保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
【課題】臨床診断における遺伝子検査に使用する核酸増幅検出試薬の性能を維持するための試薬を提供する。
【解決手段】ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬を、２以上の液状組成物で構成し、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とを、別の液状組成物中に配合することにより、保存安定性を向上させる。
【解決手段】ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬を、２以上の液状組成物で構成し、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とを、別の液状組成物中に配合することにより、保存安定性を向上させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応において使用される試薬の性能を維持する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲによる核酸増幅検出反応は、多くの異なる試薬を必要とする。主な試薬には、核酸増幅酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標的核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウムイオン及び他の緩衝液が含まれる。さらに増幅産物を検出するための色素標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＤＮＡ結合色素、例えば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（商標登録）も核酸増幅検出反応に必要な試薬である。
これらの試薬の中には周囲温度、圧力及び湿度条件によっては安定でないものがある。そこで従来は、不安定な試薬については予め別々の容器に入れて−２０℃以下で保存しておき、核酸増幅検出反応を行う際に、従事者が保存されている各試薬を取り出して、最適な方法にて慎重に反応液を調製していた。このような反応液の調製は、遺伝子工学や分子生物学が専門の研究者にとっては、とりわけ特別な操作ではなかった。
【０００３】
ところが、最近の核酸増幅検出技術の進歩によって、遺伝子検査は従来の検査法よりも感度が高いことを理由に、感染症など様々な分野に応用されるようになってきた。これらの分野においては、たとえば、病院の検査技師が臨床診断に利用する時など、試薬を扱うのは必ずしも遺伝子に取り扱いに慣れた専門家ではなく、また、高度な専門知識を有する者でもないことが多い。
このような場合、複雑な操作なく取り扱える、自動化装置で分注しやすい等、簡便な取り扱いが可能な試薬形態が望まれる。さらに、一般に検査に用いる試薬の場合、凍結保存されている試薬を解凍して使用するよりも液状で保存されている試薬の方が、解凍の手間や時間が省けるため好まれる。
【０００４】
このような要望を満たす試薬を供給するために、まず考えられることは、核酸増幅検出反応に必要な試薬を全て混合することによって使用しやすくすることだが、液状の試薬を常温で保存した場合は極端に試薬の性能が低下することが知られている。また、−２０℃の凍結保存であってもＤＮＡポリメラーゼの反応開始基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを含めると非特異反応の増加によって試薬の性能が低下することがあった。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲを行うための増幅検出試薬として用いられている方法の一つにＴａｑＭａｎ（登録商標）法がある。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、供与体および受容体分子で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。このプローブは、ＰＣＲ増幅産物の一方の鎖の特異的領域に結合するよう設計される。ＰＣＲプライマーがこの鎖にアニールした後、Ｔａｑ酵素が５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｔａｑ伸長の開始を防ぐために、３’末端がリン酸化で保護されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションすると、伸長するＴａｑＤＮＡポリメラーゼがプローブを５‘から加水分解し、検出の基本として受容体から供与体を遊離する。この場合のシグナルは累積的であり、遊離の供与体と受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する（非特許文献１）。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲを行うための増幅検出試薬として用いられている別の方法として、特許文献１には３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプライマーを用いてＰＣＲを行なうＱ−Ｐｒｏｂｅ法が開示されている。これにより、当該蛍光の変化を確認することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
通常、蛍光色素の劣化は起こりうるものと考え、標準物質などを追加して検出し、得られた蛍光値を基準として補正する方法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２８６３００号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．７２７６−７２８０，Ａｕｇｕｓｔ，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＴａｑＭａｎ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法は蛍光標識されたプローブを用いて核酸を検出するための技術であり、ＤＮＡポリメラーゼが働き核酸を増幅すると同時に検出できるホモジニアス検出の技術である。どちらも蛍光を検出することから蛍光プローブの発する蛍光量の維持は非常に重要な課題である。また、増幅と検出を同時に行うことから反応液を構成する試薬成分も多く、保存安定性の良好な反応液の調製は容易ではなかった。従来の試薬の保存安定化方法では蛍光プローブを含めた試薬の保存安定化方法についての報告はなされていなかった。
【００１０】
さらに、ホモジニアス検出においては、標的となる核酸を増幅する酵素の活性の維持も重要な課題となる。蛍光プローブの蛍光をできるだけ保持したまま、酵素を安定させて、簡便に使用できる状態で保存させるための有用な方法はこれまで報告されてなかった。
【００１１】
本発明の目的は、臨床診断における遺伝子検査に使用する核酸増幅検出試薬の性能を維持するための試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、核酸増幅検出反応に必要な試薬を２つの容器に分け、主要成分を最適に組み合わせることによって、蛍光標識プローブを安定して保存する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１３】
［項１］
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
（１）該試薬が２以上の液状組成物から構成され、該試薬を使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該試薬には、ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識プローブとが、別な液状組成物中に配合されている。
［項２］
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、マグネシウムイオンを含む、項１に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項３］
マグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、項２に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項４］
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項５］
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項６］
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項７］
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、さらにオリゴヌクレオチドプライマーを含む、項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項８］
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いるキット。
（１）該キットが２以上の液状組成物から構成され、該キットを使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該キットには、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とが、別な液状組成物中に配合されている。
［項９］
（ａ）におけるマグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、項８に記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１０］
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、項８または９に記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１１］
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、項８〜１０のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１２］
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、項８〜１１のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１３］
試薬組成物（ａ）に、オリゴヌクレオチドプライマーを含む、項８〜１２のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、臨床診断において核酸増幅検出反応が簡便、迅速に行うことができる。具体的には、凍結せずに保存するため凍結融解を繰り返すことなく増幅検出反応液の調製が可能であり、かつ試薬性能を長期間保持することのできる試薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】温度変化における消光プローブの蛍光変化解析結果を示す図である。
【図２】温度変化における消光プローブの蛍光変化量を表す検出ピークを示す図である。
