修飾されたＥ２タンパク質を含む組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）および前記組み換えＣＳＦＶを形成するための方法
発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）に関する。好ましい組み換えＣＳＦＶはＥ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む。本発明は更に組み換えＣＳＦＶを含むワクチン、組み換えＣＳＦＶを形成するための方法、および組み換えＣＳＦＶの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物疾患に関する。より具体的には、本発明は修飾されたＥ２タンパク質を含む組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）に関する。本発明はまた、感染動物を予防接種動物から区別可能とする前記組み換えＣＳＦＶを含むワクチン、および、前記組み換えＣＳＦＶを形成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）はエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスであり、これはウシウィルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）およびボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共に、フラビウイルス科のファミリーのペスチウイルス属を含む（Ｐｒｉｎｇｌｅ，１９９８．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４３：２０３−１０）。家畜化されたブタの群れにＣＳＦＶが伝染すると巨額の経済的損失が生じる場合がある（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ ｄｅ Ｓｍｉｔ．２０００．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７：３−１５）。ウサギおよび細胞培養における反復継代により弱毒化されているＣＳＦＶウイルス、いわゆる「チャイニーズ」または「Ｃ」株による予防接種は、強毒性のＣＳＦＶに対抗する即効性で長寿命の免疫をもたらす。Ｃ株ウイルスは世界中で良好に使用されており、しばしば、これまで作成されたもののうちで最も効果的な獣医科用ワクチンと称される。しかしながらこのワクチンは感染と予防接種の動物の間の血清学的区別（ＤＩＶＡ）を可能にしない。このことは、予防接種集団中でＣＳＦ感染動物を検出することが不可能であることは重大な商取引上の制約をもたらす場合があるため、主要な難点となっている。
【０００３】
この分野におけるＣＳＦの診断は構造糖タンパク質ＥｒｎｓまたはＥ２のいずれかに対して指向された抗体を検出するＥＬＩＳＡにより実施できる。サブユニットワクチン（Ｈｕｌｓｔら、１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：５４３５−４２）から弱毒化生ワクチン（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４４７−５９；ｖａｎ Ｚｉｊｌら、１９９１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７６１−２７６５）およびレプリコン系ワクチン（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１５４４−５６；Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：２９７３−２９８０）にまで渡る、適切なＥＬＩＳＡを伴う場合ＤＩＶＡの基準を満足できる数種の候補ワクチンが開発されている。
【０００４】
ＣＳＦに対抗する市販のＤＩＶＡワクチンはＥｒｎｓに対して指向された抗体を検出する血清学的な試験を伴っているバキュロウィルス産生Ｅ２に基づいている（Ｖａｎ Ａａｒｌｅ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ Ｂａｓｅｌ １１４：１９３−２００）。このワクチンはＣＳＦに対抗して保護を与えるが、免疫の発生および持続時間の両方の点においてＣ株ワクチンよりも有効性が低い（ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００３．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７−８４）。より重要なことは、このワクチンを伴っているＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡはペスチウイルス属の他のメンバー（即ちＢＶＤＶおよびＢＤＶ）も検出する。従ってこれらの使用はこれらのウイルスが循環する領域においては推奨されない（２００３／２６５／ＥＣ；ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３）。
【０００５】
更に、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡの感度は個々の動物を診断するには不十分であることが以前よりわかっており、従って十分多数量の動物を用いた群れ基準でのみ使用しなければならない（Ｂｌｏｍｅら、２００６．Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ２５：１０２５−３８；Ｆｌｏｅｇｅｌ−Ｎｉｅｓｍａｎｎ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（１１４：１８５−９１））。このことは、一般的にはＥ２ ＥＬＩＳＡはＤＩＶＡワクチンを伴う場合にはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡよりもはるかに好ましいことを説明している。
【０００６】
Ｅ２タンパク質は２つの主要な抗原ドメイン、即ちＢ／ＣドメインおよびＡドメインを含有する（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９３．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７４：２０５３−６０；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６）。ＣＳＦＶポリタンパク質のアミノ酸７６６と８６６の間に位置するドメインＡは、サブドメインＡ１、Ａ２およびＡ３に分割される（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６）。Ａ１ドメインは中和抗体に対する優性な標的であるという事実にもかかわらず、これは進化の過程を通して保存されている。実際、この配列の保存および免疫優性は、Ｅ２ ＥＬＩＳＡにおいてこれを優性標的としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｒｉｎｇｌｅ，１９９８．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４３：２０３−１０
【非特許文献２】Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ ｄｅ Ｓｍｉｔ．２０００．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７：３−１５
【非特許文献３】Ｈｕｌｓｔら、１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：５４３５−４２
【非特許文献４】ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４４７−５９
【非特許文献５】ｖａｎ Ｚｉｊｌら、１９９１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７６１−２７６５
【非特許文献６】ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１５４４−５６
【非特許文献７】Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：２９７３−２９８０
【非特許文献８】Ｖａｎ Ａａｒｌｅ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ Ｂａｓｅｌ １１４：１９３−２００
【非特許文献９】ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００３．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７−８４
【非特許文献１０】２００３／２６５／ＥＣ；ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３
【非特許文献１１】Ｂｌｏｍｅら、２００６．Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ２５：１０２５−３８
【非特許文献１２】Ｆｌｏｅｇｅｌ−Ｎｉｅｓｍａｎｎ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（１１４：１８５−９１）
【非特許文献１３】ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９３．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７４：２０５３−６０
【非特許文献１４】Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＳＦの爆発的発生は現在では検疫規制および被疑動物群の屠殺により制御されているが、将来のＣＳＦの爆発的発生を制御するためにはより人間的でより経済的な介入策の実施が急務である。従って、頑健でＣＳＦＶ特異的なＥＬＩＳＡを伴ったＤＩＶＡワクチンが緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、親ＣＳＦＶポリタンパク質の８２９位から８３７位に相当するＥ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む上記ウイルスを提供する。
【００１０】
ポリタンパク質とはウイルスＲＮＡの翻訳時に形成される約４０００アミノ酸の仮説的ポリタンパク質を意味する。前記ポリタンパク質はプロセシングにより最終切断産物ＮＰｒｏ−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂとなる。
【００１１】
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はアミノ酸配列ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ（ＣＳＦＶポリタンパク質の残基８２９から８３７；アミノ酸に関する一文字コードを用いた場合）を含む最近発見されたエピトープを含有する（Ｌｉｎら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：１１６１９−２５）。このエピトープはＡ１ドメインの全ての特徴的側面、即ち免疫優性であり、進化的に保存されており、ＣＳＦＶに特異であり、中和抗体に対する標的であることを共有している。ペスチウイルスの異なる株に由来するＥ２タンパク質内でのＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン周囲の配列の比較によれば、配列ＴＡＶＳＰＴＴＬＲはＣＳＦＶの株内で強力に保存されており、ＢＶＤＶおよびＢＤＶの株内では高度に可変である（Ｌｉｎら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：１１６１９−２５）。
【００１２】
ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを認識するＥ２特異的ＥＬＩＳＡで使用される抗体、特にモノクローナル抗体は、ペスチウイルス属の他のメンバーとは交差反応せず、そのため、これらの他のウイルスが循環する領域において使用できる。前記抗体は、Ｅ２タンパク質の前記ドメイン中に欠失を含む本発明の組み換えＣＳＦＶは認識しない。
【００１３】
即ち、前記組み換えウイルスは、組み換えウイルスを感染させた動物を、野生型ＣＳＦＶに感染した動物から、感染していない、および／または予防接種されていない動物から、区別可能とする。更に、前記組み換えウイルスの使用はこれらの動物の間で判別を行うためのペプチド系診断試験の使用を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、ＣＳＦＶの「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインまたはこの等価物において少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む上記ウイルスを提供する。等価なドメインは、１つのアミノ酸が他のアミノ酸、例えば同じグループに属するアミノ酸で置き換えられた、即ち別の芳香族アミノ酸で置き換えられた芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸で置き換えられた脂肪族アミノ酸である、Ｅ２領域内部のドメインである。
【００１５】
前記親ゲノムは好ましくはＣＳＦＶ株、好ましくは天然に存在する、または組み換え弱毒化ＣＳＦＶ株から誘導された実質的に完全なウイルスゲノムを含む。親ゲノムという用語は核酸分子、例えばＲＮＡ分子および／またはこのｃＤＮＡコピーを含む。
【００１６】
「少なくとも１つのアミノ酸の欠失」という用語は本説明において使用する場合、アミノ酸少なくとも１つの除去を意味する。「欠失」という用語はアミノ酸少なくとも１つの除去の後に同じ位置に別のアミノ酸少なくとも１つの挿入がある場合を包含しない。従って、「欠失」という用語は本明細書において使用する場合、アミノ酸の別のアミノ酸との置換を包含しない。
【００１７】
前記組み換えｃＤＮＡ分子は好ましくは実質的に完全な組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムを含み、これにより、前記ゲノムはＣＳＦＶポリタンパク質の８２９位から８３７位に相当する保存された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むＥ２タンパク質をコードする。「実質的に完全な」という用語は、前記ゲノムにより形成された前記ウイルスが適する細胞または細胞系統を感染させることができ、上記適する細胞または細胞系統中で再生できることを指す。「実質的に完全な」ウイルスゲノムは好ましくは複製コンピテントなゲノムである。より好ましくは、感染性で、複製コンピテントで、パッケージングコンピテントなウイルスゲノムである。更に好ましくは、組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）は「実質的に完全な」ウイルスゲノム、好ましくは複製コンピテントなゲノム、または、より好ましくは、感染性で、複製コンピテントで、パッケージングコンピテントなウイルスゲノムを含む。
【００１８】
好ましい実施形態においては、本発明による組み換えＣＳＦＶのＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、前記「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインの中央部プロリンの欠失を含む。
【００１９】
プロリンは骨格窒素原子上に環化した側鎖を有する点において２０種の一般的アミノ酸の中では独特である。これにより前記プロリンおよびプロリンに先行する残基のコンホーメーションが制約される。更に、プロリンはコンホーメーション「スイッチ」として作用することができ、これによりタンパク質の部分を代替コンホーメーション採用可能とすることができる。従って、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の中央部プロリンの改変は、一次配列を変化させるのみならず、免疫原性のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインのコンホーメーションも変化させる。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインの中央部プロリンの欠失を含むＥ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質内部の前記ドメインを認識する抗体により認識されない。
【００２０】
更なる好ましい実施形態において、本発明による組み換えＣＳＦＶの改変されたＥ２タンパク質は前記ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインからの少なくとも２つのアミノ酸の欠失を含む。２つのアミノ酸の欠失は、Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインからのそれぞれ、ＴＡ、ＡＶ、ＶＳ、ＳＰ、ＰＴ、ＴＴ、ＴＬおよびＬＲの欠失を含む。２つのアミノ酸の最も好ましい欠失はＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の８３３から８３４位のＰＴの欠失である。
【００２１】
更なる好ましい実施形態において、本発明による組み換えＣＳＦＶの改変されたＥ２タンパク質は、前記ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインから少なくとも３つのアミノ酸、例えば３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸または９つのアミノ酸の欠失を含む。更に好ましいＥ２タンパク質はアミノ酸配列ＶＳＰ、ＳＰＴ、ＡＶＳＰ、またはＳＰＴＴＬの欠失を含む。
【００２２】
本発明は更に、親ＣＳＦＶゲノムの少なくとも１つの更なる改変を含む本発明による組み換えＣＳＦＶを提供する。前記保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中に欠失を含むウイルスは親ウイルスと比較して細胞を感染させることにおいてより低効率性であるか、および／または感染細胞中でより低効率に複製しており、その結果、親ウイルスと比較してより低いウイルス力価となっていた。保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の欠失を含むウイルスに感染した細胞の連続継代は、より効率的に感染するか、および／または細胞中で複製される救済されたウイルスをもたらしており、これにより、親ウイルスの力価に匹敵する力価がもたらされている。救済されたウイルスは保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の欠失を有するウイルスの適合性の損失を補償している親ゲノム中の更なる改変１つ以上を導入している。
【００２３】
１つの実施形態において、前記少なくとも１つの更なる改変はウイルスのゲノムを変化させるがアミノ酸の改変はもたらさないサイレントな突然変異である。前記サイレントな突然変異はウイルスゲノムの非コーディング部分、またはウイルスゲノムのコーディング部分において、例えばＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２をコードするウイルスゲノムの部分において、および／または、非構造タンパク質をコードする部分において、存在している。サイレントな突然変異はこれらのウイルスの形成の間のある時点において改変されたウイルスの適合性の回復に寄与していると考えられる。いかなる理論にも拘束されないが、例えばサイレントな突然変異は、前記サイレントな突然変異はウイルスゲノム核酸のコンホーメーションを改変するため、ウイルスゲノムの向上した安定性および／または向上した複製をもたらす。更に、前記サイレントな突然変異は向上したコドン使用をもたらす場合がある。好ましいサイレントな突然変異はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位のＵからＣへの改変により与えられる。
【００２４】
更なる実施形態において、前記少なくとも１つの更なる改変はＥ２タンパク質と共にジスルフィド結合ヘテロ２量体に組み立てられることがわかっているＥ１タンパク質をコードする領域中にある。即ち、Ｅ２の保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける欠失は、少なくとも部分的には、Ｅ１タンパク質中の少なくとも１つのアミノ酸の改変により補償される。更なる実施形態において、前記少なくとも１つの更なる改変はＮｐｒｏ、Ｃ、ＥｒｎｓまたはＥ２タンパク質をコードする領域中にある。前記少なくとも１つの更なる改変は好ましくはＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質をコードする領域から選択される異なる領域中、または、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質をコードする１つの領域内部における、少なくとも２つの改変を含む。前記少なくとも２つの更なる改変は、好ましくは、少なくとも１つのサイレントな突然変異を含む。好ましいサイレントな突然変異はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位のＵからＣへの改変により与えられる。
【００２５】
好ましい実施形態においては、前記少なくとも１つの更なる改変はＥ２タンパク質中の追加的Ｎ連結グリコシル化部位の導入をもたらす。Ｅ２タンパク質の追加的位置におけるＮ連結グリコシル化部位は明らかに、直接、または、炭水化物部分に対する係留部位としてのこの機能により、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の前記欠失により課せられた適合性の損失を補償している。好ましい実施形態においては前記Ｎ連結グリコシル化部位は例えば７７４位におけるＤからＮへの改変のような、アミノ酸位置７７２から７７８からのＬＦＤＧＴＮＰドメインの改変により導入される。または、もしくは追加的に、Ｎ連結グリコシル化部位はＥ２タンパク質中の８３０位におけるＡからＮへの改変により導入される。
【００２６】
前記更なる改変は好ましくは、Ｅｒｎｓタンパク質内部のＶ３９２をコードする１５４７位から１５４９位におけるコドン；Ｅ１タンパク質内部のＥ６３４をコードする２２７３位から２２７５位におけるコドン；Ｅ２タンパク質内部のＤ７７４をコードする２６９３位から２６９５位におけるコドン；および／またはＥ２タンパク質内部のＶ８３１をコードする２８６４位から２８６６位におけるコドンを改変する。記載した位置におけるコドンの前記改変はサイレントな突然変異を含むか、またはコードされたアミノ酸の改変を含む。好ましい少なくとも１つの更なる改変はグリシン（Ｇ）との８３１位におけるバリン（Ｖ）の置換を含む。
【００２７】
別の好ましい実施形態においては、親ゲノムの前記少なくとも１つの更なる改変は７８９位におけるＳからＦへの置換および／または４４５位におけるＡからＴへの置換をもたらす。７８９位におけるセリンおよび４４５位におけるアラニンは全てのＣ株ウイルス中に存在し、家兎継代したＣＳＦＶ株に関連しているのに対し、７８９位におけるフェニルアラニンおよび４４５位におけるスレオニンは強毒性ＣＳＦＶ株中で保存されている。Ｃ株ウイルスの履歴は十分解明されていないが、ウイルスは数百回ウサギにおいて継代されることにより弱毒化されていることが明らかであり、そのためには７８９位におけるＳおよび４４５位におけるＡが有利であり得る。７８９位におけるＳからＦへの改変および４４５位におけるＡからＴへの改変は同様にＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の欠失を含むウイルスの増殖のために有利であるのに対し、これはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むウイルスにおいてはほぼ中立的となる。
【００２８】
なお更なる好ましい実施形態において、本発明は８３３位におけるＰの欠失およびサイレントな改変を含む組み換えＣＳＦＶを提供する。好ましいサイレントな改変はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位におけるＵからＣへの改変である。更に好ましい組み換えＣＳＦＶは８３３位におけるＰの欠失および７８９位におけるＳからＦへの改変および／または４４５位におけるＡからＴへの改変；８３３位におけるＰの欠失および７７４位におけるＤからＮへの改変、８３１位におけるＶからＧへの置換、および８３４位におけるＴの欠失を、１５４９位におけるＵからＣへの改変に加えて、または加えることなく、含んでいる。最も好ましい組み換えＣＳＦＶは、Ｅ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインのそれぞれ８３３および８３４位のプロリンおよびスレオニンの欠失、Ｅ２タンパク質の１５４９位のＵからＣへの改変、６３４位のアスパラギン酸（Ｄ）とのグルタミン酸（Ｅ）の置換、７７４位のアスパラギン酸（Ｎ）とのアスパラギン酸（Ｄ）の置換、および、８３１位のグリシン（Ｇ）とのバリン（Ｖ）の置換を含む。
【００２９】
更なる実施形態において、本発明は親ＣＳＦＶポリタンパク質のＥ２における８２９位から８３７位の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の改変を含み、これにより上記改変がＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける中央部プロリンからアスパラギンへの置換を含む、組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）を提供する。前記置換は改変されたＥ２タンパク質へのＥ２特異的モノクローナル抗体の結合を最小限化、または、更には阻害することがわかった。
【００３０】
一次アミノ酸配列を変化させることとは別に、前記アスパラギンの導入は、グリコシル化コンセンサス配列［Ｎ−ｘ−Ｓ／Ｔ］、ここで式中ｘはＰまたはＤ以外のいずれかのアミノ酸を指すものを含むＮ連結グリコシル化部位の導入をもたらす（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１−６４）。ウイルスタンパク質のＮグリコシル化は、免疫原性に関与していることが示唆されており、そのため、Ｎ連結グリコシル化の導入はウイルスタンパク質に対する細胞および抗体の応答の両方を制限することができる。即ち前記置換は前記組み換えウイルスを感染させた動物からの野生型ウイルスを感染させた動物の区別を可能にする前記組み換えウイルスを形成するために使用できる。
【００３１】
１つの実施形態において、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける中央部プロリンからアスパラギンへの置換を含む組み換えＣＳＦＶは、ゲノム内に少なくとも１つの更なる改変を含む。好ましい少なくとも１つの更なる改変はＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２における、および／または非構造タンパク質をコードする部分における、追加的なＮグリコシル化部位をもたらす。好ましい追加的なＮグリコシル化はＥ２内部、例えばＥ２タンパク質のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン内部、またはＬＦＤＧＴＮＰエピトープ内部に存在する。
【００３２】
更に好ましい少なくとも１つの更なる改変は、ウイルスゲノムの非コーディング部分、または、ウイルスゲノムのコーディング部分、例えばＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２をコードするウイルスゲノムの部分、および／または非構造タンパク質をコードする部分に存在するサイレントな突然変異である。好ましいサイレントな突然変異はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位におけるＵからＣへの改変により与えられる。
【００３３】
また更に好ましい少なくとも１つの更なる改変は、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２において、および／または、非構造タンパク質をコードする部分において、少なくとも１つのアミノ酸の改変を含む。前記少なくとも１つの更なる改変は好ましくは、ＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位における例えばＵからＣへのサイレントな改変、７８９位におけるＳからＦへの改変、４４５位におけるＡからＴへの改変、７７４位におけるＤからＮへの改変、８３１位におけるＶからＧへの改変、および／または８３４位におけるＴの欠失から選択される。更により好ましくは、前記少なくとも１つの更なる改変は、サイレントな突然変異、追加的Ｎグリコシル部位、および／またはアミノ酸改変から選択される少なくとも２つの更なる改変を、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインの中央部プロリンからアスパラギンへの置換に加えて含む。前記少なくとも２つの更なる改変は、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２および非構造タンパク質から選択される同じタンパク質において、または異なるタンパク質において、存在する。前記少なくとも２つの更なる改変はＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２から選択される同じタンパク質において、または異なるタンパク質において、存在することが好ましい。
【００３４】
なお更なる実施形態において、本発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、親ＣＳＦＶゲノムによりコードされるＥ２における８２９位から８３７位の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の付加を含む上記ウイルスを提供する。前記挿入付加は、改変されたＥ２タンパク質へのＥ２特異的モノクローナル抗体の結合を最小限化、更には阻害することになる。「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の挿入は好ましくは、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２および非構造タンパク質において、サイレントな突然変異、追加的Ｎグリコシル部位、および／またはアミノ酸改変、またはこの組み合わせから選択される少なくとも１つの更なる改変と、組み合わせられる。前記少なくとも１つの更なる改変は好ましくは、ＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位における例えばＵからＣへのサイレントな改変、７８９位におけるＳからＦへの改変、４４５位におけるＡからＴへの改変、７７４位におけるＤからＮへの改変、および／または８３１位におけるＶからＧへの改変から選択される。
【００３５】
本発明による組み換えＣＳＦＶの親ゲノムは好ましくは弱毒化されたＣＳＦＶ株のゲノムである。
【００３６】
弱毒化されたＣＳＦＶ株は、ＲＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＥｒｎｓ遺伝子の突然変異により（Ｍａｙｅｒら、２００３．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．９８：１０５−１６）；ＣＳＦＶ強毒性株からのＮｐｒｏの欠失により（Ｍａｙｅｒら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ２２：３１７−３２８）；ＥｒｎｓとＥ２における突然変異を組み合わせることにより（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２００４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８：８８１２−８８２３）；Ｅ１遺伝子の突然変異により（Ｒｉｓａｔｔｉら、２００５．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４３：１１６−１２７）；並びにＥ２遺伝子の突然変異により（Ｒｉｓａｔｔｉら、２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６４：３７１−８２）、形成できる。
【００３７】
好ましい弱毒化されたＣＳＦＶ株は、３’末端非コーディング領域に挿入を含む。例えば、３’未翻訳領域中の１２ヌクレオチドの挿入はＣＳＦＶの弱毒化をもたらす（Ｗａｎｇら、２００８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３７４：３９０−８）。前記挿入は好ましくは５’−ＣＵＵＵＵＵＵＣＵＵＵＵからなる１２ヌクレオチドの配列を含む。
【００３８】
