優秀な組換え蛋白質を生産するためのヒト宿主細胞
優秀な組換え蛋白質を生産するための遺伝子工学技術を利用したヒト宿主細胞を提供する。具体的には、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞に関するものであり、前記ヒト宿主細胞は、安定化した特殊形質が良好に保存され、異種組換え蛋白質医薬品の生産に有用に利用されうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優秀な組換え蛋白質を生産するためのヒト宿主細胞に係り、さらに具体的には、遺伝子工学技術を利用したヒト胚芽腎臓由来の細胞及びヒトＢ細胞由来の細胞の融合から誘導されたヒト宿主細胞に関するものであり、それらヒト宿主細胞は、安定化した特殊形質が良好に保存され、異種組換え蛋白質医薬品の生産に有用に利用されうる。
【背景技術】
【０００２】
最近までも、人間を治療するためのほとんどの組換え蛋白質医薬品は、人間ではない哺乳動物の細胞、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Chinese hamster ovary）、マウス黒色腫（ＮＳＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞などから生産されている。一方、ヒト細胞株を治療用組換え蛋白質の生産に使用しようとする試みがあったが、ヒト胚芽腎臓（human embryonic kidney）２９３細胞による活性蛋白質Ｃの生産（非特許文献１）、ナマルワ（Namalwa）細胞によるインターフェロン−ベータの生産（非特許文献２）、ＨＫＢ１１細胞による切断された形態の（truncated）組換えfactor ＶＩＩＩ及びさまざまな抗体の生産（非特許文献３）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（非特許文献４）による多数の抗体、及びウイルス性ＤＮＡの生産（非特許文献５及び非特許文献６）がその例である。
【０００３】
特許文献１及び特許文献２には、ＣＨＯ細胞内で発現させ難い蛋白質を生産するための代替方案として、ヒト宿主細胞であるＨＫＢ１１細胞が開示されている（非特許文献３、非特許文献７）。また、特許文献３及び特許文献４には、ＨＫＢ１１細胞によって切断された形態の組換えfactor ＶＩＩＩを生産する方法が開示されている。前記ＨＫＢ細胞は、ＨＨ５１４−１６から誘導された細胞株であって、Ｂ細胞不滅化能とウイルス生成能に欠陥があるエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ：Epstein Barr virus）ゲノムを含んでいる（非特許文献８）。かようなＨＫＢ細胞は、高密度の細胞成長、高効率の形質移入（transfection）、簡便なＭＴＸ誘導増幅、目的蛋白質の多量分泌、及びＩｇＭ発現の消失のような特性を示しているが、これは、組換え治療用蛋白質を生産するにあたって、望ましい特性であると言える。しかし、ＨＫＢ細胞の増殖培養過程で、ＥＢＶが細胞から分離される傾向があることを観察することになった（非特許文献９）。かような傾向性は、ＨＫＢ細胞がＥＢＶがない細胞になることが可能であり、その結果、異種遺伝子の効果的な発現に有用なさまざまな長所をそれ以上保有できないということを意味する。言い換えれば、ＨＫＢ細胞の場合、長期間培養することになればＥＢＶが消失し、組換え治療用蛋白質生産のための望ましい特性を発揮できないという問題点がある。
【０００４】
このために、本発明者らは、前記問題点を解決するために研究を繰り返していて、ナマルワ細胞の場合、ＥＢＶゲノムがエピソーム（episome）形態で存在せずに、細胞染色体に挿入されている（非特許文献１０、非特許文献１１及び非特許文献１２）という点に着眼し、ナマルワ細胞を利用し、ウイルスが生成される安全性に対する問題は解決しつつ、ＥＢＶの情報は続けて維持できる新たなヒト宿主細胞のクローンを確立し、前記ヒト宿主細胞の優秀性を究明することによって、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，１３６，５９９号明細書
【特許文献２】大韓民国特許第６２７，７５３号公報
【特許文献３】米国特許６，３５８，７０３Ｂ１号明細書
【特許文献４】大韓民国特許第６１６，０２８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Eli Lylly，2001
【非特許文献２】Wellcome Research Laboratory，1999
【非特許文献３】Cho et al．，2003，Biotech．Prog 19: 229-232
【非特許文献４】Fallaux et al．，1998，Human Gene Therapy，9：1909-1917
【非特許文献５】Jones et al．，2003，Biotechnol．Prog．19：163-168
【非特許文献６】Xie et al．，2003，Biotech．Bioeng．83：45-52
【非特許文献７】Cho and Chan，2002，Biomedical Science 9：631-638
【非特許文献８】Rabson et al．，1983，PNAS USA 87：3660-3664
【非特許文献９】Chang et al．，2002，J Virol．76：3168-3178
【非特許文献１０】Matsuo et al．，Science 14 December 1984：1322-1325
【非特許文献１１】Henderson et al．，1983，PNAS USA 80：1987-1991
【非特許文献１２】Rose et al．，2002，J．Clin．Microbiol．40：2533-2544
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞を提供することである。
本発明の他の目的は、組換え蛋白質を生産するための用途の前記ヒト宿主細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のような目的を達成するために、本発明は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、モノクローナル（monoclonal）抗体を含んだ組換え蛋白質を生産するための用途の前記ヒト宿主細胞を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導された新たなヒト宿主細胞を確立した。本発明によるヒト宿主細胞を利用し、短時間に研究用蛋白質を供給できるだけではなく、量的及び質的な側面で、非常にすぐれた人間治療に適した異種組換え蛋白質医薬品を生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｆ２Ｎ細胞融合過程及びＦ２Ｎ７８クローン選別過程の概括図である。
【図２】ＡないしＤは、初期段階でのＦ２Ｎクローンのさまざまな成長パターンを示し、塊りを形成する成長パターンを示すクローン（Ｃ及びＤ）は、選別過程から除外した。
【図３】本発明で使われた発現ベクターの開裂地図を示し、あらゆるベクターは、ｐＣＴベクターを基本骨格として構築している。
【図４Ａ】ＩｇＧ発現が高いＦ２Ｎクローンを選別するために、一時的形質移入を行った結果を示し、一次スクリーニングした結果である。
【図４Ｂ】ＩｇＧ発現が高いＦ２Ｎクローンを選別するために、一時的形質移入を行った結果を示し、一次選別された１７個のクローンを対象に二次スクリーニングした結果である。
【図４Ｃ】ＩｇＧ発現が高いＦ２Ｎクローンを選別するために、一時的形質移入を行った結果を示し、最終選別されたＦ２Ｎ７８細胞のＩｇＧ生産性を、２９３細胞と比較した結果（３回反復実験を行う）である。
【図５Ａ】蛍光免疫染色法を利用し、Ｉｇ−ｍｕとＩｇ−ｋａｐｐａとの発現有無を確認した結果を示すイメージである。
【図５Ｂ】蛍光免疫染色法を利用し、ＥＢＮＡ１とα（２，６）−ＳＴとの発現有無を確認した結果を示すイメージである。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）を利用し、Ｆ２Ｎ９８細胞で、ＧｎｔＩＩＩ、Ｉｇ−ｍｕ及びＥＢＮＡ１の発現いかんを確認した結果を示し、ナマルワ、２９３及びＣＨＯ細胞を陰性対照群として使用し、ＧｎｔＩＩＩ、Ｉｇ−ｍｕ及びＥＢＮＡ１蛋白質の特異的なプライマー対は、表１に整理してある。
【図７】Ｆ２Ｎ７８細胞と２９３細胞とを比較し、ｏｒｉＰ発現ベクター（ｐＣＴ１２５及びｐＣＴ１３２）の抗体生産性を確認した結果を示すグラフである。
【図８】Ｆ２Ｎ７８細胞をＥＢＮＡ１遺伝子のない発現ベクターであるｐＣＴ１３２で一時的形質移入して得た抗体生産性の結果を示すグラフであり、４回反復実験を行った。
【図９Ａ】ＣＨＯ細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図９Ｂ】ナマルワ細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図９Ｃ】２９３細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図９Ｄ】Ｆ２Ｎ７８細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図１０】酪酸ナトリウム処理によるＦ２Ｎ７８細胞、ナマルワ細胞及び２９３細胞でのＢＨＲＦ１及びＢＡＬＦ１の発現いかんを、ＲＴ−ＰＣＲを利用して確認した結果を示し、ここで０、１及び４は、それぞれ細胞培養培地に添加した酪酸ナトリウムの濃度（ｍＭ）である。
【図１１】ＣＨＯ＃２４７細胞の抗体生産性に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図１２】Ｆ２Ｎ７８＿Ｉｇ細胞の抗体生産性に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のヒト宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞（human embryonic kidney-derived cell）と、ＥＢＶ（Epstein-Barr virus）ゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合（fusion）から誘導されたことを特徴とする。
【００１２】
前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞は、ヒト胚芽腎臓細胞、ヒト胚芽腎臓細胞から誘導した細胞、他のヒト胚芽腎臓由来の細胞から誘導した細胞、または前記任意の体細胞分裂から得た細胞を含む。ここで、「から誘導した」には、正常な体細胞分裂（mitotic division）、形質移入（transfection）、細胞融合、または細胞を変形させたり新たな特性を有する細胞を製造するのに使われる他の遺伝子工学的な技術や、細胞生物学的な技術のような方法が含まれるが、これらに制限されるものではない。具体的には、前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞は、２９３由来細胞、望ましくは、２９３細胞でありうる。かような２９３細胞は、高い形質移入効率性と、高レベルの蛋白質生産能とを示す一方、無血清浮遊（suspension）培養時に、凝集現象（aggregation）を起こす。
【００１３】
前記ヒトＢ細胞由来の細胞は、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入された細胞であって、ヒトＢ細胞、ヒトＢ細胞から誘導した細胞、他のヒトＢ細胞由来の細胞から誘導した細胞、または前記任意の体細胞分裂から得た細胞を含む。ここで、「から誘導した」には、正常な体細胞分裂、形質移入、細胞融合、または細胞を変形させたり新たな特性を有する細胞を製造するのに使われる他の遺伝子工学的な技術や、細胞生物学的な技術のような方法が含まれるが、これらに制限されるものではない。具体的には、ＥＢＶゲノムが細胞染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞は、ナマルワ細胞でありうる。かようなナマルワ細胞は、形質移入効率が低い一方、浮遊培養条件で、凝集なしに良好に成長する特徴がある。
【００１４】
ＥＢＶゲノムは、前述の通り、一般的なＢ細胞内で、エピソーム形態で存在するが、例外的に、ナマルワ細胞のようなＢ細胞では、細胞染色体に挿入された形態として存在する。本発明では、かような例外的であって独特の現象を活用し、ウイルス情報は続けて維持しつつ、ウイルスが生成されない安全な新たなヒト宿主細胞株を製造した。前記ＥＢＶゲノム遺伝子のうち、ｏｒｉＰ発現ベクターに必要なエプスタイン・バール核抗原１（ＥＢＮＡ１：Epstein Barr nuclear antigen １）遺伝子と、アポトーシス抑制（anti-apoptotic）現象を維持するＢＨＲＦ１遺伝子及びＢＡＬＦ１遺伝子（Cabras et al．，2005，J Clinical Virology 34：26-34）は、ナマルワ細胞で発現されるために、宿主細胞でもウイルス情報として有用に利用されうるのである。そして、溶菌サイクル（lytic cycle）遺伝子として、初期蛋白質発現を誘導するＢＺＬＦ１遺伝子（Countryman et al．，1987，J Virol，61：3672-3679）と、エピソーム状態のゲノムでのみ発現されるＬＭＰ２遺伝子（Sample et al．，J Virol 63：933-937）は、ナマルワ細胞で発現されないために、ウイルスが生成されない（M．Bernasconi et al．，Virology Journal，2006，3：43-57）安全な宿主細胞として製造できるのである。
【００１５】
本発明のヒト宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたために、ヒト胚芽腎臓由来の細胞、例えば、２９３細胞、並びにヒトＢ細胞由来の細胞、例えば、ナマルワ細胞それぞれの望ましい特性を共に保有する新たな細胞株である。付け加えて述べるならば、本発明によるヒト宿主細胞の確立のための細胞融合パートナーとして、２９３細胞を選択することによって、本発明のヒト宿主細胞は、形質移入効率が高く、かつさらに向上した蛋白質生産能を有することができる。また、ナマルワ細胞を他の細胞融合パートナーとして選択することによって、本発明のヒト宿主細胞は、浮遊培養が容易であるだけではなく、ウイルス生成の問題点がないので、安全であり、かつＥＢＮＡ１蛋白質が持続的に発現され、ｏｒｉＰ発現ベクターにＥＢＮＡ１遺伝子が必要なく、またはＢＨＲＦ１及びＢＡＬＦ１のようなウイルス性ｂｃｌ−２類似（homolog）遺伝子によってアポトーシス抑制活性を有することができる。
【００１６】