【図３】Ａの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図４】Ｂの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図５】Ｃの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図６】Ｄの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図７】Ｅの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図８】Ｆの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図９】Ｇの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１０】Ｈの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１１】Ｃの試薬形態で、８℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１２】Ｈの試薬形態で、８℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１３】ｐＨ６．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１４】ｐＨ７．０、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１５】ｐＨ７．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１６】ｐＨ８．０、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１７】ｐＨ８．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１８】ｐＨ９．０、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１９】ｐＨ９．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法である。
（１）該試薬が２以上の液状組成物から構成され、該試薬を使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該試薬には、ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識プローブとが、別な液状組成物中に配合されている。
【００１７】
ＰＣＲによる核酸増幅反応を行う試薬は通常研究に用いる場合、−２０℃以下で凍結保存されていることが多い。使用する場合は室温で融解した後必要量を分取し、その後は再び凍結にて保存されている。凍結して保存するとこのような室温解凍を使用時に行う必要があり、迅速かつ簡便な臨床検査には適さない。本発明においては、迅速かつ簡便に使用できるように凍結融解を行わずに使用できる試薬を前提としている。０℃〜４０℃は凍結融解なしに核酸増幅試薬を使用できる温度であり、試薬が凍結しない温度である。
【００１８】
ＰＣＲによる核酸増幅反応は、多くの異なる試薬を必要とする。主な試薬成分には、ＤＮＡポリメラーゼのような増幅酵素、反応の基質となるヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応を開始するための標的物質に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、酵素を活性化させるマグネシウムイオン、及び他の緩衝液が含まれる。さらに、リアルタイムＰＣＲまたは増幅後に検出が必要な場合では、色素標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標登録）などのＤＮＡ結合色素、および内部対照核酸を含む。
【００１９】
これらの試薬成分の中には特定の成分と混合して保存することで、増幅酵素の活性が低下したり、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブが加水分解したり、オリゴヌクレオチドプローブに標識された蛍光色素やＤＮＡ結合色素が劣化したりする組み合わせが存在する。
例えば、マグネシウムイオンとＤＮＡポリメラーゼを混合して保存するとＤＮＡポリメラーゼの活性が低下することが一般的に知られている。ＤＮＡポリメラーゼと反応開始剤となるオリゴヌクレオチドプライマーを混合して保存しても非特異産物ができることで特異的な反応ができなくなることも知られている。また、二価の金属イオンとオリゴヌクレオチドを混合すると、溶液中に微量に存在するＤＮａｓｅが活性化されてオリゴヌクレオチドが加水分解されやすくなることも知られている。
【００２０】
本願でいう安定性とは、広義では増幅反応試薬の増幅性能が維持されること、または検出試薬の蛍光色素の蛍光が維持されていることを意味し、具体的にはＤＮＡポリメラーゼの活性が維持され、オリゴヌクレオチドプライマーが加水分解されずに配列が維持され、かつ蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの蛍光色素がプローブから乖離せず、蛍光色素の蛍光量が維持されていることを言う。
【００２１】
一般的に増幅試薬の性能は主にＤＮＡポリメラーゼの活性とオリゴヌクレオチドプライマーの性能に大きく左右されている。増幅試薬の性能を維持する保存安定化方法についてはこの２種類の試薬成分をいかに安定的に保存するかが決め手となる。
ＤＮＡポリメラーゼは活性を抑えた状態で保存することが安定化につながる。そのためには、ＤＮＡポリメラーゼの活性をおさえるための方法を施せばよく、そのような方法としては特に限定されないが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いる方法、アプタマーを用いる方法、ＢＳＡを使用する方法を併用することが好ましい。さらにできるだけ低温で保存する方法やＤＮＡポリメラーゼを凍結乾燥する方法なども組み合わせて使用できる。
オリゴヌクレオチドプライマーは加水分解されることによって顕著な性能低下を引き起こす。特に３‘末端が加水分解によって短くなると二本鎖結合能が大きく変化し、配列特異的な結合ができなくなる可能性がある。この加水分解はＤＮａｓｅが働ことで生じるため、ＤＮａｓｅの混入を防ぐあるいはＤＮａｓｅの活性をおさえることがオリゴヌクレオチドプライマーの安定化に必要である。
【００２２】
増幅試薬を安定的に保存するためにはＤＮＡポリメラーゼの活性とオリゴヌクレオチドプライマーの性能を保てればよく、両立させることができれば最適である。しかしながらこれらの増幅試薬の主成分を２つの容器に分ける場合、ＤＮＡポリメラーゼを活性化するマグネシウムイオンは同時にＤＮａｓｅの活性化因子でもあるため両立は困難である。この両者のバランスを最適なものにするために、マグネシウムイオンとオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、ＤＮａｓｅをできる限り除去した溶液を調製して保存することが好ましい。
【００２３】
一般的に検出試薬の性能は蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（以下プローブと略する）が持つ蛍光量とプローブの配列に依存されるハイブリダイゼーション能による。検出試薬の性能を維持する保存安定化方法についてはプローブの持つ２種類の能力をいかに維持したままプローブを保存するかが決め手となる。
蛍光量については、例えば保存する緩衝液のｐＨにも左右される。ｐＨを適した状態に保つことも一つの安定化させうる方策である。蛍光色素の種類によってはＥＤＴＡなどの金属キレート剤を保存溶液中に含むことで本来持つ蛍光量から大幅に減少するものも存在する。
プローブの配列に関しては、オリゴヌクレオチドプライマーと同様に加水分解されることによって顕著なハイブリダイゼーション能力の低下を引き起こす。この加水分解はＤＮａｓｅが働ことで生じるため、ＤＮａｓｅの混入を防ぐあるいはＤＮａｓｅの活性をおさえることがプローブの安定化に必要である。
【００２４】
増幅検出試薬を安定的に保存するためには試薬の増幅性能と検出性能を両立させることができれば最適である。増幅試薬の主成分を２つの容器に分ける場合、ＤＮＡポリメラーゼを活性化するマグネシウムイオンは同時にＤＮａｓｅの活性化因子でもあるため両立は困難である。この両者のバランスを最適なものにするために、マグネシウムイオンとオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、ＤＮａｓｅをできる限り除去した溶液を調製して保存することが好ましい。ここにホモジニアス増幅検出反応などで検出試薬を加える場合は、オリゴヌクレオチドプライマーを含む容器にプローブを含めることが好ましい。
【００２５】
通常専門家でない者が使用する場合は、簡便にするためにできるだけ混合した状態で保存することが良く、例えば４つに分けて保存することが好ましく、３つに分けて保存することはより好ましい。２つに分けて保存することはさらに好ましい保存方法である。核酸増幅反応に必要な全ての試薬を混合して保存することは、上述した通り活性が低下するため、本発明には適さない。
【００２６】
蛍光色素標識プローブ
蛍光色素は一般にオリゴヌクレオチドに標識して、核酸の測定および検出に用いられるものが使用できるが、蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、蛍光標識プローブとも示す。）が標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、オリゴヌクレオチドに標識した当該蛍光色素が検出に有利に働くものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）またはその誘導体類、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）若しくはその誘導体等、Ａｌｅｘａ 類、ＴＡＭＲＡ 、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇ（Ｒ６Ｇ）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ｔｅｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（ＴＭＲ）、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ｒｅｄ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）類（商標名；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製、米国）、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類からなる群より選ぶことができる。好適なものとしてフルオロセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッドが挙げられる。
【００２７】
蛍光標識プローブに標識する蛍光色素は、核酸増幅工程中分解もしくは蛍光が減衰しなければよく、ハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質であればよい。特に蛍光標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光物質が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用できるが、ＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇの使用が特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなどの他の二重鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、また、ＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光色素に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。蛍光標識プローブの塩基配列中の蛍光色素の標識位置は、特に限定されないが、末端に標識されていることがより好ましい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、第３０３〜３０８頁、１９９６年; Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６３巻、第１１４３〜 １１４７頁、１９９７年; Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、第４５３２〜４５３５頁、１９９６年）。例えば、５´末端に蛍光色素を結合させる場合は、先ず常法に従って５’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ２)ｎ−ＳＨを導入する。これらの導入体は市販されている製品を用いてもよい（グレンリサーチ社）。この場合、ｎは３〜８の整数、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光体基で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されている製品を用いてもよい（グレンリサーチ社）。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨを導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７の整数である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光体基又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光体基で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００３０】