最も好ましい親ゲノムはＣ（チャイニーズ）株のゲノムである。親ゲノムとして更により好ましいものは、ブタ腎臓細胞系統ＳＫ６の懸濁培養に適合されたＣ株ウイルスであるセジペスト（Ｃｅｄｉｐｅｓｔ）Ｃ株のゲノムである（Ｔｅｒｐｓｔｒａら、１９９０．Ｄｔｓｃｈ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．９７：７７−９）。セジペスト株４００から６００ＴＣＩＤ５０を接種されたブタは、予防接種後７日および６ヶ月において、ＣＳＦＶの強毒性株の１００ｐｉｇＬＤ５０より高値の攻撃に対して完全に保護される。従って、本発明はまたＥ２における８２９位から８３７位の改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインをコードする組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムのコピーを含むｃＤＮＡ分子を提供する。前記ｃＤＮＡ分子は好ましくは本発明による実質的に完全な組み換え親ＣＳＦＶウイルスゲノムを含み、これにより、前記親ゲノムはＣ（チャイニーズ）株から、またはより好ましくはセジペスト株から誘導される。好ましいｃＤＮＡ分子は「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むＥ２タンパク質をコードする組み換えＣＳＦＶゲノムのコピーを含む。本発明はまた、前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。本発明は更に、前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを含むタンパク質をコードするコンストラクトに関する。本発明は更に、前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを含むタンパク質、および前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを含むペプチド、および例えばＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイにおける前記タンパク質またはペプチドの使用に関する。
【００３９】
その他の態様において、本発明は本発明による組み換えＣＳＦＶを含む生ＣＳＦワクチンを提供する。
【００４０】
本発明による組み換えＣＳＦＶを含むワクチン、即ち免疫活性な組成物は、生弱毒化ウイルスにより誘導される保護の急速な誘導および延長性を、Ｅ２タンパク質の重要な免疫優性エピトープであるＥ２の保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける欠失のような相違に基づく、予防接種動物と野生型のウイルスを感染させた動物との間の区別の可能性と組み合わせている。
【００４１】
循環ウイルスレベルの顕著な低減および臨床症例の同時低減をもたらす数種のワクチンを開発している。例えばエンベロープ糖タンパク質Ｅ２に基づくＣＳＦＶに対するサブユニットワクチンを開発している。このサブユニットワクチンはＥＲＮＳに対する抗体の検出に基づいて、予防接種ブタと感染ブタとの間の判別を可能にする（Ｖａｎ Ａａｒｌｅ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ（Ｂａｓｅｌ）１１４：１９３−２００）。しかしながら、ワクチンは免疫の発生と持続時間の両方に関してＣ株ワクチンより劣っている。より重要な点として、このワクチンを伴うＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡはペスチウイルス属の他のメンバー（即ちＢＶＤＶおよびＢＤＶ）も検出する。従ってこれらの使用はこれらのウイルスが循環する領域においては推奨されない（２００３／２６５／ＥＣ；ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３）。
【００４２】
更なるワクチンがいわゆるウィルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）により提供される。ＶＲＰ粒子は、複製可能でありコードされたウイルスタンパク質を発現することができるが、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つにおける欠失のために粒子形成のために必要とされる完全な情報を含有していない突然変異体のゲノムＲＮＡを含有する。これらのウイルス粒子は非伝染性であり、従って安全なワクチンのための要件の１つを満足している。しかしながらＥ２遺伝子の部分的または完全な欠失を有するＶＲＰは、高度に強毒性のＣＳＦＶによる致死的攻撃に対抗しては僅かに部分的な保護のみしか誘導しなかった（Ｍａｕｒｅｒら、２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ２３：３３１８−２８）。
【００４３】
本発明は更に、本発明によるワクチンの有効量を動物に投与することを含む、ＣＳＦに対抗して上記動物を保護する方法を提供する。
【００４４】
有効量とは、これを投与する個体において免疫学的応答を誘導することにより、ワクチンに対する分泌、細胞および／または抗体媒介の免疫応答を個体において発生させる、前記ワクチンの量として定義される。ワクチンに対する前記分泌、細胞および／または抗体媒介の免疫応答はまた、強毒性ＣＳＦＶ株による攻撃に対抗して効果的である。
【００４５】
前記有効量は好ましくは経口、または口鼻または筋肉内に投与される。本発明による組み換えＣＳＦＶを含むブタコレラに対する免疫原性組成物は、好ましくは製薬上許容し得る担体と共に投与する。
【００４６】
ＣＳＦに対抗して動物を保護する別の方法は、特に野生の雄ブタのような野生動物を保護するための餌ワクチンとしての本発明のワクチンの有効量を提供することを含む。
【００４７】
効力のあるワクチンはウイルスの複製を防止することおよび／またはウイルスの伝染を低減することにより、臨床症状を低減または防止する。ＤＩＶＡ（感染動物を予防接種動物から区別する）という用語は、区別診断試験と連携して野生型ウイルスの突然変異体に基づいているワクチンおよびこの付随診断試験に関して使用される。この系は回復期の動物の血清学的発見を代償とすることなく感受性の動物集団の集団的予防接種を可能にする。
【００４８】
本発明は更に血清学的試験において動物の血清を分析することを含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、非感染動物から、または本発明によるＣＳＦワクチンを接種した動物から区別する方法を提供する。前記ＣＳＦＶワクチンは本発明のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインの改変、より好ましくは、Ｅ２タンパク質における少なくとも１つの更なる改変、例えばアミノ酸位置７７２から７７８のＬＦＤＧＴＮＰドメインにおける改変を含むことが好ましい。
【００４９】
前記血清学的試験は好ましくは未損傷のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質を認識するモノクローナル抗体のような抗体１つ以上、および、ＣＳＦＶによりコードされる更なるエピトープ、例えばＥ２タンパク質内部の更なるエピトープ、例えばＬＦＤＧＴＮＰエピトープを認識するモノクローナル抗体のような抗体１つ以上を含む。
【００５０】
好ましい実施形態においては、前記抗体の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）は生存ブタにおけるＣＳＦの診断を可能にする。好ましいＥＬＩＳＡは、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡである。好ましいＥＬＩＳＡはＥ２に基づいた競合的ＥＬＩＳＡ、例えばＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡである。改変されたＬＦＤＧＴＮＰドメインの存在下または非存在下に、改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含む突然変異体のＥ２タンパク質を有する動物の血清を予備インキュベートすることにより、前記改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインおよび改変されたＬＦＤＧＴＮＰドメインに対して指向された抗体に対する前記血清を枯渇させることができる。
【００５１】
最も好ましいＥＬＩＳＡはペプチド系のＥＬＩＳＡであり、その場合、ペプチドはマイクロウェルの試験プレートに交差結合される。前記交差結合は好ましくは例えばポリＬ−リジンのようなアンカータンパク質を通じて実施される。交差結合ペプチドを使用するＥＬＩＳＡは一般的には受動的にコーティングされたペプチドを使用するＥＬＩＳＡと比較して、より感度が高い。手法は比較的簡素に実施され、組織培養施設を必要とせず、自動化に適しており、半日以内に結果が出る。一方でＣＳＦＶの野生種とワクチン株との間、他方でＣＳＦＶと他のペスチウイルスとの間で、区別を明確に行うモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用することができる。ペプチドは非特異的な交差反応性をブロックするために使用される。
【００５２】
前記ペプチド系のＥＬＩＳＡは好ましくは液相ペプチドＥＬＩＳＡ（ｌｐＥＬＩＳＡ）である。ＣＳＦＶに対抗する抗体の検出のための前記ｌｐ−ＥＬＩＳＡにおいては、被験血清を修飾ＣＳＦＶペプチドと非相同対照ペプチド、例えばＢＶＤＶペプチドの混合物と共にインキュベートする。前記修飾されたＣＳＦＶペプチドは好ましくはビオチニル化されているのに対し、対照ペプチドはビオチニル化されていない。ＣＳＦＶ特異的抗体は前記ＣＳＦＶペプチドに結合することになり、前記修飾を通じて、例えばビオチニル化されたＣＳＦＶペプチドのアビジンまたはストレプトアビジンへの結合により、捕獲される。修飾されたＣＳＦＶペプチドと複合体化された抗体を検出することができ、例えば、複合体化されたブタ抗体は、抗ブタパーオキシダーゼコンジュゲートおよびその後の適切な基質とのインキュベーションにより検出される。
【００５３】
野生種ＣＳＦＶに感染しているか、本発明の組み換えウイルスで予防接種されている動物の区別のための代替の試験は、蛍光抗体試験（ＦＡＴ）および逆転写酵素とその後の例えばポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡ複製、および増幅されたＤＮＡの配列の分析により、与えられる。ＦＡＴはＣＳＦＶに感染している疑いのある、または、本発明によるワクチンを予防接種されているブタから単離した扁桃、脾臓、腎臓、リンパ節または回腸遠位部分の低温切片においてＣＳＦＶ抗原を検出するために使用される。代替の試験法においては、ＣＳＦＶは例えば野生種のＣＳＦＶに感染しているか感染の疑いのある動物の扁桃から単離され、ＰＫ−１５細胞と共にインキュベートされる。その後、複製したウイルスを、ＰＫ−１５細胞中で野生種のウイルスと本発明の組み換えウイルスとを区別する抗体を用いながら、検出する。
【００５４】
更なる好ましい血清学的試験は、前記血清が未損傷のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質に対抗して指向された抗体の結合を阻害する抗体を含むか、または、前記血清が改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質に対抗して指向された抗体の結合を阻害する抗体を含むかを調べるための競合的ＥＬＩＳＡを含む。
【００５５】
なお更に好ましい血清学的試験は、本発明による改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質を特異的に認識する１つ以上の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含む。よりいっそう好ましい実施形態において、前記血清学的試験は、本発明による改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインおよび前記Ｅ２タンパク質の更なる改変された免疫原性ドメインを含むＥ２タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体のような抗体１つ以上を含む。前記マーカーワクチンは動物への予防接種の後の判別抗体の信頼性の高い誘導および検出（感度および特異性）を必要とする。前記判別抗体の存在は、好ましくは蛍光抗体ウイルス中和試験、中和パーオキシダーゼ結合試験、および抗体ＥＬＩＳＡから選択される、上記血清学的試験により検出される。
【００５６】
本発明は更に、感染した動物を予防接種された動物から区別することができるようにするマーカーワクチン中で使用できる感染性組み換えウイルスを単離するための方法を提供し、方法は、前記ウイルスによりコードされ、ウイルスの少なくとも９０％において、好ましくはウイルスの少なくとも９５％において、より好ましくはウイルスの少なくとも９９％において、保存されているタンパク質の免疫優性ドメインを選択する工程；前記免疫優性ドメインをコードする前記ウイルスのゲノム領域中に、改変、好ましくは欠失を導入することにより、例えば出発ウイルスを形成する工程；改変されたゲノムを適する細胞または細胞系統に接触させる工程；適する細胞または細胞系統を継代することによりウイルスの増殖を可能にする工程；および、出発ウイルスの適合性の損失を補償するゲノム中の１つ以上の更なる改変を含む上記適する細胞または細胞系統から感染性ウイルスを単離する工程、を含む。
【００５７】
タンパク質の保存された免疫優性ドメイン中の前記改変は、野生型の免疫優性ドメインを発現するウイルスを改変された免疫優性ドメインを発現するウイルスから判別する、モノクローナルおよびポリクローナル抗体のような抗体の形成を可能にする。従って、本発明はまた、前記改変され保存された免疫優性ドメインを特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。
【００５８】
本発明は更に、前記改変され保存された免疫優性ドメインを含むタンパク質をコードするコンストラクトに関する。本発明は更に前記改変され保存された免疫優性ドメインを含むタンパク質、および、前記改変され保存された免疫優性ドメインを含むペプチドに関する。
【００５９】
保存された免疫優性ドメイン中に改変を含むワクチンは更に、未改変の免疫優性ドメインを認識する予防接種された個体における抗体の形成を誘導しない。前記未改変の保存された免疫優性ドメインを認識することを指向する診断試験は、野生型免疫優性ドメインを発現するウイルスに感染した動物を、予防接種した動物から判別することを可能にする。
【００６０】
保存された免疫優性ドメインの前記改変は、野生型ウイルスと比較して細胞を感染させることにおいてより低効率性であるか、および／または感染細胞中でより低効率に複製するウイルスをもたらす場合がある。感染した細胞または細胞系統の継代を行うことは、ウイルスを救済する１つ以上の第２の部位のゲノム改変の導入を可能とする。前記救済されたウイルスは、改変されたウイルスと比較してより効率的に感染し、および／または細胞中で複製するか、または保存された免疫優性ドメインの改変に相関する別の不都合に拮抗している。従って救済されたウイルスは保存された免疫優性ドメイン中の改変により導入された適合性の損失を補償する親ゲノムにおける１つ以上の更なる改変を含む。本発明による方法の更なる利点は、親ゲノム中の追加的な１つ以上の更なる改変が、親の免疫優性ドメインを含む復帰変異株のウイルスの形成を阻止する点である。
【００６１】
本発明による好ましい方法において、ゲノム領域中の前記改変は少なくとも１つのアミノ酸の欠失をもたらす。少なくとも１つのアミノ酸、例えば１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、または３つより多いアミノ酸の欠失は、親の免疫優性ドメインを含む復帰変異株ウイルスの形成を更に阻止することになる。
【００６２】
本発明による更なる好ましい方法においては、少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、親ウイルスのゲノムにおける少なくとも１つの更なる改変と組み合わせられる。前記少なくとも１つの更なる改変により、出発ウイルスの感染細胞または細胞系統の継代は、少なくとも１つのアミノ酸の前記欠失が前記細胞または細胞系統中のウイルスの複製にとって有害である場合には、可能となる。前記少なくとも１つの更なる改変の導入はある程度までは出発ウイルスの適合性を回復させ、出発ウイルスが前記細胞または細胞系統中で複製可能となる。
【００６３】
好ましい実施形態においては、前記ウイルスは負鎖ＲＮＡウイルス、例えば狂犬病ウイルスおよびニューカッスル病ウイルス、および正鎖ＲＮＡウイルス、例えばフラビウイルス科、好ましくはペスチウイルス、例えばウシウィルス性下痢ウイルス、ボーダー病ウイルス、およびＣＳＦＶから選択される。本発明の方法のために最も好ましいウイルスはＣＳＦＶである。
【００６４】
本発明は更に本発明の方法により得ることができる感染性組み換えウイルス、好ましくはＣＳＦＶを提供する。
【００６５】
本発明はまた、本発明の方法により得ることができる感染性組み換えウイルス、好ましくはＣＳＦＶの使用、例えば１匹以上の動物に予防接種することにより前記動物を強毒性野生種ウイルスによる感染に対抗して保護するためのワクチンにおける使用を提供する。
【００６６】
ワクチンの前記使用は、感染動物を非感染動物または予防接種動物から区別できるようにする。
【００６７】
効力のあるマーカーワクチンの主要な利点は、これが予防接種ブタ集団中の感染ブタの検出を可能にし、これによりブタ集団におけるＣＳＦＶの蔓延または再伝播をモニタリングする可能性を付与する点である。即ち、予防接種ブタ集団が検査室試験結果に基づいてＣＳＦ非含有であることをある程度の信頼性をもって宣言できるようになる。
【００６８】
後者は生存ブタまたはブタ製品の輸出のための制限期間を短縮することができる。商取引の迅速な続行の経済的利点は明らかであり、従って、いずれかのマーカーワクチンの使用に緊密に関連している。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ｅ２における導入された適応突然変異。 ａ研究中の組み換えウイルスの７７２位から７９１位および８２３位から８４２位のアミノ酸の比較。 ｂ導入されたアミノ酸置換は太字で示し、適応突然変異は太字斜体で示す。 ｃＴＡＶＳＰＴＴＬＲおよびＬＦＤＧＴＮＰエピトープは枠内に表示。 ｄ＋＋；ウイルスは救済され、生育はｖＦｌｃ３４（野生型）のものに匹敵していた。＋；ｖＦｌｃ３４と比較して減損した生育のウイルス。＋：ウイルスは数回の継代の後に培養基から消失していた。−；ウイルスは検出されなかった。ｎｄ；測定せず。 ｅ新たに導入されたＡＡＵコドンの１つはウイルスの増殖中に欠失した。
【図２】ｖＦｌｃ３４（野生型Ｃ株）、Ｃ株グリコシル化突然変異ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２およびＣ株欠失突然変異体ｖＦｌｃ−ΔＰおよびｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のインビトロの生育特性。ＳＫ６．Ｔ７単層を感染させ、メチルセルロースを含有する生育培地で被覆し、４日間３７℃でインキュベートした。単層を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パーオキシダーゼコンジュゲートｍＡｂ ＷＢ１０３で免疫染色した。
【図３】（Ａ）ウイルスｖＦｌｃ３４（◇）、ｖＦｌｃ−Ｎ１（□）、ｖＦｌｃ−Ｎ２（○）、および（Ｂ）ｖＦｌｃ３４（◇）、ｖＦｌｃ−ΔＰ（×）およびｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（Δ）の多段階生育曲線。ＳＫ６．Ｔ７細胞は０．１の感染多重度で感染させた。
【図４】未感染（擬似検体）、またはｖＦｌｃ３４、ｖＦｌｃ−Ｎ１またはｖＦｌｃ−Ｎ２をそれぞれ感染させたＳＫ６．Ｔ７細胞の溶解物、およびＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後の同試料を含有する変性ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット。タンパク質はｍＡｂ Ｃ２および二次抗体としてのパーオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリンにより検出した。オリゴマー（Ｏ）、単量体（Ｍ）およびＰＮＧａｓｅ Ｆ−処理単量体（Ｍ＊）の位置を示す。分子量標準物質タンパク質の位置は左側に示す。
【図５】ｖＦｌｃ−３４（Ａ）、ｖＦｌｃ−Ｎ１（Ｂ）、またはｖＦｌｃ−ΔＰ（Ｃ）により誘導された、それぞれＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（▲）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（□）によるＥ２およびＥＲＮＳ抗体の応答の分析。記載した数値は平均（ｎ＝４）および標準偏差である。
【図６−１】左パネル：ｖＦｌｃ３４（ウサギ１．１（Ａ）および１．２（Ｂ））またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ウサギ２．１（Ｃ）、２．２（Ｄ）および２．３（Ｅ））により誘導された、それぞれＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（▲）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（□）によるＥ２およびＥＲＮＳ抗体の応答の分析。右パネル：ＰＥＰＳＣＡＮ分析による第３６日において得られたウサギ抗血清の分析。１６２ペプチドとのウサギ抗血清の反応性（ｘ軸）を示す。Ｘ軸上の数字はＣＳＦＶポリペプチド中のペプチドＮ末端の位置に相当する。ｙ軸はＯＤｃｃｄ値を示す。
【図６−２】左パネル：ｖＦｌｃ３４（ウサギ１．１（Ａ）および１．２（Ｂ））またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ウサギ２．１（Ｃ）、２．２（Ｄ）および２．３（Ｅ））により誘導された、それぞれＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（▲）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（□）によるＥ２およびＥＲＮＳ抗体の応答の分析。右パネル：ＰＥＰＳＣＡＮ分析による第３６日において得られたウサギ抗血清の分析。１６２ペプチドとのウサギ抗血清の反応性（ｘ軸）を示す。Ｘ軸上の数字はＣＳＦＶポリペプチド中のペプチドＮ末端の位置に相当する。ｙ軸はＯＤｃｃｄ値を示す。
【図６−３】ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープとのｖＦｌｃ３４（Ｆ）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（Ｇ）に対して育成したウサギ抗血清由来の抗体の反応性の比較。Ｘ軸上の数字はＣＳＦＶポリペプチド中のペプチドＮ末端の位置に相当する。ｙ軸はＯＤｃｃｄ値を示す。
【図７】ＣＳＦＶ Ｃ株Ｅ２タンパク質の外ドメインの抗原構造の案（Ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：３９３４−４２から変更）。抗原ドメインＢ／ＣおよびＡを示す。テキスト中で言及しているＰＮＧＳの位置は矢印で示す。これらの突然変異体において、記載したアミノ酸はＡｓｎ残基に置換されている。正規のＮ連結グリカンは実線で描画し、新たに導入された（推定）Ｎ連結グリカンは破線で描画する。ネイティブのＥ２構造中で共局在していると予測されるＥ２の位置は陰影部分である。Ｂ細胞エピトープ８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７および７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８は太字で示す。
【図８】ｖＦｌｃ３４（Ａ；ブタ番号３１６６から３１７０）、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（Ｂ；ブタ番号３１７１から３１７５）を予防接種したブタ、または、培養基のみを接種したブタ（Ｃ；ブタ番号３１７６から３１７８）の体温（黒符号）および臨床数値（ＣＳ；白符号）。ブタには第２８日に強毒性のブレシア株で攻撃した。発熱は４０℃超の体温として定義した（破線）。
【図９】高度に強毒性のブレシア株の致死量で攻撃したブタから得られた末梢血中の末梢血白血球（Ａ）および血小板（Ｂ）計数値。攻撃２８日前において、ブタに培養基のみを接種するか、またはｖＦｌｃ３４（ブタ番号３１６６から３１７０）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ブタ番号３１７１から３１７５）を１回予防接種した。
【図１０】ｖＦｌｃ３４またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種し、その後強毒性ブレシア株で攻撃したブタにおいて誘導された抗体応答の分析。ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＣＳＦＶ Ａｂ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（Ａ）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（Ｂ）を用いて抗体応答を分析した。４０％または５０％を超えるブロッキングをもたらした血清を、それぞれＥ２ ＥＬＩＳＡおよびＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにおいて、ＣＳＦＶ抗体に関して陽性とみなす。ブタは第０日にｖＦｌｃ３４（ブタ番号３１６６から３１７０；破線）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ブタ番号３１７１から３１７５；実線）を予防接種し、第２８日に攻撃した（矢印）。
【００７０】
実施例
【実施例１】
【００７１】
材料および方法
ウイルスおよび細胞。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＳＫ６．Ｔ７）を構成的に発現するブタ腎細胞（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：１１７−２８）をグルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、５％ウシ胎児血清および抗生物質ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、アンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）および適宜、１０ｍＭ２塩酸Ｌ−ヒスチジノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＫ１０００培地中で生育させた。特段の記載が無い限り、ウイルス保存液は、ＳＫ６．Ｔ７細胞上で３から４回ウイルスを継代し、その後、感染単層の２回連続凍結／解凍サイクルを行うことにより作成した。後者は強度に細胞会合性であるＣ株ウイルスの放出を最大限とするために実施した。ウイルス保存液はｌｏｇ１０希釈でＳＫ６．Ｔ７細胞上で力価検定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして求めた。
【００７２】
Ｃ株突然変異体の構築。Ｔ７プロモーター制御下の「セジペスト」ＣＳＦＶ Ｃ株のＤＮＡコピーを含有するプラスミドｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４を部位指向性突然変異誘発により突然変異を導入するための鋳型として使用した。Ｃ株ウイルスの以前に公開されたＤＮＡコピー、即ちｐＰＲＫｆｌｃ−１３３（（Ｍｏｏｒｍａｎｎら、１９９６．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：７６３−７０）はゲノムの３’末端の−１０位におけるシトシンを欠いていることがわかった。ｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４において、このエラーを補正する。プライマーは表１に示す。フォワードプライマーの名称は構築された組み換えウイルスの名称に相当する。プライマーＲＶ−ｒを各構築のためのリバースプライマーとして使用した。ＰＣＲ増幅は、エキスパンドハイフィディリティーＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。ＰＣＲ産物は製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書に従ってｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター内にクローニングし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０遺伝子分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。ＰＣＲ産物はＡｐａＬＩで消化することによりｐＧＥＭ−Ｔプラスミドから遊離させ、Ｃ株ウイルスの５’側半分をコードするｃＤＮＡを含有するｐＯＫ１２−誘導プラスミドであるプラスミドｐＰＲｃ１２９の相当するゲノムフラグメントを置き換えるために使用した。その後ｐＰＲｃ１２９プラスミドをＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、得られたフラグメントは、プラスミドｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４の相当するセグメントを置き換えるために使用し、これによりプラスミドｐＦｌｃ−Ｎｌ、ｐＦｌｃ−Ｎ２、ｐＦｌｃ−Ｎ３、ｐＦｌｃ−Ｎ４、ｐＦｌｃ−Ｎ５、ｐＦｌｃ−ΔＰ、ｐＦｌｃ−ΔＰＴ、ｐＦｌｃ−ΔＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＳＰＴ、ｐＦｌｃ−ΔＶＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＡＶＳＰおよびｐＦｌｃ−ΔＳＰＴＴＬを得た。
【００７３】
Ｃ株突然変異体のウイルス生産。完全長ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドをＸｂａＩで線状化し、以前に記載されている通りＳＫ６．Ｔ７細胞にトランスフェクトした（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：１１７−２８）。トランスフェクションの４日後、ウイルスタンパク質の発現を、ＣＳＦＶ非構造タンパク質ＮＳ３に対して指向されたｍＡｂ ＷＢ１０３を用いながらイムノパーオキシダーゼ単層試験（ＩＰＭＡ）により測定した（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９１．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９：１０１−８）。別のウェルに由来する細胞をトリプシン処理し、２５ｃｍ２の組織培養フラスコに移し、３から４日間生育させた。必要に応じて、細胞を反復して継代することにより、ウイルスの生育を支援した。単層を凍結解凍し、遠心分離することにより細胞破砕物を除去し、その後、−７０℃で保存した。清澄化した溶解物を用いながら、新しいＳＫ６．Ｔ７細胞を感染し、次いで４日後に採取することによりワクチン候補のシードロットを調製した。ウイルスの生育は常時、ＳＫ６．Ｔ７細胞上で実施した。本明細書に記載したウイルスはＳＫ６細胞上でも正常に複製するが、ＳＫ６．Ｔ７細胞を用いた場合のほうが、生産収率がより正確な再現性を示した。
【００７４】
救済されたウイルスの生育動態を研究するために、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中のサブコンフルエントな単層を０．１の感染多重度で感染させた。感染２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、１４４時間後および１６８時間に、細胞溶解物中のウイルス力価を測定した。材料を２回凍結解凍し、４℃で２５００×ｇで遠心分離することにより清澄化し、−７０℃で保存した。ウイルス力価（ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ）をＳＫ６．Ｔ７細胞上で求めた。救済されたウイルスのＥ２遺伝子を配列決定した。適宜、キャプシド（Ｃ）、ＥＲＮＳおよびＥ１タンパク質（即ち構造タンパク質）をコードする遺伝子も配列決定した。この目的のため、ウイルスＲＮＡをＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ全ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いながら単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および遺伝子特異的プライマーを用いながらｃＤＮＡ合成のために使用した。ｃＤＮＡは上記した通り配列決定した。
【００７５】
