光学活性ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法
【課題】光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を、より高い光学純度で安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供する。
【解決手段】３−オキソアミノ酸誘導体のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、該３−オキソアミノ酸誘導体下式（２）を生成させることを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（式中、Ｒ１はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ２は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ３はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ１からＲ３におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
【解決手段】３−オキソアミノ酸誘導体のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、該３−オキソアミノ酸誘導体下式（２）を生成させることを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（式中、Ｒ１はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ２は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ３はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ１からＲ３におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボニルレダクターゼを含む微生物、同微生物の調製物もしくは同微生物を培養して得られた培養液を用いて、３−オキソアミノ酸誘導体の２位のアミノ基を立体認識しながら、３位のカルボニル基を立体選択的に還元し、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である。例えば（２Ｒ，３Ｒ）−３−シクロへキシル−３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は医薬の中間体として用いられているが、これの製法としては光学活性なエポキシドを生成して３−シクロへキシル−３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に導く方法（特許文献１）、または、３−シクロへキシル−３−オキソアミノ酸誘導体を不斉触媒で還元して得られることが報告されているが（非特許文献１）、前者は原料化合物の単価が高く工業的に問題があり、また、後者は高圧水添のため特別な反応装置を必要とし、かつ光学純度も満足なものではなく、工業化は困難であった。
【０００３】
カルボニルレダクターゼは、カルボニル（ｃａｒｂｏｎｙｌ）基の炭素・酸素二重結合を還元する反応を触媒する酵素であるが、酵母、細菌、カビなどの各種の微生物でその存在が報告されている。例えば、下記反応式のような、Ｎ−アセチル化された３−オキソアミノ酸誘導体の還元によるスレオニン誘導体の生成が記載されている（特許文献２、３、４）。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかしながらこの方法では、ディアステレオマーや光学異性体の選択的合成は行われていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−５５３５８号公報
【特許文献２】特開平２−６０５９２号公報
【特許文献３】特開平２−６０５９３号公報
【特許文献４】特開平２−６０５９４号公報
【非特許文献１】Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ （２００４） ｖｏｌ４３ ｐｐ８８２−８８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を、より高い光学純度で安価かつ簡便に製造するための新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法について鋭意検討した結果、微生物の菌体及び／または該菌体処理物が、原料となる３−オキソアミノ酸誘導体の不斉還元反応を触媒することを見出した。さらに、該不斉還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を作製し、該細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、原料となる３−オキソアミノ酸誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物である光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を得られることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 下記一般式（１）
【化２】
（式中、Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ2は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ1からＲ3におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
で表される３−オキソアミノ酸誘導体のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、前記一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用させて、下記一般式（２）
【化３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は前記と同義である）
で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成させることを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【００１０】
（２） 微生物がアブシディア（Absidia）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、シトロバクター（Citrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、デルフティア（Delftia）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディイデス（Nocardioides）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス（Paracoccus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドコッカス（Rhodococccus）属、セラチア（Serratia）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、バリドボラックス（Variovorax）属、又はエクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属に属する微生物であることを特徴とする（１）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【００１１】
（３） 微生物が下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡを発現させた形質転換体である、（１）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
（４） 形質転換体が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換されたものである、（３）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（５） 形質転換体が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体である、（３）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【００１３】
（６） 一般式（１）および（２）の化合物において、Ｒ2がアリール基であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（７） 一般式（２）の光学純度が９８％ｅｅである（１）〜（６）のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（８） 一般式（２）の絶対配置が下記一般式（３）で表されるように２Ｒ，３Ｒであることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【化４】
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を高い光学純度で得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
【００１６】
（３−オキソアミノ酸誘導体、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体）
本発明においては、微生物の菌体及び／または該菌体処理物を反応基質である下記一般式（１）
【００１７】
【化５】
【００１８】
（式中、Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ2は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ1からＲ3におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用させて、下記一般式（２）
【００１９】
【化６】
【００２０】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は前記と同義である）
で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成させる。
【００２１】
Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環を示す。ここで、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基、ｎ−デシル基等の炭素数１〜３０、好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数１〜１０の直鎖、分岐鎖、又は環状のアルキル基が挙げられる。
【００２２】
アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ベンゾイル基、チオフェニル基などの炭素数６〜２０のアリール基を挙げることができる。
【００２３】
ヘテロ環基としては、Ｎ、ＯまたはＳ原子の少なくとも一つを含む３員から１０員の飽和もしくは不飽和のヘテロ環基を挙げることができ、これらは単環であってもよいし、更に他の環と縮合環を形成してもよい。ヘテロ環基として好ましくは、縮合環を有していてもよい５ないし６員の不飽和ヘテロ環基であり、より好ましくは縮合環を有していてもよい５ないし６員の芳香族ヘテロ環基である。ヘテロ環基中のヘテロ環の具体例としては、例えばピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアゾール、トリアジン、インドール、インダゾール、プリン、チアジアゾール、オキサジアゾール、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンズセレナゾール、インドレニン、テトラザインデンなどが挙げられる。
【００２４】
上記のアルキル基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい。アルキル基、アリール基及びヘテロ環基が有していてもよい置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００２５】
置換されたアルキル基として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、トリル基、メシチル基、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。
【００２６】
また、上記アルキル基及びアリール基内の炭素原子は窒素原子、硫黄原子、酸素原子など複素原子で置換されていてもよい。例えば、アルキル基としては、ＣＨ3（ＣＨ2）nＳ（ＣＨ2）n−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＮＨ（ＣＨ2）n−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）n−などでもよい（ここで、ｎは１以上の整数を示し、好ましくは１から１０を示し、より好ましくは１から５を示す）。
【００２７】
Ｒ1として好ましいのは、炭素数１〜３０のアルキル基、アリール基またはヘテロ基である。さらに好ましくは、炭素数１〜２０の鎖状、環状または分岐状アルキル基、フェニル基、クロロフェニル基、ナフチル基、チオフェニル基であり、より好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロヘキシル基、ｎ−デシル基、フェニル基、クロロフェニル基、ナフチル基、またはチオフェン基である。
【００２８】
Ｒ2は、炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示す。炭素数４以上のアルキル基としては、前記Ｒ1で挙げたアルキル基のうち炭素数４以上のものが挙げられる。炭素数４以上のアルコキシ基としては、上記した炭素数４以上のアルキル基の１個の水素原子を水酸基で置換したアルコキシ基を挙げることができ、炭素数４〜２０、好ましくは炭素数４〜１０、より好ましくは炭素数４〜６の直鎖、分岐鎖、又は環状のアルコキシ基を挙げることができ、具体的には、ｔ−ブトキシ基、−Ｏ−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5などを挙げることができる。Ｒ2が示すアリール基及びヘテロ環基としては、前記Ｒ1で挙げたアリール基及びヘテロ環基が挙げられる。
【００２９】
Ｒ2が示す炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基は置換されていてもよい。炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基が有していてもよい置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ2としてはフェニル基、又はtert-ブチル基が好ましい。
【００３１】
Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示す。Ｒ3が示すアルキル基及びアリール基としては、前記Ｒ1で挙げたものが挙げられる。
【００３２】
Ｒ3が示すアルキル基またはアリール基は置換されていてもよい。アルキル基またはアリール基が有していてもよい置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００３３】
Ｒ3としては、炭素数１〜６の直鎖状または分岐上のアルキル基、又はベンジル基が好ましい。Ｒ3として特に好ましいものはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基である。
【００３４】
一般式（１）の具体的な化合物としては以下の化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ｎ−プロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸フェニル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ベンジル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸メチル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸エチル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸ｎ−プロピル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸ベンジル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソブタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソペンタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソヘキサン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−４，４−ジメチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−フェニル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−（チオフェン−２−カルボキサミド）−３−（チオフェン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−（ナフタレン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
３−オキソ−３−フェニル−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノブタン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノペンタン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノヘキサン酸イソプロピル、
４，４−ジメチル−３−オキソ−２−ピバロイルアミノペンタン酸イソプロピル、
３−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル、
２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル、
【００３５】
一般式（２）の具体的な化合物としては、上記一般式（１）の具体的化合物のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元することによって得られる光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体である。
【００３６】
一般式（２）の化合物は、２位と３位に不斉炭素を有するため４種の異性体を有し、（２Ｒ，３Ｒ）体、（２Ｒ，３Ｓ）体、（２Ｓ，３Ｒ）体、（２Ｓ，３Ｓ）体があるが、本発明における微生物の菌体及び／または該菌体処理物を用いた製造ではその中から1種類を優先的に製造する。なお医薬の中間体として需要がある化合物としては（２Ｒ，３Ｒ）体であることが好ましい。 また（２Ｒ，３Ｒ）体および（２Ｓ，３Ｓ）体をアンチ（ａｎｔｉ）体 （２Ｒ，３Ｓ）体および（２Ｓ，３Ｒ）体をシン（ｓｙｎ）体という。
【００３７】
【化７】
【００３８】
（本発明に用いられる微生物の菌体及び／または該菌体処理物）
本発明に用いる微生物の菌体及び／または該菌体処理物としては、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用し、β位のカルボニル基を立体特異的に還元することによって一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成するものであればいずれを用いてもかまわない。
【００３９】
光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の生成の確認方法としては、通常、一般式（１）の３−オキソアミノ酸誘導体を含む水溶液に対象となる微生物、その菌体処理物を作用させ、その反応液を薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用い、基質、及び生成物である一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を定性、定量すればよい。
【００４０】
本発明における一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は光学純度が９６％ｅｅ以上であることが好ましく、さらに好ましくは９８％ｅｅ以上、より好ましくは９９％ｅｅ以上である。光学純度が低いと、医薬中間体として用いるために更なる精製が必要となる。一般的に光学異性体同士の分離精製は特殊なカラムを用いたり、あるいは、別の光学活性体とともに晶析するなど、容易とはいえない作業であり、光学純度の高い化合物をこのような分離精製することなく製造する方法を提供する事は重要である。
【００４１】
本発明に用いることのできる微生物の菌体及び／または該菌体処理物は、上記生成確認法に供し、数分以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質の減少が確認しうるもの、具体的には、数時間以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質が１％以上、好ましくは５％以上減少するものである。
【００４２】
一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用して一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成する微生物としては、アブシディア（Absidia）属に属する微生物、アクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物、アルスロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物、バチルス（Bacillus）属に属する微生物、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属に属する微生物、セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物、シトロバクター（Citrobacter）属に属する微生物、コマモナス（Comamonas）属に属する微生物、デルフティア（Delftia）属に属する微生物、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に属する微生物、ノカルディイデス（Nocardioides）属に属する微生物、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物、パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、リゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物、ロドコッカス（Rhodococccus）属に属する微生物、セラチア（Serratia）属に属する微生物、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する微生物、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物、バリドボラックス（Variovorax）属に属する微生物、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物、並びにカルボニルレダクターゼをコードする遺伝子を有する組換え微生物が挙げられる。
【００４３】
アブシディア（Absidia）属に属する微生物としては、具体的にはアブシディア リクテミ（Absidia lichthemi）OUT1010、が挙げられる。
アクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物としては、具体的にはアクレモニウム クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）ATCC14615が、挙げられる。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物としては、例えばアグロバクテリウム リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）MAFF03-01724、MAFF07-20001、MAFF301724 、IAM13570アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）MAFF301001、MAFF301222、IAM12048,IAM13129が挙げられる。