核酸プローブの鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２２５巻、第３２−３８頁（１９９８年））。この場合、市販の蛍光色素が既に結合した状態のチミンアミダイト（グレンリサーチ社）を使用すると便利である。
【００３１】
蛍光標識プローブを保存する時のｐＨは６．５以上８．５未満が好ましく、ｐＨ７．０以上７．５未満がより好ましい。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼは一般的に核酸増幅反応に使用できるものであればよく、現在知られているＤＮＡポリメラーゼ（単独あるいは組みあわせ）としてのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼや，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ（以上はＰｏｌＩ型酵素），Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標），Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ（以上はα型酵素）などが挙げられる。
天然型のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を公知の手段により、１もしくは数個が欠失、置換若しくは付加させたもの（変異体）であっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、もしくは変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、もしくは変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。
例えば、最も一般的であるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡績製のもの（製品コードＫＯＤ−１０１など）を容易に入手することができる。
【００３３】
ＤＮＡポリメラーゼはさらに、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことが好ましい。本発明では標識プローブからの蛍光変化量を標的核酸の検出に利用することがある。そのため、高速ＰＣＲ工程中で第一のプライマーによる伸長産物に対して標識プローブ及び第二のプライマーがハイブリダイゼーションしている場合に、５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは標識プローブを分解し、非特異シグナルの増加を伴う。５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００３４】
ｄＮＴＰｓ
ｄＮＴＰｓは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの混合物であり、核酸増幅反応の基質物質である。４つの化合物をそれぞれ等量ずつ混合することが好ましい。凍結保存しない環境下では、ｄＮＴＰｓはＤＮＡポリメラーゼを含む溶液中に含むことが好ましい。ｄＮＴＰｓの濃度は特に限定されるものではないが、５０ｍＭ以上５００ｍＭ以下が好ましい。これらは種々市販されている。
【００３５】
マグネシウムイオン
マグネシウムイオンは、通常塩の状態の化合物を利用する。核酸増幅反応に適したマグネシウム塩が好ましい。
本発明において、マグネシウム塩は水性溶媒中にマグネシウムイオンが放出されるような形態でマグネシウムを含有するあらゆる物質を表すものとする。マグネシウム塩には、塩化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび硫酸マグネシウム等が例示されるが、これらに限定されるものではない。特に、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムが好ましい。
【００３６】
マグネシウムイオンの濃度は、特に限定されないが１ｍＭから８ｍＭの最終反応用液の濃度となるように調整されることが好ましい。
最終濃度１ｍＭから８ｍＭとは核酸増幅反応に使用する好適なマグネシウム濃度を示しており、試薬の保存に際しては、最終的に他の試薬混合液と混合するためさらに高い濃度で保存されている。例えば全量５０μＬの核酸増幅反応系であって、１２．５μＬのＤＮＡポリメラーゼ含有混合物と１２．５μＬのマグネシウム含有混合物を加える場合は、最終液量が４倍となるため保存中のマグネシウムイオン濃度は４ｍＭから３２ｍＭが好ましい。濃縮倍率は２試薬を混合する場合、２倍から１０倍が適した範囲であり、好ましくは２倍から８倍、更に好ましくは３倍から５倍で保存することが好ましい。このような濃縮倍率を考慮した時のマグネシウムイオン濃度は特に限定はしないが２ｍＭから４０ｍＭが好ましい。より好ましくは、３ｍＭから４０ｍＭである。２ｍＭ未満の場合、例えば５倍濃縮では０．４ｍＭ未満のマグネシウムイオン濃度となってしまうため、ＤＮＡポリメラーゼが活性化されずにＰＣＲ増幅が起こらない可能性がある。また、４０ｍＭを超えると溶解するマグネシウム塩の濃度が高すぎるため調製が難しい。
【００３７】
このほか、本発明の方法においては、反応に影響を及ぼさない範囲で緩衝液、アミノ酸またはタンパク質、糖類、還元剤多価アルコールなどを必要により適宜各液状組成物に配してもよい。
緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００ｍＭの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９（２５℃））が例示できる。好ましくはトリス緩衝液である。好ましい緩衝ｐＨ範囲は７〜９である。
アミノ酸又はタンパク質としては、グルタミン酸ソーダ、アルブミン、スキムミルク等、糖としてはシュクロース、マルトース等、還元剤としてはグルタチオン、メルカプトエタノール等、多価アルコールとしてはグリセロール、ソルビトールなどが含まれていても良い。
また、界面活性剤などが含まれていても良い。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤がよく、好ましくＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０などが例示される。界面活性剤は、反応段階、すなわち、ポリメラーゼ反応時に、０．０００１〜１％になるように含まれていてもよく、好ましくは０．００１〜０．１％がよい。
【００３８】
一方、ＤＮＡポリメラーゼを含む混合液の濃度は、できる限り濃度の高い状態での保存が好ましいが、混合時の操作の簡便性を考慮すると、濃縮倍率が２倍から１０倍の範囲、好ましくは２倍から８倍、更に好ましくは３倍から５倍で保存することが好ましい。
【００３９】
核酸増幅検出反応に用いるキット
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いるキットである。
（１）該キットが２以上の液状組成物から構成され、該キットを使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該キットには、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とが、別な液状組成物中に配合されている。
【００４０】
本発明のキットにおける各液状組成物の調製方法は特に限定されるものではないが、上述の方法が例示できる。
【００４１】
以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に特に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
（検体の採取）
胃生検材料より遺伝子をＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。抽出されたＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００４３】
（テンプレートプラスミドの調製）
１μＬの抽出されたＤＮＡ溶液を鋳型として用い、ＰＣＲを実施した。ここで使用したプライマーペアは、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を全長増幅できるプライマーを使用した。いずれもピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ２７２７０）の公知の配列から設計した。
【００４４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、全量を２６μＬとして実施した。１μＬのＤＮＡ溶液と試薬混合物（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ０．５Ｕ、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、２００μＭのｄＮＴＰｓ、各々５μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・１５秒の変性工程、６０℃・３０秒のアニーリング工程、６８℃・６０秒の伸長工程のサイクルを３５回繰り返した。得られた核酸断片を制限酵素によって平滑末端切断されたｐＵＣ１８へライゲーションし、コンピテントセルＪＭ１０９を用いて形質転換体の取得を行なった。目的核酸断片が挿入された形質転換体を液体培養しプラスミドを抽出した。
【００４５】
得られたプラスミドの核酸配列をオートシークエンサーにより解析し、ピロリ菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子野生型の塩基配列を有するプラスミドを得た。以下、野生型をＷＴと示す。
【００４６】
（プライマー及び標識プローブの合成）
検出に使用するプライマー及び蛍光標識プローブは核酸合成受託会社に合成を委託して入手した。
【００４７】
使用した蛍光標識プローブ及びプライマーの塩基配列を示す。
標識プローブは配列番号１に示す１６塩基の配列、プライマーＦは配列番号２の２５塩基に示す配列、プライマーＲは配列番号３の２６塩基に示す配列である。
【００４８】
（野生型ピロリ菌の検出）
表１には、全量１０μＬで各試薬を要時調製により調製した反応組成を示す。核酸増幅には、東洋紡績製のＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を利用したＰＣＲ法を用いた。検出には蛍光標識されたプローブが標的核酸とハイブリダイゼーションした時に消光するＱＰｒｏｂｅ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ａ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ ｏｒ ｐｒｉｍｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１， Ｖｏｌ． ２９， Ｎｏ．６， ｅ３４）を利用した。表１の組成をもとにした反応組成の最適化は同業者であれば容易に行える。プラスミドＤＮＡ量は全量１０μＬの系で約１０００コピー含まれるように調製した。ＰＣＲ増幅時の反応条件および検出条件は表２の通りである。増幅及び蛍光の測定には、ロシュ・ダイアグノスティック製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用した。以下、特に記載がない場合は全てライトサイクラー（登録商標）での測定とする。融解曲線解析においては標識プローブが標的核酸から解離する時の蛍光量の増加を検出している。
ＷＴ（野生型）を含む試料とＮＣ（ネガティブコントロール：水をテンプレートに使用）とを、それぞれ上記条件で増幅・検出し、ライトサイクラーソフトウェアによる解析により、図１と図２の解析結果が得られた。図１の縦軸は蛍光強度を、横軸は温度（℃）を示している。図２の縦軸は蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（−ｄＦ／ｄｔ）で蛍光の変化量を、横軸は温度（℃）を示している。
