低栄養症状疾患治療剤
【課題】食欲不振、悪液質又は悪性疾患、感染症及び炎症性疾患による付随的体重減少による衰弱状態などの低栄養症状を示す疾患の治療剤を提供する。
【解決手段】グレリン又はグレリン類似体を有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤。
【解決手段】グレリン又はグレリン類似体を有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な低栄養症状疾患治療剤に関する。さらに詳しくは、グレリン又はグレリン類似体を有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤に関する。また、グレリンのアゴニスト又はアンタゴニストを用いた新規な摂食異常又は代謝異常治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
体重調節は摂食量とエネルギー消費のバランスが鍵を握り、両者のバランスが肥満、やせを引き起こす。１９９４年に発見されたレプチンがadiposity（体脂肪量蓄積）シグナルとして体重調節の根幹に関わることが明らかにされて以来、レプチンの下流に位置する、多くの新しい食欲調節に関与するペプチドが見いだされた。特に、それまで個々独立した機能としてしか捉えられていなかった視床下部由来の神経ペプチド群が、レプチンの下流でそれぞれが機能し、さらにこれらの神経ペプチド群相互間でも密に情報交換が行われていることがわかってきた。
【０００３】
これらの神経ペプチドのうち、食欲を亢進する物質としては、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシン類（orexins）、モチリン（motilin）、メラニン濃縮ホルモン（melanin-concentrating hormone：ＭＣＨ）やアゴウチ関連タンパク質（agouti-related protein：ＡＧＲＰ）が知られている。また、食欲を抑制する物質としては、α−メラノサイト刺激ホルモン（α-melanocyte-stimulating hormone：α−ＭＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（corticotropin-releasing factor：ＣＲＦ）、コカイン−及びアンフェタミン−制御転写物（cocain- and amphetamine- regulated transcript：ＣＡＲＴ）やコレシストキニン（cholesystokinin：ＣＣＫ）などが知られている。これらのペプチドは胃腸の運動を制御する生理学的メカニズムに関与しており、エネルギー恒常性に影響すると考えられている。
【０００４】
特に、ＮＰＹは３６アミノ酸からなる神経伝達物質であり、摂食中枢とされる視床下部に豊富に発現する。ＮＰＹは視床下部弓状核（ＡＲＣ）で産生され、軸索を通じて主に室傍核（ＰＶＮ）へと分泌されて摂食に影響を及ぼす。ＮＰＹを中枢投与すると強力な摂食亢進作用を示す（Schwartz, MW et al., Am. J. Clin. Nutr., 69:584, 1999）が、末梢への投与では摂食に関係しないか、逆に抑制傾向を示した。この現象は他のＰＰファミリーペプチドでも同様に見られる。ＮＰＹが引き起こす種々の生理作用はＮＰＹ受容体を介して行われる。ＮＰＹ受容体は現在、５つのサブタイプ（Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、ｙ６）がクローニングされており、その基本構造は７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体である。リガンドの結合特異性と摂食促進活性の検討からＹ５受容体が、そしてアンタゴニスト投与実験を含めた解析から、Ｙ１受容体が摂食調節と密接に関係する受容体として報告されている（Inui A., Trends Pharmacol Sic 20:43-46, 1999など）。
【０００５】
一方、成長ホルモン（ＧＨ）は、下垂体前葉から分泌されるホルモンであり、その分泌は巧妙に制御されており、視床下部の成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）によって刺激を受け、ソマトスタチンによって抑制される。近年、ＧＨＲＨやソマトスタチンとは別の経路によるＧＨ分泌調節機構が明らかになってきた。この別経路のＧＨ分泌調節機構は、ＧＨの分泌促進活性をもつ合成化合物である成長ホルモン放出促進因子（growth hormone secretagogue：ＧＨＳ）の研究により展開されてきた。ＧＨＳはＧＨＲＨとは異なる経路で作用する。すなわち、ＧＨＲＨはＧＨＲＨ受容体を活性化して、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させるのに対して、ＧＨＳはＧＨＲＨ受容体とは異なる受容体を活性化して、細胞内ＩＰ３系を介して細胞内Ｃａ++イオン濃度を上昇させる。このＧＨＳが作用する受容体であるＧＨＳ−Ｒは、１９９６年に発現クローニング法により構造が解明された（Howard A.D. et al, Science, 273: 974-977, 1996）。ＧＨＳ−Ｒは細胞膜を７回貫通する典型的なＧタンパク質共役型受容体であり、主として視床下部、下垂体に存在する。
【０００６】
さらに、生体内に存在しない合成化合物であるＧＨＳを結合する受容体が存在することから、このＧＨＳ−Ｒに結合して、活性化する内因性のリガンドが探索された。その結果、ＧＨＳ−Ｒに特異的なリガンドとして、グレリン（Ghrelin）がラットの胃から精製、同定された（Kojima M. et al., Nature, 402:656-660, 1999）。
【０００７】
グレリンは、アミノ酸２８残基からなるペプチドで、３番目のセリン残基がｎ−オクタノイル化されている。また、ヒトのグレリンはラットグレリンとアミノ酸２残基が異なる。以下にラット及びヒトのグレリンの構造式を示す。
【０００８】
【化１】
【０００９】
化学合成したグレリンはナノモルオーダーで、ＧＨＳ−Ｒを発現させたＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａ++上昇活性や、初代培養下垂体細胞で成長ホルモンの放出活性をもつ。さらに、in vivoでもラットにおいて血中成長ホルモンを上昇させる。グレリンのｍＲＮＡは胃で顕著に発現しており、またグレリンは血中にも存在する。さらに、ＧＨＳ−Ｒは視床下部、心臓、肺、膵臓、小腸や脂肪組織にも存在している（前記Kojima ら）。また、グレリンには摂食促進作用のあることが報告されている（Wren et al., Endocrinology, 141(11):4325-4328, 2000）。これらの知見から、グレリンは胃で産生され、血中を介して下垂体に運搬された後に脳や末梢でさまざまな作用を及ぼしていると考えられているが、その生理的役割はまだ十分に解明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、グレリンの食欲調節における作用及びそのメカニズムを解明し、またこれを用いた新規な低栄養症状疾患治療剤を開発することにある。さらには、グレリンのアゴニスト又はアンタゴニストを用いた新規な摂食異常又は代謝異常治療剤を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、グレリンがＮＰＹとＹ１受容体を介して顕著な食欲促進作用を示すことを発見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、グレリンを有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、グレリンの存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することを含む、グレリンのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、上記方法により得られるグレリンのアゴニストを有効成分として含有する食欲不振症又は体重減少症治療剤を提供する。
本発明はさらに、上記方法により得られるグレリンのアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ａは、ヒトグレリンとヒトモチリンのアミノ酸配列を示したものである。Ｂは、ヒトグレリン受容体とヒトモチリン受容体のアミノ酸配列を示したものである。同じアミノ酸を星印で示す。
【図２】図２は、グレリンＩＣＶ投与の摂食に及ぼす効果を示す。
【図３】図３は、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシンＡ、オレキシンＢ及びＭＣＨと比較したグレリンのマウスＩＣＶ投与の効果を示す。
【図４】図４は、グレリンのＩＣＶ投与後の視床下部におけるＮＰＹ遺伝子の発現を示す。上のパネルは、グレリンＩＣＶ投与後の視床下部ＮＰＹ ｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。下のグラフは、ノーザンブロットのデータをＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化して対照群のパーセントで表示したものである。
【図５】図５は、ＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニスト（ＢＩＢＯ３３０４）及びＹ５受容体アンタゴニスト（Ｌ１５２８０４）で前処理することが、グレリンで誘導された摂食に及ぼす効果を示す。
【図６】図６は、グレリンＩＣＶ投与の酸素消費量に及ぼす効果を示す。
【図７】図７は、グレリンＩＰ投与の摂食に及ぼす効果を示す。
【図８】図８は、グレリンＩＰ投与の視床下部ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現に及ぼす効果を示す。
【図９】図９は、グレリンＩＰ投与の胃内容排出速度に及ぼす効果を示す。
【図１０】図１０は、迷走神経切断術がグレリンの摂食促進効果に及ぼす効果を示す。
【図１１】図１１は、迷走神経切断術がグレリン投与時の胃迷走神経の求心性神経活性に及ぼす効果を示す。
【図１２】図１２は、４８時間絶食したリーンマウスにおける、グレリンｍＲＮＡの胃での発現をノーザンブロット分析で試験した結果を示す。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１β及びレプチンをＩＰ投与したときの、胃におけるグレリンｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験した結果を示す。
【図１４】図１４は、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスの胃におけるグレリンｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験した結果を示す。
【図１５】図１５は、ｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを繰り返し投与したときの、胃におけるグレリンｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験した結果を示す。
【図１６】図１６は、絶食リーンマウスにグレリンとＩＬ−１βを共投与したときの摂食量と体重に及ぼす効果を示す。
【図１７】図１７は、グレリンを繰り返し投与したときの、ＩＬ−１βで誘導される摂食量と体重の減少に及ぼす効果を示す。
【図１８】図１８は、LC-6移植HHM/cahexiaモデルマウスにおけるグレリンの体重増加に及ぼす効果を示す。
【図１９】図１９は、LC-6移植HHM/cahexiaモデルマウスにおけるグレリンの脂肪増加に及ぼす効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で有効成分として用いるグレリンは、式１で表されるラットグレリン又はヒトグレリン又はグレリン類似体である。
【００１６】
【化２】
【００１７】
グレリン類似体には、食欲促進作用を有する限り、２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているものも包含され、さらに、これらの各種誘導体、例えば、ペプチド構成アミノ酸が置換された誘導体（アミノ酸間に基、例えば、アルキレンが挿入されたものも包含する）及びエステル誘導体も包含される。