また、前記ヒトＢ細胞由来の細胞、望ましくはナマルワ細胞は、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性を有する細胞でありうる。ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ヒトＢ細胞由来の細胞との望ましい特性をいずれも保有することを特徴とする本発明のヒト宿主細胞の確立のためには、細胞融合後に、２つの細胞の望ましい特性をいずれも保有するクローンを選別する過程を経なければならない。ほとんどの細胞と同様に、ヒト胚芽腎臓由来の細胞、すなわち、２９３細胞は、ＨＡＴに耐性を有してＧ４１８に感受性がある性質を有するので、本発明では、前記のような選別のために、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性を有するヒトＢ細胞由来の細胞、望ましくは、ナマルワ細胞をその融合パートナーとして選択した。
【００１７】
本発明の一実施例では、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導された新たなヒト宿主細胞を開発するために、２９３細胞及びナマルワ細胞を利用した。まず、２９３細胞との細胞融合パートナーとして、ＨＡＴに感受性があってＧ４１８に耐性があるナマルワ細胞株を誘導するために、ナマルワ細胞株をウシ胎児血清（ＦＢＳ：fetal bovine serum）及び６−チオグアニンが添加された培地で培養した。数カ月にわたる選別期間の間、６−チオグアニンの濃度を高めつつ処理した後、ＨＡＴ含有培地に対する前記ナマルワ細胞の感受性を確認した。次に、ＨＡＴに感受性があるナマルワ細胞群に、ｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドを形質移入した後、Ｇ４１８に耐性を有する細胞群を選別し、最終的に２９３細胞との融合パートナーとして使用した。次に、文献（Kennett RH．Cell fusion Methods Enzymol 58：345-359；1979）に記載されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を利用した方法によって、２９３細胞とＨＡＴ感受性ナマルワ細胞との融合反応を行った。細胞融合反応は、前記方法に制限されるものではなく、当技術分野の一般的な方法によって行うことができる。
【００１８】
本発明者らは、前記２９３細胞とナマルワ細胞との融合過程から誘導された本発明によるヒト宿主細胞を、Ｆ２Ｎ（Fusion of 293 and Namalwa cells）と命名した。本発明者らは、本発明によるＦ２Ｎ細胞がＨＫＢ細胞と類似した特性を有するが、ＨＫＢ細胞とは異なり、ＥＢＶゲノムがＦ２Ｎ細胞の染色体内に挿入されているために、長期間細胞培養しても、ＥＢＶゲノムが消失されずに存在するであろうと予想した。これを証明するために、いくつかのＦ２Ｎクローンを選別し、無血清浮遊培養条件で１年以上培養した。その結果、無血清浮遊培養条件下で、１年以上培養させた細胞集団で、ほぼ１００％いずれもＥＢＮＡ１の発現が観察され（図５及び図６参照）、かような結果から、Ｆ２Ｎ細胞は、長い間培養しても、ＥＢＶゲノムが消失されずに維持されるという事実を確認することができた。
【００１９】
本発明の一実施例では、前記Ｆ２Ｎ細胞中で、形質移入の効率が高いクローンを選別するために、ＩｇＧを発現するｐＣＴ１３２ベクター（図３参照）をＦ２Ｎ細胞に形質移入させた後、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）を行い、細胞の抗体生産効率を比較した（図４参照）。一般的に、Ｆ２Ｎ細胞の形質移入効率が、２９３細胞の形質移入効率より高かった。さらに、それらのうち、特に形質移入効率が高く、無血清浮遊培養条件で良好に成長する１個のクローンを選択し、Ｆ２Ｎ７８と命名し、これを２００８年４月１１日付けで、大田市儒城区クァハクノ１１１番地に所在する韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ：Korean Collection for Type Cultures）に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１３０９ＢＰ）。
【００２０】
本発明の一実施例では、２９３細胞とナマルワ細胞との融合から誘導されたＦ２Ｎ細胞が目的とする望ましい特性を有しているか否かを確認するために、Ｆ２Ｎ７８細胞から抽出したｍＲＮＡで、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：reverse transcription-polymerase chain reaction）を行い、Ｆ２Ｎ７８クローンのＥＢＮＡ１、Ｉｇ−ｍｕ、Ｉｇ−ｋａｐｐａ及びＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴＩＩＩ：Ｎ−acetylglucosaminyl transferase ＩＩＩ）の発現いかんを確認した。その結果、Ｆ２Ｎ７８クローンがＥＢＮＡ１及びＧｎＴＩＩＩを発現し、ＩｇＭを発現しないことを確認することができた（図６参照）。また、本発明の一実施例では、蛋白質レベルで、ＥＢＮＡ１、ＩｇＭ及びα（２，６）−シアン酸転移酵素（α（２，６）ＳＴ：alpha(2,6)-sialyl transferase）の発現いかんを確認するために、蛍光免疫染色法（ＩＦ：immunofluorescence）を行い、そこからＦ２Ｎ７８細胞がＥＢＮＡ１及びα（２，６）ＳＴを発現する一方、ＩｇＭを発現しないことを確認した（図５参照）。ここで、ＥＢＮＡ１の発現は、それらＦ２ＮクローンにＥＢＶゲノムが存在することを意味し、ＧｎＴＩＩＩ及びα（２，６）ＳＴの発現は、人間と類似したグリコシル化プロファイルが持続的に示されるということを意味する。また、ＩｇＭの未発現は、ナマルワ細胞で観察されていた免疫グロブリンの発現が融合細胞であるＦ２Ｎ細胞では抑制されたことを意味するが、かような特性は、Ｆ２Ｎクローン、特に、Ｆ２Ｎ７８細胞から組換え治療用モノクローナル抗体を生産するのに必須要素に該当する。
【００２１】
従って、本発明のヒト宿主細胞は、ＥＢＮＡ１蛋白質を持続的に発現し、人間と類似したグリコシル化プロファイルに関与する酵素を発現し、ＩｇＭ蛋白質を発現しないヒト宿主細胞を提供する。
【００２２】
このように、本発明によるヒト宿主細胞は、ＥＢＮＡ１の安定した発現を提供する。ＥＢＮＡ１は、ほぼ３ｋｂサイズの遺伝子であり、細胞内のｏｒｉＰ発現ベクターの自律複製（autonomous replication）において必須不可欠な要素である。ＥＢＮＡ１がシス（cis）形態であっても、トランス（trans）形態であっても、細胞内にｏｒｉＰ発現ベクターと共に存在する場合であるならば、ｏｒｉＰ発現ベクターは、ヒト細胞内で正常に複製されうる。しかし、ＥＢＮＡ１がｏｒｉＰ発現ベクターと別個に存在（すなわち、トランス形態）ではなくして、ｏｒｉＰ発現ベクター内に位置する場合（すなわち、シス形態）には、その発現ベクターのサイズが大く過ぎて、ベクターＤＮＡ操作が容易ではなく、またＥＢＮＡ１遺伝子を含んだあらゆる遺伝子の効率的な発現に困難が伴いうる。しかし、本発明によるＦ２Ｎ７８細胞の場合は、細胞染色体に挿入されたＥＢＶゲノムからＥＢＮＡ１蛋白質が持続的に発現されるために、ｏｒｉＰプラスミド内にＥＢＮＡ１遺伝子が存在する必要がないので、ｏｒｉＰ発現ベクターの効率的な操作と、かようなベクターに含まれた遺伝子の発現とがさらに容易である。
【００２３】
また、本発明によるヒト宿主細胞は、人間と類似したグリコシル化プロファイルに関与する酵素を持続的に発現する。よって、本発明によるヒト宿主細胞から生産される蛋白質は、人間と類似したグリコシル化プロファイルを有するので、ＣＨＯ細胞のような非ヒト細胞で生産された蛋白質より、生体内免疫原性（immunogenicity）が低く、生体内半減期が長く、その結果、蛋白質医薬品の効率性を向上させることもできる。
【００２４】
また、本発明によるヒト宿主細胞は、ナマルワ細胞で発現されるＩｇＭ蛋白質を発現させない。よって、本発明によるヒト宿主細胞は、組換え治療用モノクローナル抗体の生産に必須な条件を有している。
【００２５】
本発明の一実施例では、Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制活性を確認するために、さまざまな濃度の酪酸ナトリウムを処理した。一般的に酪酸ナトリウムは、細胞培養時に、ＣＭＶ−プロモータまたはＳＶ４０−プロモータによる遺伝子発現レベルを上昇させる一方（Lee etal．，1993，Cell 72：73-84；Cockett et al．，1990，Bio/technology 8：662-667；Chang et al．，1999，Free Rad Res 30：85-91；Gorman et al．，1983，Nucl Acid Res11：7631-7648）、細胞周期（cell cycle）を停滞（arrest）させたり、細胞分化（differentiation）を誘導してアポトーシスを誘導したりもする（Cuisset et al．，1998，Biochem Biophy Res Commun 246：760-764；Cuisset et al．，1998，Biochem Biophy Res Commun 246：760-764）。しかし、本発明によるＦ２Ｎ７８細胞は、酪酸ナトリウム処理時にも、アポトーシス現象が抑制され、場合によっては、細胞成長率が同一細胞の対照群（０ｍＭ酪酸ナトリウム）より良好であった。対照群細胞としてのナマルワ細胞では、酪酸ナトリウム処理後に実験した全ての条件で、細胞生存率（viability）が低下し、細胞成長がそれ以上なされない現象が顕著に示され、２９３細胞では、高い濃度の酪酸ナトリウム処理時に、アポトーシス（apoptosis）現象が示された（図９参照）。
【００２６】
また、本発明の一実施例では、Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制的（anti-apoptotic）細胞成長を説明するために、ナマルワ細胞から由来したＥＢＶゲノム遺伝子に属するウイルス性ｂｃｌ−２類似因子であるＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１との発現いかんをＲＴ−ＰＣＲを行って確認した。その結果、図１０から分かるように、ナマルワ細胞の場合、酪酸ナトリウム処理群並びに未処理群のいずれでもＢＨＲＦ１が発現する一方、Ｆ２Ｎ７８細胞の場合は、いずれの側からもＢＨＲＦ１が発現しなかった。しかし、ＢＡＬＦ１は、酪酸ナトリウム処理いかんと関係なく、ナマルワ細胞及びＦ２Ｎ７８細胞いずれでも発現した。対照群としての２９３細胞では、ＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１とがいずれも発現しなかった。既存に発表されたさまざまな論文（Bellows et al．，2002，J Virol．76：2469-2479，Marshall et al．，1999，J Virol．73：5181-5185）によれば、ＢＨＲＦ１遺伝子及びＢＡＬＦ１遺伝子が同時に発現しとき、ＢＡＬＦ１は、ＢＨＲＦ１のアポトーシス抑制活性を阻害すると報告されている。これは、ナマルワ細胞で見られる現象である。従って、Ｆ２Ｎ７８細胞内で、ＢＡＬＦ１のみ発現されるということを示す前記実施例は、Ｆ２Ｎ７８細胞が有するアポトーシス抑制活性に係わる根拠になりうる。かような結果は、Ｆ２Ｎ７８以外の他のクローンでも観察された。これは、期待していなかった結果であり、具体的な理由やメカニズムについてはまだ明らかになっていない。
【００２７】
よって、本発明のヒト宿主細胞は、酪酸ナトリウム添加培養時に、アポトーシス抑制活性を示すヒト宿主細胞を提供する。これはさらに、本発明のヒト宿主細胞が、酪酸ナトリウムが添加されていない場合でも、長期間の回分培養（batch culture）条件で、自然に発生するアポトーシス現象に対する抵抗性を有することができることを意味する。
本発明の一実施例では、酪酸ナトリウム処理下で、Ｆ２Ｎ７８細胞の抗体生産性を確認するために、２種の抗体生産細胞株であるＣＨＯ細胞とＦ２Ｎ７８細胞とを比較した。酪酸ナトリウムを処理したＣＨＯ細胞株の場合、細胞成長は、対照群（０ｍＭ酪酸ナトリウム）と比較して、５０％まで減少し、生産性は、２倍ほど上昇した（図１１参照）。一方、酪酸ナトリウムを処理したＦ２Ｎ７８細胞株の場合、細胞成長率は、対照群（０ｍＭ酪酸ナトリウム）と比較して、最大２倍ほど上昇し、生産性も、対照群細胞（０ｍＭ酪酸ナトリウム）と比較して、４倍ないし５倍の高い上昇率を示した（図１２参照）。かような現象は、酪酸ナトリウムによるＦ２Ｎ７８細胞株のアポトーシス抑制現象が、細胞の抗体生産性上昇にも、影響を与えたものであると見ることができる。
【００２８】
本発明の一実施例では、Ｆ２Ｎ７８細胞内のｏｒｉＰ発現ベクターの抗体生産性を確認するために、Ｆ２Ｎ７８細胞に、ｐＣＴ１３２発現ベクターとｐＣＴ１２５発現ベクターとをそれぞれ形質移入させた後、抗体生産性を比較した。ここで、前記ｐＣＴ１２５発現ベクターは、プラスミド内にＥＢＮＡ１コーディング配列を含む一方、ｐＣＴ１３２発現ベクターは、プラスミド内にＥＢＮＡ１コーディング配列がないという差がある。図７から分かるように、ｐＣＴ１３２ベクターが形質移入された細胞は、ｐＣＴ１２５ベクターが形質移入された細胞と同等であるか、または多少優位な抗体生産性を示した。一般的には、新薬開発過程に必要な少量の蛋白質を短期間に生産するためには、一時的形質移入（transient transfection）による生産方法を使用することが有益である。従って、かような側面から見るとき、本発明によるヒト宿主細胞は、ＥＢＮＡ１が持続的に発現されるという点で、ｐＣＴ１３２のようなＥＢＮＡ１遺伝子のない発現ベクターを使用した一時的形質移入による新薬開発に、特に適した細胞株であると言える。
【００２９】
また本発明は、組換え蛋白質を生産するための前記ヒト宿主細胞を提供する。前記ヒト宿主細胞は、さまざまな種類の組換え蛋白質を発現するように、遺伝子工学的に改造されうる。前記組換え蛋白質は、人間治療用組換え蛋白質、望ましくは、治療用モノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体以外の治療用組換え蛋白質も含む。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
材料及び方法
１．細胞及びプラスミド
ヒト胚芽腎臓（２９３）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）及びナマルワ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３２）は、米国・微生物保存センター（ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection）からそれぞれ譲り受けた。