【００４４】
アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物としては、具体的にはアルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes faecalis）JCM10169、が挙げられる。
アルスロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物としては、具体的にはアルスロバクター クリスタロポエテス（Arthrobacter crystallopoietes）JCM2522アルスロバクター スルファレス（Arthrobacter sulfureus）JCM1338アルスロバクター エスピー（Arthrobacter sp）JCM1336、IFO14590、が挙げられる。
バチルス（Bacillus）属に属する微生物としては、具体的にはバチルス レンタス（Bacillus lentus）IAM11055が挙げられる。
【００４５】
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物としては、具体的にはブレビバクテリウム スルフレム（Brevibacterium sulfureum)
(JCM1485)が挙げられる。
ブレブンディモナス（Brevundimonas）属に属する微生物としては、具体的にはブレブンディモナス（Brevundimonas diminuta）IFO12697が挙げられる。
セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物としては、具体的にはセルロモナス（Cellulomonas biazotea）ATCC486セルロモナス（Cellulomonas flavigena）ATCC482が挙げられる。
【００４６】
シトロバクター（Citrobacter）属に属する微生物としては、具体的にはシトロバクター（Citrobacter youngae）ATCC11102が挙げられる。
コマモナス（Comamonas）属に属する微生物としては、具体的にはコマモナス（Comamonas terrigena）IFO13299、IFO12685、NBRC14918が挙げられる。
デルフティア（Delftia）属に属する微生物としては、具体的にはデルフティア（Delftia acidovorans）JCM6218が挙げられる。
【００４７】
マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に属する微生物としては、具体的にはマイコバクテリウム エスピー（Mycobacterium sp.）NCIMB11678、NCIMB11677が挙げられる。
ノカルディイデス（Nocardioides）属に属する微生物としては、具体的にはノカルディイデス シンプレックス（Nocardioides simplex）IAM1398が挙げられる。
オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物としては、具体的にはオクロバクトラム アンスロピー（Ochrobactrum anthropi）ATCC49237 オクロバクトラム エスピー（Ochrobactrum sp）IFO12950が挙げられる。
【００４８】
パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物としては、具体的にはパラコッカス デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）IFO12442、IFO13301が挙げられる。
シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物としては、具体的にはシュードモナス アルカリゲネスJCM5967（Pseudomonas alcaligenes）シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）NCIMB11924シュードモナス タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460, シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp）DSM6426が挙げられる。
リゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物としては、具体的にはリゾビウム ホーキー（Rhizobium haukuii）MAFF 210250 が挙げられる。
【００４９】
ロドコッカス（Rhodococccus）属に属する微生物としては、具体的にはロドコッカス ロドクロス（Rhodococccus rhodochrous）ATCC21291が挙げられる。
セラチア（Serratia）属に属する微生物としては、具体的にはセラチア（Serratia marcescens）IFO3046セラチア（Serratia plymuthica）NCIMB8285が挙げられる。
シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する微生物としては、具体的にはシノリゾビウム メリロティー（Sinorhizobium meliloti）IAM12611、MAFF 303042が挙げられる。
【００５０】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物としてはストレプトマイセス アクロモゲネス サブスピーシーズ アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes subsp. Achromogenes） IFO12735が挙げられる。
バリドボラックス（Variovorax）属に属する微生物としては、具体的には バリドボラックス パラドクサス（Variovorax paradoxus） DSM30034、DSM30162が挙げられる。
エクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属に属する微生物としては、具体的にはエクシグオバクテリウム ｓｐ（Exiguobacterium sp）MCI4322株（FERM-P-19239株）が挙げられ、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターから入手可能である。
【００５１】
これらの微生物は各研究機関から取得できる。
ＩＡＭカルチャーコレクション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉａｍ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｍｉｓｙｓｔ／ＣｏｌｌｅＢＯＸ／ｊｐ／ＩＡＭｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）
JCM（理化学研究所、バイオリソースセンター）(http://www.jcm.riken.jp/JCM/JCM_Home_J.html）
NBRC（旧IFOを含む）独立行政法人 製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NBRC）遺伝資源保存課
（http://www.nbrc.nite.go.jp/gene.html）
IAM（東京大学分子細胞生物学研究所 細胞機能情報研究センター ＩＡＭカルチャーコレクション）（http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/misyst/ColleBOX/jp/IAMcollection.html）
ＮＣＩＭＢ（日本代理店 （株）エヌシーアイエムビー・ジャパン）（http://www.ncimb.co.jp/index.html）
ＡＴＣＣ (American Type Culture Collection（http://www.atcc.org/Home.cfm）)（日本代理店：住商ファーマ インターナショナル ＡＴＣＣ事業グループ）
（http://www.summitpharma.co.jp/japanese/index_j.html）
ＤＳＭ （http://www.dsmz.de/species/strains.htm）
ＣＢＳ（Centraalbureau voor Schimmelcultures Uppsalalaan）http://www.cbs.knaw.nl/databases/index.htm
ＮＣＹＣ （National Collection of Yeast Cultures）http://www.ifrn.bbsrc.ac.uk/NCYC/）
OUT : Department of Fermentation Technology, Faculty of Engineering, Osaka University, Osaka, Japan
MAFF : Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Tsukuba, Japan
(http://www.gene.affrc.go.jp/micro/index_j.html)
NRRL : Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization
FERM-P；独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センター
【００５２】
カルボニルレダクターゼは、一般には、カルボニル（carbonyl）の炭素・酸素二重結合の還元反応を触媒する酵素をいうが、本発明においては、３−オキソアミノ酸誘導体の炭素・酸素二重結合を不斉還元して光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素をいう。
【００５３】
本発明の製造方法において用いることのできるカルボニルレダクターゼとしては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のカルボニルレダクターゼである。
【００５４】
また、本発明においては、これらのホモログであって、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとは、例えば、前記活性を害さない範囲内において配列番号２に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００５５】
また、前記ホモログは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号２に記載のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍによりホモロジー検索を行った結果、配列番号２の配列はクロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のオキシドレダクターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８）と５７％の相同性を示した。
【００５６】
本発明の製造方法に用いるカルボニルレダクターゼは、カルボニルレダクターゼの一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニルレダクターゼ活性を有する任意の微生物からカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡを大腸菌などの宿主に発現させることによって得ることができる。また、カルボニルレダクターゼ活性を有する微生物、例えば、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。細菌の菌体からカルボニルレダクターゼを取得する方法としては、例えば、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ． ９７， ｐ１０３（１９７９）に記載の方法を参考に行うことができる。
【００５７】
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、例えばエクシグオバクテリウム ｓｐ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＦＥＲＭ−Ｐ−１９２３９株（ＭＣＩ４３２２株）が、本発明に好適に利用できるカルボニルレダクターゼを有しており、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターから入手可能である。
【００５８】
本発明の製造方法においては、３−オキソアミノ酸誘導体をカルボニルレダクターゼの精製酵素と反応させてもよいが、カルボニルレダクターゼを含む細胞、同細胞の調製物、または同細胞を培養して得られた培養液を、３−オキソアミノ酸誘導体に反応させて、３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を製造してもよい。カルボニルレダクターゼを含む細胞としては、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。
【００５９】
この場合、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号２のアミノ酸配列を有するカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列番号２のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。また、本発明製造法においては、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡのホモログであって、カルボニルレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００６０】
ここで、ホモログとは、カルボニルレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１に記載の塩基配列に１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなるＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００６１】
また、ホモログは、配列番号１または３の塩基配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、カルボニルレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００６２】
カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、カルボニルレダクターゼを上記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、カルボニルレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、カルボニルレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００６３】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニルレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ． １２０，ｐ６２１−６２３（１９８８））を行うことにより、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００６４】
なおカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００６５】
当業者であれば、配列番号１に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ｖｏｌ． １０， ｐ６４８７ （１９８２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ｖｏｌ． １００， ｐ４４８（１９８３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐ２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００６６】
また、配列番号２のアミノ酸配列の全部またはその一部や、配列番号１の塩基配列の全部または一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ等から入手可能）からのＰＣＲ等によりカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００６７】
さらに、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基配列の全部または一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、カルボニルレダクターゼ活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００６８】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００６９】
上記のようにして単離された、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニルレダクターゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換された細胞を培養することにより、カルボニルレダクターゼを該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００７０】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００７１】
このとき、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターをカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ｖｏｌ． ４３，ｐ７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ｖｏｌ． ８，ｐ４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００７２】
本発明のカルボニルレダクターゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００７３】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００７４】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００７５】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００７６】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００７７】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００７８】
形質転換細胞作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、参照）。
【００７９】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００８０】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、プロモーターとしては、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００８１】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００８２】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．
２６，ｐ２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００８３】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ｖｏｌ． ３９，ｐ２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００８４】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ． １９６，ｐ１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００８５】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００８６】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ． ６，ｐ８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００８７】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ７，ｐ２８３−２８７（１９８９））。
【００８８】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． ３１５， ｐ５９２−５９４ （１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００８９】
（本発明の製造方法）
本発明の製造方法においては、反応基質である３−オキソアミノ酸誘導体に微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させる。該菌体処理物とは、例えば、該微生物菌体をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体細胞調製物、および、該微生物菌体中の本発明のカルボニルレダクターゼ画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものの事を示す。
【００９０】
本発明の製造方法においては、反応液に補酵素ＮＡＤＰ+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）もしくはＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型）を添加するのが好ましい。添加濃度は、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。これらの補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、（ｉ） 宿主微生物自体のＮＡＤＰ＋還元能を利用する方法、（ｉｉ） ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、または（ｉｉｉ）形質転換細胞を作製するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子とカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、が挙げられる。
【００９１】
このうち、上記（ｉ）の方法においては、反応系にグルコースや２−プロパノールなどを添加することが好ましい。
【００９２】
また、上記（ｉｉ）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の再生酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニルレダクターゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である３−オキソアミノ酸誘導体に対して、０．１〜１００倍モル当量、好ましくは１〜２０倍モル当量添加する。
【００９３】
また、上記（ｉｉｉ）の方法においては、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法、及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００９４】
本発明の製造方法は、水性媒体中または該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことができる。上記の水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ジメチルスルホキシド、イソプロパノール等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。上記の水性媒体に各種の界面活性剤など反応基質の溶解度を増加させるものを使用することもできる。
【００９５】
本発明の製造方法において反応基質となる一般式（１）で表される化合物は、既存の化学的合成を組み合わせる事により製造することが出来る。
【００９６】
例えば、次のような経路で製造することができる。
【００９７】
【化８】
【００９８】