【００１８】
グレリン又はグレリン類似体はいかなる方法で製造したものでもよく、例えば、ヒト、ラットの細胞より分離、精製したもの、合成品、半合成品、遺伝子工学的手法により得られたものなどを含み、特に制限はない。
【００１９】
２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているもの例としては、グレリンの１４番目のＧｌｎ残基が欠除した、des-Gln14-グレリンなどが代表的である。ラットdes-Gln14-グレリンはグレリン遺伝子のスプライシングの違いにより生じるものであり、ラット胃においてはグレリンの４分の１程度存在し、成長ホルモン放出活性の強さはグレリンと同じである。
【００２０】
さらに、J.Med.Chem.2000, 43, 4370-4376には、ヒトＧＨＳＲ１ａの活性化に必要なグレリンの最少配列が記載されており、ここに記載された下記のようなものも本発明のグレリン類似体に包含される。例えば、グレリン２８個のアミノ酸のうち、Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸（好ましくは、Ｎ末端４個のアミノ酸）を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているペプチド及びその誘導体であって、食欲促進作用を有するものが挙げられる。
【００２１】
Ｎ末端から３番目のアミノ酸の側鎖の例としてはグレリンの側鎖であるｎ−オクタノイル以外のアシル基及び置換アルキル基（これらの炭素数は６〜１８が好ましい）が挙げられ、具体的な側鎖としては、下記のものが挙げられる：
−ＣＯ−（ＣＨ2）6ＣＨ3、−ＣO（ＣＨ2）9ＣＨ3、−ＣO（ＣＨ2）14ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）2、−ＣＯ−（ＣＨ2）6ＣＨ2Ｂｒ、−ＣＯ−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３、
【００２２】
【化３】
【００２３】
Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているグレリン類似体の具体的な例としては、第３７回ペプチド討論会（２０００年１０月１８日〜２０日）で報告された化合物：
ＮＨ2−（ＣＨ2）4−ＣＯ−Ｓｅｒ（オクチル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2があげられる。
【００２４】
本発明によって明らかになった以下に記載するグレリンの作用メカニズムを考慮すると、これらのグレリン類似体も食欲促進活性を期待することができる。
本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤においては、グレリン又はグレリン類似体を２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤は中枢投与（例えば脳室内投与、脊髄腔注）とすることも、末梢投与とすることも可能である。好ましくは、末梢投与で使用する。上述したように、ＮＰＹや他のＰＰファミリーペプチドは末梢への投与では摂食に関係しないが、本発明の治療剤は末梢投与でも顕著な食欲亢進効果を示した。従って、本発明の治療剤は投与に伴う患者の苦痛が少なく、かつ簡便に服用することができ、従来の食欲調節性ペプチドに比べてはるかに利点が大きい。
【００２６】
グレリン又はグレリン類似体は、公知の製剤技術により、単独であるいは薬理学的に受容しうる担体、添加剤などとともに、通常の経口投与用製剤及び非経口投与用製剤とすることができる。例えば、溶液製剤（動脈注、静脈注又は皮下注などの注射剤、点鼻剤、シロップ剤等）、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、座剤などに製剤化することができる。また、ドラッグデリバリーシステム（除放剤など）で使用することも可能である。
【００２７】
本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路などに応じて異なり、医師の判断によって決定される。通常、静脈内投与のためには、グレリンとして、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。但し、投与量はこれに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の治療剤は、低栄養症状を示す疾患の治療に用いることができ、特に食欲不振、悪液質又は悪性疾患、感染症及び炎症性疾患による付随的体重減少による衰弱状態から選ばれる疾患に有効である。とりわけ、悪液質に伴う食欲不振症又は体重減少症の治療剤として有用である。悪液質は、漸進性の体重減少、貧血、皮膚乾燥又は浮腫、食欲不振などを主症状とする全身状態の不良をいい、感染症、寄生虫症、悪性腫瘍など非常に多くの疾患の末期症状としてみられる。本明細書では、食欲亢進、摂食増加、摂食促進などの用語は同じ意味をもつ言葉として互換的に使用する。
【００２９】
本発明はさらに、グレリンの存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することを含む、グレリン又はグレリン類似体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。具体的な測定方法は例えば本明細書に記載の方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００３０】
上記スクリーニング方法で得られたグレリン又はグレリン類似体のアゴニストを本発明の食欲不振症又は体重減少症治療剤の有効成分として用いることができる。
また、上記スクリーニング方法で得られたグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストを本発明の肥満予防剤又は治療剤の有効成分として用いることができる。以下の実施例に示すように、ＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニストで前処理することによって、グレリンで誘導される摂食促進を有意に阻害した。従って、グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニスト投与により、肥満を治療するだけでなく、予防することも可能となる。
【００３１】
本発明では、グレリン又はグレリン類似体のアゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体又はそれらのアゴニストを用いることができ、またグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体のアンタゴニストを用いることができる。
【００３２】
モチリンは十二指腸、空腸上部の内分泌細胞から分泌される２２アミノ酸残基のペプチドであり（Itoh, Z., Peptides, 18:593-608, 1997）、消化管の空腹期（interdigestive）運動、胆嚢収縮及び胃や膵臓からの酵素分泌に関与する。モチリンはＧＨ分泌を促進することが報告されており、非ペプチド性のモチリンアゴニストを用いて胃の運動を促進することが報告されている（前出、Itoh）。図１のＡに示すように、ヒトグレリンとヒトモチリンは互いに３６％のアミノ酸同一性を示す（アクセス番号Ａ５９３１６及びＰ１２８７２）。さらに、図１のＢに示すように、ヒトグレリン受容体はヒトモチリン受容体と全体として５０％のアミノ酸同一性を示す（アクセス番号Ｑ９２８４７、Ｑ９２８４８及びＱ４３１９３）。また、最近になって、Tomasettoたちもマウス胃から新規なペプチドを単離したが、これはグレリンと同一であり、モチリン関連ペプチドと命名した（Tomasetto C. et al., Gastroenterology, 119:395-405, 2000）。グレリンとモチリンとの配列相同性及びグレリン受容体とモチリン受容体との配列相同性に鑑み、グレリン又はグレリン類似体のアゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体又はそれらのアゴニストを用いることができ、またグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体のアンタゴニストを用いることができる。
【００３３】
摂食とエネルギーバランスを制御するメカニズムは複雑であり、まだ十分には解明されていない。現在までに、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシン類、ＭＣＨ、ビーコン（beacon）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、ニューロメジンＵ、コカイン−及びアンフェタミン−制御転写物（ＣＡＲＴ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）やレプチンを含む多くのペプチドがエネルギー恒常性に影響することが示されてきた。上述したように、３６アミノ酸からなるペプチドであるＮＰＹが摂食刺激系及び体重制御における鍵となる成分の一つである。これまでの研究では、中枢投与したＮＰＹはげっ歯類で摂食を刺激し、代謝率を下げる（Bray G.A. et al., Recent Prog Horm Res, 53:95-118, 1998）。ＮＰＹ類似体及び特定のアンタゴニストを用いた受容体の薬理学的性状決定によると、Ｙ１受容体及びＹ５受容体のいずれもがＮＰＹ摂食受容体であると考えられている。
【００３４】
本発明において、ＩＣＶ投与したグレリンはＮＰＹと同様に摂食を顕著に刺激し、酸素消費量を減少し、これらはいずれもＹ１受容体アンタゴニストでブロックされた。少量のグレリンが脳に存在することが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅と、免疫組織学的分析で示唆されている。従来の報告では、ＧＨＳ−Ｒは弓状核（arcuate nucleus：ＡＲＣ）に局在しており、弓状核でＮＰＹが合成される（Tannenbaus GS et al., Endocrinology, 139:4420-4423, 1998）。インサイチュハイブリダーゼーション試験で、ＧＨＳ−ＲとＮＰＹは弓状核ニューロンに共に局在していることが示されている（Guan XM et al., Brain Res MolBrain Res, 48:23-29, 1997など）。さらに、非ペプチド性の成長ホルモン放出促進因子が視床下部で機能して弓状核ニューロンの電気活性を変えて、転写因子であるｃ−ｆｏｓの発現を活性化することが知られている（Dickson Sl et al., Neuroendocrinology, 61:36-43, 1995など）。
【００３５】
本発明では、ＮＰＹのｍＲＮＡ発現はグレリンを中枢投与することによって有意に上昇した。従って、ポジティブなエネルギーバランスを生み出すグレリンの作用メカニズムは、視床下部のＮＰＹとＹ１受容体系と関与していると思われる。現在までに、いくつかのペプチドが脳に投与したときに摂食を増加することが示されている（Elmquist JK et al., Nat Neurosci, 1:445-450, 1998など）。しかしながら、末梢投与して食欲亢進作用を示すペプチドは今までに報告されていない。本発明では、末梢投与したグレリンがＮＰＹとＹ１受容体を介して摂食刺激することを明らかにした。迅速な胃の内容排出は過食や肥満と密に関連すること、また同様に胃の内容排出の遅延は食欲不振や悪液質と関連することが示唆されている（Inui A., Cancer Res 59:4493-4501, 1999など）。本発明では、グレリンはモチリンと同様に有意に胃内容排出速度を増加した。これまでの研究では、コレシストキニン（ＣＣＫ）が強力な摂食阻害効果と、胃迷走神経の求心活性化を介する胃空隙化を阻害する効果を有することが報告されている（Schwartz GJ et al., Am J Physiol, 272:R1726-1733, 1997）。
【００３６】