図１では融解曲線解析における標識プローブの蛍光変化が示されている。ＷＴでは温度を上げていくと標識プローブが標的核酸から解離し、７５℃の時の蛍光値は標識プローブが標的核酸から完全に解離した時の蛍光値である。解離蛍光値はＮＣ（水をテンプレートに使用したとき）の４０℃における蛍光値を示し、蛍光標識プローブの蛍光量の基準とすることができる。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
解析の結果、図１では融解曲線解析における標識プローブの蛍光変化が示されている。７５℃の時の蛍光値は標識プローブが標的核酸から完全に解離した時の蛍光値である。解離蛍光値は水をテンプレートに使用したときの４０℃における蛍光値を示し、蛍光標識プローブの蛍光量の基準とすることができる。また図２では融解曲線解析における標的核酸と蛍光標識プローブの解離を示す検出ピークが示されている。検出ピークは蛍光標識プローブとハイブリダイゼーションする標的核酸の存在を示している。
【実施例２】
【００５２】
３５℃保存による増幅検出試薬性能の検討
（試薬の保存）
増幅検出試薬の試薬組成を表１に示す成分量に固定した。増幅検出試薬の主要成分をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、マグネシウムイオン、プライマーセット、蛍光標識プローブの５つに分類し、各成分を２つの試薬混合液に分けて保存した。表３に示されるように各成分を組み合わせて３通りの試薬混合液セットを調製した。プローブおよびプライマーは実施例１に記載の標識プローブ、プライマーＦおよびプライマーＲを使用した。各試薬混合液は、１．５ｍＬのスクリュー付チューブに入れて、遮光ラックに整理した。保存方法は、３５℃保存の場合は三洋電機製ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＭＩＲ−１５３に保存し、設定温度を３５℃に設定した。８℃保存の場合は三洋電機製ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＭＩＲ−５５３に保存し、設定温度を８℃に設定した。使用時には２つの試薬混合液を混ぜてから使用した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
（試薬の測定）
ＤＮＡポリメラーゼ混合溶液２．５μＬ、プライマー混合溶液２．５μＬ、プラスミドＤＮＡ溶液５μＬを混合した反応液１０μＬを調製した。テンプレート量は５μＬ中に約１０００コピー含まれるように調製し、その他は実施例１の方法に従って実施した。３５℃保存の試薬には１週間毎に測定し、１０週間まで測定を行った。
【００５５】
（データの解析）
ライトサイクラー（商標登録）付属の解析ソフトを利用して図１から解離蛍光値、図２に示される検出ピークの高さから測定値を算出して増幅検出試薬の保存安定性の解析に用いた。解離蛍光値は融解曲線解析の４０℃における蛍光値をそのまま用い、蛍光標識プローブの基本となる蛍光値を示しており、解離蛍光値で蛍光標識プローブの劣化が確認できる。増幅検出試薬性能の確認方法は測定値の高さで比較できる。測定値は融解曲線解析の蛍光値を微分したグラフで見られる検出ピークの高さの絶対値の１０倍の値を用いている。
【００５６】
（結果）
３５℃保存試薬の保存安定性の解析結果を図３から図６に示す。図３から図６に示されるように試薬成分の組み合わせをＡからＤにすると１３週間目の測定結果でも解離蛍光値が検出できていた。これらの組み合わせによる増幅検出試薬の保存では蛍光標識プローブが１３週間目でも蛍光を示していたことから安定性の優れた保存方法であるといえる。ＡからＤに共通した組成は、酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと蛍光標識プローブを別々の混合液として保存していることである。また、蛍光標識プローブの保存液性がｐＨ７．４であることも蛍光標識プローブを安定して保存できる一つの要因である。
【００５７】
さらにＡまたはＢとＣまたはＤを比較すると、全て１３週間目まで蛍光値の維持は可能であるが、ＡまたはＢについては測定値が１０週間目で０になっていた。ＡまたはＢは酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとマグネシウムイオンが混合されて保存されているため、酵素の活性が低下したことが原因であると考えられる。この結果から、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと蛍光標識プローブを分けて保存することで蛍光標識プローブの蛍光を安定させることに加えて、蛍光標識プローブを含む試薬混合液にマグネシウムイオンを混合することで酵素の活性を維持できるＣまたはＤの組み合わせで保存することが増幅検出試薬の保存方法として好ましいことがわかった。
【比較例１】
【００５８】
（方法）
試薬の保存、試薬の測定、データの解析は実施例２に従って実施した。表４に示されるように、５つに分類された増幅検出試薬の主要成分のうち、酵素と蛍光標識プローブを混合して保存している試薬混合液セット４種類を調製した。実施例２と同様に３５℃で保存した。
【００５９】
【表４】
【００６０】
（結果）
図７から図１０に３５℃保存の結果を示す。ＥからＨまでの４種類の試薬混合液セットでは、１３週間目の解離蛍光値がライトサイクラーの検出感度を下回り、蛍光値は０を示した。また、Ｆ、Ｇ、Ｈは解離蛍光値よりも酵素活性の低下が早く、増幅検出試薬としての増幅検出性能が消失している。これに対し、Ｅでは酵素活性は維持されているが蛍光標識プローブの劣化によりライトサイクラーの検出感度以下の蛍光値となったため、１３週間目では増幅検出性能を消失した。この結果から、ＫＯＤと蛍光標識プローブを混合して保存すると蛍光標識プローブの蛍光の劣化が促進されることがわかった。
【実施例３】
【００６１】
８℃保存による増幅検出試薬性能の検討
試薬の保存、試薬の測定、データの解析は実施例２に従って実施した。表２のＣの試薬混合セットおよびＨの試薬混合セットを使用した。８℃保存の試薬は１ヶ月ごとに、１６ヶ月まで測定を行った。
【００６２】
（結果）
８℃保存試薬の保存安定性の解析結果を図１１または図１２に示す。図１１から試薬成分の組み合わせをＣにすると、１６ヶ月目の測定結果でも解離蛍光値は１．２を超えていた。また図１２から試薬成分の組み合わせをＨにすると１６ヶ月目の測定結果で解離蛍光値は１．２以下となっていた。Ｈの組み合わせでは、増幅検出試薬の性能のうち蛍光標識プローブの蛍光が低下していることを示している。３５℃保存の結果と同様にＣの組み合わせにより保存した増幅検出試薬は冷蔵で１６ヶ月間保存しても、大幅な蛍光値の低下はないことがわかった。さらにＣで１６ヶ月間保存しても増幅検出試薬の性能の指標となる測定値も維持されていることがわかった。
【実施例４】
【００６３】
（試薬の保存）
３５℃保存した時の、ｐＨ変化における蛍光標識プローブの経時的な変化について検討した。蛍光標識プローブの保存用溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ２ＳＯ４ ｐＨ６．５〜９．５）を調製した。さらに、各保存用溶液に配列番号１に示される蛍光標識プローブ１μＭとなるように加えて蛍光標識プローブ溶液とした。各蛍光標識プローブ溶液は１．５ｍＬのスクリュー付チューブに５００μＬを入れて、遮光ラック内に静置した。保存方法は、三洋電機製ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＭＩＲ−１５３に保存し、設定温度を３５℃に設定した。
【００６４】
（試薬の測定）
各蛍光標識プローブ溶液を１×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒで５倍希釈した溶液を調製した。２０μＬをライトサイクラー（商標登録）専用ガラスキャピラリーに充填し、ライトサイクラー（商標登録）のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒモードにて測定温度を３０℃に設定して５３０ｎｍの蛍光の測定を実施した。３５℃保存の各蛍光標識プローブ溶液は１週間毎に、６週間まで測定を行った。
【００６５】
（データの解析と結果）
ライトサイクラー（商標登録）における蛍光測定結果をｐＨ毎にまとめてグラフを作成した。結果を図１３から図１９に示す。０週間目と６週間目の蛍光値の差で比較した時に、ｐＨ８．５以上の溶液中で保存した場合２．０以上であり、ｐＨ８．５未満で保存した時は２．０未満であった。さらに、ｐＨ７．０およびｐＨ７．５では０週間目と６週間目の蛍光値の差が１．５未満となっておりより蛍光色素の劣化が抑えられていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、従来凍結保存により成分ごとに保存されていた核酸増幅検出試薬を冷蔵保存可能な試薬混合液で保存することにより、より簡便、迅速に試薬調製が行うことができる。調製が簡便なため、核酸増幅技術に専門的な知識を有しない臨床診断の場でも容易に核酸増幅検出を利用した遺伝子検査が可能となり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応において使用される試薬の性能を維持する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲによる核酸増幅検出反応は、多くの異なる試薬を必要とする。主な試薬には、核酸増幅酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標的核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウムイオン及び他の緩衝液が含まれる。さらに増幅産物を検出するための色素標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＤＮＡ結合色素、例えば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（商標登録）も核酸増幅検出反応に必要な試薬である。
これらの試薬の中には周囲温度、圧力及び湿度条件によっては安定でないものがある。そこで従来は、不安定な試薬については予め別々の容器に入れて−２０℃以下で保存しておき、核酸増幅検出反応を行う際に、従事者が保存されている各試薬を取り出して、最適な方法にて慎重に反応液を調製していた。このような反応液の調製は、遺伝子工学や分子生物学が専門の研究者にとっては、とりわけ特別な操作ではなかった。
【０００３】
ところが、最近の核酸増幅検出技術の進歩によって、遺伝子検査は従来の検査法よりも感度が高いことを理由に、感染症など様々な分野に応用されるようになってきた。これらの分野においては、たとえば、病院の検査技師が臨床診断に利用する時など、試薬を扱うのは必ずしも遺伝子に取り扱いに慣れた専門家ではなく、また、高度な専門知識を有する者でもないことが多い。
このような場合、複雑な操作なく取り扱える、自動化装置で分注しやすい等、簡便な取り扱いが可能な試薬形態が望まれる。さらに、一般に検査に用いる試薬の場合、凍結保存されている試薬を解凍して使用するよりも液状で保存されている試薬の方が、解凍の手間や時間が省けるため好まれる。
【０００４】