ウエスタンブロット。感染ＳＫ６．Ｔ７細胞の溶解物を２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中に生育させたコンフルエントな単層から調製した。この目的のために、細胞は１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＢＤＨ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）を含有する０．５ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で溶解させた。細胞破砕物を４℃で１０，０００×ｇで４分間遠心分離することにより除去した。タンパク質は１２％ポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離し、そしてその後、ニトロセルロース紙（Ｐｒｏｔｒａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移行させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％Ｐｒｏｔｉｆａｒ（Ｎｕｔｒｉｃｉａ）を含有するＰＢＳでブロッキング後、ブロットをＥ２のＢ／Ｃドメインに対して指向されたＣ株特異的ｍＡｂ Ｃ２（Ｂｏｇｎａｒ ａｎｄ Ｍｅｓｚａｒｏｓ，１９６３．Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｈｕｎｇ １３：４２９−４３８）、次にパーオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートした。パーオキシダーゼ活性はＳｔｏｒｍ ８６０分子画像化装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いながら増強ケミルミネセンスシステム（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
【００７６】
イムノパーオキシダーゼ単層試験（ＩＰＭＡ）。単層をＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、風乾し、−２０℃で凍結した。単層をパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％ｗ／ｖ）で１５分間固定し、その後ＰＢＳで洗浄した。パーオキシダーゼコンジュゲートＡドメイン特異的ｍＡｂであるｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ７（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６）、ｃ１、ｃ４、ｃ８、ｃ１１（Ｂｏｇｎａｒ ａｎｄ Ｍｅｓｚａｒｏｓ，１９６３．Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｈｕｎｇ １３：４２９−４３８）およびＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡで使用するｍＡｂ、即ちｍＡｂ １８．４を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０および５％ウマ血清を含有するＰＢＳ中（ＰＢＳ−Ｔ）で使用した。１時間３７℃でインキュベートした後、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後パーオキシダーゼの活性を基質として３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（ＡＥＣ、Ｓｉｇｍａ）を用いながら検出した。
【００７７】
ウサギの接種。約２ｋｇのニュージーランド白ウサギを２匹から４匹の群で飼育した。体温は接種の３日前から５日後まで毎日モニタリングした。ウサギの正常体温は３８．５から４０．１℃である。従って、発熱は４０．１℃を超える体温として定義した。ウサギはウイルス１０３ ＴＣＩＤ５０を含有する生育培地２００μｌで耳辺縁静脈を介して接種した。７日毎に、血清を採集した。ウイルス単離のために使用するべきＥＤＴＡ血液の接種４日後に採集した。
【００７８】
ウイルス単離。末梢血白血球（ＰＢＬ）をＥＤＴＡ血液試料から、記載（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８８．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６：１２３−８）に従って塩化アンモニウム沈殿（０．８３％ＮＨ４Ｃｌ）により濃縮した。ＰＢＬをＰＢＳに再懸濁し、−７０℃で凍結した。翌日、サブコンフルエントのＳＫ６．Ｔ７細胞単層を１時間凍結解凍したＰＢＬの懸濁液と共にインキュベートし、その後懸濁液を新しい生育培地に交換し、その後４日間インキュベートした。配列分析のために十分なウイルスを生産するために、救済されたウイルスをＳＫ６．Ｔ７細胞上で数回継代した。
【００７９】
ＰＥＰＳＣＡＮ分析。ＣＳＦＶポリタンパク質のアミノ酸６９０から８５１に渡るＣＳＦＶ株ブレシアＥ２タンパク質から誘導されたオーバーラップ１５アミノ酸長ペプチドの完全なセットを以前に記載されている通り（Ｇｅｙｓｅｎら、１９８４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２）クレジットカードフォーマットｍｉｎｉＰＥＰＳＣＡＮカード中で合成した。各ペプチドへの血清由来抗体の結合はＳｌｏｏｔｓｔｒａらの記載の通りｐｉｎに基づいてＥＬＩＳＡにおいて試験した（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら、１９９６．Ｍｏｌ Ｄｉｖｅｒｓ １：８７−９６）。
【００８０】
結果
新たに導入された潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）を有するＣ株突然変異体の生産および特性化。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の新たに導入された潜在的Ｎ連結グリコシル化部位を有する突然変異体Ｃ株ウイルスをコードする完全長ｃＤＮＡコンストラクト（図１）は、Ｔ７プロモーター制御下のｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４、即ち「セジペスト」Ｃ株のｃＤＮＡクローンの遺伝子修飾により構築した。Ｎ連結グリコシル化のための最低条件は、アミノ酸配列アスパラギン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）またはセリン（Ｓｅｒ）の存在であり、ここでＸはＰｒｏとアスパルテート（Ａｓｐ）を除くいずれかのアミノ酸であることができる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１−６４）。突然変異体ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ１は単一の新たに導入されたＰＮＧＳを含有するのに対し、突然変異体ｖＦｌｃ−Ｎ２、ｖＦｌｃ−Ｎ３、ｖＦｌｃ−Ｎ４およびｖＦｌｃ−Ｎ５は多数を含有する（図１）。ｖＦｌｃ−Ｎ５ウイルスにおいて、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部のＰｒｏ残基（Ｐｒｏ８３３）は２つのＡｓｎ（Ｎ）残基と置換されており、２つのオーバーラップするＰＮＧＳをもたらしている（即ちＮＮＴＴ）。
【００８１】
組み換えウイルスを生産するために、線状化されたプラスミドを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するＳＫ６．Ｔ７細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、全例において、培養基中の感染性ウイルスの存在が新しいＳＫ６−Ｔ７細胞の感染により明らかにされた。しかしながら、ウイルスの適合性における大きな相違が観察された。ｖＦｌｃ−Ｎ１の感染巣はｖＦｌｃ３４のものよりも幾分小型であった（図２）が、多段階生育曲線によればこれらの２種のウイルスの適合性には有意差はなかった（図３Ａ）。ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ２は明確により弱毒化しており、かなり小型の病巣およびより低値の最終力価をもたらした（それぞれ図２および図３Ａ）。ｐＦｌｃ−Ｎ３またはｐＦｌｃ−Ｎ４でトランスフェクトした細胞の上澄みに由来するウイルスを１回または２回継代したが、最終的には消失した。突然変異によりこれ自体の適合性を増大させる機会を有するウイルスを得るために、これらのウイルスを含有する細胞を反復して継代した。しかしながら残念にも、陽性染色された細胞の数はこれらの継代の間に増大せず、適合性補償突然変異が導入されなかったことを示唆していた。
【００８２】
興味深いことに、ｐＦｌｃ−Ｎ５から生産されたウイルス（図１）はトランスフェクトした細胞の僅か数回の継代の後に救済されており、最終的には１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価をもたらした。このウイルスのＥ２遺伝子を配列決定したところ、未変化であることがわかった。ｖＦｌｃ−Ｎ５をより大量に生産するために、ウイルスを用いて新しいＳＫ６．Ｔ７細胞を感染させた。これによりｖＦｌｃ３４の通常得られるものと同様の力価が実際に得られたが（データ示さず）、コンセンサス配列は、ウイルスは２つの新たに導入されたＡｓｎ残基の一方を損失しており、このため、ｖＦｌｃ−Ｎ１と本質的に同一であったことを示していた。この所見は、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の第２のＡｓｎ残基が感染プロセスのある段階においてウイルスに対して有害であることを示唆している。結果として、ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２のみがその後の研究に適していると考えられた。
【００８３】
ＤＩＶＡワクチンとして適しているためには、ワクチン候補はＡドメイン特異的抗体をインビボで誘導不可能でなければならない。しかしながら、現在の候補中に導入された修飾がＡドメインの抗原性の構造に影響したかどうかに関する第１の考えを得るために、本発明者らは組み換えウイルスが本発明者らのＡドメイン特異的ｍＡｂのいずれかによりＩＰＭＡ中で認識されるかどうかを調べた。使用したＡドメイン特異的ｍＡｂはＣＳＦＶ株ブレシア（即ちｍＡｂ ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ７）またはＣ株（即ちｃ１、ｃ４、ｃ８およびｃ１１）のいずれかに対して育成した。Ｃｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡにおいて使用したｍＡｂ、即ちｍＡｂ１８．４をこれらの実験に使用した。本発明者らの抗体の一部は野生型Ｃ株を弱く染色したのみであったため、突然変異体Ｃ株ウイルスを認識する抗体の能力を、メチルセルロース被覆下にウイルスを生育させることにより生じさせた感染巣を染色することにより検討した。野生型Ｃ株の感染巣は使用した全抗体により明確に染色されたが、これらの実験は、Ｐｒｏ８３３→Ａｓｎの置換はインビトロのｍＡｂによるＡドメインの認識を防止するために十分であることを示していた（データ示さず）。
【００８４】
ビリオンの表面におけるこの露出およびこれが中和抗体に対する優性な標的であるという事実にも関わらず、ＡドメインのＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープは進化の過程に渡って保存されている。このことは、この当該配列を含有するウイルスが、この領域中にアミノ酸置換を含有するウイルス集団内部の変異体を超えた選択的利点を有することを示唆している。本発明者らはこのエピトープ中に１つ（即ちｖＦｌｃ−Ｎ１）または２つ（即ちｖＦｌｃ−Ｎ２）のいずれかの新たに導入されたＰＮＧＳを有するウイルスを回収することができたが、組織培養物中の生育時のこれらの突然変異体の進化を研究することは明確に関連性があった。この目的のために、ｖＦｌｃ−Ｎ１をインビトロで３０回継代した。ウイルスの表現型の安定性を研究するために、感染した単層を非構造タンパク質ＮＳ３に対して指向された抗体、即ちＷＢ１０３で免疫染色し、２連の単層をＡドメイン特異的抗体ｂ３およびｂ４の混合物で染色することにより、表現型の復帰変異体（即ちＡドメインがこれらの抗体で染色されるウイルス）が存在するかどうか調べた。僅か３継代の後、ｖＦｌｃ−Ｎ１に感染させた細胞の極めて低比率がｂ３／ｂ４混合物で染色され、表現型の復帰が起こったことが明らかに示されていた。集団生物学の一般的競争排除原理によれば、資源が限定されている環境中に２生物が共存している場合、一方が最終的には他方より優勢となる（Ｇａｕｓｅ，１９３４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９：１６−１７）。このことを考慮し、本発明者らは表現型の復帰突然変異体がウイルスの反復継代によりｖＦｌｃ−Ｎ１より優勢に生育できるかどうか調べることとした。驚いたことに、表現型復帰突然変異体の量は極めて低いレベルのままであり、殆どの実験において、ｂ３／ｂ４ ｍＡｂ混合物で染色された僅か数個の細胞により現れたのみであった。即ち、表現型復帰突然変異体ウイルスは連続的に生じたが、ウイルス集団中では少数派変異体として常時維持されていたと考えられる。この所見はｖＦｌｃ−Ｎ１と相対比較して表現型復帰変異体ウイルスのより低値の適合性を示唆しているため、本発明者らは復帰突然変異体ウイルスが野生型のＣ株配列への真の復帰を示している可能性は低いと考えた。復帰突然変異体の表現型を担っている突然変異を発見するためには、ウイルス集団は、このゲノムを配列決定可能とするために復帰突然変異体ウイルスに関してリッチ化する必要があった。９６穴プレート中にウイルスの希釈液を播種することにより、表現型復帰変異体に関してリッチ化された集団を選択できる。この選択を反復した後、このゲノム配列を決定するために十分な量の復帰突然変異体ウイルスを含有している集団を得た。２つの個別の実験において、表現型復帰突然変異体はＡｓｎコドンにおける単一対突然変異（ＡＡＵからＡＧＵ）に起因して、Ａｓｎが導入された位置（即ちＣＳＦＶポリタンパク質の８３３位）にＳｅｒ残基を含有することがわかった。この突然変異はＰＮＧＳの損失をもたらすため、Ａドメインを認識するｍＡｂの能力回復を伴うことは意外ではない。結論として、復帰突然変異体サブ集団の検出は、ｖＦｌｃ−Ｎ１が突然変異によりこの適合性を増大させる可能性を探索していることを示している。しかしながら、新たに導入されたＡＡＵコドンはマスター遺伝子型により維持されているため、ウイルスは集団レベルでは遺伝子的に安定であると考えられる。
【００８５】
ｖＦｌｃ−Ｎ２の分析はｖＦｌｃ−Ｎ１を用いた実験の間に観察されたものと同様の特性を有する表現型変異体を示したが、これらは更には特性化しなかった。
【００８６】
１つまたは多数の新たに導入されたＰＮＧＳを有するＥ２タンパク質の相対的な電気泳動運動性の分析。ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の新たに導入されたＰＮＧＳがＥ２への新しい炭水化物部分の結合をもたらしたかどうかを調べるために、修飾されたＥ２タンパク質の相対的な電気泳動運動性を還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、次いでウエスタンブロットにより検討した。ｖＦｌｃ３４、ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２を感染させた細胞の分離タンパク質を含有するウエスタンブロットによれば、ｖＦｌｃ−Ｎ１のＥ２タンパク質はｖＦｌｃ３４の相当するタンパク質よりも高値の分子量を有していた（図４）。Ｅ２を含有するオリゴマーも検出されたが、タンパク質を変性条件下で分析したことを考慮すれば、これらのオリゴマーは恐らくは生理学的なものではない（図４）。タンパク質からＮ連結グリカン類を除去する酵素であるＰＮＧａｓｅ Ｆで細胞溶解物を処理したところ、同一の分子量のＥ２タンパク質が生じた。
【００８７】
ｖＦｌｃ−Ｎ２の分離タンパク質を含有するウエスタンブロットは、２つの新たに導入されたグリコシル化シークオンの少なくとも１つが炭水化物部分のための係留部位として使用されることを示唆した（図４）。これらの溶解物は、より高分子量のＥ２タンパク質でさえも含有すると考えられ、第２のグリコシル化部位のグリコシル化を示唆している。
【００８８】
ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中のターゲティングされた欠失を有するＣ株突然変異体の生産および特性化。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのターゲティングされた欠失を有するＣ株ウイルスをコードする完全長ｃＤＮＡコンストラクト（図１）をグリコシル化突然変異体に関して上記した通り構築した。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部Ｐｒｏ残基の欠失はｖＦｌｃ−ΔＰをもたらし、これはｖＦｌｃ３４と比較すれば幾分より小型の感染巣を生じさせ（図２）、大部分の実験において１０倍低値の力価まで生育した（図３Ｂ）。しかしながら得られた最高の力価は１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌを超えていた。ＩＰＭＡによるｖＦｌｃ−ΔＰの分析によれば、このＣ株突然変異体は本発明者らのＡドメイン特異的ｍＡｂのいずれによっても検出されなかった。留意すべきは、２０継代の後、コンセンサス配列決定によればＳｅｒ７８９コドンにおける対突然変異（ＵＣＣからＵＵＣ）が明らかになり、これはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）とのセリンの置換をもたらしていた。得られたウイルスはｖＦｌｃΔＰａ１と命名した（図１）。
【００８９】
ｖＦｌｃ−ΔＰとは対照的に、１つより多いアミノ酸の欠失を有するウイルスは高度に無力化されていた。グリコシル化突然変異体ｖＦｌｃ−Ｎ３およびｖＦｌｃ−Ｎ４に関して既に記載したものと同様、これらのウイルスをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞の上澄みに由来するウイルスは、数回継代できたが、その後消失した。突然変異により自体の適合性を増大させる機会を有するウイルスを得るために、これらのコンストラクトでトランスフェクトされた細胞を反復して継代した。ｐＦｌｃ−ΔＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＳＰＴ、ｐＦｌｃ−ΔＶＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＡＶＳＰおよびｐＦｌｃ−ΔＳＰＴＴＬでトランスフェクトした細胞の継代ではウイルス生産の増大は起こらなかった。
【００９０】
ｐＦｌｃ−ΔＰＴでトランスフェクトした細胞の初回継代の間、結果は他の欠失コンストラクトを用いて得られたものと同様であり、一定に小型（１０から２０個の細胞の平均）である感染巣が生じた。しかしながら、数回の追加的継代の後、免疫染色によれば、突然向上したウイルス生育が観察され、これはウイルスが適合性補償突然変異を導入していたことを示唆していた。得られたウイルスはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名した。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の推定蘇生突然変異を識別するために、このＥ２遺伝子のコンセンサス配列を決定した。明らかにこれはウイルスが導入された欠失を保持しており、Ｅ２遺伝子中に２つの突然変異を導入していたことを示していた。好都合なことに、突然変異の１つの配列クロマトグラム中の明確な二重ピークは、ＧＡＣからＡＡＣへのコドンの変化をもたらした対突然変異が最初に発生していたことを示唆していた（データ示さず）。この突然変異はＡｓｐ７７４からＡｓｎへの置換をもたらし、興味深いことにＥ２のＡドメイン中に新しいＰＮＧＳを導入していた（図１および７）。第２の変化はＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのバリン（Ｖａｌ）−８３１コドン内部の転換型突然変異（ＧＵＧからＧＧＧ）であり、これはＶａｌからグリシン（Ｇｌｙ）への置換をもたらした。
【００９１】
適応突然変異もまた他の構造タンパク質をコードする遺伝子中に存在する可能性を考慮し、Ｃ、ＥＲＮＳおよびＥ１遺伝子のコンセンサス配列も決定した。Ｃ遺伝子およびＥＲＮＳ遺伝子の配列分析によれば後者において僅か１つのサイレントな突然変異が明らかになった（Ｕ１５４９→Ｃ）。興味深いことに、Ｅ１遺伝子において、２２７５位における対突然変異（Ａ２２７５→Ｕ）が検出され、これはアスパラギン酸（Ａｓｐ）とのグルタミン酸（Ｇｌｕ）−６３４の置換をもたらしている（表２）。
【００９２】
ｖＦｌｃ３４およびｖＦｌｃ−ΔＰと相対比較した場合のｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のインビトロの生育特性を多段階生育曲線により可視化する（図３）。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスはｖＦｌｃ３４よりも幾分緩徐に生育したが、同一の最終力価が得られる。
【００９３】
ウイルス生産型プラスミドｐＦｌｃ−ΔＰＴの実験的進化。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の配列分析から得られた結果により、ＥＲＮＳにおけるサイレントな突然変異、Ｅ１におけるアミノ酸置換およびＥ２における２置換が適合性回復の原因であることが本発明者らに示唆される。この仮説を試験するために、ｐＦｌｃ−ΔＰＴによる１０独立トランスフェクションを実施し、構造タンパク質をコードする遺伝子を配列決定した。トランスフェクトされた細胞を反復継代し、ウイルスの存在をｍＡｂ ＷＢ１０３を用いながらＩＰＭＡによりモニタリングした。僅か２から３継代の後、陽性細胞の数は明確に増大し、ウイルスが適合性補償突然変異を導入したことが示唆された。１１継代の後、ウイルスのゲノムをｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に関して記載した通り分析した。この実験の結果を表２に総括する。Ａｓｐ７７４→Ａｓｎ置換をもたらした突然変異は１０進化ウイルス中６つにおいて観察され、平行進化を明らかに示していた。しかしながら、これらのウイルスの１つにおいて、Ａｓｐ７７４→Ｇｌｕ置換をもたらした突然変異が観察され、３つの残余のウイルスにおいては、アミノ酸７７４のコドンに突然変異は観察されなかった。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１におけるＶａｌ８３１→Ｇｌｙの原因となった突然変異が１つのウイルスで検出された（即ちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ８、表２）。
【００９４】
興味深いことに、１５４９位のサイレントな突然変異は全てのウイルスにおいて観察された。この結果は天然の選択はＲＮＡレベルでも作動していること、および、追加的な適応突然変異はこの実験では分析しなかったゲノムの領域で観察される可能性があることを示している。しかしながら、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のゲノムにおいて検出された４つの突然変異のうち３つがここでもまた現在の実験においてウイルスの進化の間に導入されたことを観察したことは印象的であった。注目すべきは、ウイルスｖＦｌｃ−ΔＰＴａ５においては、第５の位置における突然変異が検出された。ＥＲＮＳ遺伝子におけるサイレントな突然変異およびＥ２におけるＡｓｐ７７４→Ａｓｎ置換の他に、このウイルスはＥＲＮＳ遺伝子のＡｌａ４４５コドンにおける対突然変異（ＧＣＡからＡＣＡ）を導入しており、これによりＡｌａ４４５のＴｈｒとの置換がもたらされた（表２）。
【００９５】
ｖＦｌｃ−ΔＰおよびｖＦｌｃ−Ｎ１に対する抗体応答の分析。Ａドメイン特異的抗体がインビトロでｖＦｌｃ−ΔＰおよびｖＦｌｃ−Ｎ１を認識する能力が無いことは、本発明者らがＡドメインの抗原性構造を修飾することに成功したことを示している。しかしながら、ＤＩＶＡワクチンとして適しているためには、インビボで誘導された抗体応答は、予防接種動物から感染動物を血清学的に区別することが可能となるために十分鈍化されなければならない。ワクチン候補は最終的にはブタにおけるこれらのＤＩＶＡ特性および保護効力に関して試験されることになるが、現作業においては、本発明者らは２つの主要な理由から、体液性免疫応答の分析のためにウサギを使用することを好適とした。第１に本発明者らは研究中のワクチンウイルスがインビボで増殖し得感染を行えるかどうかを調べたいと考えた。ブタにおいて、Ｃ株ウイルスの接種はいかなる臨床症状も誘導しないのに対し、ウサギにおける接種は一時的な発熱疾患を誘導する。従って、ウサギを使用することにより増殖性感染を確認できるようになり、更に、選択された候補の毒性における潜在的相違を研究できるようになり、これによりインビボのウイルスの適合性に関する考え方が与えられる（ｄｅ Ｓｍｉｔら、２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ １８：２３５１−８）。ウサギを使用することの第２の利点は、Ｃ株ウイルスを血液から単離できることであり、これはブタを使用する場合には成功しない場合が多い。インビボ複製後のワクチンウイルスの単離は、導入された遺伝子修飾が安定に維持されているかどうかを調べることを可能にした。ウサギ４匹の群にｖＦｌｃ−ΔＰまたはｖＦｌｃ−Ｎ１を接種した。対照動物にはｖＦｌｃ３４か培養基のいずれかを接種した。馴化期間中、ウサギの平均体温は正常であった（３９．２℃、ＳＤ±０．２８、ｎ＝６８）。発熱は４０．１℃超の体温として定義した。発熱はまず、ｖＦｌｃ３４（４０．７℃、ＳＤ±０．４８、ｎ＝４）およびｖＦｌｃ−Ｎ１（４０．５℃、ＳＤ±０．３２、ｎ＝４）を接種した群において、両方とも接種後２日に観察された。ｖＦｌｃ−ΔＰを接種したウサギにおける上昇した体温（４０．０℃、ＳＤ±０．１３、ｎ＝４）は接種後３日に観察された。
【００９６】
ウイルスはｖＦｌｃ３４を接種したウサギ４匹中３匹、ｖＦｌｃ−Ｎ１を接種したウサギ４匹中３匹、およびｖＦｌｃ−ΔＰを接種したウサギ４匹中２匹のＰＢＬから単離された。コンセンサス配列はこれらのウイルスのＥ２遺伝子はウサギにおける継代では改変されなかったことを示していた。Ｃ株突然変異体が感染動物と予防接種動物の間の区別を可能とするかどうかを調べるために、ウサギの抗血清をＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）により分析した。このＥＬＩＳＡはＥ２のＡドメインに対する抗体を特異的に検出する。効果的な免疫化のための比較対照として、ＣＨＥＫＩＴ ＣＳＦ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
【００９７】
ｖＦｌｃ３４、ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−ΔＰにより誘導したＥＲＮＳ応答は同程度であった（図５）。Ｃｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡによるｖＦｌｃ３４およびｖＦｌｃ−Ｎ１により誘導されたＡドメイン特異的Ｅ２応答の比較によれば、ｖＦｌｃ−Ｎ１中に存在する修飾はこの応答に対して僅かな作用のみ有していたことが明らかになった。これとは対照的に、ｖＦｌｃ−ΔＰのＥ２応答をｖＦｌｃ３４のものと比較すると、Ｐｒｏ８３３の欠失はＡドメインに対する抗体応答において定量的なシフトを実際にもたらしていたことがわかる（図５）。Ａドメイン特異的抗体応答に対するｖＦｌｃ−Ｎ１の新たに導入されたＮ連結グリコシル化部位の作用が期待はずれであったことを考慮し、本発明者らはウサギにおけるｖＦｌｃ−Ｎ２の抗原性特性の研究は行わなかったが、その代わりその後の実験に関しては欠失突然変異体に着目した。
【００９８】
ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に対する抗体応答の分析。第２の動物実験において、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に対する抗体応答をｖＦｌｃ３４に対して誘導されたものと比較した。接種前のウサギの平均体温は正常であった（３９．２℃、ＳＤ±０．３７、ｎ＝２８）。この実験においては、ｖＦｌｃ３４を接種したウサギ２匹中１匹のみが接種後２日に発熱した（４０．３℃）。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種したウサギ１匹（ウサギ２．１）は体温上昇を示さなかった。これとは対照的に、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種された残余２匹では発熱が観察された（ウサギ２．２および２．３）。これらの動物中１匹において、接種５日後に体温４０．６℃となり、もう１匹においては体温は接種後７日に４０．４℃であった。ｖＦｌｃ−ΔＰは発熱を誘導しなかったという事実を考慮すれば、この所見は極めて意外であった。しかしながら留意すべき重要な点として、接種後短時間において、ウサギ２．２および２．３は格闘状態となり、創傷を被っていた。これらの創傷は皮膚感染を誘発していること、および、この感染の兆候は発熱と同時に起こったという事実を鑑みれば、発熱はウイルス接種の結果であるよりはむしろ皮膚感染症に起因したと推定することは妥当であると考えられる。接種４日後、ウイルスをｖＦｌｃ３４を接種した両方の動物から単離した。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種した３匹のウサギのＰＢＬからはウイルスは単離されず、これは本ウイルスの弱毒化に関連すると考えられる。
【００９９】
ｖＦｌｃ３４を接種したウサギ２匹（動物１．１および１．２；図６、左パネル）の血清は、第１の実験で得られたものに匹敵するＥＲＮＳおよびＥ２ ＥＬＩＳＡにおける結果を示した。Ｅ２ ＥＬＩＳＡにより測定したブロッキングのパーセンテージはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにより検出されたものよりも高値であった。これとは対照的に、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種したウサギ２．１由来の血清の分析は、Ｅ２ ＥＬＩＳＡにおけるブロッキングのパーセンテージがＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにおいて検出されたものよりも低値であることを示していた。この結果は、ｖＦｌｃ−ΔＰを用いた場合に得られた結果と合致しており（図５）、共にＡドメイン特異的抗体応答の特異的な鈍化を示している。しかしながら意外にも、動物２．２および２．３由来の血清の分析はこの結果を確認するものではなかった。これらの動物は明らかに高レベルのＡドメイン特異的Ｅ２抗体を発生させていた。動物２．１で得られた結果およびｖＦｌｃ−ΔＰで得られたより早期の結果を考慮すると、この所見は極めて意外であった。動物２．２および２．３におけるＡドメイン特異的抗体の誘導は、恐らくは、通常は優性未満であるＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ以外のＡドメインのエピトープに向けてのＡドメイン特異的抗体応答の再焦点調整により説明できる。
【０１００】
抗体応答をより十分に分析するために、本発明者らはＣＳＦＶ株ブレシアのＥ２タンパク質から誘導した予め構築された１５アミノ酸長のオーバーラップペプチドを用いながら、ＰＥＰＳＣＡＮ分析を行った。この分析によれば、野生型Ｃ株を接種した動物から第３６日に得られた血清はＣＳＦＶ株ブレシアの２つのエピトープを認識したことがわかった（図６、右パネル）。予測した通り、これらのエピトープの第１のものは８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープであった。特に、残基８３１ＶＳＰＴＴＬＲ８３７は最も重要であると考えられた（図６Ｂ、上パネル）。第２のエピトープはアミノ酸７５４ＹＬＡＳＬＨＫＤＡＰＴ７６４を含んでいた。興味深いことに、最初に認識されるこのエピトープは以前に定義されたＡドメイン（即ちアミノ酸７６６から８６６；図７）の外部に位置する。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種したウサギから得られた血清のいずれも、上記したエピトープのいずれをも認識しなかった。８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープの認識が欠如していること（図６Ｂ；下パネル）はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１中に導入された突然変異により説明できるが、７５４ＹＬＡＳＬＨＫＤＡＰＴ７６４エピトープの認識が欠如していることは、より驚くべきことであった。この所見はある様式における７５４ＹＬＡＳＬＨＫＤＡＰＴ７６４エピトープは８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープと相互作用すること、およびこれらのエピトープはネイティブのＥ２構造中で近接して位置していることを示唆している（図７）。ＰＥＰＳＣＡＮ分析はウサギ２．２および２．３の抗血清により認識されるＡドメインのエピトープを明らかにしなかったが、これらの血清のいずれもＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを認識しなかったことは確かに示していた。これより、本発明者らはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１はＴＡＶＳＰＴＴＬＲに基づいたペプチドＥＬＩＳＡを伴う場合にはＤＩＶＡ基準を満足すると結論できる。
【０１０１】
考察
