修飾ＤＮＡを切断するための組成物、方法および関連する使用
修飾ＤＮＡの切断に関連する組成物、方法および関連する使用が提供される。例えば、大型ＤＮＡの酵素による切断によって得ることができる、少なくとも５０％が類似のサイズであり、中心に位置する修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡ断片セットが記載されている。さらに、ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離である部位でＤＮＡを切断する１種以上の酵素を含む酵素調製物が提供される。１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする。関連する使用には、メチロームの創出、修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を精製するための方法および診断適用が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
メチルトランスフェラーゼと関連するＤＮＡ切断酵素は、原核生物のゲノム中に広く存在する。ＤＮＡ切断酵素は、通常、規定の部位でＤＮＡを切断することにより、侵入するＤＮＡ（例えば、バクテリオファージ）から宿主細胞を防御する制限エンドヌクレアーゼ、該制限エンドヌクレアーゼ部位内の特定の塩基をメチル化することによって宿主ＤＮＡが分解されるのを防ぐＤＮＡメチルトランスフェラーゼからなる（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５巻：Ｄ２６９−２７０（２００７年））。そのため、これらの制限エンドヌクレアーゼは、メチル化感受性と呼ばれる。
【０００２】
原核生物およびファージＤＮＡ内の修飾塩基は、ゲノムを制限エンドヌクレアーゼによる切断から防御する上である役割を果たし、メチル化シトシン（ｍ５Ｃ）は、哺乳動物ゲノムの遺伝子発現に関与する。メチル化ＤＮＡを同定するための技法は、厄介であり、再現可能なやり方で実施することが実験上困難である。２つの手法が一般的に用いられる。１つは、シトシンメチル化への感受性が異なるＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩなどの制限酵素の使用を含む。例えば、ＨｐａＩＩエンドヌクレアーゼは、ＣＣＧＧ認識部位内の２つのシトシンのいずれかをメチル化することによって遮断されるが、そのアイソシゾマーであるＭｓｐＩは、外側のＣがメチル化されているときにだけ遮断される。ＭｓｐＩは、内側のシトシンが修飾されているとき、ＤＮＡを切断する。第２の方法は、非メチル化シトシン残基の亜硫酸水素塩修飾、その後の選択的増幅および残りのＤＮＡの配列決定を含む。この方法では、メチル化シトシンは治療に抵抗性である。この方法は、最適化することが容易でなく、複雑な化学修飾ステップ、およびその後の複雑なプライマーセットを用いた増幅を用いる。この方法は、より単純な代替手法がない場合に広く用いられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５巻：Ｄ２６９−２７０（２００７年）
【発明の概要】
【０００４】
本発明の実施形態において、大型のＤＮＡの酵素的切断によって得られる二重鎖オリゴヌクレオチド断片セットが提供され、大型ＤＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、哺乳動物細胞に由来し得、より具体的にはヒト細胞に由来し得る。セット中の断片の少なくとも５０％は、好ましくは類似のサイズになるものとし、好ましくは、中心的に位置する修飾ヌクレオチドを含むものとする。１つ以上の断片は、セットから単離することができる。大型ＤＮＡは、少なくとも長さ１００ヌクレオチドとなり得；修飾ヌクレオチドは、例えば、メチル化シトシンまたはヒドロキシメチル化シトシンなどの修飾シトシンとなり得、修飾シトシンは、ＣｐＧまたはＣＮＧを形成するためにグアニンに近接し得る。しかし、修飾シトシンは、代替的に、他のシトシン、アデニンまたはチミジンに近接して位置し得る。セット中のオリゴヌクレオチド断片は、好ましくは６０ヌクレオチド長未満、例えば、２８−３６ヌクレオチドになり得；および／または修飾ヌクレオチド、具体的にはシトシンは、断片のどちらかの末端から３０ヌクレオチド以内に位置し得る。
【０００５】
本発明の一実施形態において、各酵素が修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離である位置でＤＮＡを切断することができるように、ＤＮＡ内の修飾ヌクレオチドを認識する１種以上の酵素を特徴とする酵素調製物が提供される。より具体的には、切断部位と修飾ヌクレオチドとの非ランダムな距離は、上記のタイプの断片セットを生成するように、その酵素に特徴的なものであり得る。１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメイン、より具体的には、ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ（Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２ＬＸ１０−２０ＰＸ３Ｆとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする。
【０００６】
本発明の一実施形態において、酵素調製物中の１種以上の酵素は、単一のオープンリーディングフレーム内の認識ドメインおよび切断ドメインによってさらに定義される。切断ドメインは、ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有し得る。さらに、酵素の少なくとも１種は、配列番号７−２２として同定された配列のいずれかとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有し得る。さらに、酵素の１種以上は、タンパク質親和性タグまたは他のタグに共有結合もしくは非共有結合により連結するまたは融合し得る。適当な親和性タグの例には、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、抗体およびＨｉｓタグが含まれる。さらに、１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤを含むアミノ酸配列に結合特異性を有する抗体によって認識することができる。さらに、調製物は、アクチベーターＤＮＡを含むことができる。
【０００７】
本発明の一実施形態において、各酵素が修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離である部位で、より具体的には、切断部位と修飾ヌクレオチドとの距離が酵素に特徴的であり、それによって、断片セットを生成する部位で二重鎖ＤＮＡを切断することができるような、ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識する１種以上の酵素を含む酵素調製物が提供される。ＤＮＡが、二重鎖の各ストランド上でほぼ反対の位置に修飾ヌクレオチドを含む場合、断片セットは、類似のサイズとなり得るまたは半修飾ＤＮＡについては様々なサイズとなり得る。１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とすることができる。
【０００８】
本発明の一実施形態において、上記の酵素のＮ末端ドメインを認識しそれに結合することのできる抗体が提供される。
【０００９】
本発明の一実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡを上記組成物で切断するステップおよびオリゴヌクレオチド断片セットを得るステップを含む方法が提供される。この方法は、このオリゴヌクレオチド断片セットを非切断ＤＮＡから分離するステップをさらに含むことができ、少なくとも１つの断片内に含まれる１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を決定するために、分離した断片セットから少なくとも１つの断片を配列決定するステップをさらに含むことができる。この方法は、配列決定または他の手段による大型ＤＮＡ中の１つ以上の修飾ヌクレオチドの存在および位置についてオリゴヌクレオチド断片の一部またはすべてを分析するステップおよびゲノムもしくはメチロームマップ上で配列を位置づけて修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップを含むことができる。
【００１０】
本発明の一実施形態において、配列番号７−２２およびそれらの変異形からなる群から選択される配列を用いて配列データベースを検索するステップおよびＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤのコンセンサス配列を特徴とするＮ末端領域を有する追加の配列を同定するステップを含む方法は、上記などの酵素を同定するために提供される。この方法は、ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫのコンセンサス配列、より具体的にはＦＥ（Ｘ）２Ａ（Ｘ）１５−１８ Ｔ／ＳＸ４ＤＧＧＸＤＸ２Ｇ／ＬＸ１５−２０Ｅ／ＱＡＫのコンセンサス配列を有する触媒ドメインを含むＣ末端を同定するさらなるステップを含むことができる。
【００１１】
本発明の一実施形態において、方法は、ＤＮＡ断片の混合物から単離するために提供され、これらのＤＮＡ断片は１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、混合物は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡの酵素切断から生じる。この方法は、混合物に、修飾ヌクレオチドを含むこれらの断片を選択的に結合することができる固定化されたもしくは標識された親和性結合分子を加えることを含むことができる。あるいは、修飾ヌクレオチドを含むこれらの断片は、修飾ヌクレオチドを含まないこれらの断片からサイズ分離することができる。親和性結合分子の例は、上記の酵素調製物であり、酵素調製物の１種以上の酵素は、酵素切断活性を欠如するために突然変異されており、突然変異させた酵素は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を結合するために固体表面上で固定化される。親和性結合分子の他の例には、抗体、不活性化Ｔ４グルコシルトランスフェラーゼおよびＤＮＭＴ１などの細胞タンパク質のメチル結合ドメインが含まれる。これらの分子は、例えば、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメインまたはビオチン分子のいずれかに融合することができ、その上、適当なカラムに結合することができる。
【００１２】
本発明の他の実施形態では、方法は、修飾ヌクレオチドのあるパターンから得られた細胞調製物または組織サンプル中の現在もしくは将来の表現型特性を同定するために提供される。この方法には、上記の酵素調製物の手段によって細胞調製物もしくは組織から得られた大型ＤＮＡを断片に切断するステップ；および現在または将来の表現型特性を決定するために、断片内の修飾ヌクレオチドのための位置を対照ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチドのあるパターンと比較するステップが含まれる。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、上記方法は、修飾ヌクレオチドを結合することができる親和性結合分子と切断断片を接触させるステップ、または電気泳動によるもしくはサイズ分離を実施することのできる当技術分野で公知の他の手段によるステップをさらに含む。結合部分は、前述した通り酵素調製物を含むことができ、酵素切断活性は、従来の手段によって不活性化されている。したがって、修飾ヌクレオチドを有する断片は、修飾ヌクレオチドを欠如する断片から分離することができる。上記方法は、メチロームまたはゲノム上で固定化された切断断片内の１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を同定するステップをさらに含むことができる。位置は、分離した断片を配列決定することによって決定することができる。
【００１４】
本発明の他の実施形態では、方法は、大型ＤＮＡ中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定するために提供される。この方法には、上記の酵素調製物で大型ＤＮＡを切断するステップ；少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド切断セット生成物を得るステップ；および例えば、そのオリゴヌクレオチド切断セット生成物を配列決定することにより大型ＤＮＡの配列中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップが含まれる。そのセット中の配列決定するためのオリゴヌクレオチド断片の数は、このセットがクローン化ＤＮＡに由来する、または断片のサブセットを配列決定するために十分となり得る繰り返しに由来するか否かに依存し得る、またはセットが、このセット中のほぼすべての断片を配列決定することが望ましいこともあるユニーク配列を含むことが予測されるか否かに依存し得る。
【００１５】
本発明の一実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む精製された断片の調製物を得るために、１つ以上の断片が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片の混合物を、ＤＮＡ断片に共有結合的にもしくは非共有結合的に結合することのできる固定化された親和性結合タンパク質と接触するステップを含む方法が提供される。親和性結合タンパク質の例は、上記の酵素調製物中の突然変異させた酵素であり、酵素切断活性は不活性化している。この方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の断片を、結合タンパク質に結合するステップ；および１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片の精製された調製を得るステップをさらに含むことができる。
【００１６】
本発明の一実施形態において、使用説明書と共に容器内の上記酵素調製物を含む、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド断片を精製するためのキットが提供される。キットはアクチベーター分子をさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＭｓｐＪＩ ＲＭ系を示す図であり、ＭｓｐＪＩ ＲＭ系をコード化するマイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＪＬＳのゲノム分節を示す図である。オープンリーディングフレームのＮＣＢＩアノテーションは、Ｍｊｌｓ０８２１、推定上のヘリカーゼ；Ｍｊｌｓ０８２２（ＭｓｐＪＩ）、制限エンドヌクレアーゼ；Ｍｊｌｓ０８２３（Ｖ．ＭｓｐＪＩＰ）、ＤＮＡミスマッチエンドヌクレアーゼｖｓｒ；Ｍｊｌｓ０８２４（Ｍ．ＭｓｐＪＩ）、ＤＮＡシトシンメチルトランスフェラーゼである。
【図１Ｂ】ＭｓｐＪＩ ＲＭ系を示す図であり、ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーの模式的なドメイン構造を示す図である。Ｎ末端ドメインは、本明細書において残りのＣ末端ドメインのタンパク質配列上流の約５０％として定義される。
【図１Ｃ】Ｎ末端ドメインにおける保存されたモチーフを示す図である。
【図１Ｄ】Ｃ末端ドメインにおける保存されたモチーフを示す図である。
【図２Ａ】ＭｓｐＪＩに対する修飾依存性酵素活性を示す図である。 レーン１、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）ＤＮＡ１μｇのみ； レーン２、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ； レーン３、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ＋ＢｓｔＮＩ１０単位； レーン４、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）１μｇ＋ＢｓｔＮＩ１０単位のみ； レーン５、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）ＤＮＡ１μｇのみ；および レーン６、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ。 すべての反応は、３７℃で１時間温置し、１％アガロースゲル上で分離した。レーン３および４は、ＭｓｐＪＩがＢｓｔＮＩによって切断されない部位を全く切断しないことを示す。したがって、ＣｍＣ Ａ／Ｔ ＧＧにおいてメチル化されるこの基質上で、修飾Ｄｃｍ部位だけが、ＭｓｐＪＩによって切断される。すべてのＤｃｍ部位は、Ｄｃｍメチル化に感受性でないＢｓｔＮＩによって切断される。
【図２Ｂ】他の部位でメチル化されたｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）のＭｓｐＪＩ消化を示す図である。すべての反応は、５０μｌ容積中で３７℃で２時間行われ、１％アガロースゲルで分離した。ＭｓｐＪＩ０．８μｇはすべての反応に用いられた。 レーン１、Ｍ．ＭｓｐＩ（ＣｍＣＧＧ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ； レーン２、Ｍ．ＨａｅＩＩＩ（ＧＧｍＣＣ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ； レーン３、Ｍ．ＨｐａＩＩ（ＣｍＣＧＧ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ； レーン４、Ｍ．ＨｈａＩ（ＧｍＣＧＣ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ；および レーン５、Ｍ．ＡｌｕＩ（ＡＧｍＣＴ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ。
【図２Ｃ】ヒドロキシメチルシトシン−含有ＤＮＡにおけるＭｓｐＪＩ消化を示す図である。すべての反応は、５０μｌ容積中で３７℃で１時間行われた。 レーン１、グルコシル化ヒドロキシメチルシトシンを有するＴ４野性型（ｗｔ）ＤＮＡ１μｇ； レーン２、ヒドロキシメチルシトシンを有するＴ４ ｇｔＤＮＡ１μｇ； レーン３、Ｔ４ ｗｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｃｒＢＣ１０単位； レーン４、Ｔ４ ｇｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｃｒＢＣ１０単位； レーン５、Ｔ４ ｗｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｓｐＩ２０単位； レーン６、Ｔ４ ｇｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｓｐＩ２０単位； レーン７、Ｔ４ ｗｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ； レーン８から１１まで、１．６μｇで開始する２−倍連続希釈したＭｓｐＪＩを有するＴ４ ｇｔＤＮＡ １μｇ（レーン８）。
【図２Ｄ】異なる量のＤＮＡアクチベーターのｏｎＭｓｐＪＩ活性に対する効果を示す図である。レーン１から５まで、各反応は、ｐＢＲ３２２ １μｇ（０．３５ｐｍｏｌ）およびＭｓｐＪＩ １．６ｐｍｏｌを含む。レーン１−４は、メチル化されたＣＣＷＧＧ部位を含むＤＮＡアクチベーターの滴定（４０、２０、１０、５ｐｍｏｌ）を示す。レーン５は、ＤＮＡアクチベーターを含まないＭｓｐＪＩを用いたｐＢＲ３２２−消化を示す。レーン６は、ＢｓｔＮＩ（ＣＣＷＧＧ）を用いたｐＢＲ３２２−消化を示す。
【図３】完全にメチル化されたＤＮＡに対するＭｓｐＪＩの切断活性の概略図である。二重鎖切断はメチル化部位のどちらかの側で起こり得る。切断は、認識されたメチル化塩基の３’側においてである。この図において、上部ストランドメチル化シトシンが認識されるとき、ＭｓｐＪＩは右側で切断し；底部ストランドメチル化シトシンが認識されるとき、ＭｓｐＪＩは左側で切断する。切断部位から認識されたメチル化シトシンまでの距離は固定される。例えば、上部ストランドメチル化シトシンが認識されるとき、底部ストランドニッキング部位は、そこから１６ヌクレオチド離れており、上部ストランドニッキング部位は、そこから１２ヌクレオチド離れている。
【図４Ａ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、合成二重鎖オリゴヌクレオチドＴＧＧＴＡＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧ（配列番号１）中の予測した酵素切断部位（指定されたＲｔ、Ｒｂ、Ｌｔ、Ｌｂ）を示す図である。上部ストランドの３’末端または底部ストランドの５’末端は、４Ｂに示した通り、ＦＡＭで標識される。
【図４Ｂ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質におけるＭｓｐＪＩ−消化を示す図である。 レーン１、非メチル化、標識された上部ストランド； レーン２、非メチル化、標識された底部ストランド； レーン３、上部および底部メチル化、標識された上部ストランド； レーン４、メチル化された上部および底部ストランド、標識された底部ストランド；８ｎｔおよび７ｎｔのサイズで切断された生成物は、底部ストランド中でゆらぎ切断を示唆している； レーン５、メチル化された上部ストランド、標識された上部ストランド； レーン６、メチル化された上部ストランド、標識された底部ストランド；レーン４のように、８ｎｔおよび７ｎｔのサイズで切断された生成物は、底部ストランド中でゆらぎ切断を示唆している； レーン７、メチル化された底部ストランド、標識された上部ストランド；および レーン８、メチル化された底部ストランド、標識された底部ストランド。 対照として、マーカーは、ゲルの右側で移動する。