このような要望を満たす試薬を供給するために、まず考えられることは、核酸増幅検出反応に必要な試薬を全て混合することによって使用しやすくすることだが、液状の試薬を常温で保存した場合は極端に試薬の性能が低下することが知られている。また、−２０℃の凍結保存であってもＤＮＡポリメラーゼの反応開始基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを含めると非特異反応の増加によって試薬の性能が低下することがあった。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲを行うための増幅検出試薬として用いられている方法の一つにＴａｑＭａｎ（登録商標）法がある。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、供与体および受容体分子で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。このプローブは、ＰＣＲ増幅産物の一方の鎖の特異的領域に結合するよう設計される。ＰＣＲプライマーがこの鎖にアニールした後、Ｔａｑ酵素が５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｔａｑ伸長の開始を防ぐために、３’末端がリン酸化で保護されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションすると、伸長するＴａｑＤＮＡポリメラーゼがプローブを５‘から加水分解し、検出の基本として受容体から供与体を遊離する。この場合のシグナルは累積的であり、遊離の供与体と受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する（非特許文献１）。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲを行うための増幅検出試薬として用いられている別の方法として、特許文献１には３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプライマーを用いてＰＣＲを行なうＱ−Ｐｒｏｂｅ法が開示されている。これにより、当該蛍光の変化を確認することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
通常、蛍光色素の劣化は起こりうるものと考え、標準物質などを追加して検出し、得られた蛍光値を基準として補正する方法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２８６３００号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．７２７６−７２８０，Ａｕｇｕｓｔ，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＴａｑＭａｎ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法は蛍光標識されたプローブを用いて核酸を検出するための技術であり、ＤＮＡポリメラーゼが働き核酸を増幅すると同時に検出できるホモジニアス検出の技術である。どちらも蛍光を検出することから蛍光プローブの発する蛍光量の維持は非常に重要な課題である。また、増幅と検出を同時に行うことから反応液を構成する試薬成分も多く、保存安定性の良好な反応液の調製は容易ではなかった。従来の試薬の保存安定化方法では蛍光プローブを含めた試薬の保存安定化方法についての報告はなされていなかった。
【００１０】
さらに、ホモジニアス検出においては、標的となる核酸を増幅する酵素の活性の維持も重要な課題となる。蛍光プローブの蛍光をできるだけ保持したまま、酵素を安定させて、簡便に使用できる状態で保存させるための有用な方法はこれまで報告されてなかった。
【００１１】
本発明の目的は、臨床診断における遺伝子検査に使用する核酸増幅検出試薬の性能を維持するための試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、核酸増幅検出反応に必要な試薬を２つの容器に分け、主要成分を最適に組み合わせることによって、蛍光標識プローブを安定して保存する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１３】
［項１］
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
（１）該試薬が２以上の液状組成物から構成され、該試薬を使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該試薬には、ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識プローブとが、別な液状組成物中に配合されている。
［項２］
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、マグネシウムイオンを含む、項１に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項３］
マグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、項２に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項４］
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項５］
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項６］
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項７］
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、さらにオリゴヌクレオチドプライマーを含む、項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
［項８］
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いるキット。
（１）該キットが２以上の液状組成物から構成され、該キットを使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該キットには、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とが、別な液状組成物中に配合されている。
［項９］
（ａ）におけるマグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、項８に記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１０］
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、項８または９に記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１１］
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、項８〜１０のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１２］
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、項８〜１１のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
［項１３］
試薬組成物（ａ）に、オリゴヌクレオチドプライマーを含む、項８〜１２のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、臨床診断において核酸増幅検出反応が簡便、迅速に行うことができる。具体的には、凍結せずに保存するため凍結融解を繰り返すことなく増幅検出反応液の調製が可能であり、かつ試薬性能を長期間保持することのできる試薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】温度変化における消光プローブの蛍光変化解析結果を示す図である。
【図２】温度変化における消光プローブの蛍光変化量を表す検出ピークを示す図である。
【図３】Ａの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図４】Ｂの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図５】Ｃの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図６】Ｄの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図７】Ｅの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図８】Ｆの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図９】Ｇの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１０】Ｈの試薬形態で、３５℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１１】Ｃの試薬形態で、８℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１２】Ｈの試薬形態で、８℃で保存した時の解離蛍光値、測定値の推移を示す図である。
【図１３】ｐＨ６．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１４】ｐＨ７．０、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１５】ｐＨ７．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１６】ｐＨ８．０、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１７】ｐＨ８．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１８】ｐＨ９．０、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【図１９】ｐＨ９．５、３５℃で保存した時の蛍光標識プローブの蛍光値の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法である。
（１）該試薬が２以上の液状組成物から構成され、該試薬を使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該試薬には、ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識プローブとが、別な液状組成物中に配合されている。
【００１７】
ＰＣＲによる核酸増幅反応を行う試薬は通常研究に用いる場合、−２０℃以下で凍結保存されていることが多い。使用する場合は室温で融解した後必要量を分取し、その後は再び凍結にて保存されている。凍結して保存するとこのような室温解凍を使用時に行う必要があり、迅速かつ簡便な臨床検査には適さない。本発明においては、迅速かつ簡便に使用できるように凍結融解を行わずに使用できる試薬を前提としている。０℃〜４０℃は凍結融解なしに核酸増幅試薬を使用できる温度であり、試薬が凍結しない温度である。
【００１８】
ＰＣＲによる核酸増幅反応は、多くの異なる試薬を必要とする。主な試薬成分には、ＤＮＡポリメラーゼのような増幅酵素、反応の基質となるヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応を開始するための標的物質に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、酵素を活性化させるマグネシウムイオン、及び他の緩衝液が含まれる。さらに、リアルタイムＰＣＲまたは増幅後に検出が必要な場合では、色素標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標登録）などのＤＮＡ結合色素、および内部対照核酸を含む。
【００１９】
これらの試薬成分の中には特定の成分と混合して保存することで、増幅酵素の活性が低下したり、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブが加水分解したり、オリゴヌクレオチドプローブに標識された蛍光色素やＤＮＡ結合色素が劣化したりする組み合わせが存在する。
例えば、マグネシウムイオンとＤＮＡポリメラーゼを混合して保存するとＤＮＡポリメラーゼの活性が低下することが一般的に知られている。ＤＮＡポリメラーゼと反応開始剤となるオリゴヌクレオチドプライマーを混合して保存しても非特異産物ができることで特異的な反応ができなくなることも知られている。また、二価の金属イオンとオリゴヌクレオチドを混合すると、溶液中に微量に存在するＤＮａｓｅが活性化されてオリゴヌクレオチドが加水分解されやすくなることも知られている。
【００２０】
本願でいう安定性とは、広義では増幅反応試薬の増幅性能が維持されること、または検出試薬の蛍光色素の蛍光が維持されていることを意味し、具体的にはＤＮＡポリメラーゼの活性が維持され、オリゴヌクレオチドプライマーが加水分解されずに配列が維持され、かつ蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの蛍光色素がプローブから乖離せず、蛍光色素の蛍光量が維持されていることを言う。