具体的には、一般式（４）で表される馬尿酸やアセチルグリシンなどのグリシン誘導体の縮合反応で、一般式（５）で表されるオキサゾロン環化合物を得る。オキサゾロン環化合物にアシル化剤を作用させ、又はＯ−アシル化してオキサゾール化合物とした後にさらにアシル基を転位させて、一般式（６）で表されるジアシルオキサゾロン環化合物を得る。このジアシルオキサゾロン環化合物をアルコール類と反応させて、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を得ることができる。この反応は一般式（５）で表されるオキサゾロン環化合物及び／又は一般式（６）で表されるジアシルオキサゾロン環化合物を単離せず同一反応器で行うこともできる。
【００９９】
又、次のような経路で製造することも可能である。
【０１００】
【化９】
【０１０１】
具体的には、一般式（４）で表される馬尿酸やアセチルグリシンなどのグリシン誘導体から、一般式（７）で表されるオキサゾール化合物を得、これにルイス酸の存在下、酸クロライドを作用させることにより、一般式（８）で表されるアシルオキサゾロン化合物を得る。このアシルオキサゾロン化合物にアルコール類を作用させることにより、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を得ることができる。
【０１０２】
本発明の製造方法において反応基質となる一般式（１）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．００１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いることができる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、基質の分解を減らすという点や基質の溶解度の観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【０１０３】
本発明の製造方法において、使用する微生物の菌体及び／または該菌体処理物の量は、反応基質となる一般式（１）で表される化合物に対して、通常、が０．０１〜５００倍量（Ｗ／Ｗ）、好ましくは１〜２００倍の範囲で用いることができる。微生物の菌体及び／または該菌体処理物は、反応開始時に一括して添加しても良いが、反応の低下などが見られた場合、間欠的に追加添加することも有効である。
【０１０４】
本発明の製造方法は例えば、４〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の反応温度で、ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ５〜１０で行うことができる。また、基質のカルボン酸エステル部分の分解を防ぐため、反応液中に、エステル部分の分解を防ぐ化合物、具体的にはエステラーゼ阻害剤を添加したり、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどの塩を添加する事は有効である。同様にアミド結合の分解を防ぐために添加剤を入れても良い。具体的にはアシラーゼ阻害剤などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の製造方法において反応時間は、一般式（１）で表される化合物が変換され、一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体が生成されれば特にかまわないが、通常１分から７日、好ましくは１時間から４日の間で行なわれる。
【０１０６】
反応形態としてはバッチ法でも連続法でも何れでも構わないが、連続法の場合には式（１）の３−オキソアミノ酸誘導体、微生物の培養液、菌体及び／または該菌体処理物を、必要に応じて、適宜添加して行われ、また、目的生成物から分離された菌体をリサイクル使用しても良い。
【０１０７】
本発明の製造方法により生成する光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【０１０８】
（光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の用途）
一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は、それ自体あるいは、各種の手法にて誘導化し、種々の医薬や農薬の中間体として有用である。特に下記一般式（９）
【０１０９】
【化１０】
【０１１０】
で表される化合物は抗ＨＩＶ活性を持つ薬剤（ＷＯ０１／４０２２７） の中間体として工業的に有用である。この（９）やその類縁体への変換の手法としては、上記一般式（２）で表される化合物を下記一般式（１０）
【０１１１】
【化１１】
【０１１２】
で表される化合物あるいはそのアミン塩に変換する。この変換の手法としては、酸あるいは塩基存在下、加水分解あるいは加水分解酵素にて加水分解する手法が挙げられる。
【０１１３】
この一般式（１０）で表される化合物を塩基条件中、ｔ−ブトキシカルボニル化を行うことで一般式（９）で表される化合物へと変換可能である。
【０１１４】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１５】
（合成例１）
（４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロンの合成）
１００ｍｌのフラスコに塩化メチレン４３ｍｌ、５−アセトキシ−２−フェニルオキサゾール４．２８ｇ（２１．１ｍｍｏｌ）を仕込み、シクロヘキサンカルボン酸クロリド３．１０ｍｌ（２３．２ｍｍｏｌ）を添加し、しばらく攪拌した後に四塩化スズ３．８７ｍｌ（７３．２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。２４時間後、ＴＬＣにて原料の消失を確認し、４規定塩酸水溶液１０ｍｌ及び酢酸エチル１５０ｍｌを添加し、有機層を分離した後にさらに水５０ｍｌで２回、飽和食塩水５０ｍｌにて洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１５０ｇ， ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２〜１００：４）にて精製し、黄色固体として目的物４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン３．２０ｇ（純度換算後の収率５２％）を得た。
【０１１６】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ）：δ１．１４−１．５１（５Ｈ，ｍ），１．６８−１．７９（５Ｈ， ｍ），３．３１−３．３７（１Ｈ， ｍ），７．５３−７．５７（３Ｈ，ｍ），７．９６−８．０１（２Ｈ， ｍ）
【０１１７】
（合成例２）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピルの合成）
合成例１で製造した４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン４７．５ｇ（１７５ｍｍｏｌ）、および２−プロパノール２３８ｍｌを仕込み、加熱還流下２時間攪拌した後、減圧濃縮し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピルを６６．１ｇ（純分として５３．９ｇ、収率９３％）得た。
【０１１８】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．３８（９Ｈ，ｍ），１．４５−１．５６（２Ｈ， ｍ），１．６９−１．８５（（４Ｈ， ｍ），２．０８−２．１０（１Ｈ， ｂｒ−ｓ），２．８６−２．９３（１Ｈ， ｍ），５．１０−５．１７ （１Ｈ，ｍ），５．５２（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），７．４３−７．５５（３Ｈ， ｍ），７．８３−７．８５（ｍ， ２Ｈ）
【０１１９】
（合成例３）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルの合成）
合成例１で製造した４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン100mｇ（0.37ｍｍｏｌ）、およびエタノール（2.0ml）を仕込み、加熱還流下２時間攪拌した後、減圧濃縮し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルを 112mｇ（純分として 108mｇ、収率９６％）得た。
【０１２０】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．５５（８Ｈ，ｍ），１．６８−１．８４（４Ｈ， ｍ），２．０６−２．１０（１Ｈ， ｂｒ−ｓ），２．８６−２．９０（１Ｈ， ｍ），４．２５−４．３３（２Ｈ，ｍ），５．５６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．３０−７．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．４３−７．４８（２Ｈ， ｍ），７．５２−７．５６（１Ｈ， ｍ），７．８３−７．８６（ｍ， ２Ｈ）
【０１２１】
（合成例４）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピルの製造）
２００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン５．００ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）、４−ピコリン１６ｍＬ（１７０ｍｍｏｌ）、アセトン５０ｍＬを仕込み、氷冷下、シクロヘキサンカルボン酸クロリド１５.２ｍＬ（１１２ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、氷冷下３０分、室温にて２０時間反応させた。反応液にイソプロパノール２５ｍＬを添加し、１時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．６８ｇ（５．６ｍｍｏｌ）を２−プロパノール２．５ｍＬに溶解して添加し、更に７時間加熱還流させた。反応終了後、反応液を濃縮し、得られた濃縮液をトルエン１００ｍＬにて抽出し、２Ｎ塩酸４０ｍＬで洗浄後、有機層を濃縮した。残渣を酢酸エチル５ｍＬ、ヘプタン９０ｍＬにて晶析し、白色結晶として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル６．１６ｇ（化学純度９８％、収率６７％）を得た。
【０１２２】
（合成例５）
（４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロンの製造）
５００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２０．０ｇ（１１２ｍｍｏｌ）、４−ピコリン６５ｍＬ（６７０ｍｍｏｌ）、アセトニトリル３００ｍＬを仕込み、氷冷下、シクロヘキサンカルボン酸クロリド６１ｍＬ（４５０ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。氷冷下５時間反応させた後、１Ｎ塩酸１００ｍＬを添加し、結晶を濾取した。結晶を乾燥し、白色結晶として４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン３７．９ｇ（少量の不純物を含む２種の幾何異性体混合物、約８５：１５、収率８９％）を得た。
【０１２３】
ｍａｊｏｒ−ｉｓｏｍｅｒ：1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１５−１．５０（８Ｈ，ｍ），１．６２−１．９３（１０Ｈ，ｍ），２．１０−２．１６（２Ｈ，ｍ），２．６６（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．１，３．８Ｈｚ），３．５８−３．６３（１Ｈ，ｍ），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ），７．５４−７．５６（１Ｈ，ｍ），７．９７−７．９９（２Ｈ，ｍ）．
【０１２４】
ｍｉｎｏｒ−ｉｓｏｍｅｒ：1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．４７（８Ｈ，ｍ），１．５９−１．８５（１０Ｈ，ｍ），２．１１−２．１５（２Ｈ，ｍ），２．６５（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．４，３．７Ｈｚ），３．２６−３．３１（１Ｈ，ｍ），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ），７．５４−７．５６（１Ｈ，ｍ），８．０４−８．０７（２Ｈ，ｍ）．
【０１２５】
（合成例６）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチルの製造）
３０ｍＬフラスコに合成例５の方法で得られた４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン０．９９ｇ（２６．０ｍｍｏｌ）、４−ピコリン０．２５ｍＬ（２．６ｍｍｏｌ）、メタノール５ｍＬを仕込み、１時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン６８ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を添加して、更に４時間加熱還流させた。反応終了後、反応液を濃縮し、得られた濃縮液を酢酸エチル１０ｍＬにて抽出し、２Ｎ塩酸２ｍＬ及び飽和食塩水２ｍＬにて洗浄後、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチル０．５８ｇ（少量の不純物を含む、収率約６０％）を得た。
【０１２６】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１８−１．５５（５Ｈ，ｍ），１．６５−１．８７（４Ｈ，ｍ），２．０４−２．１１（１Ｈ，ｍ），２．８３−２．９１（１Ｈ，ｍ），３．８３（３Ｈ，ｓ），５．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．４３−７．４９（２Ｈ，ｍ），７．５１−７．５６（１Ｈ，ｍ），７．８２−７．８７（２Ｈ，ｍ）．
【０１２７】
（合成例７）
（２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸イソプロピルの製造）
２００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２．５ｇ（１３．７ｍｍｏｌ）、４−ピコリン７．６６ｇ（８０．６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル２５ｍＬを仕込み、氷冷下、イソ酪酸クロリド６．０７ｇ（１１２ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、氷冷下５時間、室温にて２時間反応させた。反応液にイソプロパノール１２．５ｍＬを添加し、２時間半加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．３４ｇ（２．８ｍｍｏｌ）を２−プロパノール１．２５ｍＬに溶解して添加し、更に４時間加熱還流させた。反応終了後、反応液を濃縮し、得られた濃縮液をトルエン１００ｍＬにて抽出し、２Ｎ塩酸４０ｍＬで洗浄後、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、淡黄色固体として２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル２．６３ｇ（収率６６％）を得た。
【０１２８】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．３２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．４４−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５２−７．５５（１Ｈ，ｍ），７．８４−７．８５（２Ｈ，ｍ）．
【０１２９】
（合成例８）
（２−ベンゾイルアミノ−４，４−ジメチル−３−オキソペンタン酸イソプロピルの製造）
３００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２．０１ｇ（１１．０ｍｍｏｌ）、４−ピコリン６．２８ｇ（６７．４ｍｍｏｌ）、アセトン２０ｍＬを仕込み、氷冷下、ピバリン酸クロリド５.１７ｇ（４２．３ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、氷冷下３０分、室温にて６時間、加熱還流して１４時間、さらにアセトニトリル３０ｍＬ加えて４時間加熱還流した。反応液にイソプロパノール１７ｍＬを添加し、１時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．２８ｇ（２．３ｍｍｏｌ）を２−プロパノール１．７ｍＬに溶解して添加し更に１時間、２−プロパノール１７ｍＬを追加して９時間半加熱還流させた。反応液を濃縮し、トルエン７５ｍＬで希釈後、２Ｎ塩酸３０ｍＬで洗浄し、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、橙褐色固体として２−ベンゾイルアミノ−４，４−ジメチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル０．３６ｇを得た（少量の不純物を含む、収率約１０％）。
【０１３０】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），５．０９（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４３−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５１−７．８２（１Ｈ，ｍ），７．８３−７．８４（２Ｈ，ｍ）．
【０１３１】
（合成例９）
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピルの製造）
１００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２．００ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）、４−ピコリン６．５ｍＬ（６７．０ｍｍｏｌ）、アセトニトリル２０ｍＬを仕込み、氷冷下、ウンデカノイルクロリド８．９９ｇ（４２．６ｍｍｏｌ）を２５分かけて滴下し、氷冷下４５分、室温にて２時間攪拌を行った。反応液にイソプロパノール１０ｍＬを添加し、２時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．２７ｇ（２．２ｍｍｏｌ）を添加し更に３時間、加熱還流を続けた。反応液を濃縮し、酢酸エチル４５ｍＬで希釈後、２Ｎ塩酸１５ｍＬおよび飽和食塩水１５ｍＬで洗浄し、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、得られた油状物質をクロロホルム１２０ｍＬに溶かし飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍＬで洗浄した。有機層を濃縮し白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピル２．３８ｇ（少量の不純物を含む、収率約４５％）を得た。更に得られた固体をヘキサン懸濁洗浄により精製し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピル０．５９ｇ（収率１４％）を得た。
【０１３２】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２６−１．３０（１４Ｈ，ｍ），１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．３３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６２−１．６７（２Ｈ，ｍ），２．７８（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１７．４，７．５Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．４３−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５１−７．５５（１Ｈ，ｍ），７．８２−７．８５（２Ｈ，ｍ）．
【０１３３】
（合成例１０）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸フェニルの製造）
５０ｍＬフラスコに実施例１の方法で得られた４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン２．００ｇ（５．１４ｍｍｏｌ）、４−ピコリン０．５４ｇ（５．７２ｍｍｏｌ）、フェノール１０ｍＬおよびアセトニトリル１０ｍＬを仕込み、４５℃で６時間加熱後、４−ジメチルアミノピリジン０．１３ｇ（１．０ｍｍｏｌ）を添加し同じ温度で１２時間、５５℃で６時間半加熱した。反応終了後、反応液を酢酸エチル１１０ｍＬにて希釈し２Ｎ塩酸１０ｍＬで２回、飽和食塩水２０ｍＬにて１回洗浄後、有機層の乾燥および濃縮をした。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸フェニル２．７ｇを得た（フェノールを含む、収率４７％）。
【０１３４】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．５０（４Ｈ，ｍ），１．５０−１．６３（１Ｈ，ｍ），１．６８−１．７６（１Ｈ，ｍ），１．８０−１．９５（３Ｈ，ｍ），２．１１−２．１９（１Ｈ，ｍ），２．９７−３．０６（１Ｈ，ｍ），５．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．１１−７．２５（２Ｈ，ｍ），７．２６−７．２９（１Ｈ，ｍ），７．３７−７．４２（３Ｈ，ｍ），７．４４−７．４８（２Ｈ，ｍ），７．５２−７．５６（１Ｈ，ｍ），７．８６−７．８９（２Ｈ，ｍ）．
【０１３５】
（合成例１１）
（Ｎ−ベンゾイルグリシンイソプロピルエステルの製造）
５００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２４ｇ（０．１３４ｍｏｌ）、２−プロパノール５０ｍＬ、トルエン６０ｍＬ、ｐ−トルエンスルホン酸０．２ｇを入れ、Ｄｅａｎ ｓｔａｒｋ装置を付し還流を４時間行った。冷却後、酢酸エチル６０ｍＬを加え、反応混合物を飽和重曹液３０ｍＬｘ２、食塩水３０ｍＬで順次洗浄し芒硝で脱水した。溶媒を濃縮し生じた無色の固体をろ取、風乾し目的物２７ｇを得た（収率９３％）。
【０１３６】
（合成例１２）
（Ｎ−ピバロイルグリシンイソプロピルエステルの製造）
２００ｍＬフラスコにグリシンイソプロピルエステル４．８ｇ（３１．３ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン５０ｍＬ、トリエチルアミン６．３ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）を入れ１５℃付近に冷却しつつ、ピバロイルクロリド３．８ｇを含むジクロロメタン溶液１０ｍＬを徐々に滴下した。このとき反応温度を１５℃以下に保った。滴下終了後さらに室温にて３０分間攪拌した。反応混合液を１Ｎ塩酸２０ｍＬｘ２ 飽和食塩水２０ｍＬｘ２洗浄し芒硝で脱水した。溶媒を濃縮し生じた無色の固体をろ取、風乾し目的物５．５ｇを得た（収率８７％）。
【０１３７】
（合成例１３）
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソブタン酸イソプロピルの製造）
田辺らの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，２８５４）を参照し、２−ベンゾイルアミノ−３−オキソブタン酸イソプロピルの製造を行った。１００ｍＬフラスコにジクロロメタン１６ｍＬ、Ｎ−ベンゾイルグリシンイソプロピルエステル１．７７ｇ（８ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール０．７９ｇ（９．６ｍｍｏｌ）、アセチルクロリド０．６３ｇ（８ｍｍｏｌ）をいれ、窒素雰囲気下、−４５℃に冷却し１０分間攪拌し、次いでその温度で四塩化チタン５．３ｇ（２８ｍｍｏｌ）、トリｎ−ブチルアミン５．９ｇ（３２ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した。滴下終了後反応液をさらに１時間攪拌し、水５０ｍＬにあけ、有機相を取り、水、食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水した。有機相を濃縮し シリカゲルカラムクロマトにて精製し、０．５ｇの目的物を得た（少量の不純物を含む、収率３５％）。
【０１３８】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．４５（３Ｈ，ｓ），５．１５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４０−７．５５（３Ｈ，ｍ），７．８０−７．９０（２Ｈ，ｍ）．
