩ１００ｍｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、穴当たり１００μｌに４℃で一晩浸した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０含有ＰＢＳＴで２回洗浄し、２×ＰＢＳおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ブロック液を用いて非結合部位を３７℃で１時間ブロックした。血清力価を測定するため、１％ＢＳＡおよびウサギ抗血清（１次抗体）含有１×ＰＢＳに段階希釈した血清１００ｍｌを入れてプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。再度プレートを３回洗浄し、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（分子全体）‐ペルオキシダーゼ複合体１００ｍｌで１時間インキュベート後、さらに３回洗浄した。ペルオキシダーゼアッセイＡおよびＢ用基質溶液をすべての穴に添加し、反応システムの色に基づいて抗体価を確認した。
【００４２】
結果：抗原として使用した五歩蛇毒由来の精製された線溶酵素ＦＩＩによりＮＯ．１およびＮＯ．２のウサギを免疫化した。４週後、ＥＬIＳＡにより抗体価を測定した。各ウサギの抗体価は１：２００００であった。
【００４３】
３．２ ＦＩＩモノクローナル抗体の作製
【００４４】
方法：（１）免疫、ハイブリドーマ融合クローニングを用いたスクリーニング。Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週齢）に対し、ＦＩＩ０．２ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）および同量のフロイント完全アジュバントの混合液を皮下注射した。フロイント完全アジュバントに入れた同量の抗原による追加抗原を、２週間隔で、計３サイクル投与した。尾静脈からＦＩＩ０．２ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を注入し、３日後、ハイブリドーマ融合を実施した。すなわち、免疫化したマウスから脾細胞を採取し、１０：１の割合でＳＰ２／１０細胞と混合し、５０％ＰＥＧ（ｕ３７００）を用いて融合を実施した。融合した細胞を５９６穴のプレートで培養し、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。１５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択培地を４日間、次にＨＴ培地を６日間継続的に適用し、１１日目以降はＲＰＭI‐１６４０培地を使用した。前述のように、培地で生成された抗体を、間接酵素結合免疫測定法（間接ＥＬIＳＡ）により測定した。
【００４５】
（２）結果：ハイブリドーマ融合２サイクル後、細胞株２０株が確立された。このうち特異度の高い細胞株２株について、それぞれＣ１およびＣ４と名付けた。この２株から生成されたモノクローナル抗体はいずれもIｇＧIで、IｇＧ分類キットを用いて試験し、製造会社の指示に従って使用した。
【００４６】
４． 五歩蛇の毒腺由来の発現ｃＤＮＡライブラリーの構築
【００４７】
４．１ ＲＮＡの作製
【００４８】
方法：（１）蛇の頭から対の毒腺を摘出し、切除して、直ちにドライアイスのなかに保存した。
【００４９】
（２）ＲＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、製造会社のプロトコールに従った。毒腺（計約１．７ｇ）を混合した。トリゾール、クロロホルム、およびイソプロピルアルコールを使用して各腺を均質化し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水相のＲＮＡを分離して、イソプロピルアルコールによりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡのペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、短時間風乾した。最後に、ＲＮＡをジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水で溶解した。１％アガロースゲルに入れたリボソームＲＮＡの２８Ｓ，１８Ｓ，および５Ｓのバンドを識別することにより、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの完全性を確認した。Ａ２６０とＡ２８０の比でｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度を確認した。
【００５０】
結果：ｔｏｔａｌ ＲＮＡは長いスメアとして検出され、２８Ｓ、１８Ｓ，および５Ｓに明るいバンドが認められた。ｔｏｔａｌ ＲＮＡのＣＤ／２６０とＣＤ２８０の比は２０で、総量は４２６μｇであった。したがって、ＲＮＡは劣化しておらず、高品質であるとの結論を導くことができた。ＲＮＡ電気泳動（図８）によれば、２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡは明るく示された。２８Ｓの蛍光強度は１８ＳｒＲＮＡの２倍であり、ライブラリーが高品質であることの根拠を示した。
【００５１】
４．２ ｍＲＮＡの精製
【００５２】
方法：引き続き、製造会社のプロトコールに従って、オリゴ（ｄＴ）‐セルロースアフィニティクロマトグラフィーを用いてｍＲＮＡを精製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＰｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを濃縮し、サンプルバッファー溶液でセルロースカラムを十分に洗浄し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（３ｍｇ）をＤＥＰＣ処理水に入れて６５℃で１０分間インキュベートした。すぐに氷冷したバスを用いて、温度を室温まで下げた。サンプルバッファー溶液３回のあと、溶離液で溶出し、ｍＲＮＡを洗浄して分離した。
【００５３】
１％アガロース‐エチジウムブロマイド電気泳動を用いてＲＮＡの無損傷性を評価した。ｍＲＮＡの完全性は１％アガロース電気泳動で確認した。
【００５４】
結果：ｍＲＮＡの総量は１０μｇであった。
【００５５】
４．３ ｃＤＮＡライブラリーの構築
【００５６】
方法：ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、製造会社のプロトコールに従った。図９参照。
【００５７】
（１）第1ストランドｃＤＮＡ合成
【００５８】
（２）第2ストランドｃＤＮＡ合成
【００５９】
（３）ｃＤＮＡ末端にＮｏｔIおよびＳａｌIアダプターを付加する。
【００６０】
（４）ｃＤＮＡの連結と形質転換。ｃＤＮＡおよびｐＳｐｏｒｔIベクターを連結した。ｃＤＮＡ反応液、ｐＳｐｏｒｔIベクター、Ｔ４リガーゼ１０×バッファーの混合液を１６℃で一晩インキュベートした。連結産物１０μｌを大腸菌コンピテントセルＤＨ５ ５０μｌに添加し、４℃で３０分間、４２℃で１２０秒間、４℃で５分間、３７℃で１０分間の順で培養した。次に懸濁した細胞を新しい１．５ｍＬ ＥＰチューブに入れ、３７℃で1時間、２５０ｒｐｍで振盪した。形質転換体２μＬを、１０倍、１００倍、および１０００倍に希釈して、アンピシリン、イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトシド、および５‐ｂｒｏｍ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｙｌ‐ｂｅｔａ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ１００ｍｇ／Ｌ−１を含有するＬｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉプレートにまき、３７℃で一晩インキュベートした。ｃＤＮＡライブラリーの力価を計算し、−８０℃で保存した。
【００６１】
結果：増幅していない５ライブラリーの総力価は、５×１０７ｐｆｕ／ｍｌである。
【００６２】
５． 発現ｃＤＮＡライブラリーからのＦＩＩ遺伝子のクローン
【００６３】
５．１ 抗体による発現ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング
【００６４】
方法：適切に希釈してから、ｃＤＮＡライブラリーに入れた細菌１００μｌを、１％グルコース、８％グリセロール、およびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを付加したＬＢ培地を含有するプレートにまき、３７℃で一晩増殖させた。
【００６５】
酢酸セルロース膜をIＰＴＧ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）に浸漬してＬＢプレートにひろげ、酢酸セルロース膜上の非対称な３箇所をスポットして配向させた。確認された酢酸セルロース膜をアガロースプレートに広げ、融合タンパク質の発現を誘導するため、３７℃で６〜８時間インキュベートした。
【００６６】
誘導から６〜８時間後、酢酸セルロース膜をクロロホルムで３０分間処理し、１％ＢＳＡ、リゾチーム４ｇ／ｍｌ、およびＤＮＡａｓｅ１μｇ／ｍｌに入れて３０分間軽く攪拌し、４℃で一晩ブロックした。ブロック後、各フィルターに対し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００（ＴＢＳ−ＴＴ）約１００ｍｌで、１回１５分間の洗浄を３回行った。続いてＴＢＳ１００ｍｌ／フィルターで２回洗浄し、残留洗浄剤を除去した。組換えタンパク質を産生するコロニーを検出するため、ブロッキング・バッファーで１０００倍に希釈したウサギ抗体で膜を探索し、室温で３時間軽く攪拌した。ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（分子全体）‐ペルオキシダーゼ複合体１００ｍｌで膜を再度３回洗浄し、１時間インキュベートした。その後、さらに３回洗浄した。
【００６７】
ＤＡＢ発色基質溶液に膜を浸漬し、３０分間軽く攪拌して、蒸留水ですすいだ。茶色の陽性コロニーが検出された。
【００６８】
結果：プレート（直径９ｃｍ、５×１０３クローンを含む）を用いて１次スクリーニングを実施した。２００，０００個のクローンをスクリーニングし、１５個の陽性クローンを検出した。これらの陽性クローンに対し繰り返しスクリーニングを行ったところ、１１個のクローンに陽性反応が認められた（図１０）。この１１個の陽性クローンを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ-１を含有するＬｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉプレートで平板培養し、モノクローナル抗体で確認したところ、９個のクローンに陽性反応（Ｃ１およびＣ４抗体を使用）が認められた。
【００６９】
５．２ プラスミド抽出と陽性クローンの配列決定
【００７０】
方法：プラスミドをアルカリ法（ＧIＡＧＥＮ）により抽出した。（１）新しく画線培養したプレートから単一コロニーを採取し、スターター培養液（適切な選択的抗生物質を含有するＬＢ培地２〜５ｍｌ）に接種する。３７℃で約８時間、激しく振盪（約３００ｒｐｍ）しながら培養する。
【００７１】
（２）スターター培養液を選択的ＬＢ培地３ｍｌに入れて５００倍〜１０００倍に希釈する。３７℃で１２〜１６時間、激しく振盪（約３００ｒｐｍ）しながら増殖させる。
【００７２】
（３）６０００×ｇ、４℃で１５分間遠心して細菌細胞を採集する。
【００７３】
（４）細菌ペレットをバッファーＰ１ ０．３ｍｌで再懸濁する。
【００７４】