過去２０年間において、Ｅ２またはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡのいずれかを伴う必要がある数種の実験的ＤＩＶＡワクチンが開発された。文献によれば、両方の診断試験が現場でのＣＳＦの検出に適していると報告されている場合が多い。これは原則的には正しいが、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡはＥ２ ＥＬＩＳＡよりも２つの主要な難点を有することに留意することが重要である。第１に、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡは感染動物群の検出に関して信頼性を有するが、これらのＥＬＩＳＡは個体動物を診断するには感度が不十分であることが以前よりわかっている。第２に、より重要な点として、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡはＣＳＦ特異的ではない（２００３／２６５／ＥＣ）。ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ−Ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｕｍｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）。結果として、ＢＶＤＶおよび／またはＢＤＶウイルスが循環する領域におけるＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡの使用は推奨されない。
【０１０２】
本作業の目的はＥ２ ＥＬＩＳＡに匹敵するＣ株系ＤＩＶＡワクチンを構築することであった。本発明者らはこれらのＥＬＩＳＡの優性な標的であるＡドメインのＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中に適正な突然変異を導入することによりこれを達成することを目標とした。２つの手順の１つ目において、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部のＰｒｏ（即ちＰｒｏ８３３）残基をＡｓｎと置換し、これによりＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部にＰＮＧＳを導入した。Ｎ連結グリカンは体液性免疫系から免疫原性ドメインを遮蔽するこれらの能力に関して周知であるが、これらは炭水化物鎖の構造的柔軟性に起因する２つの特徴となっている機能的に重要なドメインにおいて、またはこの近傍において十分な忍容性を顕著に示し得る。本発明者らはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部に係留された新たに導入されたＮ連結グリカンを安定に維持しているｖＦｌｃ−Ｎ１と命名されたＣ株突然変異体の生産を良好に行えたが、この修飾はＡドメイン特異的抗体応答には僅かな作用しか有さないと考えられる。この理由により、本発明者らはこの手順を継続しないことを選択した。代替の手順において、本発明者らはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープからアミノ酸を欠失させることによりＡドメインの抗原性構造を改変することを目標とした。中央部のＰｒｏ残基（即ちＰｒｏ８３３）の欠失は、導入された欠失を安定に維持していたｖＦｌｃ−ΔＰと命名されたウイルスをもたらしたが、ウイルスは最終的には適応突然変異を獲得し、Ｓｅｒ７８９からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）への置換をもたらした。本発明者らはこの非保存的置換を興味深いものとみなしたが、その理由は、Ｓｅｒ７８９は全てのＣ株ウイルスおよび関連のウサギ化されたＣＳＦＶ株中に存在するのに対し、Ｐｈｅ７８９は強毒性ＣＳＦＶ株中で完全に保存されており、ペスチウイルス遺伝子の他のメンバー中でむしろ高度に保存されているからである（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：３３７−４８）。Ｃ株ウイルスの歴史は十分解明されていないが、ウイルスは数百回ウサギにおいて継代することにより弱毒化されたことは明白である（ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００３．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７−８４）。従って、Ｓｅｒ７８９はウサギにおけるＣ株の複製のために好都合であると仮説を立てることができる。この推定が正しければ、Ｃ株がインビトロのブタ細胞上の成育時にＰｈｅ７８９に復帰しない理由は興味深いものである。これはＷｒｉｇｈｔの適合性ランドスケープの概念により説明できる（Ｗｒｉｇｈｔ，１９３１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：９７−１５９）。この概念に従えば、好都合な突然変異は、野生型のＣ株ウイルスに関して同様に適用される通り適合性ピークの最上領域において遺伝子型が存在する場合に緩徐に発生するのに対し、これらはｖＦｌｃ−ΔＰの場合と同様に適合性のピークのより低いレベルにおいて遺伝子型が存在する場合にはより迅速に発生する。
【０１０３】
ｖＦｌｃ−ΔＰを接種したウサギから得られた血清の分析によれば、Ｐｒｏ８３３の欠失はＡドメインの免疫原性をかなり鈍化させるために既に十分であることが明らかになった。この結果は本発明者らの手順の原則の証拠を明らかにしているが、これは同様に、得られるウイルスをＤＩＶＡワクチンとして適しているものとするためにはＡドメインの抗原性構造はより広範に修飾される必要があったことをも明らかにしている。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープからの２から４アミノ酸の欠失（ΔＳＰ、ΔＰＴ、ΔＳＰＴ、ΔＶＳＰ、ΔＡＶＳＰ）を有するＣ株突然変異体をコードするプラスミドは感染性のウイルスを生産したが、これらは高度に無力化されており、持続的生育が不可能であった。しかしながらｖＦｌｃ−ΔＰＴを含有する細胞の数継代の後、適合性の顕著な増大が観察された。救済されたウイルスはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名された。本発明者らはＥ２遺伝子における適応突然変異が適合性回復を担っている可能性が高いと考えた。実際、２つの適応突然変異がＥ２遺伝子において検出された（図１）。第１の突然変異はＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのＶａｌ残基のＧｌｙとの置換をもたらした。導入された欠失に近接する適応突然変異が期待されたが、第２の突然変異は線状のＥ２配列中でＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対して遠位に位置していることがわかった。更に興味深いことに、この第２の突然変異（Ａｓｐ７７４→Ａｓｎ）はＡドメイン中にＰＮＧＳを導入していた。
【０１０４】
逆方向遺伝学により同様のウイルス（即ちｖＦｌｃ−Ｎ１；図１および図７）を構築した直後のＡドメイン中にＰＮＧＳを有するＣ株突然変異体（即ちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１、図１および図７）の救済は、顕著な偶然であるように見える。しかしながら、本発明者らが研究を開始しようと思うに至った以前の所見を再考すれば、本発明者らの所見は偶然ではないことが示唆される。本発明者らの作業は中和ｍＡｂの存在下にウイルスを生育させることにより選択されたＣＳＦＶ突然変異体の表現型により思い立ったものである（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：３９３４−４２）。ブレシア株のこのＭＡＲ（モノクローナル抗体耐性）突然変異体、即ちｖＰＫ２６．２と命名されたものは、Ａドメインの抗原性構造に影響したＥ２における２つのアミノ酸置換、即ち、Ｐｒｏ８３３→Ｌｅｕ（ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ内部）およびＴｈｒ８５８→Ａｓｎ（２４）を有していた。他のＭＡＲ突然変異体の分析ではＰｒｏ８３３→Ｌｅｕの置換は中和回避の原因であり、更に、第２のＡドメイン特異的ｍＡｂの結合を妨害していたことが明らかになった。しかしながら、Ｌｅｕ８３３のみを含有するＭＡＲ突然変異体はなお２つの他のＡドメイン特異的ｍＡｂにより認識されているが、Ｌｅｕ８３３およびＡｓｎ８５８の両方を含有するＭＡＲ突然変異体ｖＰＫ２６．２は本発明者らのＡドメイン特異的ｍＡｂのいずれによっても検出されなかった。Ａｓｎ８５８がＡドメインの抗原性構造に明らかに影響していたことを考慮して、本発明者らは８５８位は何らかの様式において、ネイティブのＥ２構造中のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープと相互作用するか、これと近接しているという仮説を立てた。更に興味深いことに、Ｔｈｒ８５８→Ａｓｎ置換はＡドメインに新しいＰＮＧＳを導入している（図７）。この部位におけるグリコシル化は以前には注目されていなかったが、Ｅ２の抗原性構造に対するこの突然変異の作用はＮ連結グリカンによるＡドメインの遮蔽により説明できると考えられる。ｖＰＫ２６．２の表現型は、本発明者らに、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部Ｐｒｏを欠失させる作用を調べることのみならず、Ｎ連結グリカンによりＡドメインを遮蔽することの実現可能性を研究することを惹起した。本発明者らは、ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ１をもたらしたＰｒｏ８３３のＡｓｎとの置換が構造的に重要なＰｒｏ８３３残基を除去し、同時に新しいＰＮＧＳをＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中に導入することは、好都合であることを発見した。この修飾はＡｓｎによるＰｒｏ８３３の置き換えとみなすことができるが、Ｐｒｏ８３３を欠いたウイルス中のＡｓｎ残基の挿入ともみなすことができることが重要である。これは意味論の問題とも考えられるが、ｖＰＫ２６．２の表現型並びにｖＦｌｃ−Ｎ１の遺伝子的安定性および適合性を説明できる全く新しい展望を開くものである。これらのウイルスの驚くべき共通の特徴は、これらが共にＰｒｏ８３３を欠き、共に新しいＰＮＧＳをＡドメインに含有することである。この点から推察されることは、８３３位および８５８位は実際にはネイティブＥ２構造中同様の位置に所在していること、および、これらの位置のいずれかにおけるＡｓｎ部分は、直接、または炭水化物部分に対する係留部位としてのこの機能により、Ｐｒｏ８３３の欠失または置換により損なわれた適合性の浪費を補償することができることである（図７）。
【０１０５】
再度ウイルスｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に関し、興味深い点は、７７４位においてｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１中に新たに導入されたＰＮＧＳはまた、ネイティブＥ２構造中ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに近接して位置することである。即ち、このウイルスにおけるＡｓｐ７７４→Ａｓｎの置換はアミノ酸７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８を含む最近同定されたエピトープの中央に位置する（Ｐｅｎｇら、２００８．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １３５：２６７−７２）。８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープと同様、７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８エピトープはＡ１ドメインを定義する３つの特徴全て、即ちＣＳＦＶ特異的であり、進化的に保存されており、中和抗体のための標的であること、を共有している。上記および本発明者らの実験所見に基づいて、本発明者らは、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲおよびＬＦＤＧＴＮＰエピトープはＥ２のネイティブの構造中で共局在化しており、恐らくは一緒になってＡ１ドメインを形成しているという仮説を立てる。
【０１０６】
総括すれば、本発明者らはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部Ｐｒｏ残基の突然変異はＥ２タンパク質における３つの可能な位置の１つに位置するＮ連結グリカンにより補償されることができること、および、これらの位置はネイティブのＥ２構造に近接して位置することを仮説として唱える。第１のものは８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープそのものの内部に位置し、第２のものは７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８エピトープの内部に位置し、第３のドメインはアミノ酸配列８５８ＴＴＴ８６０を含む（図７）。恐らくは、後者のアミノ酸はＡドメイン中に位置する未確認のエピトープの部分でもある。これらの仮説を立証するための実験が進行中である。
【０１０７】
Ｅ２遺伝子の適応突然変異が適合性の回復において重要な役割を果たしていると推定することは妥当と思われるが、本発明者らは構造タンパク質をコードする他の遺伝子における突然変異も役割を果たしていることが合理的であると考える。従って、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のＣ、ＥＲＮＳおよびＥ１遺伝子も配列決定した。ゲノムのこの部分の配列決定は実際に２つの追加的な突然変異を明らかにした。第１のものはＥ１遺伝子において検出された。この突然変異は完全に保存されたＧｌｕ６３４残基のＡｓｐとの置換をもたらした。Ｅ２タンパク質がＥ１タンパク質とのジスルフィド結合ヘテロ２量体に組み立てられることが知られている（Ｔｈｉｅｌら、１９９１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：４７０５−１２）ことを考慮すれば、この突然変異はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の適合性回復に寄与していることが察知される。Ｃ遺伝子中には突然変異は検出されなかったが、単一のサイレントな突然変異がＥＲＮＳ遺伝子において検出された。野生型ＣＳＦＶのコンセンサス配列が例外的に安定であり、インビトロまたはインビボの継代により実質的に全く突然変異を蓄積しないこと（Ｖａｎｄｅｒｈａｌｌｅｎら、１９９９．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４４：１６６９−７７）を念頭に置けば、コンセンサス配列決定によるこのようなサイレントな突然変異の検出は、自然選択がＲＮＡレベルでも作動しており、それによりゲノムの他の領域における同義突然変異もまたｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の適合性回復に寄与していたことを明らかにしている。
【０１０８】
適合性回復の分子経路を理解するために、進化実験を実施した。この実験はＥＲＮＳ遺伝子におけるサイレントな突然変異、Ｖａｌ８３１→Ｇｌｙ置換をもたらす突然変異、および７７４位において新しいＰＮＧＳを導入する突然変異の平行進化を明らかにした（表２）。適合性回復の分子機序を十分解明するためには追加的な検討が必要であることは明白であるが、本所見はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の適合性回復には上記した突然変異が実際に関与しているという見解を裏付けるものである。これらの突然変異がＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープにおけるより大きい欠失を有する突然変異の適合性を回復できることは十分可能である。
【０１０９】
進化実験において検討したウイルスの１つ（即ちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ５）において、Ａｌａ４４５からＴｈｒへの置換をもたらした突然変異がＥＲＮＳ遺伝子において検出されたことは重要なことである（表２）。以前に記載したｖＦｌｃ−ΔＰの進化において観察されたＳｅｒ７８９からＰｈｅへの置換と同様、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ５において改変されたアミノ酸、この場合はＡｌａ４４５は、ＣＳＦＶの野生種系統内で保存されているアミノ酸、この場合はＴｈｒ４４５に変化している。これは本作業の範囲を超えているが、この所見もまた、ＣＳＦＶの弱毒化はこの分子進化に関して価値ある見識を与えることができることを示している。
【０１１０】
Ｖａｎ Ｒｉｊｎらにより実施されたＭＡＲ突然変異体を用いた以前の研究は、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのＰｒｏ８３３およびＴｈｒ８３４はＡドメインの保存されたエピトープの一体性のために極めて重要であることを示唆していた（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：３９３４−４２）。これら両方のアミノ酸を欠いており、更にＶａｌ８３１→Ｇｌｙの置換を含有する十分生育しているＣ株突然変異体の生産が良好に行えたことは、このウイルスのＡドメインの抗原性構造が劇的に変化したことを示唆していた。従って本発明者らは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１により誘導された免疫応答はＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡを用いて野生型ＣＳＦＶにより誘導されたものとは区別可能であることを期待した。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１が実際にＡドメイン特異的抗体を誘導することにおいて極めて強力であり得ることは意外であった。この所見の可能な説明としては、他の面では免疫優性であるＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの破断が通常では優性未満であるＡドメインのエピトープに対する抗体応答の再焦点調整をもたらすことが考えられる。これらのエピトープを同定する試みにおいて、抗血清をＰＥＰＳＣＡＮ分析により分析した。この分析は新しく認識されたエピトープを明らかにしなかったが、抗血清のいずれもＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含有するペプチドを認識しなかったことを確かに示していた。興味深いことに、このことは、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに基づくＥＬＩＳＡをＤＩＶＡ試験として使用することによりｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ワクチンウイルスを併用できることを示唆している。
【０１１１】
総括すれば、現作業は、強制的ウイルス進化はＣＳＦウイルスを遺伝子的に修飾するための強力なツールとなり得ることを明らかにしている。ここにおいて、本方法は野生型ＣＳＦＶから血清学的に区別できる遺伝子的に安定なＣ株突然変異体を生産するために良好に使用できた。
【実施例２】
【０１１２】
材料および方法
Ｃ株欠失突然変異体ウイルスｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を実施例１に記載した通り作成した。ＳＫ６−Ｔ７細胞はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するブタ腎細胞とする（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ １９（４−５），４４７−５９）。これらの細胞をグルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｒｅｄａ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）およびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＫ１０００培地中で生育させた。ウイルス保存液はＳＫ６．Ｔ７細胞上で力価検定し、５０％組織培養物感染用量（ＴＣＩＤ５０）として報告する。
【０１１３】
ペスチウイルスに対する抗生物質を含有しない１３匹のコンベンショナルブタを５匹２群と３匹１群に分割した。第１群のブタ（３１６６から３１７０番）には２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０５ＴＣＩＤ５０の組み換えＣ株ウイルスｖＦｌｃ３４を含有する培養基１ｍｌと共に筋肉内の経路で第０日に１回予防接種した（実施例１参照）。第２群のブタ（３１７１から３１７５群）にはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ワクチンを同じプロトコルで予防接種した。第３群のブタ（３１７６から３１７８番）には２％ＦＢＳを含有する培養基を１回接種した。
【０１１４】
第２８日に、第１、２および３群のブタを、鼻内投与によりＣＳＦＶ株ブレシアの５０％致死用量の２００倍を含有する１ｍｌ（各鼻腔に０．５ｍｌ）で攻撃した。全ブタの疾患を毎日観察し、これらの体温の測定は−第３日から開始した。臨床症状の重症度は１０ＣＳＦ特異的基準の予め定義されたリストを用いて採点した（Ｍｉｔｔｅｌｈｏｌｚｅｒら、２０００．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７４（４）２９３−３０８）。
【０１１５】
血清試料は全ブタから毎週調製した。ＥＤＴＡ試料および口腔咽頭液は、攻撃日（第２８日）およびその後は第３０、３２、３５、３７、３９、４２、４４、４６、４９、５２および５６日に、第１、２および３群の全ブタから採集した。ＥＤＴＡ試料を用いて白血球および血小板の数を測定した。この分析はＭｅｄｏｎｉｃ ＣＡ ６２０コールターカウンター（Ｂｏｕｌｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＢ）を用いて実施した。コンベンショナルに飼育されたブタにおいては、白血球および血小板の血中濃度はそれぞれ１１×１０９から２３×１０９、および３２０×１０９から７２０×１０９／リットルの範囲である。その結果、白血球減少症は＜８×１０９個／ｌ血液および血小板減少症は＜２００×１０９血小板／ｌ血液として定義した。
【０１１６】
末梢血白血球（ＰＢＬ）または咽喉スワブを用いたウイルス単離および定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＲＴ−ＰＣＲ）を本質的には文献記載の通り実施した（Ｗｅｅｓｅｎｄｏｒｐら、２００９．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３５（３−４），２２２−３０）。
【０１１７】
血清試料は市販のＥ２ ＥＬＩＳＡ（ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＣＳＦＶ Ａｂ２．０Ｅ２ ＥＬＩＳＡ、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および市販のＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（Ｃｈｅｋｉｔ ＣＳＦ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ、ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｏｆｄｄｏｒｐ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いながら製造元の説明書に従って分析した。
【０１１８】
結果
本発明者らは高度に強毒性のブレシア株を用いた致死的攻撃に対するｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスの保護効力をこの親ウイルスｖＦｌｃ３４と比較した。ブタ５匹の２群をｖＦｌｃ３４（第１群）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（第２群）のいずれかで第０日に予防接種した。３匹よりなる対照群（第３群）には細胞培養基のみを接種した。第１、２および３群のブタは、第２８日に高度に強毒性のブレシア株で攻撃した。
【０１１９】
対照群のブタは全て、高熱（図８Ｃ）、白血球減少症（図９Ａ）および血小板減少症（図９Ｂ）を含むＣＳＦの典型的臨床兆候を発症した。ウイルスは攻撃後第４日にはブタ３匹のうちの２匹、および第７および９日にはブタ全３匹のＰＢＬから単離した。ウイルスは攻撃後第７日に２匹の咽喉スワブから、および攻撃後第９日には１匹から単離した。この群に属するブタは瀕死状態で発見され、感染後９日（ブタ３１７８番）または１０日（ブタ３１７６番および３１７７番）に安楽死させた。
【０１２０】
組み換えＣ株ワクチン（即ちｖＦｌｃ３４）を予防接種したブタのいずれも、攻撃後臨床兆候を発症しなかった（図８Ａ）が、１匹のブタ（３１６８番）が１日発熱し、もう１匹の別のブタ（３１６６番）は少なくとも１日血小板減少症を呈した（図９Ｂ）。ＰＢＬまたは咽喉スワブからはウイルスは単離されなかった。
【０１２１】
ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種した全ブタは３から６日間発熱し、そして攻撃後に軽度の臨床兆候を呈した（図８Ｂ）が、全ブタが完全に回復した。攻撃後第２日に１匹のブタ（ブタ番号３１７５）のＰＢＬからウイルスが単離された。これから、本発明者らは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を用いた単回予防接種は高度に強毒性なブレシア株を用いた致死的攻撃に対する保護を与えると結論付けた。
【０１２２】
全血清を抗Ｅ２および抗ＥＲＮＳ抗体の存在について、それぞれＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＣＳＦＶ Ａｂ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）およびＣｈｅｋｉｔ ＣＳＦ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いながら分析した。ｖＦｌｃ３４を予防接種したブタは全て感染後２１日にＥ２ ＥＬＩＳＡにおいて陽性であった（図１０Ａ）が、これらのブタは感染後３５日にはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにおいても陽性であった（図１０Ｂ）。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種したブタはいずれも、攻撃前のＥ２ ＥＬＩＳＡで陽性ではなかった（図１０Ａ）。攻撃後７日以内に、全てのブタがＥ２ ＥＬＩＳＡで陽性となった（図１０Ａ）。興味深いことは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種したブタ２匹（即ちブタ３１７１番および３１７２番）はｖＦｌｃ３４を予防接種したものよりもはるかに早期にＥＲＮＳ抗体へのセロコンバージョンを示した（図１０Ｂ）。
【０１２３】
即ち、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種したブタは全て、攻撃まではＰｒｉｏＣＨＥＣＫ Ｅ２ ＥＬＩＳＡのカットオフ未満を維持し、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１がブタにおいてもＤＩＶＡワクチンとして使用できることを示していたと結論できる。
【０１２４】
結論として、本発明者らは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の単回予防接種が全予防接種ブタにおいて高度に強毒性の攻撃に対抗して保護をもたらしたことを明らかにしており、ウイルス出芽は殆ど、または全く無いという証拠が提示されている。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物疾患に関する。より具体的には、本発明は修飾されたＥ２タンパク質を含む組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）に関する。本発明はまた、感染動物を予防接種動物から区別可能とする前記組み換えＣＳＦＶを含むワクチン、および、前記組み換えＣＳＦＶを形成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）はエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスであり、これはウシウィルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）およびボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共に、フラビウイルス科のファミリーのペスチウイルス属を含む（Ｐｒｉｎｇｌｅ，１９９８．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４３：２０３−１０）。家畜化されたブタの群れにＣＳＦＶが伝染すると巨額の経済的損失が生じる場合がある（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ ｄｅ Ｓｍｉｔ．２０００．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７：３−１５）。ウサギおよび細胞培養における反復継代により弱毒化されているＣＳＦＶウイルス、いわゆる「チャイニーズ」または「Ｃ」株による予防接種は、強毒性のＣＳＦＶに対抗する即効性で長寿命の免疫をもたらす。Ｃ株ウイルスは世界中で良好に使用されており、しばしば、これまで作成されたもののうちで最も効果的な獣医科用ワクチンと称される。しかしながらこのワクチンは感染と予防接種の動物の間の血清学的区別（ＤＩＶＡ）を可能にしない。このことは、予防接種集団中でＣＳＦ感染動物を検出することが不可能であることは重大な商取引上の制約をもたらす場合があるため、主要な難点となっている。
【０００３】
この分野におけるＣＳＦの診断は構造糖タンパク質ＥｒｎｓまたはＥ２のいずれかに対して指向された抗体を検出するＥＬＩＳＡにより実施できる。サブユニットワクチン（Ｈｕｌｓｔら、１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：５４３５−４２）から弱毒化生ワクチン（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４４７−５９；ｖａｎ Ｚｉｊｌら、１９９１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７６１−２７６５）およびレプリコン系ワクチン（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１５４４−５６；Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：２９７３−２９８０）にまで渡る、適切なＥＬＩＳＡを伴う場合ＤＩＶＡの基準を満足できる数種の候補ワクチンが開発されている。
【０００４】
ＣＳＦに対抗する市販のＤＩＶＡワクチンはＥｒｎｓに対して指向された抗体を検出する血清学的な試験を伴っているバキュロウィルス産生Ｅ２に基づいている（Ｖａｎ Ａａｒｌｅ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ Ｂａｓｅｌ １１４：１９３−２００）。このワクチンはＣＳＦに対抗して保護を与えるが、免疫の発生および持続時間の両方の点においてＣ株ワクチンよりも有効性が低い（ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００３．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７−８４）。より重要なことは、このワクチンを伴っているＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡはペスチウイルス属の他のメンバー（即ちＢＶＤＶおよびＢＤＶ）も検出する。従ってこれらの使用はこれらのウイルスが循環する領域においては推奨されない（２００３／２６５／ＥＣ；ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３）。
【０００５】
更に、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡの感度は個々の動物を診断するには不十分であることが以前よりわかっており、従って十分多数量の動物を用いた群れ基準でのみ使用しなければならない（Ｂｌｏｍｅら、２００６．Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ２５：１０２５−３８；Ｆｌｏｅｇｅｌ−Ｎｉｅｓｍａｎｎ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（１１４：１８５−９１））。このことは、一般的にはＥ２ ＥＬＩＳＡはＤＩＶＡワクチンを伴う場合にはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡよりもはるかに好ましいことを説明している。
【０００６】