【図４Ｃ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、ＣｐＧを有するオリゴヌクレオチド配列および中心位置でＣｐＧを有する断片を生成する酵素による切断部位を示す図である。
【図４Ｄ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、アクチベーターＤＮＡが存在するまたは存在しない場合におけるＭｓｐＪＩを用いた図４Ｃに示されるオリゴヌクレオチドの消化を示す図である。反応は１０μｌ中で３７℃で１時間行われた。各反応において、オリゴヌクレオチドは、１ｐｍｏｌであり、ＭｓｐＪＩは０．４μｇである。アクチベーターとの反応において、原液（１５μＭ）１μｌを１０μｌ反応に加えた。反応５μｌは取り出され、異なる時点で停止させ、２０％未変性のポリアクリルアミドゲルで分離した。 レーン１、ＤＮＡのみ； レーン２、３０分におけるアクチベーターのない消化反応； レーン３、３０分におけるアクチベーターとの消化反応； レーン４、１．５時間におけるアクチベーターのない消化反応；および レーン５、１．５時間におけるアクチベーターとの消化反応。
【図５】異なるｍ５Ｃメチル化された部位におけるＭｓｐＪＩ切断部位位置の配列分析を示す図である。ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（ｄｃｍ−）は、様々なメチルトランスフェラーゼを用いてメチル化された。メチルトランスフェラーゼは、欄見出しの「メチラーゼ」の下に示される。ランオフ配列決定パターンは「配列決定クロマトグラムの例」の欄の下に示される（配列番号２−６）。推定された切断パターンは、「ＭｓｐＪＩ切断部位」の欄に示す。
【図６Ａ】大型ＤＮＡが新規な酵素ファミリーのメンバーで切断されるとき、得られたオリゴヌクレオチドセットの代表的な断片である、中心に位置する修飾シトシンを有する二重鎖ＤＮＡを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ａで示されるオリゴヌクレオチド断片セットが干渉性バンドとして現れる、ポリアクリルアミドゲルにおけるヒトゲノムＤＮＡのＤＮＡサンプルを示す図である。３２ｂｐバンドは、ゲノムから得られたメチル化されたＣｐＧ部位を含む短い断片のプールを表す。このプールは、精製することができ、メチローム分析に関する次世代配列決定プラットフォームに直接入れることできる。
【図６Ｃ】ＭｓｐＪＩファミリー中の様々なメンバー酵素によって生成された切断生成物の比較を示す図である。第１のレーンは、ＤＮＡマーカーを含む。その後のすべてのレーンは、異なるＭｓｐＪＩファミリーメンバー酵素をそれぞれ有する、ＣｐＧ−メチル化ＨｅｌａゲノムＤＮＡの消化を含む。レーン１−３および５は、長さ約３２ヌクレオチド（矢印）に対応するバンドを示す。レーン４において、ＲｌａＩは、ＣＣＷＧＧを認識し、中心に位置する修飾シトシンを提供するために認識部位のどちらかの側で切断する。しかし、この配列は、ＨｅｌａゲノムＤＮＡ中で見出されない。 レーン１は、ＭｓｐＪＩから得られた切断生成物を示す； レーン２は、Ｆｒａｎｋｉａ５３３６から得られた切断生成物を示す； レーン３は、Ｌｐｇ１２３４から得られた切断生成物を示す； レーン４は、ＲｌａＩから得られた切断生成物を示す； レーン５は、ＡｓｐＢＨＩから得られた切断生成物を示す； レーン６は、ＤＮＡのみを示す。
【図７−１】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−２】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−３】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−４】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−５】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−６】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−７】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−８】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図８−１】３つの生物における異なる長さのＣＧ−中心配列のバイオインフォマティクス分析を示す図である。ＣＧ部位の総数は、ヒト、マウスおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ゲノムの各生物について列挙される。欄は、異なる（配列が異なる）ＣＧ−中心配列の数、ユニークである（単一のコピーに発生する）数、ユニークであるかかる全ＣＧ−中心配列の画分およびユニーク（単一のコピー）である異なるＣＧ−中心配列の画分を報告している。
【図８−２】３つの生物における異なる長さのＣＧ−中心配列のバイオインフォマティクス分析を示す図である。ＣＧ部位の総数は、ヒト、マウスおよびアラビドプシスゲノムの各生物について列挙される。欄は、異なる（配列が異なる）ＣＧ−中心配列の数、ユニークである（単一のコピーに発生する）数、ユニークであるかかる全ＣＧ−中心配列の画分およびユニーク（単一のコピー）である異なるＣＧ−中心配列の画分を報告している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施形態の詳細な記述
ファミリーのメンバーが二重鎖ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチドを認識し、次いで、修飾ヌクレオチドから下流（３’方向）の非ランダムな距離で切断される場合、修飾特異的ＤＮＡ切断酵素の新規なファミリーが見出された。これらの酵素の独特な特性の１つは、これらが修飾ヌクレオチドを含む短いＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡを含む大型ＤＮＡから直接放出できることである。修飾ヌクレオチドが各ストランドに対して反対の位置に存在するとき、これらの酵素は、ＤＮＡ中で両ストランドにおいて二重鎖切断をもたらすことができる。ＤＮＡが片側のストランドのみに修飾ヌクレオチドを含むとき、二重鎖切断は、修飾ヌクレオチドの片側で起こる。したがって、大型ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチドの位置は、切断生成物をクローン化することによっておよび／または配列決定することによって推論することができる。超高処理の配列決定プラットフォームを用いて、信頼できる迅速な方式でメチル化シトシンまたはヒドロキシル−メチル化シトシンなどの修飾ヌクレオチドを同定し位置づけることが可能である。
【００１９】
「修飾」ヌクレオチドは、５−ヒドロキシメチル基または５−メチル基などの余分な化学基を含む任意のヌクレオチドを意味するものとする。例えば、「修飾」シトシンは、哺乳動物ゲノムにおいてＣｐＧおよび植物ゲノムにおいてＣＮＧとして生じ、一般に、対称性のため、同じ位置で両方のストランドでメチル化することが可能である。ヒドロキシメチルシトシンは、ヒトＤＮＡの構成物として認識されている（Ｔａｈｉｌｉａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４巻（５９２９号）：９３０−５頁（２００９年）；Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４巻（５９２９号）：９２９−３０頁（２００９年））。
【００２０】
「大型ＤＮＡ」は、ゲノムのサイズまでの１００ヌクレオチドを超えるサイズを有する、任意の天然に存在するもしくは合成ＤＮＡを意味するものとする。
【００２１】
オリゴヌクレオチド断片「セット」に関連する「類似のサイズ」は、長さ約±５ヌクレオチド以下で変わる断片を意味するものとする。しかし、異なる断片「セット」は、５−５０ヌクレオチドの範囲のサイズを有してもよい。
【００２２】
「中心に位置する」は、二重鎖の断片の同じストランドにおいてほぼ中心である片側のストランド上で修飾ヌクレオチドの位置に対応するものとする。この位置は、一般に、断片のどちらかの末端からヌクレオチドをカウントすることによって決定された中心の５ヌクレオチド以内である。
【００２３】
「Ｎ末端ドメイン」は、タンパク質のアミノ酸配列の約５０％まで伸長する領域を意味する。本発明の一実施形態において、Ｎ末端ドメイン内の保存された領域は、ＳＥＱ ＩＤ：ＮＯ：２２（ＭｓｐＪＩ）の８１から２２４アミノ酸に対応し、Ｃ末端ドメイン内の保存された領域は、タンパク質（配列番号２２（ＭｓｐＪＩ））のＣ末端の３００アミノ酸に対応する。
【００２４】
大型二重鎖ＤＮＡの切断によって得られた類似のサイズの「オリゴヌクレオチド断片セット」は、修飾ヌクレオチドが、第２の相補的なストランド上の他の修飾ヌクレオチドとほぼ反対の、片側のストランドに位置するとき、修飾ヌクレオチドの両側で大型ＤＮＡの切断から生じる断片を意味する。
【００２５】
「酵素調製物」は、試薬を意味し、インビボでその天然状態で発生するものではないことを意味するものとする。
【００２６】
複数の大型ＤＮＡ（例えば、染色体）からなるゲノムが切断される場合、各大型ＤＮＡは、類似のサイズのオリゴヌクレオチド断片セットを生じる。全ヒトゲノムの切断から得られた断片の混合物は、各セットが染色体に由来する、複数のオリゴヌクレオチド断片セットとして、または状況に依存する単一の断片セットとしてみなすことができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドセットは、異なるＤＮＡ配列を有する少なくとも６つのオリゴヌクレオチド断片を含む。例えば、オリゴヌクレオチドセットは、異なる配列を有する少なくとも１０のオリゴヌクレオチドまたは異なる配列を有する少なくとも２０のオリゴヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、クローン化二重鎖ＤＮＡは、両方のストランド上にあるＣｐＧにおける一部位で、例えば、シトシンの修飾部分で標的ヌクレオチドで酵素により修飾することができる。この例では、ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメンバーによる二重鎖切断は、修飾シトシンの両側で非ランダムな距離で起こる。オリゴヌクレオチドセットは、中心に位置する修飾ヌクレオチドを有する同様のサイズの断片からなる。
【００２７】
ファミリー中の酵素が微生物中で判明したものに限られるものではないが、酵素の新たに記載されたＭｓｐＪＩファミリーのメンバーは、微生物起源から同定されている。ＢＬＡＳＴ検索によって、本明細書で定義するファミリー中のタンパク質をコード化するすべての生物起源から得られたゲノムを含むＤＮＡデータベース中で同定された配列の数は、比較的小さいことが示されている。１６の相同体が、図１Ｃ、１Ｄおよび７−１から７−７に示されており、この配列同一性％および相同性（類似性）％は、表２に示される。
【００２８】
修飾ヌクレオチドを認識し修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離でＤＮＡを切断することのできる酵素は、Ｎ末端ドメイン中で配列モチーフを共有することが判明している。これらの酵素は、非ランダムサイズの断片を産生するために修飾ヌクレオチドの両側でＤＮＡを独自に切断することができることが判明している。真核細胞ゲノム中のシトシンの５位の修飾部分（ｍ５Ｃ）は、遺伝子発現の調節に最も一般的に関連する。本発明の実施形態は、ＣｐＧ部位の修飾シトシン、すなわち環外のＮ４位のシトシン（ｍＮ４Ｃ）、またはアデニンなどのシトシン以外の修飾ヌクレオチド、例えば、環外のＮ６位のアデニン（ｍＮ６Ａ）を認識することのできる酵素を包含することができ、かかる酵素は修飾認識配列のどちらか一方の側で切断する。
【００２９】
保存された配列ドメインおよびある種の機能的特徴により本明細書で定義された酵素のファミリーには、誘導体酵素または認識および／または触媒ドメインの外側または内側に配列修飾部分を有する変異体が含まれる。さらに、組換え型誘導体酵素または酵素変異体は、標識、タグまたはマーカーとして使用する第２のタンパク質に融合することができるファミリー（米国特許第５，６４３，７５８号）またはセレノシスチン置換によって行われるなどの標識として働く置換を含むことができるファミリー（特許第７，１４１，３６６号を参照のこと）中に含まれる。酵素の上記ファミリーの他に、Ｎ末端ドメインがメチル化ＤＮＡまたはヒドロキシメチル化ＤＮＡ結合ドメインとして働くような、触媒ドメインが修飾されるまたは存在しない誘導体酵素および酵素変異体が考えられる。
【００３０】
オリゴヌクレオチド断片セットを生成するための酵素のＭｓｐＪＩファミリーの使用は、単一の酵素を利用することができる以上の酵素を含むことができ、酵素のいくつかまたはすべては、ＭｓｐＪＩファミリーのメンバーであるまたはＭｓｐＪＩファミリーのメンバーに由来する。
【００３１】
新たに定義されたファミリーのメンバーは、化学修飾または突然変異の前に、以下に列挙する特徴の１つ以上によって構造的に定義することができる。
【００３２】
（ａ）ヘテロマーでない；
（ｂ）単一のオープンリーディングフレーム中の認識および切断機能；
（ｃ）コード配列およびタンパク質配列がメチルトランスフェラーゼモチーフを含まない；
（ｄ）ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤであるＮ末端ドメイン中の保存されたモチーフとの少なくとも９０％の配列相同性；および
（ｅ）保存されたモチーフを包含する共通の第２の構造要素。
【００３３】
図１Ｂおよび図７−１から７−７は、触媒コアを構築する第２の構造要素の全体的な順番が、ヘリックス（Ｈ１）−ヘリックス（Ｈ２）−シート（Ｓ１）−シート（Ｓ２）−シート（Ｓ３）−ヘリックス（Ｈ３）−シート（Ｓ４）−ヘリックス（Ｈ４）である、酵素ファミリーの一実施形態を示す（例えば、ｈ＝ヘリックスであり、一連のｅがβ−プリーツシートを表す、図７−１から７−７を参照のこと。）。保存されたＦＥは、α−ヘリックスＨ２中にあり；第１の保存されたアスパラギン酸（Ｄ）は、２つのβシートＳ１およびＳ２間のヒンジ領域にあり；第２の保存されたアスパラギン酸は、βシートＳ２中にあり；保存された（Ｑ／Ｅ）ＸＫは、βシートＳ３中にある。
【００３４】
ファミリーのメンバーは、配列番号７−２２から選択される配列または関連する配列を用いてＢＬＡＳＴ検索によって同定することができる。次いで、これらの該当項目から、Ｎ末端ドメイン中の上記で指定されたコンセンサス配列をさらに検索し、必要に応じてコンセンサス配列ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫのＣ末端ドメインにおける少なくとも９０％配列相同性または同一性もまた検索する。必要に応じて、Ｎ末端ドメイン中の保存された配列は、ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ （Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２Ｌ Ｘ１０−２０ＰＸ３Ｆとの９０％を超える配列相同性および／またはＦＥ（Ｘ）２Ａ（Ｘ）１５−１８ Ｔ／ＳＸ４ＤＧＧＸＤＸ２Ｇ／ＬＸ１５−２０Ｅ／ＱＡＫとの９０％を超える配列相同性に伸張拡張することができる。
【００３５】
次いで、選択される配列は、当技術分野で公知の技法によって、例えばインビトロ転写−翻訳（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）によってまたは＃ＥＲ２６５５（ＮＥＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ、＃Ｃ２５２３、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）などの修飾された塩基を欠如する微生物宿主にクローン化することによって発現することができ、定義されたサイズのオリゴヌクレオチド断片を生成するための修飾ヌクレオチドを含むおよび／または中心に位置する修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡの切断についてアッセイすることができる。
【００３６】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成するための標準的な技法を用いて酵素（ＭｓｐＪＩ酵素ファミリー）の新たに定義されたファミリーのメンバーに産生することができる。これらの抗体もしくは断片は、修飾された大型ＤＮＡに結合したＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメンバーのインサイツ標識化のために用いることができる。酵素は、切断機能が不活性化されるまたは除去されるように突然変異し得る。この場合、次いで、断片は、抗体結合することのできる親和性マトリックスに結合することによって分離することができる。
【００３７】
機能上、ＭｓｐＪＩは、メチラーゼ遺伝子配列に隣接する、データベース中でＤＮＡ配列として同定され、そのため、エンドヌクレアーゼ遺伝子と名付けられた。しかし、ＭｓｐＪＩがタンパク質として発現したとき、制限エンドヌクレアーゼ活性を決定するための標準的なアッセイを用いて不活性であることが判明した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤｃｍ＋株から得られたＤＮＡで温置したとき、酵素は活性であり、エシェリキア・コリのＤｅｍ−株から得られたＤＮＡについて試験したとき、不活性であったという本明細書に記載されている思いがけない発見がなければ、これにより、普通なら、さらなる試験を終了しているはずである。酵素がヒトゲノムＤＮＡなどの修飾シトシンを含むことが知られている真核細胞のＤＮＡで温置されたとき、高分子量ＤＮＡのスメアは、約３２塩基対のサイズに対応する断片を含む明らかに可視のバンドと共に、ポリアクリルアミドゲル上で観察された（図６Ｂを参照のこと）。
【００３８】
関連する酵素のファミリーは同定され（図７−１から７−７）、これらの酵素の代表的な例によるＤＮＡ切断は、ヒトゲノムＤＮＡで試験された。試験された酵素は、図６Ｃにおけるゲル上で観察することができるように、約３２ヌクレオチドの同様のサイズのオリゴヌクレオチド断片セットを生成した。
【００３９】
本明細書に記載されている酵素の新たに定義されたファミリーは、切断がＤＮＡ上の酵素認識部位の下流の実質的に固定された距離で行われる、５位でヌクレオチド残留物修飾を認識するおよびオリゴヌクレオチド断片セットを生成するこれらの能力を含むために特に興味深い（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを参照のこと）。本発明の実施形態において、修飾部位からの切断距離は、以下の規定に従う。
【００４０】
（１）回帰性ｍ５ＣｐＧを有する二重鎖ＤＮＡまたは両方のストランドにおいて極めて接近した他の修飾ヌクレオチドの場合、二重鎖切断は、類似のサイズの断片を生成するために、修飾ヌクレオチドのそれぞれの側で行うことができる。一実施形態では、修飾ＣｐＧを有する片側のストランド上の切断部位間の距離は、１２塩基となることが判明し、ｍ５Ｃから反対側のストランド上の切断部位への距離は、４塩基オーバーハングを含めて１６塩基（ＭｓｐＪＩ）となり、その結果、長さ３２塩基のオリゴヌクレオチド断片になることが判明した。
【００４１】
（２）半修飾二重鎖ＤＮＡの場合、二重鎖切断は、修飾ヌクレオチドから３’下流である位置で行われる。同じストランド上の切断部位から修飾ヌクレオチドまでの距離は、一定である（例えば、ＭｓｐＪＩの場合、距離は１２塩基であり、もう一方の側のストランド上の切断部位からの修飾ヌクレオチドまでの距離は、１６塩基である。）。ＤＮＡ中の半修飾の部位は、ＭｍｅＩ様酵素（ＭｍｅＩなど、米国特許第７，１１５，４０７号を参照のこと）によって認識された部位を含むオリゴヌクレオチドを、修飾ヌクレオチドから１６ヌクレオチドの部位における片側の部位で切断された半修飾ＤＮＡに連結することによって検出することができる。オリゴヌクレオチドは、底部ストランドにおける４塩基伸長部へのアニーリングを可能にするため、ＭｍｅＩ部位オリゴヌクレオチドの５’末端で４つの変性ヌクレオチドを含むことができる。あるいは、４塩基伸長部における単一のストランド領域が標準的な分子生物学技法を用いて満たされるように、平滑末端のオリゴヌクレオチドは用いられ得る。ＭｍｅＩ様酵素は、ＭｓｐＪＩ切断断片が、修飾断片の約２ヌクレオチド上流である１８もしくは１９ヌクレオチド上流を切断する。この方式において生成された断片は配列決定することができ、ＤＮＡにおける半修飾ヌクレオチドの位置が決定される。
【００４２】
ヒト、マウスおよびアラビドプシスから得られたゲノム中のＣｐＧ部位の数は、バイオインフォマティクスを用いて決定されている。次いで、これらの生物のゲノムが、中心に位置するＣｐＧを含む、２４塩基から６０塩基の様々な長さの断片に切断される場合、ユニーク配列を有する断片は、サイズが増加するに従ってヒトにおいて全ユニーク配列の７１％から９１％を表し、同じ基準によってマウスにおいて８３％から９０％を表し、アラビドプシスにおいて８９％から９５％を表す。
【００４３】