（５）バッファーＰ２ ０．３ｍｌを添加し、密閉したチューブを４〜６回激しく転倒混和し、室温（１５〜２５℃）で５分間インキュベートする。
【００７５】
（６）冷却したバッファーＰ３ ０．３ｍｌを添加し、直後に４〜６回激しく転倒混和し、氷上で５分間インキュベートする。
【００７６】
（７）マイクロ遠心チューブに移して、最高速度で１０分間遠心する。すぐにプラスミドＤＮＡを含む上清を除去する。
【００７７】
（８）Ｂｕｆｆｅｒ ＱＢＴ１ｍｌを添加してＧIＡＧＥＮ−ｔｉｐ２０を平衡化し、重力流によりカラムを空にする。
【００７８】
（９）手順７の上清をＧIＡＧＥＮ‐ｔｉｐ２０に添加し、重力流により樹脂に入れる。
【００７９】
（１０）Ｂｕｆｆｅｒ ＱＣ２×２ｍｌでＧIＡＧＥＮ‐ｔｉｐ２０を洗浄する。
【００８０】
（１１）Ｂｕｆｆｅｒ ＱＦ０．８ｍｌでＤＮＡを溶出する。１．５ｍｌまたは２ｍｌのマイクロ遠心チューブに溶出液を回収する。
【００８１】
（１２）室温のイソプロパノールをＤＮＡの０．７倍量（ＤＮＡ溶出量０．８ｍｌ当たり０．５６ｍｌ）添加して、ＤＮＡを沈殿させる。マイクロ遠心チューブで混和し、直ちに１０，０００ｒｐｍ以上で３０分間遠心する。慎重に上清を取り除く。
【００８２】
（１３）７０％エタノール１ｍｌでＤＮＡペレットを洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心する。
【００８３】
（１４）ペレットを５〜１０分間風乾し、適量のバッファーでＤＮＡを再溶解する。
【００８４】
キャピラリー電気泳動による配列決定にプラスミドを使用し、標準的なプライマーＴ７およびＳＰ６を適用した。
【００８５】
結果：陽性プレート９枚から単一コロニーをそれぞれ採取し、スターター培養液（適切な選択的抗生物質を含有するＬＢ培地２〜５ｍｌ）に接種した。３７℃で約８時間、激しく振盪しながらインキュベートし、プラスミドを抽出した。ＰＣＲ反応を実施し、標準的なプライマーＴ７およびＳＰ６を適用した。各クローンに、産物に特異的なバンドが認められた。キャピラリー電気泳動による配列決定にプラスミドを使用し、標準的なプライマーＴ７およびＳＰ６を適用した（図１１）。
【００８６】
５．３ シーケンス・アラインメント
【００８７】
方法：これら陽性クローンのゲノムの起源を同定するため、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐにより、これらのシーケンスとＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースおよびタンパク質データベースとを比較した。この９個のシーケンスのほとんどは、ＳＶＭＰファミリーと相同性がある（報告された遺伝子と相同性を共有し、同一性は最高で８５％）。このうちＦＩＩ‐２およびＦＩＩ‐４は、ＳＶＭＰファミリーと関連のあるＡＤＡＭファミリーに属す、最も保守的なシーケンスを共有していた。したがって、われわれはＦＩＩ‐２の遺伝子をＦＩＩと名付け、このタンパク質を優先的に発現させて、ＦＩＩのアミノ酸シーケンスを推測した（図１２）。
【００８８】
６． 大腸菌における五歩蛇毒由来ＦＩＩ遺伝子の発現
【００８９】
方法：一晩振盪（抽出により確認されたＦＩＩプラスミド含有コロニー）させた大腸菌０．２ｍｌをアンピシリン２０ｍｌ含有ＳＯＢ培地に添加し、３７℃で３時間、Ａ６００（濁度）が約０．５になるまで振盪した。最終濃度１μｍｏｌ／ＬまでIＰＴＧを添加した。４時間振盪し、１，５００ｒｐｍで２０分間遠心して、上清を捨てた。水０．５ｍｌおよびＳＤＳローディングバッファー０．５ｍｌをペレットに添加して１００℃で５分間加熱し、１０，０００ｒｐｍで遠心した。上清２０μｌを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
結果：IＰＴＧによる誘導後のＦＩＩプラスミド含有大腸菌溶解産物では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０ｋＤのバンドが示された。IＰＴＧにより誘導しなかった、あるいはプラスミドを含まない大腸菌溶解産物では、そのようなバンドは認められなかったことから、大腸菌の融合タンパク質としてＦＩＩの遺伝子を発現させることが可能であることが示された。
【００９１】
７． 五歩蛇毒由来ＦＩＩ遺伝子のクローニング
【００９２】
方法：（図１４参照）
【００９３】
７．１ ＦＩＩのＰＣＲ増幅
【００９４】
２段階のＰＣＲにより、標的遺伝子のαシグナルから５’までのシーケンスおよび制限酵素サイトを導入した。
プライマー１：５’ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＡＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ Ｃ ３’
プライマー２：５’ＣＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＡＴ Ｃ ３’
リバースプライマー：
プライマー３：５’ＧＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＴ ＴＣ ３’
手順：（１）ＰＣＲ１回目：プライマー１がフォワードプライマー、プライマー３がリバースプライマー、テンプレートはＦＩＩプラスミドである。
（２）ＰＣＲ２回目：プライマー２がフォワードプライマー、プライマー３がリバースプライマー、テンプレートは、ＰＣＲ１回目の産物である。ＰＣＲの条件は、１回目と同じである。
【００９５】
７．２ 組換えＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドの構築
【００９６】
１％アガロースゲル電気泳動後、ＰＣＲ２回目の産物を抽出した。アガロースゲルから抽出した標的フラグメントおよびＰＰIＣ-９Ｋプラスミドの両方をＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化し、それぞれを電気泳動後、回収した。次に１６℃で１２時間Ｔ４反応系に接合した。次にコンピテント細胞Ｔｏｐ １０Ｆに形質転換し、ＬＢ／ペニシリンプレートで平板培養した。陽性コロニーを採取してプラスミドを抽出し、制限酵素分析により同定した。次に、標的フラグメントを含むプラスミドを精製した。
【００９７】
７．３ 組換え発現ＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドの構築
【００９８】
標的フラグメントの有無に関わらず、ＰＰIＣ９ＫプラスミドをＳａｃIおよびＮｏｔIの両方で消化して接合し、形質転換した。次に、陽性コロニーを採取し、ＰＰIＣ９ＫＦＩＩプラスミドを同定し、精製した。
【００９９】
結果：上の２段階のＰＣＲ後のＰＣＲ産物は約７００ｂｐで、ＦＩＩ遺伝子の大きさと同じであった。電気泳動後に回収されたＰＣＲ産物およびＰＰIＣ９ＫプラスミドをＸｈｏIおよびＮｏｔIの両方で消化し、構築された組換えＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩを制限酵素消化により同定した。
【０１００】
組換えＰＰI９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドをＸｈｏIおよびＮｏｔIの両方で消化し、小さな消化フラグメントもＰＰIＣ９ＫプラスミドへサブクローニングしてＸｈｏIおよびＮｏｔIの両方で消化し、組換え発現ＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドを構築した。制限酵素消化により同定された産物は７００ｂｐで、予測値と同じであった（図１５参照）。サンガー法による配列決定によれば、組換え発現ＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドにＦＩＩのＤＮＡシーケンスが認められる。
【０１０１】
８． 酵母における五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの発現
【０１０２】
８．１ 酵母の形質転換およびスクリーニング
【０１０３】
方法：大腸菌から組換えプラスミドＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩ５０μｇを分離し、ＳａｃI制限酵素サイトで直線化した。続いてフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。その後、ＴＥバッファーでＤＮＡを溶解し、−３０℃で保存した。直線化プラスミドをサケ精子ＤＮＡと混合して、３％ポリグリコール酸で調製したコンピテント酵母へ添加した。これを２枚のＲＤプレート培地へひろげ、よく分布させた。プレートは、３０℃で上下を入れ替えて増殖させた。９６時間後、ＲＤプレート培地の酵母菌株を洗い流し、０．５、１、２、３、４ｍｇ／ｍｌなど、さまざまな濃度のＧ４１８（ジェネティシン）を含有するＹＰＤプレート培地で平板培養した。ＹＰＤプレート培地において、３０℃で増殖させた。４日目、低濃度のＧ４１８によりプレートに組換えコロニーが初めて現れた。６日目、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレートからコロニーを選択し、ＰＣＲ分析用のＤＮＡを分離した。
【０１０４】
結果：プラスミドＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩをＳａｃIサイトで分離し、直線化した。直線化プラスミドを精製し、ＰＥＧ法によりコンピテント酵母へ形質転換した。４日目、低濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＧ４１８によりＹＰＤプレート培地に最初のコロニーが現れ、６日目に、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレートから６コロニーを選択した。
【０１０５】
８．２ 発現量の多い菌株のスクリーニングおよび組換えＦＩＩの発現量の増大
【０１０６】
方法：挿入遺伝子を含むことがＰＣＲで確認された組換え菌株６株をＭＤ培地１０ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃で一晩、振盪しながら増殖させた。次に遠心により採取し、ＢＭＭＹ培地に添加して発現を誘導した。最終濃度が１％になるように、１００％メタノールを２４時間ごとに添加し、引き続き発現を誘導した。培養した誘導物質のサンプリングも毎日実施し、３７℃でフィブリノゲンと反応させてからＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、フィブリン（フィブリノゲン）溶解活性を分析した。３日目にサンプルチューブ３本を急速に凍結させた。
【０１０７】
凍結した菌株のチューブを１本選択してＭＤ培地１００ｍｌに添加し、３０℃で一晩、振盪しながら培養した。５Ｌフラスコ２本に、それぞれ培養液２Ｌまで増幅した。２４時間後、培養液を１００Ｌ容量のジャーファーメンターのＢＭＭＹ培地へ移し、３０℃で引き続き増殖させた。さらに、１％メタノールを２４時間ごとに補充した。９６時間の発酵後、培養液を遠心して上清を保存し、限外濾過により２Ｌまで濃縮した。
【０１０８】
結果：ＦＩＩ遺伝子を含むことが確認された組換え菌株６株を培養した。毎日サンプリングを行い、上清を用いて３７℃で１時間フィブリノゲンと反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。１番、２番、３番の酵母菌株の３日目のサンプルに、フィブリノゲンに対する加水分解活性（図１６）が認められた。天然ＦＩＩを陽性対照として使用した。組換えＦＩＩは、加水分解の種類という面では天然ＦＩＩと同じであり、加水分解後に支配的な分画から、これら３つの酵母菌株は効率よく組換えＦＩＩを発現することが可能であることが示された。メタノール誘導による９６時間の発酵後、培養液の上清に大量の組換えＦＩＩが発現した。