本発明に使われた発現ベクターの開裂（cleavage）地図は、図３に記載されている。
【００３１】
２．形質移入
細胞内の形質移入のために、電気穿孔法（electrophoration）及び陽イオン性ポリマー（cationic polymer）を利用した方法が使われた。
【００３２】
電気穿孔法：３ｘ１０６個の細胞をプラスミド１２μｇ[ｐＳＶ２neoベクター２μｇ、及びＭＡＲ（matrix attached region）配列を含むベクター１０μｇ］が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地３００μｌに懸濁（resuspension）した後、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅ ＩＩ electroporator（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用し、電気衝撃（２２０Ｖ／９６０microfarads）を与えた。その後、成長培地に懸濁させて７２時間経過後、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８と、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とを含有する選別培地で培養した。およそ１４日後に観察したところ、形質移入された細胞は、活発な成長を示す一方、対照群細胞は、それ以上成長しなかった。選別された細胞は、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を含む選別培地で、続けて培養した。ネオマイシン（Neomycin）遺伝子に特異的なプライマーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を行い、ネオマイシン遺伝子の存在を確認した。
【００３３】
陽イオン性ポリマーを利用した方法：陽イオン性ポリマーとしては、LipofectamineＴＭＬＴＸ（Invitrogen、１５３３８−１００）とFreeStyleＴＭＭａｘ（Invitrogen、１６４４７−１００）とを使用し、メーカーの使用説明書によって形質移入を行った。LipofectamineＴＭＬＴＸ試薬の場合、形質移入当日細胞の飽和度が６ウェルプレートで、ウェルの５０〜８０％になるように、前日に細胞を接種（seeding）した後、形質移入当日、２．５μｇのＤＮＡと６．２５μｌのＬＴＸとを使用して形質移入を進めた。FreeStyleＴＭＭａｘ試薬の場合、浮遊培養状態での形質移入に使用し、無血清培地のFreeStyle ２９３ Expression media（Invitrogen、１２３３８、以下、FreeStyle ２９３培地とする）、またはＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３ Serum free media（Sigma、１４５７１Ｃ、以下、ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地とする）で育つ細胞は、形質移入当日、１ｍｌ当たり１ｘ１０６個の細胞になるように、前日接種した。形質移入は、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ ＩＩ（Invitrogen、１２３０９）培地に、ＤＮＡとFreeStyleＴＭＭａｘ試薬とを、１：１の割合で使用して進めた。
【００３４】
３．蛍光免疫染色法（ＩＦ）
ＥＢＮＡ１の発現を感知するために、蛍光物質と間接的に結合して染色される方法である染色蛍光物質が接合された（conjugated）抗血清蛋白質（ＡＣＩＦ）（Reedman and Klein，1973；Fresen and zur Hausen，1976）との反応を行った。まず、スライドガラス上に塗抹された細胞を、−２０℃で５分間メタノールで固定させた。最初の反応抗体としては、抗ＥＢＮＡの力価（titer）の高いヒト血清を使用した。その後、ＥＢＮＡ１染色のシグナルを増大させるために、ヒト補体（血清蛋白質、complement）で処理し、蛍光物質が接合された抗ヒト補体Ｃ３抗体（ＦＩＴＣ−conjugated anti human complement Ｃ３ antibody、ＵＳBiological、Ｃ７８５０−１４Ｃ）で処理した。このように処理されたスライドをグリセロールとホスフェートバッファ（ＰＢＳ）とが１：１で混合された溶液で覆って仕上げた。
【００３５】
Ｉｇ−ｍｕとＩｇ−ｋａｐｐａとの発現を確認するために、それぞれ蛍光物質が接合された抗ヒトＩｇＭ抗体（ＦＩＴＣ−conjugated affinity-purified goat anti-human ＩｇＭ、mu chain specific、Sigma、Ｆ５３８４）と、蛍光物質が接合された抗ヒトkappa chain（Fluorescein anti-human kappa chain，affinity purified made in goat、Vector、ＦＩ−３０６０）を使用し、前記と類似した方法で細胞染色を行った。
また、α（２，６）ＳＴの蛋白質発現を確認するために、蛍光物質が接合されたサンブクスニグラ（Sambuicus nigra）レクチン（ＦＩＴＣ conjugated Sambucus nigra（Elderberry bark）−ＳＮＡ−１、ＥＹ laboratories、Ｆ−２６０２）で、前記と類似した方法で細胞を染色した。
【００３６】
４．ＥＢＮＡ１、ＧｎＴＩＩＩ、Ｉｇ−ｍｕ、ＢＡＬＦ１、ＢＨＲＦ１に対するＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮeasy(R)Plus Mini kit（Qiagen、７４１３４）を使用し、細胞からｍＲＮＡを抽出した後、OneStep ＲＴ−ＰＣＲ Kit（Qiagen、２１０２１２）を使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。それぞれのプライマー配列は、下記表１に表示した。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ system ９７００（Applied Biosystems）を使用して進め、ＲＴ−ＰＣＲ段階及び条件は、次の通りである：（ｉ）逆転写段階（５０℃で３０分、１サイクル）；（ｉｉ）逆転写酵素不活性化及びｃＤＮＡ変性（denaturation）段階（９５℃で１５分、１サイクル）；（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅段階（９４℃で３０秒、５２℃で１分、７２℃で３０秒、３５サイクル）；（ｉｖ）伸張段階（７２℃で１０分、１サイクル）。ＲＴ−ＰＣＲの生成物は、電気泳動でアガロースゲル上で確認した。
【００３７】
（表１）ＲＴ−ＰＣＲに使われたプライマーの配列
【００３８】
５．酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）
分泌される抗体の濃度は、酵素結合免疫吸収分析法によって測定された。まず、ヤギの抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃγ）（Jackson ImmunoReserarch、１０９−００６−０９８）を９６ウェル・マイクロタイタ（microtiter）プレート（Ｎｕｎｃ、４４９８２４）上に吸着させた。このプレートを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれたホスフェートバッファで処理してブロッキングした後、２倍ずつ連続して希釈したサンプルをプレートの各ウェルに入れた。室温で２時間インキュベーションした後、ヤギのペルオキシダーゼ標識抗−ヒトλ抗体（peroxidase-labeled goat anti-human λ antibody）（Sigma、Ａ５１７５）で処理した。室温で１時間インキュベーションした後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応させ、この反応を１Ｎ ＨＣｌで中止させた。スタンダード（standard）としては、骨髄腫プラズマで精製されたヒトＩｇＧ１λ（human ＩｇＧ１ lampda purified myeloma plasma）（Sigma、Ｉ５０２９）を２５０ｎｇ／ｍｌの濃度から使用した。プレートリーダ（Spectramax plus ３８４、Molecular Device）を使用し、４５０／５７０ｎｍで吸光度を読んで濃度を測定した。
【００３９】
実施例１：細胞融合によるヒト細胞株の確立
まず、細胞融合パートナーとして、ＨＡＴ（Sigma、Ｈ０２６２）に感受性があり、Ｇ４１８（Calbiochem、３４５８１０）に耐性があるナマルワ細胞株を誘導するために、ナマルワ細胞株を、１０％ＦＢＳ（Hyclone、ＳＨ３００７０．０３）及び６−チオグアニン（Sigma、Ａ４６６０）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。４ヵ月の選別期間の間、６−チオグアニンの濃度を５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌまで上昇させて処理した後、１ｘＨＡＴ含有培地に対する前記細胞の感受性を確認した。ＨＡＴに感受性があるナマルワ細胞群に、ｐＳＶ２neoプラスミドを形質移入した後、１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８に耐性を有する細胞群を選別し、細胞融合パートナーとして使用した。
【００４０】
細胞融合は、主に文献（Kennett RH．Cell fusion Methods Enzymol 58：345-359；1979）に記載されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を利用した方法によって進められた。対数増殖期にある４ｘ１０６個の２９３細胞と６ｘ１０６個のナマルワ細胞とを、カルシウム（Ｃａ２＋）とマグネシウム（Ｍｇ２＋）とのないホスフェートバッファで２回洗浄した後、５μｇ／ｍｌ濃度の落花生凝集素（peanut agglutinin、Sigma、Ｌ０８８１）で前処理された６ウェルプレートに接種した。細胞を接種した６ウェルプレートを、Beckman AllegraＴＭ Ｘ−１２Ｒ遠心分離器で、６分間４００ｇに遠心分離した。ウェルからホスフェートバッファを除去した後、ウェルにある細胞に２ｍｌの４０％ポリエチレングリコール（Sigma、Ｐ７７７７）を２分間処理した。対照群として、それらのうち１つのウェルの細胞は、ポリエチレングリコール処理を行わなかった。次の段階として、細胞を５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma、Ｄ２６５０）が添加された５ｍｌのホスフェートバッファで３回洗浄した後、ホスフェートバッファを利用し、さらに３回洗浄した。１５％ＦＢＳが添加されており、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＲＰＭＩ１６４０培地とを同量に混ぜた培地で細胞を処理した後、ＣＯ２インキュベータに３０分間静置させた。その後、培地を除去した後、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８、０．５ｘのＨＡＴ及び１５％ＦＢＳが添加されており、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＲＰＭＩ１６４０とが同量で混合されている選別培地で細胞を処理した後、９６ウェルプレートの各ウェル当たり１ｘ１０４個の細胞を接種した。一週間後、細胞接種時に使用した培地と同じ組成の新鮮な選別培地に交換した。接種２週間後には、Ｇ４１８とＨＡＴとの濃度がそれぞれ０．８ｍｇ／ｍｌと１ｘとに上昇した選別培地を細胞に供給した。接種して３週間経過後に観察したとき、対照群細胞は成長していない一方、融合細胞は成長した。それらのうち成長が速く、かつ健康に育つ９個のウェルにある細胞を混合し、それら細胞で９６ウェルプレートで制限希釈クローニング（ＬＤＣ：limiting dilution cloning）を進め、単一細胞クローン（ＳＣＣ：single cell clone）を確保した。制限希釈クローニング段階で、対数的に育つ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌの選別培地と共に１個の細胞を接種し、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８、１ｘＨＡＴ及び１５％ＦＢＳが添加された新鮮培地を選別培地として使用した。毎週１回ずつ新鮮な選別培地を細胞に供給し、１つの細胞が接種されて育っているか否かを確認するために、顕微鏡下で各ウェルを観察した。かような過程を介して、９７個の単一細胞クローンを確保し、これをＦ２Ｎと命名した。Ｆ２Ｎは、２９３細胞とナマルワ細胞との融合細胞を意味する。この段階で、それぞれのＦ２Ｎクローンの成長パターンは、底に若干吸着しつつも浮遊培養される性質を有しており、強く凝集されたパッチを形成するものとするとき、２９３細胞と多少類似している。
【００４１】
全てのクローンは、窒素タンクに冷凍保管され、それら全てのクローンでＥＢＮＡ１発現、ＩｇＭ発現そして形質移入効率を調べた。調査結果、全てのクローンがＥＢＮＡ１を発現することを確認した。ＥＢＮＡ１が発現されるということは、それらクローンにＥＢＶが存在することを意味する。また、全てのクローンは、ＩｇＭを発現しないことを確認し、これは、ナマルワ細胞の免疫グロブリン発現が融合細胞では、抑制されたことを意味する。さらに体系的な特徴分析のために、友好的な（favorable）成長パターンを示し、高い形質移入効率を有する１７個のクローンを選定した。ＩｇＧを発現するｐＣＴ１３２ベクターを使用して試験したとき、選定された１７個のＦ２Ｎクローンの形質移入効率は、２９３細胞の形質移入効率より高かった。１７個のＦ２Ｎクローンを選定する過程で、細胞が凝集して育つ単一細胞クローンは除外した（図２のＣ及びＤ参照）。
【００４２】
実施例２：Ｆ２Ｎ７８クローンの特徴究明
Ｆ２Ｎクローンの選別のために、一時的形質移入を利用し、一次的にＩｇＧの発現が高い１７個のクローンを選別し（図４Ａ）、それらクローンを対象に、二次スクリーニングを実施した（図４Ｂ）。それらのうちＩｇＧの発現が最も高いＦ２Ｎ７８クローンに対して、２９３細胞とＩｇＧとの生産性を比較するために、ｐＣＴ１３２ベクターを利用して一時的形質移入試験を反復的に行い、その結果、Ｆ２Ｎ７８細胞のＩｇＧ発現率が２９３細胞より２〜３倍高いということを確認した（図４Ｃ）。
【００４３】