【０１３９】
（合成例１４）
上記と同様にして以下の化合物を得た。
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソペンタン酸イソプロピル：収率３５％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．７４−２．９０（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４０−７．５５（３Ｈ，ｍ），７．８０−７．９０（２Ｈ，ｍ）．
【０１４０】
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソヘキサン酸イソプロピル：収率３９％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．６５−１．７４（２Ｈ，ｍ），２．７１−２．８２（２Ｈ，ｍ），５．１４（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｂｒｓ），
７．４０−７．５５（３Ｈ，ｍ），７．８４−７．８６（２Ｈ，ｍ）．
【０１４１】
（２−ベンゾイルアミノ−３−（ナフタレン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル：収率１１％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．４−７．７（６Ｈ，ｍ），７．８０−８．２０（６Ｈ，ｍ），８．８４（１Ｈ，ｓ）．
【０１４２】
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル：収率１７％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．２−７．５（５Ｈ，ｍ），７．８−７．９（３Ｈ，ｍ），８．１９（１Ｈ，ｓ）．
【０１４３】
（２−ベンゾイルアミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル：収率１１％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．４−７．６（６Ｈ，ｍ），７．８５−７．８８（２Ｈ，ｍ），８．１２−８．１４（２Ｈ，ｍ）．
【０１４４】
（３−オキソ−３−フェニル−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル：収率５３％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２６（９Ｈ，ｓ），４．９８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４５−７．６５（３Ｈ，ｍ），８．１０−８．１３（２Ｈ，ｍ）．
【０１４５】
（３−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル：収率２０％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２５（９Ｈ，ｓ），５．０２（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ），８．０５−８．０８（２Ｈ，ｍ）．
【０１４６】
（３−オキソ−２−ピバロイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル：収率３５％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２６（９Ｈ，ｓ），４．９８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．９５（１Ｈ，ｂｒｓ），７．１５−７．２５（１Ｈ，ｍ），７．７０−７．８０（１Ｈ，ｍ），８．０５−８．１５（１Ｈ，ｍ）．
【０１４７】
（実施例１）
（エクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２由来のカルボニルレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製）
特開２００４−２６７１３０と同様にしてプラスミドｐＥｘＳＤＲ１、および形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株を得た。すなわち、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２由来由来のカルボニルレダクターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ３０１６３３０Ａ、配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ｇｐ：ＡＢ１５４４０９、配列番号１）を元に配列番号３および４に記載のプライマーを合成した。
【０１４８】
配列番号１：
atgaaatata cggtgattac tggagcaagt tcaggaattg gatatgagac ggcaaaacta 60
ctcgcaggaa aaggaaaatc actcgttctc gtcgcgcgac ggacgtctga gctcgaaaaa 120
cttcgggatg aagtcaaaca aatctcacca gatagtgatg tcatcctcaa gtcggtcgat 180
ctcgcagata accaaaatgt ccatgattta tatgagggat taaaggaact cgacatcgaa 240
acgtggatca acaatgctgg attcggcgat tttgatctcg tccaggacat tgagctcggg 300
aaaatcgaga aaatgcttcg cttgaacatc gaggcgctaa cgattctatc gagtctgttc 360
gtccgcgatc atcatgacat cgaaggaacg acgctcgtca atatctcgtc agcaggtggc 420
taccggatcg tgccgaacgc ggtcacgtat tgcgcgacga agttctatgt cagtgcttat 480
acagaagggc tcgcgcaaga actgcaaaaa ggtggggcaa aacttcgggc gaaagtactg 540
gcaccagctg cgactgagac agagtttgcg gatcgttcgc gcggcgaagc aggtttcgac 600
tacagcaaga acgtcaaaaa gtaccatacg gcggctgaaa tggcaggctt cctgcatcag 660
ttgattgaaa gcgacgcgat cgtcggcatc gtcgacggtg agacgtatga gttcgaattg 720
cgtggtccat tgttcaacta cgcaggataa 750
【０１４９】
配列番号２：
Met Lys Tyr Thr Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Glu
Thr Ala Lys Leu Leu Ala Gly Lys Gly Lys Ser Leu Val Leu Val Ala
Arg Arg Thr Ser Glu Leu Glu Lys Leu Arg Asp Glu Val Lys Gln Ile
Ser Pro Asp Ser Asp Val Ile Leu Lys Ser Val Asp Leu Ala Asp Asn
Gln Asn Val His Asp Leu Tyr Glu Gly Leu Lys Glu Leu Asp Ile Glu
Thr Trp Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Asp Phe Asp Leu Val Gln Asp
Ile Glu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Met Leu Arg Leu Asn Ile Glu Ala
Leu Thr Ile Leu Ser Ser Leu Phe Val Arg Asp His His Asp Ile Glu
Gly Thr Thr Leu Val Asn Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Arg Ile Val
Pro Asn Ala Val Thr Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Tyr Val Ser Ala Tyr
Thr Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Gln Lys Gly Gly Ala Lys Leu Arg
Ala Lys Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Glu Thr Glu Phe Ala Asp Arg
Ser Arg Gly Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Lys Asn Val Lys Lys Tyr
His Thr Ala Ala Glu Met Ala Gly Phe Leu His Gln Leu Ile Glu Ser
Asp Ala Ile Val Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Tyr Glu Phe Glu Leu
Arg Gly Pro Leu Phe Asn Tyr Ala Gly
【０１５０】
配列番号３：ggaggcgaat tcatgaaata tacggtgatt
配列番号４：taatcactgc agttatcctg cgtagttgaa
【０１５１】
これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡ ２５ｎｇ 、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ− １ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製） により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで消化したｐＫＫ２２３−３(アマシャム−ファルマシア社製)とＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【０１５２】
形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＥｘＳＤＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１の塩基配列と一致した。）
【０１５３】
（実施例２）
（カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換した大腸菌を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシルー３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの合成）
実施例１で得られたｐＥｘＳＤＲ１をもつ形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（国産化学）で３０℃で１．７時間生育させ、０．１ｍＭになるように イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに３０℃で２０時間培養した。得られた菌体ブロス２ｍＬを遠心分離により集菌し、１００μＬの緩衝液（１０％硫酸ナトリウム、１０％グルコースを含む１００ｍＭトリス（最終ｐＨ９．９））を加えよく混合した。これに３０μＬの１０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、３０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１ｕｎｉｔ／ｍｌ）、合成例２で得られた２０μＬの１０ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）を添加後４０℃で１８時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、２００μＬの２−プロパノールで溶かし、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルを定量した。
【０１５４】
定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＯＤＳカラムＡｃｅｎｔｉｓ Ａｍｉｄｅ（Ｓｐｅｌｃｏ社製 ４．６ｍｍｘ１０ｃｍ） ４０℃
溶離液：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝４０／６０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１５５】
この結果、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの収量は１４．１μｇであった。
【０１５６】
また該遺伝子を含まないプラスミドｐＫＫ２２３−３を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【０１５７】
次に光学純度の測定をＨＰＬＣを用いて行なった。
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＯＤ−ＲＨ（ダイセル社製 ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ） ３０℃
溶離液：４０％アセトニトリル
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体はＲ，Ｒ体であった。
【０１５８】
（実施例３）
（カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換した大腸菌を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの合成）
実施例２と同様にして、形質転換体を培養した。得られた菌体ブロス２ｍＬを遠心分離により集菌し、５０μＬの４０％硫酸アンモニウム、５０μＬの５０％グルコース、２０μＬの１Ｍトリスを加えよく混合した。これに３０μＬの１０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、３０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１ｕｎｉｔ／ｍｌ）、合成例２で得られた２０μＬの１０ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル（ＤＭＳＯ溶液）を添加後４０℃で１８時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、２００μＬの２−プロパノールで溶かし、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを実施例１と同様に定量した。
【０１５９】
この結果、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの収量は４８．０μｇであった。また該遺伝子を含まないプラスミドｐＫＫ２２３−３を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【０１６０】
次に光学純度の測定を実施例２と同様にして行なった所、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【０１６１】
（実施例４）
（アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）(IAM12048)による（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの合成）
酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、燐酸１カリウム１ｇ／Ｌ、燐酸２カリウム３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化マンガン０．０１ｇ／Ｌを含んだ培地を作成し、４０ｍｌを２００ｍｌのひだ付き三角フラスコにいれ１２０度２０分間の条件で滅菌した。この培地にアグロバクテリウム ツメファシエンス（ＩＡＭ１２０４８）を植菌し３０度で２４時間培養した。培養液を１ｍｌ遠心し菌体を得た。これに２０ｍＭのトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を５０μｌ、５０％のグルコース液を１０μｌ加え激しく攪拌した。この懸濁液にさらに１％のＮＡＤ+（オリエンタル酵母社製）を１０μｌ、１％のＮＡＤＰ+を１０μｌ、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬製 １ｕｎｉｔ／ｍｌ）を１０μｌ、合成例２で得られた１ｇ／Ｌの２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）を１０μｌ添加し３０度で１８時間反応させた。反応液に２−プロパノールを加え全量を１ｍｌとし、実施例２と同様に定量したところ、２Ｒ，３Ｒ'-２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルは１．７ｍｇ／Ｌの濃度であった。光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【０１６２】
（実施例５）
（各種バクテリアによる２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの合成）
実施例４と同様に表１に記載した各種バクテリアを植菌し３０℃で２４時間培養した。ただしVariovorax paradoxus (DSM66)は1週間培養した。培養液を３０ｍｌ遠心し菌体を得た。５mlの蒸留水を加え超音波破砕し遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液２００μｌに１Ｍのトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を３０μｌ、５０％のグルコース液を１０μｌ加え激しく攪拌した。この懸濁液にさらに１％のＮＡＤ+（オリエンタル酵母社製）を１０μｌ、１％のＮＡＤＰ+を１０μｌ、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬製 １ｕｎｉｔ／ｍｌ）を１０μｌ、合成例３で得られた１０ｇ／Ｌの２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル（ＤＭＳＯ溶液）を１０μｌ添加し３０度で１８時間反応させた。反応液に２−プロパノールを加え全量を１ｍｌとし定量した。定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【０１６３】
カラム：ＯＤＳカラムＡｃｅｎｔｉｓ Ａｍｉｄｅ（Ｓｐｅｌｃｏ社製 ４．６ｍｍｘ１０ｃｍ） ４０℃
溶離液：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝５５／４５
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１６４】
生成した還元体である２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチル量を表１に示す。なおいずれもａｎｔｉ体でありｓｙｎ体は検出されなかった。
【０１６５】
【表１】
【０１６６】
（実施例６）
（各種微生物による２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの合成）
実施例４と同様に、表２に記載した各種微生物を植菌し３０℃で１から７日十分に生育するまで培養した。培養液を１ｍｌ遠心し菌体を得た。これに0.1Ｍのトリス塩酸バッファー（ｐＨ１０）を１００μｌ、５０％のグルコース液を２０μｌ、１％のＮＡＤ+（オリエンタル酵母社製）を２０μｌ、１％のＮＡＤＰ+を２０μｌ、加え激しく攪拌した。この懸濁液にさらにグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬製 １ｕｎｉｔ／ｍｌ）を１０μｌ、合成例３で得られた２．５ｇ／Ｌの２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）を２０μｌ添加し３０度で1日反応させた。反応液に２−プロパノールを０．３ｍｌ加えＨＰＬＣで定量した。生成した還元体である２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピル量を表２に示す。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【０１６７】
カラム：ＯＤＳカラムＡｃｅｎｔｉｓ Ａｍｉｄｅ（Ｓｐｅｌｃｏ社製 ４．６ｍｍｘ１０ｃｍ） ４０℃
溶離液：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝４０／６０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１６８】
【表２】
【０１６９】
（実施例７）
実施例２と同様にして培養し得られた形質転換体５．６６ｇに０．１ｍMジチオスレイトール(dithiothreitol)を含む１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０））１８ｍｌを加えよく混合した。この菌体懸濁液を超音波破砕し遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液は蛋白濃度４９g/Lであった。
【０１７０】
（１）カルボニルレダクターゼ活性の測定
カルボニルレダクターゼ活性の測定は100mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、0.32mM NADPH、10mM ３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを含む反応液を3７℃で行った。1Uは上記反応条件で1分間に1μmolのNADPHを酸化する酵素量とした。結果、5U/mlであった。
【０１７１】
合成例６で得られた２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチルを１０ｇ／Ｌとなるように、ＤＭＳＯあるいは２−プロパノールで溶解させた。
【０１７２】
粗酵素液１８０μＬあるいは粗酵素液２０μＬに蒸留水１６０μＬ加えたもの、さらにあるいは蒸留水１８０μＬに２５μＬの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０）、１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１０μＬの５０％グルコース液、１０μＬの１０ｇ／Ｌ基質液を添加後３０℃で90分振とう反応させた。反応終了後の反応液に５００μＬの酢酸エチルを添加しよく攪拌後有機層を別の容器に移し乾燥させた。乾燥後２０μＬイソフ゜ロハ゜ノールに溶解させうち２μＬをTLCで分析した。（シリカゲルプレート 展開液 ヘキサン／酢酸エチル＝１／１ ＵＶ照射で検出） 基質を溶かした溶媒がＤＭＳＯの方が還元体生成量が多かった。ＤＭＳＯ溶液で反応させたサンプルをＬＣ−Ｍａｓｓで分析した。
【０１７３】
ＬＣ−Ｍａｓｓ装置：ヒューレットパッカード社１１００ＭＳＤ
ＨＰＬＣカラム：MCI−GEL ＯＤＳ−１ＨＵ(１50 x 4.6 mm)
溶離液A：１０ｍM 酢酸アンモニウム液 溶離液B：１００％アセトニトリル A:B=50:50
流速： ０．５ ml／min
温度：４０℃
ＵＶ２２０ｎｍ
イオン化電圧：２０Ｖ
イオン化法：ＡＰＩ−ＥＳ法
正イオン測定モード
【０１７４】
粗酵素液１８０μＬの条件では変換率は８４％、還元体収率は３０％であった。ディアステレオ選択性は８６％ｄ．ｅ．であり、アンチ体が主であった。また脱炭酸された化合物が（[M＋H]+＝２４８．１）４７％生成していた。
【０１７５】
粗酵素液２０μＬの条件では変換率は２２％、還元体収率は７％であった。ディアステレオ選択性は９１％ｄ．ｅ．であり、アンチ体が主であった。また脱炭酸された化合物が（[M＋H]+＝２４８．１）９％生成していた。
【０１７６】
蒸留水１８０μＬの条件では基質はまったく変換されなかった。
実施例４と同様に光学純度を測定したところ、１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【０１７７】
（実施例８）
実施例７で得られた粗酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製を行った。塩化ナトリウム０〜０．６Ｍのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム付近にピークが見られた。これを粗精製酵素とした。カルボニルレダクターゼ活性は１U/mlであった。
【０１７８】