本発明では、グレリンの食欲亢進効果もまた迷走神経と求心活性を介していることを明らかにした。電気生理学的研究から明らかなように、ラットに静脈投与するときのグレリンの有効量は、ＣＣＫの有効量よりも低い。ボンベシン、ＩＬ−１β、レプチン及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）を含む種々の反オレキシン分子（anorexigenic molecules）が胃迷走神経求心の放電率（discharge rate）を増加することが報告されている（前出、Schwartzなど）。従って、グレリンが迷走神経活性に及ぼす効果、及び摂食に及ぼす効果はこれらの摂食阻害分子とは反対のものであり、食欲亢進活性が迷走神経を介して作用することを支持している。
【００３７】
さらに本発明では、胃でのグレリンｍＲＮＡの発現が飢餓状態によって上昇することを示した。これらの結果は、飢餓状態でのグレリンｍＲＮＡの増加が少なくとも部分的には視床下部ＮＰＹの活性化の原因であり、その結果摂食を引き起こすことを示唆している。もしそうであるとすると、胃は、末梢から視床下部への飽満シグナルであるレプチンの産生源であるだけでなく、摂食刺激シグナルであるグレリンの産生源でもある。食欲不振や悪液質では、ＩＬ−１、ＩＬ−６や腫瘍壊死因子のようなサイトカインがエネルギーバランスに重要な影響を及ぼす（Inui A., Cancer Res 59:4493-4501, 1999など）。また、悪液質は体重減少などを主症状とする全身状態の不良をきたすことが知られている。摂食を抑制することが知られているレプチン、ＣＲＦ、ＣＣＫ及びインスリンを含むいくつかのホルモンはサイトカインで誘導される。本発明では、胃でのグレリンｍＲＮＡ発現がＩＬ−１β及びレプチンのいずれによっても減少し、ｏｂ／ｏｂマウス（レプチンが欠失しており、そのため暴食に陥り肥満となっているマウス）では上昇することを示した。レプチンを繰り返し投与するとエネルギーの取込だけでなく、グレリンｍＲＮＡの発現も減少した。従って、胃におけるグレリン遺伝子の発現が食欲の制御と蜜に関連しており、飢餓状態への適応性応答又は肥満の発生のいずれかに役割を果たしている。さらに、末梢投与したグレリンがＩＬ−１βで誘導される食欲不振と体重減少を逆転させ、悪液質状態を改善した。グレリンが下垂体からの成長ホルモン放出を強力に刺激することは知られている（前出、Kojima et al.）。これらの知見と本発明で得られた知見を合わせて考えると、ＩＰ投与したグレリンのみで、体重増加を刺激することができ、このペプチドが体の成長と脂肪組織の質量の制御に寄与している可能性がある。本発明者は特定の理論に拘束されるものではないが、グレリンは、短期的な食事関連のオレキシゲン（ＣＣＫやその他の食事関連飽満因子のカウンターパート）というよりは、体重を長期的に制御する因子、すなわちレプチンのカウンターパートであるのかも知れない。現在までのところ、成長ホルモンは、外科手術ストレス、敗血症、グルココルチコイド投与、ＨＩＶ感染及び癌と関連する筋肉喪失を治療する有力な同化剤として用いられてきた。成長ホルモンは少なくともある条件下では、全身と筋肉タンパク質合成を刺激する。代って、グレリンは成長ホルモン分泌が減少し、筋肉質量が減少し、また多くの場合食欲不振を伴う老人の治療に有効である。
【００３８】
グレリン又はグレリン類似体を有効成分とする本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤は、摂食を促進し、エネルギー消費を減少し、成長ホルモン分泌を刺激することによって、ポジティブなエネルギーバランス状態と体重増加を誘導する。
【００３９】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４０】
試験材料及び方法
（１）動物実験
７週齢のｄｄｙ雄マウス（３２−３５ｇ）はJAPAN SLC (Shizuoka, Japan)から購入した。１０−１１週齢の肥満型（ｏｂ／ｏｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３８−４２ｇ）はShionogi Co., Ltd. (Shiga, Japan)から購入した。これらを個別で制御された環境で飼育した（温度２２±２℃、湿度５５±１０％、１２時間ごとの明暗サイクルで午前７時に明サイクル開始）。特記しない限り食餌と水は自由に与えた。マウスは各実験で１回だけ用いた。ラットグレリン、ラットＮＰＹ、ヒトアゴウチ関連タンパク質（agouti-related protein）８６−１３２（ＡＧＲＰ）、マウスオレキシンＡ、マウスオレキシンＢ及びマウスメラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）はPeptide Institute (Osaka, Japan)から購入した。組換えマウスレプチン及び組換えマウスＩＬ−１βはそれぞれR & D Systems (Minneapolis, USA)及びUpstate Biotechnology (New York, USA)から購入した。ＢＩＢＯ３３０４はBoeringer-Ingelheim Pharma, Germany)から、またＬ１５２８０４及びＪ１１５８１４はBanyu (Banyu Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan)から恵与された。なお、ＢＩＢＯ３３０４及びＪ１１５８１４はＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニストであり、Ｌ１５２８０４はＹ５受容体アンタゴニストである。投与の直前に各薬剤を人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）４μｌで希釈して第三脳室内（intra-third corebroventricular：ＩＣＶ）投与するか、あるいは生理食塩水１００μｌで希釈して腹腔内（ＩＰ）投与した。対照群にはＡＣＳＦ又は生理食塩水のみを与えた。各アンタゴニストはグレリンと同時に投与した。結果は平均値±ＳＥで示した。分散解析（ＡＮＯＶＡ）を行い、Bonferroniのｔ検定により群間の差を求めた。Ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意な差があるとした。
（２）ＩＣＶ投与
ＩＣＶ投与を行うためには、マウスをペントバルビタールナトリウム（８０−８５ｍｇ／ｋｇＩＰ）で麻酔し、実験前の７日間、定位固定装置（SR-6, Narishige, Tokyo, Japan）内においた。各頭蓋骨に、針を使って中央縫合の側方０．９ｍｍで前頂の０．９ｍｍ後方に穴をあけた。一端を長さ３ｍｍにわたって傾斜させた２４ゲージのカニューレ（Safelet-Cas, Nipro, Osaka, Japan）を第三脳室に埋め込みＩＣＶ投与用とした。カニューレを歯科用セメントで頭蓋骨に固定し、シリコンでふたをした。２７ゲージの注入用インサートをＰＥ−２０チュービングでミクロシリンジに取り付けた。マウスを拘束したり、行動を大きく制限することなく、これをピンセットで前記の固定したカニューレに挿入した。実験終了後、カニューレ端の位置を確認するために、色素（エバンスブルー０．５％及びゼラチン５％）を注入し、凍結脳セクションの組織学的実験に供した。
（３）迷走神経切断術（truncal vagotomy）
実験の４日前に、以下のようにして迷走神経切断術を行った。マウスをペントバルビタールナトリウム（８０−８５ｍｇ／ｋｇＩＰ）で麻酔した。腹壁の中央線を切開して、胃を暖かい食塩水で湿らせた滅菌ガーゼで覆った。食道下部を露出して、迷走神経の前方枝及び後方枝を切断した。手術の最後に腹壁を二重に縫合した。シャム（虚偽）手術マウスでは、同様に迷走神経幹を露出したが、切断はしなかった。迷走神経を切断したマウス及びシャム手術したマウスを完全栄養流動食（Oriental Yeast Co., Ltd. Tokyo, Japan）で飼育した。
（４）摂食試験
試験は１０時に開始した。摂食試験前に、マウスには自由に食餌と水を摂らせた。ただし、グレリンとＩＬ−１βのＩＰ共投与が摂食に及ぼす効果を調べる試験では、マウスに１６時間食餌を与えず、水のみ自由に摂らせた。摂食量の測定は、ＩＣＶ又はＩＰ投与の２０分、１時間、２時間及び４時間後に、予め測定して与えておいた食餌量から残った食餌量を差し引いて求めた。食餌制限をしなかったリーンマウスでは、グレリン（３ナノモル／マウス）、ＩＬ−１β（５ピコモル／マウス）もしくは生理食塩水を５日間繰り返しＩＰ投与した。マウスには７時と１９時に毎日注射した。摂食量と体重を毎日測定するとともに、毛並みの状態を観察した。
（５）ＲＮＡの単離とノーザンブロット分析
視床下部ブロックと胃からRNeasy Mini Kit (Qlagen, Tokyo, Japan）を用いてＲＮＡを単離した。全ＲＮＡをホルムアルデヒドで変性し、１％アガロースゲルで電気泳動し、Hybond N+ メンブラン（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）にブロットした（Ueno N. et al., Gastroenterology, 117:1427-1432, 1999）。メンブランを32Ｐ標識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて視床下部中のＮＰＹ ｍＲＮＡを測定し、ジゴキシゲニン標識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて胃中のグレリンｍＲＮＡを測定した。ハイブリダイズしたシグナルの全量をデンシトメトリ（Image Master 1D Elite ver 3.0, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）で測定した。データをグリセルアルデニド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡに正規化して対照群のパーセントで表示した。
（６）ＮＰＹ遺伝子発現
マウスを２４時間絶食させた。絶食期間中、ＩＣＶ投与する予定のマウスにはグレリン（１ナノモル／マウス）もしくはＡＣＳＦを１２時間毎に投与し、３回目の最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。ＩＰ投与する予定のマウスにはグレリン（３ナノモル／マウス）もしくは生理食塩水を８時間毎に投与し、４回目の最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。直ちに脳ブロックを切除してドライアイスで凍結し、ノーザンブロットを調製するまで−８０℃で保存した。
（７）グレリン遺伝子発現
リーンマウスを４８時間絶食させた。絶食期間中、絶食マウスにＩＬ−１β（５ピコモル／マウス）、レプチン（３ナノモル／マウス）もしくは生理食塩水を１２時間毎にＩＰ投与し、５回目の最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。絶食しないｏｂ／ｏｂマウスでは、レプチン（３ナノモル／マウス）もしくは生理食塩水を７日間繰り返し投与した。マウスには毎日７時と１９時に注射をし、最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。直ちに胃を切除してドライアイスで凍結し、ノーザンブロットを調製するまで−８０℃で保存した。
（８）酸素消費量
酸素消費量を２２℃でＯ2／ＣＯ2代謝測定システム（Model MK-5000, Muromachikikai, Tokyo, Japan）を用いて測定した（前出、Ueno N. et al.）。チャンバー容量は５６０ｍｌ、チャンバーへの空気の流速は５００ｍｌ／分であった。サンプルは３分ごとに取り出し、標準ガスサンプルは３０分毎に取り出した。マウスを明サイクル中で食餌、水を与えずに、またチャンバー中に拘束せずに入れて、ＢＩＢＯ３３０４（５ナノモル／マウス）の存在下もしくは不在下に、グレリン（１０時に０．３−１ナノモル／マウス）をＩＣＶ投与し、その２時間後の酸素消費量を測定した。
（９）胃内容排出速度
胃内容排出速度測定試験の前に、マウスを１６時間絶食させ、水は自由に摂らせた。絶食マウスに予め計量した食餌ぺレットを１時間自由に摂らせ、その後グレリンを投与した。投与後１又は２時間で再度マウスを絶食させた。摂食重量は残ったぺレットを計量して求めた。試験開始後２又は３時間後にマウスを頸部脱臼により殺した。ただちに胃を開腹術により露出し、幽門と噴門を素早く結紮して除去し、乾燥内容物重量を測定した。内容物は真空凍結乾燥システム（Model 77400, Labconco, Kansas, USA）で乾燥した。胃内容排出速度は以下の式によって計算した：