一次選定された１７個のクローンいずれも、ＥＢＮＡ１の発現が陽性であり、ＩｇＭの発現は陰性であった。それら１７個の単一細胞クローンのうちＩｇＧ発現が高い順に、７個の単一細胞クローンを選別し、無血清培地を利用した浮遊培養条件の下に適応させた。無血清浮遊培養条件に適応された７個の単一細胞クローン内に、ＥＢＶゲノムが存在するか否かをＥＢＮＡ１の持続的な発現いかんを介して確認した。図５から分かるように、無血清浮遊培養条件下で１年以上育ったＦ２Ｎ７８細胞集団のほぼ１００％がＥＢＮＡ１発現に対して陽性を示した。治療用蛋白質の製造において、マスター細胞銀行（ＭＣＢ：master cell bank）とマスター製造用細胞銀行（ＭＷＣＢ：master working cell bank）とを設け、生産する期間を含んだ生産細胞クローンの分裂期間は、１年ほどならば十分である。
【００４４】
また、細胞内の重要な遺伝子の持続的な発現を調べるために、無血清培地を使用して浮遊培養で１年以上培養してきたＦ２Ｎ７８クローンを対象に、ＩＦ（図５参照）とＲＴ−ＰＣＲ（図６参照）とを行った。結果を整理すれば、次の通りである：（１）ＩＦでＥＢＮＡ１の発現を確認し、また２種の異なるプライマー対を利用したＲＴ−ＰＣＲを介して、ＥＢＮＡ１が発現されるということを再度確認し；（２）Ｉｇ−ｍｕは、前記ＩＦ及びＲＴ−ＰＣＲによって発現が消失したことを確認し、またＩＦで、Ｉｇ−ｋａｐｐａの発現が消失したことを確認し；（３）２種の異なるプライマー対を利用したＲＴ−ＰＣＲを介して、抗体依存性細胞障害（antibody dependant cellular cytotoxicity）と密接な関連があるbisectingＮ−アセチルグルコサミンの生成に関与するＧｎＴＩＩＩ（Campbell and Stanley、１９８４）の発現を確認し；（４）ＣＨＯ細胞には存在せずにてヒト細胞にだけ特殊に存在するα（２，６）ＳＴの発現もまたＩＦによって証明された。
【００４５】
実施例３：一時的形質移入
新薬開発過程に必要な蛋白質を短時間内に生産するためには、一時的形質移入による生産方法が使われている。このために、FreeStyle ２９３培地で浮遊培養されたＦ２Ｎ７８細胞と２９３細胞とを２つの異なる構造のｏｒｉＰ発現ベクター（ｐＣＴ１３２及びｐＣＴ１２５）で形質移入して抗体生産性を比較した。２つのベクターのうちｐＣＴ１３２は、プラスミド内にＥＢＮＡ１コーディング配列がなく、ｐＣＴ１２５は、ＥＢＮＡ１コーディング配列がプラスミド内に存在する。
【００４６】
図７から分かるように、ｐＣＴ１３２とｐＣＴ１２５とを、Ｆ２Ｎ７８細胞と２９３細胞とにそれぞれ形質移入した反復試験で、Ｆ２Ｎ７８細胞では、２つのベクターが類似した抗体生産性を示した一方、２９３細胞では、ｐＣＴ１２５がｐＣＴ１３２よりさらに高いＩｇＧ生産を示した。さらに、ｐＣＴ１３２ベクターで形質移入されたＦ２Ｎ７８細胞での生産量（２５μｇ／ｍｌ以上）は、ｐＣＴ１２５ベクターで形質移入された２９３細胞の生産量（１５μｇ／ｍｌ）より高かった。これは、Ｆ２Ｎ７８細胞でのＥＢＮＡ１遺伝子のないｐＣＴ１３２発現ベクターのＩｇＧ生産が、２９３細胞でのＥＢＮＡ１遺伝子があるｐＣＴ１２５発現ベクターのＩｇＧ生産より効率的であるという面を示している一方、ＥＢＮＡ１が発現されない２９３細胞では、ＥＢＮＡ１のあるｐＣＴ１２５発現ベクターが、ＥＢＮＡ１のないｐＣＴ１３２発現ベクターよりその効率性が高いということを示している。
【００４７】
かようなｐＣＴ１３２発現ベクターの効率性を高めるために、Ｆ２Ｎ７８細胞が良好に成長できるように、新たな培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地）に適応させた後、FreeStyle Max試薬を使用した一時的形質移入を行った。その結果、形質移入後の６日目に、１００μｇ／ｍｌほどの高い抗体生産性を示すことが反復試験を介して確認された（図８参照）。これは、本発明で開発したヒト細胞株が、すでに開発されている２９３細胞株より一時的形質移入での優秀性を意味する。
【００４８】
実施例４：Ｆ２Ｎ細胞に対する酪酸ナトリウム処理の効果
酪酸ナトリウム処理は、生産細胞株に２種の影響を及ぼす。さまざまな遺伝子上の過アセチル化（hyper-acetylation）を介して遺伝子発現を活性化させる一方、アポトーシスを誘導して細胞成長率を低下させる。かような現象を確認するために、ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地に適応させたＣＨＯ、２９３、ナマルワ及びＦ２Ｎ７８の細胞を１ｍｌ当たり３ｘ１０５個の細胞になるように接種した後、３日目に、さまざまな濃度（０，１，２及び４ｍＭ）の酪酸ナトリウムで処理した。
【００４９】
図９Ａないし図９Ｄから分かるように、ＣＨＯ細胞は、酪酸ナトリウムの濃度が高いほど細胞数と細胞生存率とが急落する現象が見られた。ナマルワ細胞もＣＨＯ細胞と同様に、処理した全ての濃度の酪酸ナトリウムで、細胞成長率と生存率とが急減することを確認した。これに対して２９３細胞は、低濃度（１ｍＭ及び２ｍＭ）の酪酸ナトリウムでは、細胞成長率に特に影響を受けず、高濃度（４ｍＭ）では、細胞成長率と生存率とがかなり低下した。しかし、Ｆ２Ｎ７８細胞は、試験した全ての条件で、細胞成長率と生存率とがいずれも低下せず、むしろ高濃度（４ｍＭ）の酪酸ナトリウムでは、その成長率と生存率とが上昇した。
【００５０】
Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制的な細胞成長を説明するために、ナマルワ細胞から由来したＥＢＶゲノム内に存在する２つのウイルス性ｂｃｌ２類似因子であるＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１との発現をＲＴ−ＰＣＲを介して確認した。図１０から分かるように、Ｆ２Ｎ７８細胞では、酪酸ナトリウム処理群並びに未処理群いずれでも、ＢＨＲＦ１は発現されず、ＢＡＬＦ１は発現されることを確認した。一方、ナマルワ細胞では、２種の遺伝子がいずれも発現されることを確認した。対照群として使用した２９３細胞では、ＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１とがいずれも発現していない。Ｆ２Ｎ７８細胞が、ナマルワ細胞から由来しているにもかかわらず、Ｆ２Ｎ７８細胞内では、ＢＨＲＦ１が発現しないという事実は、Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制的な細胞成長を説明できる根拠となる。既存に発表されたさまざまな報告によれば、ＢＨＲＦ１遺伝子とＢＡＬＦ１遺伝子とが共に発現されたとき、ＢＡＬＦ１は、ＢＨＲＦ１のアポトーシス抑制的活性を阻害するとのことである（Marshall et al．，1999，J Virol．73：5181-5185）。従って、Ｆ２Ｎ７８内で、ＢＡＬＦ１のみ発現されるという事実は、Ｆ２Ｎ７８細胞がアポトーシス抑制活性を有するということを意味する。しかし、ナマルワ細胞内では、２種の因子いずれも発現するために、Ｆ２Ｎ７８細胞とは異なり、アポトーシス抑制現象を確認できるものではないと考えられる。
【００５１】
次に、酪酸ナトリウムが細胞の抗体生産性に狂ぼす影響を確認するために、ＣＨＯ細胞とＦ２Ｎ７８細胞とからそれぞれ抗体生産細胞株を製造して比較した。ＣＨＯ＃２４７は、ＭＴＸ増幅過程を経て製作された抗体生産単一細胞株であり、Ｆ２Ｎ７８＿Ｉｇは、プロマイシン（puromycin）選別を経て製作された抗体生産細胞集団である。２つの細胞株をそれぞれ接種した後、３日目にさまざまな濃度（０，１，２，４ｍＭ）の酪酸ナトリウムを処理した。ＣＨＯ＃２４７の場合、酪酸ナトリウムを処理していない群と比較したとき、酪酸ナトリウム処理群の細胞成長は、５０％まで低下したが、生産性は、２倍近く上昇した（図１１参照）。一方、Ｆ２Ｎ７８＿Ｉｇの場合、酪酸ナトリウム処理を行っていない群に比べて、最大２倍ほどの細胞成長率上昇を示し、生産性面でも、４ないし５倍の上昇率を示した（図１２参照）。図１２から分かるように、Ｆ２Ｎ７８の抗体生産上昇率は、ＣＨＯ細胞株と比較するとき、さらに高い上昇率に該当する。かような現象は、酪酸ナトリウムに対するＦ２Ｎ７８細胞株のアポトーシス抑制効果が、細胞の抗体生産性上昇にさらに影響を与えて示されるものであると見られる。
【００５２】
討議
一般的に、ＥＢＶゲノムがウイルス・パーティクルを生成するために、ＥＢＶライフサイクルのエピソーム状態にある一方、ナマルワ細胞は、染色体に挿入された２つのコピーのＥＢＶゲノム（Henderson et al．，1983，PNAS USA 80：1987-1991及びRose et al．，2002，J．Clin．Microbiol．40：2533-2544）を有する。かような例外的な染色体内に、ＥＢＶゲノムが挿入された形態は、組換え蛋白質を生産する宿主細胞に２種のメリットを提供する。第一に、染色体に挿入されたＥＢＶゲノムからウイルス生成の恐れがないというメリットがあり、第二に、潜伏期（latent）のＥＢＮＡ１蛋白質並びにＢＡＬＦ１の初期遺伝子は持続的に発現される一方、ＢＨＲＦ１の発現は消失するＥＢＶ遺伝子の発現様相にそのメリットを見出すことができる。これと関連して、特にウイルス性ｂｃｌ−２と関連した２つの遺伝子のうり一つであるＢＨＲＦ１遺伝子の消失は、Ｆ２Ｎ７８クローンのアポトーシス抑制的成長を提示する予期できなかった結果である。また、ＥＢＮＡ１遺伝子の持続的な発現は、ＥＢＮＡ１遺伝子のないｏｒｉＰ発現ベクターを使用できるという長所として作用する。それ以外にも、ＧｎＴＩＩＩとα（２，６）ＳＴとの発現は、ヒト細胞としての特別のメリットを提供するものである。また、Ｉｇ−ｍｕｃｈａｉｎとＩｇ−kappa chainの発現が消失し、組換えモノクローナル抗体の製造においても、本発明によるヒト宿主細胞は有用である。
【００５３】
細胞致死率が低くなり、細胞成長期間が延びるということは、目的とする蛋白質（protein of interest）の生産量増加を意味するために、アポトーシス抑制的な細胞成長は、組換え蛋白質の生産を増大させるにおいて、非常に重要である。かような価値は、Ｆ２Ｎ７８細胞の培養時に、酪酸ナトリウムを処理した実験で確認することができ、場合によっては、酪酸ナトリウムをＦ２Ｎ７８細胞の治療用蛋白質の生産性を高めるのに使用することもできるというところにある。
【００５４】
以上、本発明について実施形態を用いて説明したが、それらは例示的なものに過ぎず、本技術分野の当業者ならば、本発明の範囲および趣旨から外れない範囲で多様な変更および変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、本発明の技術的範囲は、説明された実施形態によって定められず、特許請求の範囲によって定められねばならない。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第１プライマー（センス）
配列番号２：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第１プライマー（アンチセンス）
配列番号３：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第２プライマー（センス）
配列番号４：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第２プライマー（アンチセンス）
配列番号５：Ｉｇ−ｍｕ遺伝子のプライマー（センス）
配列番号６：Ｉｇ−ｍｕ遺伝子のプライマー（アンチセンス）
配列番号７：ＥＢＮＡ１遺伝子の第１プライマー（センス）
配列番号８：ＥＢＮＡ１遺伝子の第１プライマー（アンチセンス）
配列番号９：ＥＢＮＡ１遺伝子の第２プライマー（センス）
配列番号１０：ＥＢＮＡ１遺伝子の第２プライマー（アンチセンス）
配列番号１１：ＢＨＲＦ１遺伝子のプライマー（センス）
配列番号１２：ＢＨＲＦ１遺伝子のプライマー（アンチセンス）
配列番号１３：ＢＡＬＦ１遺伝子のプラーマー（センス）
配列番号１４：ＢＡＬＦ１遺伝子のプラーマー（アンチセンス）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優秀な組換え蛋白質を生産するためのヒト宿主細胞に係り、さらに具体的には、遺伝子工学技術を利用したヒト胚芽腎臓由来の細胞及びヒトＢ細胞由来の細胞の融合から誘導されたヒト宿主細胞に関するものであり、それらヒト宿主細胞は、安定化した特殊形質が良好に保存され、異種組換え蛋白質医薬品の生産に有用に利用されうる。
【背景技術】
【０００２】
最近までも、人間を治療するためのほとんどの組換え蛋白質医薬品は、人間ではない哺乳動物の細胞、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Chinese hamster ovary）、マウス黒色腫（ＮＳＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞などから生産されている。一方、ヒト細胞株を治療用組換え蛋白質の生産に使用しようとする試みがあったが、ヒト胚芽腎臓（human embryonic kidney）２９３細胞による活性蛋白質Ｃの生産（非特許文献１）、ナマルワ（Namalwa）細胞によるインターフェロン−ベータの生産（非特許文献２）、ＨＫＢ１１細胞による切断された形態の（truncated）組換えfactor ＶＩＩＩ及びさまざまな抗体の生産（非特許文献３）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（非特許文献４）による多数の抗体、及びウイルス性ＤＮＡの生産（非特許文献５及び非特許文献６）がその例である。
【０００３】
特許文献１及び特許文献２には、ＣＨＯ細胞内で発現させ難い蛋白質を生産するための代替方案として、ヒト宿主細胞であるＨＫＢ１１細胞が開示されている（非特許文献３、非特許文献７）。また、特許文献３及び特許文献４には、ＨＫＢ１１細胞によって切断された形態の組換えfactor ＶＩＩＩを生産する方法が開示されている。前記ＨＫＢ細胞は、ＨＨ５１４−１６から誘導された細胞株であって、Ｂ細胞不滅化能とウイルス生成能に欠陥があるエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ：Epstein Barr virus）ゲノムを含んでいる（非特許文献８）。かようなＨＫＢ細胞は、高密度の細胞成長、高効率の形質移入（transfection）、簡便なＭＴＸ誘導増幅、目的蛋白質の多量分泌、及びＩｇＭ発現の消失のような特性を示しているが、これは、組換え治療用蛋白質を生産するにあたって、望ましい特性であると言える。しかし、ＨＫＢ細胞の増殖培養過程で、ＥＢＶが細胞から分離される傾向があることを観察することになった（非特許文献９）。かような傾向性は、ＨＫＢ細胞がＥＢＶがない細胞になることが可能であり、その結果、異種遺伝子の効果的な発現に有用なさまざまな長所をそれ以上保有できないということを意味する。言い換えれば、ＨＫＢ細胞の場合、長期間培養することになればＥＢＶが消失し、組換え治療用蛋白質生産のための望ましい特性を発揮できないという問題点がある。
【０００４】