この粗精製酵素１８０μＬに２５μＬの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０）、１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、５μＬの１Mグルコース液、５μＬの１０ｇ／Ｌ基質液を添加後３０℃で3時間半反応させたところ 変換率は１００％、還元体収率は９９％であった。ディアステレオ選択性は９０％ｄ．ｅ．であり、アンチ体が主であった。
【０１７９】
（実施例９）
（各種（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの合成）
実施例２と同様にして培養し得られた形質転換体２５ｇに１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０））を加え１５０ｍｌとしよく混合した。この菌体懸濁液を超音波破砕し硫酸アンモニウムを３０ｇ添加し溶解させてから遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液はカルボニルレダクターゼ活性２．６U/mlであった。これにさらにグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製）を２ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加した。
【０１８０】
この粗精製酵素８８μＬに２５μＬの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０）、１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬの５０％グルコース液、１０μＬの１０ｇ／Ｌ基質液を添加後３０℃で１９時間反応させた。基質は２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ｎ−プロピルを用いた。エチルエステルは変換率９７％、還元体収率９７％、イソプロピルエステルは変換率７７％、還元体収率７６％、ｎ−プロピルエステルは変換率８７％、還元体収率８２％、であった。
【０１８１】
（実施例１０）
（化学式１で表される各種３−オキソアミノ酸誘導体からの化学式２で表される各種光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体生成）
実施例２と同様にして培養し得られた形質転換体１０ｇに緩衝液（１０％硫酸ナトリウム、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム-１０ｍＭ炭酸ナトリウム（最終ｐＨ８．５））を加え全量を40mlとしてよく混合した。この菌体懸濁液を超音波破砕し遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液は蛋白濃度80g/Lであった。この粗酵素液はカルボニルレダクターゼ活性５U/mlであった。これにさらにグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製）を１００ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加した。
【０１８２】
この粗酵素液１００μＬに１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、５μＬの５０％グルコース液、１０μＬの１０ｇ／Ｌ 表３に示す化学式１で表される各種３−オキソアミノ酸誘導体（ＤＭＳＯ溶液）を添加後３７℃で１日から2日振とう反応させた。反応終了後の反応液に１０００μＬの２−プロパノールを添加しよく攪拌後LC-Ｍａｓｓで分析した。
【０１８３】
ＬＣ-Ｍａｓｓの条件は以下の通りである。
ＬＣ−Ｍａｓｓ装置：ヒューレットパッカード社１１００ＭＳＤ
ＨＰＬＣカラム：L-column ＯＤＳ−１ＨＵ(250 x 4.6 mm)
溶離液A：１０ｍM 酢酸アンモニウム液 溶離液B：１００％アセトニトリル
グラジェント方法１ A:B=50:50 （０分） → A:B=0:100 （１０分）
A:B=0:100 （10分〜15分）
グラジェント方法２ A:B=40:60 （０分） → A:B=0:100 （１０分）
A:B=0:100 （10分〜15分）
流速：１ ml／min
温度：４０℃
ＵＶ２５４ｎｍ
イオン化電圧：２０Ｖ
イオン化法：ＡＰＩ−ＥＳ法
正イオン測定モード
グラジェント方法１での分析を分析条件１としグラジェント方法２での分析を分析条件２とする。
分析の結果を表３に示す。
【０１８４】
【表３】
【０１８５】
なお表３中の面積％とはｍａｓｓクロマトグラムで得られた還元体と基質のヒ゜ークの面積値の総和に対する比率を表す。還元体のマスイオンおよびリテンションタイムとも３−オキソアミノ酸誘導体を化学的に還元して得られた３−ヒドロキシアミノ酸誘導体と一致した。
【０１８６】
（実施例１１）
実施例１０において反応性が良くジアステロマー過剰度も高い基質に関して、得られた還元体、３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の立体構造を調べるべく反応スケールをあげて実施し、分取ＴＬＣにより還元体を掻き取り酢酸エチルで回収し濃縮した。得られた粗精製体のジアステロマー過剰度(diastereomer excess; de%)および光学純度(enantiomer excess; ee%)を調べた。
【０１８７】
ジアステロマー過剰度の測定は下記の条件のＨＰＬＣを用いて行なった。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ−ＣＮ（ＧＬサイエンス社製 ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）４０℃
溶離液A：8０％１０ｍM酢酸アンモニウム,2０％アセトニトリル液
溶離液B：１００％アセトニトリル
グラジェント方法3 A:B=９０:１０ （０分〜20分） → A:B=0:100 （30分）
A:B=0:100 （30分〜35分）
グラジェント方法4 A:B=8０:2０ （０分〜20分） → A:B=0:100 （30分）
A:B=0:100 （30分〜35分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
グラジェント方法３での分析を分析条件３としグラジェント方法４での分析を分析条件４とする
【０１８８】
光学純度の測定は下記の条件のＨＰＬＣを用いて行なった。
カラム：ＯＤ−Ｈ（ダイセル社製 ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）３０℃
溶離液：溶離液５ Hex/IPA=95/5 溶離液６ Hex/IPA=9０/１０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ230ｎｍ
溶離液５での分析を分析条件５とし溶離液６での分析を分析条件６とする。結果を表４に示す。
【０１８９】
【表４】
【０１９０】
次にこれらをNMRの測定に供した。以下に結果を示す。
【０１９１】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシブタン酸イソプロピル、
【化１２】
【０１９２】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.14(3H,d,J=6.3Hz),1.24(3H,d,J=6.3Hz),1.25(3H,d,J=6.3Hz),
3.66(1H,m),4.25(1H,m),4.78(1H,dd,J=6.6,3.0Hz),5.06(1H,sept,J=6.3Hz),
7.08(1H,brd,J=5.6Hz),7.38-7.50(3H,m),7.76-7.78(2H,m)
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ１８．４８, 21.7３, 59.14, 69.53,
70.23, 127.21,128.69,132.11, 133.28, 168.43, 169.71 ppm
【０１９３】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシペンタン酸イソプロピル、
【化１３】
【０１９４】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.95(3H,t,J=7.5Hz),1.24(3H,d,J=6.3Hz),1.25(d,J=6.3Hz),
1.47(2H,m),3.38(1H,brd,J=7.3Hz),3.92(1H,m),4.77(1H,dd,J=6.8,3.0Hz),
5.07(1H,sept,J=6.3Hz),7.09(1H,brd,J=6.0Hz),7.36-7.49(3H,m),7.73-7.78(2H,m)
【０１９５】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸イソプロピル
【化１４】
【０１９６】
１H NMR（400MHz、CDCl３）：δ1.00(3H, d, J=6.6Hz), 1.05(3H d, J=6.6Hz), 1.31(3H, d, J=6.0Hz), 1.31(3H, d, J=6.0Hz), 1.78(1H, sept, J=6.6Hz), 3.22(1H, brs), 3.64(1H, d, J=7.3Hz), 4.90(1H, dd, J=6.3,3.0Hz), 5.13(1H, sept, J=6.0Hz), 7.19(1H, d, J=6.3Hz), 7.43-7.55(3H, m), 7.82-7.84(2H, m) ppm
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ18.04, 18.12, 20.71, 20.76, 30.67, 55.63, 68.99, 77.92, 126.14, 127.64, 130.94, 132.53, 166.56, 169.42 ppm
【０１９７】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシヘキサン酸イソプロピル、
【化１５】
【０１９８】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86(3H,t,J=7.3Hz),1.24(3H,d,J=6.3Hz),1.25(3H,d,J=6.3Hz),
1.28-1.55(4H.m),3.45(1H,brd,J=7.1Hz),4.02(1H.m),4.77(1H,dd,J=6.6,3.0Hz),
5.07(1H,sept,J=6.3Hz),7.09(1H,brd,J=6.1Hz),7.37-7.49(3H,m),7.76-7.78(2H,m)
【０１９９】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−４，４−ジメチルペンタン酸イソプロピル
【化１６】
【０２００】
１H NMR（400MHz、CDCl３）：δ1.00(9H, s), 1.31(6H, d, J=6.3Hz), 3.58-3.67(1H, brs),3.67(1H, d, J=2.8Hz), 4.92(1H, dd, J=7.6,2.8Hz), 5.07(1H, sept, J=6.3Hz), 7.14(1H, d, J=7.6Hz), 7.42-7.46(2H, m), 7.50-7.55(1H, m), 7.80-7.82(2H, m) ppm
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ20.45, 20.74, 25.15, 34.63, 54.04, 69.08, 80.15, 126.13, 127.66, 130.94, 132.55, 166.39, 170.39 ppm
【０２０１】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸イソプロピル、
【化１７】
【０２０２】
１H NMR（400MHz、CDCl３）：δ1.27(6H, d, J=6.3Hz), 4.73(1H, d, J=6.1Hz), 5.07(1H, sept, J=6.3Hz), 5.17(1H, dd, J=6.6, 3.0Hz), 5.40(1H, m), 6.91(1H, d, J=6.1Hz), 7.26-7.34(5H, m), 7.42-7.46(2H, m), 7.51-7.55(1H, m), 7.73-7.76(2H, m) ppm
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ20.65, 20.71, 58.88, 69.41, 74.52, 125.03, 126.15, 127.02, 127.23, 127.70, 131.14, 132.15, 138.17, 167.81, 167.88 ppm
【０２０３】
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピル
【化１８】
【０２０４】
1H−NMR(400MHz,CD3OD)：δ0.80−1.27(5H,m),1.58−1.79(5H,m),1.96−
1.99(1H,m),3.42(1H,m),4.00(1H,d,J＝2.3Hz)．
【０２０５】
２−ベンゾイルアミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピル、
【化１９】
【０２０６】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.20(3H,d,J=6.4Hz),1.18(3H,d,J=6.4Hz), 5.00(1H,sept,J=6.4Hz), 5.05(1H,dd,J=6.3,2.8Hz),5.29(1H,m), 6.89(1H,brs),7.14-7.23(4H,m),7.34-
7.50(3H,m),7.68(2H,d,J=8.1Hz)
13C NMR（100MHz、CDCl３）δ 20.69、20.72、58.88、69.65、73.93、126.16、126.48、127.37、127.76、131.31、131.88、132.75、136.84、167.65、167.89
【０２０７】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル
【化２０】
【０２０８】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.22(3H,d,J=6.3Hz),1.24(1H,d,J=6.0Hz), 5.03(1H,sept,J=6.0Hz), 5.16(1H,dd,J=7.4,3.3Hz),5.60(1H,m),6.83-6.89(2H,m), 6.98(1H,brd,J=6.1Hz), 7.17(1H,m), 7.37-7.72(3H,m),7.74(2H,m)
13C NMR（100MHz、CDCl３）δ 20.69、20.72、58.71、6975、71.60、123.49、124.24、125.55、126.26、127.73、131.28、131.99、141.53、167.31、168.34
【０２０９】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−３−（ナフタレン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル、
【化２１】
【０２１０】
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.16(6H,d,J=6.3Hz),5.00(1H,sept,J=6.3Hz)5.18(1H,dd,J=6.8,3.0Hz),5.50(1H,d,J=3.0Hz),6.56(1H,brd,J=6.6Hz),7.33-7.47(6H,m),7.67-7.76(6H,m)
13C NMR（100MHz、CDCl３）δ 20.64、20.70、58.95、69.46、74.64、122.97、124.13、
124.99、125.17、126.16、126.66、126.94、126.98、127.70、131.16、132.03、132.11、
132.14、135.76、167.84、167.89
【０２１１】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシトリデカン酸イソプロピル、
【化２２】
【０２１２】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ0.82(3H,t,J=6.9Hz), 1.12-1.21(14H,m), 1.23(3H,d,J=6.2Hz), 1.25(3H,d,J=6.2Hz), 1.26-1.57(4H,m), 3.50(1H,brs),
3.97-4.04(1H,m), 4.77(1H,dd,J=6.8,3.0Hz), 5.01-5.12(1H,m), 7.10(1H,d,J=6.8Hz),
7.36-7.42(2H,m), 7.44-7.49(1H,m), 7.75-7.78(2H,m) ppm.
13C−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ13.09, 20.75, 21.66, 24.69, 28.30,
28.47, 28.48, 28.55, 28.58, 30.88, 32.27, 57.53, 69.08, 72.40, 126.21, 127.66,
131.03, 132.39, 167.09, 168.93 ppm.
【０２１３】
３−ヒドロキシ−３−フェニル−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
【化２３】
【０２１４】
３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
【化２４】
【０２１５】
MeCN/50mMAcONH4 ＝60/40 230nm L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃ 4.84min
anti:rt 7.45 min, syn:rt8.01 min
【０２１６】
３−ヒドロキシ−２−ピバロイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル、
【化２５】
【０２１７】
MeCN/50mMAcONH4 ＝60/40 230nm L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃
anti:rt 5.58 min,, syn:rt5.91 min
【０２１８】
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸フェニル
【化２６】
【０２１９】
MeCN/50mMAcONH4=2/8-(15min)-1/0(5minHOLD), 254nm L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃ anti：rt14.10 min, syn：ｒｔ14.29 min
【０２２０】
３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル
【化２７】
【０２２１】
MeCN/50mMAcONH4=55/45, 230nm
L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃ anti：rt11.42 min, syn：ｒｔ10.96 min
【０２２２】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸ベンジル、
【化２８】
【０２２３】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ0.88(3H,d,J=6.6Hz), 0.94(3H,d,J=6.6Hz), 1.60-1.67(1H,m), 3.56(1H,dd,J=8.6,3.0Hz), 4.93(1H,dd,J=7.1,3.0Hz),
5.16(1H,d,J=12.4Hz), 5.22(1H,d,J=12.4Hz), 7.07(1H,d,J=7.1Hz), 7.24-7.34(5H,m),
7.35-7.41(2H,m), 7.44-7.49(1H,m), 7.72-7.77(2H,m) ppm.
13C−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ17.92, 18.03, 30.55, 55.27, 66.58,
77.91, 126.15, 127.36, 127.59, 127.65, 127.66, 130.99, 132.46, 133.94, 166.50,
169.81 ppm.
【０２２４】
（実施例１２）
（変異型カルボニルレダクターゼを共現させた大腸菌を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルおよび（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの合成）
配列番号２の８８番目のアミノ酸のフェニルアラニンがイソロイシンに変換された変異型カルボニルレダクターゼをコードする遺伝子を用いる以外は実施例１から２と同様に行った。得られた菌体ブロス１ｍＬを遠心分離により集菌し、７０μＬの緩衝液（１０％硫酸アンモニウム、３％グルコースを含む１００ｍＭトリス（最終ｐＨ７．５））を加えよく混合した。これに１０μＬの１ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１０μＬの５０％グルコース、１０μＬの２．５ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）あるいは１０ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル（ＤＭＳＯ溶液）を添加後３３℃で２４時間振とう反応させた。反応終了後の反応液に７５０μＬの２−プロパノールを加え、還元体を定量した。（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルおよび（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルはそれぞれ６．２μｇ、２９．３μｇ生成されていた。ディアステレオ選択性は１００％ｄ．ｅ．であり、アンチであった。光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】図１は、合成例における反応の概要を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２２６】
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> API Corporation
<120> A method for producing an optically active hydroxyl amino acid derivative
<130> A61442A
<160> 4
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Exiguobacterium sp.
<400> 1
atgaaatata cggtgattac tggagcaagt tcaggaattg gatatgagac ggcaaaacta 60
ctcgcaggaa aaggaaaatc actcgttctc gtcgcgcgac ggacgtctga gctcgaaaaa 120
cttcgggatg aagtcaaaca aatctcacca gatagtgatg tcatcctcaa gtcggtcgat 180
ctcgcagata accaaaatgt ccatgattta tatgagggat taaaggaact cgacatcgaa 240
acgtggatca acaatgctgg attcggcgat tttgatctcg tccaggacat tgagctcggg 300
aaaatcgaga aaatgcttcg cttgaacatc gaggcgctaa cgattctatc gagtctgttc 360
gtccgcgatc atcatgacat cgaaggaacg acgctcgtca atatctcgtc agcaggtggc 420
taccggatcg tgccgaacgc ggtcacgtat tgcgcgacga agttctatgt cagtgcttat 480
acagaagggc tcgcgcaaga actgcaaaaa ggtggggcaa aacttcgggc gaaagtactg 540
gcaccagctg cgactgagac agagtttgcg gatcgttcgc gcggcgaagc aggtttcgac 600
tacagcaaga acgtcaaaaa gtaccatacg gcggctgaaa tggcaggctt cctgcatcag 660
ttgattgaaa gcgacgcgat cgtcggcatc gtcgacggtg agacgtatga gttcgaattg 720
cgtggtccat tgttcaacta cgcaggataa 750
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> Exiguobacterium sp.