胃内容排出速度 (％)＝｛１−（胃から回収した食餌の乾燥重量／摂食重量）｝ｘ１００
（１０）電気生理学的研究
雄Ｗｉｓｔａｒラット（３００ｇ）をウレタン（１ｇ／ｋｇＩＰ）で麻酔し、気管カニューレを挿入した。解剖顕微鏡下で、迷走神経の胃分岐部（gastric branch）の末梢切断端から神経フィラメントを切り出して、一対の銀線電極で求心性の神経活性を記録した。神経活性の経時変化を観察するために、速度メータ（rate meter）（５秒の休止期間）を用いた（Niijima A., J. Nutr 130:971S-973S, 2000）。グレリン（３−３００フェムトモル／ラット）投与は下方大静脈（ＩＶ）に挿入した小さいカテーテルを介して行った。迷走神経活性に及ぼすグレリンの効果を、注射の前後５０秒にわたって、５秒ごとのインパルスの平均数を比較することで測定した。結果は平均値±ＳＥで表した。ＡＮＯＶＡ及びScheffe検定を行い、群間の差を評価した。Ｐ＜０．０５の場合を統計的に有意であると判定した。
実施例１：グレリンＩＣＶ投与の摂食に及ぼす効果
本実施例では、グレリンのマウス脳室（ＩＣＶ）投与の効果を試験した。絶食しないリーンマウスにＡＣＳＦ（対照）又はグレリン（０．００３−１ナノモル／マウス）をＩＣＶ投与した。薬剤投与の２０分、１時間、２時間及び４時間後に摂食量を試験した。得られた結果を図２に示す。結果は平均±ＳＥで表し、ｎは動物数を表す。*Ｐ＜０．０５及び**Ｐ＜０．０１は、Bonferroniのｔ検定によって対照群と比較した有意差である。グレリンは用量依存的に摂食量を顕著かつ有意に増加した。ＩＣＶ投与の２４時間後では、１ナノモルのグレリンを投与したマウスでは累積的摂食量も増加したが、これは統計的有意差ではなかった（６．３１±０．１０ｇ対５．６８±０．２１ｇ（対照群）：Ｐ＜０．０７６）。
【００４１】
実施例２：他のペプチドと比較したグレリンＩＣＶ投与の効果
ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシンＡ、オレキシンＢ及びＭＣＨと比較したグレリンのマウスＩＣＶ投与の効果を実施例１と同様にして、１ナノモル／マウスで試験した。結果を図３に示す。４時間での摂食増加能は、ＮＰＹ＞グレリン＞ＡＧＲＰ＞オレキシンＡ＞オレキシンＢ＞ＭＣＨの順であった。従って、グレリンはＮＰＹを除く全ての食欲亢進性ペプチドよりも強力であった。
【００４２】
実施例３：グレリンＩＣＶ投与のＮＰＹ遺伝子発現に及ぼす効果
グレリンがＮＰＹ経路を介して作用している可能性を試験するために、グレリンのＩＣＶ投与後の視床下部におけるＮＰＹ遺伝子の発現を上記した方法により調べた。得られた結果を図４に示す。上のパネルは、グレリンＩＣＶ投与後の視床下部ＮＰＹ ｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。下のグラフは、ノーザンブロットのデータをグリセルアルデニド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡに正規化して対照群のパーセントで表示したものである。グレリンはＮＰＹ ｍＲＮＡの発現を５８％も増加した。
【００４３】
実施例４：ＮＰＹの受容体アンタゴニストによる前処理がグレリン誘導の摂食増加に及ぼす効果
ＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニスト（ＢＩＢＯ３３０４及びＪ１１５８１４）及びＹ５受容体アンタゴニスト（Ｌ１５２８０４）で前処理することが、グレリンで誘導された摂食に効果を及ぼすかどうかについて試験した。Ｙ１受容体アンタゴニストであるＢＩＢＯ３３０４及びＪ１１５８１４（５ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）はグレリン（１ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）で誘導される摂食を有意に阻害した。一方、Ｙ５受容体アンタゴニストのＬ１５２８０４（５ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）はこの効果を示さなかった（図５）。従って、グレリンはＮＰＹのＹ１受容体を介して作用していると考えられた。
【００４４】
実施例５：グレリンのＩＣＶ投与の酸素消費量に及ぼす効果
グレリンのＩＣＶ投与の酸素消費量に及ぼす効果を上記の方法を用いて試験した。得られた結果を図６に示す。グレリンは摂食促進したのと同じ用量（０．３−１ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）で酸素消費量を減少したが、これはＹ１受容体アンタゴニスト（ＢＩＢＯ３３０４：５ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）で前処理することによって阻害された。また、グレリンは、１ナノモルグレリンを投与したマウスで、ＩＣＶ投与の１時間（７．２４±６．９６％）及び２時間（５．１８±６．０１％）後に呼吸商（ＲＱ）を増加する傾向を示したが、統計的有意差には至らなかった。
【００４５】
実施例６：グレリンＩＰ投与の摂食及びＮＰＹ ｍＲＮＡ発現に及ぼす効果
ＩＰ投与したグレリンが同様な摂食亢進効果を示すかを絶食していないリーンマウスで試験した。グレリンのＩＰ投与は３ナノモル／マウスで顕著に摂食を増加した（図７）。３ナノモル／マウスのグレリンをＩＰ投与した２４時間後の蓄積摂食量はさらに有意に高かった（６．６８±０．１６ｇ対６．１０±０．１７ｇ（対照）：Ｐ＜０．０５）。この食欲亢進活性はＹ１受容体アンタゴニストであるＢＩＢＯ３３０４のＩＣＶ投与によってブロックされたが、Ｙ５受容体アンタゴニストのＬ１５２８０４ではブロックされなかった。グレリンのＩＰ投与後の視床下部ＮＰＹのｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験したところ、１２％の発現増加が観察された（図８：なお、図８中のSalineは、対照群として食塩水を投与した群での結果を示す）。
【００４６】
実施例７：グレリンＩＰ投与の胃内容排出速度に及ぼす効果
グレリンが胃内容排出速度を増加するかどうかを上記の方法を用いて試験した。図９は、グレリン（０．３−１ナノモル／マウス）をＩＣＶ投与したときの１時間及び２時間後の胃内容排出速度を示す。ＩＣＶ投与でもＩＰ投与でも、グレリンは投与１時間後で胃内容排出速度を有意に増加した（３０．１６±３．７０％（３ナノモル）対２０．３４±２．２７％（対照）：Ｐ＜０．０５）。従って、グレリンはモチリンと同様に胃の運動を亢進する。
【００４７】
実施例８：迷走神経切断術がグレリンの摂食促進効果、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現及び胃迷走神経の求心性神経活性に及ぼす効果
グレリンの摂食促進効果が迷走神経を介する経路と関連するかどうかを上述した方法で迷走神経切断術を施したマウスで試験した。迷走神経切断術は侵襲的手術であるが、この手術によってグレリンのＩＰ投与で誘導された摂食促進効果が無くなった（図１０：なお、図１０中で、Shamはシャム手術群、Vagotomyは迷走神経切断術を施した群を示す）。ＩＰ投与したグレリンで誘導された視床下部ＮＰＹのｍＲＮＡ発現の有意な増加もこの手術によって無くなった（データ示さず）。上記の方法を用いて行った電気生理学的研究では、グレリンのＩＶ投与は胃迷走神経の求心性の神経活性を有意に減少した（図１１）。
【００４８】
実施例９：グレリンｍＲＮＡの胃での発現
グレリンｍＲＮＡの胃での発現をノーザンブロット分析で試験した。図１２に示すように、４８時間の絶食は、対照の絶食しないマウスに比べて有意に（１６％）グレリンｍＲＮＡを増加した（なお、図１２中で、Fedは絶食をしないマウス群を、Fastは絶食をしたマウス群を示す）。
【００４９】
胃でのグレリンｍＲＮＡ発現に何らかの異化物質が影響を及ぼしているかどうかを試験するために、ＩＬ−１β及びレプチンをＩＰ投与した。図１３に示すように、ＩＬ−１βとレプチンはいずれも胃におけるグレリンｍＲＮＡの発現を有意に減少した（ＩＬ−１βについては２３±２．８％、レプチンについては２２±３．５％）。
【００５０】
また、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスの胃におけるノーザンブロット分析を行った。任意量の食餌をさせたリーンマウスと比較して、ｏｂ／ｏｂマウスのグレリンｍＲＮＡ発現は有意に（１９％）上昇していた（図１４）。レプチンはｏｂ／ｏｂマウスにおいても、リーンマウスにおいても有意に（１７±３．２％：Ｐ＜０．０１）グレリンｍＲＮＡの発現を減少した。ｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを繰り返し投与すると、食塩水を与えた対照群と比較して、グレリンｍＲＮＡを有意に（３１％）減少し、また同時に摂食量と体重が減少した（図１５）。対照群及びｏｂ／ｏｂマウスのどちらにおいても視床下部のノーザンブロットではグレリンｍＲＮＡの発現を検出しなかった。
【００５１】
実施例１０：グレリンとＩＬ−１βを共投与したときの摂食量と体重に及ぼす効果
グレリンとＩＬ−１βを共投与したときの摂食量と体重に及ぼす効果を検討した。図１６に示すように、ＩＬ−１βで誘導される摂食減少はグレリンによってブロックされた。さらに、グレリンを繰り返し投与すると、ＩＬ−１βで誘導される摂食量と体重の減少を逆転した（図１７）。
【００５２】
また、ＩＬ−１βのみを投与した群では、毛並みが乱れ、全身状態の悪化が観察されたが、グレリンとＩＬ−１βを共投与した群では、毛並みが改善し、グレリンが悪液質に伴う全身状態の不良を改善することがわかった。
【００５３】
実施例１１：LC-6移植HHM/cahexiaモデルマウスに対するグレリンの影響
モデル動物として、ヒト肺癌細胞株LC-6を移植したHHMモデルマウスを用いた。このモデルマウスは悪液質に伴う体重減少を示すことが知られている（ＷＯ９８／１３３８８）。１群６匹のマウスにグレリンを３、０．３、０ nmol／個体を１０回（１日２回、１２時間おき、５日間）投与した。別途、腫瘍を移植していない正常群（ｎ＝５）を準備した。
【００５４】
０−５日目に体重測定を行い、また５日目には精巣周辺の脂肪重量を測定した。
得られた結果を図１８及び図１９に示す。３ nmol投与群は、０nmol投与群に比較して投与開始後３日目まで体重の増加が認められ、５日目まで持続した。また、３ nmol投与群は、０nmol投与群に比較して脂肪重量の増加が認められた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な低栄養症状疾患治療剤に関する。さらに詳しくは、グレリン又はグレリン類似体を有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤に関する。また、グレリンのアゴニスト又はアンタゴニストを用いた新規な摂食異常又は代謝異常治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
体重調節は摂食量とエネルギー消費のバランスが鍵を握り、両者のバランスが肥満、やせを引き起こす。１９９４年に発見されたレプチンがadiposity（体脂肪量蓄積）シグナルとして体重調節の根幹に関わることが明らかにされて以来、レプチンの下流に位置する、多くの新しい食欲調節に関与するペプチドが見いだされた。特に、それまで個々独立した機能としてしか捉えられていなかった視床下部由来の神経ペプチド群が、レプチンの下流でそれぞれが機能し、さらにこれらの神経ペプチド群相互間でも密に情報交換が行われていることがわかってきた。
【０００３】