このために、本発明者らは、前記問題点を解決するために研究を繰り返していて、ナマルワ細胞の場合、ＥＢＶゲノムがエピソーム（episome）形態で存在せずに、細胞染色体に挿入されている（非特許文献１０、非特許文献１１及び非特許文献１２）という点に着眼し、ナマルワ細胞を利用し、ウイルスが生成される安全性に対する問題は解決しつつ、ＥＢＶの情報は続けて維持できる新たなヒト宿主細胞のクローンを確立し、前記ヒト宿主細胞の優秀性を究明することによって、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，１３６，５９９号明細書
【特許文献２】大韓民国特許第６２７，７５３号公報
【特許文献３】米国特許６，３５８，７０３Ｂ１号明細書
【特許文献４】大韓民国特許第６１６，０２８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Eli Lylly，2001
【非特許文献２】Wellcome Research Laboratory，1999
【非特許文献３】Cho et al．，2003，Biotech．Prog 19: 229-232
【非特許文献４】Fallaux et al．，1998，Human Gene Therapy，9：1909-1917
【非特許文献５】Jones et al．，2003，Biotechnol．Prog．19：163-168
【非特許文献６】Xie et al．，2003，Biotech．Bioeng．83：45-52
【非特許文献７】Cho and Chan，2002，Biomedical Science 9：631-638
【非特許文献８】Rabson et al．，1983，PNAS USA 87：3660-3664
【非特許文献９】Chang et al．，2002，J Virol．76：3168-3178
【非特許文献１０】Matsuo et al．，Science 14 December 1984：1322-1325
【非特許文献１１】Henderson et al．，1983，PNAS USA 80：1987-1991
【非特許文献１２】Rose et al．，2002，J．Clin．Microbiol．40：2533-2544
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞を提供することである。
本発明の他の目的は、組換え蛋白質を生産するための用途の前記ヒト宿主細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のような目的を達成するために、本発明は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、モノクローナル（monoclonal）抗体を含んだ組換え蛋白質を生産するための用途の前記ヒト宿主細胞を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導された新たなヒト宿主細胞を確立した。本発明によるヒト宿主細胞を利用し、短時間に研究用蛋白質を供給できるだけではなく、量的及び質的な側面で、非常にすぐれた人間治療に適した異種組換え蛋白質医薬品を生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｆ２Ｎ細胞融合過程及びＦ２Ｎ７８クローン選別過程の概括図である。
【図２】ＡないしＤは、初期段階でのＦ２Ｎクローンのさまざまな成長パターンを示し、塊りを形成する成長パターンを示すクローン（Ｃ及びＤ）は、選別過程から除外した。
【図３】本発明で使われた発現ベクターの開裂地図を示し、あらゆるベクターは、ｐＣＴベクターを基本骨格として構築している。
【図４Ａ】ＩｇＧ発現が高いＦ２Ｎクローンを選別するために、一時的形質移入を行った結果を示し、一次スクリーニングした結果である。
【図４Ｂ】ＩｇＧ発現が高いＦ２Ｎクローンを選別するために、一時的形質移入を行った結果を示し、一次選別された１７個のクローンを対象に二次スクリーニングした結果である。
【図４Ｃ】ＩｇＧ発現が高いＦ２Ｎクローンを選別するために、一時的形質移入を行った結果を示し、最終選別されたＦ２Ｎ７８細胞のＩｇＧ生産性を、２９３細胞と比較した結果（３回反復実験を行う）である。
【図５Ａ】蛍光免疫染色法を利用し、Ｉｇ−ｍｕとＩｇ−ｋａｐｐａとの発現有無を確認した結果を示すイメージである。
【図５Ｂ】蛍光免疫染色法を利用し、ＥＢＮＡ１とα（２，６）−ＳＴとの発現有無を確認した結果を示すイメージである。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）を利用し、Ｆ２Ｎ９８細胞で、ＧｎｔＩＩＩ、Ｉｇ−ｍｕ及びＥＢＮＡ１の発現いかんを確認した結果を示し、ナマルワ、２９３及びＣＨＯ細胞を陰性対照群として使用し、ＧｎｔＩＩＩ、Ｉｇ−ｍｕ及びＥＢＮＡ１蛋白質の特異的なプライマー対は、表１に整理してある。
【図７】Ｆ２Ｎ７８細胞と２９３細胞とを比較し、ｏｒｉＰ発現ベクター（ｐＣＴ１２５及びｐＣＴ１３２）の抗体生産性を確認した結果を示すグラフである。
【図８】Ｆ２Ｎ７８細胞をＥＢＮＡ１遺伝子のない発現ベクターであるｐＣＴ１３２で一時的形質移入して得た抗体生産性の結果を示すグラフであり、４回反復実験を行った。
【図９Ａ】ＣＨＯ細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図９Ｂ】ナマルワ細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図９Ｃ】２９３細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図９Ｄ】Ｆ２Ｎ７８細胞の細胞成長に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図１０】酪酸ナトリウム処理によるＦ２Ｎ７８細胞、ナマルワ細胞及び２９３細胞でのＢＨＲＦ１及びＢＡＬＦ１の発現いかんを、ＲＴ−ＰＣＲを利用して確認した結果を示し、ここで０、１及び４は、それぞれ細胞培養培地に添加した酪酸ナトリウムの濃度（ｍＭ）である。
【図１１】ＣＨＯ＃２４７細胞の抗体生産性に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【図１２】Ｆ２Ｎ７８＿Ｉｇ細胞の抗体生産性に対する酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のヒト宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞（human embryonic kidney-derived cell）と、ＥＢＶ（Epstein-Barr virus）ゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合（fusion）から誘導されたことを特徴とする。
【００１２】
前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞は、ヒト胚芽腎臓細胞、ヒト胚芽腎臓細胞から誘導した細胞、他のヒト胚芽腎臓由来の細胞から誘導した細胞、または前記任意の体細胞分裂から得た細胞を含む。ここで、「から誘導した」には、正常な体細胞分裂（mitotic division）、形質移入（transfection）、細胞融合、または細胞を変形させたり新たな特性を有する細胞を製造するのに使われる他の遺伝子工学的な技術や、細胞生物学的な技術のような方法が含まれるが、これらに制限されるものではない。具体的には、前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞は、２９３由来細胞、望ましくは、２９３細胞でありうる。かような２９３細胞は、高い形質移入効率性と、高レベルの蛋白質生産能とを示す一方、無血清浮遊（suspension）培養時に、凝集現象（aggregation）を起こす。
【００１３】
前記ヒトＢ細胞由来の細胞は、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入された細胞であって、ヒトＢ細胞、ヒトＢ細胞から誘導した細胞、他のヒトＢ細胞由来の細胞から誘導した細胞、または前記任意の体細胞分裂から得た細胞を含む。ここで、「から誘導した」には、正常な体細胞分裂、形質移入、細胞融合、または細胞を変形させたり新たな特性を有する細胞を製造するのに使われる他の遺伝子工学的な技術や、細胞生物学的な技術のような方法が含まれるが、これらに制限されるものではない。具体的には、ＥＢＶゲノムが細胞染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞は、ナマルワ細胞でありうる。かようなナマルワ細胞は、形質移入効率が低い一方、浮遊培養条件で、凝集なしに良好に成長する特徴がある。
【００１４】
ＥＢＶゲノムは、前述の通り、一般的なＢ細胞内で、エピソーム形態で存在するが、例外的に、ナマルワ細胞のようなＢ細胞では、細胞染色体に挿入された形態として存在する。本発明では、かような例外的であって独特の現象を活用し、ウイルス情報は続けて維持しつつ、ウイルスが生成されない安全な新たなヒト宿主細胞株を製造した。前記ＥＢＶゲノム遺伝子のうち、ｏｒｉＰ発現ベクターに必要なエプスタイン・バール核抗原１（ＥＢＮＡ１：Epstein Barr nuclear antigen １）遺伝子と、アポトーシス抑制（anti-apoptotic）現象を維持するＢＨＲＦ１遺伝子及びＢＡＬＦ１遺伝子（Cabras et al．，2005，J Clinical Virology 34：26-34）は、ナマルワ細胞で発現されるために、宿主細胞でもウイルス情報として有用に利用されうるのである。そして、溶菌サイクル（lytic cycle）遺伝子として、初期蛋白質発現を誘導するＢＺＬＦ１遺伝子（Countryman et al．，1987，J Virol，61：3672-3679）と、エピソーム状態のゲノムでのみ発現されるＬＭＰ２遺伝子（Sample et al．，J Virol 63：933-937）は、ナマルワ細胞で発現されないために、ウイルスが生成されない（M．Bernasconi et al．，Virology Journal，2006，3：43-57）安全な宿主細胞として製造できるのである。
【００１５】
本発明のヒト宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ＥＢＶゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたために、ヒト胚芽腎臓由来の細胞、例えば、２９３細胞、並びにヒトＢ細胞由来の細胞、例えば、ナマルワ細胞それぞれの望ましい特性を共に保有する新たな細胞株である。付け加えて述べるならば、本発明によるヒト宿主細胞の確立のための細胞融合パートナーとして、２９３細胞を選択することによって、本発明のヒト宿主細胞は、形質移入効率が高く、かつさらに向上した蛋白質生産能を有することができる。また、ナマルワ細胞を他の細胞融合パートナーとして選択することによって、本発明のヒト宿主細胞は、浮遊培養が容易であるだけではなく、ウイルス生成の問題点がないので、安全であり、かつＥＢＮＡ１蛋白質が持続的に発現され、ｏｒｉＰ発現ベクターにＥＢＮＡ１遺伝子が必要なく、またはＢＨＲＦ１及びＢＡＬＦ１のようなウイルス性ｂｃｌ−２類似（homolog）遺伝子によってアポトーシス抑制活性を有することができる。
【００１６】
また、前記ヒトＢ細胞由来の細胞、望ましくはナマルワ細胞は、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性を有する細胞でありうる。ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ヒトＢ細胞由来の細胞との望ましい特性をいずれも保有することを特徴とする本発明のヒト宿主細胞の確立のためには、細胞融合後に、２つの細胞の望ましい特性をいずれも保有するクローンを選別する過程を経なければならない。ほとんどの細胞と同様に、ヒト胚芽腎臓由来の細胞、すなわち、２９３細胞は、ＨＡＴに耐性を有してＧ４１８に感受性がある性質を有するので、本発明では、前記のような選別のために、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性を有するヒトＢ細胞由来の細胞、望ましくは、ナマルワ細胞をその融合パートナーとして選択した。
【００１７】
本発明の一実施例では、ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、ヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導された新たなヒト宿主細胞を開発するために、２９３細胞及びナマルワ細胞を利用した。まず、２９３細胞との細胞融合パートナーとして、ＨＡＴに感受性があってＧ４１８に耐性があるナマルワ細胞株を誘導するために、ナマルワ細胞株をウシ胎児血清（ＦＢＳ：fetal bovine serum）及び６−チオグアニンが添加された培地で培養した。数カ月にわたる選別期間の間、６−チオグアニンの濃度を高めつつ処理した後、ＨＡＴ含有培地に対する前記ナマルワ細胞の感受性を確認した。次に、ＨＡＴに感受性があるナマルワ細胞群に、ｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドを形質移入した後、Ｇ４１８に耐性を有する細胞群を選別し、最終的に２９３細胞との融合パートナーとして使用した。次に、文献（Kennett RH．Cell fusion Methods Enzymol 58：345-359；1979）に記載されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を利用した方法によって、２９３細胞とＨＡＴ感受性ナマルワ細胞との融合反応を行った。細胞融合反応は、前記方法に制限されるものではなく、当技術分野の一般的な方法によって行うことができる。
【００１８】
本発明者らは、前記２９３細胞とナマルワ細胞との融合過程から誘導された本発明によるヒト宿主細胞を、Ｆ２Ｎ（Fusion of 293 and Namalwa cells）と命名した。本発明者らは、本発明によるＦ２Ｎ細胞がＨＫＢ細胞と類似した特性を有するが、ＨＫＢ細胞とは異なり、ＥＢＶゲノムがＦ２Ｎ細胞の染色体内に挿入されているために、長期間細胞培養しても、ＥＢＶゲノムが消失されずに存在するであろうと予想した。これを証明するために、いくつかのＦ２Ｎクローンを選別し、無血清浮遊培養条件で１年以上培養した。その結果、無血清浮遊培養条件下で、１年以上培養させた細胞集団で、ほぼ１００％いずれもＥＢＮＡ１の発現が観察され（図５及び図６参照）、かような結果から、Ｆ２Ｎ細胞は、長い間培養しても、ＥＢＶゲノムが消失されずに維持されるという事実を確認することができた。
【００１９】