異なる配列を有する定義された長さのこれらの配列が、全配列と区別され別々に分析される場合、その場合、サイズ２４−６０ヌクレオチドの断片の９６％−９８％は、ヒトゲノムの単一の遺伝子座をマッチさせる。図８−１から８−２に提供されるバイオインフォマティクス分析において、断片の長さが６０ヌクレオチドである場合、その場合、２５，５３８，４８０が異なる配列を有し、これらの９８％がゲノム中の単一の座をマッチさせる、中心に位置するＣｐＧを含む２６，１８５，４９３断片がある（図８−１から８−２を参照のこと）。
【００４４】
そのため、新たに定義されたファミリーにおける酵素によって生成されたオリゴヌクレオチド断片セットにかなりの情報価値があり、酵素は修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドからの距離でＤＮＡを切断して同様のサイズの断片を好ましくは生成する。データによって、かかる断片の大型の画分がゲノム中の単一の座を位置づける可能性が高いことが示される。これによって、最初にメチロームを創出するための単純で効率的な方法が可能である。その結果、高処理配列分析は、ゲノム中の実際の修飾ヌクレオチドのすべてが迅速におよび容易でないまでも、大部分の位置を生成することができる。
【００４５】
本発明の一実施形態において、スクリーニングアッセイは、酵素の修飾特異的切断活性を決定するために記載される（実施例１を参照のこと）。これらのアッセイは、制限するものではない。一実施形態では、選択される宿主細胞は、特異的ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドで転換された。次いで、発現されたメチルトランスフェラーゼは、特定の部位で宿主ゲノムをメチル化した。様々な定義された配列特異性を有する何百ものメチルトランスフェラーゼは、文献に記載されている（例えば、ＲＥＢＡＳＥ（登録商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡによって維持される公的に入手可能なオンラインデータベースを参照のこと）。異なるメチル化特異性を有するこれらのメチルトランスフェラーゼのいずれかは、スクリーニング目的のために用いることができる。宿主の修飾パターンに対して作用することができる修飾依存性切断活性を有する遺伝子を発現する相溶性のあるプラスミドを導入することにより、これらの転換された細胞の生存率が低減するまたはなくなり、転換プレーティング効率は低くなる。非メチル化された宿主は、メチル化−特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子との並行転換において高いプレーティング効率を示すはずである。したがって、この試験は、コードされた遺伝子産物の修飾依存性切断特性を確認する。
【００４６】
ＭｓｐＪＩファミリーにおける酵素の活性は、好ましくは、１６ｂｐ未満の長さを有し、修飾ｄｃｍ部位（例えば、ｄｃｍ（Ｃ５ｍＣＷＧＧ）部位）を含む二重鎖ＤＮＡアクチベーターの存在中で増強することができる。切断部位でホスホロチオネート結合を含む３０ｂｐ切断抵抗性ＤＮＡアクチベーターはまた、酵素反応を刺激した。
【００４７】
ＤＮＡサンプルのメチル化またはヒドロキシメチル化のレベルを決定することは、エピジェネティックな研究に重要である。ゲノムのエピジェネティックな調節は、シトシンを５−メチルシトシンに変換するためにほとんどＣｐＧ部位で、メチル基のＤＮＡへの付加によって達成することができ、おそらく、ヒドロキシメチルシトシンによってその逆で達成することができる染色質リモデリングを含む。真核細胞のゲノム中のシトシンのメチル化は、ある親の生殖系列からこの親から遺伝する染色体を標識する接合体中で持続することができる（遺伝子インプリンティング）。さらに、メチル化の大きな変化は、接合生殖後および発生する生物の組織中で起こる（Ｍｏｒｇａｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４ Ｓｐｅｃ Ｎｏ．１：Ｒ４７−５８（２００５年））。さらに、ゲノムの一部の領域でのメチル化は、環境因子に応じて変わり得る（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ ６９巻（６号）：９１５−９２６頁（１９９２年））。メチル化パターンの相違は、例えば、胚性幹細胞の、不適切な発生過程の決定的な指標となり得る（Ｂｒｕｎｎｅｒら Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９巻： １０４４−１０５６頁（２００９年））。
【００４８】
いくつかの酵素（ＤＮＭＴ１など）は、ｍ５Ｃに高親和性を有する。この酵素がＤＮＡの「半メチル化された」部分を達成する場合（メチルシトシンが２つのＤＮＡストランドのうちのただ１つに存在する場合）、酵素は、他の半分をメチル化する。
【００４９】
ＤＮＡメチル化は、繰り返し配列に起こり、転移因子の発現および可動性を抑制するのに役立つ（Ｓｌｏｔｋｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．８巻（４号）：２７２−８５頁（２００７年））。自発的な脱アミノ反応のため、５−メチルシトシンは、チミジンに変換することができ；そのため、ＣｐＧ部位は突然変異することが多く、したがって、これらが非メチル化のままであるＣｐＧアイランドにおいて以外、ゲノム中で稀になる。この状態における脱アミノ反応は、シトシンをウラシルに変換する。メチル化パターンの診断上の変化は、永続的な遺伝子突然変異の頻度の増加を検出する可能性を有する。ヒトゲノムにおけるメチル化は、治療を探索する目的のために癌細胞において研究されている（例えば、Ｇａｒｇｉｕｌｏら、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４１巻：１２７−３５頁（２００９年）；およびＧｒｏｎｂａｅｋら、Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ １０３巻：３８９−９６頁（２００８年）を参照のこと）。
【００５０】
本発明の実施形態は、マップ（メチローム）を生成するためにゲノム中の修飾ヌクレオチドを位置づける能力をかなり向上させる。ヒトメチロームは、全生物におけるおよび個別の細胞における個人間の表現型の変動に関する研究を容易にするはずであり、発生、老化および疾患に関する有用な情報をもたらすことができる。この情報から、疾患が現れる前に癌などの疾患に対する感受性を決定し、強力な診断検査および治療薬を提供する可能性を有する適当な治療を設計することが可能である。
【００５１】
新規な特性を有する酵素のファミリーを同定し新規なオリゴヌクレオチド断片を創出すると、ヒトゲノムにおいて見出される修飾された塩基の濃度を提供する１組以上のオリゴヌクレオチド断片セットの単離を可能にすることにより、ヒトメチロームの状態の記述ができるようになる。１セット（以上の）の断片の単離は、ゲル電気泳動、固相親和性結合または他の手段により容易になり得る。メチローム分析は、ゲノム中で実質的にすべてのＣｐＧジヌクレオチドをメチル化するＭ．ＳｓｓＩでゲノムを処理することを含むことができる対照を付加することによって補助することができる。（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４巻：ｅ１９（２００６年））。
【００５２】
酵素切断によって生じる１セット（以上の）オリゴヌクレオチド断片は、ＤＮＡ中の修飾シトシンヌクレオチドを同定し位置づけるためにＮｅｘｔＧｅｎ配列決定法を用いて現在利用可能である種類の高処理の配列決定方法を用いて配列決定することができる。この手法は、任意の大型ＤＮＡまたは哺乳動物ゲノムなどのゲノムのためのメチロームの生成を非常に単純化する。ゲノムの特定の領域の迅速な診断方法のための特異的なオリゴヌクレオチド切断生成物の選択は、癌などの疾患と相関した修飾シトシンの異常な存在または非存在を決定することができる。特異的なオリゴヌクレオチドは、個体のある特定の表現型を決定するために用いることができる。例えば、断片セットの定義された配列または固体表面上に示された（アレイハイブリダイゼーション）もしくは溶液中でタグを付けた（または逆もまた同様）配列のセットへのハイブリダイゼーションは、メチロームを特徴付ける断片の標準的なセットとの矛盾を明らかにすることができる。ｑＰＣＲまたはアレイハイブリダイゼーションは、存在量を目的とする１つ以上の公知の位置を調べるために用いることができる。修飾ヌクレオチドまたは結合分子は、蛍光もしくは化学発光タグまたは検出を容易にするために当技術分野で公知の他の標識方法で標識することができる。
【００５３】
ゲノム中の修飾ヌクレオチドは、不活性化された切断部位を有する新たに定義されたファミリーの突然変異酵素メンバーを用いてインサイチュで同定することができる。突然変異酵素の結合部位を可視化することによって、修飾ヌクレオチドの位置は決定することができる。
【００５４】
酵素の新たに定義されたファミリーのメンバーは、大規模な生成のために組換え型タンパク質を形成するように遺伝子工学によって作ることができる。組換え型タンパク質の精製は、酵素が追加の使用を有する親和性タグに融合するように融合タンパク質を形成することによって容易にすることができる。例えば、タグがビオチン、Ｈｉｓペプチド、キチン結合ドメインもしくはマルトース結合タンパク質ドメインまたは他の基質結合ドメインである場合、そのファミリーのメンバーは、親和性マトリックス上で、メチル結合ドメインとして作用するそれ自体を直接単離することができるまたは抗体親和性マトリックスに結合することによって単離することができるまたは親和性タグによって単離することができる。単独の、修飾されたまたはタグに融合された組換え型タンパク質は、画像処理目的のために蛍光で標識することができる。
【００５５】
酵素反応速度論が単一の代謝回転、低い代謝回転である場合または酵素が全体的に触媒活性を欠如する場合、修飾ヌクレオチドを含む断片にさらに結合した酵素または酵素融合タンパク質は、配列決定または診断検査用に修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド断片を残りの断片から分離するために親和性マトリックスに直接結合することもできる。
【００５６】
主にＭｓｐＪＩについて以下に提供される実験プロトコールは、限定するものではない。当業者は、新たに定義されたファミリーの任意の追加のメンバーに対して以下に提供されている通り実験計画を使用することができる。
【００５７】
２００８年１２月２３日出願の米国特許仮出願第６１／１４０，５８６号および２００９年１２月８日出願の米国特許仮出願第６１／２６７，６１７号を含めた、本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）：ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメチル化特異的ＤＮＡ切断活性
酵素の生成
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーの組換え型メンバーを、ｄｃｍ−株ＥＲ２５６６中で発現させ、複数のクロマトグラフィステップを用いて実質的に均質になるまで精製した。Ｎ末端８ｘＨｉｓタグを有した酵素を、最初にＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製し、次いでＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製し、最後にＨｉＴｒａｐ ＳＰカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製した。精製手順は製造業者の推奨に従った。酵素画分の切断活性を（部分的にｄｃｍ−メチル化される）λＤＮＡでアッセイした。発現レベルをさらに改善するために、酵素をコード化するＤＮＡは、コドン最適化することができる。
【００５９】
スクリーニングアッセイによるＭｓｐＪＩ酵素ファミリーの切断パターンの決定
アッセイは、以下のステップの１つ以上を含むことができる。
１．任意に公知の配列を有する、合成のまたは天然に存在する大型ＤＮＡ中で標的ヌクレオチドをメチル化する。例えば、λＤＮＡは、ＣｍＣＷＧＧ部位でおよびシトシンが完全に５ｍＣシトシンによって置換されるＸＰ−１２ファージゲノムＤＮＡで部分的にｄｃｍ−メチル化されたものを用いることができる。
２．大型ＤＮＡをＭｓｐＪＩ酵素ファミリーと反応させる。
３．例えば、ポリアクリルアミドゲルを用いて切断生成物をサイズ分離する。
４．類似のサイズのオリゴヌクレオチド断片セットを配列決定して、修飾ヌクレオチドの位置を決定する；
５．必要に応じて、大型ＤＮＡ配列上で断片配列を位置づける。
【００６０】
ステップ（１）の同化作用は、インビトロでＤＮＡを修飾するために異なるメチルトランスフェラーゼと反応させている、異なる大型ＤＮＡ調製物を用いるステップを含む。これらの基質を、基質特異性を同定するために用いる。
【００６１】
生成物を、１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイドによって可視化することができる。例えば、Ｍ．ＨｐａＩＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）は、ＣｍＣＧＧ修飾ＤＮＡを生成することができる。プラスミドＤＮＡ消化は、１％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色を用いた可視化によってモニターすることができる。あるいは、任意のメチル化された部位が容易に創出することができ、メチルトランスフェラーゼの利用可能性と無関係であり得る、修飾部位を含む合成二重鎖オリゴヌクレオチドが用いることができる。目的とする回帰性部位中の修飾ヌクレオチドには、例えば、ＮｍＣＧＮ、ｍＣＮＧ、ＮＧｍＣＮ、ＧＮｍＣなどが含まれる（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである。）。完全にメチル化されたオリゴヌクレオチドの他に、半メチル化された部位を有するオリゴヌクレオチドは、このようなやり方で試験することができる。５−ヒドロキシメチル化シトシンおよび５−グルコシル化ヒドロキシメチル化シトシンなどの、修飾部分の他のタイプは、合成中にオリゴヌクレオチドに直接組み入れることができるまたはヒドロキシメチル化シトシン残基のバクテリオファージＴ４グルコシルトランスフェラーゼによるさらなる修飾によって組み入れることができる。
【００６２】
切断部位を決定するために、基質オリゴヌクレオチドは、その５’末端または３’末端で３３Ｐにより標識される。切断生成物を、７Ｍ−尿素２０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で一塩基分解能に移動させ分析する。
【００６３】
インビボスクリーニングアッセイによるＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの特徴付け
ＣＣＷＧＧ中の内側のシトシンをＣｍＣＷＧＧにメチル化し、所望の切断活性を有する酵素のための標的基質として使用する内因性メチラーゼ遺伝子ｄｃｍを有するＥＲ１９９２株、およびｄｃｍ遺伝子型を有し５−メチルシトシンを有さないおよびメチル化特異的酵素による切断を受けないＥＲ２５６６を、新規な組換え型制限エンドヌクレアーゼのメチル化特異的活性についてのスクリーニングのために用いた。
【００６４】
インビトロアッセイによるＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの活性の測定
１ｋｂの介在配列によって分離されたたった２つのメチル−Ｃを含むプラスミドを用いる。これは、３つの断片、３ｋｂのプラスミド主鎖、１ｋｂの挿入および２つの３２ｂｐ断片を残して切断する。この消化が完了するまで行われるとき、切断されてないプラスミドは消失し、１ｋｂおよび主鎖のバンドのその後の出現は、アガロースゲルで容易に定量化できる。このプラスミドをｄａｍ−ｄｃｍ株に転換し、アッセイ基質として精製する。かかるプラスミドは、Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｆ．ら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７９巻：６１１−６１６頁（１９９８年）に記載されている。
【００６５】
インビトロアッセイを用いた修飾結合配列対非修飾結合配列のＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの特異性の決定
ＭｓｐＪＩのインビトロ活性を、ｄｃｍメチル化されたプラスミドＤＮＡ ｐＢＲ３２２についての図２Ａに示される通り、様々なメチル化および非メチル化ＤＮＡ基質で定量化した。ＭｓｐＪＩはエンドヌクレアーゼ活性を示し（図２Ａ、レーン１および２）、このエンドヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡメチル化依存性であった。対照的に、ＭｓｐＪＩは、ｄｃｍ修飾を有さないｐＢＲ３２２で作用しなかった（図２Ａ、レーン５および６）。二重消化アッセイにおけるｍ５Ｃメチル化に非感受性である、制限酵素ＢｓｔＮＩ（ＣＣ↓ＷＧＧ）を用いることによって、ＭｓｐＪＩによるｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）上の切断部位が、ｄｃｍ部位にあるまたはそれに近接することが示された（図２Ａ、レーン２、３および４）。二重消化は、ＢｓｔＮＩパターンを変更さず、ＭｓｐＪＩが非ＢｓｔＮＩ部位で切断しなかったことが示唆された。
【００６６】
上記で試験したｍ５Ｃ修飾ＤＮＡに加えて、ＭｓｐＪＩは、Ｍ．ＴａｑＩ−（ＴＣＧｍＡ）またはｄａｍ−（ＧｍＡＴＣ）メチル化されたｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）ＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。これにより、ＭｓｐＪＩが標的ｍ６−アデニンメチル化ＤＮＡを標的にしなかったことが確認され、ＭｓｐＪＩ遺伝子がｄａｍ＋株（ＥＲ２５６６、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）において維持し発現することができるという事実に整合した。さらに、ＭｓｐＪＩは、Ｍ．ＢｓｔＮＩ（ＣＣＷＧＧ、Ｎ４−シトシンメチラーゼ）メチル化ＤＮＡを用いることによって決定することができるため、Ｎ４−メチルシトシンを含むプラスミドＤＮＡに明らかに作用しない。
【００６７】
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの５−ヒドロキシメチルシトシンまたは５−グルコシル−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡ基質に対する活性のアッセイ
グルコシル化されたシトシンを有する野生型Ｔ４ファージＤＮＡおよびＴ４α ｇｔ５７ β ｇｔ１４（欠損したグルコシルトランスフェラーゼを有し、したがって、ＤＮＡ中でヒドロキシメチル化シトシンを含む突然変異、以下Ｔ４ｇｔ）から得られたＤＮＡを、基質として用いた（図２Ｃ、レーン１および２）。ＭｓｐＪＩを、Ｔ４ ｇｔ ＤＮＡを分解することができ（図２Ｃ、レーン８−１１）、グルコシル化されたＤＮＡ上で不活性化した（図２Ｃ、レーン７）。比較のため、他の修飾依存性エンドヌクレアーゼ、ＭｃｒＢＣ（図２Ｃ、レーン３および４）およびこれらの修飾ＤＮＡ基質を有する典型的なタイプＩＩＰ制限酵素ＭｓｐＩ（図２Ｃ、レーン５および６）の活性を示した。４０−３０００塩基対によって分離した（Ａ／Ｇ）ｍＣの対を認識するＭｃｒＢＣはまた、ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性を示したが、Ｔ４野生型ＤＮＡに対する活性を示さず、Ｍｓｐｌは、両方の基質に関して不活性であった。ＭｓｐＪＩが、ＭｃｒＢＣよりも大きな範囲までＴ４ ｇｔ ＤＮＡを分解することができ、ＭｃｒＢＣよりもそのより広範な認識配列によって説明することができることに留意されたい。全体として、ＭｓｐＪＩは、ピリミジン環上で５−ＣＨ３または５−ＣＨ２ＯＨが付加されたシトシン修飾ＤＮＡを特に標的にしていると思われる。
【００６８】
切断部位周囲の基質配列の決定
異なるメチル化された部位を有するＭｓｐＪＩによって消化されたＤＮＡサンプルは、キャピラリー配列決定を行い、切断部位は、ピークが配列決定クロマトグラムにおけるメチル化された部位に近い高さが減少する位置から推論された（図５に示された例）。切断の位置は、配列シグナル（ピーク）が高さが減少する位置で起こる。多くの場合では、ポリメラーゼがＤＮＡを流出するために鋳型でないアデニンを加え、このような「流出ピーク」アデニンの位置は、切断の位置のさらなる証拠である。配列決定クロマトグラムデータに関するある観測は、切断部位がメチル化された部位から離れた部位で起こることであった。図５はまた、異なるメチル化された部位におけるＭｓｐＪＩの推定された切断パターンを示す。他の観測では、配列決定ピークの高さの減少、基質中に存在しないアデニンの付加は、一般にメチル化された部位の両側で存在したということであった。両側におけるクロマトグラムの反応は、ＭｓｐＪＩが、ＤＮＡをメチル化された結合配列のそれぞれの側で切断したことを実証した。これは、メチル化された結合部位の対称性と整合する。２つの流出ピークの存在は、同じストランド上における２つの独立した切断イベントについての証拠である。
【００６９】
ＭｓｐＪＩは、片側のストランド上でｍ５Ｃを認識し、次いで、同じストランド上で３’下流の１２ヌクレオチドを切断し相補的なストランド上で下流の１６ヌクレオチドを切断し、５’オーバーハングの４塩基を残したことが結論付けられた。同様に、相補的なストランド上のｍ５Ｃが認識されたとき、同じパターンの切断は、同じ認識部位の周囲の２つの二重鎖切断が、中間部でメチル化された部位を有する断片を放出したことを実証していることが観察された。その断片の厳密な長さは、２つのストランド上のメチル基との間の距離に依存する。ＨｐａＩＩによってメチル化された部位（Ｃｍ５ＣＧＧ）またはＨｈａＩによってメチル化された部位（Ｇｍ５ＣＧＣ）の場合において、ＤＮＡ基質から切除された断片の長さは、５’オーバーハングの２つの４塩基を含めた３２ヌクレオチドとなることが予想された。