【００２１】
一般的に増幅試薬の性能は主にＤＮＡポリメラーゼの活性とオリゴヌクレオチドプライマーの性能に大きく左右されている。増幅試薬の性能を維持する保存安定化方法についてはこの２種類の試薬成分をいかに安定的に保存するかが決め手となる。
ＤＮＡポリメラーゼは活性を抑えた状態で保存することが安定化につながる。そのためには、ＤＮＡポリメラーゼの活性をおさえるための方法を施せばよく、そのような方法としては特に限定されないが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いる方法、アプタマーを用いる方法、ＢＳＡを使用する方法を併用することが好ましい。さらにできるだけ低温で保存する方法やＤＮＡポリメラーゼを凍結乾燥する方法なども組み合わせて使用できる。
オリゴヌクレオチドプライマーは加水分解されることによって顕著な性能低下を引き起こす。特に３‘末端が加水分解によって短くなると二本鎖結合能が大きく変化し、配列特異的な結合ができなくなる可能性がある。この加水分解はＤＮａｓｅが働ことで生じるため、ＤＮａｓｅの混入を防ぐあるいはＤＮａｓｅの活性をおさえることがオリゴヌクレオチドプライマーの安定化に必要である。
【００２２】
増幅試薬を安定的に保存するためにはＤＮＡポリメラーゼの活性とオリゴヌクレオチドプライマーの性能を保てればよく、両立させることができれば最適である。しかしながらこれらの増幅試薬の主成分を２つの容器に分ける場合、ＤＮＡポリメラーゼを活性化するマグネシウムイオンは同時にＤＮａｓｅの活性化因子でもあるため両立は困難である。この両者のバランスを最適なものにするために、マグネシウムイオンとオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、ＤＮａｓｅをできる限り除去した溶液を調製して保存することが好ましい。
【００２３】
一般的に検出試薬の性能は蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（以下プローブと略する）が持つ蛍光量とプローブの配列に依存されるハイブリダイゼーション能による。検出試薬の性能を維持する保存安定化方法についてはプローブの持つ２種類の能力をいかに維持したままプローブを保存するかが決め手となる。
蛍光量については、例えば保存する緩衝液のｐＨにも左右される。ｐＨを適した状態に保つことも一つの安定化させうる方策である。蛍光色素の種類によってはＥＤＴＡなどの金属キレート剤を保存溶液中に含むことで本来持つ蛍光量から大幅に減少するものも存在する。
プローブの配列に関しては、オリゴヌクレオチドプライマーと同様に加水分解されることによって顕著なハイブリダイゼーション能力の低下を引き起こす。この加水分解はＤＮａｓｅが働ことで生じるため、ＤＮａｓｅの混入を防ぐあるいはＤＮａｓｅの活性をおさえることがプローブの安定化に必要である。
【００２４】
増幅検出試薬を安定的に保存するためには試薬の増幅性能と検出性能を両立させることができれば最適である。増幅試薬の主成分を２つの容器に分ける場合、ＤＮＡポリメラーゼを活性化するマグネシウムイオンは同時にＤＮａｓｅの活性化因子でもあるため両立は困難である。この両者のバランスを最適なものにするために、マグネシウムイオンとオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、ＤＮａｓｅをできる限り除去した溶液を調製して保存することが好ましい。ここにホモジニアス増幅検出反応などで検出試薬を加える場合は、オリゴヌクレオチドプライマーを含む容器にプローブを含めることが好ましい。
【００２５】
通常専門家でない者が使用する場合は、簡便にするためにできるだけ混合した状態で保存することが良く、例えば４つに分けて保存することが好ましく、３つに分けて保存することはより好ましい。２つに分けて保存することはさらに好ましい保存方法である。核酸増幅反応に必要な全ての試薬を混合して保存することは、上述した通り活性が低下するため、本発明には適さない。
【００２６】
蛍光色素標識プローブ
蛍光色素は一般にオリゴヌクレオチドに標識して、核酸の測定および検出に用いられるものが使用できるが、蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、蛍光標識プローブとも示す。）が標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、オリゴヌクレオチドに標識した当該蛍光色素が検出に有利に働くものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）またはその誘導体類、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）若しくはその誘導体等、Ａｌｅｘａ 類、ＴＡＭＲＡ 、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇ（Ｒ６Ｇ）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ｔｅｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（ＴＭＲ）、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ｒｅｄ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）類（商標名；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製、米国）、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類からなる群より選ぶことができる。好適なものとしてフルオロセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッドが挙げられる。
【００２７】
蛍光標識プローブに標識する蛍光色素は、核酸増幅工程中分解もしくは蛍光が減衰しなければよく、ハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質であればよい。特に蛍光標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光物質が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用できるが、ＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇの使用が特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなどの他の二重鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、また、ＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光色素に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。蛍光標識プローブの塩基配列中の蛍光色素の標識位置は、特に限定されないが、末端に標識されていることがより好ましい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、第３０３〜３０８頁、１９９６年; Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６３巻、第１１４３〜 １１４７頁、１９９７年; Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、第４５３２〜４５３５頁、１９９６年）。例えば、５´末端に蛍光色素を結合させる場合は、先ず常法に従って５’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ２)ｎ−ＳＨを導入する。これらの導入体は市販されている製品を用いてもよい（グレンリサーチ社）。この場合、ｎは３〜８の整数、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光体基で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されている製品を用いてもよい（グレンリサーチ社）。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨを導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７の整数である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光体基又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光体基で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００３０】
核酸プローブの鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２２５巻、第３２−３８頁（１９９８年））。この場合、市販の蛍光色素が既に結合した状態のチミンアミダイト（グレンリサーチ社）を使用すると便利である。
【００３１】
蛍光標識プローブを保存する時のｐＨは６．５以上８．５未満が好ましく、ｐＨ７．０以上７．５未満がより好ましい。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼは一般的に核酸増幅反応に使用できるものであればよく、現在知られているＤＮＡポリメラーゼ（単独あるいは組みあわせ）としてのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼや，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ（以上はＰｏｌＩ型酵素），Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標），Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ（以上はα型酵素）などが挙げられる。
天然型のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を公知の手段により、１もしくは数個が欠失、置換若しくは付加させたもの（変異体）であっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、もしくは変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、もしくは変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。
例えば、最も一般的であるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡績製のもの（製品コードＫＯＤ−１０１など）を容易に入手することができる。
【００３３】
ＤＮＡポリメラーゼはさらに、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことが好ましい。本発明では標識プローブからの蛍光変化量を標的核酸の検出に利用することがある。そのため、高速ＰＣＲ工程中で第一のプライマーによる伸長産物に対して標識プローブ及び第二のプライマーがハイブリダイゼーションしている場合に、５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは標識プローブを分解し、非特異シグナルの増加を伴う。５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００３４】
ｄＮＴＰｓ
ｄＮＴＰｓは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの混合物であり、核酸増幅反応の基質物質である。４つの化合物をそれぞれ等量ずつ混合することが好ましい。凍結保存しない環境下では、ｄＮＴＰｓはＤＮＡポリメラーゼを含む溶液中に含むことが好ましい。ｄＮＴＰｓの濃度は特に限定されるものではないが、５０ｍＭ以上５００ｍＭ以下が好ましい。これらは種々市販されている。
【００３５】
マグネシウムイオン
マグネシウムイオンは、通常塩の状態の化合物を利用する。核酸増幅反応に適したマグネシウム塩が好ましい。