【０１０９】
９． 五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの精製および生化学的キャラクタリゼーションの確認
【０１１０】
９．１ ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたＦＦ陰性イオン交換クロマトグラフィー
【０１１１】
方法：（１）限外濾過。上清液をカラムが２ＬになるまでＭｉｌｌｉｐｏｒｅで限外濾過し、０．０５Ｍ ＮＨ４Ａｃダブルカラムに添加し、さらに限外濾過を続けた。
【０１１２】
（２）ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ。限外濾過した上清を、以前０．０５Ｍ ＮＨ４ａ（ＰＨ８．０）で平衡化したＡＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに添加した。カラムを０．１Ｍ ＮＨ４Ａｃ（ＰＨ６．５）で洗浄して、結合していない物質を除去し、残ったタンパク質を０．２Ｍ ＮＨ４Ａｃ（ＰＨ５．２）で溶出した。
【０１１３】
結果：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで限外濾過した上清から、５分画が生成された（図１７）。線溶活性は、０．２Ｍ ＮＨ４Ａｃ（ＰＨ５．２）の分画に局在していた。
【０１１４】
９．２ 疎水性クロマトグラフィー
【０１１５】
方法：フィブリノゲン溶解活性を示す分画を２Ｍ ＮａＣｌと混和し、以前１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＰＢＳで平衡化した別のＢｕｔｙｌ‐ｔｏｙｏｐｅａｒｌ４ＦＦカラムへ添加した。１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＰＢＳでカラムを洗浄し、結合していない物質を除去し、残ったタンパク質を２ｍＭ ＰＢＣで溶出した。
【０１１６】
結果：Ｂｕｔｙｌ‐ｔｏｙｏｐｅａｒｌで限外濾過した分画の上清から３分画が生成された（図１８）。線溶活性は、第３分画に局在していた。限外濾過、塩からの精製、およびフィブリノゲン溶解活性を示す分画の凍結乾燥により、組換えＦＩＩが生成された。
【０１１７】
９．３ 五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの純度の確認
【０１１８】
方法：組換えＦＩＩの純度は、方法２．１で述べた通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認した。
【０１１９】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、精製された組換えＦＩＩが単一のタンパク質バンドとして現れた（図１９）。
【０１２０】
９．４ 五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの線溶活性を直接測定する。
【０１２１】
方法：ＦＩＩの線溶活性は、加熱したフィブリンプレートを用いて証明した。このフィブリンプレートを８５℃で３０分間インキュベートし、プラスミン活性を不活化した。調製したプレート表面に、異なる濃度の組換えＦＩＩ２０ｍＬ（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ）を適用した。天然ＦＩＩ０．５ｍｇ／ｍｌおよびウロキナーゼ５００Ｕ／ｍｌを陽性対照として、生理食塩水を陰性対照として使用した。各濃度で３回試験を行った。プレートを加湿装置に入れ、３７℃で１２時間インキュベートした。明るい溶解ゾーンの面積により線溶活性を測定した。
【０１２２】
結果：ＦＩＩの線溶活性は、加熱したフィブリンプレートを用いて証明した。ｒＦＩＩは、濃度の増加とともにフィブリンプレートに明るい溶解ゾーンを形成し、線溶活性は天然ＦＩＩよりも高かった（ｒＦＩＩ０．５ｍｇ／ｍｌによる溶解ゾーンは５０ｍｍ２、天然ＦＩＩ０．５ｍｇ／ｍｌによる溶解ゾーンはわずか４０ｍｍ２であった）（表２、図２０）。プラスミンは、フィブリンプレートが８５℃まで加熱されたときに不活化した。これにより、組換えＦＩＩがプラスミノーゲンの活性化に依存せずフィブリンを溶解することが示された。
【０１２３】
９．５ 組換えＦＩＩのヒトのIｇＧおよびアルブミンに対する作用
【０１２４】
方法：ピペットを用いて、ｒ−ＦＩＩ（１０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と混和したヒトIｇＧ（１０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で２４時間、インキュベートした。指示された時間が経過してから、タンパク質の電気泳動液１０μｌを添加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプルを分析した。ヒトIｇＧの代わりにヒトアルブミン以外のサンプルを用いて、同じ実験を繰り返した。
【０１２５】
結果：組換えＦＩＩを用いてIｇＧをインキュベートしたとき、Ｈ鎖が消失し、Ｌ鎖は酵素に対し依然として反応しなかった。組換えＦＩＩを用いてアルブミンをインキュベートしたときは、ペプチド鎖がほぼ完全性を保っていた。これにより、組換えＦＩＩがアルブミンに対し作用しないことが示唆された（図２１）。
【０１２６】
１０．組換えＦＩＩのビーグル犬の肺動脈血栓症に対する作用
【０１２７】
方法：ビーグル犬の肺動脈血栓症実験モデルを用いてＮｏｗｋ法を実施した。実験用ビーグル犬の全血１５ｍｌを、３７℃で２時間ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートして血餅を作製し、これを適用した。異なる２群（各群６匹）を設定した。治療群に対しては、ｒＦＩＩ０．２４ｍｇ／ｋｇを投与した。ＮＳ（生理食塩水）対照群に対しては、ＮＳ０．１ｍｌ／ｋｇを注入した。ペントバルビタールナトリウム３０ｍｇ／ｋｇ筋注によりビーグル犬に麻酔し、実験全般にわたって塩酸ケタミンを筋注により補充した。麻酔後、周囲組織から左大腿静脈を分離した。６ｍｍ２Ｆｃｏｂｒａ／Ｈｕｍｔｅｒｈｅａｄカテーテルのシースを左大腿静脈に挿入し、腎下部腹静脈、右心房、右心室、肺動脈を介して、最終的に右下肺動脈へ導入した。右下肺動脈に留置したカテーテルへ、人工血栓を注入した。１０２４×１０２４ピクセルのマトリックスによる高分解能の二方向血管造影装置で、選択的動脈内デジタルサブトラクション血管造影（ＤＳＡ）を施行し、右下肺動脈の血栓塞栓症を記録した。あらかじめ作製した血栓を注入してから２時間後、単一用量の組換えＦＩＩを大腿静脈から注入した。ｒＦＩＩ注入前、注入から15分後、３０分後、６０分後、９０分後、および１２０分後の横方向および前後方向（ＡＰ）の投影像により右下肺動脈血栓の再開率を測定して、動脈血栓に対するｒＦＩＩの作用を評価した。
【０１２８】
結果：組換えＦＩＩ注入から１時間後に行った測定により、組換えＦＩＩが右下肺動脈にあらかじめ作製した血栓を効率的に溶解することが示された（図２２）。右下肺動脈血栓の平均再開通率は、８３．３％であった。注入から１時間後に測定したＮＳ対照群では、変化はほとんど認められなかった。右下肺動脈血栓の平均再開通率は、０．６％であった（表３）。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いた五歩蛇毒のイオン交換クロマトグラフィー
【図２】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いたＦＩＩの１回目のゲル濾過
【図３】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いたＦＩＩの２回目のゲル濾過
【図４】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるＦＩＩの分子量測定
【図５】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを用いたタンパク質マーカーの検量線
【図６】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるフィブリノゲンの加水分解産物の分析
【図７】ＦＩＩの線溶活性
【図８】アガロース‐ホルムアルデヒド電気泳動による五歩蛇毒のｔｏｔａｌ ＲＮＡの分析
【図９】五歩蛇毒のｃＤＮＡライブラリーの構造
【図１０】モノクローナル抗体によりスクリーニングされた五歩蛇毒のｃＤＮＡライブラリーにおけるＦＩＩの陽性結果
【図１１】組み込まれたＤＮＡ分画の陽性クローン９個のシーケンス
【図１２】ＦＩＩのＤＮＡシーケンスから推測されるａｍｏｉｄシーケンス
【図１３】大腸菌に発現しているＦＩＩ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【図１４】大腸菌におけるＦＩＩの標的ＤＮＡベクターの２段階での構築
【図１５】プラスミドＰｐｉｃ９ｋ−ＦＩＩにおける二倍体の制限
【図１６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる上清のＦＩＩの線溶活性
【図１７】ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた上清のイオン交換クロマトグラフィー
【図１８】Ｂｕｔｙｌ‐ｔｏｙｏｐｅａｒｌを用いた上清のクロマトグラフィー
【図１９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる組換えＦＩＩの純度の測定
【図２０】組換えＦＩＩの直接的な線溶作用
【図２１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる組換えＦＩＩのIｇＧおよびアルブミンに対する作用
【図２２】組換えＦＩＩのビーグル犬の肺動脈血栓症モデルに対する作用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の技術分野に関するものであり、特に五歩蛇のフィブリン（フィブリノゲン）溶解遺伝子（２番）、遺伝子ベクター、遺伝子ベクターを用いて遺伝子操作した宿主細胞、および血栓塞栓性疾患を緩和するため遺伝子を用いて作製された薬剤を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
現在、血栓塞栓性疾患、とりわけ心筋梗塞および卒中は、死亡および罹患の主な原因の１つとなっている。感染症の大半を制御するのに成功したことで、中国では生活水準が改善され、一般に寿命は延び、集団構造において高齢者数が増加し、全疾患のなかで心血管性および脳血管性血栓塞栓性疾患の罹患率が１位と２位を占めるようになった。年間３００万人以上が罹患していると推算される。血栓塞栓性疾患の罹患率が今後さらに増加すると予想されるのは当然である。
【０００３】
現在、血栓塞栓性疾患の治療薬は、主に抗血小板薬（例、アスピリン）、抗凝固薬（例、ヘパリン）、および血栓溶解薬（例、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）である。アスピリンおよびヘパリンなどの抗血小板療法および抗凝固療法は、新たなフィブリン形成を予防することにより血栓溶解作用を増強すると考えられている。しかし、これらに既存の血栓に対する作用は認められない。ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ‐ＰＡ）など、臨床使用が可能な血栓溶解薬はプラスミノーゲン活性化因子であり、プラスミノーゲンの活性化により血栓を効果的に溶解する。すなわち、特に大きな血栓に作用する場合、血栓溶解薬の一般的特徴として、血栓溶解作用が間接的かつ緩徐で、弱いことが挙げられる。心血管性および脳血管性血栓症が発症した場合、血流が遮断されてから数分で低酸素により心筋および神経細胞は死滅する。これは血栓溶解薬の血栓溶解作用が間接的だからである。上の３剤は、血栓および出血に関して選択性が低いなど、副作用が認められることがある。スタフィロキナーゼはアナフィラキシーを誘発することがあり、組織プラスミノーゲン活性化因子も高価であるため、広範な応用範囲が制限されている。