【００７０】
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの完全にメチル化されたおよび半メチル化されたＤＮＡに対する活性の比較
複製中に起こり得る、半メチル化ＤＮＡ基質上で活性であるか否かを調査するために、ＦＡＭで標識された合成基質を消化アッセイにおいて用いた（図４Ａ）。図４Ａは、予想される切断部位および生成物サイズを示し、図４Ｂは、７Ｍ尿素２０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で分離した消化反応を示す。照合のためのｍ５Ｃは、オリゴ中のＭ．ＨｐａＩＩ部位（ＣｍＣＧＧ）においてである。上部ストランドまたは底部ストランド上でのヌルメチル化、完全メチル化、半メチル化を試験し、上部ストランドおよび底部ストランド上の切断イベントを、図４Ｂに示される通り、それらを個別に標識化することによって観察した。
【００７１】
完全にメチル化されたＤＮＡ上で、ＭｓｐＪＩを、メチル化された部位の両側で切断する。上部ストランド上で、それをメチル化された部位のどちらか一方の側で切断し、その結果（切断部Ｌｔから得られた）４０ｂｐ断片および（切断部Ｒｔから得られた）１１または１２ｂｐ断片（図４Ｂ、レーン３）をもたらす。対称的に、底部ストランド上で、これは２回切断し、（切断部Ｌｂから得られた）３６ｎｔの長い断片および（切断部Ｒｂから得られた）７もしくは８ｎｔのより短い断片を生成する（図４Ｂ、レーン４）。
【００７２】
半メチル化された基質上で、ストランドメチル化状態は、二重鎖切断のみがメチル化された塩基を含むストランドの３’側上で起こるように切断の側を指示する。例えば、上部ストランドメチル化のみを有する基質の場合、各切断イベントは、より短い断片のみが観察されるように（図４Ｂ、レーン５および６）、５ｍＣの３’側にある。これらは、底部ストランドメチル化を有する基質に適用し、より長い断片のみが示される（図４Ｂ、レーン７および８）。これらの結果により、それぞれのｍ５Ｃは同じ側で２つの切断に関連し、かかる関連は対称的であることが示される。したがって、理論によって縛られることを望まずに、ＭｓｐＪＩが、上部もしくは底部ストランドの完全にメチル化された部位において、メチル化された部位のそれぞれ半分を別々に認識することおよびその場合は、半分の部位が切断の方向性を指示することを提案する。
【００７３】
共有の保存されるＤＮＡ配列を有するＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバー、第２の配列モチーフ、および結合の特徴付けおよび切断特性
問い合わせ配列として、ＭｓｐＪＩなどのＭｓｐＪＩファミリーのメンバーのアミノ酸配列を用いることによって、ＧｅｎＢａｎｋに対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻：３３８９−３４０２頁（１９９７年））では、かなりの配列相同性を有する１００件以上を検索した。上位にヒットしたもののうち１６個の遺伝子は、配列の長さ中でＭｓｐＪＩにかなりの類似性を有した。図１Ｄにおいて、部分的な多重配列アラインメントは、ＭｓｐＪＩサブファミリー内の保存された触媒モチーフの周りで提供される。保存された触媒モチーフの有意性は、Ｄ３３４ＡおよびＱ３５５Ａ突然変異がＭｓｐＪＩの触媒活性を完全に消失させる、特定部位の突然変異誘発実験によって示される。
【００７４】
ＭｓｐＪＩファミリーの予測される第２の構造要素を、ＰＲＯＭＡＬＳウェブサーバーによって創出された多重配列アラインメントを用いて決定した（Ｐｅｉら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５巻：Ｗ６４９−６５２（２００７年））（図１Ｂは、概要図を示し、図７−１から７−７は完全なアラインメントを示す。）。触媒Ｃ末端ドメインの構造コアは、３つの連続するストランド（図１Ｂ中のβ１β２β３）を有し、β３の末端におけるモチーフ（Ｑ／Ｅ）ｘＫおよびβ２の開始における保存された残基Ｄを有する（図７−１から７−７）（Ｗａｈら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５巻：１０５６４−１０５６９頁（１９９８年））。β１β２β３後のα４−β４−α５−β５の順序における２つのへリックスおよびストランドは、モノマー間の相互作用インターフェースを形成する（図１Ｂ）。
【００７５】
酵素の新たに定義されたファミリーのメンバーの切断活性を改善する上でのアクチベーターの役割の決定
二重鎖５−メチルシトシン（例えば、１１ｍｅｒ、１５−ｍｅｒ、１９ｍｅｒおよび２３ｍｅｒ）を含むアクチベーター２量体を試験してＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメンバーによる消化が促進できるか否かを決定した。これらの２量体を、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによってまたは一本鎖オリゴヌクレオチドのヘアピン形成によって構成する。
【００７６】
アクチベーターに関するアッセイには、様々な長さの中心で５−メチル−Ｃを含む自己相補的なオリゴヌクレオチドを構成することが含まれる。オリゴヌクレオチドは、これらが結合するまたは伸長することができないように反応からのその後の除去のために５’末端でビオチン化され、３’アミノ修飾される。次いで、アクチベーターを、配列決定における干渉のためのストレプトアビジンビーズを除去する前後に切断を増強する能力についてアッセイする。
【００７７】
（実施例２）：メチロームを位置づけることにおける酵素の適用の実証
マウスまたはヒトゲノムのメチローム分析を分析するために、ヒトもしくはマウスゲノムＤＮＡ１−２μｇを、一塩基分解能でメチローム分析のために用いる。ゲノムを、任意に、ビオチンを含むアクチベーター分子の存在中でＭｓｐＪＩファミリーのメンバーにより消化し、その後、ストレプトアビジン磁気親和性ビーズを用いてアクチベーター分子を除去する。消化されたＤＮＡを、ＮＥＢＮｅｘｔ（商標）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）末端修復モジュールを用いて末端修復し、エタノール沈殿し、適当な容積の水に溶解する。消化されたゲノムＤＮＡを、ＮＥＢＮｅｘｔ（商標）クイックリゲーションモジュール（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてバーコード化したＳＯＬｉＤプライマーおよびＰ１プライマーに結合する。結合させた生成物を、１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分離し、（１００−１３０ｂｐの間で）約１１０ｂｐの結合させた生成物を、エチジウムブロマイド染色により可視化した後切除する。破砕および浸漬または適当な溶離方法を用いて、ＳＯＬｉＤ配列決定のためにＤＮＡを単離する（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。例えば、ＭｓｐＪＩは、切断のためにメチル化シトシン残基およびヒドロキシメチル化シトシン残基との間で区別せず、したがって、配列決定データは、全メチロームの分析をもたらす。
【００７８】
哺乳動物における５−ヒドロキシメチルシトシンの生物学的役割の決定
マウス胚性幹細胞（ＥＳ）分化中のＤＮＡメチル化の力学的変化は、酵素の新たに定義されたファミリーを用いて同定することができる。以前の報告により、修飾シトシンの１０％も５−ヒドロキシメチルシトシンの形態であることが示唆される。これらは、亜硫酸水素塩を使用した現在の方法を用いて見逃されている。この修飾付加体は、グアニンに相補的であり、ポリメラーゼに基づく増幅においてシトシンとして読み取られる。
【００７９】
他のモデル生物のメチロームの探索
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーは、ｍＣｐＧに作用するだけでなく、メチル化された部位の他のタイプを認識し切断することができる。例えば、アラビドプシスのゲノムＤＮＡ中に存在するｍＣＮＧは、ＭｓｐＪＩの天然の基質である。これは、任意の生物における修飾された塩基の存在についてアッセイする単純な方法を提供する。例えば、ＭｓｐＪＩを有する全ゲノムＤＮＡの消化は、ポリアクリルアミドゲルから単離しやすい３２ｂｐ断片を与える。その場合、この断片は、酵素の標準的なカクテルを用いてモノヌクレオチドに消化することができ、全消化を、ＨＰＬＣおよび／または質量分析によって試験して修飾された塩基を同定した。アラビドプシス、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの様々な生物ならびにトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）などのキネトプラスチド原生動物（Ｃｒｏｓｓら ＥＭＢＯ Ｊ．１８巻：６５７３−６５８１頁（１９９９年））に見出される塩基Ｊなどの異常な修飾を含むことが知られるゲノムは、本明細書に記載した方法によって研究される。エピゲノムが確認された後、消化されたバンドは、ヒト用に確立されたプロトコールを用いて高処理の配列決定に送ることができる。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【背景技術】
【０００１】
メチルトランスフェラーゼと関連するＤＮＡ切断酵素は、原核生物のゲノム中に広く存在する。ＤＮＡ切断酵素は、通常、規定の部位でＤＮＡを切断することにより、侵入するＤＮＡ（例えば、バクテリオファージ）から宿主細胞を防御する制限エンドヌクレアーゼ、該制限エンドヌクレアーゼ部位内の特定の塩基をメチル化することによって宿主ＤＮＡが分解されるのを防ぐＤＮＡメチルトランスフェラーゼからなる（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５巻：Ｄ２６９−２７０（２００７年））。そのため、これらの制限エンドヌクレアーゼは、メチル化感受性と呼ばれる。
【０００２】
原核生物およびファージＤＮＡ内の修飾塩基は、ゲノムを制限エンドヌクレアーゼによる切断から防御する上である役割を果たし、メチル化シトシン（ｍ５Ｃ）は、哺乳動物ゲノムの遺伝子発現に関与する。メチル化ＤＮＡを同定するための技法は、厄介であり、再現可能なやり方で実施することが実験上困難である。２つの手法が一般的に用いられる。１つは、シトシンメチル化への感受性が異なるＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩなどの制限酵素の使用を含む。例えば、ＨｐａＩＩエンドヌクレアーゼは、ＣＣＧＧ認識部位内の２つのシトシンのいずれかをメチル化することによって遮断されるが、そのアイソシゾマーであるＭｓｐＩは、外側のＣがメチル化されているときにだけ遮断される。ＭｓｐＩは、内側のシトシンが修飾されているとき、ＤＮＡを切断する。第２の方法は、非メチル化シトシン残基の亜硫酸水素塩修飾、その後の選択的増幅および残りのＤＮＡの配列決定を含む。この方法では、メチル化シトシンは治療に抵抗性である。この方法は、最適化することが容易でなく、複雑な化学修飾ステップ、およびその後の複雑なプライマーセットを用いた増幅を用いる。この方法は、より単純な代替手法がない場合に広く用いられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５巻：Ｄ２６９−２７０（２００７年）
【発明の概要】
【０００４】
本発明の実施形態において、大型のＤＮＡの酵素的切断によって得られる二重鎖オリゴヌクレオチド断片セットが提供され、大型ＤＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、哺乳動物細胞に由来し得、より具体的にはヒト細胞に由来し得る。セット中の断片の少なくとも５０％は、好ましくは類似のサイズになるものとし、好ましくは、中心的に位置する修飾ヌクレオチドを含むものとする。１つ以上の断片は、セットから単離することができる。大型ＤＮＡは、少なくとも長さ１００ヌクレオチドとなり得；修飾ヌクレオチドは、例えば、メチル化シトシンまたはヒドロキシメチル化シトシンなどの修飾シトシンとなり得、修飾シトシンは、ＣｐＧまたはＣＮＧを形成するためにグアニンに近接し得る。しかし、修飾シトシンは、代替的に、他のシトシン、アデニンまたはチミジンに近接して位置し得る。セット中のオリゴヌクレオチド断片は、好ましくは６０ヌクレオチド長未満、例えば、２８−３６ヌクレオチドになり得；および／または修飾ヌクレオチド、具体的にはシトシンは、断片のどちらかの末端から３０ヌクレオチド以内に位置し得る。
【０００５】
本発明の一実施形態において、各酵素が修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離である位置でＤＮＡを切断することができるように、ＤＮＡ内の修飾ヌクレオチドを認識する１種以上の酵素を特徴とする酵素調製物が提供される。より具体的には、切断部位と修飾ヌクレオチドとの非ランダムな距離は、上記のタイプの断片セットを生成するように、その酵素に特徴的なものであり得る。１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメイン、より具体的には、ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ（Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２ＬＸ１０−２０ＰＸ３Ｆとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする。
【０００６】
本発明の一実施形態において、酵素調製物中の１種以上の酵素は、単一のオープンリーディングフレーム内の認識ドメインおよび切断ドメインによってさらに定義される。切断ドメインは、ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有し得る。さらに、酵素の少なくとも１種は、配列番号７−２２として同定された配列のいずれかとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有し得る。さらに、酵素の１種以上は、タンパク質親和性タグまたは他のタグに共有結合もしくは非共有結合により連結するまたは融合し得る。適当な親和性タグの例には、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、抗体およびＨｉｓタグが含まれる。さらに、１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤを含むアミノ酸配列に結合特異性を有する抗体によって認識することができる。さらに、調製物は、アクチベーターＤＮＡを含むことができる。
【０００７】
本発明の一実施形態において、各酵素が修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離である部位で、より具体的には、切断部位と修飾ヌクレオチドとの距離が酵素に特徴的であり、それによって、断片セットを生成する部位で二重鎖ＤＮＡを切断することができるような、ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識する１種以上の酵素を含む酵素調製物が提供される。ＤＮＡが、二重鎖の各ストランド上でほぼ反対の位置に修飾ヌクレオチドを含む場合、断片セットは、類似のサイズとなり得るまたは半修飾ＤＮＡについては様々なサイズとなり得る。１種以上の酵素は、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とすることができる。
【０００８】
本発明の一実施形態において、上記の酵素のＮ末端ドメインを認識しそれに結合することのできる抗体が提供される。
【０００９】
本発明の一実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡを上記組成物で切断するステップおよびオリゴヌクレオチド断片セットを得るステップを含む方法が提供される。この方法は、このオリゴヌクレオチド断片セットを非切断ＤＮＡから分離するステップをさらに含むことができ、少なくとも１つの断片内に含まれる１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を決定するために、分離した断片セットから少なくとも１つの断片を配列決定するステップをさらに含むことができる。この方法は、配列決定または他の手段による大型ＤＮＡ中の１つ以上の修飾ヌクレオチドの存在および位置についてオリゴヌクレオチド断片の一部またはすべてを分析するステップおよびゲノムもしくはメチロームマップ上で配列を位置づけて修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップを含むことができる。
【００１０】
本発明の一実施形態において、配列番号７−２２およびそれらの変異形からなる群から選択される配列を用いて配列データベースを検索するステップおよびＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤのコンセンサス配列を特徴とするＮ末端領域を有する追加の配列を同定するステップを含む方法は、上記などの酵素を同定するために提供される。この方法は、ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫのコンセンサス配列、より具体的にはＦＥ（Ｘ）２Ａ（Ｘ）１５−１８ Ｔ／ＳＸ４ＤＧＧＸＤＸ２Ｇ／ＬＸ１５−２０Ｅ／ＱＡＫのコンセンサス配列を有する触媒ドメインを含むＣ末端を同定するさらなるステップを含むことができる。
【００１１】
本発明の一実施形態において、方法は、ＤＮＡ断片の混合物から単離するために提供され、これらのＤＮＡ断片は１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、混合物は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡの酵素切断から生じる。この方法は、混合物に、修飾ヌクレオチドを含むこれらの断片を選択的に結合することができる固定化されたもしくは標識された親和性結合分子を加えることを含むことができる。あるいは、修飾ヌクレオチドを含むこれらの断片は、修飾ヌクレオチドを含まないこれらの断片からサイズ分離することができる。親和性結合分子の例は、上記の酵素調製物であり、酵素調製物の１種以上の酵素は、酵素切断活性を欠如するために突然変異されており、突然変異させた酵素は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を結合するために固体表面上で固定化される。親和性結合分子の他の例には、抗体、不活性化Ｔ４グルコシルトランスフェラーゼおよびＤＮＭＴ１などの細胞タンパク質のメチル結合ドメインが含まれる。これらの分子は、例えば、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメインまたはビオチン分子のいずれかに融合することができ、その上、適当なカラムに結合することができる。
【００１２】
本発明の他の実施形態では、方法は、修飾ヌクレオチドのあるパターンから得られた細胞調製物または組織サンプル中の現在もしくは将来の表現型特性を同定するために提供される。この方法には、上記の酵素調製物の手段によって細胞調製物もしくは組織から得られた大型ＤＮＡを断片に切断するステップ；および現在または将来の表現型特性を決定するために、断片内の修飾ヌクレオチドのための位置を対照ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチドのあるパターンと比較するステップが含まれる。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、上記方法は、修飾ヌクレオチドを結合することができる親和性結合分子と切断断片を接触させるステップ、または電気泳動によるもしくはサイズ分離を実施することのできる当技術分野で公知の他の手段によるステップをさらに含む。結合部分は、前述した通り酵素調製物を含むことができ、酵素切断活性は、従来の手段によって不活性化されている。したがって、修飾ヌクレオチドを有する断片は、修飾ヌクレオチドを欠如する断片から分離することができる。上記方法は、メチロームまたはゲノム上で固定化された切断断片内の１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を同定するステップをさらに含むことができる。位置は、分離した断片を配列決定することによって決定することができる。
【００１４】
本発明の他の実施形態では、方法は、大型ＤＮＡ中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定するために提供される。この方法には、上記の酵素調製物で大型ＤＮＡを切断するステップ；少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド切断セット生成物を得るステップ；および例えば、そのオリゴヌクレオチド切断セット生成物を配列決定することにより大型ＤＮＡの配列中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップが含まれる。そのセット中の配列決定するためのオリゴヌクレオチド断片の数は、このセットがクローン化ＤＮＡに由来する、または断片のサブセットを配列決定するために十分となり得る繰り返しに由来するか否かに依存し得る、またはセットが、このセット中のほぼすべての断片を配列決定することが望ましいこともあるユニーク配列を含むことが予測されるか否かに依存し得る。