Ｅ２タンパク質は２つの主要な抗原ドメイン、即ちＢ／ＣドメインおよびＡドメインを含有する（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９３．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７４：２０５３−６０；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６）。ＣＳＦＶポリタンパク質のアミノ酸７６６と８６６の間に位置するドメインＡは、サブドメインＡ１、Ａ２およびＡ３に分割される（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６）。Ａ１ドメインは中和抗体に対する優性な標的であるという事実にもかかわらず、これは進化の過程を通して保存されている。実際、この配列の保存および免疫優性は、Ｅ２ ＥＬＩＳＡにおいてこれを優性標的としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｒｉｎｇｌｅ，１９９８．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４３：２０３−１０
【非特許文献２】Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ ｄｅ Ｓｍｉｔ．２０００．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７：３−１５
【非特許文献３】Ｈｕｌｓｔら、１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：５４３５−４２
【非特許文献４】ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４４７−５９
【非特許文献５】ｖａｎ Ｚｉｊｌら、１９９１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７６１−２７６５
【非特許文献６】ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１５４４−５６
【非特許文献７】Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：２９７３−２９８０
【非特許文献８】Ｖａｎ Ａａｒｌｅ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ Ｂａｓｅｌ １１４：１９３−２００
【非特許文献９】ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００３．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７−８４
【非特許文献１０】２００３／２６５／ＥＣ；ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３
【非特許文献１１】Ｂｌｏｍｅら、２００６．Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ２５：１０２５−３８
【非特許文献１２】Ｆｌｏｅｇｅｌ−Ｎｉｅｓｍａｎｎ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（１１４：１８５−９１）
【非特許文献１３】ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９３．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７４：２０５３−６０
【非特許文献１４】Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＳＦの爆発的発生は現在では検疫規制および被疑動物群の屠殺により制御されているが、将来のＣＳＦの爆発的発生を制御するためにはより人間的でより経済的な介入策の実施が急務である。従って、頑健でＣＳＦＶ特異的なＥＬＩＳＡを伴ったＤＩＶＡワクチンが緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、親ＣＳＦＶポリタンパク質の８２９位から８３７位に相当するＥ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む上記ウイルスを提供する。
【００１０】
ポリタンパク質とはウイルスＲＮＡの翻訳時に形成される約４０００アミノ酸の仮説的ポリタンパク質を意味する。前記ポリタンパク質はプロセシングにより最終切断産物ＮＰｒｏ−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂとなる。
【００１１】
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はアミノ酸配列ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ（ＣＳＦＶポリタンパク質の残基８２９から８３７；アミノ酸に関する一文字コードを用いた場合）を含む最近発見されたエピトープを含有する（Ｌｉｎら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：１１６１９−２５）。このエピトープはＡ１ドメインの全ての特徴的側面、即ち免疫優性であり、進化的に保存されており、ＣＳＦＶに特異であり、中和抗体に対する標的であることを共有している。ペスチウイルスの異なる株に由来するＥ２タンパク質内でのＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン周囲の配列の比較によれば、配列ＴＡＶＳＰＴＴＬＲはＣＳＦＶの株内で強力に保存されており、ＢＶＤＶおよびＢＤＶの株内では高度に可変である（Ｌｉｎら、２０００．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：１１６１９−２５）。
【００１２】
ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを認識するＥ２特異的ＥＬＩＳＡで使用される抗体、特にモノクローナル抗体は、ペスチウイルス属の他のメンバーとは交差反応せず、そのため、これらの他のウイルスが循環する領域において使用できる。前記抗体は、Ｅ２タンパク質の前記ドメイン中に欠失を含む本発明の組み換えＣＳＦＶは認識しない。
【００１３】
即ち、前記組み換えウイルスは、組み換えウイルスを感染させた動物を、野生型ＣＳＦＶに感染した動物から、感染していない、および／または予防接種されていない動物から、区別可能とする。更に、前記組み換えウイルスの使用はこれらの動物の間で判別を行うためのペプチド系診断試験の使用を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、ＣＳＦＶの「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインまたはこの等価物において少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む上記ウイルスを提供する。等価なドメインは、１つのアミノ酸が他のアミノ酸、例えば同じグループに属するアミノ酸で置き換えられた、即ち別の芳香族アミノ酸で置き換えられた芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸で置き換えられた脂肪族アミノ酸である、Ｅ２領域内部のドメインである。
【００１５】
前記親ゲノムは好ましくはＣＳＦＶ株、好ましくは天然に存在する、または組み換え弱毒化ＣＳＦＶ株から誘導された実質的に完全なウイルスゲノムを含む。親ゲノムという用語は核酸分子、例えばＲＮＡ分子および／またはこのｃＤＮＡコピーを含む。
【００１６】
「少なくとも１つのアミノ酸の欠失」という用語は本説明において使用する場合、アミノ酸少なくとも１つの除去を意味する。「欠失」という用語はアミノ酸少なくとも１つの除去の後に同じ位置に別のアミノ酸少なくとも１つの挿入がある場合を包含しない。従って、「欠失」という用語は本明細書において使用する場合、アミノ酸の別のアミノ酸との置換を包含しない。
【００１７】
前記組み換えｃＤＮＡ分子は好ましくは実質的に完全な組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムを含み、これにより、前記ゲノムはＣＳＦＶポリタンパク質の８２９位から８３７位に相当する保存された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むＥ２タンパク質をコードする。「実質的に完全な」という用語は、前記ゲノムにより形成された前記ウイルスが適する細胞または細胞系統を感染させることができ、上記適する細胞または細胞系統中で再生できることを指す。「実質的に完全な」ウイルスゲノムは好ましくは複製コンピテントなゲノムである。より好ましくは、感染性で、複製コンピテントで、パッケージングコンピテントなウイルスゲノムである。更に好ましくは、組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）は「実質的に完全な」ウイルスゲノム、好ましくは複製コンピテントなゲノム、または、より好ましくは、感染性で、複製コンピテントで、パッケージングコンピテントなウイルスゲノムを含む。
【００１８】
好ましい実施形態においては、本発明による組み換えＣＳＦＶのＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、前記「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインの中央部プロリンの欠失を含む。
【００１９】
プロリンは骨格窒素原子上に環化した側鎖を有する点において２０種の一般的アミノ酸の中では独特である。これにより前記プロリンおよびプロリンに先行する残基のコンホーメーションが制約される。更に、プロリンはコンホーメーション「スイッチ」として作用することができ、これによりタンパク質の部分を代替コンホーメーション採用可能とすることができる。従って、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の中央部プロリンの改変は、一次配列を変化させるのみならず、免疫原性のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインのコンホーメーションも変化させる。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインの中央部プロリンの欠失を含むＥ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質内部の前記ドメインを認識する抗体により認識されない。
【００２０】
更なる好ましい実施形態において、本発明による組み換えＣＳＦＶの改変されたＥ２タンパク質は前記ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインからの少なくとも２つのアミノ酸の欠失を含む。２つのアミノ酸の欠失は、Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインからのそれぞれ、ＴＡ、ＡＶ、ＶＳ、ＳＰ、ＰＴ、ＴＴ、ＴＬおよびＬＲの欠失を含む。２つのアミノ酸の最も好ましい欠失はＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の８３３から８３４位のＰＴの欠失である。
【００２１】
更なる好ましい実施形態において、本発明による組み換えＣＳＦＶの改変されたＥ２タンパク質は、前記ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインから少なくとも３つのアミノ酸、例えば３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸または９つのアミノ酸の欠失を含む。更に好ましいＥ２タンパク質はアミノ酸配列ＶＳＰ、ＳＰＴ、ＡＶＳＰ、またはＳＰＴＴＬの欠失を含む。
【００２２】
本発明は更に、親ＣＳＦＶゲノムの少なくとも１つの更なる改変を含む本発明による組み換えＣＳＦＶを提供する。前記保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中に欠失を含むウイルスは親ウイルスと比較して細胞を感染させることにおいてより低効率性であるか、および／または感染細胞中でより低効率に複製しており、その結果、親ウイルスと比較してより低いウイルス力価となっていた。保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の欠失を含むウイルスに感染した細胞の連続継代は、より効率的に感染するか、および／または細胞中で複製される救済されたウイルスをもたらしており、これにより、親ウイルスの力価に匹敵する力価がもたらされている。救済されたウイルスは保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン中の欠失を有するウイルスの適合性の損失を補償している親ゲノム中の更なる改変１つ以上を導入している。
【００２３】
１つの実施形態において、前記少なくとも１つの更なる改変はウイルスのゲノムを変化させるがアミノ酸の改変はもたらさないサイレントな突然変異である。前記サイレントな突然変異はウイルスゲノムの非コーディング部分、またはウイルスゲノムのコーディング部分において、例えばＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２をコードするウイルスゲノムの部分において、および／または、非構造タンパク質をコードする部分において、存在している。サイレントな突然変異はこれらのウイルスの形成の間のある時点において改変されたウイルスの適合性の回復に寄与していると考えられる。いかなる理論にも拘束されないが、例えばサイレントな突然変異は、前記サイレントな突然変異はウイルスゲノム核酸のコンホーメーションを改変するため、ウイルスゲノムの向上した安定性および／または向上した複製をもたらす。更に、前記サイレントな突然変異は向上したコドン使用をもたらす場合がある。好ましいサイレントな突然変異はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位のＵからＣへの改変により与えられる。
【００２４】
更なる実施形態において、前記少なくとも１つの更なる改変はＥ２タンパク質と共にジスルフィド結合ヘテロ２量体に組み立てられることがわかっているＥ１タンパク質をコードする領域中にある。即ち、Ｅ２の保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける欠失は、少なくとも部分的には、Ｅ１タンパク質中の少なくとも１つのアミノ酸の改変により補償される。更なる実施形態において、前記少なくとも１つの更なる改変はＮｐｒｏ、Ｃ、ＥｒｎｓまたはＥ２タンパク質をコードする領域中にある。前記少なくとも１つの更なる改変は好ましくはＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質をコードする領域から選択される異なる領域中、または、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質をコードする１つの領域内部における、少なくとも２つの改変を含む。前記少なくとも２つの更なる改変は、好ましくは、少なくとも１つのサイレントな突然変異を含む。好ましいサイレントな突然変異はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位のＵからＣへの改変により与えられる。
【００２５】
好ましい実施形態においては、前記少なくとも１つの更なる改変はＥ２タンパク質中の追加的Ｎ連結グリコシル化部位の導入をもたらす。Ｅ２タンパク質の追加的位置におけるＮ連結グリコシル化部位は明らかに、直接、または、炭水化物部分に対する係留部位としてのこの機能により、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の前記欠失により課せられた適合性の損失を補償している。好ましい実施形態においては前記Ｎ連結グリコシル化部位は例えば７７４位におけるＤからＮへの改変のような、アミノ酸位置７７２から７７８からのＬＦＤＧＴＮＰドメインの改変により導入される。または、もしくは追加的に、Ｎ連結グリコシル化部位はＥ２タンパク質中の８３０位におけるＡからＮへの改変により導入される。
【００２６】
前記更なる改変は好ましくは、Ｅｒｎｓタンパク質内部のＶ３９２をコードする１５４７位から１５４９位におけるコドン；Ｅ１タンパク質内部のＥ６３４をコードする２２７３位から２２７５位におけるコドン；Ｅ２タンパク質内部のＤ７７４をコードする２６９３位から２６９５位におけるコドン；および／またはＥ２タンパク質内部のＶ８３１をコードする２８６４位から２８６６位におけるコドンを改変する。記載した位置におけるコドンの前記改変はサイレントな突然変異を含むか、またはコードされたアミノ酸の改変を含む。好ましい少なくとも１つの更なる改変はグリシン（Ｇ）との８３１位におけるバリン（Ｖ）の置換を含む。
【００２７】
別の好ましい実施形態においては、親ゲノムの前記少なくとも１つの更なる改変は７８９位におけるＳからＦへの置換および／または４４５位におけるＡからＴへの置換をもたらす。７８９位におけるセリンおよび４４５位におけるアラニンは全てのＣ株ウイルス中に存在し、家兎継代したＣＳＦＶ株に関連しているのに対し、７８９位におけるフェニルアラニンおよび４４５位におけるスレオニンは強毒性ＣＳＦＶ株中で保存されている。Ｃ株ウイルスの履歴は十分解明されていないが、ウイルスは数百回ウサギにおいて継代されることにより弱毒化されていることが明らかであり、そのためには７８９位におけるＳおよび４４５位におけるＡが有利であり得る。７８９位におけるＳからＦへの改変および４４５位におけるＡからＴへの改変は同様にＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の欠失を含むウイルスの増殖のために有利であるのに対し、これはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むウイルスにおいてはほぼ中立的となる。
【００２８】
なお更なる好ましい実施形態において、本発明は８３３位におけるＰの欠失およびサイレントな改変を含む組み換えＣＳＦＶを提供する。好ましいサイレントな改変はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位におけるＵからＣへの改変である。更に好ましい組み換えＣＳＦＶは８３３位におけるＰの欠失および７８９位におけるＳからＦへの改変および／または４４５位におけるＡからＴへの改変；８３３位におけるＰの欠失および７７４位におけるＤからＮへの改変、８３１位におけるＶからＧへの置換、および８３４位におけるＴの欠失を、１５４９位におけるＵからＣへの改変に加えて、または加えることなく、含んでいる。最も好ましい組み換えＣＳＦＶは、Ｅ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインのそれぞれ８３３および８３４位のプロリンおよびスレオニンの欠失、Ｅ２タンパク質の１５４９位のＵからＣへの改変、６３４位のアスパラギン酸（Ｄ）とのグルタミン酸（Ｅ）の置換、７７４位のアスパラギン酸（Ｎ）とのアスパラギン酸（Ｄ）の置換、および、８３１位のグリシン（Ｇ）とのバリン（Ｖ）の置換を含む。
【００２９】
更なる実施形態において、本発明は親ＣＳＦＶポリタンパク質のＥ２における８２９位から８３７位の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の改変を含み、これにより上記改変がＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける中央部プロリンからアスパラギンへの置換を含む、組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）を提供する。前記置換は改変されたＥ２タンパク質へのＥ２特異的モノクローナル抗体の結合を最小限化、または、更には阻害することがわかった。
【００３０】
一次アミノ酸配列を変化させることとは別に、前記アスパラギンの導入は、グリコシル化コンセンサス配列［Ｎ−ｘ−Ｓ／Ｔ］、ここで式中ｘはＰまたはＤ以外のいずれかのアミノ酸を指すものを含むＮ連結グリコシル化部位の導入をもたらす（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１−６４）。ウイルスタンパク質のＮグリコシル化は、免疫原性に関与していることが示唆されており、そのため、Ｎ連結グリコシル化の導入はウイルスタンパク質に対する細胞および抗体の応答の両方を制限することができる。即ち前記置換は前記組み換えウイルスを感染させた動物からの野生型ウイルスを感染させた動物の区別を可能にする前記組み換えウイルスを形成するために使用できる。
【００３１】
１つの実施形態において、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける中央部プロリンからアスパラギンへの置換を含む組み換えＣＳＦＶは、ゲノム内に少なくとも１つの更なる改変を含む。好ましい少なくとも１つの更なる改変はＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２における、および／または非構造タンパク質をコードする部分における、追加的なＮグリコシル化部位をもたらす。好ましい追加的なＮグリコシル化はＥ２内部、例えばＥ２タンパク質のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメイン内部、またはＬＦＤＧＴＮＰエピトープ内部に存在する。
【００３２】
更に好ましい少なくとも１つの更なる改変は、ウイルスゲノムの非コーディング部分、または、ウイルスゲノムのコーディング部分、例えばＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２をコードするウイルスゲノムの部分、および／または非構造タンパク質をコードする部分に存在するサイレントな突然変異である。好ましいサイレントな突然変異はＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位におけるＵからＣへの改変により与えられる。
【００３３】
また更に好ましい少なくとも１つの更なる改変は、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１および／またはＥ２において、および／または、非構造タンパク質をコードする部分において、少なくとも１つのアミノ酸の改変を含む。前記少なくとも１つの更なる改変は好ましくは、ＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位における例えばＵからＣへのサイレントな改変、７８９位におけるＳからＦへの改変、４４５位におけるＡからＴへの改変、７７４位におけるＤからＮへの改変、８３１位におけるＶからＧへの改変、および／または８３４位におけるＴの欠失から選択される。更により好ましくは、前記少なくとも１つの更なる改変は、サイレントな突然変異、追加的Ｎグリコシル部位、および／またはアミノ酸改変から選択される少なくとも２つの更なる改変を、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインの中央部プロリンからアスパラギンへの置換に加えて含む。前記少なくとも２つの更なる改変は、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２および非構造タンパク質から選択される同じタンパク質において、または異なるタンパク質において、存在する。前記少なくとも２つの更なる改変はＮｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２から選択される同じタンパク質において、または異なるタンパク質において、存在することが好ましい。
【００３４】
なお更なる実施形態において、本発明は組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、親ＣＳＦＶゲノムによりコードされるＥ２における８２９位から８３７位の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の付加を含む上記ウイルスを提供する。前記挿入付加は、改変されたＥ２タンパク質へのＥ２特異的モノクローナル抗体の結合を最小限化、更には阻害することになる。「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の挿入は好ましくは、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２および非構造タンパク質において、サイレントな突然変異、追加的Ｎグリコシル部位、および／またはアミノ酸改変、またはこの組み合わせから選択される少なくとも１つの更なる改変と、組み合わせられる。前記少なくとも１つの更なる改変は好ましくは、ＥＲＮＳ遺伝子の１５４９位における例えばＵからＣへのサイレントな改変、７８９位におけるＳからＦへの改変、４４５位におけるＡからＴへの改変、７７４位におけるＤからＮへの改変、および／または８３１位におけるＶからＧへの改変から選択される。
【００３５】
本発明による組み換えＣＳＦＶの親ゲノムは好ましくは弱毒化されたＣＳＦＶ株のゲノムである。
【００３６】
弱毒化されたＣＳＦＶ株は、ＲＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＥｒｎｓ遺伝子の突然変異により（Ｍａｙｅｒら、２００３．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．９８：１０５−１６）；ＣＳＦＶ強毒性株からのＮｐｒｏの欠失により（Ｍａｙｅｒら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ２２：３１７−３２８）；ＥｒｎｓとＥ２における突然変異を組み合わせることにより（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、２００４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８：８８１２−８８２３）；Ｅ１遺伝子の突然変異により（Ｒｉｓａｔｔｉら、２００５．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４３：１１６−１２７）；並びにＥ２遺伝子の突然変異により（Ｒｉｓａｔｔｉら、２００７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６４：３７１−８２）、形成できる。
【００３７】
好ましい弱毒化されたＣＳＦＶ株は、３’末端非コーディング領域に挿入を含む。例えば、３’未翻訳領域中の１２ヌクレオチドの挿入はＣＳＦＶの弱毒化をもたらす（Ｗａｎｇら、２００８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３７４：３９０−８）。前記挿入は好ましくは５’−ＣＵＵＵＵＵＵＣＵＵＵＵからなる１２ヌクレオチドの配列を含む。
【００３８】
最も好ましい親ゲノムはＣ（チャイニーズ）株のゲノムである。親ゲノムとして更により好ましいものは、ブタ腎臓細胞系統ＳＫ６の懸濁培養に適合されたＣ株ウイルスであるセジペスト（Ｃｅｄｉｐｅｓｔ）Ｃ株のゲノムである（Ｔｅｒｐｓｔｒａら、１９９０．Ｄｔｓｃｈ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．９７：７７−９）。セジペスト株４００から６００ＴＣＩＤ５０を接種されたブタは、予防接種後７日および６ヶ月において、ＣＳＦＶの強毒性株の１００ｐｉｇＬＤ５０より高値の攻撃に対して完全に保護される。従って、本発明はまたＥ２における８２９位から８３７位の改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインをコードする組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムのコピーを含むｃＤＮＡ分子を提供する。前記ｃＤＮＡ分子は好ましくは本発明による実質的に完全な組み換え親ＣＳＦＶウイルスゲノムを含み、これにより、前記親ゲノムはＣ（チャイニーズ）株から、またはより好ましくはセジペスト株から誘導される。好ましいｃＤＮＡ分子は「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むＥ２タンパク質をコードする組み換えＣＳＦＶゲノムのコピーを含む。本発明はまた、前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。本発明は更に、前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを含むタンパク質をコードするコンストラクトに関する。本発明は更に、前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを含むタンパク質、および前記改変された「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインを含むペプチド、および例えばＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイにおける前記タンパク質またはペプチドの使用に関する。
【００３９】
その他の態様において、本発明は本発明による組み換えＣＳＦＶを含む生ＣＳＦワクチンを提供する。
【００４０】
本発明による組み換えＣＳＦＶを含むワクチン、即ち免疫活性な組成物は、生弱毒化ウイルスにより誘導される保護の急速な誘導および延長性を、Ｅ２タンパク質の重要な免疫優性エピトープであるＥ２の保存されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインにおける欠失のような相違に基づく、予防接種動物と野生型のウイルスを感染させた動物との間の区別の可能性と組み合わせている。
【００４１】
循環ウイルスレベルの顕著な低減および臨床症例の同時低減をもたらす数種のワクチンを開発している。例えばエンベロープ糖タンパク質Ｅ２に基づくＣＳＦＶに対するサブユニットワクチンを開発している。このサブユニットワクチンはＥＲＮＳに対する抗体の検出に基づいて、予防接種ブタと感染ブタとの間の判別を可能にする（Ｖａｎ Ａａｒｌｅ，２００３．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ（Ｂａｓｅｌ）１１４：１９３−２００）。しかしながら、ワクチンは免疫の発生と持続時間の両方に関してＣ株ワクチンより劣っている。より重要な点として、このワクチンを伴うＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡはペスチウイルス属の他のメンバー（即ちＢＶＤＶおよびＢＤＶ）も検出する。従ってこれらの使用はこれらのウイルスが循環する領域においては推奨されない（２００３／２６５／ＥＣ；ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３）。
【００４２】
更なるワクチンがいわゆるウィルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）により提供される。ＶＲＰ粒子は、複製可能でありコードされたウイルスタンパク質を発現することができるが、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つにおける欠失のために粒子形成のために必要とされる完全な情報を含有していない突然変異体のゲノムＲＮＡを含有する。これらのウイルス粒子は非伝染性であり、従って安全なワクチンのための要件の１つを満足している。しかしながらＥ２遺伝子の部分的または完全な欠失を有するＶＲＰは、高度に強毒性のＣＳＦＶによる致死的攻撃に対抗しては僅かに部分的な保護のみしか誘導しなかった（Ｍａｕｒｅｒら、２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ２３：３３１８−２８）。
【００４３】
本発明は更に、本発明によるワクチンの有効量を動物に投与することを含む、ＣＳＦに対抗して上記動物を保護する方法を提供する。
【００４４】
有効量とは、これを投与する個体において免疫学的応答を誘導することにより、ワクチンに対する分泌、細胞および／または抗体媒介の免疫応答を個体において発生させる、前記ワクチンの量として定義される。ワクチンに対する前記分泌、細胞および／または抗体媒介の免疫応答はまた、強毒性ＣＳＦＶ株による攻撃に対抗して効果的である。
【００４５】
前記有効量は好ましくは経口、または口鼻または筋肉内に投与される。本発明による組み換えＣＳＦＶを含むブタコレラに対する免疫原性組成物は、好ましくは製薬上許容し得る担体と共に投与する。
【００４６】
ＣＳＦに対抗して動物を保護する別の方法は、特に野生の雄ブタのような野生動物を保護するための餌ワクチンとしての本発明のワクチンの有効量を提供することを含む。
【００４７】
効力のあるワクチンはウイルスの複製を防止することおよび／またはウイルスの伝染を低減することにより、臨床症状を低減または防止する。ＤＩＶＡ（感染動物を予防接種動物から区別する）という用語は、区別診断試験と連携して野生型ウイルスの突然変異体に基づいているワクチンおよびこの付随診断試験に関して使用される。この系は回復期の動物の血清学的発見を代償とすることなく感受性の動物集団の集団的予防接種を可能にする。
【００４８】
本発明は更に血清学的試験において動物の血清を分析することを含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、非感染動物から、または本発明によるＣＳＦワクチンを接種した動物から区別する方法を提供する。前記ＣＳＦＶワクチンは本発明のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインの改変、より好ましくは、Ｅ２タンパク質における少なくとも１つの更なる改変、例えばアミノ酸位置７７２から７７８のＬＦＤＧＴＮＰドメインにおける改変を含むことが好ましい。