【０００４】
特に注目すべきは、血栓溶解薬を他剤と併用投与しても、患者の２５％にとって効果がないことである。さらに、当初血栓溶解薬の投与により治癒した症例の約５〜３０％に再閉塞が生じ、血栓溶解薬に対する感受性が認められない。
【０００５】
結論として、血栓溶解薬は臨床応用の要件を完全には満たしていない。より特異的かつ効果的な血栓溶解薬の開発が急がれる。
【０００６】
蛇毒に関する海外の研究によれば、アメリカマムシおよびセイブヒシモンガラガラヘビ（ニシダイヤガラガラヘビ）の毒は、直接作用する線溶酵素を含有しており、プラスミノーゲンを活性化することはない。これらの研究では、ラットの静脈血栓塞栓症モデルにおいて血栓溶解活性が示された。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで血栓溶解活性を確認したときには、心臓、肝臓、肺、および腎臓の組織切片に関する顕微鏡検査で出血および腐敗が認められなかった。
【０００７】
ａｎｃｏｒｄおよびａｈｙｌｙｓａｎｔｉｎｆａｒｃｔａｓｅなど、中国の診療所で使用される特定の蛇毒から分離したトロンビン様の酵素は、フィブリノゲンをフィブリン類に変換し、血漿粘度を下げ、トロンビンとほぼ同じ機序で抗血栓作用を発揮する。これらの酵素と血栓溶解薬の有効性および機序を比較することはできない。
【０００８】
中国固有の五歩蛇の毒は、プラスミノーゲンを活性化せずにフィブリン／フィブリノゲンを直接分解する成分を含有し、強力な生物活性を持つ。カラムクロマトグラフィーを用いて、１５分画から数種類の線溶タンパク質を採取すると、このなかの分画IIに価値の高い生物学的特徴が認められた。（１）直接血栓を溶解する作用：加熱したプレートを用いることで線溶因子がフィブリンを分解し、プラスミノーゲンを不活化する、（２）迅速な作用：ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、線溶因子の作用はウロキナーゼより２倍速い、（３）有効性が高い：線溶因子の生物活性は、ウロキナーゼよりも高い（線溶因子１３０μｇはウロキナーゼ４５０μｇに相当する）、（４）副作用が少ない：未精製の五歩蛇毒には明らかに出血の副作用が認められるが、用量５００μｇ／ｍｌの線溶因子では出血は認められない。これらの特徴は、五歩蛇毒から得られた線溶因子が、血栓塞栓性疾患を治療する上で魅力的な製剤となり得ることを強力に裏付けている。
【０００９】
しかし、天然由来であることから、五歩蛇毒の組成および生物活性には、地域的および季節的多様性があり、安定した臨床効果を得るのは実際には困難である。さらに、未加工の蛇の成分は複雑であるため、精製しても単一成分を分離することは依然難しく、臨床応用時に毒性および副作用を引き起こす可能性もある。天然蛇毒には、生産量が限定される、コストが高い、市場占有率が低い、という特徴がある。その分子構造や構造と活性との関係は、依然としてタンパク質工学では説明できない。上記の問題を解決することで、五歩蛇毒由来の線溶因子を臨床適応するための科学的根拠を確立することは不可能である。
【００１０】
酵母は増殖が速く、特別な培地がなくとも大量に発酵する。酵母のＤＮＡは比較的単純で、クローニング法を用いたスクリーニングが簡便である。酵母とは真菌であるため、遺伝子発現および遺伝子調節の機序、そして発現産物の修飾処理法は、大腸菌よりも完成されている。例えば、酵母はグリコシル化や、正しいジスルフィド結合を形成すること等が可能である。蛇毒のタンパク質を酵母で発現させるのに成功した前例もある。五歩蛇由来のＦII抗体をプローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＦIIの遺伝子をスクリーニングし、酵母発現ベクターＰＰIＣ９Ｋへクローニングした。次に酵母細胞へと形質転換し、酵母細胞に五歩蛇のＦＩＩを大量に発現させた。ついには、クロマトグラフィーを用いて五歩蛇の組換えＦＩＩを精製し、線溶活性を確認した。われわれの研究では、遺伝子操作により五歩蛇由来の組換えＦＩＩが豊富に得られ、続く薬力学試験およびクラス１の新薬の評価の基礎となっている。
【００１１】
蛇毒研究は、蛇毒からＤＮＡエンドヌクレアーゼを単離して分子生物学的研究を大いに推進させる、サンゴヘビの毒素発見が神経伝達物質受容体の精製において重要な役割を果たすなど、バイオ医薬品開発で主要な役割を果たしてきた。蛇毒由来のあらゆる化学的、あるいは生物学的臨床製剤を比較すると、五歩蛇毒由来組換えＦＩＩが組成面および生物活性面で地域的多様性および化学的不均質性を克服し、生産量および有効性を高め、市場価値の大きい、独自の知的財産権を有する新規の臨床薬となると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
五歩蛇由来の線溶酵素ＦＩＩはフィブリンを直接分解することが可能であり、線溶活性の有効量で出血は認められなかった。しかし、未加工の蛇毒は複雑であるため、精製しても単一成分を分離することは難しい。蛇毒の産生量は限られているため、大量生産は困難である。これら上記の問題は、遺伝子工学技術を用いて五歩蛇由来の組換え線溶酵素ＦＩＩを発現させることで解決できる。われわれは、五歩蛇由来の組換え線溶酵素であるＦＩＩを単離し、ＦＩＩ遺伝子のスクリーニングおよびクローニングを行って、酵母細胞中に組換え線溶酵素を発現させて精製し、その線溶活性について試験を行った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
方法：イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により、五歩蛇毒から天然線溶酵素ＦＩＩを単離した。基質として用いたフィブリンおよびフィブリノゲンにより線溶活性を確認した。フィブリノゲンに対する作用部位は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより観察した。五歩蛇毒のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびｃＤＮＡライブラリーを作製した。プローブとして五歩蛇由来ＦＩＩの抗体を用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＦＩＩの遺伝子をスクリーニングした。これを消化および結合により酵母発現ベクターＰＰIＣ９Ｋへクローニングし、形質転換およびスクリーニングにより大量の酵母菌を発現させた。イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーにより、組換えＦＩＩを精製した。組換えＦＩＩの純度についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥで試験を行い、フィブリン平板法により線溶活性を測定し、IｇＧおよびアルブミンに対する作用について観察した。ｉｎ ｖｉｖｏの線溶活性については、ビーグル犬の肺動脈血栓症モデルを用いて測定した。
【００１４】
結果：３段階の手順を踏んで、単一のバンドとしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上に線溶酵素ＦＩＩを単離した。分子量は２５，５００であった。ＦＩＩは、フィブリノゲンおよびフィブリンの主にＡα鎖およびＢβ鎖を切断し、γ鎖にはほとんど影響を及ぼさなかった。ＦＩＩは、用量依存的にフィブリンを分解した。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、ｃＤＮＡライブラリーからＦＩＩ遺伝子をスクリーニングして、組換えプラスミドＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩを作製した。形質転換後、ＰＣＲで確認した酵母の染色体へ組換えプラスミドを組み込んだ。線溶活性を基準として用いて発現量の多い菌株をスクリーニングしたところ、発現から３日目に線溶活性がピークに達した。２段階の手順を踏んで、単一のバンドとしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上に組換え線溶酵素ＦＩＩを単離した。組換えＦＩＩはフィブリンを強力に分解できるが、IｇＧおよびアルブミンに対しては作用しない。組換えＦＩＩは、右下肺動脈にあらかじめ作製した血栓を効率的に溶解することが可能である。注入から１時間後に測定を行ったところ、右下肺動脈血栓の平均再開通率は、８３．３％であった。結論：組換え線溶酵素ＦＩＩは酵母で大量に発現し、線溶活性が高かった。
【発明の効果】
【００１５】
五歩蛇毒由来の天然ＦＩＩは収量が低く、品質が不安定である。われわれが遺伝子工学技術を用いて酵母に組換えＦＩＩを発現させたところ、天然ＦＩＩよりも線溶活性および収量が高く、品質が安定し、費用を抑えられた。組換えＦＩＩは、動物の血栓溶解モデルにおいて血栓を効率的に溶解し、出血はほとんど認められなかった。組換えＦＩＩが、社会および経済に多大な利益をもたらす有効性の高い、新規の血栓溶解薬となることが強く示唆される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
１． 五歩蛇毒由来ＦＩＩの精製
【００１７】
１．１ ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いたイオン交換クロマトグラフィー
【００１８】
五歩蛇毒（３ｇ）を０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）１０ｍｌで溶解し、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）を用いて２５℃、２４時間で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０カラム（直径３．０ｍ、高さ８０ｃｍ）に上清を移した。開始バッファーとして０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）、溶出バッファーとして１Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ５．０）からなる直線濃度勾配で分画を溶出した。流速１２ｍｌ／時間で３ｍｌ量の分画を回収した。溶出液の吸光度（２８０ｎｍにて）を試験した。ピークを示した分画の線溶活性について試験を行った。次に線溶分画を透析し、凍結乾燥した。
【００１９】
修正したフィブリン平板法（Ａｓｔｒｕｐ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒｔｚ、１９５２）を用いて線溶活性を証明した。各濃度について、３回試験を行った。ペトリ皿（直径９．５ｃｍ）に入れたウシ血漿（０．２％、２０ｍｌ）をトロンビン（８０μｌ、100Ｕ／ｍｌ）で凝血した。線溶活性は、各分画２０μｌより生じた溶解面積、すなわち径の積（ｍｍ２）として表した。各分画をペトリ皿に置き、３７℃で１２時間インキュベートした。
【００２０】
結果：ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いた未加工の毒のイオン交換クロマトグラフィーにより１０分画が生成された（図１）。第２分画（ＦＩＩ）において、線溶活性が高かった。線溶活性は６０．２３±１６．４７ｍｍ２／μｇであった。
【００２１】
１．２ １回目のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５ゲル濾過
【００２２】
ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いたイオン交換クロマトグラフィーで得られたＦＩＩ（８５ｍｇ）を０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）２ｍｌで溶解し、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）を用いて２５℃、２４時間で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５カラム（直径１．１ｃｍ、高さ１００ｃｍ）に上清を移した。０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ＰＨ８．０）で分画を溶出した。流速１２ｍｌ／時間で３ｍｌ量の分画を回収した。溶出液の吸光度（２８０ｎｍにて）ならびにピークを示した分画の線溶活性について試験を行った。次に線溶分画を透析し、凍結乾燥した。
【００２３】
結果：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５カラムにおいて、ゲル濾過によりさらに分取すると、ＦＩＩが２分画得られた（図２）。線溶活性は、第１分画に局在していた。線溶活性は８７．５１±１４．９５ｍｍ２／μｇであった。
【００２４】
１．３ ２回目のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５ゲル濾過
【００２５】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いた１回目のゲル濾過で得られた線溶分画を、上記の方法で再度Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５ゲル濾過カラムに適用した。
【００２６】
結果：単一のピークが得られた（図３）。線溶活性は９０．４９±１２．４１ｍｍ２／μｇであった。
【００２７】
２． 純度および生化学的キャラクタリゼーション
【００２８】
２．１ 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩの純度の確認
【００２９】
Ｌａｅｍｍｌｉ法に従って、ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を実施した（電気泳動バッファーの組成は、１２％分解ゲル［ｐＨ８．８］、４％濃縮ゲル［ｐＨ６．８］、Ｔｒｉｓ‐ｇｌｙｃｉｎｅゲル。電圧２００Ｖ、時間４５分）。分子量の標準は、ＭＢＰ-β-ガラクトシダーゼ１７５，０００、ＭＢＰ‐パラミオシン８３，０００、グルタミン酸脱水素酵素６２，０００、アルドラーゼ４７，５００、トリオースリン酸イソメラーゼ３２，５００、β‐ラクトグロブリンＡ２５，０００、リゾチーム１６，５００であった。タンパク質バンドは、０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
【００３０】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、精製されたＦＩＩが単一のタンパク質バンドとして確認された（図４）。回帰曲線（Ｘ軸はｌｇＭＷ、Ｙ軸は標準移動度に対する相対移動度［Ｒｆ（ｘ）］）に基づき、方程式ｌｇＭＷ＝−１．５５×＋５．５１、ｒ＝０．９５が得られた。算出された分子量は２５，５５０である（図５）。
【００３１】
２．２ 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩのフィブリノゲン溶解活性の確認
【００３２】
ウシフィブリノゲン（７５μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）をピペットで１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移した。ＦＩＩ（２５μｌ、２ｍｇ／ｍｌ）をチューブに添加し、溶液を３７℃で１時間インキュベートした。次に１２５Ｍｍ ＥＤＴＡ１０μｌを添加してチューブ内の反応を中止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー５０μｌを添加した。サンプル２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけて、ＦＩＩによるフィブリノゲン分解がプラスミンによる分解と異なっているかどうかを確認した。ＦＩＩの代わりにプラスミン以外のサンプルを用いて同じ実験を繰り返し行った。
【００３３】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、ＦＩＩはα‐およびβ‐フィブリノゲン分解酵素であり、α鎖およびβ鎖を分解する。γ鎖にはほとんど影響を及ぼさなかった。ＦＩＩによる分解画分の分子量は４５，０００Ｄａであった。フィブリノゲンのα鎖、β鎖、およびγ鎖は、プラスミンにより分解された。プラスミンによる分解画分の分子量は、それぞれ４７，０００Ｄａ、４４，０００Ｄａ、および２３，０００Ｄａであった。ＦＩＩおよびプラスミンによる分解後のバンドは異なっており、これらの切断サイトが異なっていることを示している（図６）。
【００３４】
２．３ 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩの線溶活性の確認
【００３５】
修正したフィブリン平板法を用いて線溶活性を証明した（ＡｓｔｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒｔｚ、１９５２年）。ペトリ皿（直径９．５ｃｍ）に入れたウシフィブリノゲン（０．２％、２０ｍｌ）をトロンビン（８０μｌ、１００Ｕ／ｍｌ）で凝血した。各濃度について、３回試験を行った。線溶活性は、各分画２０μｌより生じた溶解面積、すなわち径の積（ｍｍ２）として表した。各分画をペトリ皿に置き、３７℃で１２時間インキュベートした。陽性対照としてウロキナーゼ５００Ｕ／ｍｌを、陰性対照として生理食塩水を使用した。
【００３６】
結果：２０μｌのＦＩＩを、０．２５、０．５、１、および２ｍｇ／ｍｌの異なる濃度で適用した（表１）。濃度の増加とともに溶解面積も増加することが示された（図７）。
【００３７】
３． 五歩蛇毒由来線溶酵素ＦＩＩ抗体の作製
【００３８】
３．１ ウサギの抗血清ＦＩＩの作製
【００３９】
方法：（１）動物の免疫。ウサギは、ＦＩＩ（３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌおよびフロイントアジュバント１ｍｌを混合した乳化剤を背部にマルチポイント皮下注入することにより免疫化した。１回目注入後、追加抗原を週に数回、計４週間投与した。
【００４０】
（２）抗血清の作製。免疫化されたウサギに対し、塩酸ケタミン３０ｍｇ／ｋｇ筋注により麻酔した。頚動脈に挿入したカテーテルから採血し、４℃で一晩保存した。続いてこの血清を遠心分離し、一部を４℃で保存した。
【００４１】
（３）酵素結合免疫測定法（ＥＬIＳＡ）による抗体価の測定。マイクロプレート（９６穴）は、炭酸水素ナトリウムバッファーに入れたＦＩＩ１００ｍｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、穴当たり１００μｌに４℃で一晩浸した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０含有ＰＢＳＴで２回洗浄し、２×ＰＢＳおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ブロック液を用いて非結合部位を３７℃で１時間ブロックした。血清力価を測定するため、１％ＢＳＡおよびウサギ抗血清（１次抗体）含有１×ＰＢＳに段階希釈した血清１００ｍｌを入れてプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。再度プレートを３回洗浄し、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（分子全体）‐ペルオキシダーゼ複合体１００ｍｌで１時間インキュベート後、さらに３回洗浄した。ペルオキシダーゼアッセイＡおよびＢ用基質溶液をすべての穴に添加し、反応システムの色に基づいて抗体価を確認した。
【００４２】
結果：抗原として使用した五歩蛇毒由来の精製された線溶酵素ＦＩＩによりＮＯ．１およびＮＯ．２のウサギを免疫化した。４週後、ＥＬIＳＡにより抗体価を測定した。各ウサギの抗体価は１：２００００であった。
【００４３】
３．２ ＦＩＩモノクローナル抗体の作製
【００４４】
方法：（１）免疫、ハイブリドーマ融合クローニングを用いたスクリーニング。Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週齢）に対し、ＦＩＩ０．２ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）および同量のフロイント完全アジュバントの混合液を皮下注射した。フロイント完全アジュバントに入れた同量の抗原による追加抗原を、２週間隔で、計３サイクル投与した。尾静脈からＦＩＩ０．２ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を注入し、３日後、ハイブリドーマ融合を実施した。すなわち、免疫化したマウスから脾細胞を採取し、１０：１の割合でＳＰ２／１０細胞と混合し、５０％ＰＥＧ（ｕ３７００）を用いて融合を実施した。融合した細胞を５９６穴のプレートで培養し、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。１５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択培地を４日間、次にＨＴ培地を６日間継続的に適用し、１１日目以降はＲＰＭI‐１６４０培地を使用した。前述のように、培地で生成された抗体を、間接酵素結合免疫測定法（間接ＥＬIＳＡ）により測定した。
【００４５】
（２）結果：ハイブリドーマ融合２サイクル後、細胞株２０株が確立された。このうち特異度の高い細胞株２株について、それぞれＣ１およびＣ４と名付けた。この２株から生成されたモノクローナル抗体はいずれもIｇＧIで、IｇＧ分類キットを用いて試験し、製造会社の指示に従って使用した。
【００４６】
４． 五歩蛇の毒腺由来の発現ｃＤＮＡライブラリーの構築
【００４７】
４．１ ＲＮＡの作製
【００４８】
方法：（１）蛇の頭から対の毒腺を摘出し、切除して、直ちにドライアイスのなかに保存した。
【００４９】
（２）ＲＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、製造会社のプロトコールに従った。毒腺（計約１．７ｇ）を混合した。トリゾール、クロロホルム、およびイソプロピルアルコールを使用して各腺を均質化し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水相のＲＮＡを分離して、イソプロピルアルコールによりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡのペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、短時間風乾した。最後に、ＲＮＡをジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水で溶解した。１％アガロースゲルに入れたリボソームＲＮＡの２８Ｓ，１８Ｓ，および５Ｓのバンドを識別することにより、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの完全性を確認した。Ａ２６０とＡ２８０の比でｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度を確認した。
【００５０】