【００１５】
本発明の一実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む精製された断片の調製物を得るために、１つ以上の断片が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片の混合物を、ＤＮＡ断片に共有結合的にもしくは非共有結合的に結合することのできる固定化された親和性結合タンパク質と接触するステップを含む方法が提供される。親和性結合タンパク質の例は、上記の酵素調製物中の突然変異させた酵素であり、酵素切断活性は不活性化している。この方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の断片を、結合タンパク質に結合するステップ；および１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片の精製された調製を得るステップをさらに含むことができる。
【００１６】
本発明の一実施形態において、使用説明書と共に容器内の上記酵素調製物を含む、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド断片を精製するためのキットが提供される。キットはアクチベーター分子をさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＭｓｐＪＩ ＲＭ系を示す図であり、ＭｓｐＪＩ ＲＭ系をコード化するマイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＪＬＳのゲノム分節を示す図である。オープンリーディングフレームのＮＣＢＩアノテーションは、Ｍｊｌｓ０８２１、推定上のヘリカーゼ；Ｍｊｌｓ０８２２（ＭｓｐＪＩ）、制限エンドヌクレアーゼ；Ｍｊｌｓ０８２３（Ｖ．ＭｓｐＪＩＰ）、ＤＮＡミスマッチエンドヌクレアーゼｖｓｒ；Ｍｊｌｓ０８２４（Ｍ．ＭｓｐＪＩ）、ＤＮＡシトシンメチルトランスフェラーゼである。
【図１Ｂ】ＭｓｐＪＩ ＲＭ系を示す図であり、ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーの模式的なドメイン構造を示す図である。Ｎ末端ドメインは、本明細書において残りのＣ末端ドメインのタンパク質配列上流の約５０％として定義される。
【図１Ｃ】Ｎ末端ドメインにおける保存されたモチーフを示す図である。
【図１Ｄ】Ｃ末端ドメインにおける保存されたモチーフを示す図である。
【図２Ａ】ＭｓｐＪＩに対する修飾依存性酵素活性を示す図である。 レーン１、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）ＤＮＡ１μｇのみ； レーン２、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ； レーン３、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ＋ＢｓｔＮＩ１０単位； レーン４、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）１μｇ＋ＢｓｔＮＩ１０単位のみ； レーン５、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）ＤＮＡ１μｇのみ；および レーン６、ｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ。 すべての反応は、３７℃で１時間温置し、１％アガロースゲル上で分離した。レーン３および４は、ＭｓｐＪＩがＢｓｔＮＩによって切断されない部位を全く切断しないことを示す。したがって、ＣｍＣ Ａ／Ｔ ＧＧにおいてメチル化されるこの基質上で、修飾Ｄｃｍ部位だけが、ＭｓｐＪＩによって切断される。すべてのＤｃｍ部位は、Ｄｃｍメチル化に感受性でないＢｓｔＮＩによって切断される。
【図２Ｂ】他の部位でメチル化されたｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）のＭｓｐＪＩ消化を示す図である。すべての反応は、５０μｌ容積中で３７℃で２時間行われ、１％アガロースゲルで分離した。ＭｓｐＪＩ０．８μｇはすべての反応に用いられた。 レーン１、Ｍ．ＭｓｐＩ（ＣｍＣＧＧ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ； レーン２、Ｍ．ＨａｅＩＩＩ（ＧＧｍＣＣ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ； レーン３、Ｍ．ＨｐａＩＩ（ＣｍＣＧＧ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ； レーン４、Ｍ．ＨｈａＩ（ＧｍＣＧＣ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ；および レーン５、Ｍ．ＡｌｕＩ（ＡＧｍＣＴ）修飾ｐＢＲ３２２ １μｇ。
【図２Ｃ】ヒドロキシメチルシトシン−含有ＤＮＡにおけるＭｓｐＪＩ消化を示す図である。すべての反応は、５０μｌ容積中で３７℃で１時間行われた。 レーン１、グルコシル化ヒドロキシメチルシトシンを有するＴ４野性型（ｗｔ）ＤＮＡ１μｇ； レーン２、ヒドロキシメチルシトシンを有するＴ４ ｇｔＤＮＡ１μｇ； レーン３、Ｔ４ ｗｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｃｒＢＣ１０単位； レーン４、Ｔ４ ｇｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｃｒＢＣ１０単位； レーン５、Ｔ４ ｗｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｓｐＩ２０単位； レーン６、Ｔ４ ｇｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｓｐＩ２０単位； レーン７、Ｔ４ ｗｔＤＮＡ１μｇ＋ＭｓｐＪＩ０．８μｇ； レーン８から１１まで、１．６μｇで開始する２−倍連続希釈したＭｓｐＪＩを有するＴ４ ｇｔＤＮＡ １μｇ（レーン８）。
【図２Ｄ】異なる量のＤＮＡアクチベーターのｏｎＭｓｐＪＩ活性に対する効果を示す図である。レーン１から５まで、各反応は、ｐＢＲ３２２ １μｇ（０．３５ｐｍｏｌ）およびＭｓｐＪＩ １．６ｐｍｏｌを含む。レーン１−４は、メチル化されたＣＣＷＧＧ部位を含むＤＮＡアクチベーターの滴定（４０、２０、１０、５ｐｍｏｌ）を示す。レーン５は、ＤＮＡアクチベーターを含まないＭｓｐＪＩを用いたｐＢＲ３２２−消化を示す。レーン６は、ＢｓｔＮＩ（ＣＣＷＧＧ）を用いたｐＢＲ３２２−消化を示す。
【図３】完全にメチル化されたＤＮＡに対するＭｓｐＪＩの切断活性の概略図である。二重鎖切断はメチル化部位のどちらかの側で起こり得る。切断は、認識されたメチル化塩基の３’側においてである。この図において、上部ストランドメチル化シトシンが認識されるとき、ＭｓｐＪＩは右側で切断し；底部ストランドメチル化シトシンが認識されるとき、ＭｓｐＪＩは左側で切断する。切断部位から認識されたメチル化シトシンまでの距離は固定される。例えば、上部ストランドメチル化シトシンが認識されるとき、底部ストランドニッキング部位は、そこから１６ヌクレオチド離れており、上部ストランドニッキング部位は、そこから１２ヌクレオチド離れている。
【図４Ａ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、合成二重鎖オリゴヌクレオチドＴＧＧＴＡＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧ（配列番号１）中の予測した酵素切断部位（指定されたＲｔ、Ｒｂ、Ｌｔ、Ｌｂ）を示す図である。上部ストランドの３’末端または底部ストランドの５’末端は、４Ｂに示した通り、ＦＡＭで標識される。
【図４Ｂ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質におけるＭｓｐＪＩ−消化を示す図である。 レーン１、非メチル化、標識された上部ストランド； レーン２、非メチル化、標識された底部ストランド； レーン３、上部および底部メチル化、標識された上部ストランド； レーン４、メチル化された上部および底部ストランド、標識された底部ストランド；８ｎｔおよび７ｎｔのサイズで切断された生成物は、底部ストランド中でゆらぎ切断を示唆している； レーン５、メチル化された上部ストランド、標識された上部ストランド； レーン６、メチル化された上部ストランド、標識された底部ストランド；レーン４のように、８ｎｔおよび７ｎｔのサイズで切断された生成物は、底部ストランド中でゆらぎ切断を示唆している； レーン７、メチル化された底部ストランド、標識された上部ストランド；および レーン８、メチル化された底部ストランド、標識された底部ストランド。 対照として、マーカーは、ゲルの右側で移動する。
【図４Ｃ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、ＣｐＧを有するオリゴヌクレオチド配列および中心位置でＣｐＧを有する断片を生成する酵素による切断部位を示す図である。
【図４Ｄ】変性ゲルで分画された、完全にメチル化されたおよび半メチル化されたオリゴ基質上のＭｓｐＪＩ切断を示す図であり、アクチベーターＤＮＡが存在するまたは存在しない場合におけるＭｓｐＪＩを用いた図４Ｃに示されるオリゴヌクレオチドの消化を示す図である。反応は１０μｌ中で３７℃で１時間行われた。各反応において、オリゴヌクレオチドは、１ｐｍｏｌであり、ＭｓｐＪＩは０．４μｇである。アクチベーターとの反応において、原液（１５μＭ）１μｌを１０μｌ反応に加えた。反応５μｌは取り出され、異なる時点で停止させ、２０％未変性のポリアクリルアミドゲルで分離した。 レーン１、ＤＮＡのみ； レーン２、３０分におけるアクチベーターのない消化反応； レーン３、３０分におけるアクチベーターとの消化反応； レーン４、１．５時間におけるアクチベーターのない消化反応；および レーン５、１．５時間におけるアクチベーターとの消化反応。
【図５】異なるｍ５Ｃメチル化された部位におけるＭｓｐＪＩ切断部位位置の配列分析を示す図である。ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（ｄｃｍ−）は、様々なメチルトランスフェラーゼを用いてメチル化された。メチルトランスフェラーゼは、欄見出しの「メチラーゼ」の下に示される。ランオフ配列決定パターンは「配列決定クロマトグラムの例」の欄の下に示される（配列番号２−６）。推定された切断パターンは、「ＭｓｐＪＩ切断部位」の欄に示す。
【図６Ａ】大型ＤＮＡが新規な酵素ファミリーのメンバーで切断されるとき、得られたオリゴヌクレオチドセットの代表的な断片である、中心に位置する修飾シトシンを有する二重鎖ＤＮＡを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ａで示されるオリゴヌクレオチド断片セットが干渉性バンドとして現れる、ポリアクリルアミドゲルにおけるヒトゲノムＤＮＡのＤＮＡサンプルを示す図である。３２ｂｐバンドは、ゲノムから得られたメチル化されたＣｐＧ部位を含む短い断片のプールを表す。このプールは、精製することができ、メチローム分析に関する次世代配列決定プラットフォームに直接入れることできる。
【図６Ｃ】ＭｓｐＪＩファミリー中の様々なメンバー酵素によって生成された切断生成物の比較を示す図である。第１のレーンは、ＤＮＡマーカーを含む。その後のすべてのレーンは、異なるＭｓｐＪＩファミリーメンバー酵素をそれぞれ有する、ＣｐＧ−メチル化ＨｅｌａゲノムＤＮＡの消化を含む。レーン１−３および５は、長さ約３２ヌクレオチド（矢印）に対応するバンドを示す。レーン４において、ＲｌａＩは、ＣＣＷＧＧを認識し、中心に位置する修飾シトシンを提供するために認識部位のどちらかの側で切断する。しかし、この配列は、ＨｅｌａゲノムＤＮＡ中で見出されない。 レーン１は、ＭｓｐＪＩから得られた切断生成物を示す； レーン２は、Ｆｒａｎｋｉａ５３３６から得られた切断生成物を示す； レーン３は、Ｌｐｇ１２３４から得られた切断生成物を示す； レーン４は、ＲｌａＩから得られた切断生成物を示す； レーン５は、ＡｓｐＢＨＩから得られた切断生成物を示す； レーン６は、ＤＮＡのみを示す。
【図７−１】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−２】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−３】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−４】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−５】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−６】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−７】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図７−８】酵素のＭｓｐＪＩファミリーの代表的なメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。アラインメントの５つ以上のメンバーにおいて保存される残基は、上部のレーン（「保存」）において示される。第２の構造予測は、下部の（「コンセンサス＿ｓｓ」）で列挙される。第２の構造要素は、ｅ、βシート；ｈ、αへリックスである。
【図８−１】３つの生物における異なる長さのＣＧ−中心配列のバイオインフォマティクス分析を示す図である。ＣＧ部位の総数は、ヒト、マウスおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ゲノムの各生物について列挙される。欄は、異なる（配列が異なる）ＣＧ−中心配列の数、ユニークである（単一のコピーに発生する）数、ユニークであるかかる全ＣＧ−中心配列の画分およびユニーク（単一のコピー）である異なるＣＧ−中心配列の画分を報告している。
【図８−２】３つの生物における異なる長さのＣＧ−中心配列のバイオインフォマティクス分析を示す図である。ＣＧ部位の総数は、ヒト、マウスおよびアラビドプシスゲノムの各生物について列挙される。欄は、異なる（配列が異なる）ＣＧ−中心配列の数、ユニークである（単一のコピーに発生する）数、ユニークであるかかる全ＣＧ−中心配列の画分およびユニーク（単一のコピー）である異なるＣＧ−中心配列の画分を報告している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施形態の詳細な記述
ファミリーのメンバーが二重鎖ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチドを認識し、次いで、修飾ヌクレオチドから下流（３’方向）の非ランダムな距離で切断される場合、修飾特異的ＤＮＡ切断酵素の新規なファミリーが見出された。これらの酵素の独特な特性の１つは、これらが修飾ヌクレオチドを含む短いＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡを含む大型ＤＮＡから直接放出できることである。修飾ヌクレオチドが各ストランドに対して反対の位置に存在するとき、これらの酵素は、ＤＮＡ中で両ストランドにおいて二重鎖切断をもたらすことができる。ＤＮＡが片側のストランドのみに修飾ヌクレオチドを含むとき、二重鎖切断は、修飾ヌクレオチドの片側で起こる。したがって、大型ＤＮＡ中の修飾ヌクレオチドの位置は、切断生成物をクローン化することによっておよび／または配列決定することによって推論することができる。超高処理の配列決定プラットフォームを用いて、信頼できる迅速な方式でメチル化シトシンまたはヒドロキシル−メチル化シトシンなどの修飾ヌクレオチドを同定し位置づけることが可能である。
【００１９】
「修飾」ヌクレオチドは、５−ヒドロキシメチル基または５−メチル基などの余分な化学基を含む任意のヌクレオチドを意味するものとする。例えば、「修飾」シトシンは、哺乳動物ゲノムにおいてＣｐＧおよび植物ゲノムにおいてＣＮＧとして生じ、一般に、対称性のため、同じ位置で両方のストランドでメチル化することが可能である。ヒドロキシメチルシトシンは、ヒトＤＮＡの構成物として認識されている（Ｔａｈｉｌｉａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４巻（５９２９号）：９３０−５頁（２００９年）；Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４巻（５９２９号）：９２９−３０頁（２００９年））。
【００２０】
「大型ＤＮＡ」は、ゲノムのサイズまでの１００ヌクレオチドを超えるサイズを有する、任意の天然に存在するもしくは合成ＤＮＡを意味するものとする。
【００２１】
オリゴヌクレオチド断片「セット」に関連する「類似のサイズ」は、長さ約±５ヌクレオチド以下で変わる断片を意味するものとする。しかし、異なる断片「セット」は、５−５０ヌクレオチドの範囲のサイズを有してもよい。
【００２２】
「中心に位置する」は、二重鎖の断片の同じストランドにおいてほぼ中心である片側のストランド上で修飾ヌクレオチドの位置に対応するものとする。この位置は、一般に、断片のどちらかの末端からヌクレオチドをカウントすることによって決定された中心の５ヌクレオチド以内である。
【００２３】
「Ｎ末端ドメイン」は、タンパク質のアミノ酸配列の約５０％まで伸長する領域を意味する。本発明の一実施形態において、Ｎ末端ドメイン内の保存された領域は、ＳＥＱ ＩＤ：ＮＯ：２２（ＭｓｐＪＩ）の８１から２２４アミノ酸に対応し、Ｃ末端ドメイン内の保存された領域は、タンパク質（配列番号２２（ＭｓｐＪＩ））のＣ末端の３００アミノ酸に対応する。
【００２４】
大型二重鎖ＤＮＡの切断によって得られた類似のサイズの「オリゴヌクレオチド断片セット」は、修飾ヌクレオチドが、第２の相補的なストランド上の他の修飾ヌクレオチドとほぼ反対の、片側のストランドに位置するとき、修飾ヌクレオチドの両側で大型ＤＮＡの切断から生じる断片を意味する。
【００２５】
「酵素調製物」は、試薬を意味し、インビボでその天然状態で発生するものではないことを意味するものとする。
【００２６】
複数の大型ＤＮＡ（例えば、染色体）からなるゲノムが切断される場合、各大型ＤＮＡは、類似のサイズのオリゴヌクレオチド断片セットを生じる。全ヒトゲノムの切断から得られた断片の混合物は、各セットが染色体に由来する、複数のオリゴヌクレオチド断片セットとして、または状況に依存する単一の断片セットとしてみなすことができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドセットは、異なるＤＮＡ配列を有する少なくとも６つのオリゴヌクレオチド断片を含む。例えば、オリゴヌクレオチドセットは、異なる配列を有する少なくとも１０のオリゴヌクレオチドまたは異なる配列を有する少なくとも２０のオリゴヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、クローン化二重鎖ＤＮＡは、両方のストランド上にあるＣｐＧにおける一部位で、例えば、シトシンの修飾部分で標的ヌクレオチドで酵素により修飾することができる。この例では、ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメンバーによる二重鎖切断は、修飾シトシンの両側で非ランダムな距離で起こる。オリゴヌクレオチドセットは、中心に位置する修飾ヌクレオチドを有する同様のサイズの断片からなる。
【００２７】
ファミリー中の酵素が微生物中で判明したものに限られるものではないが、酵素の新たに記載されたＭｓｐＪＩファミリーのメンバーは、微生物起源から同定されている。ＢＬＡＳＴ検索によって、本明細書で定義するファミリー中のタンパク質をコード化するすべての生物起源から得られたゲノムを含むＤＮＡデータベース中で同定された配列の数は、比較的小さいことが示されている。１６の相同体が、図１Ｃ、１Ｄおよび７−１から７−７に示されており、この配列同一性％および相同性（類似性）％は、表２に示される。
【００２８】
修飾ヌクレオチドを認識し修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離でＤＮＡを切断することのできる酵素は、Ｎ末端ドメイン中で配列モチーフを共有することが判明している。これらの酵素は、非ランダムサイズの断片を産生するために修飾ヌクレオチドの両側でＤＮＡを独自に切断することができることが判明している。真核細胞ゲノム中のシトシンの５位の修飾部分（ｍ５Ｃ）は、遺伝子発現の調節に最も一般的に関連する。本発明の実施形態は、ＣｐＧ部位の修飾シトシン、すなわち環外のＮ４位のシトシン（ｍＮ４Ｃ）、またはアデニンなどのシトシン以外の修飾ヌクレオチド、例えば、環外のＮ６位のアデニン（ｍＮ６Ａ）を認識することのできる酵素を包含することができ、かかる酵素は修飾認識配列のどちらか一方の側で切断する。
【００２９】
保存された配列ドメインおよびある種の機能的特徴により本明細書で定義された酵素のファミリーには、誘導体酵素または認識および／または触媒ドメインの外側または内側に配列修飾部分を有する変異体が含まれる。さらに、組換え型誘導体酵素または酵素変異体は、標識、タグまたはマーカーとして使用する第２のタンパク質に融合することができるファミリー（米国特許第５，６４３，７５８号）またはセレノシスチン置換によって行われるなどの標識として働く置換を含むことができるファミリー（特許第７，１４１，３６６号を参照のこと）中に含まれる。酵素の上記ファミリーの他に、Ｎ末端ドメインがメチル化ＤＮＡまたはヒドロキシメチル化ＤＮＡ結合ドメインとして働くような、触媒ドメインが修飾されるまたは存在しない誘導体酵素および酵素変異体が考えられる。
【００３０】