本発明の一実施例では、前記Ｆ２Ｎ細胞中で、形質移入の効率が高いクローンを選別するために、ＩｇＧを発現するｐＣＴ１３２ベクター（図３参照）をＦ２Ｎ細胞に形質移入させた後、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）を行い、細胞の抗体生産効率を比較した（図４参照）。一般的に、Ｆ２Ｎ細胞の形質移入効率が、２９３細胞の形質移入効率より高かった。さらに、それらのうち、特に形質移入効率が高く、無血清浮遊培養条件で良好に成長する１個のクローンを選択し、Ｆ２Ｎ７８と命名し、これを２００８年４月１１日付けで、大田市儒城区クァハクノ１１１番地に所在する韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ：Korean Collection for Type Cultures）に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１３０９ＢＰ）。
【００２０】
本発明の一実施例では、２９３細胞とナマルワ細胞との融合から誘導されたＦ２Ｎ細胞が目的とする望ましい特性を有しているか否かを確認するために、Ｆ２Ｎ７８細胞から抽出したｍＲＮＡで、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：reverse transcription-polymerase chain reaction）を行い、Ｆ２Ｎ７８クローンのＥＢＮＡ１、Ｉｇ−ｍｕ、Ｉｇ−ｋａｐｐａ及びＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴＩＩＩ：Ｎ−acetylglucosaminyl transferase ＩＩＩ）の発現いかんを確認した。その結果、Ｆ２Ｎ７８クローンがＥＢＮＡ１及びＧｎＴＩＩＩを発現し、ＩｇＭを発現しないことを確認することができた（図６参照）。また、本発明の一実施例では、蛋白質レベルで、ＥＢＮＡ１、ＩｇＭ及びα（２，６）−シアン酸転移酵素（α（２，６）ＳＴ：alpha(2,6)-sialyl transferase）の発現いかんを確認するために、蛍光免疫染色法（ＩＦ：immunofluorescence）を行い、そこからＦ２Ｎ７８細胞がＥＢＮＡ１及びα（２，６）ＳＴを発現する一方、ＩｇＭを発現しないことを確認した（図５参照）。ここで、ＥＢＮＡ１の発現は、それらＦ２ＮクローンにＥＢＶゲノムが存在することを意味し、ＧｎＴＩＩＩ及びα（２，６）ＳＴの発現は、人間と類似したグリコシル化プロファイルが持続的に示されるということを意味する。また、ＩｇＭの未発現は、ナマルワ細胞で観察されていた免疫グロブリンの発現が融合細胞であるＦ２Ｎ細胞では抑制されたことを意味するが、かような特性は、Ｆ２Ｎクローン、特に、Ｆ２Ｎ７８細胞から組換え治療用モノクローナル抗体を生産するのに必須要素に該当する。
【００２１】
従って、本発明のヒト宿主細胞は、ＥＢＮＡ１蛋白質を持続的に発現し、人間と類似したグリコシル化プロファイルに関与する酵素を発現し、ＩｇＭ蛋白質を発現しないヒト宿主細胞を提供する。
【００２２】
このように、本発明によるヒト宿主細胞は、ＥＢＮＡ１の安定した発現を提供する。ＥＢＮＡ１は、ほぼ３ｋｂサイズの遺伝子であり、細胞内のｏｒｉＰ発現ベクターの自律複製（autonomous replication）において必須不可欠な要素である。ＥＢＮＡ１がシス（cis）形態であっても、トランス（trans）形態であっても、細胞内にｏｒｉＰ発現ベクターと共に存在する場合であるならば、ｏｒｉＰ発現ベクターは、ヒト細胞内で正常に複製されうる。しかし、ＥＢＮＡ１がｏｒｉＰ発現ベクターと別個に存在（すなわち、トランス形態）ではなくして、ｏｒｉＰ発現ベクター内に位置する場合（すなわち、シス形態）には、その発現ベクターのサイズが大く過ぎて、ベクターＤＮＡ操作が容易ではなく、またＥＢＮＡ１遺伝子を含んだあらゆる遺伝子の効率的な発現に困難が伴いうる。しかし、本発明によるＦ２Ｎ７８細胞の場合は、細胞染色体に挿入されたＥＢＶゲノムからＥＢＮＡ１蛋白質が持続的に発現されるために、ｏｒｉＰプラスミド内にＥＢＮＡ１遺伝子が存在する必要がないので、ｏｒｉＰ発現ベクターの効率的な操作と、かようなベクターに含まれた遺伝子の発現とがさらに容易である。
【００２３】
また、本発明によるヒト宿主細胞は、人間と類似したグリコシル化プロファイルに関与する酵素を持続的に発現する。よって、本発明によるヒト宿主細胞から生産される蛋白質は、人間と類似したグリコシル化プロファイルを有するので、ＣＨＯ細胞のような非ヒト細胞で生産された蛋白質より、生体内免疫原性（immunogenicity）が低く、生体内半減期が長く、その結果、蛋白質医薬品の効率性を向上させることもできる。
【００２４】
また、本発明によるヒト宿主細胞は、ナマルワ細胞で発現されるＩｇＭ蛋白質を発現させない。よって、本発明によるヒト宿主細胞は、組換え治療用モノクローナル抗体の生産に必須な条件を有している。
【００２５】
本発明の一実施例では、Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制活性を確認するために、さまざまな濃度の酪酸ナトリウムを処理した。一般的に酪酸ナトリウムは、細胞培養時に、ＣＭＶ−プロモータまたはＳＶ４０−プロモータによる遺伝子発現レベルを上昇させる一方（Lee etal．，1993，Cell 72：73-84；Cockett et al．，1990，Bio/technology 8：662-667；Chang et al．，1999，Free Rad Res 30：85-91；Gorman et al．，1983，Nucl Acid Res11：7631-7648）、細胞周期（cell cycle）を停滞（arrest）させたり、細胞分化（differentiation）を誘導してアポトーシスを誘導したりもする（Cuisset et al．，1998，Biochem Biophy Res Commun 246：760-764；Cuisset et al．，1998，Biochem Biophy Res Commun 246：760-764）。しかし、本発明によるＦ２Ｎ７８細胞は、酪酸ナトリウム処理時にも、アポトーシス現象が抑制され、場合によっては、細胞成長率が同一細胞の対照群（０ｍＭ酪酸ナトリウム）より良好であった。対照群細胞としてのナマルワ細胞では、酪酸ナトリウム処理後に実験した全ての条件で、細胞生存率（viability）が低下し、細胞成長がそれ以上なされない現象が顕著に示され、２９３細胞では、高い濃度の酪酸ナトリウム処理時に、アポトーシス（apoptosis）現象が示された（図９参照）。
【００２６】
また、本発明の一実施例では、Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制的（anti-apoptotic）細胞成長を説明するために、ナマルワ細胞から由来したＥＢＶゲノム遺伝子に属するウイルス性ｂｃｌ−２類似因子であるＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１との発現いかんをＲＴ−ＰＣＲを行って確認した。その結果、図１０から分かるように、ナマルワ細胞の場合、酪酸ナトリウム処理群並びに未処理群のいずれでもＢＨＲＦ１が発現する一方、Ｆ２Ｎ７８細胞の場合は、いずれの側からもＢＨＲＦ１が発現しなかった。しかし、ＢＡＬＦ１は、酪酸ナトリウム処理いかんと関係なく、ナマルワ細胞及びＦ２Ｎ７８細胞いずれでも発現した。対照群としての２９３細胞では、ＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１とがいずれも発現しなかった。既存に発表されたさまざまな論文（Bellows et al．，2002，J Virol．76：2469-2479，Marshall et al．，1999，J Virol．73：5181-5185）によれば、ＢＨＲＦ１遺伝子及びＢＡＬＦ１遺伝子が同時に発現しとき、ＢＡＬＦ１は、ＢＨＲＦ１のアポトーシス抑制活性を阻害すると報告されている。これは、ナマルワ細胞で見られる現象である。従って、Ｆ２Ｎ７８細胞内で、ＢＡＬＦ１のみ発現されるということを示す前記実施例は、Ｆ２Ｎ７８細胞が有するアポトーシス抑制活性に係わる根拠になりうる。かような結果は、Ｆ２Ｎ７８以外の他のクローンでも観察された。これは、期待していなかった結果であり、具体的な理由やメカニズムについてはまだ明らかになっていない。
【００２７】
よって、本発明のヒト宿主細胞は、酪酸ナトリウム添加培養時に、アポトーシス抑制活性を示すヒト宿主細胞を提供する。これはさらに、本発明のヒト宿主細胞が、酪酸ナトリウムが添加されていない場合でも、長期間の回分培養（batch culture）条件で、自然に発生するアポトーシス現象に対する抵抗性を有することができることを意味する。
本発明の一実施例では、酪酸ナトリウム処理下で、Ｆ２Ｎ７８細胞の抗体生産性を確認するために、２種の抗体生産細胞株であるＣＨＯ細胞とＦ２Ｎ７８細胞とを比較した。酪酸ナトリウムを処理したＣＨＯ細胞株の場合、細胞成長は、対照群（０ｍＭ酪酸ナトリウム）と比較して、５０％まで減少し、生産性は、２倍ほど上昇した（図１１参照）。一方、酪酸ナトリウムを処理したＦ２Ｎ７８細胞株の場合、細胞成長率は、対照群（０ｍＭ酪酸ナトリウム）と比較して、最大２倍ほど上昇し、生産性も、対照群細胞（０ｍＭ酪酸ナトリウム）と比較して、４倍ないし５倍の高い上昇率を示した（図１２参照）。かような現象は、酪酸ナトリウムによるＦ２Ｎ７８細胞株のアポトーシス抑制現象が、細胞の抗体生産性上昇にも、影響を与えたものであると見ることができる。
【００２８】
本発明の一実施例では、Ｆ２Ｎ７８細胞内のｏｒｉＰ発現ベクターの抗体生産性を確認するために、Ｆ２Ｎ７８細胞に、ｐＣＴ１３２発現ベクターとｐＣＴ１２５発現ベクターとをそれぞれ形質移入させた後、抗体生産性を比較した。ここで、前記ｐＣＴ１２５発現ベクターは、プラスミド内にＥＢＮＡ１コーディング配列を含む一方、ｐＣＴ１３２発現ベクターは、プラスミド内にＥＢＮＡ１コーディング配列がないという差がある。図７から分かるように、ｐＣＴ１３２ベクターが形質移入された細胞は、ｐＣＴ１２５ベクターが形質移入された細胞と同等であるか、または多少優位な抗体生産性を示した。一般的には、新薬開発過程に必要な少量の蛋白質を短期間に生産するためには、一時的形質移入（transient transfection）による生産方法を使用することが有益である。従って、かような側面から見るとき、本発明によるヒト宿主細胞は、ＥＢＮＡ１が持続的に発現されるという点で、ｐＣＴ１３２のようなＥＢＮＡ１遺伝子のない発現ベクターを使用した一時的形質移入による新薬開発に、特に適した細胞株であると言える。
【００２９】
また本発明は、組換え蛋白質を生産するための前記ヒト宿主細胞を提供する。前記ヒト宿主細胞は、さまざまな種類の組換え蛋白質を発現するように、遺伝子工学的に改造されうる。前記組換え蛋白質は、人間治療用組換え蛋白質、望ましくは、治療用モノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体以外の治療用組換え蛋白質も含む。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
材料及び方法
１．細胞及びプラスミド
ヒト胚芽腎臓（２９３）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）及びナマルワ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３２）は、米国・微生物保存センター（ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection）からそれぞれ譲り受けた。
本発明に使われた発現ベクターの開裂（cleavage）地図は、図３に記載されている。
【００３１】
２．形質移入
細胞内の形質移入のために、電気穿孔法（electrophoration）及び陽イオン性ポリマー（cationic polymer）を利用した方法が使われた。
【００３２】
電気穿孔法：３ｘ１０６個の細胞をプラスミド１２μｇ[ｐＳＶ２neoベクター２μｇ、及びＭＡＲ（matrix attached region）配列を含むベクター１０μｇ］が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地３００μｌに懸濁（resuspension）した後、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅ ＩＩ electroporator（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用し、電気衝撃（２２０Ｖ／９６０microfarads）を与えた。その後、成長培地に懸濁させて７２時間経過後、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８と、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とを含有する選別培地で培養した。およそ１４日後に観察したところ、形質移入された細胞は、活発な成長を示す一方、対照群細胞は、それ以上成長しなかった。選別された細胞は、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を含む選別培地で、続けて培養した。ネオマイシン（Neomycin）遺伝子に特異的なプライマーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を行い、ネオマイシン遺伝子の存在を確認した。
【００３３】
陽イオン性ポリマーを利用した方法：陽イオン性ポリマーとしては、LipofectamineＴＭＬＴＸ（Invitrogen、１５３３８−１００）とFreeStyleＴＭＭａｘ（Invitrogen、１６４４７−１００）とを使用し、メーカーの使用説明書によって形質移入を行った。LipofectamineＴＭＬＴＸ試薬の場合、形質移入当日細胞の飽和度が６ウェルプレートで、ウェルの５０〜８０％になるように、前日に細胞を接種（seeding）した後、形質移入当日、２．５μｇのＤＮＡと６．２５μｌのＬＴＸとを使用して形質移入を進めた。FreeStyleＴＭＭａｘ試薬の場合、浮遊培養状態での形質移入に使用し、無血清培地のFreeStyle ２９３ Expression media（Invitrogen、１２３３８、以下、FreeStyle ２９３培地とする）、またはＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３ Serum free media（Sigma、１４５７１Ｃ、以下、ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地とする）で育つ細胞は、形質移入当日、１ｍｌ当たり１ｘ１０６個の細胞になるように、前日接種した。形質移入は、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ ＩＩ（Invitrogen、１２３０９）培地に、ＤＮＡとFreeStyleＴＭＭａｘ試薬とを、１：１の割合で使用して進めた。