<400> 2
Met Lys Tyr Thr Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Ala Lys Leu Leu Ala Gly Lys Gly Lys Ser Leu Val Leu Val Ala
20 25 30
Arg Arg Thr Ser Glu Leu Glu Lys Leu Arg Asp Glu Val Lys Gln Ile
35 40 45
Ser Pro Asp Ser Asp Val Ile Leu Lys Ser Val Asp Leu Ala Asp Asn
50 55 60
Gln Asn Val His Asp Leu Tyr Glu Gly Leu Lys Glu Leu Asp Ile Glu
65 70 75 80
Thr Trp Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Asp Phe Asp Leu Val Gln Asp
85 90 95
Ile Glu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Met Leu Arg Leu Asn Ile Glu Ala
100 105 110
Leu Thr Ile Leu Ser Ser Leu Phe Val Arg Asp His His Asp Ile Glu
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Val Asn Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Arg Ile Val
130 135 140
Pro Asn Ala Val Thr Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Tyr Val Ser Ala Tyr
145 150 155 160
Thr Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Gln Lys Gly Gly Ala Lys Leu Arg
165 170 175
Ala Lys Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Glu Thr Glu Phe Ala Asp Arg
180 185 190
Ser Arg Gly Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Lys Asn Val Lys Lys Tyr
195 200 205
His Thr Ala Ala Glu Met Ala Gly Phe Leu His Gln Leu Ile Glu Ser
210 215 220
Asp Ala Ile Val Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Tyr Glu Phe Glu Leu
225 230 235 240
Arg Gly Pro Leu Phe Asn Tyr Ala Gly
245
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
ggaggcgaat tcatgaaata tacggtgatt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
taatcactgc agttatcctg cgtagttgaa 30
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボニルレダクターゼを含む微生物、同微生物の調製物もしくは同微生物を培養して得られた培養液を用いて、３−オキソアミノ酸誘導体の２位のアミノ基を立体認識しながら、３位のカルボニル基を立体選択的に還元し、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である。例えば（２Ｒ，３Ｒ）−３−シクロへキシル−３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は医薬の中間体として用いられているが、これの製法としては光学活性なエポキシドを生成して３−シクロへキシル−３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に導く方法（特許文献１）、または、３−シクロへキシル−３−オキソアミノ酸誘導体を不斉触媒で還元して得られることが報告されているが（非特許文献１）、前者は原料化合物の単価が高く工業的に問題があり、また、後者は高圧水添のため特別な反応装置を必要とし、かつ光学純度も満足なものではなく、工業化は困難であった。
【０００３】
カルボニルレダクターゼは、カルボニル（ｃａｒｂｏｎｙｌ）基の炭素・酸素二重結合を還元する反応を触媒する酵素であるが、酵母、細菌、カビなどの各種の微生物でその存在が報告されている。例えば、下記反応式のような、Ｎ−アセチル化された３−オキソアミノ酸誘導体の還元によるスレオニン誘導体の生成が記載されている（特許文献２、３、４）。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかしながらこの方法では、ディアステレオマーや光学異性体の選択的合成は行われていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−５５３５８号公報
【特許文献２】特開平２−６０５９２号公報
【特許文献３】特開平２−６０５９３号公報
【特許文献４】特開平２−６０５９４号公報
【非特許文献１】Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ （２００４） ｖｏｌ４３ ｐｐ８８２−８８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を、より高い光学純度で安価かつ簡便に製造するための新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法について鋭意検討した結果、微生物の菌体及び／または該菌体処理物が、原料となる３−オキソアミノ酸誘導体の不斉還元反応を触媒することを見出した。さらに、該不斉還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を作製し、該細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、原料となる３−オキソアミノ酸誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物である光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を得られることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 下記一般式（１）
【化２】
（式中、Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ2は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ1からＲ3におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
で表される３−オキソアミノ酸誘導体のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、前記一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用させて、下記一般式（２）
【化３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は前記と同義である）
で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成させることを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【００１０】
（２） 微生物がアブシディア（Absidia）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、シトロバクター（Citrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、デルフティア（Delftia）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディイデス（Nocardioides）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス（Paracoccus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドコッカス（Rhodococccus）属、セラチア（Serratia）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、バリドボラックス（Variovorax）属、又はエクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属に属する微生物であることを特徴とする（１）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【００１１】
（３） 微生物が下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡを発現させた形質転換体である、（１）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
（４） 形質転換体が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換されたものである、（３）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（５） 形質転換体が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体である、（３）に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【００１３】
（６） 一般式（１）および（２）の化合物において、Ｒ2がアリール基であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（７） 一般式（２）の光学純度が９８％ｅｅである（１）〜（６）のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
（８） 一般式（２）の絶対配置が下記一般式（３）で表されるように２Ｒ，３Ｒであることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【化４】
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を高い光学純度で得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
【００１６】
（３−オキソアミノ酸誘導体、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体）
本発明においては、微生物の菌体及び／または該菌体処理物を反応基質である下記一般式（１）
【００１７】
【化５】
【００１８】
（式中、Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ2は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ1からＲ3におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用させて、下記一般式（２）
【００１９】
【化６】
【００２０】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は前記と同義である）
で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成させる。
【００２１】
Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環を示す。ここで、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基、ｎ−デシル基等の炭素数１〜３０、好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数１〜１０の直鎖、分岐鎖、又は環状のアルキル基が挙げられる。
【００２２】
アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ベンゾイル基、チオフェニル基などの炭素数６〜２０のアリール基を挙げることができる。
【００２３】
ヘテロ環基としては、Ｎ、ＯまたはＳ原子の少なくとも一つを含む３員から１０員の飽和もしくは不飽和のヘテロ環基を挙げることができ、これらは単環であってもよいし、更に他の環と縮合環を形成してもよい。ヘテロ環基として好ましくは、縮合環を有していてもよい５ないし６員の不飽和ヘテロ環基であり、より好ましくは縮合環を有していてもよい５ないし６員の芳香族ヘテロ環基である。ヘテロ環基中のヘテロ環の具体例としては、例えばピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアゾール、トリアジン、インドール、インダゾール、プリン、チアジアゾール、オキサジアゾール、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンズセレナゾール、インドレニン、テトラザインデンなどが挙げられる。
【００２４】
上記のアルキル基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい。アルキル基、アリール基及びヘテロ環基が有していてもよい置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００２５】
置換されたアルキル基として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、トリル基、メシチル基、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。
【００２６】
また、上記アルキル基及びアリール基内の炭素原子は窒素原子、硫黄原子、酸素原子など複素原子で置換されていてもよい。例えば、アルキル基としては、ＣＨ3（ＣＨ2）nＳ（ＣＨ2）n−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＮＨ（ＣＨ2）n−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）n−などでもよい（ここで、ｎは１以上の整数を示し、好ましくは１から１０を示し、より好ましくは１から５を示す）。
【００２７】
Ｒ1として好ましいのは、炭素数１〜３０のアルキル基、アリール基またはヘテロ基である。さらに好ましくは、炭素数１〜２０の鎖状、環状または分岐状アルキル基、フェニル基、クロロフェニル基、ナフチル基、チオフェニル基であり、より好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロヘキシル基、ｎ−デシル基、フェニル基、クロロフェニル基、ナフチル基、またはチオフェン基である。
【００２８】
Ｒ2は、炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示す。炭素数４以上のアルキル基としては、前記Ｒ1で挙げたアルキル基のうち炭素数４以上のものが挙げられる。炭素数４以上のアルコキシ基としては、上記した炭素数４以上のアルキル基の１個の水素原子を水酸基で置換したアルコキシ基を挙げることができ、炭素数４〜２０、好ましくは炭素数４〜１０、より好ましくは炭素数４〜６の直鎖、分岐鎖、又は環状のアルコキシ基を挙げることができ、具体的には、ｔ−ブトキシ基、−Ｏ−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5などを挙げることができる。Ｒ2が示すアリール基及びヘテロ環基としては、前記Ｒ1で挙げたアリール基及びヘテロ環基が挙げられる。
【００２９】
Ｒ2が示す炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基は置換されていてもよい。炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基が有していてもよい置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ2としてはフェニル基、又はtert-ブチル基が好ましい。
【００３１】
Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示す。Ｒ3が示すアルキル基及びアリール基としては、前記Ｒ1で挙げたものが挙げられる。
【００３２】
Ｒ3が示すアルキル基またはアリール基は置換されていてもよい。アルキル基またはアリール基が有していてもよい置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００３３】
Ｒ3としては、炭素数１〜６の直鎖状または分岐上のアルキル基、又はベンジル基が好ましい。Ｒ3として特に好ましいものはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基である。
【００３４】
一般式（１）の具体的な化合物としては以下の化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ｎ−プロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸フェニル、
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ベンジル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸メチル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸エチル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸ｎ−プロピル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸ベンジル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソブタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソペンタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソヘキサン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−４，４−ジメチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−フェニル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−（チオフェン−２−カルボキサミド）−３−（チオフェン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
２−ベンゾイルアミノ−３−（ナフタレン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル、
３−オキソ−３−フェニル−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノブタン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノペンタン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノヘキサン酸イソプロピル、
４，４−ジメチル−３−オキソ−２−ピバロイルアミノペンタン酸イソプロピル、
３−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
３−オキソ−２−ピバロイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル、
２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル、
【００３５】
一般式（２）の具体的な化合物としては、上記一般式（１）の具体的化合物のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元することによって得られる光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体である。
【００３６】
一般式（２）の化合物は、２位と３位に不斉炭素を有するため４種の異性体を有し、（２Ｒ，３Ｒ）体、（２Ｒ，３Ｓ）体、（２Ｓ，３Ｒ）体、（２Ｓ，３Ｓ）体があるが、本発明における微生物の菌体及び／または該菌体処理物を用いた製造ではその中から1種類を優先的に製造する。なお医薬の中間体として需要がある化合物としては（２Ｒ，３Ｒ）体であることが好ましい。 また（２Ｒ，３Ｒ）体および（２Ｓ，３Ｓ）体をアンチ（ａｎｔｉ）体 （２Ｒ，３Ｓ）体および（２Ｓ，３Ｒ）体をシン（ｓｙｎ）体という。
【００３７】
【化７】
【００３８】
（本発明に用いられる微生物の菌体及び／または該菌体処理物）
本発明に用いる微生物の菌体及び／または該菌体処理物としては、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用し、β位のカルボニル基を立体特異的に還元することによって一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成するものであればいずれを用いてもかまわない。
【００３９】
光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の生成の確認方法としては、通常、一般式（１）の３−オキソアミノ酸誘導体を含む水溶液に対象となる微生物、その菌体処理物を作用させ、その反応液を薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用い、基質、及び生成物である一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を定性、定量すればよい。
【００４０】
本発明における一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は光学純度が９６％ｅｅ以上であることが好ましく、さらに好ましくは９８％ｅｅ以上、より好ましくは９９％ｅｅ以上である。光学純度が低いと、医薬中間体として用いるために更なる精製が必要となる。一般的に光学異性体同士の分離精製は特殊なカラムを用いたり、あるいは、別の光学活性体とともに晶析するなど、容易とはいえない作業であり、光学純度の高い化合物をこのような分離精製することなく製造する方法を提供する事は重要である。
【００４１】
本発明に用いることのできる微生物の菌体及び／または該菌体処理物は、上記生成確認法に供し、数分以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質の減少が確認しうるもの、具体的には、数時間以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質が１％以上、好ましくは５％以上減少するものである。
【００４２】
一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用して一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成する微生物としては、アブシディア（Absidia）属に属する微生物、アクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物、アルスロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物、バチルス（Bacillus）属に属する微生物、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属に属する微生物、セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物、シトロバクター（Citrobacter）属に属する微生物、コマモナス（Comamonas）属に属する微生物、デルフティア（Delftia）属に属する微生物、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に属する微生物、ノカルディイデス（Nocardioides）属に属する微生物、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物、パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、リゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物、ロドコッカス（Rhodococccus）属に属する微生物、セラチア（Serratia）属に属する微生物、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する微生物、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物、バリドボラックス（Variovorax）属に属する微生物、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物、並びにカルボニルレダクターゼをコードする遺伝子を有する組換え微生物が挙げられる。
【００４３】
アブシディア（Absidia）属に属する微生物としては、具体的にはアブシディア リクテミ（Absidia lichthemi）OUT1010、が挙げられる。
アクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物としては、具体的にはアクレモニウム クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）ATCC14615が、挙げられる。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物としては、例えばアグロバクテリウム リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）MAFF03-01724、MAFF07-20001、MAFF301724 、IAM13570アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）MAFF301001、MAFF301222、IAM12048,IAM13129が挙げられる。
【００４４】
アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物としては、具体的にはアルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes faecalis）JCM10169、が挙げられる。
アルスロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物としては、具体的にはアルスロバクター クリスタロポエテス（Arthrobacter crystallopoietes）JCM2522アルスロバクター スルファレス（Arthrobacter sulfureus）JCM1338アルスロバクター エスピー（Arthrobacter sp）JCM1336、IFO14590、が挙げられる。
バチルス（Bacillus）属に属する微生物としては、具体的にはバチルス レンタス（Bacillus lentus）IAM11055が挙げられる。
【００４５】
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物としては、具体的にはブレビバクテリウム スルフレム（Brevibacterium sulfureum)
(JCM1485)が挙げられる。
ブレブンディモナス（Brevundimonas）属に属する微生物としては、具体的にはブレブンディモナス（Brevundimonas diminuta）IFO12697が挙げられる。
セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物としては、具体的にはセルロモナス（Cellulomonas biazotea）ATCC486セルロモナス（Cellulomonas flavigena）ATCC482が挙げられる。