【００４９】
前記血清学的試験は好ましくは未損傷のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質を認識するモノクローナル抗体のような抗体１つ以上、および、ＣＳＦＶによりコードされる更なるエピトープ、例えばＥ２タンパク質内部の更なるエピトープ、例えばＬＦＤＧＴＮＰエピトープを認識するモノクローナル抗体のような抗体１つ以上を含む。
【００５０】
好ましい実施形態においては、前記抗体の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）は生存ブタにおけるＣＳＦの診断を可能にする。好ましいＥＬＩＳＡは、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡである。好ましいＥＬＩＳＡはＥ２に基づいた競合的ＥＬＩＳＡ、例えばＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡである。改変されたＬＦＤＧＴＮＰドメインの存在下または非存在下に、改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含む突然変異体のＥ２タンパク質を有する動物の血清を予備インキュベートすることにより、前記改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインおよび改変されたＬＦＤＧＴＮＰドメインに対して指向された抗体に対する前記血清を枯渇させることができる。
【００５１】
最も好ましいＥＬＩＳＡはペプチド系のＥＬＩＳＡであり、その場合、ペプチドはマイクロウェルの試験プレートに交差結合される。前記交差結合は好ましくは例えばポリＬ−リジンのようなアンカータンパク質を通じて実施される。交差結合ペプチドを使用するＥＬＩＳＡは一般的には受動的にコーティングされたペプチドを使用するＥＬＩＳＡと比較して、より感度が高い。手法は比較的簡素に実施され、組織培養施設を必要とせず、自動化に適しており、半日以内に結果が出る。一方でＣＳＦＶの野生種とワクチン株との間、他方でＣＳＦＶと他のペスチウイルスとの間で、区別を明確に行うモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用することができる。ペプチドは非特異的な交差反応性をブロックするために使用される。
【００５２】
前記ペプチド系のＥＬＩＳＡは好ましくは液相ペプチドＥＬＩＳＡ（ｌｐＥＬＩＳＡ）である。ＣＳＦＶに対抗する抗体の検出のための前記ｌｐ−ＥＬＩＳＡにおいては、被験血清を修飾ＣＳＦＶペプチドと非相同対照ペプチド、例えばＢＶＤＶペプチドの混合物と共にインキュベートする。前記修飾されたＣＳＦＶペプチドは好ましくはビオチニル化されているのに対し、対照ペプチドはビオチニル化されていない。ＣＳＦＶ特異的抗体は前記ＣＳＦＶペプチドに結合することになり、前記修飾を通じて、例えばビオチニル化されたＣＳＦＶペプチドのアビジンまたはストレプトアビジンへの結合により、捕獲される。修飾されたＣＳＦＶペプチドと複合体化された抗体を検出することができ、例えば、複合体化されたブタ抗体は、抗ブタパーオキシダーゼコンジュゲートおよびその後の適切な基質とのインキュベーションにより検出される。
【００５３】
野生種ＣＳＦＶに感染しているか、本発明の組み換えウイルスで予防接種されている動物の区別のための代替の試験は、蛍光抗体試験（ＦＡＴ）および逆転写酵素とその後の例えばポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡ複製、および増幅されたＤＮＡの配列の分析により、与えられる。ＦＡＴはＣＳＦＶに感染している疑いのある、または、本発明によるワクチンを予防接種されているブタから単離した扁桃、脾臓、腎臓、リンパ節または回腸遠位部分の低温切片においてＣＳＦＶ抗原を検出するために使用される。代替の試験法においては、ＣＳＦＶは例えば野生種のＣＳＦＶに感染しているか感染の疑いのある動物の扁桃から単離され、ＰＫ−１５細胞と共にインキュベートされる。その後、複製したウイルスを、ＰＫ−１５細胞中で野生種のウイルスと本発明の組み換えウイルスとを区別する抗体を用いながら、検出する。
【００５４】
更なる好ましい血清学的試験は、前記血清が未損傷のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質に対抗して指向された抗体の結合を阻害する抗体を含むか、または、前記血清が改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質に対抗して指向された抗体の結合を阻害する抗体を含むかを調べるための競合的ＥＬＩＳＡを含む。
【００５５】
なお更に好ましい血清学的試験は、本発明による改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＥ２タンパク質を特異的に認識する１つ以上の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含む。よりいっそう好ましい実施形態において、前記血清学的試験は、本発明による改変されたＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインおよび前記Ｅ２タンパク質の更なる改変された免疫原性ドメインを含むＥ２タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体のような抗体１つ以上を含む。前記マーカーワクチンは動物への予防接種の後の判別抗体の信頼性の高い誘導および検出（感度および特異性）を必要とする。前記判別抗体の存在は、好ましくは蛍光抗体ウイルス中和試験、中和パーオキシダーゼ結合試験、および抗体ＥＬＩＳＡから選択される、上記血清学的試験により検出される。
【００５６】
本発明は更に、感染した動物を予防接種された動物から区別することができるようにするマーカーワクチン中で使用できる感染性組み換えウイルスを単離するための方法を提供し、方法は、前記ウイルスによりコードされ、ウイルスの少なくとも９０％において、好ましくはウイルスの少なくとも９５％において、より好ましくはウイルスの少なくとも９９％において、保存されているタンパク質の免疫優性ドメインを選択する工程；前記免疫優性ドメインをコードする前記ウイルスのゲノム領域中に、改変、好ましくは欠失を導入することにより、例えば出発ウイルスを形成する工程；改変されたゲノムを適する細胞または細胞系統に接触させる工程；適する細胞または細胞系統を継代することによりウイルスの増殖を可能にする工程；および、出発ウイルスの適合性の損失を補償するゲノム中の１つ以上の更なる改変を含む上記適する細胞または細胞系統から感染性ウイルスを単離する工程、を含む。
【００５７】
タンパク質の保存された免疫優性ドメイン中の前記改変は、野生型の免疫優性ドメインを発現するウイルスを改変された免疫優性ドメインを発現するウイルスから判別する、モノクローナルおよびポリクローナル抗体のような抗体の形成を可能にする。従って、本発明はまた、前記改変され保存された免疫優性ドメインを特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。
【００５８】
本発明は更に、前記改変され保存された免疫優性ドメインを含むタンパク質をコードするコンストラクトに関する。本発明は更に前記改変され保存された免疫優性ドメインを含むタンパク質、および、前記改変され保存された免疫優性ドメインを含むペプチドに関する。
【００５９】
保存された免疫優性ドメイン中に改変を含むワクチンは更に、未改変の免疫優性ドメインを認識する予防接種された個体における抗体の形成を誘導しない。前記未改変の保存された免疫優性ドメインを認識することを指向する診断試験は、野生型免疫優性ドメインを発現するウイルスに感染した動物を、予防接種した動物から判別することを可能にする。
【００６０】
保存された免疫優性ドメインの前記改変は、野生型ウイルスと比較して細胞を感染させることにおいてより低効率性であるか、および／または感染細胞中でより低効率に複製するウイルスをもたらす場合がある。感染した細胞または細胞系統の継代を行うことは、ウイルスを救済する１つ以上の第２の部位のゲノム改変の導入を可能とする。前記救済されたウイルスは、改変されたウイルスと比較してより効率的に感染し、および／または細胞中で複製するか、または保存された免疫優性ドメインの改変に相関する別の不都合に拮抗している。従って救済されたウイルスは保存された免疫優性ドメイン中の改変により導入された適合性の損失を補償する親ゲノムにおける１つ以上の更なる改変を含む。本発明による方法の更なる利点は、親ゲノム中の追加的な１つ以上の更なる改変が、親の免疫優性ドメインを含む復帰変異株のウイルスの形成を阻止する点である。
【００６１】
本発明による好ましい方法において、ゲノム領域中の前記改変は少なくとも１つのアミノ酸の欠失をもたらす。少なくとも１つのアミノ酸、例えば１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、または３つより多いアミノ酸の欠失は、親の免疫優性ドメインを含む復帰変異株ウイルスの形成を更に阻止することになる。
【００６２】
本発明による更なる好ましい方法においては、少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、親ウイルスのゲノムにおける少なくとも１つの更なる改変と組み合わせられる。前記少なくとも１つの更なる改変により、出発ウイルスの感染細胞または細胞系統の継代は、少なくとも１つのアミノ酸の前記欠失が前記細胞または細胞系統中のウイルスの複製にとって有害である場合には、可能となる。前記少なくとも１つの更なる改変の導入はある程度までは出発ウイルスの適合性を回復させ、出発ウイルスが前記細胞または細胞系統中で複製可能となる。
【００６３】
好ましい実施形態においては、前記ウイルスは負鎖ＲＮＡウイルス、例えば狂犬病ウイルスおよびニューカッスル病ウイルス、および正鎖ＲＮＡウイルス、例えばフラビウイルス科、好ましくはペスチウイルス、例えばウシウィルス性下痢ウイルス、ボーダー病ウイルス、およびＣＳＦＶから選択される。本発明の方法のために最も好ましいウイルスはＣＳＦＶである。
【００６４】
本発明は更に本発明の方法により得ることができる感染性組み換えウイルス、好ましくはＣＳＦＶを提供する。
【００６５】
本発明はまた、本発明の方法により得ることができる感染性組み換えウイルス、好ましくはＣＳＦＶの使用、例えば１匹以上の動物に予防接種することにより前記動物を強毒性野生種ウイルスによる感染に対抗して保護するためのワクチンにおける使用を提供する。
【００６６】
ワクチンの前記使用は、感染動物を非感染動物または予防接種動物から区別できるようにする。
【００６７】
効力のあるマーカーワクチンの主要な利点は、これが予防接種ブタ集団中の感染ブタの検出を可能にし、これによりブタ集団におけるＣＳＦＶの蔓延または再伝播をモニタリングする可能性を付与する点である。即ち、予防接種ブタ集団が検査室試験結果に基づいてＣＳＦ非含有であることをある程度の信頼性をもって宣言できるようになる。
【００６８】
後者は生存ブタまたはブタ製品の輸出のための制限期間を短縮することができる。商取引の迅速な続行の経済的利点は明らかであり、従って、いずれかのマーカーワクチンの使用に緊密に関連している。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ｅ２における導入された適応突然変異。 ａ研究中の組み換えウイルスの７７２位から７９１位および８２３位から８４２位のアミノ酸の比較。 ｂ導入されたアミノ酸置換は太字で示し、適応突然変異は太字斜体で示す。 ｃＴＡＶＳＰＴＴＬＲおよびＬＦＤＧＴＮＰエピトープは枠内に表示。 ｄ＋＋；ウイルスは救済され、生育はｖＦｌｃ３４（野生型）のものに匹敵していた。＋；ｖＦｌｃ３４と比較して減損した生育のウイルス。＋：ウイルスは数回の継代の後に培養基から消失していた。−；ウイルスは検出されなかった。ｎｄ；測定せず。 ｅ新たに導入されたＡＡＵコドンの１つはウイルスの増殖中に欠失した。
【図２】ｖＦｌｃ３４（野生型Ｃ株）、Ｃ株グリコシル化突然変異ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２およびＣ株欠失突然変異体ｖＦｌｃ−ΔＰおよびｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のインビトロの生育特性。ＳＫ６．Ｔ７単層を感染させ、メチルセルロースを含有する生育培地で被覆し、４日間３７℃でインキュベートした。単層を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パーオキシダーゼコンジュゲートｍＡｂ ＷＢ１０３で免疫染色した。
【図３】（Ａ）ウイルスｖＦｌｃ３４（◇）、ｖＦｌｃ−Ｎ１（□）、ｖＦｌｃ−Ｎ２（○）、および（Ｂ）ｖＦｌｃ３４（◇）、ｖＦｌｃ−ΔＰ（×）およびｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（Δ）の多段階生育曲線。ＳＫ６．Ｔ７細胞は０．１の感染多重度で感染させた。
【図４】未感染（擬似検体）、またはｖＦｌｃ３４、ｖＦｌｃ−Ｎ１またはｖＦｌｃ−Ｎ２をそれぞれ感染させたＳＫ６．Ｔ７細胞の溶解物、およびＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後の同試料を含有する変性ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット。タンパク質はｍＡｂ Ｃ２および二次抗体としてのパーオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリンにより検出した。オリゴマー（Ｏ）、単量体（Ｍ）およびＰＮＧａｓｅ Ｆ−処理単量体（Ｍ＊）の位置を示す。分子量標準物質タンパク質の位置は左側に示す。
【図５】ｖＦｌｃ−３４（Ａ）、ｖＦｌｃ−Ｎ１（Ｂ）、またはｖＦｌｃ−ΔＰ（Ｃ）により誘導された、それぞれＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（▲）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（□）によるＥ２およびＥＲＮＳ抗体の応答の分析。記載した数値は平均（ｎ＝４）および標準偏差である。
【図６−１】左パネル：ｖＦｌｃ３４（ウサギ１．１（Ａ）および１．２（Ｂ））またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ウサギ２．１（Ｃ）、２．２（Ｄ）および２．３（Ｅ））により誘導された、それぞれＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（▲）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（□）によるＥ２およびＥＲＮＳ抗体の応答の分析。右パネル：ＰＥＰＳＣＡＮ分析による第３６日において得られたウサギ抗血清の分析。１６２ペプチドとのウサギ抗血清の反応性（ｘ軸）を示す。Ｘ軸上の数字はＣＳＦＶポリペプチド中のペプチドＮ末端の位置に相当する。ｙ軸はＯＤｃｃｄ値を示す。
【図６−２】左パネル：ｖＦｌｃ３４（ウサギ１．１（Ａ）および１．２（Ｂ））またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ウサギ２．１（Ｃ）、２．２（Ｄ）および２．３（Ｅ））により誘導された、それぞれＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（▲）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（□）によるＥ２およびＥＲＮＳ抗体の応答の分析。右パネル：ＰＥＰＳＣＡＮ分析による第３６日において得られたウサギ抗血清の分析。１６２ペプチドとのウサギ抗血清の反応性（ｘ軸）を示す。Ｘ軸上の数字はＣＳＦＶポリペプチド中のペプチドＮ末端の位置に相当する。ｙ軸はＯＤｃｃｄ値を示す。
【図６−３】ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープとのｖＦｌｃ３４（Ｆ）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（Ｇ）に対して育成したウサギ抗血清由来の抗体の反応性の比較。Ｘ軸上の数字はＣＳＦＶポリペプチド中のペプチドＮ末端の位置に相当する。ｙ軸はＯＤｃｃｄ値を示す。
【図７】ＣＳＦＶ Ｃ株Ｅ２タンパク質の外ドメインの抗原構造の案（Ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：３９３４−４２から変更）。抗原ドメインＢ／ＣおよびＡを示す。テキスト中で言及しているＰＮＧＳの位置は矢印で示す。これらの突然変異体において、記載したアミノ酸はＡｓｎ残基に置換されている。正規のＮ連結グリカンは実線で描画し、新たに導入された（推定）Ｎ連結グリカンは破線で描画する。ネイティブのＥ２構造中で共局在していると予測されるＥ２の位置は陰影部分である。Ｂ細胞エピトープ８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７および７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８は太字で示す。
【図８】ｖＦｌｃ３４（Ａ；ブタ番号３１６６から３１７０）、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（Ｂ；ブタ番号３１７１から３１７５）を予防接種したブタ、または、培養基のみを接種したブタ（Ｃ；ブタ番号３１７６から３１７８）の体温（黒符号）および臨床数値（ＣＳ；白符号）。ブタには第２８日に強毒性のブレシア株で攻撃した。発熱は４０℃超の体温として定義した（破線）。
【図９】高度に強毒性のブレシア株の致死量で攻撃したブタから得られた末梢血中の末梢血白血球（Ａ）および血小板（Ｂ）計数値。攻撃２８日前において、ブタに培養基のみを接種するか、またはｖＦｌｃ３４（ブタ番号３１６６から３１７０）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ブタ番号３１７１から３１７５）を１回予防接種した。
【図１０】ｖＦｌｃ３４またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種し、その後強毒性ブレシア株で攻撃したブタにおいて誘導された抗体応答の分析。ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＣＳＦＶ Ａｂ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（Ａ）およびＣＨＥＫＩＴ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（Ｂ）を用いて抗体応答を分析した。４０％または５０％を超えるブロッキングをもたらした血清を、それぞれＥ２ ＥＬＩＳＡおよびＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにおいて、ＣＳＦＶ抗体に関して陽性とみなす。ブタは第０日にｖＦｌｃ３４（ブタ番号３１６６から３１７０；破線）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（ブタ番号３１７１から３１７５；実線）を予防接種し、第２８日に攻撃した（矢印）。
【００７０】
実施例
【実施例１】
【００７１】
材料および方法
ウイルスおよび細胞。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＳＫ６．Ｔ７）を構成的に発現するブタ腎細胞（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：１１７−２８）をグルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、５％ウシ胎児血清および抗生物質ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、アンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）および適宜、１０ｍＭ２塩酸Ｌ−ヒスチジノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＫ１０００培地中で生育させた。特段の記載が無い限り、ウイルス保存液は、ＳＫ６．Ｔ７細胞上で３から４回ウイルスを継代し、その後、感染単層の２回連続凍結／解凍サイクルを行うことにより作成した。後者は強度に細胞会合性であるＣ株ウイルスの放出を最大限とするために実施した。ウイルス保存液はｌｏｇ１０希釈でＳＫ６．Ｔ７細胞上で力価検定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして求めた。
【００７２】
Ｃ株突然変異体の構築。Ｔ７プロモーター制御下の「セジペスト」ＣＳＦＶ Ｃ株のＤＮＡコピーを含有するプラスミドｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４を部位指向性突然変異誘発により突然変異を導入するための鋳型として使用した。Ｃ株ウイルスの以前に公開されたＤＮＡコピー、即ちｐＰＲＫｆｌｃ−１３３（（Ｍｏｏｒｍａｎｎら、１９９６．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：７６３−７０）はゲノムの３’末端の−１０位におけるシトシンを欠いていることがわかった。ｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４において、このエラーを補正する。プライマーは表１に示す。フォワードプライマーの名称は構築された組み換えウイルスの名称に相当する。プライマーＲＶ−ｒを各構築のためのリバースプライマーとして使用した。ＰＣＲ増幅は、エキスパンドハイフィディリティーＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。ＰＣＲ産物は製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書に従ってｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター内にクローニングし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０遺伝子分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。ＰＣＲ産物はＡｐａＬＩで消化することによりｐＧＥＭ−Ｔプラスミドから遊離させ、Ｃ株ウイルスの５’側半分をコードするｃＤＮＡを含有するｐＯＫ１２−誘導プラスミドであるプラスミドｐＰＲｃ１２９の相当するゲノムフラグメントを置き換えるために使用した。その後ｐＰＲｃ１２９プラスミドをＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、得られたフラグメントは、プラスミドｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４の相当するセグメントを置き換えるために使用し、これによりプラスミドｐＦｌｃ−Ｎｌ、ｐＦｌｃ−Ｎ２、ｐＦｌｃ−Ｎ３、ｐＦｌｃ−Ｎ４、ｐＦｌｃ−Ｎ５、ｐＦｌｃ−ΔＰ、ｐＦｌｃ−ΔＰＴ、ｐＦｌｃ−ΔＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＳＰＴ、ｐＦｌｃ−ΔＶＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＡＶＳＰおよびｐＦｌｃ−ΔＳＰＴＴＬを得た。
【００７３】
Ｃ株突然変異体のウイルス生産。完全長ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドをＸｂａＩで線状化し、以前に記載されている通りＳＫ６．Ｔ７細胞にトランスフェクトした（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：１１７−２８）。トランスフェクションの４日後、ウイルスタンパク質の発現を、ＣＳＦＶ非構造タンパク質ＮＳ３に対して指向されたｍＡｂ ＷＢ１０３を用いながらイムノパーオキシダーゼ単層試験（ＩＰＭＡ）により測定した（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９１．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９：１０１−８）。別のウェルに由来する細胞をトリプシン処理し、２５ｃｍ２の組織培養フラスコに移し、３から４日間生育させた。必要に応じて、細胞を反復して継代することにより、ウイルスの生育を支援した。単層を凍結解凍し、遠心分離することにより細胞破砕物を除去し、その後、−７０℃で保存した。清澄化した溶解物を用いながら、新しいＳＫ６．Ｔ７細胞を感染し、次いで４日後に採取することによりワクチン候補のシードロットを調製した。ウイルスの生育は常時、ＳＫ６．Ｔ７細胞上で実施した。本明細書に記載したウイルスはＳＫ６細胞上でも正常に複製するが、ＳＫ６．Ｔ７細胞を用いた場合のほうが、生産収率がより正確な再現性を示した。
【００７４】
救済されたウイルスの生育動態を研究するために、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中のサブコンフルエントな単層を０．１の感染多重度で感染させた。感染２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、１４４時間後および１６８時間に、細胞溶解物中のウイルス力価を測定した。材料を２回凍結解凍し、４℃で２５００×ｇで遠心分離することにより清澄化し、−７０℃で保存した。ウイルス力価（ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ）をＳＫ６．Ｔ７細胞上で求めた。救済されたウイルスのＥ２遺伝子を配列決定した。適宜、キャプシド（Ｃ）、ＥＲＮＳおよびＥ１タンパク質（即ち構造タンパク質）をコードする遺伝子も配列決定した。この目的のため、ウイルスＲＮＡをＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ全ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いながら単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および遺伝子特異的プライマーを用いながらｃＤＮＡ合成のために使用した。ｃＤＮＡは上記した通り配列決定した。
【００７５】
ウエスタンブロット。感染ＳＫ６．Ｔ７細胞の溶解物を２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中に生育させたコンフルエントな単層から調製した。この目的のために、細胞は１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＢＤＨ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）を含有する０．５ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で溶解させた。細胞破砕物を４℃で１０，０００×ｇで４分間遠心分離することにより除去した。タンパク質は１２％ポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離し、そしてその後、ニトロセルロース紙（Ｐｒｏｔｒａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移行させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％Ｐｒｏｔｉｆａｒ（Ｎｕｔｒｉｃｉａ）を含有するＰＢＳでブロッキング後、ブロットをＥ２のＢ／Ｃドメインに対して指向されたＣ株特異的ｍＡｂ Ｃ２（Ｂｏｇｎａｒ ａｎｄ Ｍｅｓｚａｒｏｓ，１９６３．Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｈｕｎｇ １３：４２９−４３８）、次にパーオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートした。パーオキシダーゼ活性はＳｔｏｒｍ ８６０分子画像化装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いながら増強ケミルミネセンスシステム（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
【００７６】
イムノパーオキシダーゼ単層試験（ＩＰＭＡ）。単層をＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、風乾し、−２０℃で凍結した。単層をパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％ｗ／ｖ）で１５分間固定し、その後ＰＢＳで洗浄した。パーオキシダーゼコンジュゲートＡドメイン特異的ｍＡｂであるｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ７（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１９８９．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７０：２８６５−７６）、ｃ１、ｃ４、ｃ８、ｃ１１（Ｂｏｇｎａｒ ａｎｄ Ｍｅｓｚａｒｏｓ，１９６３．Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｈｕｎｇ １３：４２９−４３８）およびＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡで使用するｍＡｂ、即ちｍＡｂ １８．４を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０および５％ウマ血清を含有するＰＢＳ中（ＰＢＳ−Ｔ）で使用した。１時間３７℃でインキュベートした後、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後パーオキシダーゼの活性を基質として３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（ＡＥＣ、Ｓｉｇｍａ）を用いながら検出した。
【００７７】
ウサギの接種。約２ｋｇのニュージーランド白ウサギを２匹から４匹の群で飼育した。体温は接種の３日前から５日後まで毎日モニタリングした。ウサギの正常体温は３８．５から４０．１℃である。従って、発熱は４０．１℃を超える体温として定義した。ウサギはウイルス１０３ ＴＣＩＤ５０を含有する生育培地２００μｌで耳辺縁静脈を介して接種した。７日毎に、血清を採集した。ウイルス単離のために使用するべきＥＤＴＡ血液の接種４日後に採集した。
【００７８】
ウイルス単離。末梢血白血球（ＰＢＬ）をＥＤＴＡ血液試料から、記載（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ａｎｄ Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８８．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６：１２３−８）に従って塩化アンモニウム沈殿（０．８３％ＮＨ４Ｃｌ）により濃縮した。ＰＢＬをＰＢＳに再懸濁し、−７０℃で凍結した。翌日、サブコンフルエントのＳＫ６．Ｔ７細胞単層を１時間凍結解凍したＰＢＬの懸濁液と共にインキュベートし、その後懸濁液を新しい生育培地に交換し、その後４日間インキュベートした。配列分析のために十分なウイルスを生産するために、救済されたウイルスをＳＫ６．Ｔ７細胞上で数回継代した。
【００７９】
ＰＥＰＳＣＡＮ分析。ＣＳＦＶポリタンパク質のアミノ酸６９０から８５１に渡るＣＳＦＶ株ブレシアＥ２タンパク質から誘導されたオーバーラップ１５アミノ酸長ペプチドの完全なセットを以前に記載されている通り（Ｇｅｙｓｅｎら、１９８４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２）クレジットカードフォーマットｍｉｎｉＰＥＰＳＣＡＮカード中で合成した。各ペプチドへの血清由来抗体の結合はＳｌｏｏｔｓｔｒａらの記載の通りｐｉｎに基づいてＥＬＩＳＡにおいて試験した（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら、１９９６．Ｍｏｌ Ｄｉｖｅｒｓ １：８７−９６）。
【００８０】
結果
新たに導入された潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）を有するＣ株突然変異体の生産および特性化。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の新たに導入された潜在的Ｎ連結グリコシル化部位を有する突然変異体Ｃ株ウイルスをコードする完全長ｃＤＮＡコンストラクト（図１）は、Ｔ７プロモーター制御下のｐＰＲＫ−ｆｌｃ３４、即ち「セジペスト」Ｃ株のｃＤＮＡクローンの遺伝子修飾により構築した。Ｎ連結グリコシル化のための最低条件は、アミノ酸配列アスパラギン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）またはセリン（Ｓｅｒ）の存在であり、ここでＸはＰｒｏとアスパルテート（Ａｓｐ）を除くいずれかのアミノ酸であることができる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１−６４）。突然変異体ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ１は単一の新たに導入されたＰＮＧＳを含有するのに対し、突然変異体ｖＦｌｃ−Ｎ２、ｖＦｌｃ−Ｎ３、ｖＦｌｃ−Ｎ４およびｖＦｌｃ−Ｎ５は多数を含有する（図１）。ｖＦｌｃ−Ｎ５ウイルスにおいて、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部のＰｒｏ残基（Ｐｒｏ８３３）は２つのＡｓｎ（Ｎ）残基と置換されており、２つのオーバーラップするＰＮＧＳをもたらしている（即ちＮＮＴＴ）。