【００３４】
３．蛍光免疫染色法（ＩＦ）
ＥＢＮＡ１の発現を感知するために、蛍光物質と間接的に結合して染色される方法である染色蛍光物質が接合された（conjugated）抗血清蛋白質（ＡＣＩＦ）（Reedman and Klein，1973；Fresen and zur Hausen，1976）との反応を行った。まず、スライドガラス上に塗抹された細胞を、−２０℃で５分間メタノールで固定させた。最初の反応抗体としては、抗ＥＢＮＡの力価（titer）の高いヒト血清を使用した。その後、ＥＢＮＡ１染色のシグナルを増大させるために、ヒト補体（血清蛋白質、complement）で処理し、蛍光物質が接合された抗ヒト補体Ｃ３抗体（ＦＩＴＣ−conjugated anti human complement Ｃ３ antibody、ＵＳBiological、Ｃ７８５０−１４Ｃ）で処理した。このように処理されたスライドをグリセロールとホスフェートバッファ（ＰＢＳ）とが１：１で混合された溶液で覆って仕上げた。
【００３５】
Ｉｇ−ｍｕとＩｇ−ｋａｐｐａとの発現を確認するために、それぞれ蛍光物質が接合された抗ヒトＩｇＭ抗体（ＦＩＴＣ−conjugated affinity-purified goat anti-human ＩｇＭ、mu chain specific、Sigma、Ｆ５３８４）と、蛍光物質が接合された抗ヒトkappa chain（Fluorescein anti-human kappa chain，affinity purified made in goat、Vector、ＦＩ−３０６０）を使用し、前記と類似した方法で細胞染色を行った。
また、α（２，６）ＳＴの蛋白質発現を確認するために、蛍光物質が接合されたサンブクスニグラ（Sambuicus nigra）レクチン（ＦＩＴＣ conjugated Sambucus nigra（Elderberry bark）−ＳＮＡ−１、ＥＹ laboratories、Ｆ−２６０２）で、前記と類似した方法で細胞を染色した。
【００３６】
４．ＥＢＮＡ１、ＧｎＴＩＩＩ、Ｉｇ−ｍｕ、ＢＡＬＦ１、ＢＨＲＦ１に対するＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮeasy(R)Plus Mini kit（Qiagen、７４１３４）を使用し、細胞からｍＲＮＡを抽出した後、OneStep ＲＴ−ＰＣＲ Kit（Qiagen、２１０２１２）を使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。それぞれのプライマー配列は、下記表１に表示した。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ system ９７００（Applied Biosystems）を使用して進め、ＲＴ−ＰＣＲ段階及び条件は、次の通りである：（ｉ）逆転写段階（５０℃で３０分、１サイクル）；（ｉｉ）逆転写酵素不活性化及びｃＤＮＡ変性（denaturation）段階（９５℃で１５分、１サイクル）；（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅段階（９４℃で３０秒、５２℃で１分、７２℃で３０秒、３５サイクル）；（ｉｖ）伸張段階（７２℃で１０分、１サイクル）。ＲＴ−ＰＣＲの生成物は、電気泳動でアガロースゲル上で確認した。
【００３７】
（表１）ＲＴ−ＰＣＲに使われたプライマーの配列
【００３８】
５．酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）
分泌される抗体の濃度は、酵素結合免疫吸収分析法によって測定された。まず、ヤギの抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃγ）（Jackson ImmunoReserarch、１０９−００６−０９８）を９６ウェル・マイクロタイタ（microtiter）プレート（Ｎｕｎｃ、４４９８２４）上に吸着させた。このプレートを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれたホスフェートバッファで処理してブロッキングした後、２倍ずつ連続して希釈したサンプルをプレートの各ウェルに入れた。室温で２時間インキュベーションした後、ヤギのペルオキシダーゼ標識抗−ヒトλ抗体（peroxidase-labeled goat anti-human λ antibody）（Sigma、Ａ５１７５）で処理した。室温で１時間インキュベーションした後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応させ、この反応を１Ｎ ＨＣｌで中止させた。スタンダード（standard）としては、骨髄腫プラズマで精製されたヒトＩｇＧ１λ（human ＩｇＧ１ lampda purified myeloma plasma）（Sigma、Ｉ５０２９）を２５０ｎｇ／ｍｌの濃度から使用した。プレートリーダ（Spectramax plus ３８４、Molecular Device）を使用し、４５０／５７０ｎｍで吸光度を読んで濃度を測定した。
【００３９】
実施例１：細胞融合によるヒト細胞株の確立
まず、細胞融合パートナーとして、ＨＡＴ（Sigma、Ｈ０２６２）に感受性があり、Ｇ４１８（Calbiochem、３４５８１０）に耐性があるナマルワ細胞株を誘導するために、ナマルワ細胞株を、１０％ＦＢＳ（Hyclone、ＳＨ３００７０．０３）及び６−チオグアニン（Sigma、Ａ４６６０）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。４ヵ月の選別期間の間、６−チオグアニンの濃度を５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌまで上昇させて処理した後、１ｘＨＡＴ含有培地に対する前記細胞の感受性を確認した。ＨＡＴに感受性があるナマルワ細胞群に、ｐＳＶ２neoプラスミドを形質移入した後、１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８に耐性を有する細胞群を選別し、細胞融合パートナーとして使用した。
【００４０】
細胞融合は、主に文献（Kennett RH．Cell fusion Methods Enzymol 58：345-359；1979）に記載されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を利用した方法によって進められた。対数増殖期にある４ｘ１０６個の２９３細胞と６ｘ１０６個のナマルワ細胞とを、カルシウム（Ｃａ２＋）とマグネシウム（Ｍｇ２＋）とのないホスフェートバッファで２回洗浄した後、５μｇ／ｍｌ濃度の落花生凝集素（peanut agglutinin、Sigma、Ｌ０８８１）で前処理された６ウェルプレートに接種した。細胞を接種した６ウェルプレートを、Beckman AllegraＴＭ Ｘ−１２Ｒ遠心分離器で、６分間４００ｇに遠心分離した。ウェルからホスフェートバッファを除去した後、ウェルにある細胞に２ｍｌの４０％ポリエチレングリコール（Sigma、Ｐ７７７７）を２分間処理した。対照群として、それらのうち１つのウェルの細胞は、ポリエチレングリコール処理を行わなかった。次の段階として、細胞を５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma、Ｄ２６５０）が添加された５ｍｌのホスフェートバッファで３回洗浄した後、ホスフェートバッファを利用し、さらに３回洗浄した。１５％ＦＢＳが添加されており、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＲＰＭＩ１６４０培地とを同量に混ぜた培地で細胞を処理した後、ＣＯ２インキュベータに３０分間静置させた。その後、培地を除去した後、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８、０．５ｘのＨＡＴ及び１５％ＦＢＳが添加されており、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＲＰＭＩ１６４０とが同量で混合されている選別培地で細胞を処理した後、９６ウェルプレートの各ウェル当たり１ｘ１０４個の細胞を接種した。一週間後、細胞接種時に使用した培地と同じ組成の新鮮な選別培地に交換した。接種２週間後には、Ｇ４１８とＨＡＴとの濃度がそれぞれ０．８ｍｇ／ｍｌと１ｘとに上昇した選別培地を細胞に供給した。接種して３週間経過後に観察したとき、対照群細胞は成長していない一方、融合細胞は成長した。それらのうち成長が速く、かつ健康に育つ９個のウェルにある細胞を混合し、それら細胞で９６ウェルプレートで制限希釈クローニング（ＬＤＣ：limiting dilution cloning）を進め、単一細胞クローン（ＳＣＣ：single cell clone）を確保した。制限希釈クローニング段階で、対数的に育つ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌの選別培地と共に１個の細胞を接種し、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８、１ｘＨＡＴ及び１５％ＦＢＳが添加された新鮮培地を選別培地として使用した。毎週１回ずつ新鮮な選別培地を細胞に供給し、１つの細胞が接種されて育っているか否かを確認するために、顕微鏡下で各ウェルを観察した。かような過程を介して、９７個の単一細胞クローンを確保し、これをＦ２Ｎと命名した。Ｆ２Ｎは、２９３細胞とナマルワ細胞との融合細胞を意味する。この段階で、それぞれのＦ２Ｎクローンの成長パターンは、底に若干吸着しつつも浮遊培養される性質を有しており、強く凝集されたパッチを形成するものとするとき、２９３細胞と多少類似している。
【００４１】
全てのクローンは、窒素タンクに冷凍保管され、それら全てのクローンでＥＢＮＡ１発現、ＩｇＭ発現そして形質移入効率を調べた。調査結果、全てのクローンがＥＢＮＡ１を発現することを確認した。ＥＢＮＡ１が発現されるということは、それらクローンにＥＢＶが存在することを意味する。また、全てのクローンは、ＩｇＭを発現しないことを確認し、これは、ナマルワ細胞の免疫グロブリン発現が融合細胞では、抑制されたことを意味する。さらに体系的な特徴分析のために、友好的な（favorable）成長パターンを示し、高い形質移入効率を有する１７個のクローンを選定した。ＩｇＧを発現するｐＣＴ１３２ベクターを使用して試験したとき、選定された１７個のＦ２Ｎクローンの形質移入効率は、２９３細胞の形質移入効率より高かった。１７個のＦ２Ｎクローンを選定する過程で、細胞が凝集して育つ単一細胞クローンは除外した（図２のＣ及びＤ参照）。
【００４２】
実施例２：Ｆ２Ｎ７８クローンの特徴究明
Ｆ２Ｎクローンの選別のために、一時的形質移入を利用し、一次的にＩｇＧの発現が高い１７個のクローンを選別し（図４Ａ）、それらクローンを対象に、二次スクリーニングを実施した（図４Ｂ）。それらのうちＩｇＧの発現が最も高いＦ２Ｎ７８クローンに対して、２９３細胞とＩｇＧとの生産性を比較するために、ｐＣＴ１３２ベクターを利用して一時的形質移入試験を反復的に行い、その結果、Ｆ２Ｎ７８細胞のＩｇＧ発現率が２９３細胞より２〜３倍高いということを確認した（図４Ｃ）。
【００４３】
一次選定された１７個のクローンいずれも、ＥＢＮＡ１の発現が陽性であり、ＩｇＭの発現は陰性であった。それら１７個の単一細胞クローンのうちＩｇＧ発現が高い順に、７個の単一細胞クローンを選別し、無血清培地を利用した浮遊培養条件の下に適応させた。無血清浮遊培養条件に適応された７個の単一細胞クローン内に、ＥＢＶゲノムが存在するか否かをＥＢＮＡ１の持続的な発現いかんを介して確認した。図５から分かるように、無血清浮遊培養条件下で１年以上育ったＦ２Ｎ７８細胞集団のほぼ１００％がＥＢＮＡ１発現に対して陽性を示した。治療用蛋白質の製造において、マスター細胞銀行（ＭＣＢ：master cell bank）とマスター製造用細胞銀行（ＭＷＣＢ：master working cell bank）とを設け、生産する期間を含んだ生産細胞クローンの分裂期間は、１年ほどならば十分である。
【００４４】
また、細胞内の重要な遺伝子の持続的な発現を調べるために、無血清培地を使用して浮遊培養で１年以上培養してきたＦ２Ｎ７８クローンを対象に、ＩＦ（図５参照）とＲＴ−ＰＣＲ（図６参照）とを行った。結果を整理すれば、次の通りである：（１）ＩＦでＥＢＮＡ１の発現を確認し、また２種の異なるプライマー対を利用したＲＴ−ＰＣＲを介して、ＥＢＮＡ１が発現されるということを再度確認し；（２）Ｉｇ−ｍｕは、前記ＩＦ及びＲＴ−ＰＣＲによって発現が消失したことを確認し、またＩＦで、Ｉｇ−ｋａｐｐａの発現が消失したことを確認し；（３）２種の異なるプライマー対を利用したＲＴ−ＰＣＲを介して、抗体依存性細胞障害（antibody dependant cellular cytotoxicity）と密接な関連があるbisectingＮ−アセチルグルコサミンの生成に関与するＧｎＴＩＩＩ（Campbell and Stanley、１９８４）の発現を確認し；（４）ＣＨＯ細胞には存在せずにてヒト細胞にだけ特殊に存在するα（２，６）ＳＴの発現もまたＩＦによって証明された。
【００４５】
実施例３：一時的形質移入
新薬開発過程に必要な蛋白質を短時間内に生産するためには、一時的形質移入による生産方法が使われている。このために、FreeStyle ２９３培地で浮遊培養されたＦ２Ｎ７８細胞と２９３細胞とを２つの異なる構造のｏｒｉＰ発現ベクター（ｐＣＴ１３２及びｐＣＴ１２５）で形質移入して抗体生産性を比較した。２つのベクターのうちｐＣＴ１３２は、プラスミド内にＥＢＮＡ１コーディング配列がなく、ｐＣＴ１２５は、ＥＢＮＡ１コーディング配列がプラスミド内に存在する。
【００４６】
図７から分かるように、ｐＣＴ１３２とｐＣＴ１２５とを、Ｆ２Ｎ７８細胞と２９３細胞とにそれぞれ形質移入した反復試験で、Ｆ２Ｎ７８細胞では、２つのベクターが類似した抗体生産性を示した一方、２９３細胞では、ｐＣＴ１２５がｐＣＴ１３２よりさらに高いＩｇＧ生産を示した。さらに、ｐＣＴ１３２ベクターで形質移入されたＦ２Ｎ７８細胞での生産量（２５μｇ／ｍｌ以上）は、ｐＣＴ１２５ベクターで形質移入された２９３細胞の生産量（１５μｇ／ｍｌ）より高かった。これは、Ｆ２Ｎ７８細胞でのＥＢＮＡ１遺伝子のないｐＣＴ１３２発現ベクターのＩｇＧ生産が、２９３細胞でのＥＢＮＡ１遺伝子があるｐＣＴ１２５発現ベクターのＩｇＧ生産より効率的であるという面を示している一方、ＥＢＮＡ１が発現されない２９３細胞では、ＥＢＮＡ１のあるｐＣＴ１２５発現ベクターが、ＥＢＮＡ１のないｐＣＴ１３２発現ベクターよりその効率性が高いということを示している。
【００４７】