結果：ｔｏｔａｌ ＲＮＡは長いスメアとして検出され、２８Ｓ、１８Ｓ，および５Ｓに明るいバンドが認められた。ｔｏｔａｌ ＲＮＡのＣＤ／２６０とＣＤ２８０の比は２０で、総量は４２６μｇであった。したがって、ＲＮＡは劣化しておらず、高品質であるとの結論を導くことができた。ＲＮＡ電気泳動（図８）によれば、２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡは明るく示された。２８Ｓの蛍光強度は１８ＳｒＲＮＡの２倍であり、ライブラリーが高品質であることの根拠を示した。
【００５１】
４．２ ｍＲＮＡの精製
【００５２】
方法：引き続き、製造会社のプロトコールに従って、オリゴ（ｄＴ）‐セルロースアフィニティクロマトグラフィーを用いてｍＲＮＡを精製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＰｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを濃縮し、サンプルバッファー溶液でセルロースカラムを十分に洗浄し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（３ｍｇ）をＤＥＰＣ処理水に入れて６５℃で１０分間インキュベートした。すぐに氷冷したバスを用いて、温度を室温まで下げた。サンプルバッファー溶液３回のあと、溶離液で溶出し、ｍＲＮＡを洗浄して分離した。
【００５３】
１％アガロース‐エチジウムブロマイド電気泳動を用いてＲＮＡの無損傷性を評価した。ｍＲＮＡの完全性は１％アガロース電気泳動で確認した。
【００５４】
結果：ｍＲＮＡの総量は１０μｇであった。
【００５５】
４．３ ｃＤＮＡライブラリーの構築
【００５６】
方法：ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、製造会社のプロトコールに従った。図９参照。
【００５７】
（１）第1ストランドｃＤＮＡ合成
【００５８】
（２）第2ストランドｃＤＮＡ合成
【００５９】
（３）ｃＤＮＡ末端にＮｏｔIおよびＳａｌIアダプターを付加する。
【００６０】
（４）ｃＤＮＡの連結と形質転換。ｃＤＮＡおよびｐＳｐｏｒｔIベクターを連結した。ｃＤＮＡ反応液、ｐＳｐｏｒｔIベクター、Ｔ４リガーゼ１０×バッファーの混合液を１６℃で一晩インキュベートした。連結産物１０μｌを大腸菌コンピテントセルＤＨ５ ５０μｌに添加し、４℃で３０分間、４２℃で１２０秒間、４℃で５分間、３７℃で１０分間の順で培養した。次に懸濁した細胞を新しい１．５ｍＬ ＥＰチューブに入れ、３７℃で1時間、２５０ｒｐｍで振盪した。形質転換体２μＬを、１０倍、１００倍、および１０００倍に希釈して、アンピシリン、イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトシド、および５‐ｂｒｏｍ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｙｌ‐ｂｅｔａ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ１００ｍｇ／Ｌ−１を含有するＬｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉプレートにまき、３７℃で一晩インキュベートした。ｃＤＮＡライブラリーの力価を計算し、−８０℃で保存した。
【００６１】
結果：増幅していない５ライブラリーの総力価は、５×１０７ｐｆｕ／ｍｌである。
【００６２】
５． 発現ｃＤＮＡライブラリーからのＦＩＩ遺伝子のクローン
【００６３】
５．１ 抗体による発現ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング
【００６４】
方法：適切に希釈してから、ｃＤＮＡライブラリーに入れた細菌１００μｌを、１％グルコース、８％グリセロール、およびアンピシリン５０μｇ／ｍｌを付加したＬＢ培地を含有するプレートにまき、３７℃で一晩増殖させた。
【００６５】
酢酸セルロース膜をIＰＴＧ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）に浸漬してＬＢプレートにひろげ、酢酸セルロース膜上の非対称な３箇所をスポットして配向させた。確認された酢酸セルロース膜をアガロースプレートに広げ、融合タンパク質の発現を誘導するため、３７℃で６〜８時間インキュベートした。
【００６６】
誘導から６〜８時間後、酢酸セルロース膜をクロロホルムで３０分間処理し、１％ＢＳＡ、リゾチーム４ｇ／ｍｌ、およびＤＮＡａｓｅ１μｇ／ｍｌに入れて３０分間軽く攪拌し、４℃で一晩ブロックした。ブロック後、各フィルターに対し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００（ＴＢＳ−ＴＴ）約１００ｍｌで、１回１５分間の洗浄を３回行った。続いてＴＢＳ１００ｍｌ／フィルターで２回洗浄し、残留洗浄剤を除去した。組換えタンパク質を産生するコロニーを検出するため、ブロッキング・バッファーで１０００倍に希釈したウサギ抗体で膜を探索し、室温で３時間軽く攪拌した。ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（分子全体）‐ペルオキシダーゼ複合体１００ｍｌで膜を再度３回洗浄し、１時間インキュベートした。その後、さらに３回洗浄した。
【００６７】
ＤＡＢ発色基質溶液に膜を浸漬し、３０分間軽く攪拌して、蒸留水ですすいだ。茶色の陽性コロニーが検出された。
【００６８】
結果：プレート（直径９ｃｍ、５×１０３クローンを含む）を用いて１次スクリーニングを実施した。２００，０００個のクローンをスクリーニングし、１５個の陽性クローンを検出した。これらの陽性クローンに対し繰り返しスクリーニングを行ったところ、１１個のクローンに陽性反応が認められた（図１０）。この１１個の陽性クローンを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ-１を含有するＬｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉプレートで平板培養し、モノクローナル抗体で確認したところ、９個のクローンに陽性反応（Ｃ１およびＣ４抗体を使用）が認められた。
【００６９】
５．２ プラスミド抽出と陽性クローンの配列決定
【００７０】
方法：プラスミドをアルカリ法（ＧIＡＧＥＮ）により抽出した。（１）新しく画線培養したプレートから単一コロニーを採取し、スターター培養液（適切な選択的抗生物質を含有するＬＢ培地２〜５ｍｌ）に接種する。３７℃で約８時間、激しく振盪（約３００ｒｐｍ）しながら培養する。
【００７１】
（２）スターター培養液を選択的ＬＢ培地３ｍｌに入れて５００倍〜１０００倍に希釈する。３７℃で１２〜１６時間、激しく振盪（約３００ｒｐｍ）しながら増殖させる。
【００７２】
（３）６０００×ｇ、４℃で１５分間遠心して細菌細胞を採集する。
【００７３】
（４）細菌ペレットをバッファーＰ１ ０．３ｍｌで再懸濁する。
【００７４】
（５）バッファーＰ２ ０．３ｍｌを添加し、密閉したチューブを４〜６回激しく転倒混和し、室温（１５〜２５℃）で５分間インキュベートする。
【００７５】
（６）冷却したバッファーＰ３ ０．３ｍｌを添加し、直後に４〜６回激しく転倒混和し、氷上で５分間インキュベートする。
【００７６】
（７）マイクロ遠心チューブに移して、最高速度で１０分間遠心する。すぐにプラスミドＤＮＡを含む上清を除去する。
【００７７】
（８）Ｂｕｆｆｅｒ ＱＢＴ１ｍｌを添加してＧIＡＧＥＮ−ｔｉｐ２０を平衡化し、重力流によりカラムを空にする。
【００７８】
（９）手順７の上清をＧIＡＧＥＮ‐ｔｉｐ２０に添加し、重力流により樹脂に入れる。
【００７９】
（１０）Ｂｕｆｆｅｒ ＱＣ２×２ｍｌでＧIＡＧＥＮ‐ｔｉｐ２０を洗浄する。
【００８０】
（１１）Ｂｕｆｆｅｒ ＱＦ０．８ｍｌでＤＮＡを溶出する。１．５ｍｌまたは２ｍｌのマイクロ遠心チューブに溶出液を回収する。
【００８１】
（１２）室温のイソプロパノールをＤＮＡの０．７倍量（ＤＮＡ溶出量０．８ｍｌ当たり０．５６ｍｌ）添加して、ＤＮＡを沈殿させる。マイクロ遠心チューブで混和し、直ちに１０，０００ｒｐｍ以上で３０分間遠心する。慎重に上清を取り除く。
【００８２】
（１３）７０％エタノール１ｍｌでＤＮＡペレットを洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心する。
【００８３】
（１４）ペレットを５〜１０分間風乾し、適量のバッファーでＤＮＡを再溶解する。
【００８４】
キャピラリー電気泳動による配列決定にプラスミドを使用し、標準的なプライマーＴ７およびＳＰ６を適用した。
【００８５】
結果：陽性プレート９枚から単一コロニーをそれぞれ採取し、スターター培養液（適切な選択的抗生物質を含有するＬＢ培地２〜５ｍｌ）に接種した。３７℃で約８時間、激しく振盪しながらインキュベートし、プラスミドを抽出した。ＰＣＲ反応を実施し、標準的なプライマーＴ７およびＳＰ６を適用した。各クローンに、産物に特異的なバンドが認められた。キャピラリー電気泳動による配列決定にプラスミドを使用し、標準的なプライマーＴ７およびＳＰ６を適用した（図１１）。
【００８６】
５．３ シーケンス・アラインメント
【００８７】
方法：これら陽性クローンのゲノムの起源を同定するため、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐにより、これらのシーケンスとＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースおよびタンパク質データベースとを比較した。この９個のシーケンスのほとんどは、ＳＶＭＰファミリーと相同性がある（報告された遺伝子と相同性を共有し、同一性は最高で８５％）。このうちＦＩＩ‐２およびＦＩＩ‐４は、ＳＶＭＰファミリーと関連のあるＡＤＡＭファミリーに属す、最も保守的なシーケンスを共有していた。したがって、われわれはＦＩＩ‐２の遺伝子をＦＩＩと名付け、このタンパク質を優先的に発現させて、ＦＩＩのアミノ酸シーケンスを推測した（図１２）。
【００８８】
６． 大腸菌における五歩蛇毒由来ＦＩＩ遺伝子の発現
【００８９】
方法：一晩振盪（抽出により確認されたＦＩＩプラスミド含有コロニー）させた大腸菌０．２ｍｌをアンピシリン２０ｍｌ含有ＳＯＢ培地に添加し、３７℃で３時間、Ａ６００（濁度）が約０．５になるまで振盪した。最終濃度１μｍｏｌ／ＬまでIＰＴＧを添加した。４時間振盪し、１，５００ｒｐｍで２０分間遠心して、上清を捨てた。水０．５ｍｌおよびＳＤＳローディングバッファー０．５ｍｌをペレットに添加して１００℃で５分間加熱し、１０，０００ｒｐｍで遠心した。上清２０μｌを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
結果：IＰＴＧによる誘導後のＦＩＩプラスミド含有大腸菌溶解産物では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０ｋＤのバンドが示された。IＰＴＧにより誘導しなかった、あるいはプラスミドを含まない大腸菌溶解産物では、そのようなバンドは認められなかったことから、大腸菌の融合タンパク質としてＦＩＩの遺伝子を発現させることが可能であることが示された。
【００９１】
７． 五歩蛇毒由来ＦＩＩ遺伝子のクローニング
【００９２】
方法：（図１４参照）
【００９３】
７．１ ＦＩＩのＰＣＲ増幅
【００９４】
２段階のＰＣＲにより、標的遺伝子のαシグナルから５’までのシーケンスおよび制限酵素サイトを導入した。
プライマー１：５’ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＡＴ ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ Ｃ ３’
プライマー２：５’ＣＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＡＴ Ｃ ３’