オリゴヌクレオチド断片セットを生成するための酵素のＭｓｐＪＩファミリーの使用は、単一の酵素を利用することができる以上の酵素を含むことができ、酵素のいくつかまたはすべては、ＭｓｐＪＩファミリーのメンバーであるまたはＭｓｐＪＩファミリーのメンバーに由来する。
【００３１】
新たに定義されたファミリーのメンバーは、化学修飾または突然変異の前に、以下に列挙する特徴の１つ以上によって構造的に定義することができる。
【００３２】
（ａ）ヘテロマーでない；
（ｂ）単一のオープンリーディングフレーム中の認識および切断機能；
（ｃ）コード配列およびタンパク質配列がメチルトランスフェラーゼモチーフを含まない；
（ｄ）ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤであるＮ末端ドメイン中の保存されたモチーフとの少なくとも９０％の配列相同性；および
（ｅ）保存されたモチーフを包含する共通の第２の構造要素。
【００３３】
図１Ｂおよび図７−１から７−７は、触媒コアを構築する第２の構造要素の全体的な順番が、ヘリックス（Ｈ１）−ヘリックス（Ｈ２）−シート（Ｓ１）−シート（Ｓ２）−シート（Ｓ３）−ヘリックス（Ｈ３）−シート（Ｓ４）−ヘリックス（Ｈ４）である、酵素ファミリーの一実施形態を示す（例えば、ｈ＝ヘリックスであり、一連のｅがβ−プリーツシートを表す、図７−１から７−７を参照のこと。）。保存されたＦＥは、α−ヘリックスＨ２中にあり；第１の保存されたアスパラギン酸（Ｄ）は、２つのβシートＳ１およびＳ２間のヒンジ領域にあり；第２の保存されたアスパラギン酸は、βシートＳ２中にあり；保存された（Ｑ／Ｅ）ＸＫは、βシートＳ３中にある。
【００３４】
ファミリーのメンバーは、配列番号７−２２から選択される配列または関連する配列を用いてＢＬＡＳＴ検索によって同定することができる。次いで、これらの該当項目から、Ｎ末端ドメイン中の上記で指定されたコンセンサス配列をさらに検索し、必要に応じてコンセンサス配列ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫのＣ末端ドメインにおける少なくとも９０％配列相同性または同一性もまた検索する。必要に応じて、Ｎ末端ドメイン中の保存された配列は、ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ （Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２Ｌ Ｘ１０−２０ＰＸ３Ｆとの９０％を超える配列相同性および／またはＦＥ（Ｘ）２Ａ（Ｘ）１５−１８ Ｔ／ＳＸ４ＤＧＧＸＤＸ２Ｇ／ＬＸ１５−２０Ｅ／ＱＡＫとの９０％を超える配列相同性に伸張拡張することができる。
【００３５】
次いで、選択される配列は、当技術分野で公知の技法によって、例えばインビトロ転写−翻訳（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）によってまたは＃ＥＲ２６５５（ＮＥＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ、＃Ｃ２５２３、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）などの修飾された塩基を欠如する微生物宿主にクローン化することによって発現することができ、定義されたサイズのオリゴヌクレオチド断片を生成するための修飾ヌクレオチドを含むおよび／または中心に位置する修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡの切断についてアッセイすることができる。
【００３６】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成するための標準的な技法を用いて酵素（ＭｓｐＪＩ酵素ファミリー）の新たに定義されたファミリーのメンバーに産生することができる。これらの抗体もしくは断片は、修飾された大型ＤＮＡに結合したＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメンバーのインサイツ標識化のために用いることができる。酵素は、切断機能が不活性化されるまたは除去されるように突然変異し得る。この場合、次いで、断片は、抗体結合することのできる親和性マトリックスに結合することによって分離することができる。
【００３７】
機能上、ＭｓｐＪＩは、メチラーゼ遺伝子配列に隣接する、データベース中でＤＮＡ配列として同定され、そのため、エンドヌクレアーゼ遺伝子と名付けられた。しかし、ＭｓｐＪＩがタンパク質として発現したとき、制限エンドヌクレアーゼ活性を決定するための標準的なアッセイを用いて不活性であることが判明した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤｃｍ＋株から得られたＤＮＡで温置したとき、酵素は活性であり、エシェリキア・コリのＤｅｍ−株から得られたＤＮＡについて試験したとき、不活性であったという本明細書に記載されている思いがけない発見がなければ、これにより、普通なら、さらなる試験を終了しているはずである。酵素がヒトゲノムＤＮＡなどの修飾シトシンを含むことが知られている真核細胞のＤＮＡで温置されたとき、高分子量ＤＮＡのスメアは、約３２塩基対のサイズに対応する断片を含む明らかに可視のバンドと共に、ポリアクリルアミドゲル上で観察された（図６Ｂを参照のこと）。
【００３８】
関連する酵素のファミリーは同定され（図７−１から７−７）、これらの酵素の代表的な例によるＤＮＡ切断は、ヒトゲノムＤＮＡで試験された。試験された酵素は、図６Ｃにおけるゲル上で観察することができるように、約３２ヌクレオチドの同様のサイズのオリゴヌクレオチド断片セットを生成した。
【００３９】
本明細書に記載されている酵素の新たに定義されたファミリーは、切断がＤＮＡ上の酵素認識部位の下流の実質的に固定された距離で行われる、５位でヌクレオチド残留物修飾を認識するおよびオリゴヌクレオチド断片セットを生成するこれらの能力を含むために特に興味深い（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを参照のこと）。本発明の実施形態において、修飾部位からの切断距離は、以下の規定に従う。
【００４０】
（１）回帰性ｍ５ＣｐＧを有する二重鎖ＤＮＡまたは両方のストランドにおいて極めて接近した他の修飾ヌクレオチドの場合、二重鎖切断は、類似のサイズの断片を生成するために、修飾ヌクレオチドのそれぞれの側で行うことができる。一実施形態では、修飾ＣｐＧを有する片側のストランド上の切断部位間の距離は、１２塩基となることが判明し、ｍ５Ｃから反対側のストランド上の切断部位への距離は、４塩基オーバーハングを含めて１６塩基（ＭｓｐＪＩ）となり、その結果、長さ３２塩基のオリゴヌクレオチド断片になることが判明した。
【００４１】
（２）半修飾二重鎖ＤＮＡの場合、二重鎖切断は、修飾ヌクレオチドから３’下流である位置で行われる。同じストランド上の切断部位から修飾ヌクレオチドまでの距離は、一定である（例えば、ＭｓｐＪＩの場合、距離は１２塩基であり、もう一方の側のストランド上の切断部位からの修飾ヌクレオチドまでの距離は、１６塩基である。）。ＤＮＡ中の半修飾の部位は、ＭｍｅＩ様酵素（ＭｍｅＩなど、米国特許第７，１１５，４０７号を参照のこと）によって認識された部位を含むオリゴヌクレオチドを、修飾ヌクレオチドから１６ヌクレオチドの部位における片側の部位で切断された半修飾ＤＮＡに連結することによって検出することができる。オリゴヌクレオチドは、底部ストランドにおける４塩基伸長部へのアニーリングを可能にするため、ＭｍｅＩ部位オリゴヌクレオチドの５’末端で４つの変性ヌクレオチドを含むことができる。あるいは、４塩基伸長部における単一のストランド領域が標準的な分子生物学技法を用いて満たされるように、平滑末端のオリゴヌクレオチドは用いられ得る。ＭｍｅＩ様酵素は、ＭｓｐＪＩ切断断片が、修飾断片の約２ヌクレオチド上流である１８もしくは１９ヌクレオチド上流を切断する。この方式において生成された断片は配列決定することができ、ＤＮＡにおける半修飾ヌクレオチドの位置が決定される。
【００４２】
ヒト、マウスおよびアラビドプシスから得られたゲノム中のＣｐＧ部位の数は、バイオインフォマティクスを用いて決定されている。次いで、これらの生物のゲノムが、中心に位置するＣｐＧを含む、２４塩基から６０塩基の様々な長さの断片に切断される場合、ユニーク配列を有する断片は、サイズが増加するに従ってヒトにおいて全ユニーク配列の７１％から９１％を表し、同じ基準によってマウスにおいて８３％から９０％を表し、アラビドプシスにおいて８９％から９５％を表す。
【００４３】
異なる配列を有する定義された長さのこれらの配列が、全配列と区別され別々に分析される場合、その場合、サイズ２４−６０ヌクレオチドの断片の９６％−９８％は、ヒトゲノムの単一の遺伝子座をマッチさせる。図８−１から８−２に提供されるバイオインフォマティクス分析において、断片の長さが６０ヌクレオチドである場合、その場合、２５，５３８，４８０が異なる配列を有し、これらの９８％がゲノム中の単一の座をマッチさせる、中心に位置するＣｐＧを含む２６，１８５，４９３断片がある（図８−１から８−２を参照のこと）。
【００４４】
そのため、新たに定義されたファミリーにおける酵素によって生成されたオリゴヌクレオチド断片セットにかなりの情報価値があり、酵素は修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドからの距離でＤＮＡを切断して同様のサイズの断片を好ましくは生成する。データによって、かかる断片の大型の画分がゲノム中の単一の座を位置づける可能性が高いことが示される。これによって、最初にメチロームを創出するための単純で効率的な方法が可能である。その結果、高処理配列分析は、ゲノム中の実際の修飾ヌクレオチドのすべてが迅速におよび容易でないまでも、大部分の位置を生成することができる。
【００４５】
本発明の一実施形態において、スクリーニングアッセイは、酵素の修飾特異的切断活性を決定するために記載される（実施例１を参照のこと）。これらのアッセイは、制限するものではない。一実施形態では、選択される宿主細胞は、特異的ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドで転換された。次いで、発現されたメチルトランスフェラーゼは、特定の部位で宿主ゲノムをメチル化した。様々な定義された配列特異性を有する何百ものメチルトランスフェラーゼは、文献に記載されている（例えば、ＲＥＢＡＳＥ（登録商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡによって維持される公的に入手可能なオンラインデータベースを参照のこと）。異なるメチル化特異性を有するこれらのメチルトランスフェラーゼのいずれかは、スクリーニング目的のために用いることができる。宿主の修飾パターンに対して作用することができる修飾依存性切断活性を有する遺伝子を発現する相溶性のあるプラスミドを導入することにより、これらの転換された細胞の生存率が低減するまたはなくなり、転換プレーティング効率は低くなる。非メチル化された宿主は、メチル化−特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子との並行転換において高いプレーティング効率を示すはずである。したがって、この試験は、コードされた遺伝子産物の修飾依存性切断特性を確認する。
【００４６】
ＭｓｐＪＩファミリーにおける酵素の活性は、好ましくは、１６ｂｐ未満の長さを有し、修飾ｄｃｍ部位（例えば、ｄｃｍ（Ｃ５ｍＣＷＧＧ）部位）を含む二重鎖ＤＮＡアクチベーターの存在中で増強することができる。切断部位でホスホロチオネート結合を含む３０ｂｐ切断抵抗性ＤＮＡアクチベーターはまた、酵素反応を刺激した。
【００４７】
ＤＮＡサンプルのメチル化またはヒドロキシメチル化のレベルを決定することは、エピジェネティックな研究に重要である。ゲノムのエピジェネティックな調節は、シトシンを５−メチルシトシンに変換するためにほとんどＣｐＧ部位で、メチル基のＤＮＡへの付加によって達成することができ、おそらく、ヒドロキシメチルシトシンによってその逆で達成することができる染色質リモデリングを含む。真核細胞のゲノム中のシトシンのメチル化は、ある親の生殖系列からこの親から遺伝する染色体を標識する接合体中で持続することができる（遺伝子インプリンティング）。さらに、メチル化の大きな変化は、接合生殖後および発生する生物の組織中で起こる（Ｍｏｒｇａｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４ Ｓｐｅｃ Ｎｏ．１：Ｒ４７−５８（２００５年））。さらに、ゲノムの一部の領域でのメチル化は、環境因子に応じて変わり得る（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ ６９巻（６号）：９１５−９２６頁（１９９２年））。メチル化パターンの相違は、例えば、胚性幹細胞の、不適切な発生過程の決定的な指標となり得る（Ｂｒｕｎｎｅｒら Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９巻： １０４４−１０５６頁（２００９年））。
【００４８】
いくつかの酵素（ＤＮＭＴ１など）は、ｍ５Ｃに高親和性を有する。この酵素がＤＮＡの「半メチル化された」部分を達成する場合（メチルシトシンが２つのＤＮＡストランドのうちのただ１つに存在する場合）、酵素は、他の半分をメチル化する。
【００４９】
ＤＮＡメチル化は、繰り返し配列に起こり、転移因子の発現および可動性を抑制するのに役立つ（Ｓｌｏｔｋｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．８巻（４号）：２７２−８５頁（２００７年））。自発的な脱アミノ反応のため、５−メチルシトシンは、チミジンに変換することができ；そのため、ＣｐＧ部位は突然変異することが多く、したがって、これらが非メチル化のままであるＣｐＧアイランドにおいて以外、ゲノム中で稀になる。この状態における脱アミノ反応は、シトシンをウラシルに変換する。メチル化パターンの診断上の変化は、永続的な遺伝子突然変異の頻度の増加を検出する可能性を有する。ヒトゲノムにおけるメチル化は、治療を探索する目的のために癌細胞において研究されている（例えば、Ｇａｒｇｉｕｌｏら、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４１巻：１２７−３５頁（２００９年）；およびＧｒｏｎｂａｅｋら、Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ １０３巻：３８９−９６頁（２００８年）を参照のこと）。
【００５０】
本発明の実施形態は、マップ（メチローム）を生成するためにゲノム中の修飾ヌクレオチドを位置づける能力をかなり向上させる。ヒトメチロームは、全生物におけるおよび個別の細胞における個人間の表現型の変動に関する研究を容易にするはずであり、発生、老化および疾患に関する有用な情報をもたらすことができる。この情報から、疾患が現れる前に癌などの疾患に対する感受性を決定し、強力な診断検査および治療薬を提供する可能性を有する適当な治療を設計することが可能である。
【００５１】
新規な特性を有する酵素のファミリーを同定し新規なオリゴヌクレオチド断片を創出すると、ヒトゲノムにおいて見出される修飾された塩基の濃度を提供する１組以上のオリゴヌクレオチド断片セットの単離を可能にすることにより、ヒトメチロームの状態の記述ができるようになる。１セット（以上の）の断片の単離は、ゲル電気泳動、固相親和性結合または他の手段により容易になり得る。メチローム分析は、ゲノム中で実質的にすべてのＣｐＧジヌクレオチドをメチル化するＭ．ＳｓｓＩでゲノムを処理することを含むことができる対照を付加することによって補助することができる。（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４巻：ｅ１９（２００６年））。
【００５２】
酵素切断によって生じる１セット（以上の）オリゴヌクレオチド断片は、ＤＮＡ中の修飾シトシンヌクレオチドを同定し位置づけるためにＮｅｘｔＧｅｎ配列決定法を用いて現在利用可能である種類の高処理の配列決定方法を用いて配列決定することができる。この手法は、任意の大型ＤＮＡまたは哺乳動物ゲノムなどのゲノムのためのメチロームの生成を非常に単純化する。ゲノムの特定の領域の迅速な診断方法のための特異的なオリゴヌクレオチド切断生成物の選択は、癌などの疾患と相関した修飾シトシンの異常な存在または非存在を決定することができる。特異的なオリゴヌクレオチドは、個体のある特定の表現型を決定するために用いることができる。例えば、断片セットの定義された配列または固体表面上に示された（アレイハイブリダイゼーション）もしくは溶液中でタグを付けた（または逆もまた同様）配列のセットへのハイブリダイゼーションは、メチロームを特徴付ける断片の標準的なセットとの矛盾を明らかにすることができる。ｑＰＣＲまたはアレイハイブリダイゼーションは、存在量を目的とする１つ以上の公知の位置を調べるために用いることができる。修飾ヌクレオチドまたは結合分子は、蛍光もしくは化学発光タグまたは検出を容易にするために当技術分野で公知の他の標識方法で標識することができる。
【００５３】
ゲノム中の修飾ヌクレオチドは、不活性化された切断部位を有する新たに定義されたファミリーの突然変異酵素メンバーを用いてインサイチュで同定することができる。突然変異酵素の結合部位を可視化することによって、修飾ヌクレオチドの位置は決定することができる。
【００５４】
酵素の新たに定義されたファミリーのメンバーは、大規模な生成のために組換え型タンパク質を形成するように遺伝子工学によって作ることができる。組換え型タンパク質の精製は、酵素が追加の使用を有する親和性タグに融合するように融合タンパク質を形成することによって容易にすることができる。例えば、タグがビオチン、Ｈｉｓペプチド、キチン結合ドメインもしくはマルトース結合タンパク質ドメインまたは他の基質結合ドメインである場合、そのファミリーのメンバーは、親和性マトリックス上で、メチル結合ドメインとして作用するそれ自体を直接単離することができるまたは抗体親和性マトリックスに結合することによって単離することができるまたは親和性タグによって単離することができる。単独の、修飾されたまたはタグに融合された組換え型タンパク質は、画像処理目的のために蛍光で標識することができる。
【００５５】
酵素反応速度論が単一の代謝回転、低い代謝回転である場合または酵素が全体的に触媒活性を欠如する場合、修飾ヌクレオチドを含む断片にさらに結合した酵素または酵素融合タンパク質は、配列決定または診断検査用に修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド断片を残りの断片から分離するために親和性マトリックスに直接結合することもできる。
【００５６】
主にＭｓｐＪＩについて以下に提供される実験プロトコールは、限定するものではない。当業者は、新たに定義されたファミリーの任意の追加のメンバーに対して以下に提供されている通り実験計画を使用することができる。
【００５７】
２００８年１２月２３日出願の米国特許仮出願第６１／１４０，５８６号および２００９年１２月８日出願の米国特許仮出願第６１／２６７，６１７号を含めた、本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）：ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメチル化特異的ＤＮＡ切断活性
酵素の生成
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーの組換え型メンバーを、ｄｃｍ−株ＥＲ２５６６中で発現させ、複数のクロマトグラフィステップを用いて実質的に均質になるまで精製した。Ｎ末端８ｘＨｉｓタグを有した酵素を、最初にＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製し、次いでＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製し、最後にＨｉＴｒａｐ ＳＰカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製した。精製手順は製造業者の推奨に従った。酵素画分の切断活性を（部分的にｄｃｍ−メチル化される）λＤＮＡでアッセイした。発現レベルをさらに改善するために、酵素をコード化するＤＮＡは、コドン最適化することができる。
【００５９】
スクリーニングアッセイによるＭｓｐＪＩ酵素ファミリーの切断パターンの決定
アッセイは、以下のステップの１つ以上を含むことができる。
１．任意に公知の配列を有する、合成のまたは天然に存在する大型ＤＮＡ中で標的ヌクレオチドをメチル化する。例えば、λＤＮＡは、ＣｍＣＷＧＧ部位でおよびシトシンが完全に５ｍＣシトシンによって置換されるＸＰ−１２ファージゲノムＤＮＡで部分的にｄｃｍ−メチル化されたものを用いることができる。
２．大型ＤＮＡをＭｓｐＪＩ酵素ファミリーと反応させる。
３．例えば、ポリアクリルアミドゲルを用いて切断生成物をサイズ分離する。
４．類似のサイズのオリゴヌクレオチド断片セットを配列決定して、修飾ヌクレオチドの位置を決定する；
５．必要に応じて、大型ＤＮＡ配列上で断片配列を位置づける。
【００６０】
ステップ（１）の同化作用は、インビトロでＤＮＡを修飾するために異なるメチルトランスフェラーゼと反応させている、異なる大型ＤＮＡ調製物を用いるステップを含む。これらの基質を、基質特異性を同定するために用いる。
【００６１】