本発明において、マグネシウム塩は水性溶媒中にマグネシウムイオンが放出されるような形態でマグネシウムを含有するあらゆる物質を表すものとする。マグネシウム塩には、塩化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび硫酸マグネシウム等が例示されるが、これらに限定されるものではない。特に、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムが好ましい。
【００３６】
マグネシウムイオンの濃度は、特に限定されないが１ｍＭから８ｍＭの最終反応用液の濃度となるように調整されることが好ましい。
最終濃度１ｍＭから８ｍＭとは核酸増幅反応に使用する好適なマグネシウム濃度を示しており、試薬の保存に際しては、最終的に他の試薬混合液と混合するためさらに高い濃度で保存されている。例えば全量５０μＬの核酸増幅反応系であって、１２．５μＬのＤＮＡポリメラーゼ含有混合物と１２．５μＬのマグネシウム含有混合物を加える場合は、最終液量が４倍となるため保存中のマグネシウムイオン濃度は４ｍＭから３２ｍＭが好ましい。濃縮倍率は２試薬を混合する場合、２倍から１０倍が適した範囲であり、好ましくは２倍から８倍、更に好ましくは３倍から５倍で保存することが好ましい。このような濃縮倍率を考慮した時のマグネシウムイオン濃度は特に限定はしないが２ｍＭから４０ｍＭが好ましい。より好ましくは、３ｍＭから４０ｍＭである。２ｍＭ未満の場合、例えば５倍濃縮では０．４ｍＭ未満のマグネシウムイオン濃度となってしまうため、ＤＮＡポリメラーゼが活性化されずにＰＣＲ増幅が起こらない可能性がある。また、４０ｍＭを超えると溶解するマグネシウム塩の濃度が高すぎるため調製が難しい。
【００３７】
このほか、本発明の方法においては、反応に影響を及ぼさない範囲で緩衝液、アミノ酸またはタンパク質、糖類、還元剤多価アルコールなどを必要により適宜各液状組成物に配してもよい。
緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００ｍＭの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９（２５℃））が例示できる。好ましくはトリス緩衝液である。好ましい緩衝ｐＨ範囲は７〜９である。
アミノ酸又はタンパク質としては、グルタミン酸ソーダ、アルブミン、スキムミルク等、糖としてはシュクロース、マルトース等、還元剤としてはグルタチオン、メルカプトエタノール等、多価アルコールとしてはグリセロール、ソルビトールなどが含まれていても良い。
また、界面活性剤などが含まれていても良い。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤がよく、好ましくＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０などが例示される。界面活性剤は、反応段階、すなわち、ポリメラーゼ反応時に、０．０００１〜１％になるように含まれていてもよく、好ましくは０．００１〜０．１％がよい。
【００３８】
一方、ＤＮＡポリメラーゼを含む混合液の濃度は、できる限り濃度の高い状態での保存が好ましいが、混合時の操作の簡便性を考慮すると、濃縮倍率が２倍から１０倍の範囲、好ましくは２倍から８倍、更に好ましくは３倍から５倍で保存することが好ましい。
【００３９】
核酸増幅検出反応に用いるキット
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いるキットである。
（１）該キットが２以上の液状組成物から構成され、該キットを使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該キットには、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とが、別な液状組成物中に配合されている。
【００４０】
本発明のキットにおける各液状組成物の調製方法は特に限定されるものではないが、上述の方法が例示できる。
【００４１】
以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に特に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
（検体の採取）
胃生検材料より遺伝子をＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。抽出されたＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００４３】
（テンプレートプラスミドの調製）
１μＬの抽出されたＤＮＡ溶液を鋳型として用い、ＰＣＲを実施した。ここで使用したプライマーペアは、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を全長増幅できるプライマーを使用した。いずれもピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ２７２７０）の公知の配列から設計した。
【００４４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、全量を２６μＬとして実施した。１μＬのＤＮＡ溶液と試薬混合物（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ０．５Ｕ、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、２００μＭのｄＮＴＰｓ、各々５μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・１５秒の変性工程、６０℃・３０秒のアニーリング工程、６８℃・６０秒の伸長工程のサイクルを３５回繰り返した。得られた核酸断片を制限酵素によって平滑末端切断されたｐＵＣ１８へライゲーションし、コンピテントセルＪＭ１０９を用いて形質転換体の取得を行なった。目的核酸断片が挿入された形質転換体を液体培養しプラスミドを抽出した。
【００４５】
得られたプラスミドの核酸配列をオートシークエンサーにより解析し、ピロリ菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子野生型の塩基配列を有するプラスミドを得た。以下、野生型をＷＴと示す。
【００４６】
（プライマー及び標識プローブの合成）
検出に使用するプライマー及び蛍光標識プローブは核酸合成受託会社に合成を委託して入手した。
【００４７】
使用した蛍光標識プローブ及びプライマーの塩基配列を示す。
標識プローブは配列番号１に示す１６塩基の配列、プライマーＦは配列番号２の２５塩基に示す配列、プライマーＲは配列番号３の２６塩基に示す配列である。
【００４８】
（野生型ピロリ菌の検出）
表１には、全量１０μＬで各試薬を要時調製により調製した反応組成を示す。核酸増幅には、東洋紡績製のＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を利用したＰＣＲ法を用いた。検出には蛍光標識されたプローブが標的核酸とハイブリダイゼーションした時に消光するＱＰｒｏｂｅ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ａ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ ｏｒ ｐｒｉｍｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１， Ｖｏｌ． ２９， Ｎｏ．６， ｅ３４）を利用した。表１の組成をもとにした反応組成の最適化は同業者であれば容易に行える。プラスミドＤＮＡ量は全量１０μＬの系で約１０００コピー含まれるように調製した。ＰＣＲ増幅時の反応条件および検出条件は表２の通りである。増幅及び蛍光の測定には、ロシュ・ダイアグノスティック製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用した。以下、特に記載がない場合は全てライトサイクラー（登録商標）での測定とする。融解曲線解析においては標識プローブが標的核酸から解離する時の蛍光量の増加を検出している。
ＷＴ（野生型）を含む試料とＮＣ（ネガティブコントロール：水をテンプレートに使用）とを、それぞれ上記条件で増幅・検出し、ライトサイクラーソフトウェアによる解析により、図１と図２の解析結果が得られた。図１の縦軸は蛍光強度を、横軸は温度（℃）を示している。図２の縦軸は蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（−ｄＦ／ｄｔ）で蛍光の変化量を、横軸は温度（℃）を示している。
図１では融解曲線解析における標識プローブの蛍光変化が示されている。ＷＴでは温度を上げていくと標識プローブが標的核酸から解離し、７５℃の時の蛍光値は標識プローブが標的核酸から完全に解離した時の蛍光値である。解離蛍光値はＮＣ（水をテンプレートに使用したとき）の４０℃における蛍光値を示し、蛍光標識プローブの蛍光量の基準とすることができる。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
解析の結果、図１では融解曲線解析における標識プローブの蛍光変化が示されている。７５℃の時の蛍光値は標識プローブが標的核酸から完全に解離した時の蛍光値である。解離蛍光値は水をテンプレートに使用したときの４０℃における蛍光値を示し、蛍光標識プローブの蛍光量の基準とすることができる。また図２では融解曲線解析における標的核酸と蛍光標識プローブの解離を示す検出ピークが示されている。検出ピークは蛍光標識プローブとハイブリダイゼーションする標的核酸の存在を示している。
【実施例２】
【００５２】
３５℃保存による増幅検出試薬性能の検討
（試薬の保存）
増幅検出試薬の試薬組成を表１に示す成分量に固定した。増幅検出試薬の主要成分をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、マグネシウムイオン、プライマーセット、蛍光標識プローブの５つに分類し、各成分を２つの試薬混合液に分けて保存した。表３に示されるように各成分を組み合わせて３通りの試薬混合液セットを調製した。プローブおよびプライマーは実施例１に記載の標識プローブ、プライマーＦおよびプライマーＲを使用した。各試薬混合液は、１．５ｍＬのスクリュー付チューブに入れて、遮光ラックに整理した。保存方法は、３５℃保存の場合は三洋電機製ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＭＩＲ−１５３に保存し、設定温度を３５℃に設定した。８℃保存の場合は三洋電機製ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＭＩＲ−５５３に保存し、設定温度を８℃に設定した。使用時には２つの試薬混合液を混ぜてから使用した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
（試薬の測定）
ＤＮＡポリメラーゼ混合溶液２．５μＬ、プライマー混合溶液２．５μＬ、プラスミドＤＮＡ溶液５μＬを混合した反応液１０μＬを調製した。テンプレート量は５μＬ中に約１０００コピー含まれるように調製し、その他は実施例１の方法に従って実施した。３５℃保存の試薬には１週間毎に測定し、１０週間まで測定を行った。
【００５５】
（データの解析）
ライトサイクラー（商標登録）付属の解析ソフトを利用して図１から解離蛍光値、図２に示される検出ピークの高さから測定値を算出して増幅検出試薬の保存安定性の解析に用いた。解離蛍光値は融解曲線解析の４０℃における蛍光値をそのまま用い、蛍光標識プローブの基本となる蛍光値を示しており、解離蛍光値で蛍光標識プローブの劣化が確認できる。増幅検出試薬性能の確認方法は測定値の高さで比較できる。測定値は融解曲線解析の蛍光値を微分したグラフで見られる検出ピークの高さの絶対値の１０倍の値を用いている。
【００５６】
（結果）
３５℃保存試薬の保存安定性の解析結果を図３から図６に示す。図３から図６に示されるように試薬成分の組み合わせをＡからＤにすると１３週間目の測定結果でも解離蛍光値が検出できていた。これらの組み合わせによる増幅検出試薬の保存では蛍光標識プローブが１３週間目でも蛍光を示していたことから安定性の優れた保存方法であるといえる。ＡからＤに共通した組成は、酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと蛍光標識プローブを別々の混合液として保存していることである。また、蛍光標識プローブの保存液性がｐＨ７．４であることも蛍光標識プローブを安定して保存できる一つの要因である。