リバースプライマー：
プライマー３：５’ＧＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＴ ＴＣ ３’
手順：（１）ＰＣＲ１回目：プライマー１がフォワードプライマー、プライマー３がリバースプライマー、テンプレートはＦＩＩプラスミドである。
（２）ＰＣＲ２回目：プライマー２がフォワードプライマー、プライマー３がリバースプライマー、テンプレートは、ＰＣＲ１回目の産物である。ＰＣＲの条件は、１回目と同じである。
【００９５】
７．２ 組換えＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドの構築
【００９６】
１％アガロースゲル電気泳動後、ＰＣＲ２回目の産物を抽出した。アガロースゲルから抽出した標的フラグメントおよびＰＰIＣ-９Ｋプラスミドの両方をＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化し、それぞれを電気泳動後、回収した。次に１６℃で１２時間Ｔ４反応系に接合した。次にコンピテント細胞Ｔｏｐ １０Ｆに形質転換し、ＬＢ／ペニシリンプレートで平板培養した。陽性コロニーを採取してプラスミドを抽出し、制限酵素分析により同定した。次に、標的フラグメントを含むプラスミドを精製した。
【００９７】
７．３ 組換え発現ＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドの構築
【００９８】
標的フラグメントの有無に関わらず、ＰＰIＣ９ＫプラスミドをＳａｃIおよびＮｏｔIの両方で消化して接合し、形質転換した。次に、陽性コロニーを採取し、ＰＰIＣ９ＫＦＩＩプラスミドを同定し、精製した。
【００９９】
結果：上の２段階のＰＣＲ後のＰＣＲ産物は約７００ｂｐで、ＦＩＩ遺伝子の大きさと同じであった。電気泳動後に回収されたＰＣＲ産物およびＰＰIＣ９ＫプラスミドをＸｈｏIおよびＮｏｔIの両方で消化し、構築された組換えＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩを制限酵素消化により同定した。
【０１００】
組換えＰＰI９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドをＸｈｏIおよびＮｏｔIの両方で消化し、小さな消化フラグメントもＰＰIＣ９ＫプラスミドへサブクローニングしてＸｈｏIおよびＮｏｔIの両方で消化し、組換え発現ＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドを構築した。制限酵素消化により同定された産物は７００ｂｐで、予測値と同じであった（図１５参照）。サンガー法による配列決定によれば、組換え発現ＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩプラスミドにＦＩＩのＤＮＡシーケンスが認められる。
【０１０１】
８． 酵母における五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの発現
【０１０２】
８．１ 酵母の形質転換およびスクリーニング
【０１０３】
方法：大腸菌から組換えプラスミドＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩ５０μｇを分離し、ＳａｃI制限酵素サイトで直線化した。続いてフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。その後、ＴＥバッファーでＤＮＡを溶解し、−３０℃で保存した。直線化プラスミドをサケ精子ＤＮＡと混合して、３％ポリグリコール酸で調製したコンピテント酵母へ添加した。これを２枚のＲＤプレート培地へひろげ、よく分布させた。プレートは、３０℃で上下を入れ替えて増殖させた。９６時間後、ＲＤプレート培地の酵母菌株を洗い流し、０．５、１、２、３、４ｍｇ／ｍｌなど、さまざまな濃度のＧ４１８（ジェネティシン）を含有するＹＰＤプレート培地で平板培養した。ＹＰＤプレート培地において、３０℃で増殖させた。４日目、低濃度のＧ４１８によりプレートに組換えコロニーが初めて現れた。６日目、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレートからコロニーを選択し、ＰＣＲ分析用のＤＮＡを分離した。
【０１０４】
結果：プラスミドＰＰIＣ９Ｋ‐ＦＩＩをＳａｃIサイトで分離し、直線化した。直線化プラスミドを精製し、ＰＥＧ法によりコンピテント酵母へ形質転換した。４日目、低濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＧ４１８によりＹＰＤプレート培地に最初のコロニーが現れ、６日目に、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレートから６コロニーを選択した。
【０１０５】
８．２ 発現量の多い菌株のスクリーニングおよび組換えＦＩＩの発現量の増大
【０１０６】
方法：挿入遺伝子を含むことがＰＣＲで確認された組換え菌株６株をＭＤ培地１０ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃で一晩、振盪しながら増殖させた。次に遠心により採取し、ＢＭＭＹ培地に添加して発現を誘導した。最終濃度が１％になるように、１００％メタノールを２４時間ごとに添加し、引き続き発現を誘導した。培養した誘導物質のサンプリングも毎日実施し、３７℃でフィブリノゲンと反応させてからＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、フィブリン（フィブリノゲン）溶解活性を分析した。３日目にサンプルチューブ３本を急速に凍結させた。
【０１０７】
凍結した菌株のチューブを１本選択してＭＤ培地１００ｍｌに添加し、３０℃で一晩、振盪しながら培養した。５Ｌフラスコ２本に、それぞれ培養液２Ｌまで増幅した。２４時間後、培養液を１００Ｌ容量のジャーファーメンターのＢＭＭＹ培地へ移し、３０℃で引き続き増殖させた。さらに、１％メタノールを２４時間ごとに補充した。９６時間の発酵後、培養液を遠心して上清を保存し、限外濾過により２Ｌまで濃縮した。
【０１０８】
結果：ＦＩＩ遺伝子を含むことが確認された組換え菌株６株を培養した。毎日サンプリングを行い、上清を用いて３７℃で１時間フィブリノゲンと反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。１番、２番、３番の酵母菌株の３日目のサンプルに、フィブリノゲンに対する加水分解活性（図１６）が認められた。天然ＦＩＩを陽性対照として使用した。組換えＦＩＩは、加水分解の種類という面では天然ＦＩＩと同じであり、加水分解後に支配的な分画から、これら３つの酵母菌株は効率よく組換えＦＩＩを発現することが可能であることが示された。メタノール誘導による９６時間の発酵後、培養液の上清に大量の組換えＦＩＩが発現した。
【０１０９】
９． 五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの精製および生化学的キャラクタリゼーションの確認
【０１１０】
９．１ ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたＦＦ陰性イオン交換クロマトグラフィー
【０１１１】
方法：（１）限外濾過。上清液をカラムが２ＬになるまでＭｉｌｌｉｐｏｒｅで限外濾過し、０．０５Ｍ ＮＨ４Ａｃダブルカラムに添加し、さらに限外濾過を続けた。
【０１１２】
（２）ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ。限外濾過した上清を、以前０．０５Ｍ ＮＨ４ａ（ＰＨ８．０）で平衡化したＡＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに添加した。カラムを０．１Ｍ ＮＨ４Ａｃ（ＰＨ６．５）で洗浄して、結合していない物質を除去し、残ったタンパク質を０．２Ｍ ＮＨ４Ａｃ（ＰＨ５．２）で溶出した。
【０１１３】
結果：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで限外濾過した上清から、５分画が生成された（図１７）。線溶活性は、０．２Ｍ ＮＨ４Ａｃ（ＰＨ５．２）の分画に局在していた。
【０１１４】
９．２ 疎水性クロマトグラフィー
【０１１５】
方法：フィブリノゲン溶解活性を示す分画を２Ｍ ＮａＣｌと混和し、以前１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＰＢＳで平衡化した別のＢｕｔｙｌ‐ｔｏｙｏｐｅａｒｌ４ＦＦカラムへ添加した。１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＰＢＳでカラムを洗浄し、結合していない物質を除去し、残ったタンパク質を２ｍＭ ＰＢＣで溶出した。
【０１１６】
結果：Ｂｕｔｙｌ‐ｔｏｙｏｐｅａｒｌで限外濾過した分画の上清から３分画が生成された（図１８）。線溶活性は、第３分画に局在していた。限外濾過、塩からの精製、およびフィブリノゲン溶解活性を示す分画の凍結乾燥により、組換えＦＩＩが生成された。
【０１１７】
９．３ 五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの純度の確認
【０１１８】
方法：組換えＦＩＩの純度は、方法２．１で述べた通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認した。
【０１１９】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、精製された組換えＦＩＩが単一のタンパク質バンドとして現れた（図１９）。
【０１２０】
９．４ 五歩蛇毒由来組換え線溶酵素ＦＩＩの線溶活性を直接測定する。
【０１２１】
方法：ＦＩＩの線溶活性は、加熱したフィブリンプレートを用いて証明した。このフィブリンプレートを８５℃で３０分間インキュベートし、プラスミン活性を不活化した。調製したプレート表面に、異なる濃度の組換えＦＩＩ２０ｍＬ（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ）を適用した。天然ＦＩＩ０．５ｍｇ／ｍｌおよびウロキナーゼ５００Ｕ／ｍｌを陽性対照として、生理食塩水を陰性対照として使用した。各濃度で３回試験を行った。プレートを加湿装置に入れ、３７℃で１２時間インキュベートした。明るい溶解ゾーンの面積により線溶活性を測定した。
【０１２２】
結果：ＦＩＩの線溶活性は、加熱したフィブリンプレートを用いて証明した。ｒＦＩＩは、濃度の増加とともにフィブリンプレートに明るい溶解ゾーンを形成し、線溶活性は天然ＦＩＩよりも高かった（ｒＦＩＩ０．５ｍｇ／ｍｌによる溶解ゾーンは５０ｍｍ２、天然ＦＩＩ０．５ｍｇ／ｍｌによる溶解ゾーンはわずか４０ｍｍ２であった）（表２、図２０）。プラスミンは、フィブリンプレートが８５℃まで加熱されたときに不活化した。これにより、組換えＦＩＩがプラスミノーゲンの活性化に依存せずフィブリンを溶解することが示された。
【０１２３】
９．５ 組換えＦＩＩのヒトのIｇＧおよびアルブミンに対する作用
【０１２４】
方法：ピペットを用いて、ｒ−ＦＩＩ（１０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と混和したヒトIｇＧ（１０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で２４時間、インキュベートした。指示された時間が経過してから、タンパク質の電気泳動液１０μｌを添加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプルを分析した。ヒトIｇＧの代わりにヒトアルブミン以外のサンプルを用いて、同じ実験を繰り返した。
【０１２５】