【００４６】
シトロバクター（Citrobacter）属に属する微生物としては、具体的にはシトロバクター（Citrobacter youngae）ATCC11102が挙げられる。
コマモナス（Comamonas）属に属する微生物としては、具体的にはコマモナス（Comamonas terrigena）IFO13299、IFO12685、NBRC14918が挙げられる。
デルフティア（Delftia）属に属する微生物としては、具体的にはデルフティア（Delftia acidovorans）JCM6218が挙げられる。
【００４７】
マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に属する微生物としては、具体的にはマイコバクテリウム エスピー（Mycobacterium sp.）NCIMB11678、NCIMB11677が挙げられる。
ノカルディイデス（Nocardioides）属に属する微生物としては、具体的にはノカルディイデス シンプレックス（Nocardioides simplex）IAM1398が挙げられる。
オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物としては、具体的にはオクロバクトラム アンスロピー（Ochrobactrum anthropi）ATCC49237 オクロバクトラム エスピー（Ochrobactrum sp）IFO12950が挙げられる。
【００４８】
パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物としては、具体的にはパラコッカス デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）IFO12442、IFO13301が挙げられる。
シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物としては、具体的にはシュードモナス アルカリゲネスJCM5967（Pseudomonas alcaligenes）シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）NCIMB11924シュードモナス タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460, シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp）DSM6426が挙げられる。
リゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物としては、具体的にはリゾビウム ホーキー（Rhizobium haukuii）MAFF 210250 が挙げられる。
【００４９】
ロドコッカス（Rhodococccus）属に属する微生物としては、具体的にはロドコッカス ロドクロス（Rhodococccus rhodochrous）ATCC21291が挙げられる。
セラチア（Serratia）属に属する微生物としては、具体的にはセラチア（Serratia marcescens）IFO3046セラチア（Serratia plymuthica）NCIMB8285が挙げられる。
シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する微生物としては、具体的にはシノリゾビウム メリロティー（Sinorhizobium meliloti）IAM12611、MAFF 303042が挙げられる。
【００５０】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物としてはストレプトマイセス アクロモゲネス サブスピーシーズ アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes subsp. Achromogenes） IFO12735が挙げられる。
バリドボラックス（Variovorax）属に属する微生物としては、具体的には バリドボラックス パラドクサス（Variovorax paradoxus） DSM30034、DSM30162が挙げられる。
エクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属に属する微生物としては、具体的にはエクシグオバクテリウム ｓｐ（Exiguobacterium sp）MCI4322株（FERM-P-19239株）が挙げられ、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターから入手可能である。
【００５１】
これらの微生物は各研究機関から取得できる。
ＩＡＭカルチャーコレクション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉａｍ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｍｉｓｙｓｔ／ＣｏｌｌｅＢＯＸ／ｊｐ／ＩＡＭｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）
JCM（理化学研究所、バイオリソースセンター）(http://www.jcm.riken.jp/JCM/JCM_Home_J.html）
NBRC（旧IFOを含む）独立行政法人 製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NBRC）遺伝資源保存課
（http://www.nbrc.nite.go.jp/gene.html）
IAM（東京大学分子細胞生物学研究所 細胞機能情報研究センター ＩＡＭカルチャーコレクション）（http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/misyst/ColleBOX/jp/IAMcollection.html）
ＮＣＩＭＢ（日本代理店 （株）エヌシーアイエムビー・ジャパン）（http://www.ncimb.co.jp/index.html）
ＡＴＣＣ (American Type Culture Collection（http://www.atcc.org/Home.cfm）)（日本代理店：住商ファーマ インターナショナル ＡＴＣＣ事業グループ）
（http://www.summitpharma.co.jp/japanese/index_j.html）
ＤＳＭ （http://www.dsmz.de/species/strains.htm）
ＣＢＳ（Centraalbureau voor Schimmelcultures Uppsalalaan）http://www.cbs.knaw.nl/databases/index.htm
ＮＣＹＣ （National Collection of Yeast Cultures）http://www.ifrn.bbsrc.ac.uk/NCYC/）
OUT : Department of Fermentation Technology, Faculty of Engineering, Osaka University, Osaka, Japan
MAFF : Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Tsukuba, Japan
(http://www.gene.affrc.go.jp/micro/index_j.html)
NRRL : Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization
FERM-P；独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センター
【００５２】
カルボニルレダクターゼは、一般には、カルボニル（carbonyl）の炭素・酸素二重結合の還元反応を触媒する酵素をいうが、本発明においては、３−オキソアミノ酸誘導体の炭素・酸素二重結合を不斉還元して光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素をいう。
【００５３】
本発明の製造方法において用いることのできるカルボニルレダクターゼとしては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のカルボニルレダクターゼである。
【００５４】
また、本発明においては、これらのホモログであって、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとは、例えば、前記活性を害さない範囲内において配列番号２に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００５５】
また、前記ホモログは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号２に記載のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍによりホモロジー検索を行った結果、配列番号２の配列はクロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のオキシドレダクターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８）と５７％の相同性を示した。
【００５６】
本発明の製造方法に用いるカルボニルレダクターゼは、カルボニルレダクターゼの一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニルレダクターゼ活性を有する任意の微生物からカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡを大腸菌などの宿主に発現させることによって得ることができる。また、カルボニルレダクターゼ活性を有する微生物、例えば、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。細菌の菌体からカルボニルレダクターゼを取得する方法としては、例えば、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ． ９７， ｐ１０３（１９７９）に記載の方法を参考に行うことができる。
【００５７】
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、例えばエクシグオバクテリウム ｓｐ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＦＥＲＭ−Ｐ−１９２３９株（ＭＣＩ４３２２株）が、本発明に好適に利用できるカルボニルレダクターゼを有しており、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターから入手可能である。
【００５８】
本発明の製造方法においては、３−オキソアミノ酸誘導体をカルボニルレダクターゼの精製酵素と反応させてもよいが、カルボニルレダクターゼを含む細胞、同細胞の調製物、または同細胞を培養して得られた培養液を、３−オキソアミノ酸誘導体に反応させて、３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を製造してもよい。カルボニルレダクターゼを含む細胞としては、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。
【００５９】
この場合、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号２のアミノ酸配列を有するカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列番号２のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。また、本発明製造法においては、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡのホモログであって、カルボニルレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００６０】
ここで、ホモログとは、カルボニルレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１に記載の塩基配列に１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなるＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００６１】
また、ホモログは、配列番号１または３の塩基配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、カルボニルレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００６２】
カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、カルボニルレダクターゼを上記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、カルボニルレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、カルボニルレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００６３】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニルレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ． １２０，ｐ６２１−６２３（１９８８））を行うことにより、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００６４】
なおカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００６５】
当業者であれば、配列番号１に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ｖｏｌ． １０， ｐ６４８７ （１９８２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ｖｏｌ． １００， ｐ４４８（１９８３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐ２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００６６】
また、配列番号２のアミノ酸配列の全部またはその一部や、配列番号１の塩基配列の全部または一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ等から入手可能）からのＰＣＲ等によりカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００６７】
さらに、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基配列の全部または一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、カルボニルレダクターゼ活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００６８】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００６９】
上記のようにして単離された、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニルレダクターゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換された細胞を培養することにより、カルボニルレダクターゼを該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００７０】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００７１】
このとき、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターをカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ｖｏｌ． ４３，ｐ７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ｖｏｌ． ８，ｐ４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００７２】
本発明のカルボニルレダクターゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００７３】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００７４】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００７５】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００７６】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００７７】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００７８】
形質転換細胞作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、参照）。
【００７９】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００８０】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、プロモーターとしては、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００８１】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００８２】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．
２６，ｐ２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００８３】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ｖｏｌ． ３９，ｐ２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００８４】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ． １９６，ｐ１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００８５】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００８６】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ． ６，ｐ８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００８７】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ７，ｐ２８３−２８７（１９８９））。
【００８８】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． ３１５， ｐ５９２−５９４ （１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００８９】
（本発明の製造方法）
本発明の製造方法においては、反応基質である３−オキソアミノ酸誘導体に微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させる。該菌体処理物とは、例えば、該微生物菌体をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体細胞調製物、および、該微生物菌体中の本発明のカルボニルレダクターゼ画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものの事を示す。
【００９０】
本発明の製造方法においては、反応液に補酵素ＮＡＤＰ+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）もしくはＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型）を添加するのが好ましい。添加濃度は、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。これらの補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、（ｉ） 宿主微生物自体のＮＡＤＰ＋還元能を利用する方法、（ｉｉ） ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、または（ｉｉｉ）形質転換細胞を作製するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子とカルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、が挙げられる。
【００９１】
このうち、上記（ｉ）の方法においては、反応系にグルコースや２−プロパノールなどを添加することが好ましい。
【００９２】
また、上記（ｉｉ）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の再生酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニルレダクターゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である３−オキソアミノ酸誘導体に対して、０．１〜１００倍モル当量、好ましくは１〜２０倍モル当量添加する。
【００９３】
また、上記（ｉｉｉ）の方法においては、カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法、及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００９４】
本発明の製造方法は、水性媒体中または該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことができる。上記の水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ジメチルスルホキシド、イソプロパノール等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。上記の水性媒体に各種の界面活性剤など反応基質の溶解度を増加させるものを使用することもできる。
【００９５】
本発明の製造方法において反応基質となる一般式（１）で表される化合物は、既存の化学的合成を組み合わせる事により製造することが出来る。
【００９６】
例えば、次のような経路で製造することができる。
【００９７】
【化８】
【００９８】
具体的には、一般式（４）で表される馬尿酸やアセチルグリシンなどのグリシン誘導体の縮合反応で、一般式（５）で表されるオキサゾロン環化合物を得る。オキサゾロン環化合物にアシル化剤を作用させ、又はＯ−アシル化してオキサゾール化合物とした後にさらにアシル基を転位させて、一般式（６）で表されるジアシルオキサゾロン環化合物を得る。このジアシルオキサゾロン環化合物をアルコール類と反応させて、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を得ることができる。この反応は一般式（５）で表されるオキサゾロン環化合物及び／又は一般式（６）で表されるジアシルオキサゾロン環化合物を単離せず同一反応器で行うこともできる。
【００９９】
又、次のような経路で製造することも可能である。
【０１００】
【化９】
【０１０１】
具体的には、一般式（４）で表される馬尿酸やアセチルグリシンなどのグリシン誘導体から、一般式（７）で表されるオキサゾール化合物を得、これにルイス酸の存在下、酸クロライドを作用させることにより、一般式（８）で表されるアシルオキサゾロン化合物を得る。このアシルオキサゾロン化合物にアルコール類を作用させることにより、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を得ることができる。
【０１０２】
本発明の製造方法において反応基質となる一般式（１）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．００１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いることができる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、基質の分解を減らすという点や基質の溶解度の観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【０１０３】
本発明の製造方法において、使用する微生物の菌体及び／または該菌体処理物の量は、反応基質となる一般式（１）で表される化合物に対して、通常、が０．０１〜５００倍量（Ｗ／Ｗ）、好ましくは１〜２００倍の範囲で用いることができる。微生物の菌体及び／または該菌体処理物は、反応開始時に一括して添加しても良いが、反応の低下などが見られた場合、間欠的に追加添加することも有効である。
【０１０４】
本発明の製造方法は例えば、４〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の反応温度で、ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ５〜１０で行うことができる。また、基質のカルボン酸エステル部分の分解を防ぐため、反応液中に、エステル部分の分解を防ぐ化合物、具体的にはエステラーゼ阻害剤を添加したり、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどの塩を添加する事は有効である。同様にアミド結合の分解を防ぐために添加剤を入れても良い。具体的にはアシラーゼ阻害剤などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の製造方法において反応時間は、一般式（１）で表される化合物が変換され、一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体が生成されれば特にかまわないが、通常１分から７日、好ましくは１時間から４日の間で行なわれる。
【０１０６】
反応形態としてはバッチ法でも連続法でも何れでも構わないが、連続法の場合には式（１）の３−オキソアミノ酸誘導体、微生物の培養液、菌体及び／または該菌体処理物を、必要に応じて、適宜添加して行われ、また、目的生成物から分離された菌体をリサイクル使用しても良い。
【０１０７】
本発明の製造方法により生成する光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【０１０８】
（光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の用途）
一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体は、それ自体あるいは、各種の手法にて誘導化し、種々の医薬や農薬の中間体として有用である。特に下記一般式（９）
【０１０９】
【化１０】
【０１１０】
で表される化合物は抗ＨＩＶ活性を持つ薬剤（ＷＯ０１／４０２２７） の中間体として工業的に有用である。この（９）やその類縁体への変換の手法としては、上記一般式（２）で表される化合物を下記一般式（１０）
【０１１１】
【化１１】
【０１１２】
で表される化合物あるいはそのアミン塩に変換する。この変換の手法としては、酸あるいは塩基存在下、加水分解あるいは加水分解酵素にて加水分解する手法が挙げられる。
【０１１３】
この一般式（１０）で表される化合物を塩基条件中、ｔ−ブトキシカルボニル化を行うことで一般式（９）で表される化合物へと変換可能である。
【０１１４】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１５】
（合成例１）
（４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロンの合成）