生成物を、１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイドによって可視化することができる。例えば、Ｍ．ＨｐａＩＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）は、ＣｍＣＧＧ修飾ＤＮＡを生成することができる。プラスミドＤＮＡ消化は、１％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色を用いた可視化によってモニターすることができる。あるいは、任意のメチル化された部位が容易に創出することができ、メチルトランスフェラーゼの利用可能性と無関係であり得る、修飾部位を含む合成二重鎖オリゴヌクレオチドが用いることができる。目的とする回帰性部位中の修飾ヌクレオチドには、例えば、ＮｍＣＧＮ、ｍＣＮＧ、ＮＧｍＣＮ、ＧＮｍＣなどが含まれる（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである。）。完全にメチル化されたオリゴヌクレオチドの他に、半メチル化された部位を有するオリゴヌクレオチドは、このようなやり方で試験することができる。５−ヒドロキシメチル化シトシンおよび５−グルコシル化ヒドロキシメチル化シトシンなどの、修飾部分の他のタイプは、合成中にオリゴヌクレオチドに直接組み入れることができるまたはヒドロキシメチル化シトシン残基のバクテリオファージＴ４グルコシルトランスフェラーゼによるさらなる修飾によって組み入れることができる。
【００６２】
切断部位を決定するために、基質オリゴヌクレオチドは、その５’末端または３’末端で３３Ｐにより標識される。切断生成物を、７Ｍ−尿素２０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で一塩基分解能に移動させ分析する。
【００６３】
インビボスクリーニングアッセイによるＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの特徴付け
ＣＣＷＧＧ中の内側のシトシンをＣｍＣＷＧＧにメチル化し、所望の切断活性を有する酵素のための標的基質として使用する内因性メチラーゼ遺伝子ｄｃｍを有するＥＲ１９９２株、およびｄｃｍ遺伝子型を有し５−メチルシトシンを有さないおよびメチル化特異的酵素による切断を受けないＥＲ２５６６を、新規な組換え型制限エンドヌクレアーゼのメチル化特異的活性についてのスクリーニングのために用いた。
【００６４】
インビトロアッセイによるＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの活性の測定
１ｋｂの介在配列によって分離されたたった２つのメチル−Ｃを含むプラスミドを用いる。これは、３つの断片、３ｋｂのプラスミド主鎖、１ｋｂの挿入および２つの３２ｂｐ断片を残して切断する。この消化が完了するまで行われるとき、切断されてないプラスミドは消失し、１ｋｂおよび主鎖のバンドのその後の出現は、アガロースゲルで容易に定量化できる。このプラスミドをｄａｍ−ｄｃｍ株に転換し、アッセイ基質として精製する。かかるプラスミドは、Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｆ．ら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７９巻：６１１−６１６頁（１９９８年）に記載されている。
【００６５】
インビトロアッセイを用いた修飾結合配列対非修飾結合配列のＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの特異性の決定
ＭｓｐＪＩのインビトロ活性を、ｄｃｍメチル化されたプラスミドＤＮＡ ｐＢＲ３２２についての図２Ａに示される通り、様々なメチル化および非メチル化ＤＮＡ基質で定量化した。ＭｓｐＪＩはエンドヌクレアーゼ活性を示し（図２Ａ、レーン１および２）、このエンドヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡメチル化依存性であった。対照的に、ＭｓｐＪＩは、ｄｃｍ修飾を有さないｐＢＲ３２２で作用しなかった（図２Ａ、レーン５および６）。二重消化アッセイにおけるｍ５Ｃメチル化に非感受性である、制限酵素ＢｓｔＮＩ（ＣＣ↓ＷＧＧ）を用いることによって、ＭｓｐＪＩによるｐＢＲ３２２（ｄｃｍ＋）上の切断部位が、ｄｃｍ部位にあるまたはそれに近接することが示された（図２Ａ、レーン２、３および４）。二重消化は、ＢｓｔＮＩパターンを変更さず、ＭｓｐＪＩが非ＢｓｔＮＩ部位で切断しなかったことが示唆された。
【００６６】
上記で試験したｍ５Ｃ修飾ＤＮＡに加えて、ＭｓｐＪＩは、Ｍ．ＴａｑＩ−（ＴＣＧｍＡ）またはｄａｍ−（ＧｍＡＴＣ）メチル化されたｐＢＲ３２２（ｄｃｍ−）ＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。これにより、ＭｓｐＪＩが標的ｍ６−アデニンメチル化ＤＮＡを標的にしなかったことが確認され、ＭｓｐＪＩ遺伝子がｄａｍ＋株（ＥＲ２５６６、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）において維持し発現することができるという事実に整合した。さらに、ＭｓｐＪＩは、Ｍ．ＢｓｔＮＩ（ＣＣＷＧＧ、Ｎ４−シトシンメチラーゼ）メチル化ＤＮＡを用いることによって決定することができるため、Ｎ４−メチルシトシンを含むプラスミドＤＮＡに明らかに作用しない。
【００６７】
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの５−ヒドロキシメチルシトシンまたは５−グルコシル−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡ基質に対する活性のアッセイ
グルコシル化されたシトシンを有する野生型Ｔ４ファージＤＮＡおよびＴ４α ｇｔ５７ β ｇｔ１４（欠損したグルコシルトランスフェラーゼを有し、したがって、ＤＮＡ中でヒドロキシメチル化シトシンを含む突然変異、以下Ｔ４ｇｔ）から得られたＤＮＡを、基質として用いた（図２Ｃ、レーン１および２）。ＭｓｐＪＩを、Ｔ４ ｇｔ ＤＮＡを分解することができ（図２Ｃ、レーン８−１１）、グルコシル化されたＤＮＡ上で不活性化した（図２Ｃ、レーン７）。比較のため、他の修飾依存性エンドヌクレアーゼ、ＭｃｒＢＣ（図２Ｃ、レーン３および４）およびこれらの修飾ＤＮＡ基質を有する典型的なタイプＩＩＰ制限酵素ＭｓｐＩ（図２Ｃ、レーン５および６）の活性を示した。４０−３０００塩基対によって分離した（Ａ／Ｇ）ｍＣの対を認識するＭｃｒＢＣはまた、ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性を示したが、Ｔ４野生型ＤＮＡに対する活性を示さず、Ｍｓｐｌは、両方の基質に関して不活性であった。ＭｓｐＪＩが、ＭｃｒＢＣよりも大きな範囲までＴ４ ｇｔ ＤＮＡを分解することができ、ＭｃｒＢＣよりもそのより広範な認識配列によって説明することができることに留意されたい。全体として、ＭｓｐＪＩは、ピリミジン環上で５−ＣＨ３または５−ＣＨ２ＯＨが付加されたシトシン修飾ＤＮＡを特に標的にしていると思われる。
【００６８】
切断部位周囲の基質配列の決定
異なるメチル化された部位を有するＭｓｐＪＩによって消化されたＤＮＡサンプルは、キャピラリー配列決定を行い、切断部位は、ピークが配列決定クロマトグラムにおけるメチル化された部位に近い高さが減少する位置から推論された（図５に示された例）。切断の位置は、配列シグナル（ピーク）が高さが減少する位置で起こる。多くの場合では、ポリメラーゼがＤＮＡを流出するために鋳型でないアデニンを加え、このような「流出ピーク」アデニンの位置は、切断の位置のさらなる証拠である。配列決定クロマトグラムデータに関するある観測は、切断部位がメチル化された部位から離れた部位で起こることであった。図５はまた、異なるメチル化された部位におけるＭｓｐＪＩの推定された切断パターンを示す。他の観測では、配列決定ピークの高さの減少、基質中に存在しないアデニンの付加は、一般にメチル化された部位の両側で存在したということであった。両側におけるクロマトグラムの反応は、ＭｓｐＪＩが、ＤＮＡをメチル化された結合配列のそれぞれの側で切断したことを実証した。これは、メチル化された結合部位の対称性と整合する。２つの流出ピークの存在は、同じストランド上における２つの独立した切断イベントについての証拠である。
【００６９】
ＭｓｐＪＩは、片側のストランド上でｍ５Ｃを認識し、次いで、同じストランド上で３’下流の１２ヌクレオチドを切断し相補的なストランド上で下流の１６ヌクレオチドを切断し、５’オーバーハングの４塩基を残したことが結論付けられた。同様に、相補的なストランド上のｍ５Ｃが認識されたとき、同じパターンの切断は、同じ認識部位の周囲の２つの二重鎖切断が、中間部でメチル化された部位を有する断片を放出したことを実証していることが観察された。その断片の厳密な長さは、２つのストランド上のメチル基との間の距離に依存する。ＨｐａＩＩによってメチル化された部位（Ｃｍ５ＣＧＧ）またはＨｈａＩによってメチル化された部位（Ｇｍ５ＣＧＣ）の場合において、ＤＮＡ基質から切除された断片の長さは、５’オーバーハングの２つの４塩基を含めた３２ヌクレオチドとなることが予想された。
【００７０】
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバーの完全にメチル化されたおよび半メチル化されたＤＮＡに対する活性の比較
複製中に起こり得る、半メチル化ＤＮＡ基質上で活性であるか否かを調査するために、ＦＡＭで標識された合成基質を消化アッセイにおいて用いた（図４Ａ）。図４Ａは、予想される切断部位および生成物サイズを示し、図４Ｂは、７Ｍ尿素２０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で分離した消化反応を示す。照合のためのｍ５Ｃは、オリゴ中のＭ．ＨｐａＩＩ部位（ＣｍＣＧＧ）においてである。上部ストランドまたは底部ストランド上でのヌルメチル化、完全メチル化、半メチル化を試験し、上部ストランドおよび底部ストランド上の切断イベントを、図４Ｂに示される通り、それらを個別に標識化することによって観察した。
【００７１】
完全にメチル化されたＤＮＡ上で、ＭｓｐＪＩを、メチル化された部位の両側で切断する。上部ストランド上で、それをメチル化された部位のどちらか一方の側で切断し、その結果（切断部Ｌｔから得られた）４０ｂｐ断片および（切断部Ｒｔから得られた）１１または１２ｂｐ断片（図４Ｂ、レーン３）をもたらす。対称的に、底部ストランド上で、これは２回切断し、（切断部Ｌｂから得られた）３６ｎｔの長い断片および（切断部Ｒｂから得られた）７もしくは８ｎｔのより短い断片を生成する（図４Ｂ、レーン４）。
【００７２】
半メチル化された基質上で、ストランドメチル化状態は、二重鎖切断のみがメチル化された塩基を含むストランドの３’側上で起こるように切断の側を指示する。例えば、上部ストランドメチル化のみを有する基質の場合、各切断イベントは、より短い断片のみが観察されるように（図４Ｂ、レーン５および６）、５ｍＣの３’側にある。これらは、底部ストランドメチル化を有する基質に適用し、より長い断片のみが示される（図４Ｂ、レーン７および８）。これらの結果により、それぞれのｍ５Ｃは同じ側で２つの切断に関連し、かかる関連は対称的であることが示される。したがって、理論によって縛られることを望まずに、ＭｓｐＪＩが、上部もしくは底部ストランドの完全にメチル化された部位において、メチル化された部位のそれぞれ半分を別々に認識することおよびその場合は、半分の部位が切断の方向性を指示することを提案する。
【００７３】
共有の保存されるＤＮＡ配列を有するＭｓｐＪＩ酵素ファミリーメンバー、第２の配列モチーフ、および結合の特徴付けおよび切断特性
問い合わせ配列として、ＭｓｐＪＩなどのＭｓｐＪＩファミリーのメンバーのアミノ酸配列を用いることによって、ＧｅｎＢａｎｋに対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻：３３８９−３４０２頁（１９９７年））では、かなりの配列相同性を有する１００件以上を検索した。上位にヒットしたもののうち１６個の遺伝子は、配列の長さ中でＭｓｐＪＩにかなりの類似性を有した。図１Ｄにおいて、部分的な多重配列アラインメントは、ＭｓｐＪＩサブファミリー内の保存された触媒モチーフの周りで提供される。保存された触媒モチーフの有意性は、Ｄ３３４ＡおよびＱ３５５Ａ突然変異がＭｓｐＪＩの触媒活性を完全に消失させる、特定部位の突然変異誘発実験によって示される。
【００７４】
ＭｓｐＪＩファミリーの予測される第２の構造要素を、ＰＲＯＭＡＬＳウェブサーバーによって創出された多重配列アラインメントを用いて決定した（Ｐｅｉら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５巻：Ｗ６４９−６５２（２００７年））（図１Ｂは、概要図を示し、図７−１から７−７は完全なアラインメントを示す。）。触媒Ｃ末端ドメインの構造コアは、３つの連続するストランド（図１Ｂ中のβ１β２β３）を有し、β３の末端におけるモチーフ（Ｑ／Ｅ）ｘＫおよびβ２の開始における保存された残基Ｄを有する（図７−１から７−７）（Ｗａｈら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５巻：１０５６４−１０５６９頁（１９９８年））。β１β２β３後のα４−β４−α５−β５の順序における２つのへリックスおよびストランドは、モノマー間の相互作用インターフェースを形成する（図１Ｂ）。
【００７５】
酵素の新たに定義されたファミリーのメンバーの切断活性を改善する上でのアクチベーターの役割の決定
二重鎖５−メチルシトシン（例えば、１１ｍｅｒ、１５−ｍｅｒ、１９ｍｅｒおよび２３ｍｅｒ）を含むアクチベーター２量体を試験してＭｓｐＪＩ酵素ファミリーのメンバーによる消化が促進できるか否かを決定した。これらの２量体を、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによってまたは一本鎖オリゴヌクレオチドのヘアピン形成によって構成する。
【００７６】
アクチベーターに関するアッセイには、様々な長さの中心で５−メチル−Ｃを含む自己相補的なオリゴヌクレオチドを構成することが含まれる。オリゴヌクレオチドは、これらが結合するまたは伸長することができないように反応からのその後の除去のために５’末端でビオチン化され、３’アミノ修飾される。次いで、アクチベーターを、配列決定における干渉のためのストレプトアビジンビーズを除去する前後に切断を増強する能力についてアッセイする。
【００７７】
（実施例２）：メチロームを位置づけることにおける酵素の適用の実証
マウスまたはヒトゲノムのメチローム分析を分析するために、ヒトもしくはマウスゲノムＤＮＡ１−２μｇを、一塩基分解能でメチローム分析のために用いる。ゲノムを、任意に、ビオチンを含むアクチベーター分子の存在中でＭｓｐＪＩファミリーのメンバーにより消化し、その後、ストレプトアビジン磁気親和性ビーズを用いてアクチベーター分子を除去する。消化されたＤＮＡを、ＮＥＢＮｅｘｔ（商標）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）末端修復モジュールを用いて末端修復し、エタノール沈殿し、適当な容積の水に溶解する。消化されたゲノムＤＮＡを、ＮＥＢＮｅｘｔ（商標）クイックリゲーションモジュール（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてバーコード化したＳＯＬｉＤプライマーおよびＰ１プライマーに結合する。結合させた生成物を、１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分離し、（１００−１３０ｂｐの間で）約１１０ｂｐの結合させた生成物を、エチジウムブロマイド染色により可視化した後切除する。破砕および浸漬または適当な溶離方法を用いて、ＳＯＬｉＤ配列決定のためにＤＮＡを単離する（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。例えば、ＭｓｐＪＩは、切断のためにメチル化シトシン残基およびヒドロキシメチル化シトシン残基との間で区別せず、したがって、配列決定データは、全メチロームの分析をもたらす。
【００７８】
哺乳動物における５−ヒドロキシメチルシトシンの生物学的役割の決定
マウス胚性幹細胞（ＥＳ）分化中のＤＮＡメチル化の力学的変化は、酵素の新たに定義されたファミリーを用いて同定することができる。以前の報告により、修飾シトシンの１０％も５−ヒドロキシメチルシトシンの形態であることが示唆される。これらは、亜硫酸水素塩を使用した現在の方法を用いて見逃されている。この修飾付加体は、グアニンに相補的であり、ポリメラーゼに基づく増幅においてシトシンとして読み取られる。
【００７９】
他のモデル生物のメチロームの探索
ＭｓｐＪＩ酵素ファミリーは、ｍＣｐＧに作用するだけでなく、メチル化された部位の他のタイプを認識し切断することができる。例えば、アラビドプシスのゲノムＤＮＡ中に存在するｍＣＮＧは、ＭｓｐＪＩの天然の基質である。これは、任意の生物における修飾された塩基の存在についてアッセイする単純な方法を提供する。例えば、ＭｓｐＪＩを有する全ゲノムＤＮＡの消化は、ポリアクリルアミドゲルから単離しやすい３２ｂｐ断片を与える。その場合、この断片は、酵素の標準的なカクテルを用いてモノヌクレオチドに消化することができ、全消化を、ＨＰＬＣおよび／または質量分析によって試験して修飾された塩基を同定した。アラビドプシス、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの様々な生物ならびにトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）などのキネトプラスチド原生動物（Ｃｒｏｓｓら ＥＭＢＯ Ｊ．１８巻：６５７３−６５８１頁（１９９９年））に見出される塩基Ｊなどの異常な修飾を含むことが知られるゲノムは、本明細書に記載した方法によって研究される。エピゲノムが確認された後、消化されたバンドは、ヒト用に確立されたプロトコールを用いて高処理の配列決定に送ることができる。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡの酵素による切断によって得られる、少なくとも５０％が類似のサイズであり、中心に位置する修飾ヌクレオチドを有する断片を含む二重鎖オリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項２】
１つ以上の断片がセットから単離される、請求項１に記載のセット。
【請求項３】
大型ＤＮＡが少なくとも長さ１００ヌクレオチドである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項４】
大型ＤＮＡが哺乳動物ゲノムＤＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項５】
大型ＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである、請求項１から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項６】
中心に位置する修飾ヌクレオチドがシトシンである、請求項１から５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項７】
中心に位置する修飾シトシンがグアニンに近接する、請求項１から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項８】
修飾シトシンがメチル化シトシンもしくはヒドロキシメチル化シトシンである、請求項１から７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項９】
断片がサイズ６０ヌクレオチド未満である、請求項１から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項１０】
断片が２８−３６ヌクレオチドの範囲で類似のサイズを有する、請求項１から９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項１１】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、断片の一末端から３０ヌクレオチド以内に位置する、請求項１から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項１２】
ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドから距離がある部位でＤＮＡを切断し、それによって請求項１に記載の断片セットを生成する少なくとも１種の酵素を含み、前記少なくとも１種の酵素が、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする、酵素調製物。
【請求項１３】
少なくとも１種の酵素が修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離でＤＮＡを切断する、請求項１２に記載の酵素調製物。
【請求項１４】
少なくとも１種の酵素が、ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ（Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２ＬＸ１０−２０ＰＸ３Ｆとの９０％を超える配列相同性を有するＮ末端保存ドメインを有する、請求項１２または１３に記載の酵素調製物。
【請求項１５】
少なくとも１種の酵素が、単一のオープンリーディングフレームによってコードされた認識ドメインおよび切断ドメインを含む、請求項１２から１４のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１６】
少なくとも１種の酵素が、ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＣ末端保存ドメインを有する、請求項１２から１５のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１７】
少なくとも１種の酵素が、配列番号７−２２から選択されたタンパク質配列との９０％を超える配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１２から１６のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１８】