これらの神経ペプチドのうち、食欲を亢進する物質としては、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシン類（orexins）、モチリン（motilin）、メラニン濃縮ホルモン（melanin-concentrating hormone：ＭＣＨ）やアゴウチ関連タンパク質（agouti-related protein：ＡＧＲＰ）が知られている。また、食欲を抑制する物質としては、α−メラノサイト刺激ホルモン（α-melanocyte-stimulating hormone：α−ＭＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（corticotropin-releasing factor：ＣＲＦ）、コカイン−及びアンフェタミン−制御転写物（cocain- and amphetamine- regulated transcript：ＣＡＲＴ）やコレシストキニン（cholesystokinin：ＣＣＫ）などが知られている。これらのペプチドは胃腸の運動を制御する生理学的メカニズムに関与しており、エネルギー恒常性に影響すると考えられている。
【０００４】
特に、ＮＰＹは３６アミノ酸からなる神経伝達物質であり、摂食中枢とされる視床下部に豊富に発現する。ＮＰＹは視床下部弓状核（ＡＲＣ）で産生され、軸索を通じて主に室傍核（ＰＶＮ）へと分泌されて摂食に影響を及ぼす。ＮＰＹを中枢投与すると強力な摂食亢進作用を示す（Schwartz, MW et al., Am. J. Clin. Nutr., 69:584, 1999）が、末梢への投与では摂食に関係しないか、逆に抑制傾向を示した。この現象は他のＰＰファミリーペプチドでも同様に見られる。ＮＰＹが引き起こす種々の生理作用はＮＰＹ受容体を介して行われる。ＮＰＹ受容体は現在、５つのサブタイプ（Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、ｙ６）がクローニングされており、その基本構造は７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体である。リガンドの結合特異性と摂食促進活性の検討からＹ５受容体が、そしてアンタゴニスト投与実験を含めた解析から、Ｙ１受容体が摂食調節と密接に関係する受容体として報告されている（Inui A., Trends Pharmacol Sic 20:43-46, 1999など）。
【０００５】
一方、成長ホルモン（ＧＨ）は、下垂体前葉から分泌されるホルモンであり、その分泌は巧妙に制御されており、視床下部の成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）によって刺激を受け、ソマトスタチンによって抑制される。近年、ＧＨＲＨやソマトスタチンとは別の経路によるＧＨ分泌調節機構が明らかになってきた。この別経路のＧＨ分泌調節機構は、ＧＨの分泌促進活性をもつ合成化合物である成長ホルモン放出促進因子（growth hormone secretagogue：ＧＨＳ）の研究により展開されてきた。ＧＨＳはＧＨＲＨとは異なる経路で作用する。すなわち、ＧＨＲＨはＧＨＲＨ受容体を活性化して、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させるのに対して、ＧＨＳはＧＨＲＨ受容体とは異なる受容体を活性化して、細胞内ＩＰ３系を介して細胞内Ｃａ++イオン濃度を上昇させる。このＧＨＳが作用する受容体であるＧＨＳ−Ｒは、１９９６年に発現クローニング法により構造が解明された（Howard A.D. et al, Science, 273: 974-977, 1996）。ＧＨＳ−Ｒは細胞膜を７回貫通する典型的なＧタンパク質共役型受容体であり、主として視床下部、下垂体に存在する。
【０００６】
さらに、生体内に存在しない合成化合物であるＧＨＳを結合する受容体が存在することから、このＧＨＳ−Ｒに結合して、活性化する内因性のリガンドが探索された。その結果、ＧＨＳ−Ｒに特異的なリガンドとして、グレリン（Ghrelin）がラットの胃から精製、同定された（Kojima M. et al., Nature, 402:656-660, 1999）。
【０００７】
グレリンは、アミノ酸２８残基からなるペプチドで、３番目のセリン残基がｎ−オクタノイル化されている。また、ヒトのグレリンはラットグレリンとアミノ酸２残基が異なる。以下にラット及びヒトのグレリンの構造式を示す。
【０００８】
【化１】
【０００９】
化学合成したグレリンはナノモルオーダーで、ＧＨＳ−Ｒを発現させたＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａ++上昇活性や、初代培養下垂体細胞で成長ホルモンの放出活性をもつ。さらに、in vivoでもラットにおいて血中成長ホルモンを上昇させる。グレリンのｍＲＮＡは胃で顕著に発現しており、またグレリンは血中にも存在する。さらに、ＧＨＳ−Ｒは視床下部、心臓、肺、膵臓、小腸や脂肪組織にも存在している（前記Kojima ら）。また、グレリンには摂食促進作用のあることが報告されている（Wren et al., Endocrinology, 141(11):4325-4328, 2000）。これらの知見から、グレリンは胃で産生され、血中を介して下垂体に運搬された後に脳や末梢でさまざまな作用を及ぼしていると考えられているが、その生理的役割はまだ十分に解明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、グレリンの食欲調節における作用及びそのメカニズムを解明し、またこれを用いた新規な低栄養症状疾患治療剤を開発することにある。さらには、グレリンのアゴニスト又はアンタゴニストを用いた新規な摂食異常又は代謝異常治療剤を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、グレリンがＮＰＹとＹ１受容体を介して顕著な食欲促進作用を示すことを発見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、グレリンを有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、グレリンの存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することを含む、グレリンのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、上記方法により得られるグレリンのアゴニストを有効成分として含有する食欲不振症又は体重減少症治療剤を提供する。
本発明はさらに、上記方法により得られるグレリンのアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ａは、ヒトグレリンとヒトモチリンのアミノ酸配列を示したものである。Ｂは、ヒトグレリン受容体とヒトモチリン受容体のアミノ酸配列を示したものである。同じアミノ酸を星印で示す。
【図２】図２は、グレリンＩＣＶ投与の摂食に及ぼす効果を示す。
【図３】図３は、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシンＡ、オレキシンＢ及びＭＣＨと比較したグレリンのマウスＩＣＶ投与の効果を示す。
【図４】図４は、グレリンのＩＣＶ投与後の視床下部におけるＮＰＹ遺伝子の発現を示す。上のパネルは、グレリンＩＣＶ投与後の視床下部ＮＰＹ ｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。下のグラフは、ノーザンブロットのデータをＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化して対照群のパーセントで表示したものである。
【図５】図５は、ＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニスト（ＢＩＢＯ３３０４）及びＹ５受容体アンタゴニスト（Ｌ１５２８０４）で前処理することが、グレリンで誘導された摂食に及ぼす効果を示す。
【図６】図６は、グレリンＩＣＶ投与の酸素消費量に及ぼす効果を示す。
【図７】図７は、グレリンＩＰ投与の摂食に及ぼす効果を示す。
【図８】図８は、グレリンＩＰ投与の視床下部ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現に及ぼす効果を示す。
【図９】図９は、グレリンＩＰ投与の胃内容排出速度に及ぼす効果を示す。
【図１０】図１０は、迷走神経切断術がグレリンの摂食促進効果に及ぼす効果を示す。
【図１１】図１１は、迷走神経切断術がグレリン投与時の胃迷走神経の求心性神経活性に及ぼす効果を示す。
【図１２】図１２は、４８時間絶食したリーンマウスにおける、グレリンｍＲＮＡの胃での発現をノーザンブロット分析で試験した結果を示す。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１β及びレプチンをＩＰ投与したときの、胃におけるグレリンｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験した結果を示す。
【図１４】図１４は、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスの胃におけるグレリンｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験した結果を示す。
【図１５】図１５は、ｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを繰り返し投与したときの、胃におけるグレリンｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験した結果を示す。
【図１６】図１６は、絶食リーンマウスにグレリンとＩＬ−１βを共投与したときの摂食量と体重に及ぼす効果を示す。
【図１７】図１７は、グレリンを繰り返し投与したときの、ＩＬ−１βで誘導される摂食量と体重の減少に及ぼす効果を示す。
【図１８】図１８は、LC-6移植HHM/cahexiaモデルマウスにおけるグレリンの体重増加に及ぼす効果を示す。
【図１９】図１９は、LC-6移植HHM/cahexiaモデルマウスにおけるグレリンの脂肪増加に及ぼす効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で有効成分として用いるグレリンは、式１で表されるラットグレリン又はヒトグレリン又はグレリン類似体である。
【００１６】
【化２】
【００１７】
グレリン類似体には、食欲促進作用を有する限り、２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているものも包含され、さらに、これらの各種誘導体、例えば、ペプチド構成アミノ酸が置換された誘導体（アミノ酸間に基、例えば、アルキレンが挿入されたものも包含する）及びエステル誘導体も包含される。
【００１８】
グレリン又はグレリン類似体はいかなる方法で製造したものでもよく、例えば、ヒト、ラットの細胞より分離、精製したもの、合成品、半合成品、遺伝子工学的手法により得られたものなどを含み、特に制限はない。
【００１９】
２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているもの例としては、グレリンの１４番目のＧｌｎ残基が欠除した、des-Gln14-グレリンなどが代表的である。ラットdes-Gln14-グレリンはグレリン遺伝子のスプライシングの違いにより生じるものであり、ラット胃においてはグレリンの４分の１程度存在し、成長ホルモン放出活性の強さはグレリンと同じである。
【００２０】
さらに、J.Med.Chem.2000, 43, 4370-4376には、ヒトＧＨＳＲ１ａの活性化に必要なグレリンの最少配列が記載されており、ここに記載された下記のようなものも本発明のグレリン類似体に包含される。例えば、グレリン２８個のアミノ酸のうち、Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸（好ましくは、Ｎ末端４個のアミノ酸）を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているペプチド及びその誘導体であって、食欲促進作用を有するものが挙げられる。
【００２１】
Ｎ末端から３番目のアミノ酸の側鎖の例としてはグレリンの側鎖であるｎ−オクタノイル以外のアシル基及び置換アルキル基（これらの炭素数は６〜１８が好ましい）が挙げられ、具体的な側鎖としては、下記のものが挙げられる：
−ＣＯ−（ＣＨ2）6ＣＨ3、−ＣO（ＣＨ2）9ＣＨ3、−ＣO（ＣＨ2）14ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ3、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）2、−ＣＯ−（ＣＨ2）6ＣＨ2Ｂｒ、−ＣＯ−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３、