かようなｐＣＴ１３２発現ベクターの効率性を高めるために、Ｆ２Ｎ７８細胞が良好に成長できるように、新たな培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地）に適応させた後、FreeStyle Max試薬を使用した一時的形質移入を行った。その結果、形質移入後の６日目に、１００μｇ／ｍｌほどの高い抗体生産性を示すことが反復試験を介して確認された（図８参照）。これは、本発明で開発したヒト細胞株が、すでに開発されている２９３細胞株より一時的形質移入での優秀性を意味する。
【００４８】
実施例４：Ｆ２Ｎ細胞に対する酪酸ナトリウム処理の効果
酪酸ナトリウム処理は、生産細胞株に２種の影響を及ぼす。さまざまな遺伝子上の過アセチル化（hyper-acetylation）を介して遺伝子発現を活性化させる一方、アポトーシスを誘導して細胞成長率を低下させる。かような現象を確認するために、ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地に適応させたＣＨＯ、２９３、ナマルワ及びＦ２Ｎ７８の細胞を１ｍｌ当たり３ｘ１０５個の細胞になるように接種した後、３日目に、さまざまな濃度（０，１，２及び４ｍＭ）の酪酸ナトリウムで処理した。
【００４９】
図９Ａないし図９Ｄから分かるように、ＣＨＯ細胞は、酪酸ナトリウムの濃度が高いほど細胞数と細胞生存率とが急落する現象が見られた。ナマルワ細胞もＣＨＯ細胞と同様に、処理した全ての濃度の酪酸ナトリウムで、細胞成長率と生存率とが急減することを確認した。これに対して２９３細胞は、低濃度（１ｍＭ及び２ｍＭ）の酪酸ナトリウムでは、細胞成長率に特に影響を受けず、高濃度（４ｍＭ）では、細胞成長率と生存率とがかなり低下した。しかし、Ｆ２Ｎ７８細胞は、試験した全ての条件で、細胞成長率と生存率とがいずれも低下せず、むしろ高濃度（４ｍＭ）の酪酸ナトリウムでは、その成長率と生存率とが上昇した。
【００５０】
Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制的な細胞成長を説明するために、ナマルワ細胞から由来したＥＢＶゲノム内に存在する２つのウイルス性ｂｃｌ２類似因子であるＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１との発現をＲＴ−ＰＣＲを介して確認した。図１０から分かるように、Ｆ２Ｎ７８細胞では、酪酸ナトリウム処理群並びに未処理群いずれでも、ＢＨＲＦ１は発現されず、ＢＡＬＦ１は発現されることを確認した。一方、ナマルワ細胞では、２種の遺伝子がいずれも発現されることを確認した。対照群として使用した２９３細胞では、ＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１とがいずれも発現していない。Ｆ２Ｎ７８細胞が、ナマルワ細胞から由来しているにもかかわらず、Ｆ２Ｎ７８細胞内では、ＢＨＲＦ１が発現しないという事実は、Ｆ２Ｎ７８細胞のアポトーシス抑制的な細胞成長を説明できる根拠となる。既存に発表されたさまざまな報告によれば、ＢＨＲＦ１遺伝子とＢＡＬＦ１遺伝子とが共に発現されたとき、ＢＡＬＦ１は、ＢＨＲＦ１のアポトーシス抑制的活性を阻害するとのことである（Marshall et al．，1999，J Virol．73：5181-5185）。従って、Ｆ２Ｎ７８内で、ＢＡＬＦ１のみ発現されるという事実は、Ｆ２Ｎ７８細胞がアポトーシス抑制活性を有するということを意味する。しかし、ナマルワ細胞内では、２種の因子いずれも発現するために、Ｆ２Ｎ７８細胞とは異なり、アポトーシス抑制現象を確認できるものではないと考えられる。
【００５１】
次に、酪酸ナトリウムが細胞の抗体生産性に狂ぼす影響を確認するために、ＣＨＯ細胞とＦ２Ｎ７８細胞とからそれぞれ抗体生産細胞株を製造して比較した。ＣＨＯ＃２４７は、ＭＴＸ増幅過程を経て製作された抗体生産単一細胞株であり、Ｆ２Ｎ７８＿Ｉｇは、プロマイシン（puromycin）選別を経て製作された抗体生産細胞集団である。２つの細胞株をそれぞれ接種した後、３日目にさまざまな濃度（０，１，２，４ｍＭ）の酪酸ナトリウムを処理した。ＣＨＯ＃２４７の場合、酪酸ナトリウムを処理していない群と比較したとき、酪酸ナトリウム処理群の細胞成長は、５０％まで低下したが、生産性は、２倍近く上昇した（図１１参照）。一方、Ｆ２Ｎ７８＿Ｉｇの場合、酪酸ナトリウム処理を行っていない群に比べて、最大２倍ほどの細胞成長率上昇を示し、生産性面でも、４ないし５倍の上昇率を示した（図１２参照）。図１２から分かるように、Ｆ２Ｎ７８の抗体生産上昇率は、ＣＨＯ細胞株と比較するとき、さらに高い上昇率に該当する。かような現象は、酪酸ナトリウムに対するＦ２Ｎ７８細胞株のアポトーシス抑制効果が、細胞の抗体生産性上昇にさらに影響を与えて示されるものであると見られる。
【００５２】
討議
一般的に、ＥＢＶゲノムがウイルス・パーティクルを生成するために、ＥＢＶライフサイクルのエピソーム状態にある一方、ナマルワ細胞は、染色体に挿入された２つのコピーのＥＢＶゲノム（Henderson et al．，1983，PNAS USA 80：1987-1991及びRose et al．，2002，J．Clin．Microbiol．40：2533-2544）を有する。かような例外的な染色体内に、ＥＢＶゲノムが挿入された形態は、組換え蛋白質を生産する宿主細胞に２種のメリットを提供する。第一に、染色体に挿入されたＥＢＶゲノムからウイルス生成の恐れがないというメリットがあり、第二に、潜伏期（latent）のＥＢＮＡ１蛋白質並びにＢＡＬＦ１の初期遺伝子は持続的に発現される一方、ＢＨＲＦ１の発現は消失するＥＢＶ遺伝子の発現様相にそのメリットを見出すことができる。これと関連して、特にウイルス性ｂｃｌ−２と関連した２つの遺伝子のうり一つであるＢＨＲＦ１遺伝子の消失は、Ｆ２Ｎ７８クローンのアポトーシス抑制的成長を提示する予期できなかった結果である。また、ＥＢＮＡ１遺伝子の持続的な発現は、ＥＢＮＡ１遺伝子のないｏｒｉＰ発現ベクターを使用できるという長所として作用する。それ以外にも、ＧｎＴＩＩＩとα（２，６）ＳＴとの発現は、ヒト細胞としての特別のメリットを提供するものである。また、Ｉｇ−ｍｕｃｈａｉｎとＩｇ−kappa chainの発現が消失し、組換えモノクローナル抗体の製造においても、本発明によるヒト宿主細胞は有用である。
【００５３】
細胞致死率が低くなり、細胞成長期間が延びるということは、目的とする蛋白質（protein of interest）の生産量増加を意味するために、アポトーシス抑制的な細胞成長は、組換え蛋白質の生産を増大させるにおいて、非常に重要である。かような価値は、Ｆ２Ｎ７８細胞の培養時に、酪酸ナトリウムを処理した実験で確認することができ、場合によっては、酪酸ナトリウムをＦ２Ｎ７８細胞の治療用蛋白質の生産性を高めるのに使用することもできるというところにある。
【００５４】
以上、本発明について実施形態を用いて説明したが、それらは例示的なものに過ぎず、本技術分野の当業者ならば、本発明の範囲および趣旨から外れない範囲で多様な変更および変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、本発明の技術的範囲は、説明された実施形態によって定められず、特許請求の範囲によって定められねばならない。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第１プライマー（センス）
配列番号２：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第１プライマー（アンチセンス）
配列番号３：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第２プライマー（センス）
配列番号４：ＧｎＴＩＩＩ遺伝子の第２プライマー（アンチセンス）
配列番号５：Ｉｇ−ｍｕ遺伝子のプライマー（センス）
配列番号６：Ｉｇ−ｍｕ遺伝子のプライマー（アンチセンス）
配列番号７：ＥＢＮＡ１遺伝子の第１プライマー（センス）
配列番号８：ＥＢＮＡ１遺伝子の第１プライマー（アンチセンス）
配列番号９：ＥＢＮＡ１遺伝子の第２プライマー（センス）
配列番号１０：ＥＢＮＡ１遺伝子の第２プライマー（アンチセンス）
配列番号１１：ＢＨＲＦ１遺伝子のプライマー（センス）
配列番号１２：ＢＨＲＦ１遺伝子のプライマー（アンチセンス）
配列番号１３：ＢＡＬＦ１遺伝子のプラーマー（センス）
配列番号１４：ＢＡＬＦ１遺伝子のプラーマー（アンチセンス）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）ゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞。
【請求項２】
前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞が、２９３細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項３】
前記ヒトＢ細胞由来の細胞が、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性の細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項４】
前記ヒトＢ細胞由来の細胞が、ナマルワ細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項５】
前記ナマルワ細胞が、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性のナマルワ細胞であることを特徴とする請求項４に記載のヒト宿主細胞。
【請求項６】
前記ヒト宿主細胞が、（ｉ）ＥＢＮＡ１蛋白質を連続して発現させ、（ｉｉ）ＩｇＭ蛋白質を発現させず、（ｉｉｉ）人間と類似したグリコシル化プロファイルを持続し、（ｉｖ）ＢＡＬＦ１を発現させてＢＨＲＦ１を発現させないことを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項７】
前記ヒト宿主細胞が、酪酸ナトリウム添加培養時に、細胞成長に抑制を受けないことを特徴とする請求項１ないし請求項６のうち、いずれか１項に記載のヒト宿主細胞。
【請求項８】
前記ヒト宿主細胞が、寄託番号ＫＣＴＣ１１３０９ＢＰのＦ２Ｎ７８であることを特徴とする請求項１，請求項６及び請求項７のうちいずれか１項に記載のヒト宿主細胞。
【請求項９】
組換え蛋白質を生産するためであることを特徴とする請求項１，請求項６，請求項７及び請求項８のうちいずれか１項に記載のヒト宿主細胞。
【請求項１０】
前記組換え蛋白質が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９に記載のヒト宿主細胞。
【請求項１１】
前記組換え蛋白質が、モノクローナル抗体以外の治療用蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載のヒト宿主細胞。
【請求項１】
ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）ゲノムが染色体内に挿入されたヒトＢ細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞。
【請求項２】
前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞が、２９３細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項３】
前記ヒトＢ細胞由来の細胞が、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性の細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項４】
前記ヒトＢ細胞由来の細胞が、ナマルワ細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項５】
前記ナマルワ細胞が、ＨＡＴ感受性及びＧ４１８耐性のナマルワ細胞であることを特徴とする請求項４に記載のヒト宿主細胞。
【請求項６】
前記ヒト宿主細胞が、（ｉ）ＥＢＮＡ１蛋白質を連続して発現させ、（ｉｉ）ＩｇＭ蛋白質を発現させず、（ｉｉｉ）人間と類似したグリコシル化プロファイルを持続し、（ｉｖ）ＢＡＬＦ１を発現させてＢＨＲＦ１を発現させないことを特徴とする請求項１に記載のヒト宿主細胞。
【請求項７】
前記ヒト宿主細胞が、酪酸ナトリウム添加培養時に、細胞成長に抑制を受けないことを特徴とする請求項１ないし請求項６のうち、いずれか１項に記載のヒト宿主細胞。
【請求項８】
前記ヒト宿主細胞が、寄託番号ＫＣＴＣ１１３０９ＢＰのＦ２Ｎ７８であることを特徴とする請求項１，請求項６及び請求項７のうちいずれか１項に記載のヒト宿主細胞。
【請求項９】
組換え蛋白質を生産するためであることを特徴とする請求項１，請求項６，請求項７及び請求項８のうちいずれか１項に記載のヒト宿主細胞。
【請求項１０】
前記組換え蛋白質が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９に記載のヒト宿主細胞。
【請求項１１】
前記組換え蛋白質が、モノクローナル抗体以外の治療用蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載のヒト宿主細胞。
【図１】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図１０】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５１７５６６（Ｐ２０１１−５１７５６６Ａ）
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０３９１３（Ｐ２０１１−５０３９１３）
【出願日】平成２１年４月１０日（２００９．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１８５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２５９９９
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５１０２６９３５５）セルトリオン インク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１０日（２００９．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１８５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２５９９９
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５１０２６９３５５）セルトリオン インク (1)
【Ｆターム（参考）】
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