親和性タグに融合された、請求項１２から１７のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１９】
親和性タグが、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメインおよびＨｉｓタグからなる群から選択される、請求項１２から１８のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項２０】
アクチベーターＤＮＡをさらに含む、請求項１２から１９のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項２１】
少なくとも１種の酵素のＮ末端ドメインが抗体によって認識されることができる、請求項１２から２０のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項２２】
請求項２１に定義された抗体。
【請求項２３】
ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離でＤＮＡを切断する１種以上の酵素を含み、前記１種以上の酵素が、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列類似性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする酵素調製物。
【請求項２４】
ａ．１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡを酵素により切断するステップ；および
ｂ．オリゴヌクレオチド断片セットを得るステップ
を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド断片セットを得るための方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチド断片セットを切断されていないＤＮＡから分離するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分離した断片セットから、前記断片セットのなかの少なくとも１つの断片を配列決定して、前記少なくとも１つの断片内に含まれる１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップ
をさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
大型ＤＮＡ中の１つ以上の修飾ヌクレオチドの存在および位置についていくつかの標的オリゴヌクレオチド断片を分析するステップ
をさらに含む、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチド断片セットのなかの実質的にすべての断片を配列決定するステップおよびゲノム配列マップ上に配列を位置づけて修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップ
をさらに含む、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ａ．配列番号７−２２およびそれらの変異形からなる群から選択される配列を用いて配列データベースを検索するステップ；および
ｂ．ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ（Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２Ｌ Ｘ１０−２０ＰＸ３Ｆのコンセンサス配列を特徴とするＮ末端領域を有する追加の配列を同定するステップ
を含む、請求項１２に記載の酵素調製物中で１種以上の酵素を同定するための方法。
【請求項３０】
同定された追加の配列がＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫのコンセンサス配列を有する触媒ドメインを含むＣ末端を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ．混合物に請求項１２に記載の酵素調製物を加えるステップであって、少なくとも１種の酵素が酵素切断活性を欠如するように突然変異されており、突然変異酵素が固体表面上で固定化されるステップ；および
ｂ．固定化された酵素に結合されたＤＮＡ断片を混合物から分離するステップ
を含む、混合物から、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する方法。
【請求項３２】
ａ．大型ＤＮＡを請求項１２に記載の酵素調製物で切断するステップ；
ｂ．それぞれの断片が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド切断断片セットを得るステップ；および
ｃ．オリゴヌクレオチド切断セット生成物中で１つ以上のオリゴヌクレオチドを配列決定することによって、大型ＤＮＡの配列マップ中で少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップ
を含む、大型ＤＮＡ中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定する方法。
【請求項３３】
ａ．請求項１２に記載の酵素調製物によって、細胞調製物または組織から得られた大型ＤＮＡを断片に切断するステップ；および
ｂ．現在または将来の表現型の特性を決定するために、対照ＤＮＡにおける修飾ヌクレオチドのパターンと、断片内の修飾ヌクレオチドの位置を比較するステップ
を含む、修飾ヌクレオチドのパターンから得られた細胞調製物または組織サンプル中で、現在または将来の表現型の特性を同定する方法。
【請求項３４】
（ａ）が、
（ｉ）親和性結合タンパク質の固定化された調製物と、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片に結合する分子を有する切断断片を接触させることにより；または
（ｉｉ）サイズ分離により、
１つ以上の修飾ヌクレオチドを有する断片を修飾ヌクレオチドを欠如する断片から分離するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
親和性結合タンパク質が、請求項１２に記載の酵素調製物に由来し、少なくとも１種の酵素の酵素切断活性が不活性化されている、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）が、メチロームまたはゲノム上で、固定化された切断断片内の１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を同定するステップをさらに含む、請求項３３から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ａ．断片の１つ以上が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ＤＮＡ断片の混合物を親和性結合分子の固定化された調製物と接触させるステップ；
ｂ．少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の断片を親和性結合分子に結合するステップ；および
ｃ．１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片の精製調製物を得るステップ
を含む、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片の精製調製物を得るための方法。
【請求項３８】
親和性結合分子が請求項１２に記載の酵素調製物であり、少なくとも１種の酵素の酵素切断活性が不活性化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
酵素調製物中の少なくとも１種の酵素が結合部分と結合している、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
容器内に、請求項１２に記載の酵素調製物および使用説明書を含むキット。
【請求項４１】
アクチベーター分子をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項１】
１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡの酵素による切断によって得られる、少なくとも５０％が類似のサイズであり、中心に位置する修飾ヌクレオチドを有する断片を含む二重鎖オリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項２】
１つ以上の断片がセットから単離される、請求項１に記載のセット。
【請求項３】
大型ＤＮＡが少なくとも長さ１００ヌクレオチドである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項４】
大型ＤＮＡが哺乳動物ゲノムＤＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項５】
大型ＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである、請求項１から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項６】
中心に位置する修飾ヌクレオチドがシトシンである、請求項１から５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項７】
中心に位置する修飾シトシンがグアニンに近接する、請求項１から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項８】
修飾シトシンがメチル化シトシンもしくはヒドロキシメチル化シトシンである、請求項１から７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項９】
断片がサイズ６０ヌクレオチド未満である、請求項１から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項１０】
断片が２８−３６ヌクレオチドの範囲で類似のサイズを有する、請求項１から９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項１１】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、断片の一末端から３０ヌクレオチド以内に位置する、請求項１から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド断片セット。
【請求項１２】
ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドから距離がある部位でＤＮＡを切断し、それによって請求項１に記載の断片セットを生成する少なくとも１種の酵素を含み、前記少なくとも１種の酵素が、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする、酵素調製物。
【請求項１３】
少なくとも１種の酵素が修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離でＤＮＡを切断する、請求項１２に記載の酵素調製物。
【請求項１４】
少なくとも１種の酵素が、ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ（Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２ＬＸ１０−２０ＰＸ３Ｆとの９０％を超える配列相同性を有するＮ末端保存ドメインを有する、請求項１２または１３に記載の酵素調製物。
【請求項１５】
少なくとも１種の酵素が、単一のオープンリーディングフレームによってコードされた認識ドメインおよび切断ドメインを含む、請求項１２から１４のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１６】
少なくとも１種の酵素が、ＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫとの９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有するＣ末端保存ドメインを有する、請求項１２から１５のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１７】
少なくとも１種の酵素が、配列番号７−２２から選択されたタンパク質配列との９０％を超える配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１２から１６のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１８】
親和性タグに融合された、請求項１２から１７のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項１９】
親和性タグが、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメインおよびＨｉｓタグからなる群から選択される、請求項１２から１８のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項２０】
アクチベーターＤＮＡをさらに含む、請求項１２から１９のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項２１】
少なくとも１種の酵素のＮ末端ドメインが抗体によって認識されることができる、請求項１２から２０のいずれかに記載の酵素調製物。
【請求項２２】
請求項２１に定義された抗体。
【請求項２３】
ＤＮＡ中で修飾ヌクレオチドを認識し、修飾ヌクレオチドから非ランダムな距離でＤＮＡを切断する１種以上の酵素を含み、前記１種以上の酵素が、ＷＸＤ（Ｘ）１０ＹＸＧＤとの９０％を超えるアミノ酸配列類似性を有するＮ末端保存ドメインをさらに特徴とする酵素調製物。
【請求項２４】
ａ．１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む大型ＤＮＡを酵素により切断するステップ；および
ｂ．オリゴヌクレオチド断片セットを得るステップ
を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド断片セットを得るための方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチド断片セットを切断されていないＤＮＡから分離するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分離した断片セットから、前記断片セットのなかの少なくとも１つの断片を配列決定して、前記少なくとも１つの断片内に含まれる１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップ
をさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
大型ＤＮＡ中の１つ以上の修飾ヌクレオチドの存在および位置についていくつかの標的オリゴヌクレオチド断片を分析するステップ
をさらに含む、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチド断片セットのなかの実質的にすべての断片を配列決定するステップおよびゲノム配列マップ上に配列を位置づけて修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップ
をさらに含む、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ａ．配列番号７−２２およびそれらの変異形からなる群から選択される配列を用いて配列データベースを検索するステップ；および
ｂ．ＷＸＤ（Ｘ）６Ｇ（Ｘ）３ＹＸＧＤ（Ｘ）１０−１５ＧＮ（Ｘ）２Ｌ Ｘ１０−２０ＰＸ３Ｆのコンセンサス配列を特徴とするＮ末端領域を有する追加の配列を同定するステップ
を含む、請求項１２に記載の酵素調製物中で１種以上の酵素を同定するための方法。
【請求項３０】
同定された追加の配列がＦＥＸ２０−３０ＤＸ２−４ＤＸ１９−２２（Ｑ／Ｅ）ＸＫのコンセンサス配列を有する触媒ドメインを含むＣ末端を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ．混合物に請求項１２に記載の酵素調製物を加えるステップであって、少なくとも１種の酵素が酵素切断活性を欠如するように突然変異されており、突然変異酵素が固体表面上で固定化されるステップ；および
ｂ．固定化された酵素に結合されたＤＮＡ断片を混合物から分離するステップ
を含む、混合物から、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する方法。
【請求項３２】
ａ．大型ＤＮＡを請求項１２に記載の酵素調製物で切断するステップ；
ｂ．それぞれの断片が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド切断断片セットを得るステップ；および
ｃ．オリゴヌクレオチド切断セット生成物中で１つ以上のオリゴヌクレオチドを配列決定することによって、大型ＤＮＡの配列マップ中で少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定するステップ
を含む、大型ＤＮＡ中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの位置を決定する方法。
【請求項３３】
ａ．請求項１２に記載の酵素調製物によって、細胞調製物または組織から得られた大型ＤＮＡを断片に切断するステップ；および
ｂ．現在または将来の表現型の特性を決定するために、対照ＤＮＡにおける修飾ヌクレオチドのパターンと、断片内の修飾ヌクレオチドの位置を比較するステップ
を含む、修飾ヌクレオチドのパターンから得られた細胞調製物または組織サンプル中で、現在または将来の表現型の特性を同定する方法。
【請求項３４】
（ａ）が、
（ｉ）親和性結合タンパク質の固定化された調製物と、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片に結合する分子を有する切断断片を接触させることにより；または
（ｉｉ）サイズ分離により、
１つ以上の修飾ヌクレオチドを有する断片を修飾ヌクレオチドを欠如する断片から分離するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
親和性結合タンパク質が、請求項１２に記載の酵素調製物に由来し、少なくとも１種の酵素の酵素切断活性が不活性化されている、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）が、メチロームまたはゲノム上で、固定化された切断断片内の１つ以上の修飾ヌクレオチドの位置を同定するステップをさらに含む、請求項３３から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ａ．断片の１つ以上が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ＤＮＡ断片の混合物を親和性結合分子の固定化された調製物と接触させるステップ；
ｂ．少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の断片を親和性結合分子に結合するステップ；および
ｃ．１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片の精製調製物を得るステップ
を含む、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む断片の精製調製物を得るための方法。
【請求項３８】
親和性結合分子が請求項１２に記載の酵素調製物であり、少なくとも１種の酵素の酵素切断活性が不活性化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
酵素調製物中の少なくとも１種の酵素が結合部分と結合している、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
容器内に、請求項１２に記載の酵素調製物および使用説明書を含むキット。
【請求項４１】
アクチベーター分子をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図７−５】
【図７−６】
【図７−７】
【図７−８】
【図８−１】
【図８−２】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図７−５】
【図７−６】
【図７−７】
【図７−８】
【図８−１】
【図８−２】
【公表番号】特表２０１３−５１４７５８（Ｐ２０１３−５１４７５８Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３６３６（Ｐ２０１１−５４３６３６）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９１７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５３７５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９１７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５３７５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
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