【００２２】
【化３】
【００２３】
Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているグレリン類似体の具体的な例としては、第３７回ペプチド討論会（２０００年１０月１８日〜２０日）で報告された化合物：
ＮＨ2−（ＣＨ2）4−ＣＯ−Ｓｅｒ（オクチル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2があげられる。
【００２４】
本発明によって明らかになった以下に記載するグレリンの作用メカニズムを考慮すると、これらのグレリン類似体も食欲促進活性を期待することができる。
本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤においては、グレリン又はグレリン類似体を２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤は中枢投与（例えば脳室内投与、脊髄腔注）とすることも、末梢投与とすることも可能である。好ましくは、末梢投与で使用する。上述したように、ＮＰＹや他のＰＰファミリーペプチドは末梢への投与では摂食に関係しないが、本発明の治療剤は末梢投与でも顕著な食欲亢進効果を示した。従って、本発明の治療剤は投与に伴う患者の苦痛が少なく、かつ簡便に服用することができ、従来の食欲調節性ペプチドに比べてはるかに利点が大きい。
【００２６】
グレリン又はグレリン類似体は、公知の製剤技術により、単独であるいは薬理学的に受容しうる担体、添加剤などとともに、通常の経口投与用製剤及び非経口投与用製剤とすることができる。例えば、溶液製剤（動脈注、静脈注又は皮下注などの注射剤、点鼻剤、シロップ剤等）、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、座剤などに製剤化することができる。また、ドラッグデリバリーシステム（除放剤など）で使用することも可能である。
【００２７】
本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路などに応じて異なり、医師の判断によって決定される。通常、静脈内投与のためには、グレリンとして、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。但し、投与量はこれに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の治療剤は、低栄養症状を示す疾患の治療に用いることができ、特に食欲不振、悪液質又は悪性疾患、感染症及び炎症性疾患による付随的体重減少による衰弱状態から選ばれる疾患に有効である。とりわけ、悪液質に伴う食欲不振症又は体重減少症の治療剤として有用である。悪液質は、漸進性の体重減少、貧血、皮膚乾燥又は浮腫、食欲不振などを主症状とする全身状態の不良をいい、感染症、寄生虫症、悪性腫瘍など非常に多くの疾患の末期症状としてみられる。本明細書では、食欲亢進、摂食増加、摂食促進などの用語は同じ意味をもつ言葉として互換的に使用する。
【００２９】
本発明はさらに、グレリンの存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することを含む、グレリン又はグレリン類似体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。具体的な測定方法は例えば本明細書に記載の方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００３０】
上記スクリーニング方法で得られたグレリン又はグレリン類似体のアゴニストを本発明の食欲不振症又は体重減少症治療剤の有効成分として用いることができる。
また、上記スクリーニング方法で得られたグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストを本発明の肥満予防剤又は治療剤の有効成分として用いることができる。以下の実施例に示すように、ＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニストで前処理することによって、グレリンで誘導される摂食促進を有意に阻害した。従って、グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニスト投与により、肥満を治療するだけでなく、予防することも可能となる。
【００３１】
本発明では、グレリン又はグレリン類似体のアゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体又はそれらのアゴニストを用いることができ、またグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体のアンタゴニストを用いることができる。
【００３２】
モチリンは十二指腸、空腸上部の内分泌細胞から分泌される２２アミノ酸残基のペプチドであり（Itoh, Z., Peptides, 18:593-608, 1997）、消化管の空腹期（interdigestive）運動、胆嚢収縮及び胃や膵臓からの酵素分泌に関与する。モチリンはＧＨ分泌を促進することが報告されており、非ペプチド性のモチリンアゴニストを用いて胃の運動を促進することが報告されている（前出、Itoh）。図１のＡに示すように、ヒトグレリンとヒトモチリンは互いに３６％のアミノ酸同一性を示す（アクセス番号Ａ５９３１６及びＰ１２８７２）。さらに、図１のＢに示すように、ヒトグレリン受容体はヒトモチリン受容体と全体として５０％のアミノ酸同一性を示す（アクセス番号Ｑ９２８４７、Ｑ９２８４８及びＱ４３１９３）。また、最近になって、Tomasettoたちもマウス胃から新規なペプチドを単離したが、これはグレリンと同一であり、モチリン関連ペプチドと命名した（Tomasetto C. et al., Gastroenterology, 119:395-405, 2000）。グレリンとモチリンとの配列相同性及びグレリン受容体とモチリン受容体との配列相同性に鑑み、グレリン又はグレリン類似体のアゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体又はそれらのアゴニストを用いることができ、またグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体のアンタゴニストを用いることができる。
【００３３】
摂食とエネルギーバランスを制御するメカニズムは複雑であり、まだ十分には解明されていない。現在までに、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシン類、ＭＣＨ、ビーコン（beacon）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、ニューロメジンＵ、コカイン−及びアンフェタミン−制御転写物（ＣＡＲＴ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）やレプチンを含む多くのペプチドがエネルギー恒常性に影響することが示されてきた。上述したように、３６アミノ酸からなるペプチドであるＮＰＹが摂食刺激系及び体重制御における鍵となる成分の一つである。これまでの研究では、中枢投与したＮＰＹはげっ歯類で摂食を刺激し、代謝率を下げる（Bray G.A. et al., Recent Prog Horm Res, 53:95-118, 1998）。ＮＰＹ類似体及び特定のアンタゴニストを用いた受容体の薬理学的性状決定によると、Ｙ１受容体及びＹ５受容体のいずれもがＮＰＹ摂食受容体であると考えられている。
【００３４】
本発明において、ＩＣＶ投与したグレリンはＮＰＹと同様に摂食を顕著に刺激し、酸素消費量を減少し、これらはいずれもＹ１受容体アンタゴニストでブロックされた。少量のグレリンが脳に存在することが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅と、免疫組織学的分析で示唆されている。従来の報告では、ＧＨＳ−Ｒは弓状核（arcuate nucleus：ＡＲＣ）に局在しており、弓状核でＮＰＹが合成される（Tannenbaus GS et al., Endocrinology, 139:4420-4423, 1998）。インサイチュハイブリダーゼーション試験で、ＧＨＳ−ＲとＮＰＹは弓状核ニューロンに共に局在していることが示されている（Guan XM et al., Brain Res MolBrain Res, 48:23-29, 1997など）。さらに、非ペプチド性の成長ホルモン放出促進因子が視床下部で機能して弓状核ニューロンの電気活性を変えて、転写因子であるｃ−ｆｏｓの発現を活性化することが知られている（Dickson Sl et al., Neuroendocrinology, 61:36-43, 1995など）。
【００３５】
本発明では、ＮＰＹのｍＲＮＡ発現はグレリンを中枢投与することによって有意に上昇した。従って、ポジティブなエネルギーバランスを生み出すグレリンの作用メカニズムは、視床下部のＮＰＹとＹ１受容体系と関与していると思われる。現在までに、いくつかのペプチドが脳に投与したときに摂食を増加することが示されている（Elmquist JK et al., Nat Neurosci, 1:445-450, 1998など）。しかしながら、末梢投与して食欲亢進作用を示すペプチドは今までに報告されていない。本発明では、末梢投与したグレリンがＮＰＹとＹ１受容体を介して摂食刺激することを明らかにした。迅速な胃の内容排出は過食や肥満と密に関連すること、また同様に胃の内容排出の遅延は食欲不振や悪液質と関連することが示唆されている（Inui A., Cancer Res 59:4493-4501, 1999など）。本発明では、グレリンはモチリンと同様に有意に胃内容排出速度を増加した。これまでの研究では、コレシストキニン（ＣＣＫ）が強力な摂食阻害効果と、胃迷走神経の求心活性化を介する胃空隙化を阻害する効果を有することが報告されている（Schwartz GJ et al., Am J Physiol, 272:R1726-1733, 1997）。
【００３６】
本発明では、グレリンの食欲亢進効果もまた迷走神経と求心活性を介していることを明らかにした。電気生理学的研究から明らかなように、ラットに静脈投与するときのグレリンの有効量は、ＣＣＫの有効量よりも低い。ボンベシン、ＩＬ−１β、レプチン及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）を含む種々の反オレキシン分子（anorexigenic molecules）が胃迷走神経求心の放電率（discharge rate）を増加することが報告されている（前出、Schwartzなど）。従って、グレリンが迷走神経活性に及ぼす効果、及び摂食に及ぼす効果はこれらの摂食阻害分子とは反対のものであり、食欲亢進活性が迷走神経を介して作用することを支持している。
【００３７】