結果：組換えＦＩＩを用いてIｇＧをインキュベートしたとき、Ｈ鎖が消失し、Ｌ鎖は酵素に対し依然として反応しなかった。組換えＦＩＩを用いてアルブミンをインキュベートしたときは、ペプチド鎖がほぼ完全性を保っていた。これにより、組換えＦＩＩがアルブミンに対し作用しないことが示唆された（図２１）。
【０１２６】
１０．組換えＦＩＩのビーグル犬の肺動脈血栓症に対する作用
【０１２７】
方法：ビーグル犬の肺動脈血栓症実験モデルを用いてＮｏｗｋ法を実施した。実験用ビーグル犬の全血１５ｍｌを、３７℃で２時間ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートして血餅を作製し、これを適用した。異なる２群（各群６匹）を設定した。治療群に対しては、ｒＦＩＩ０．２４ｍｇ／ｋｇを投与した。ＮＳ（生理食塩水）対照群に対しては、ＮＳ０．１ｍｌ／ｋｇを注入した。ペントバルビタールナトリウム３０ｍｇ／ｋｇ筋注によりビーグル犬に麻酔し、実験全般にわたって塩酸ケタミンを筋注により補充した。麻酔後、周囲組織から左大腿静脈を分離した。６ｍｍ２Ｆｃｏｂｒａ／Ｈｕｍｔｅｒｈｅａｄカテーテルのシースを左大腿静脈に挿入し、腎下部腹静脈、右心房、右心室、肺動脈を介して、最終的に右下肺動脈へ導入した。右下肺動脈に留置したカテーテルへ、人工血栓を注入した。１０２４×１０２４ピクセルのマトリックスによる高分解能の二方向血管造影装置で、選択的動脈内デジタルサブトラクション血管造影（ＤＳＡ）を施行し、右下肺動脈の血栓塞栓症を記録した。あらかじめ作製した血栓を注入してから２時間後、単一用量の組換えＦＩＩを大腿静脈から注入した。ｒＦＩＩ注入前、注入から15分後、３０分後、６０分後、９０分後、および１２０分後の横方向および前後方向（ＡＰ）の投影像により右下肺動脈血栓の再開率を測定して、動脈血栓に対するｒＦＩＩの作用を評価した。
【０１２８】
結果：組換えＦＩＩ注入から１時間後に行った測定により、組換えＦＩＩが右下肺動脈にあらかじめ作製した血栓を効率的に溶解することが示された（図２２）。右下肺動脈血栓の平均再開通率は、８３．３％であった。注入から１時間後に測定したＮＳ対照群では、変化はほとんど認められなかった。右下肺動脈血栓の平均再開通率は、０．６％であった（表３）。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ‐５０を用いた五歩蛇毒のイオン交換クロマトグラフィー
【図２】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いたＦＩＩの１回目のゲル濾過
【図３】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ‐７５を用いたＦＩＩの２回目のゲル濾過
【図４】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるＦＩＩの分子量測定
【図５】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを用いたタンパク質マーカーの検量線
【図６】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるフィブリノゲンの加水分解産物の分析
【図７】ＦＩＩの線溶活性
【図８】アガロース‐ホルムアルデヒド電気泳動による五歩蛇毒のｔｏｔａｌ ＲＮＡの分析
【図９】五歩蛇毒のｃＤＮＡライブラリーの構造
【図１０】モノクローナル抗体によりスクリーニングされた五歩蛇毒のｃＤＮＡライブラリーにおけるＦＩＩの陽性結果
【図１１】組み込まれたＤＮＡ分画の陽性クローン９個のシーケンス
【図１２】ＦＩＩのＤＮＡシーケンスから推測されるａｍｏｉｄシーケンス
【図１３】大腸菌に発現しているＦＩＩ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【図１４】大腸菌におけるＦＩＩの標的ＤＮＡベクターの２段階での構築
【図１５】プラスミドＰｐｉｃ９ｋ−ＦＩＩにおける二倍体の制限
【図１６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる上清のＦＩＩの線溶活性
【図１７】ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた上清のイオン交換クロマトグラフィー
【図１８】Ｂｕｔｙｌ‐ｔｏｙｏｐｅａｒｌを用いた上清のクロマトグラフィー
【図１９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる組換えＦＩＩの純度の測定
【図２０】組換えＦＩＩの直接的な線溶作用
【図２１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる組換えＦＩＩのIｇＧおよびアルブミンに対する作用
【図２２】組換えＦＩＩのビーグル犬の肺動脈血栓症モデルに対する作用
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のように、１つ以上の部分配列を含む、単離されたポリヌクレオチド（ＮＯ．２遺伝子）：
（Ａ）以下のシーケンスを含むポリヌクレオチド：５’-ａａａａｇａｇａｇｇｃｔｇａａｇｃｔａａｔｃｇｔａｃｔｃｃｔｇａａｃａａｃａａａｔｃｔａｔｇａｃｃｃｃｔａｃａａａｔａｃｇｔｔｇａｇａｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｃａａａｇｃａａｔｇｇｔｃａｃａａａａｔａｃａａｔｇｇｃｇａｔｔｔａｇａｔａａｇａｔａａａａａｃａａｇａａｔｇｔａｃｇａａｇｃｔｇｃｃａａｃａａｔａｔｇａａｔｇａｇａｔｇｔａｃａｇａｔａｔａｔｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｇｔａｇｔａａｔｇｇｔｔｇｇｃｃｔａａｔａａｔｔｔｇｇａｃｃｇａａｇａａｇａｔａａｇａｔｔａｃｃｇｔｇａａｇｃｃａｇａｔｇｔｇｇａｔｔａｔａｃｔｔｔｇａａｃｇｃａｔｔｔｇｃａｇａａｔｇｇａｇａａａａａｃａｔａｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇａｇａａａａａａｃａｔｇａｔａａｔｇｃｔｃａｇｔｔａａｔｃａｃｇｇｇｃａｔｔｇａｃｔｔｃａｇａｇｇａａｇｃａｔｔａｔａｇｇａｔａｃｇｃｔｔａｃａｔｔｇｇｃａｇｃａｔｇｔｇｃｃａｃｃｃｇａａｇｃｇｔｔｃｔｇｔａｇｇａａｔｔａｔｔｃａｇｇａｔｔａｔａｇｃｃｃａａｔａａａｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｃｃｇｔｔａｔａａｔｇｇｃｃｃａｔｇａｇａｔｇｇｇｔｃａｃａａｔｃｔｇｇｇｃａｔｔｃａｃｃａｔｇａｃｇａｃｇｇｔｔａｃｔｇｔｔａｔｔｇｃｇｇｔｇｇｔｔａｃｃｃａｔｇｃａｔｔａｔｇｇｇｔｃｃｃｔｃｇａｔａａｇｃｃｃｔｇａａｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｔｔｃａｇｃａａｔｔｇｔａｇｔｔａｔａｔｃｃａａｔｇｔｔｇｇｇａｃｔｔｔａｔｔａｔｇａａｔｃａｃａａｃｃｃａｇａａｔｇｃａｔｔｇａｃａａｔｇａａｃｃｃｔｔｇｇｇａａｃａｇａｔａｔｔａｔｔｔｃａｃｃｔｃｃａｃｔｔｔｇｔｇｇａａａｔｇａａｃｔｔｔｔｇｇａｇｇｃｇｔｇａ‐３’（７０２ｂｐ）
（Ｂ）（Ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）のフラグメント
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド
【請求項３】
請求項２のＤＮＡを含むＤＮＡベクター
【請求項４】
請求項３のベクター遺伝子により遺伝子操作された宿主細胞
【請求項５】
血栓塞栓性疾患に対しフィブリン（フィブリノゲン）溶解に使用し、請求項１または請求項２のポリヌクレオチドの生物活性を含む薬物併用法
【請求項１】
以下のように、１つ以上の部分配列を含む、単離されたポリヌクレオチド（ＮＯ．２遺伝子）：
（Ａ）以下のシーケンスを含むポリヌクレオチド：５’-ａａａａｇａｇａｇｇｃｔｇａａｇｃｔａａｔｃｇｔａｃｔｃｃｔｇａａｃａａｃａａａｔｃｔａｔｇａｃｃｃｃｔａｃａａａｔａｃｇｔｔｇａｇａｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｃａａａｇｃａａｔｇｇｔｃａｃａａａａｔａｃａａｔｇｇｃｇａｔｔｔａｇａｔａａｇａｔａａａａａｃａａｇａａｔｇｔａｃｇａａｇｃｔｇｃｃａａｃａａｔａｔｇａａｔｇａｇａｔｇｔａｃａｇａｔａｔａｔｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｇｔａｇｔａａｔｇｇｔｔｇｇｃｃｔａａｔａａｔｔｔｇｇａｃｃｇａａｇａａｇａｔａａｇａｔｔａｃｃｇｔｇａａｇｃｃａｇａｔｇｔｇｇａｔｔａｔａｃｔｔｔｇａａｃｇｃａｔｔｔｇｃａｇａａｔｇｇａｇａａａａａｃａｔａｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇａｇａａａａａａｃａｔｇａｔａａｔｇｃｔｃａｇｔｔａａｔｃａｃｇｇｇｃａｔｔｇａｃｔｔｃａｇａｇｇａａｇｃａｔｔａｔａｇｇａｔａｃｇｃｔｔａｃａｔｔｇｇｃａｇｃａｔｇｔｇｃｃａｃｃｃｇａａｇｃｇｔｔｃｔｇｔａｇｇａａｔｔａｔｔｃａｇｇａｔｔａｔａｇｃｃｃａａｔａａａｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｃｃｇｔｔａｔａａｔｇｇｃｃｃａｔｇａｇａｔｇｇｇｔｃａｃａａｔｃｔｇｇｇｃａｔｔｃａｃｃａｔｇａｃｇａｃｇｇｔｔａｃｔｇｔｔａｔｔｇｃｇｇｔｇｇｔｔａｃｃｃａｔｇｃａｔｔａｔｇｇｇｔｃｃｃｔｃｇａｔａａｇｃｃｃｔｇａａｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｔｔｃａｇｃａａｔｔｇｔａｇｔｔａｔａｔｃｃａａｔｇｔｔｇｇｇａｃｔｔｔａｔｔａｔｇａａｔｃａｃａａｃｃｃａｇａａｔｇｃａｔｔｇａｃａａｔｇａａｃｃｃｔｔｇｇｇａａｃａｇａｔａｔｔａｔｔｔｃａｃｃｔｃｃａｃｔｔｔｇｔｇｇａａａｔｇａａｃｔｔｔｔｇｇａｇｇｃｇｔｇａ‐３’（７０２ｂｐ）
（Ｂ）（Ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）のフラグメント
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド
【請求項３】
請求項２のＤＮＡを含むＤＮＡベクター
【請求項４】
請求項３のベクター遺伝子により遺伝子操作された宿主細胞
【請求項５】
血栓塞栓性疾患に対しフィブリン（フィブリノゲン）溶解に使用し、請求項１または請求項２のポリヌクレオチドの生物活性を含む薬物併用法
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２００８−５２２６３３（Ｐ２００８−５２２６３３Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５８１１（Ｐ２００７−５４５８１１）
【出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／００１４５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３４８６
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０７１９７８７８）中山大学 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／００１４５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３４８６
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０７１９７８７８）中山大学 (2)
【Ｆターム（参考）】
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