【００８１】
組み換えウイルスを生産するために、線状化されたプラスミドを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するＳＫ６．Ｔ７細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、全例において、培養基中の感染性ウイルスの存在が新しいＳＫ６−Ｔ７細胞の感染により明らかにされた。しかしながら、ウイルスの適合性における大きな相違が観察された。ｖＦｌｃ−Ｎ１の感染巣はｖＦｌｃ３４のものよりも幾分小型であった（図２）が、多段階生育曲線によればこれらの２種のウイルスの適合性には有意差はなかった（図３Ａ）。ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ２は明確により弱毒化しており、かなり小型の病巣およびより低値の最終力価をもたらした（それぞれ図２および図３Ａ）。ｐＦｌｃ−Ｎ３またはｐＦｌｃ−Ｎ４でトランスフェクトした細胞の上澄みに由来するウイルスを１回または２回継代したが、最終的には消失した。突然変異によりこれ自体の適合性を増大させる機会を有するウイルスを得るために、これらのウイルスを含有する細胞を反復して継代した。しかしながら残念にも、陽性染色された細胞の数はこれらの継代の間に増大せず、適合性補償突然変異が導入されなかったことを示唆していた。
【００８２】
興味深いことに、ｐＦｌｃ−Ｎ５から生産されたウイルス（図１）はトランスフェクトした細胞の僅か数回の継代の後に救済されており、最終的には１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価をもたらした。このウイルスのＥ２遺伝子を配列決定したところ、未変化であることがわかった。ｖＦｌｃ−Ｎ５をより大量に生産するために、ウイルスを用いて新しいＳＫ６．Ｔ７細胞を感染させた。これによりｖＦｌｃ３４の通常得られるものと同様の力価が実際に得られたが（データ示さず）、コンセンサス配列は、ウイルスは２つの新たに導入されたＡｓｎ残基の一方を損失しており、このため、ｖＦｌｃ−Ｎ１と本質的に同一であったことを示していた。この所見は、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の第２のＡｓｎ残基が感染プロセスのある段階においてウイルスに対して有害であることを示唆している。結果として、ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２のみがその後の研究に適していると考えられた。
【００８３】
ＤＩＶＡワクチンとして適しているためには、ワクチン候補はＡドメイン特異的抗体をインビボで誘導不可能でなければならない。しかしながら、現在の候補中に導入された修飾がＡドメインの抗原性の構造に影響したかどうかに関する第１の考えを得るために、本発明者らは組み換えウイルスが本発明者らのＡドメイン特異的ｍＡｂのいずれかによりＩＰＭＡ中で認識されるかどうかを調べた。使用したＡドメイン特異的ｍＡｂはＣＳＦＶ株ブレシア（即ちｍＡｂ ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ７）またはＣ株（即ちｃ１、ｃ４、ｃ８およびｃ１１）のいずれかに対して育成した。Ｃｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡにおいて使用したｍＡｂ、即ちｍＡｂ１８．４をこれらの実験に使用した。本発明者らの抗体の一部は野生型Ｃ株を弱く染色したのみであったため、突然変異体Ｃ株ウイルスを認識する抗体の能力を、メチルセルロース被覆下にウイルスを生育させることにより生じさせた感染巣を染色することにより検討した。野生型Ｃ株の感染巣は使用した全抗体により明確に染色されたが、これらの実験は、Ｐｒｏ８３３→Ａｓｎの置換はインビトロのｍＡｂによるＡドメインの認識を防止するために十分であることを示していた（データ示さず）。
【００８４】
ビリオンの表面におけるこの露出およびこれが中和抗体に対する優性な標的であるという事実にも関わらず、ＡドメインのＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープは進化の過程に渡って保存されている。このことは、この当該配列を含有するウイルスが、この領域中にアミノ酸置換を含有するウイルス集団内部の変異体を超えた選択的利点を有することを示唆している。本発明者らはこのエピトープ中に１つ（即ちｖＦｌｃ−Ｎ１）または２つ（即ちｖＦｌｃ−Ｎ２）のいずれかの新たに導入されたＰＮＧＳを有するウイルスを回収することができたが、組織培養物中の生育時のこれらの突然変異体の進化を研究することは明確に関連性があった。この目的のために、ｖＦｌｃ−Ｎ１をインビトロで３０回継代した。ウイルスの表現型の安定性を研究するために、感染した単層を非構造タンパク質ＮＳ３に対して指向された抗体、即ちＷＢ１０３で免疫染色し、２連の単層をＡドメイン特異的抗体ｂ３およびｂ４の混合物で染色することにより、表現型の復帰変異体（即ちＡドメインがこれらの抗体で染色されるウイルス）が存在するかどうか調べた。僅か３継代の後、ｖＦｌｃ−Ｎ１に感染させた細胞の極めて低比率がｂ３／ｂ４混合物で染色され、表現型の復帰が起こったことが明らかに示されていた。集団生物学の一般的競争排除原理によれば、資源が限定されている環境中に２生物が共存している場合、一方が最終的には他方より優勢となる（Ｇａｕｓｅ，１９３４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９：１６−１７）。このことを考慮し、本発明者らは表現型の復帰突然変異体がウイルスの反復継代によりｖＦｌｃ−Ｎ１より優勢に生育できるかどうか調べることとした。驚いたことに、表現型復帰突然変異体の量は極めて低いレベルのままであり、殆どの実験において、ｂ３／ｂ４ ｍＡｂ混合物で染色された僅か数個の細胞により現れたのみであった。即ち、表現型復帰突然変異体ウイルスは連続的に生じたが、ウイルス集団中では少数派変異体として常時維持されていたと考えられる。この所見はｖＦｌｃ−Ｎ１と相対比較して表現型復帰変異体ウイルスのより低値の適合性を示唆しているため、本発明者らは復帰突然変異体ウイルスが野生型のＣ株配列への真の復帰を示している可能性は低いと考えた。復帰突然変異体の表現型を担っている突然変異を発見するためには、ウイルス集団は、このゲノムを配列決定可能とするために復帰突然変異体ウイルスに関してリッチ化する必要があった。９６穴プレート中にウイルスの希釈液を播種することにより、表現型復帰変異体に関してリッチ化された集団を選択できる。この選択を反復した後、このゲノム配列を決定するために十分な量の復帰突然変異体ウイルスを含有している集団を得た。２つの個別の実験において、表現型復帰突然変異体はＡｓｎコドンにおける単一対突然変異（ＡＡＵからＡＧＵ）に起因して、Ａｓｎが導入された位置（即ちＣＳＦＶポリタンパク質の８３３位）にＳｅｒ残基を含有することがわかった。この突然変異はＰＮＧＳの損失をもたらすため、Ａドメインを認識するｍＡｂの能力回復を伴うことは意外ではない。結論として、復帰突然変異体サブ集団の検出は、ｖＦｌｃ−Ｎ１が突然変異によりこの適合性を増大させる可能性を探索していることを示している。しかしながら、新たに導入されたＡＡＵコドンはマスター遺伝子型により維持されているため、ウイルスは集団レベルでは遺伝子的に安定であると考えられる。
【００８５】
ｖＦｌｃ−Ｎ２の分析はｖＦｌｃ−Ｎ１を用いた実験の間に観察されたものと同様の特性を有する表現型変異体を示したが、これらは更には特性化しなかった。
【００８６】
１つまたは多数の新たに導入されたＰＮＧＳを有するＥ２タンパク質の相対的な電気泳動運動性の分析。ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中の新たに導入されたＰＮＧＳがＥ２への新しい炭水化物部分の結合をもたらしたかどうかを調べるために、修飾されたＥ２タンパク質の相対的な電気泳動運動性を還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、次いでウエスタンブロットにより検討した。ｖＦｌｃ３４、ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−Ｎ２を感染させた細胞の分離タンパク質を含有するウエスタンブロットによれば、ｖＦｌｃ−Ｎ１のＥ２タンパク質はｖＦｌｃ３４の相当するタンパク質よりも高値の分子量を有していた（図４）。Ｅ２を含有するオリゴマーも検出されたが、タンパク質を変性条件下で分析したことを考慮すれば、これらのオリゴマーは恐らくは生理学的なものではない（図４）。タンパク質からＮ連結グリカン類を除去する酵素であるＰＮＧａｓｅ Ｆで細胞溶解物を処理したところ、同一の分子量のＥ２タンパク質が生じた。
【００８７】
ｖＦｌｃ−Ｎ２の分離タンパク質を含有するウエスタンブロットは、２つの新たに導入されたグリコシル化シークオンの少なくとも１つが炭水化物部分のための係留部位として使用されることを示唆した（図４）。これらの溶解物は、より高分子量のＥ２タンパク質でさえも含有すると考えられ、第２のグリコシル化部位のグリコシル化を示唆している。
【００８８】
ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中のターゲティングされた欠失を有するＣ株突然変異体の生産および特性化。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのターゲティングされた欠失を有するＣ株ウイルスをコードする完全長ｃＤＮＡコンストラクト（図１）をグリコシル化突然変異体に関して上記した通り構築した。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部Ｐｒｏ残基の欠失はｖＦｌｃ−ΔＰをもたらし、これはｖＦｌｃ３４と比較すれば幾分より小型の感染巣を生じさせ（図２）、大部分の実験において１０倍低値の力価まで生育した（図３Ｂ）。しかしながら得られた最高の力価は１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌを超えていた。ＩＰＭＡによるｖＦｌｃ−ΔＰの分析によれば、このＣ株突然変異体は本発明者らのＡドメイン特異的ｍＡｂのいずれによっても検出されなかった。留意すべきは、２０継代の後、コンセンサス配列決定によればＳｅｒ７８９コドンにおける対突然変異（ＵＣＣからＵＵＣ）が明らかになり、これはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）とのセリンの置換をもたらしていた。得られたウイルスはｖＦｌｃΔＰａ１と命名した（図１）。
【００８９】
ｖＦｌｃ−ΔＰとは対照的に、１つより多いアミノ酸の欠失を有するウイルスは高度に無力化されていた。グリコシル化突然変異体ｖＦｌｃ−Ｎ３およびｖＦｌｃ−Ｎ４に関して既に記載したものと同様、これらのウイルスをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞の上澄みに由来するウイルスは、数回継代できたが、その後消失した。突然変異により自体の適合性を増大させる機会を有するウイルスを得るために、これらのコンストラクトでトランスフェクトされた細胞を反復して継代した。ｐＦｌｃ−ΔＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＳＰＴ、ｐＦｌｃ−ΔＶＳＰ、ｐＦｌｃ−ΔＡＶＳＰおよびｐＦｌｃ−ΔＳＰＴＴＬでトランスフェクトした細胞の継代ではウイルス生産の増大は起こらなかった。
【００９０】
ｐＦｌｃ−ΔＰＴでトランスフェクトした細胞の初回継代の間、結果は他の欠失コンストラクトを用いて得られたものと同様であり、一定に小型（１０から２０個の細胞の平均）である感染巣が生じた。しかしながら、数回の追加的継代の後、免疫染色によれば、突然向上したウイルス生育が観察され、これはウイルスが適合性補償突然変異を導入していたことを示唆していた。得られたウイルスはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名した。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の推定蘇生突然変異を識別するために、このＥ２遺伝子のコンセンサス配列を決定した。明らかにこれはウイルスが導入された欠失を保持しており、Ｅ２遺伝子中に２つの突然変異を導入していたことを示していた。好都合なことに、突然変異の１つの配列クロマトグラム中の明確な二重ピークは、ＧＡＣからＡＡＣへのコドンの変化をもたらした対突然変異が最初に発生していたことを示唆していた（データ示さず）。この突然変異はＡｓｐ７７４からＡｓｎへの置換をもたらし、興味深いことにＥ２のＡドメイン中に新しいＰＮＧＳを導入していた（図１および７）。第２の変化はＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのバリン（Ｖａｌ）−８３１コドン内部の転換型突然変異（ＧＵＧからＧＧＧ）であり、これはＶａｌからグリシン（Ｇｌｙ）への置換をもたらした。
【００９１】
適応突然変異もまた他の構造タンパク質をコードする遺伝子中に存在する可能性を考慮し、Ｃ、ＥＲＮＳおよびＥ１遺伝子のコンセンサス配列も決定した。Ｃ遺伝子およびＥＲＮＳ遺伝子の配列分析によれば後者において僅か１つのサイレントな突然変異が明らかになった（Ｕ１５４９→Ｃ）。興味深いことに、Ｅ１遺伝子において、２２７５位における対突然変異（Ａ２２７５→Ｕ）が検出され、これはアスパラギン酸（Ａｓｐ）とのグルタミン酸（Ｇｌｕ）−６３４の置換をもたらしている（表２）。
【００９２】
ｖＦｌｃ３４およびｖＦｌｃ−ΔＰと相対比較した場合のｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のインビトロの生育特性を多段階生育曲線により可視化する（図３）。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスはｖＦｌｃ３４よりも幾分緩徐に生育したが、同一の最終力価が得られる。
【００９３】
ウイルス生産型プラスミドｐＦｌｃ−ΔＰＴの実験的進化。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の配列分析から得られた結果により、ＥＲＮＳにおけるサイレントな突然変異、Ｅ１におけるアミノ酸置換およびＥ２における２置換が適合性回復の原因であることが本発明者らに示唆される。この仮説を試験するために、ｐＦｌｃ−ΔＰＴによる１０独立トランスフェクションを実施し、構造タンパク質をコードする遺伝子を配列決定した。トランスフェクトされた細胞を反復継代し、ウイルスの存在をｍＡｂ ＷＢ１０３を用いながらＩＰＭＡによりモニタリングした。僅か２から３継代の後、陽性細胞の数は明確に増大し、ウイルスが適合性補償突然変異を導入したことが示唆された。１１継代の後、ウイルスのゲノムをｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に関して記載した通り分析した。この実験の結果を表２に総括する。Ａｓｐ７７４→Ａｓｎ置換をもたらした突然変異は１０進化ウイルス中６つにおいて観察され、平行進化を明らかに示していた。しかしながら、これらのウイルスの１つにおいて、Ａｓｐ７７４→Ｇｌｕ置換をもたらした突然変異が観察され、３つの残余のウイルスにおいては、アミノ酸７７４のコドンに突然変異は観察されなかった。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１におけるＶａｌ８３１→Ｇｌｙの原因となった突然変異が１つのウイルスで検出された（即ちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ８、表２）。
【００９４】
興味深いことに、１５４９位のサイレントな突然変異は全てのウイルスにおいて観察された。この結果は天然の選択はＲＮＡレベルでも作動していること、および、追加的な適応突然変異はこの実験では分析しなかったゲノムの領域で観察される可能性があることを示している。しかしながら、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のゲノムにおいて検出された４つの突然変異のうち３つがここでもまた現在の実験においてウイルスの進化の間に導入されたことを観察したことは印象的であった。注目すべきは、ウイルスｖＦｌｃ−ΔＰＴａ５においては、第５の位置における突然変異が検出された。ＥＲＮＳ遺伝子におけるサイレントな突然変異およびＥ２におけるＡｓｐ７７４→Ａｓｎ置換の他に、このウイルスはＥＲＮＳ遺伝子のＡｌａ４４５コドンにおける対突然変異（ＧＣＡからＡＣＡ）を導入しており、これによりＡｌａ４４５のＴｈｒとの置換がもたらされた（表２）。
【００９５】
ｖＦｌｃ−ΔＰおよびｖＦｌｃ−Ｎ１に対する抗体応答の分析。Ａドメイン特異的抗体がインビトロでｖＦｌｃ−ΔＰおよびｖＦｌｃ−Ｎ１を認識する能力が無いことは、本発明者らがＡドメインの抗原性構造を修飾することに成功したことを示している。しかしながら、ＤＩＶＡワクチンとして適しているためには、インビボで誘導された抗体応答は、予防接種動物から感染動物を血清学的に区別することが可能となるために十分鈍化されなければならない。ワクチン候補は最終的にはブタにおけるこれらのＤＩＶＡ特性および保護効力に関して試験されることになるが、現作業においては、本発明者らは２つの主要な理由から、体液性免疫応答の分析のためにウサギを使用することを好適とした。第１に本発明者らは研究中のワクチンウイルスがインビボで増殖し得感染を行えるかどうかを調べたいと考えた。ブタにおいて、Ｃ株ウイルスの接種はいかなる臨床症状も誘導しないのに対し、ウサギにおける接種は一時的な発熱疾患を誘導する。従って、ウサギを使用することにより増殖性感染を確認できるようになり、更に、選択された候補の毒性における潜在的相違を研究できるようになり、これによりインビボのウイルスの適合性に関する考え方が与えられる（ｄｅ Ｓｍｉｔら、２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ １８：２３５１−８）。ウサギを使用することの第２の利点は、Ｃ株ウイルスを血液から単離できることであり、これはブタを使用する場合には成功しない場合が多い。インビボ複製後のワクチンウイルスの単離は、導入された遺伝子修飾が安定に維持されているかどうかを調べることを可能にした。ウサギ４匹の群にｖＦｌｃ−ΔＰまたはｖＦｌｃ−Ｎ１を接種した。対照動物にはｖＦｌｃ３４か培養基のいずれかを接種した。馴化期間中、ウサギの平均体温は正常であった（３９．２℃、ＳＤ±０．２８、ｎ＝６８）。発熱は４０．１℃超の体温として定義した。発熱はまず、ｖＦｌｃ３４（４０．７℃、ＳＤ±０．４８、ｎ＝４）およびｖＦｌｃ−Ｎ１（４０．５℃、ＳＤ±０．３２、ｎ＝４）を接種した群において、両方とも接種後２日に観察された。ｖＦｌｃ−ΔＰを接種したウサギにおける上昇した体温（４０．０℃、ＳＤ±０．１３、ｎ＝４）は接種後３日に観察された。
【００９６】
ウイルスはｖＦｌｃ３４を接種したウサギ４匹中３匹、ｖＦｌｃ−Ｎ１を接種したウサギ４匹中３匹、およびｖＦｌｃ−ΔＰを接種したウサギ４匹中２匹のＰＢＬから単離された。コンセンサス配列はこれらのウイルスのＥ２遺伝子はウサギにおける継代では改変されなかったことを示していた。Ｃ株突然変異体が感染動物と予防接種動物の間の区別を可能とするかどうかを調べるために、ウサギの抗血清をＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）により分析した。このＥＬＩＳＡはＥ２のＡドメインに対する抗体を特異的に検出する。効果的な免疫化のための比較対照として、ＣＨＥＫＩＴ ＣＳＦ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
【００９７】
ｖＦｌｃ３４、ｖＦｌｃ−Ｎ１およびｖＦｌｃ−ΔＰにより誘導したＥＲＮＳ応答は同程度であった（図５）。Ｃｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ ＥＬＩＳＡによるｖＦｌｃ３４およびｖＦｌｃ−Ｎ１により誘導されたＡドメイン特異的Ｅ２応答の比較によれば、ｖＦｌｃ−Ｎ１中に存在する修飾はこの応答に対して僅かな作用のみ有していたことが明らかになった。これとは対照的に、ｖＦｌｃ−ΔＰのＥ２応答をｖＦｌｃ３４のものと比較すると、Ｐｒｏ８３３の欠失はＡドメインに対する抗体応答において定量的なシフトを実際にもたらしていたことがわかる（図５）。Ａドメイン特異的抗体応答に対するｖＦｌｃ−Ｎ１の新たに導入されたＮ連結グリコシル化部位の作用が期待はずれであったことを考慮し、本発明者らはウサギにおけるｖＦｌｃ−Ｎ２の抗原性特性の研究は行わなかったが、その代わりその後の実験に関しては欠失突然変異体に着目した。
【００９８】
ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に対する抗体応答の分析。第２の動物実験において、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に対する抗体応答をｖＦｌｃ３４に対して誘導されたものと比較した。接種前のウサギの平均体温は正常であった（３９．２℃、ＳＤ±０．３７、ｎ＝２８）。この実験においては、ｖＦｌｃ３４を接種したウサギ２匹中１匹のみが接種後２日に発熱した（４０．３℃）。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種したウサギ１匹（ウサギ２．１）は体温上昇を示さなかった。これとは対照的に、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種された残余２匹では発熱が観察された（ウサギ２．２および２．３）。これらの動物中１匹において、接種５日後に体温４０．６℃となり、もう１匹においては体温は接種後７日に４０．４℃であった。ｖＦｌｃ−ΔＰは発熱を誘導しなかったという事実を考慮すれば、この所見は極めて意外であった。しかしながら留意すべき重要な点として、接種後短時間において、ウサギ２．２および２．３は格闘状態となり、創傷を被っていた。これらの創傷は皮膚感染を誘発していること、および、この感染の兆候は発熱と同時に起こったという事実を鑑みれば、発熱はウイルス接種の結果であるよりはむしろ皮膚感染症に起因したと推定することは妥当であると考えられる。接種４日後、ウイルスをｖＦｌｃ３４を接種した両方の動物から単離した。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種した３匹のウサギのＰＢＬからはウイルスは単離されず、これは本ウイルスの弱毒化に関連すると考えられる。
【００９９】
ｖＦｌｃ３４を接種したウサギ２匹（動物１．１および１．２；図６、左パネル）の血清は、第１の実験で得られたものに匹敵するＥＲＮＳおよびＥ２ ＥＬＩＳＡにおける結果を示した。Ｅ２ ＥＬＩＳＡにより測定したブロッキングのパーセンテージはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにより検出されたものよりも高値であった。これとは対照的に、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種したウサギ２．１由来の血清の分析は、Ｅ２ ＥＬＩＳＡにおけるブロッキングのパーセンテージがＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにおいて検出されたものよりも低値であることを示していた。この結果は、ｖＦｌｃ−ΔＰを用いた場合に得られた結果と合致しており（図５）、共にＡドメイン特異的抗体応答の特異的な鈍化を示している。しかしながら意外にも、動物２．２および２．３由来の血清の分析はこの結果を確認するものではなかった。これらの動物は明らかに高レベルのＡドメイン特異的Ｅ２抗体を発生させていた。動物２．１で得られた結果およびｖＦｌｃ−ΔＰで得られたより早期の結果を考慮すると、この所見は極めて意外であった。動物２．２および２．３におけるＡドメイン特異的抗体の誘導は、恐らくは、通常は優性未満であるＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ以外のＡドメインのエピトープに向けてのＡドメイン特異的抗体応答の再焦点調整により説明できる。
【０１００】
抗体応答をより十分に分析するために、本発明者らはＣＳＦＶ株ブレシアのＥ２タンパク質から誘導した予め構築された１５アミノ酸長のオーバーラップペプチドを用いながら、ＰＥＰＳＣＡＮ分析を行った。この分析によれば、野生型Ｃ株を接種した動物から第３６日に得られた血清はＣＳＦＶ株ブレシアの２つのエピトープを認識したことがわかった（図６、右パネル）。予測した通り、これらのエピトープの第１のものは８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープであった。特に、残基８３１ＶＳＰＴＴＬＲ８３７は最も重要であると考えられた（図６Ｂ、上パネル）。第２のエピトープはアミノ酸７５４ＹＬＡＳＬＨＫＤＡＰＴ７６４を含んでいた。興味深いことに、最初に認識されるこのエピトープは以前に定義されたＡドメイン（即ちアミノ酸７６６から８６６；図７）の外部に位置する。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を接種したウサギから得られた血清のいずれも、上記したエピトープのいずれをも認識しなかった。８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープの認識が欠如していること（図６Ｂ；下パネル）はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１中に導入された突然変異により説明できるが、７５４ＹＬＡＳＬＨＫＤＡＰＴ７６４エピトープの認識が欠如していることは、より驚くべきことであった。この所見はある様式における７５４ＹＬＡＳＬＨＫＤＡＰＴ７６４エピトープは８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープと相互作用すること、およびこれらのエピトープはネイティブのＥ２構造中で近接して位置していることを示唆している（図７）。ＰＥＰＳＣＡＮ分析はウサギ２．２および２．３の抗血清により認識されるＡドメインのエピトープを明らかにしなかったが、これらの血清のいずれもＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを認識しなかったことは確かに示していた。これより、本発明者らはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１はＴＡＶＳＰＴＴＬＲに基づいたペプチドＥＬＩＳＡを伴う場合にはＤＩＶＡ基準を満足すると結論できる。
【０１０１】
考察
過去２０年間において、Ｅ２またはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡのいずれかを伴う必要がある数種の実験的ＤＩＶＡワクチンが開発された。文献によれば、両方の診断試験が現場でのＣＳＦの検出に適していると報告されている場合が多い。これは原則的には正しいが、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡはＥ２ ＥＬＩＳＡよりも２つの主要な難点を有することに留意することが重要である。第１に、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡは感染動物群の検出に関して信頼性を有するが、これらのＥＬＩＳＡは個体動物を診断するには感度が不十分であることが以前よりわかっている。第２に、より重要な点として、Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡはＣＳＦ特異的ではない（２００３／２６５／ＥＣ）。ＳＡＮＣＯ／１０８０９／２００３。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ−Ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｕｍｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）。結果として、ＢＶＤＶおよび／またはＢＤＶウイルスが循環する領域におけるＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡの使用は推奨されない。
【０１０２】
本作業の目的はＥ２ ＥＬＩＳＡに匹敵するＣ株系ＤＩＶＡワクチンを構築することであった。本発明者らはこれらのＥＬＩＳＡの優性な標的であるＡドメインのＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中に適正な突然変異を導入することによりこれを達成することを目標とした。２つの手順の１つ目において、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部のＰｒｏ（即ちＰｒｏ８３３）残基をＡｓｎと置換し、これによりＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部にＰＮＧＳを導入した。Ｎ連結グリカンは体液性免疫系から免疫原性ドメインを遮蔽するこれらの能力に関して周知であるが、これらは炭水化物鎖の構造的柔軟性に起因する２つの特徴となっている機能的に重要なドメインにおいて、またはこの近傍において十分な忍容性を顕著に示し得る。本発明者らはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部に係留された新たに導入されたＮ連結グリカンを安定に維持しているｖＦｌｃ−Ｎ１と命名されたＣ株突然変異体の生産を良好に行えたが、この修飾はＡドメイン特異的抗体応答には僅かな作用しか有さないと考えられる。この理由により、本発明者らはこの手順を継続しないことを選択した。代替の手順において、本発明者らはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープからアミノ酸を欠失させることによりＡドメインの抗原性構造を改変することを目標とした。中央部のＰｒｏ残基（即ちＰｒｏ８３３）の欠失は、導入された欠失を安定に維持していたｖＦｌｃ−ΔＰと命名されたウイルスをもたらしたが、ウイルスは最終的には適応突然変異を獲得し、Ｓｅｒ７８９からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）への置換をもたらした。本発明者らはこの非保存的置換を興味深いものとみなしたが、その理由は、Ｓｅｒ７８９は全てのＣ株ウイルスおよび関連のウサギ化されたＣＳＦＶ株中に存在するのに対し、Ｐｈｅ７８９は強毒性ＣＳＦＶ株中で完全に保存されており、ペスチウイルス遺伝子の他のメンバー中でむしろ高度に保存されているからである（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：３３７−４８）。Ｃ株ウイルスの歴史は十分解明されていないが、ウイルスは数百回ウサギにおいて継代することにより弱毒化されたことは明白である（ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００３．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７−８４）。従って、Ｓｅｒ７８９はウサギにおけるＣ株の複製のために好都合であると仮説を立てることができる。この推定が正しければ、Ｃ株がインビトロのブタ細胞上の成育時にＰｈｅ７８９に復帰しない理由は興味深いものである。これはＷｒｉｇｈｔの適合性ランドスケープの概念により説明できる（Ｗｒｉｇｈｔ，１９３１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：９７−１５９）。この概念に従えば、好都合な突然変異は、野生型のＣ株ウイルスに関して同様に適用される通り適合性ピークの最上領域において遺伝子型が存在する場合に緩徐に発生するのに対し、これらはｖＦｌｃ−ΔＰの場合と同様に適合性のピークのより低いレベルにおいて遺伝子型が存在する場合にはより迅速に発生する。
【０１０３】
ｖＦｌｃ−ΔＰを接種したウサギから得られた血清の分析によれば、Ｐｒｏ８３３の欠失はＡドメインの免疫原性をかなり鈍化させるために既に十分であることが明らかになった。この結果は本発明者らの手順の原則の証拠を明らかにしているが、これは同様に、得られるウイルスをＤＩＶＡワクチンとして適しているものとするためにはＡドメインの抗原性構造はより広範に修飾される必要があったことをも明らかにしている。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープからの２から４アミノ酸の欠失（ΔＳＰ、ΔＰＴ、ΔＳＰＴ、ΔＶＳＰ、ΔＡＶＳＰ）を有するＣ株突然変異体をコードするプラスミドは感染性のウイルスを生産したが、これらは高度に無力化されており、持続的生育が不可能であった。しかしながらｖＦｌｃ−ΔＰＴを含有する細胞の数継代の後、適合性の顕著な増大が観察された。救済されたウイルスはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名された。本発明者らはＥ２遺伝子における適応突然変異が適合性回復を担っている可能性が高いと考えた。実際、２つの適応突然変異がＥ２遺伝子において検出された（図１）。第１の突然変異はＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのＶａｌ残基のＧｌｙとの置換をもたらした。導入された欠失に近接する適応突然変異が期待されたが、第２の突然変異は線状のＥ２配列中でＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対して遠位に位置していることがわかった。更に興味深いことに、この第２の突然変異（Ａｓｐ７７４→Ａｓｎ）はＡドメイン中にＰＮＧＳを導入していた。