さらに本発明では、胃でのグレリンｍＲＮＡの発現が飢餓状態によって上昇することを示した。これらの結果は、飢餓状態でのグレリンｍＲＮＡの増加が少なくとも部分的には視床下部ＮＰＹの活性化の原因であり、その結果摂食を引き起こすことを示唆している。もしそうであるとすると、胃は、末梢から視床下部への飽満シグナルであるレプチンの産生源であるだけでなく、摂食刺激シグナルであるグレリンの産生源でもある。食欲不振や悪液質では、ＩＬ−１、ＩＬ−６や腫瘍壊死因子のようなサイトカインがエネルギーバランスに重要な影響を及ぼす（Inui A., Cancer Res 59:4493-4501, 1999など）。また、悪液質は体重減少などを主症状とする全身状態の不良をきたすことが知られている。摂食を抑制することが知られているレプチン、ＣＲＦ、ＣＣＫ及びインスリンを含むいくつかのホルモンはサイトカインで誘導される。本発明では、胃でのグレリンｍＲＮＡ発現がＩＬ−１β及びレプチンのいずれによっても減少し、ｏｂ／ｏｂマウス（レプチンが欠失しており、そのため暴食に陥り肥満となっているマウス）では上昇することを示した。レプチンを繰り返し投与するとエネルギーの取込だけでなく、グレリンｍＲＮＡの発現も減少した。従って、胃におけるグレリン遺伝子の発現が食欲の制御と蜜に関連しており、飢餓状態への適応性応答又は肥満の発生のいずれかに役割を果たしている。さらに、末梢投与したグレリンがＩＬ−１βで誘導される食欲不振と体重減少を逆転させ、悪液質状態を改善した。グレリンが下垂体からの成長ホルモン放出を強力に刺激することは知られている（前出、Kojima et al.）。これらの知見と本発明で得られた知見を合わせて考えると、ＩＰ投与したグレリンのみで、体重増加を刺激することができ、このペプチドが体の成長と脂肪組織の質量の制御に寄与している可能性がある。本発明者は特定の理論に拘束されるものではないが、グレリンは、短期的な食事関連のオレキシゲン（ＣＣＫやその他の食事関連飽満因子のカウンターパート）というよりは、体重を長期的に制御する因子、すなわちレプチンのカウンターパートであるのかも知れない。現在までのところ、成長ホルモンは、外科手術ストレス、敗血症、グルココルチコイド投与、ＨＩＶ感染及び癌と関連する筋肉喪失を治療する有力な同化剤として用いられてきた。成長ホルモンは少なくともある条件下では、全身と筋肉タンパク質合成を刺激する。代って、グレリンは成長ホルモン分泌が減少し、筋肉質量が減少し、また多くの場合食欲不振を伴う老人の治療に有効である。
【００３８】
グレリン又はグレリン類似体を有効成分とする本発明の低栄養症状を示す疾患の治療剤は、摂食を促進し、エネルギー消費を減少し、成長ホルモン分泌を刺激することによって、ポジティブなエネルギーバランス状態と体重増加を誘導する。
【００３９】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４０】
試験材料及び方法
（１）動物実験
７週齢のｄｄｙ雄マウス（３２−３５ｇ）はJAPAN SLC (Shizuoka, Japan)から購入した。１０−１１週齢の肥満型（ｏｂ／ｏｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３８−４２ｇ）はShionogi Co., Ltd. (Shiga, Japan)から購入した。これらを個別で制御された環境で飼育した（温度２２±２℃、湿度５５±１０％、１２時間ごとの明暗サイクルで午前７時に明サイクル開始）。特記しない限り食餌と水は自由に与えた。マウスは各実験で１回だけ用いた。ラットグレリン、ラットＮＰＹ、ヒトアゴウチ関連タンパク質（agouti-related protein）８６−１３２（ＡＧＲＰ）、マウスオレキシンＡ、マウスオレキシンＢ及びマウスメラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）はPeptide Institute (Osaka, Japan)から購入した。組換えマウスレプチン及び組換えマウスＩＬ−１βはそれぞれR & D Systems (Minneapolis, USA)及びUpstate Biotechnology (New York, USA)から購入した。ＢＩＢＯ３３０４はBoeringer-Ingelheim Pharma, Germany)から、またＬ１５２８０４及びＪ１１５８１４はBanyu (Banyu Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan)から恵与された。なお、ＢＩＢＯ３３０４及びＪ１１５８１４はＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニストであり、Ｌ１５２８０４はＹ５受容体アンタゴニストである。投与の直前に各薬剤を人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）４μｌで希釈して第三脳室内（intra-third corebroventricular：ＩＣＶ）投与するか、あるいは生理食塩水１００μｌで希釈して腹腔内（ＩＰ）投与した。対照群にはＡＣＳＦ又は生理食塩水のみを与えた。各アンタゴニストはグレリンと同時に投与した。結果は平均値±ＳＥで示した。分散解析（ＡＮＯＶＡ）を行い、Bonferroniのｔ検定により群間の差を求めた。Ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意な差があるとした。
（２）ＩＣＶ投与
ＩＣＶ投与を行うためには、マウスをペントバルビタールナトリウム（８０−８５ｍｇ／ｋｇＩＰ）で麻酔し、実験前の７日間、定位固定装置（SR-6, Narishige, Tokyo, Japan）内においた。各頭蓋骨に、針を使って中央縫合の側方０．９ｍｍで前頂の０．９ｍｍ後方に穴をあけた。一端を長さ３ｍｍにわたって傾斜させた２４ゲージのカニューレ（Safelet-Cas, Nipro, Osaka, Japan）を第三脳室に埋め込みＩＣＶ投与用とした。カニューレを歯科用セメントで頭蓋骨に固定し、シリコンでふたをした。２７ゲージの注入用インサートをＰＥ−２０チュービングでミクロシリンジに取り付けた。マウスを拘束したり、行動を大きく制限することなく、これをピンセットで前記の固定したカニューレに挿入した。実験終了後、カニューレ端の位置を確認するために、色素（エバンスブルー０．５％及びゼラチン５％）を注入し、凍結脳セクションの組織学的実験に供した。
（３）迷走神経切断術（truncal vagotomy）
実験の４日前に、以下のようにして迷走神経切断術を行った。マウスをペントバルビタールナトリウム（８０−８５ｍｇ／ｋｇＩＰ）で麻酔した。腹壁の中央線を切開して、胃を暖かい食塩水で湿らせた滅菌ガーゼで覆った。食道下部を露出して、迷走神経の前方枝及び後方枝を切断した。手術の最後に腹壁を二重に縫合した。シャム（虚偽）手術マウスでは、同様に迷走神経幹を露出したが、切断はしなかった。迷走神経を切断したマウス及びシャム手術したマウスを完全栄養流動食（Oriental Yeast Co., Ltd. Tokyo, Japan）で飼育した。
（４）摂食試験
試験は１０時に開始した。摂食試験前に、マウスには自由に食餌と水を摂らせた。ただし、グレリンとＩＬ−１βのＩＰ共投与が摂食に及ぼす効果を調べる試験では、マウスに１６時間食餌を与えず、水のみ自由に摂らせた。摂食量の測定は、ＩＣＶ又はＩＰ投与の２０分、１時間、２時間及び４時間後に、予め測定して与えておいた食餌量から残った食餌量を差し引いて求めた。食餌制限をしなかったリーンマウスでは、グレリン（３ナノモル／マウス）、ＩＬ−１β（５ピコモル／マウス）もしくは生理食塩水を５日間繰り返しＩＰ投与した。マウスには７時と１９時に毎日注射した。摂食量と体重を毎日測定するとともに、毛並みの状態を観察した。
（５）ＲＮＡの単離とノーザンブロット分析
視床下部ブロックと胃からRNeasy Mini Kit (Qlagen, Tokyo, Japan）を用いてＲＮＡを単離した。全ＲＮＡをホルムアルデヒドで変性し、１％アガロースゲルで電気泳動し、Hybond N+ メンブラン（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）にブロットした（Ueno N. et al., Gastroenterology, 117:1427-1432, 1999）。メンブランを32Ｐ標識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて視床下部中のＮＰＹ ｍＲＮＡを測定し、ジゴキシゲニン標識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて胃中のグレリンｍＲＮＡを測定した。ハイブリダイズしたシグナルの全量をデンシトメトリ（Image Master 1D Elite ver 3.0, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）で測定した。データをグリセルアルデニド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡに正規化して対照群のパーセントで表示した。
（６）ＮＰＹ遺伝子発現
マウスを２４時間絶食させた。絶食期間中、ＩＣＶ投与する予定のマウスにはグレリン（１ナノモル／マウス）もしくはＡＣＳＦを１２時間毎に投与し、３回目の最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。ＩＰ投与する予定のマウスにはグレリン（３ナノモル／マウス）もしくは生理食塩水を８時間毎に投与し、４回目の最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。直ちに脳ブロックを切除してドライアイスで凍結し、ノーザンブロットを調製するまで−８０℃で保存した。
（７）グレリン遺伝子発現
リーンマウスを４８時間絶食させた。絶食期間中、絶食マウスにＩＬ−１β（５ピコモル／マウス）、レプチン（３ナノモル／マウス）もしくは生理食塩水を１２時間毎にＩＰ投与し、５回目の最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。絶食しないｏｂ／ｏｂマウスでは、レプチン（３ナノモル／マウス）もしくは生理食塩水を７日間繰り返し投与した。マウスには毎日７時と１９時に注射をし、最終投与の３０分後にマウスを頸部脱臼によって殺した。直ちに胃を切除してドライアイスで凍結し、ノーザンブロットを調製するまで−８０℃で保存した。
（８）酸素消費量
酸素消費量を２２℃でＯ2／ＣＯ2代謝測定システム（Model MK-5000, Muromachikikai, Tokyo, Japan）を用いて測定した（前出、Ueno N. et al.）。チャンバー容量は５６０ｍｌ、チャンバーへの空気の流速は５００ｍｌ／分であった。サンプルは３分ごとに取り出し、標準ガスサンプルは３０分毎に取り出した。マウスを明サイクル中で食餌、水を与えずに、またチャンバー中に拘束せずに入れて、ＢＩＢＯ３３０４（５ナノモル／マウス）の存在下もしくは不在下に、グレリン（１０時に０．３−１ナノモル／マウス）をＩＣＶ投与し、その２時間後の酸素消費量を測定した。
（９）胃内容排出速度
胃内容排出速度測定試験の前に、マウスを１６時間絶食させ、水は自由に摂らせた。絶食マウスに予め計量した食餌ぺレットを１時間自由に摂らせ、その後グレリンを投与した。投与後１又は２時間で再度マウスを絶食させた。摂食重量は残ったぺレットを計量して求めた。試験開始後２又は３時間後にマウスを頸部脱臼により殺した。ただちに胃を開腹術により露出し、幽門と噴門を素早く結紮して除去し、乾燥内容物重量を測定した。内容物は真空凍結乾燥システム（Model 77400, Labconco, Kansas, USA）で乾燥した。胃内容排出速度は以下の式によって計算した：
胃内容排出速度 (％)＝｛１−（胃から回収した食餌の乾燥重量／摂食重量）｝ｘ１００
（１０）電気生理学的研究
雄Ｗｉｓｔａｒラット（３００ｇ）をウレタン（１ｇ／ｋｇＩＰ）で麻酔し、気管カニューレを挿入した。解剖顕微鏡下で、迷走神経の胃分岐部（gastric branch）の末梢切断端から神経フィラメントを切り出して、一対の銀線電極で求心性の神経活性を記録した。神経活性の経時変化を観察するために、速度メータ（rate meter）（５秒の休止期間）を用いた（Niijima A., J. Nutr 130:971S-973S, 2000）。グレリン（３−３００フェムトモル／ラット）投与は下方大静脈（ＩＶ）に挿入した小さいカテーテルを介して行った。迷走神経活性に及ぼすグレリンの効果を、注射の前後５０秒にわたって、５秒ごとのインパルスの平均数を比較することで測定した。結果は平均値±ＳＥで表した。ＡＮＯＶＡ及びScheffe検定を行い、群間の差を評価した。Ｐ＜０．０５の場合を統計的に有意であると判定した。
実施例１：グレリンＩＣＶ投与の摂食に及ぼす効果
本実施例では、グレリンのマウス脳室（ＩＣＶ）投与の効果を試験した。絶食しないリーンマウスにＡＣＳＦ（対照）又はグレリン（０．００３−１ナノモル／マウス）をＩＣＶ投与した。薬剤投与の２０分、１時間、２時間及び４時間後に摂食量を試験した。得られた結果を図２に示す。結果は平均±ＳＥで表し、ｎは動物数を表す。*Ｐ＜０．０５及び**Ｐ＜０．０１は、Bonferroniのｔ検定によって対照群と比較した有意差である。グレリンは用量依存的に摂食量を顕著かつ有意に増加した。ＩＣＶ投与の２４時間後では、１ナノモルのグレリンを投与したマウスでは累積的摂食量も増加したが、これは統計的有意差ではなかった（６．３１±０．１０ｇ対５．６８±０．２１ｇ（対照群）：Ｐ＜０．０７６）。
【００４１】