【００５７】
さらにＡまたはＢとＣまたはＤを比較すると、全て１３週間目まで蛍光値の維持は可能であるが、ＡまたはＢについては測定値が１０週間目で０になっていた。ＡまたはＢは酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとマグネシウムイオンが混合されて保存されているため、酵素の活性が低下したことが原因であると考えられる。この結果から、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと蛍光標識プローブを分けて保存することで蛍光標識プローブの蛍光を安定させることに加えて、蛍光標識プローブを含む試薬混合液にマグネシウムイオンを混合することで酵素の活性を維持できるＣまたはＤの組み合わせで保存することが増幅検出試薬の保存方法として好ましいことがわかった。
【比較例１】
【００５８】
（方法）
試薬の保存、試薬の測定、データの解析は実施例２に従って実施した。表４に示されるように、５つに分類された増幅検出試薬の主要成分のうち、酵素と蛍光標識プローブを混合して保存している試薬混合液セット４種類を調製した。実施例２と同様に３５℃で保存した。
【００５９】
【表４】
【００６０】
（結果）
図７から図１０に３５℃保存の結果を示す。ＥからＨまでの４種類の試薬混合液セットでは、１３週間目の解離蛍光値がライトサイクラーの検出感度を下回り、蛍光値は０を示した。また、Ｆ、Ｇ、Ｈは解離蛍光値よりも酵素活性の低下が早く、増幅検出試薬としての増幅検出性能が消失している。これに対し、Ｅでは酵素活性は維持されているが蛍光標識プローブの劣化によりライトサイクラーの検出感度以下の蛍光値となったため、１３週間目では増幅検出性能を消失した。この結果から、ＫＯＤと蛍光標識プローブを混合して保存すると蛍光標識プローブの蛍光の劣化が促進されることがわかった。
【実施例３】
【００６１】
８℃保存による増幅検出試薬性能の検討
試薬の保存、試薬の測定、データの解析は実施例２に従って実施した。表２のＣの試薬混合セットおよびＨの試薬混合セットを使用した。８℃保存の試薬は１ヶ月ごとに、１６ヶ月まで測定を行った。
【００６２】
（結果）
８℃保存試薬の保存安定性の解析結果を図１１または図１２に示す。図１１から試薬成分の組み合わせをＣにすると、１６ヶ月目の測定結果でも解離蛍光値は１．２を超えていた。また図１２から試薬成分の組み合わせをＨにすると１６ヶ月目の測定結果で解離蛍光値は１．２以下となっていた。Ｈの組み合わせでは、増幅検出試薬の性能のうち蛍光標識プローブの蛍光が低下していることを示している。３５℃保存の結果と同様にＣの組み合わせにより保存した増幅検出試薬は冷蔵で１６ヶ月間保存しても、大幅な蛍光値の低下はないことがわかった。さらにＣで１６ヶ月間保存しても増幅検出試薬の性能の指標となる測定値も維持されていることがわかった。
【実施例４】
【００６３】
（試薬の保存）
３５℃保存した時の、ｐＨ変化における蛍光標識プローブの経時的な変化について検討した。蛍光標識プローブの保存用溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ２ＳＯ４ ｐＨ６．５〜９．５）を調製した。さらに、各保存用溶液に配列番号１に示される蛍光標識プローブ１μＭとなるように加えて蛍光標識プローブ溶液とした。各蛍光標識プローブ溶液は１．５ｍＬのスクリュー付チューブに５００μＬを入れて、遮光ラック内に静置した。保存方法は、三洋電機製ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＭＩＲ−１５３に保存し、設定温度を３５℃に設定した。
【００６４】
（試薬の測定）
各蛍光標識プローブ溶液を１×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒで５倍希釈した溶液を調製した。２０μＬをライトサイクラー（商標登録）専用ガラスキャピラリーに充填し、ライトサイクラー（商標登録）のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒモードにて測定温度を３０℃に設定して５３０ｎｍの蛍光の測定を実施した。３５℃保存の各蛍光標識プローブ溶液は１週間毎に、６週間まで測定を行った。
【００６５】
（データの解析と結果）
ライトサイクラー（商標登録）における蛍光測定結果をｐＨ毎にまとめてグラフを作成した。結果を図１３から図１９に示す。０週間目と６週間目の蛍光値の差で比較した時に、ｐＨ８．５以上の溶液中で保存した場合２．０以上であり、ｐＨ８．５未満で保存した時は２．０未満であった。さらに、ｐＨ７．０およびｐＨ７．５では０週間目と６週間目の蛍光値の差が１．５未満となっておりより蛍光色素の劣化が抑えられていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、従来凍結保存により成分ごとに保存されていた核酸増幅検出試薬を冷蔵保存可能な試薬混合液で保存することにより、より簡便、迅速に試薬調製が行うことができる。調製が簡便なため、核酸増幅技術に専門的な知識を有しない臨床診断の場でも容易に核酸増幅検出を利用した遺伝子検査が可能となり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
（１）該試薬が２以上の液状組成物から構成され、該試薬を使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該試薬には、ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識プローブとが、別な液状組成物中に配合されている。
【請求項２】
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、マグネシウムイオンを含む、請求項１に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項３】
マグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、請求項２に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項４】
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項５】
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項７】
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、さらにオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項８】
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いるキット。
（１）該キットが２以上の液状組成物から構成され、該キットを使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該キットには、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とが、別な液状組成物中に配合されている。
【請求項９】
（ａ）におけるマグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、請求項８に記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１０】
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、請求項８または９に記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１１】
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、請求項８〜１１のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１３】
試薬組成物（ａ）に、オリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項８〜１２のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１】
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いる核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
（１）該試薬が２以上の液状組成物から構成され、該試薬を使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該試薬には、ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識プローブとが、別な液状組成物中に配合されている。
【請求項２】
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、マグネシウムイオンを含む、請求項１に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項３】
マグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、請求項２に記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項４】
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項５】
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項７】
蛍光標識プローブを含む試薬組成物に、さらにオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬の保存安定性を向上させる方法。
【請求項８】
以下の（１）〜（２）の特徴を有する、ＰＣＲによる核酸増幅検出反応に用いるキット。
（１）該キットが２以上の液状組成物から構成され、該キットを使用する際に、当該２以上の液状組成物をすべて混合することにより反応液が調製される。
（２）該キットには、（ａ）少なくとも蛍光標識プローブ、マグネシウムイオンおよび緩衝剤を含み、ｐＨが６．５以上８．５未満である試薬組成物、と、（ｂ）少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤を含む試薬組成物とが、別な液状組成物中に配合されている。
【請求項９】
（ａ）におけるマグネシウムイオン濃度が２ｍＭ〜４０ｍＭである、請求項８に記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１０】
蛍光標識プローブの蛍光色素が、フルオレセインまたはその誘導体、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンまたはその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類、ＢＨＱ類からなる群より選ばれるいずれかである、請求項８または９に記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１１】
蛍光標識プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションによって消光する蛍光色素によって標識されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）またはその変異体である、請求項８〜１１のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【請求項１３】
試薬組成物（ａ）に、オリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項８〜１２のいずれかに記載の核酸増幅検出試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−２３３５０５（Ｐ２０１０−２３３５０５Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８５３１８（Ｐ２００９−８５３１８）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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