【０１０４】
逆方向遺伝学により同様のウイルス（即ちｖＦｌｃ−Ｎ１；図１および図７）を構築した直後のＡドメイン中にＰＮＧＳを有するＣ株突然変異体（即ちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１、図１および図７）の救済は、顕著な偶然であるように見える。しかしながら、本発明者らが研究を開始しようと思うに至った以前の所見を再考すれば、本発明者らの所見は偶然ではないことが示唆される。本発明者らの作業は中和ｍＡｂの存在下にウイルスを生育させることにより選択されたＣＳＦＶ突然変異体の表現型により思い立ったものである（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：３９３４−４２）。ブレシア株のこのＭＡＲ（モノクローナル抗体耐性）突然変異体、即ちｖＰＫ２６．２と命名されたものは、Ａドメインの抗原性構造に影響したＥ２における２つのアミノ酸置換、即ち、Ｐｒｏ８３３→Ｌｅｕ（ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ内部）およびＴｈｒ８５８→Ａｓｎ（２４）を有していた。他のＭＡＲ突然変異体の分析ではＰｒｏ８３３→Ｌｅｕの置換は中和回避の原因であり、更に、第２のＡドメイン特異的ｍＡｂの結合を妨害していたことが明らかになった。しかしながら、Ｌｅｕ８３３のみを含有するＭＡＲ突然変異体はなお２つの他のＡドメイン特異的ｍＡｂにより認識されているが、Ｌｅｕ８３３およびＡｓｎ８５８の両方を含有するＭＡＲ突然変異体ｖＰＫ２６．２は本発明者らのＡドメイン特異的ｍＡｂのいずれによっても検出されなかった。Ａｓｎ８５８がＡドメインの抗原性構造に明らかに影響していたことを考慮して、本発明者らは８５８位は何らかの様式において、ネイティブのＥ２構造中のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープと相互作用するか、これと近接しているという仮説を立てた。更に興味深いことに、Ｔｈｒ８５８→Ａｓｎ置換はＡドメインに新しいＰＮＧＳを導入している（図７）。この部位におけるグリコシル化は以前には注目されていなかったが、Ｅ２の抗原性構造に対するこの突然変異の作用はＮ連結グリカンによるＡドメインの遮蔽により説明できると考えられる。ｖＰＫ２６．２の表現型は、本発明者らに、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部Ｐｒｏを欠失させる作用を調べることのみならず、Ｎ連結グリカンによりＡドメインを遮蔽することの実現可能性を研究することを惹起した。本発明者らは、ウイルスｖＦｌｃ−Ｎ１をもたらしたＰｒｏ８３３のＡｓｎとの置換が構造的に重要なＰｒｏ８３３残基を除去し、同時に新しいＰＮＧＳをＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ中に導入することは、好都合であることを発見した。この修飾はＡｓｎによるＰｒｏ８３３の置き換えとみなすことができるが、Ｐｒｏ８３３を欠いたウイルス中のＡｓｎ残基の挿入ともみなすことができることが重要である。これは意味論の問題とも考えられるが、ｖＰＫ２６．２の表現型並びにｖＦｌｃ−Ｎ１の遺伝子的安定性および適合性を説明できる全く新しい展望を開くものである。これらのウイルスの驚くべき共通の特徴は、これらが共にＰｒｏ８３３を欠き、共に新しいＰＮＧＳをＡドメインに含有することである。この点から推察されることは、８３３位および８５８位は実際にはネイティブＥ２構造中同様の位置に所在していること、および、これらの位置のいずれかにおけるＡｓｎ部分は、直接、または炭水化物部分に対する係留部位としてのこの機能により、Ｐｒｏ８３３の欠失または置換により損なわれた適合性の浪費を補償することができることである（図７）。
【０１０５】
再度ウイルスｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１に関し、興味深い点は、７７４位においてｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１中に新たに導入されたＰＮＧＳはまた、ネイティブＥ２構造中ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに近接して位置することである。即ち、このウイルスにおけるＡｓｐ７７４→Ａｓｎの置換はアミノ酸７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８を含む最近同定されたエピトープの中央に位置する（Ｐｅｎｇら、２００８．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １３５：２６７−７２）。８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープと同様、７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８エピトープはＡ１ドメインを定義する３つの特徴全て、即ちＣＳＦＶ特異的であり、進化的に保存されており、中和抗体のための標的であること、を共有している。上記および本発明者らの実験所見に基づいて、本発明者らは、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲおよびＬＦＤＧＴＮＰエピトープはＥ２のネイティブの構造中で共局在化しており、恐らくは一緒になってＡ１ドメインを形成しているという仮説を立てる。
【０１０６】
総括すれば、本発明者らはＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの中央部Ｐｒｏ残基の突然変異はＥ２タンパク質における３つの可能な位置の１つに位置するＮ連結グリカンにより補償されることができること、および、これらの位置はネイティブのＥ２構造に近接して位置することを仮説として唱える。第１のものは８２９ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ８３７エピトープそのものの内部に位置し、第２のものは７７２ＬＦＤＧＴＮＰ７７８エピトープの内部に位置し、第３のドメインはアミノ酸配列８５８ＴＴＴ８６０を含む（図７）。恐らくは、後者のアミノ酸はＡドメイン中に位置する未確認のエピトープの部分でもある。これらの仮説を立証するための実験が進行中である。
【０１０７】
Ｅ２遺伝子の適応突然変異が適合性の回復において重要な役割を果たしていると推定することは妥当と思われるが、本発明者らは構造タンパク質をコードする他の遺伝子における突然変異も役割を果たしていることが合理的であると考える。従って、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１のＣ、ＥＲＮＳおよびＥ１遺伝子も配列決定した。ゲノムのこの部分の配列決定は実際に２つの追加的な突然変異を明らかにした。第１のものはＥ１遺伝子において検出された。この突然変異は完全に保存されたＧｌｕ６３４残基のＡｓｐとの置換をもたらした。Ｅ２タンパク質がＥ１タンパク質とのジスルフィド結合ヘテロ２量体に組み立てられることが知られている（Ｔｈｉｅｌら、１９９１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：４７０５−１２）ことを考慮すれば、この突然変異はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の適合性回復に寄与していることが察知される。Ｃ遺伝子中には突然変異は検出されなかったが、単一のサイレントな突然変異がＥＲＮＳ遺伝子において検出された。野生型ＣＳＦＶのコンセンサス配列が例外的に安定であり、インビトロまたはインビボの継代により実質的に全く突然変異を蓄積しないこと（Ｖａｎｄｅｒｈａｌｌｅｎら、１９９９．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４４：１６６９−７７）を念頭に置けば、コンセンサス配列決定によるこのようなサイレントな突然変異の検出は、自然選択がＲＮＡレベルでも作動しており、それによりゲノムの他の領域における同義突然変異もまたｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の適合性回復に寄与していたことを明らかにしている。
【０１０８】
適合性回復の分子経路を理解するために、進化実験を実施した。この実験はＥＲＮＳ遺伝子におけるサイレントな突然変異、Ｖａｌ８３１→Ｇｌｙ置換をもたらす突然変異、および７７４位において新しいＰＮＧＳを導入する突然変異の平行進化を明らかにした（表２）。適合性回復の分子機序を十分解明するためには追加的な検討が必要であることは明白であるが、本所見はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の適合性回復には上記した突然変異が実際に関与しているという見解を裏付けるものである。これらの突然変異がＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープにおけるより大きい欠失を有する突然変異の適合性を回復できることは十分可能である。
【０１０９】
進化実験において検討したウイルスの１つ（即ちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ５）において、Ａｌａ４４５からＴｈｒへの置換をもたらした突然変異がＥＲＮＳ遺伝子において検出されたことは重要なことである（表２）。以前に記載したｖＦｌｃ−ΔＰの進化において観察されたＳｅｒ７８９からＰｈｅへの置換と同様、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ５において改変されたアミノ酸、この場合はＡｌａ４４５は、ＣＳＦＶの野生種系統内で保存されているアミノ酸、この場合はＴｈｒ４４５に変化している。これは本作業の範囲を超えているが、この所見もまた、ＣＳＦＶの弱毒化はこの分子進化に関して価値ある見識を与えることができることを示している。
【０１１０】
Ｖａｎ Ｒｉｊｎらにより実施されたＭＡＲ突然変異体を用いた以前の研究は、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのＰｒｏ８３３およびＴｈｒ８３４はＡドメインの保存されたエピトープの一体性のために極めて重要であることを示唆していた（ｖａｎ Ｒｉｊｎら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：３９３４−４２）。これら両方のアミノ酸を欠いており、更にＶａｌ８３１→Ｇｌｙの置換を含有する十分生育しているＣ株突然変異体の生産が良好に行えたことは、このウイルスのＡドメインの抗原性構造が劇的に変化したことを示唆していた。従って本発明者らは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１により誘導された免疫応答はＣｅｄｉｔｅｓｔ ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡを用いて野生型ＣＳＦＶにより誘導されたものとは区別可能であることを期待した。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１が実際にＡドメイン特異的抗体を誘導することにおいて極めて強力であり得ることは意外であった。この所見の可能な説明としては、他の面では免疫優性であるＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの破断が通常では優性未満であるＡドメインのエピトープに対する抗体応答の再焦点調整をもたらすことが考えられる。これらのエピトープを同定する試みにおいて、抗血清をＰＥＰＳＣＡＮ分析により分析した。この分析は新しく認識されたエピトープを明らかにしなかったが、抗血清のいずれもＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含有するペプチドを認識しなかったことを確かに示していた。興味深いことに、このことは、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに基づくＥＬＩＳＡをＤＩＶＡ試験として使用することによりｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ワクチンウイルスを併用できることを示唆している。
【０１１１】
総括すれば、現作業は、強制的ウイルス進化はＣＳＦウイルスを遺伝子的に修飾するための強力なツールとなり得ることを明らかにしている。ここにおいて、本方法は野生型ＣＳＦＶから血清学的に区別できる遺伝子的に安定なＣ株突然変異体を生産するために良好に使用できた。
【実施例２】
【０１１２】
材料および方法
Ｃ株欠失突然変異体ウイルスｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を実施例１に記載した通り作成した。ＳＫ６−Ｔ７細胞はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するブタ腎細胞とする（ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐら、１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ １９（４−５），４４７−５９）。これらの細胞をグルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｒｅｄａ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）およびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＫ１０００培地中で生育させた。ウイルス保存液はＳＫ６．Ｔ７細胞上で力価検定し、５０％組織培養物感染用量（ＴＣＩＤ５０）として報告する。
【０１１３】
ペスチウイルスに対する抗生物質を含有しない１３匹のコンベンショナルブタを５匹２群と３匹１群に分割した。第１群のブタ（３１６６から３１７０番）には２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０５ＴＣＩＤ５０の組み換えＣ株ウイルスｖＦｌｃ３４を含有する培養基１ｍｌと共に筋肉内の経路で第０日に１回予防接種した（実施例１参照）。第２群のブタ（３１７１から３１７５群）にはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ワクチンを同じプロトコルで予防接種した。第３群のブタ（３１７６から３１７８番）には２％ＦＢＳを含有する培養基を１回接種した。
【０１１４】
第２８日に、第１、２および３群のブタを、鼻内投与によりＣＳＦＶ株ブレシアの５０％致死用量の２００倍を含有する１ｍｌ（各鼻腔に０．５ｍｌ）で攻撃した。全ブタの疾患を毎日観察し、これらの体温の測定は−第３日から開始した。臨床症状の重症度は１０ＣＳＦ特異的基準の予め定義されたリストを用いて採点した（Ｍｉｔｔｅｌｈｏｌｚｅｒら、２０００．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７４（４）２９３−３０８）。
【０１１５】
血清試料は全ブタから毎週調製した。ＥＤＴＡ試料および口腔咽頭液は、攻撃日（第２８日）およびその後は第３０、３２、３５、３７、３９、４２、４４、４６、４９、５２および５６日に、第１、２および３群の全ブタから採集した。ＥＤＴＡ試料を用いて白血球および血小板の数を測定した。この分析はＭｅｄｏｎｉｃ ＣＡ ６２０コールターカウンター（Ｂｏｕｌｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＢ）を用いて実施した。コンベンショナルに飼育されたブタにおいては、白血球および血小板の血中濃度はそれぞれ１１×１０９から２３×１０９、および３２０×１０９から７２０×１０９／リットルの範囲である。その結果、白血球減少症は＜８×１０９個／ｌ血液および血小板減少症は＜２００×１０９血小板／ｌ血液として定義した。
【０１１６】
末梢血白血球（ＰＢＬ）または咽喉スワブを用いたウイルス単離および定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＲＴ−ＰＣＲ）を本質的には文献記載の通り実施した（Ｗｅｅｓｅｎｄｏｒｐら、２００９．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３５（３−４），２２２−３０）。
【０１１７】
血清試料は市販のＥ２ ＥＬＩＳＡ（ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＣＳＦＶ Ａｂ２．０Ｅ２ ＥＬＩＳＡ、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および市販のＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（Ｃｈｅｋｉｔ ＣＳＦ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ、ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｏｆｄｄｏｒｐ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いながら製造元の説明書に従って分析した。
【０１１８】
結果
本発明者らは高度に強毒性のブレシア株を用いた致死的攻撃に対するｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスの保護効力をこの親ウイルスｖＦｌｃ３４と比較した。ブタ５匹の２群をｖＦｌｃ３４（第１群）またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１（第２群）のいずれかで第０日に予防接種した。３匹よりなる対照群（第３群）には細胞培養基のみを接種した。第１、２および３群のブタは、第２８日に高度に強毒性のブレシア株で攻撃した。
【０１１９】
対照群のブタは全て、高熱（図８Ｃ）、白血球減少症（図９Ａ）および血小板減少症（図９Ｂ）を含むＣＳＦの典型的臨床兆候を発症した。ウイルスは攻撃後第４日にはブタ３匹のうちの２匹、および第７および９日にはブタ全３匹のＰＢＬから単離した。ウイルスは攻撃後第７日に２匹の咽喉スワブから、および攻撃後第９日には１匹から単離した。この群に属するブタは瀕死状態で発見され、感染後９日（ブタ３１７８番）または１０日（ブタ３１７６番および３１７７番）に安楽死させた。
【０１２０】
組み換えＣ株ワクチン（即ちｖＦｌｃ３４）を予防接種したブタのいずれも、攻撃後臨床兆候を発症しなかった（図８Ａ）が、１匹のブタ（３１６８番）が１日発熱し、もう１匹の別のブタ（３１６６番）は少なくとも１日血小板減少症を呈した（図９Ｂ）。ＰＢＬまたは咽喉スワブからはウイルスは単離されなかった。
【０１２１】
ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種した全ブタは３から６日間発熱し、そして攻撃後に軽度の臨床兆候を呈した（図８Ｂ）が、全ブタが完全に回復した。攻撃後第２日に１匹のブタ（ブタ番号３１７５）のＰＢＬからウイルスが単離された。これから、本発明者らは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を用いた単回予防接種は高度に強毒性なブレシア株を用いた致死的攻撃に対する保護を与えると結論付けた。
【０１２２】
全血清を抗Ｅ２および抗ＥＲＮＳ抗体の存在について、それぞれＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＣＳＦＶ Ａｂ２．０ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）およびＣｈｅｋｉｔ ＣＳＦ Ｅｒｎｓ ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いながら分析した。ｖＦｌｃ３４を予防接種したブタは全て感染後２１日にＥ２ ＥＬＩＳＡにおいて陽性であった（図１０Ａ）が、これらのブタは感染後３５日にはＥｒｎｓ ＥＬＩＳＡにおいても陽性であった（図１０Ｂ）。ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種したブタはいずれも、攻撃前のＥ２ ＥＬＩＳＡで陽性ではなかった（図１０Ａ）。攻撃後７日以内に、全てのブタがＥ２ ＥＬＩＳＡで陽性となった（図１０Ａ）。興味深いことは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種したブタ２匹（即ちブタ３１７１番および３１７２番）はｖＦｌｃ３４を予防接種したものよりもはるかに早期にＥＲＮＳ抗体へのセロコンバージョンを示した（図１０Ｂ）。
【０１２３】
即ち、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１を予防接種したブタは全て、攻撃まではＰｒｉｏＣＨＥＣＫ Ｅ２ ＥＬＩＳＡのカットオフ未満を維持し、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１がブタにおいてもＤＩＶＡワクチンとして使用できることを示していたと結論できる。
【０１２４】
結論として、本発明者らは、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１の単回予防接種が全予防接種ブタにおいて高度に強毒性の攻撃に対抗して保護をもたらしたことを明らかにしており、ウイルス出芽は殆ど、または全く無いという証拠が提示されている。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、親ＣＳＦＶポリタンパク質の８２９位から８３７位に相当するＥ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）。
【請求項２】
前記欠失が前記「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおけるプロリンの欠失を含む、請求項１の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項３】
前記欠失が少なくとも２つのアミノ酸を含む、請求項１または請求項２の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項４】
親ゲノムの少なくとも１つの更なる改変を含む、請求項１から３のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項５】
少なくとも１つの更なる改変がサイレントな突然変異である、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項６】
サイレントな突然変異がＥＲＮＳ遺伝子内の１５４９位におけるＵからＣへの改変である、請求項５に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項７】
少なくとも１つの更なる改変がＥ２タンパク質中のＮ連結グリコシル化部位を形成する、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項８】
前記少なくとも１つの更なる改変がＥ２タンパク質中の７７４位におけるアスパラギン酸（Ｄ）の置換である、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項９】
前記少なくとも１つの更なる改変が８３１におけるグリシン（Ｇ）、および／または７８９位におけるフェニルアラニン（Ｆ）、および／または４４５位におけるスレオニン（Ｔ）をもたらす、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１０】
１５４９位におけるＵからＣへの改変、６３４位におけるアスパラギン酸（Ｄ）、Ｅ２タンパク質中の７７４位におけるアスパラギン（Ｎ）、および８３１位におけるグリシン’（Ｇ）を更に含む、Ｅ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインのそれぞれ８３３および８３４位におけるプロリンおよびスレオニンの欠失を含む、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１１】
親ゲノムが弱毒化されたＣＳＦＶ株のゲノムである、請求項１から１０のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１２】
親ゲノムがＣ（チャイニーズ）株のゲノムである、請求項１から１１のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶを含む生ＣＳＦワクチン。
【請求項１４】
ＣＳＦに対抗して動物を保護する方法であって、有効量の請求項１３のワクチンを前記動物に投与することを含む方法。
【請求項１５】
血清学的試験において動物の血清を分析することを含む、非感染動物から、または請求項１３のＣＳＦワクチンを予防接種した動物から、ＣＳＦＶに感染した動物を区別する方法。
【請求項１６】
前記血清学的試験がペプチド系ＥＬＩＳＡである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むＥ２タンパク質をコードする組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムを含むｃＤＮＡ分子。
【請求項１８】
感染動物を予防接種動物から区別できるようにするワクチン中で使用できる感染性組み換えＣＳＦＶを単離するための方法であって、方法が：
前記ウイルスによりコードされるタンパク質の免疫優性ドメインを選択する工程；
前記免疫優性ドメインをコードする前記ウイルスのゲノム領域中に改変を導入する工程；
改変されたゲノムを適した細胞または細胞系統に接触させる工程；
適した細胞または細胞系統を継代することによりウイルスの増殖を可能にする工程；および、
感染性ウイルスを前記適した細胞または細胞系統から単離する工程；
を含む方法。
【請求項１９】
ゲノム領域中の前記改変が少なくとも１つのアミノ酸の欠失である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１８から１９のいずれかの方法により得られる感染性組み換えＣＳＦＶ。
【請求項２１】
ワクチン中の請求項２０に記載の感染性組み換えＣＳＦＶの使用。
【請求項２２】
ワクチンが、未感染または予防接種動物から感染動物を区別できるようにする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
未損傷のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を特異的に認識する１つ以上の抗体を含むペプチド系ＥＬＩＳＡ。
【請求項１】
組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）であって、親ＣＳＦＶポリタンパク質の８２９位から８３７位に相当するＥ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）。
【請求項２】
前記欠失が前記「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインにおけるプロリンの欠失を含む、請求項１の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項３】
前記欠失が少なくとも２つのアミノ酸を含む、請求項１または請求項２の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項４】
親ゲノムの少なくとも１つの更なる改変を含む、請求項１から３のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項５】
少なくとも１つの更なる改変がサイレントな突然変異である、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項６】
サイレントな突然変異がＥＲＮＳ遺伝子内の１５４９位におけるＵからＣへの改変である、請求項５に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項７】
少なくとも１つの更なる改変がＥ２タンパク質中のＮ連結グリコシル化部位を形成する、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項８】
前記少なくとも１つの更なる改変がＥ２タンパク質中の７７４位におけるアスパラギン酸（Ｄ）の置換である、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項９】
前記少なくとも１つの更なる改変が８３１におけるグリシン（Ｇ）、および／または７８９位におけるフェニルアラニン（Ｆ）、および／または４４５位におけるスレオニン（Ｔ）をもたらす、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１０】
１５４９位におけるＵからＣへの改変、６３４位におけるアスパラギン酸（Ｄ）、Ｅ２タンパク質中の７７４位におけるアスパラギン（Ｎ）、および８３１位におけるグリシン’（Ｇ）を更に含む、Ｅ２タンパク質の「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメインのそれぞれ８３３および８３４位におけるプロリンおよびスレオニンの欠失を含む、請求項４に記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１１】
親ゲノムが弱毒化されたＣＳＦＶ株のゲノムである、請求項１から１０のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１２】
親ゲノムがＣ（チャイニーズ）株のゲノムである、請求項１から１１のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶ。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の組み換えＣＳＦＶを含む生ＣＳＦワクチン。
【請求項１４】
ＣＳＦに対抗して動物を保護する方法であって、有効量の請求項１３のワクチンを前記動物に投与することを含む方法。
【請求項１５】
血清学的試験において動物の血清を分析することを含む、非感染動物から、または請求項１３のＣＳＦワクチンを予防接種した動物から、ＣＳＦＶに感染した動物を区別する方法。
【請求項１６】
前記血清学的試験がペプチド系ＥＬＩＳＡである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むＥ２タンパク質をコードする組み換えブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムを含むｃＤＮＡ分子。
【請求項１８】
感染動物を予防接種動物から区別できるようにするワクチン中で使用できる感染性組み換えＣＳＦＶを単離するための方法であって、方法が：
前記ウイルスによりコードされるタンパク質の免疫優性ドメインを選択する工程；
前記免疫優性ドメインをコードする前記ウイルスのゲノム領域中に改変を導入する工程；
改変されたゲノムを適した細胞または細胞系統に接触させる工程；
適した細胞または細胞系統を継代することによりウイルスの増殖を可能にする工程；および、
感染性ウイルスを前記適した細胞または細胞系統から単離する工程；
を含む方法。
【請求項１９】
ゲノム領域中の前記改変が少なくとも１つのアミノ酸の欠失である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１８から１９のいずれかの方法により得られる感染性組み換えＣＳＦＶ。
【請求項２１】
ワクチン中の請求項２０に記載の感染性組み換えＣＳＦＶの使用。
【請求項２２】
ワクチンが、未感染または予防接種動物から感染動物を区別できるようにする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
未損傷のＴＡＶＳＰＴＴＬＲドメインを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を特異的に認識する１つ以上の抗体を含むペプチド系ＥＬＩＳＡ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５１３２１２（Ｐ２０１２−５１３２１２Ａ）
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３４５３（Ｐ２０１１−５４３４５３）
【出願日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５０８０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７４５７５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５０８０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７４５７５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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