実施例２：他のペプチドと比較したグレリンＩＣＶ投与の効果
ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシンＡ、オレキシンＢ及びＭＣＨと比較したグレリンのマウスＩＣＶ投与の効果を実施例１と同様にして、１ナノモル／マウスで試験した。結果を図３に示す。４時間での摂食増加能は、ＮＰＹ＞グレリン＞ＡＧＲＰ＞オレキシンＡ＞オレキシンＢ＞ＭＣＨの順であった。従って、グレリンはＮＰＹを除く全ての食欲亢進性ペプチドよりも強力であった。
【００４２】
実施例３：グレリンＩＣＶ投与のＮＰＹ遺伝子発現に及ぼす効果
グレリンがＮＰＹ経路を介して作用している可能性を試験するために、グレリンのＩＣＶ投与後の視床下部におけるＮＰＹ遺伝子の発現を上記した方法により調べた。得られた結果を図４に示す。上のパネルは、グレリンＩＣＶ投与後の視床下部ＮＰＹ ｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。下のグラフは、ノーザンブロットのデータをグリセルアルデニド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡに正規化して対照群のパーセントで表示したものである。グレリンはＮＰＹ ｍＲＮＡの発現を５８％も増加した。
【００４３】
実施例４：ＮＰＹの受容体アンタゴニストによる前処理がグレリン誘導の摂食増加に及ぼす効果
ＮＰＹのＹ１受容体アンタゴニスト（ＢＩＢＯ３３０４及びＪ１１５８１４）及びＹ５受容体アンタゴニスト（Ｌ１５２８０４）で前処理することが、グレリンで誘導された摂食に効果を及ぼすかどうかについて試験した。Ｙ１受容体アンタゴニストであるＢＩＢＯ３３０４及びＪ１１５８１４（５ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）はグレリン（１ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）で誘導される摂食を有意に阻害した。一方、Ｙ５受容体アンタゴニストのＬ１５２８０４（５ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）はこの効果を示さなかった（図５）。従って、グレリンはＮＰＹのＹ１受容体を介して作用していると考えられた。
【００４４】
実施例５：グレリンのＩＣＶ投与の酸素消費量に及ぼす効果
グレリンのＩＣＶ投与の酸素消費量に及ぼす効果を上記の方法を用いて試験した。得られた結果を図６に示す。グレリンは摂食促進したのと同じ用量（０．３−１ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）で酸素消費量を減少したが、これはＹ１受容体アンタゴニスト（ＢＩＢＯ３３０４：５ナノモル／マウス：ＩＣＶ投与）で前処理することによって阻害された。また、グレリンは、１ナノモルグレリンを投与したマウスで、ＩＣＶ投与の１時間（７．２４±６．９６％）及び２時間（５．１８±６．０１％）後に呼吸商（ＲＱ）を増加する傾向を示したが、統計的有意差には至らなかった。
【００４５】
実施例６：グレリンＩＰ投与の摂食及びＮＰＹ ｍＲＮＡ発現に及ぼす効果
ＩＰ投与したグレリンが同様な摂食亢進効果を示すかを絶食していないリーンマウスで試験した。グレリンのＩＰ投与は３ナノモル／マウスで顕著に摂食を増加した（図７）。３ナノモル／マウスのグレリンをＩＰ投与した２４時間後の蓄積摂食量はさらに有意に高かった（６．６８±０．１６ｇ対６．１０±０．１７ｇ（対照）：Ｐ＜０．０５）。この食欲亢進活性はＹ１受容体アンタゴニストであるＢＩＢＯ３３０４のＩＣＶ投与によってブロックされたが、Ｙ５受容体アンタゴニストのＬ１５２８０４ではブロックされなかった。グレリンのＩＰ投与後の視床下部ＮＰＹのｍＲＮＡ発現をノーザンブロットで試験したところ、１２％の発現増加が観察された（図８：なお、図８中のSalineは、対照群として食塩水を投与した群での結果を示す）。
【００４６】
実施例７：グレリンＩＰ投与の胃内容排出速度に及ぼす効果
グレリンが胃内容排出速度を増加するかどうかを上記の方法を用いて試験した。図９は、グレリン（０．３−１ナノモル／マウス）をＩＣＶ投与したときの１時間及び２時間後の胃内容排出速度を示す。ＩＣＶ投与でもＩＰ投与でも、グレリンは投与１時間後で胃内容排出速度を有意に増加した（３０．１６±３．７０％（３ナノモル）対２０．３４±２．２７％（対照）：Ｐ＜０．０５）。従って、グレリンはモチリンと同様に胃の運動を亢進する。
【００４７】
実施例８：迷走神経切断術がグレリンの摂食促進効果、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現及び胃迷走神経の求心性神経活性に及ぼす効果
グレリンの摂食促進効果が迷走神経を介する経路と関連するかどうかを上述した方法で迷走神経切断術を施したマウスで試験した。迷走神経切断術は侵襲的手術であるが、この手術によってグレリンのＩＰ投与で誘導された摂食促進効果が無くなった（図１０：なお、図１０中で、Shamはシャム手術群、Vagotomyは迷走神経切断術を施した群を示す）。ＩＰ投与したグレリンで誘導された視床下部ＮＰＹのｍＲＮＡ発現の有意な増加もこの手術によって無くなった（データ示さず）。上記の方法を用いて行った電気生理学的研究では、グレリンのＩＶ投与は胃迷走神経の求心性の神経活性を有意に減少した（図１１）。
【００４８】
実施例９：グレリンｍＲＮＡの胃での発現
グレリンｍＲＮＡの胃での発現をノーザンブロット分析で試験した。図１２に示すように、４８時間の絶食は、対照の絶食しないマウスに比べて有意に（１６％）グレリンｍＲＮＡを増加した（なお、図１２中で、Fedは絶食をしないマウス群を、Fastは絶食をしたマウス群を示す）。
【００４９】
胃でのグレリンｍＲＮＡ発現に何らかの異化物質が影響を及ぼしているかどうかを試験するために、ＩＬ−１β及びレプチンをＩＰ投与した。図１３に示すように、ＩＬ−１βとレプチンはいずれも胃におけるグレリンｍＲＮＡの発現を有意に減少した（ＩＬ−１βについては２３±２．８％、レプチンについては２２±３．５％）。
【００５０】
また、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスの胃におけるノーザンブロット分析を行った。任意量の食餌をさせたリーンマウスと比較して、ｏｂ／ｏｂマウスのグレリンｍＲＮＡ発現は有意に（１９％）上昇していた（図１４）。レプチンはｏｂ／ｏｂマウスにおいても、リーンマウスにおいても有意に（１７±３．２％：Ｐ＜０．０１）グレリンｍＲＮＡの発現を減少した。ｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを繰り返し投与すると、食塩水を与えた対照群と比較して、グレリンｍＲＮＡを有意に（３１％）減少し、また同時に摂食量と体重が減少した（図１５）。対照群及びｏｂ／ｏｂマウスのどちらにおいても視床下部のノーザンブロットではグレリンｍＲＮＡの発現を検出しなかった。
【００５１】
実施例１０：グレリンとＩＬ−１βを共投与したときの摂食量と体重に及ぼす効果
グレリンとＩＬ−１βを共投与したときの摂食量と体重に及ぼす効果を検討した。図１６に示すように、ＩＬ−１βで誘導される摂食減少はグレリンによってブロックされた。さらに、グレリンを繰り返し投与すると、ＩＬ−１βで誘導される摂食量と体重の減少を逆転した（図１７）。
【００５２】
また、ＩＬ−１βのみを投与した群では、毛並みが乱れ、全身状態の悪化が観察されたが、グレリンとＩＬ−１βを共投与した群では、毛並みが改善し、グレリンが悪液質に伴う全身状態の不良を改善することがわかった。
【００５３】
実施例１１：LC-6移植HHM/cahexiaモデルマウスに対するグレリンの影響
モデル動物として、ヒト肺癌細胞株LC-6を移植したHHMモデルマウスを用いた。このモデルマウスは悪液質に伴う体重減少を示すことが知られている（ＷＯ９８／１３３８８）。１群６匹のマウスにグレリンを３、０．３、０ nmol／個体を１０回（１日２回、１２時間おき、５日間）投与した。別途、腫瘍を移植していない正常群（ｎ＝５）を準備した。
【００５４】
０−５日目に体重測定を行い、また５日目には精巣周辺の脂肪重量を測定した。
得られた結果を図１８及び図１９に示す。３ nmol投与群は、０nmol投与群に比較して投与開始後３日目まで体重の増加が認められ、５日目まで持続した。また、３ nmol投与群は、０nmol投与群に比較して脂肪重量の増加が認められた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グレリン又はグレリン類似体を有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤。
【請求項２】
低栄養症状を示す疾患が食欲不振、悪液質又は悪性疾患、感染症及び炎症性疾患による付随的体重減少による衰弱状態から選ばれる疾患である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
悪液質に伴う食欲不振症又は体重減少症治療剤である請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
末梢投与用である請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
グレリンの存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することを含む、グレリン又はグレリン類似体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により得られるグレリン又はグレリン類似体のアゴニストを有効成分として含有する食欲不振症又は体重減少症治療剤。
【請求項７】
請求項５記載の方法により得られるグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤。
【請求項１】
グレリン又はグレリン類似体を有効成分として含有する低栄養症状を示す疾患の治療剤。
【請求項２】
低栄養症状を示す疾患が食欲不振、悪液質又は悪性疾患、感染症及び炎症性疾患による付随的体重減少による衰弱状態から選ばれる疾患である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
悪液質に伴う食欲不振症又は体重減少症治療剤である請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
末梢投与用である請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
グレリンの存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することを含む、グレリン又はグレリン類似体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により得られるグレリン又はグレリン類似体のアゴニストを有効成分として含有する食欲不振症又は体重減少症治療剤。
【請求項７】
請求項５記載の方法により得られるグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤。
【図１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１９】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−６８２３（Ｐ２０１０−６８２３Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９００３７（Ｐ２００９−１９００３７）
【出願日】平成２１年８月１９日（２００９．８．１９）
【分割の表示】特願２００２−５６０６６３（Ｐ２００２−５６０６６３）の分割
【原出願日】平成１４年１月３１日（２００２．１．３１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１９日（２００９．８．１９）
【分割の表示】特願２００２−５６０６６３（Ｐ２００２−５６０６６３）の分割
【原出願日】平成１４年１月３１日（２００２．１．３１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
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