１００ｍｌのフラスコに塩化メチレン４３ｍｌ、５−アセトキシ−２−フェニルオキサゾール４．２８ｇ（２１．１ｍｍｏｌ）を仕込み、シクロヘキサンカルボン酸クロリド３．１０ｍｌ（２３．２ｍｍｏｌ）を添加し、しばらく攪拌した後に四塩化スズ３．８７ｍｌ（７３．２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。２４時間後、ＴＬＣにて原料の消失を確認し、４規定塩酸水溶液１０ｍｌ及び酢酸エチル１５０ｍｌを添加し、有機層を分離した後にさらに水５０ｍｌで２回、飽和食塩水５０ｍｌにて洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１５０ｇ， ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２〜１００：４）にて精製し、黄色固体として目的物４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン３．２０ｇ（純度換算後の収率５２％）を得た。
【０１１６】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ）：δ１．１４−１．５１（５Ｈ，ｍ），１．６８−１．７９（５Ｈ， ｍ），３．３１−３．３７（１Ｈ， ｍ），７．５３−７．５７（３Ｈ，ｍ），７．９６−８．０１（２Ｈ， ｍ）
【０１１７】
（合成例２）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピルの合成）
合成例１で製造した４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン４７．５ｇ（１７５ｍｍｏｌ）、および２−プロパノール２３８ｍｌを仕込み、加熱還流下２時間攪拌した後、減圧濃縮し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピルを６６．１ｇ（純分として５３．９ｇ、収率９３％）得た。
【０１１８】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．３８（９Ｈ，ｍ），１．４５−１．５６（２Ｈ， ｍ），１．６９−１．８５（（４Ｈ， ｍ），２．０８−２．１０（１Ｈ， ｂｒ−ｓ），２．８６−２．９３（１Ｈ， ｍ），５．１０−５．１７ （１Ｈ，ｍ），５．５２（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），７．４３−７．５５（３Ｈ， ｍ），７．８３−７．８５（ｍ， ２Ｈ）
【０１１９】
（合成例３）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルの合成）
合成例１で製造した４−（１−シクロヘキシル−１−ヒドロキシメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン100mｇ（0.37ｍｍｏｌ）、およびエタノール（2.0ml）を仕込み、加熱還流下２時間攪拌した後、減圧濃縮し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルを 112mｇ（純分として 108mｇ、収率９６％）得た。
【０１２０】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．５５（８Ｈ，ｍ），１．６８−１．８４（４Ｈ， ｍ），２．０６−２．１０（１Ｈ， ｂｒ−ｓ），２．８６−２．９０（１Ｈ， ｍ），４．２５−４．３３（２Ｈ，ｍ），５．５６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．３０−７．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．４３−７．４８（２Ｈ， ｍ），７．５２−７．５６（１Ｈ， ｍ），７．８３−７．８６（ｍ， ２Ｈ）
【０１２１】
（合成例４）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピルの製造）
２００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン５．００ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）、４−ピコリン１６ｍＬ（１７０ｍｍｏｌ）、アセトン５０ｍＬを仕込み、氷冷下、シクロヘキサンカルボン酸クロリド１５.２ｍＬ（１１２ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、氷冷下３０分、室温にて２０時間反応させた。反応液にイソプロパノール２５ｍＬを添加し、１時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．６８ｇ（５．６ｍｍｏｌ）を２−プロパノール２．５ｍＬに溶解して添加し、更に７時間加熱還流させた。反応終了後、反応液を濃縮し、得られた濃縮液をトルエン１００ｍＬにて抽出し、２Ｎ塩酸４０ｍＬで洗浄後、有機層を濃縮した。残渣を酢酸エチル５ｍＬ、ヘプタン９０ｍＬにて晶析し、白色結晶として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル６．１６ｇ（化学純度９８％、収率６７％）を得た。
【０１２２】
（合成例５）
（４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロンの製造）
５００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２０．０ｇ（１１２ｍｍｏｌ）、４−ピコリン６５ｍＬ（６７０ｍｍｏｌ）、アセトニトリル３００ｍＬを仕込み、氷冷下、シクロヘキサンカルボン酸クロリド６１ｍＬ（４５０ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。氷冷下５時間反応させた後、１Ｎ塩酸１００ｍＬを添加し、結晶を濾取した。結晶を乾燥し、白色結晶として４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン３７．９ｇ（少量の不純物を含む２種の幾何異性体混合物、約８５：１５、収率８９％）を得た。
【０１２３】
ｍａｊｏｒ−ｉｓｏｍｅｒ：1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１５−１．５０（８Ｈ，ｍ），１．６２−１．９３（１０Ｈ，ｍ），２．１０−２．１６（２Ｈ，ｍ），２．６６（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．１，３．８Ｈｚ），３．５８−３．６３（１Ｈ，ｍ），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ），７．５４−７．５６（１Ｈ，ｍ），７．９７−７．９９（２Ｈ，ｍ）．
【０１２４】
ｍｉｎｏｒ−ｉｓｏｍｅｒ：1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．４７（８Ｈ，ｍ），１．５９−１．８５（１０Ｈ，ｍ），２．１１−２．１５（２Ｈ，ｍ），２．６５（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．４，３．７Ｈｚ），３．２６−３．３１（１Ｈ，ｍ），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ），７．５４−７．５６（１Ｈ，ｍ），８．０４−８．０７（２Ｈ，ｍ）．
【０１２５】
（合成例６）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチルの製造）
３０ｍＬフラスコに合成例５の方法で得られた４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン０．９９ｇ（２６．０ｍｍｏｌ）、４−ピコリン０．２５ｍＬ（２．６ｍｍｏｌ）、メタノール５ｍＬを仕込み、１時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン６８ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を添加して、更に４時間加熱還流させた。反応終了後、反応液を濃縮し、得られた濃縮液を酢酸エチル１０ｍＬにて抽出し、２Ｎ塩酸２ｍＬ及び飽和食塩水２ｍＬにて洗浄後、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチル０．５８ｇ（少量の不純物を含む、収率約６０％）を得た。
【０１２６】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１８−１．５５（５Ｈ，ｍ），１．６５−１．８７（４Ｈ，ｍ），２．０４−２．１１（１Ｈ，ｍ），２．８３−２．９１（１Ｈ，ｍ），３．８３（３Ｈ，ｓ），５．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．４３−７．４９（２Ｈ，ｍ），７．５１−７．５６（１Ｈ，ｍ），７．８２−７．８７（２Ｈ，ｍ）．
【０１２７】
（合成例７）
（２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸イソプロピルの製造）
２００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２．５ｇ（１３．７ｍｍｏｌ）、４−ピコリン７．６６ｇ（８０．６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル２５ｍＬを仕込み、氷冷下、イソ酪酸クロリド６．０７ｇ（１１２ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、氷冷下５時間、室温にて２時間反応させた。反応液にイソプロパノール１２．５ｍＬを添加し、２時間半加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．３４ｇ（２．８ｍｍｏｌ）を２−プロパノール１．２５ｍＬに溶解して添加し、更に４時間加熱還流させた。反応終了後、反応液を濃縮し、得られた濃縮液をトルエン１００ｍＬにて抽出し、２Ｎ塩酸４０ｍＬで洗浄後、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、淡黄色固体として２−ベンゾイルアミノ−４−メチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル２．６３ｇ（収率６６％）を得た。
【０１２８】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．３２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．４４−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５２−７．５５（１Ｈ，ｍ），７．８４−７．８５（２Ｈ，ｍ）．
【０１２９】
（合成例８）
（２−ベンゾイルアミノ−４，４−ジメチル−３−オキソペンタン酸イソプロピルの製造）
３００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２．０１ｇ（１１．０ｍｍｏｌ）、４−ピコリン６．２８ｇ（６７．４ｍｍｏｌ）、アセトン２０ｍＬを仕込み、氷冷下、ピバリン酸クロリド５.１７ｇ（４２．３ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、氷冷下３０分、室温にて６時間、加熱還流して１４時間、さらにアセトニトリル３０ｍＬ加えて４時間加熱還流した。反応液にイソプロパノール１７ｍＬを添加し、１時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．２８ｇ（２．３ｍｍｏｌ）を２−プロパノール１．７ｍＬに溶解して添加し更に１時間、２−プロパノール１７ｍＬを追加して９時間半加熱還流させた。反応液を濃縮し、トルエン７５ｍＬで希釈後、２Ｎ塩酸３０ｍＬで洗浄し、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、橙褐色固体として２−ベンゾイルアミノ−４，４−ジメチル−３−オキソペンタン酸イソプロピル０．３６ｇを得た（少量の不純物を含む、収率約１０％）。
【０１３０】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），５．０９（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４３−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５１−７．８２（１Ｈ，ｍ），７．８３−７．８４（２Ｈ，ｍ）．
【０１３１】
（合成例９）
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピルの製造）
１００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２．００ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）、４−ピコリン６．５ｍＬ（６７．０ｍｍｏｌ）、アセトニトリル２０ｍＬを仕込み、氷冷下、ウンデカノイルクロリド８．９９ｇ（４２．６ｍｍｏｌ）を２５分かけて滴下し、氷冷下４５分、室温にて２時間攪拌を行った。反応液にイソプロパノール１０ｍＬを添加し、２時間加熱還流後、４−ジメチルアミノピリジン０．２７ｇ（２．２ｍｍｏｌ）を添加し更に３時間、加熱還流を続けた。反応液を濃縮し、酢酸エチル４５ｍＬで希釈後、２Ｎ塩酸１５ｍＬおよび飽和食塩水１５ｍＬで洗浄し、有機層を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、得られた油状物質をクロロホルム１２０ｍＬに溶かし飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍＬで洗浄した。有機層を濃縮し白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピル２．３８ｇ（少量の不純物を含む、収率約４５％）を得た。更に得られた固体をヘキサン懸濁洗浄により精製し、白色固体として２−ベンゾイルアミノ−３−オキソトリデカン酸イソプロピル０．５９ｇ（収率１４％）を得た。
【０１３２】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２６−１．３０（１４Ｈ，ｍ），１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．３３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６２−１．６７（２Ｈ，ｍ），２．７８（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１７．４，７．５Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．４３−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５１−７．５５（１Ｈ，ｍ），７．８２−７．８５（２Ｈ，ｍ）．
【０１３３】
（合成例１０）
（２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸フェニルの製造）
５０ｍＬフラスコに実施例１の方法で得られた４−（１−シクロヘキシルカルボニルオキシ−１−シクロヘキシルメチリデン）−２−フェニル−５−オキサゾロン２．００ｇ（５．１４ｍｍｏｌ）、４−ピコリン０．５４ｇ（５．７２ｍｍｏｌ）、フェノール１０ｍＬおよびアセトニトリル１０ｍＬを仕込み、４５℃で６時間加熱後、４−ジメチルアミノピリジン０．１３ｇ（１．０ｍｍｏｌ）を添加し同じ温度で１２時間、５５℃で６時間半加熱した。反応終了後、反応液を酢酸エチル１１０ｍＬにて希釈し２Ｎ塩酸１０ｍＬで２回、飽和食塩水２０ｍＬにて１回洗浄後、有機層の乾燥および濃縮をした。残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製し、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸フェニル２．７ｇを得た（フェノールを含む、収率４７％）。
【０１３４】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．５０（４Ｈ，ｍ），１．５０−１．６３（１Ｈ，ｍ），１．６８−１．７６（１Ｈ，ｍ），１．８０−１．９５（３Ｈ，ｍ），２．１１−２．１９（１Ｈ，ｍ），２．９７−３．０６（１Ｈ，ｍ），５．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．１１−７．２５（２Ｈ，ｍ），７．２６−７．２９（１Ｈ，ｍ），７．３７−７．４２（３Ｈ，ｍ），７．４４−７．４８（２Ｈ，ｍ），７．５２−７．５６（１Ｈ，ｍ），７．８６−７．８９（２Ｈ，ｍ）．
【０１３５】
（合成例１１）
（Ｎ−ベンゾイルグリシンイソプロピルエステルの製造）
５００ｍＬフラスコにＮ−ベンゾイルグリシン２４ｇ（０．１３４ｍｏｌ）、２−プロパノール５０ｍＬ、トルエン６０ｍＬ、ｐ−トルエンスルホン酸０．２ｇを入れ、Ｄｅａｎ ｓｔａｒｋ装置を付し還流を４時間行った。冷却後、酢酸エチル６０ｍＬを加え、反応混合物を飽和重曹液３０ｍＬｘ２、食塩水３０ｍＬで順次洗浄し芒硝で脱水した。溶媒を濃縮し生じた無色の固体をろ取、風乾し目的物２７ｇを得た（収率９３％）。
【０１３６】
（合成例１２）
（Ｎ−ピバロイルグリシンイソプロピルエステルの製造）
２００ｍＬフラスコにグリシンイソプロピルエステル４．８ｇ（３１．３ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン５０ｍＬ、トリエチルアミン６．３ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）を入れ１５℃付近に冷却しつつ、ピバロイルクロリド３．８ｇを含むジクロロメタン溶液１０ｍＬを徐々に滴下した。このとき反応温度を１５℃以下に保った。滴下終了後さらに室温にて３０分間攪拌した。反応混合液を１Ｎ塩酸２０ｍＬｘ２ 飽和食塩水２０ｍＬｘ２洗浄し芒硝で脱水した。溶媒を濃縮し生じた無色の固体をろ取、風乾し目的物５．５ｇを得た（収率８７％）。
【０１３７】
（合成例１３）
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソブタン酸イソプロピルの製造）
田辺らの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，２８５４）を参照し、２−ベンゾイルアミノ−３−オキソブタン酸イソプロピルの製造を行った。１００ｍＬフラスコにジクロロメタン１６ｍＬ、Ｎ−ベンゾイルグリシンイソプロピルエステル１．７７ｇ（８ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール０．７９ｇ（９．６ｍｍｏｌ）、アセチルクロリド０．６３ｇ（８ｍｍｏｌ）をいれ、窒素雰囲気下、−４５℃に冷却し１０分間攪拌し、次いでその温度で四塩化チタン５．３ｇ（２８ｍｍｏｌ）、トリｎ−ブチルアミン５．９ｇ（３２ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した。滴下終了後反応液をさらに１時間攪拌し、水５０ｍＬにあけ、有機相を取り、水、食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水した。有機相を濃縮し シリカゲルカラムクロマトにて精製し、０．５ｇの目的物を得た（少量の不純物を含む、収率３５％）。
【０１３８】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．４５（３Ｈ，ｓ），５．１５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４０−７．５５（３Ｈ，ｍ），７．８０−７．９０（２Ｈ，ｍ）．
【０１３９】
（合成例１４）
上記と同様にして以下の化合物を得た。
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソペンタン酸イソプロピル：収率３５％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．７４−２．９０（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４０−７．５５（３Ｈ，ｍ），７．８０−７．９０（２Ｈ，ｍ）．
【０１４０】
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソヘキサン酸イソプロピル：収率３９％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．６５−１．７４（２Ｈ，ｍ），２．７１−２．８２（２Ｈ，ｍ），５．１４（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｂｒｓ），
７．４０−７．５５（３Ｈ，ｍ），７．８４−７．８６（２Ｈ，ｍ）．
【０１４１】
（２−ベンゾイルアミノ−３−（ナフタレン−２−イル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル：収率１１％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．４−７．７（６Ｈ，ｍ），７．８０−８．２０（６Ｈ，ｍ），８．８４（１Ｈ，ｓ）．
【０１４２】
（２−ベンゾイルアミノ−３−オキソ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル：収率１７％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．２−７．５（５Ｈ，ｍ），７．８−７．９（３Ｈ，ｍ），８．１９（１Ｈ，ｓ）．
【０１４３】
（２−ベンゾイルアミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−オキソプロピオン酸イソプロピル：収率１１％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．４−７．６（６Ｈ，ｍ），７．８５−７．８８（２Ｈ，ｍ），８．１２−８．１４（２Ｈ，ｍ）．
【０１４４】
（３−オキソ−３−フェニル−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル：収率５３％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２６（９Ｈ，ｓ），４．９８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４５−７．６５（３Ｈ，ｍ），８．１０−８．１３（２Ｈ，ｍ）．
【０１４５】
（３−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル：収率２０％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２５（９Ｈ，ｓ），５．０２（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ），８．０５−８．０８（２Ｈ，ｍ）．
【０１４６】
（３−オキソ−２−ピバロイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル：収率３５％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．１３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．２６（９Ｈ，ｓ），４．９８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），６．９５（１Ｈ，ｂｒｓ），７．１５−７．２５（１Ｈ，ｍ），７．７０−７．８０（１Ｈ，ｍ），８．０５−８．１５（１Ｈ，ｍ）．
【０１４７】
（実施例１）
（エクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２由来のカルボニルレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製）
特開２００４−２６７１３０と同様にしてプラスミドｐＥｘＳＤＲ１、および形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株を得た。すなわち、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２由来由来のカルボニルレダクターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ３０１６３３０Ａ、配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ｇｐ：ＡＢ１５４４０９、配列番号１）を元に配列番号３および４に記載のプライマーを合成した。
【０１４８】
配列番号１：
atgaaatata cggtgattac tggagcaagt tcaggaattg gatatgagac ggcaaaacta 60
ctcgcaggaa aaggaaaatc actcgttctc gtcgcgcgac ggacgtctga gctcgaaaaa 120
cttcgggatg aagtcaaaca aatctcacca gatagtgatg tcatcctcaa gtcggtcgat 180
ctcgcagata accaaaatgt ccatgattta tatgagggat taaaggaact cgacatcgaa 240
acgtggatca acaatgctgg attcggcgat tttgatctcg tccaggacat tgagctcggg 300
aaaatcgaga aaatgcttcg cttgaacatc gaggcgctaa cgattctatc gagtctgttc 360
gtccgcgatc atcatgacat cgaaggaacg acgctcgtca atatctcgtc agcaggtggc 420
taccggatcg tgccgaacgc ggtcacgtat tgcgcgacga agttctatgt cagtgcttat 480
acagaagggc tcgcgcaaga actgcaaaaa ggtggggcaa aacttcgggc gaaagtactg 540
gcaccagctg cgactgagac agagtttgcg gatcgttcgc gcggcgaagc aggtttcgac 600
tacagcaaga acgtcaaaaa gtaccatacg gcggctgaaa tggcaggctt cctgcatcag 660
ttgattgaaa gcgacgcgat cgtcggcatc gtcgacggtg agacgtatga gttcgaattg 720
cgtggtccat tgttcaacta cgcaggataa 750
【０１４９】
配列番号２：
Met Lys Tyr Thr Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Glu
Thr Ala Lys Leu Leu Ala Gly Lys Gly Lys Ser Leu Val Leu Val Ala
Arg Arg Thr Ser Glu Leu Glu Lys Leu Arg Asp Glu Val Lys Gln Ile
Ser Pro Asp Ser Asp Val Ile Leu Lys Ser Val Asp Leu Ala Asp Asn
Gln Asn Val His Asp Leu Tyr Glu Gly Leu Lys Glu Leu Asp Ile Glu
Thr Trp Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Asp Phe Asp Leu Val Gln Asp
Ile Glu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Met Leu Arg Leu Asn Ile Glu Ala
Leu Thr Ile Leu Ser Ser Leu Phe Val Arg Asp His His Asp Ile Glu
Gly Thr Thr Leu Val Asn Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Arg Ile Val
Pro Asn Ala Val Thr Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Tyr Val Ser Ala Tyr
Thr Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Gln Lys Gly Gly Ala Lys Leu Arg
Ala Lys Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Glu Thr Glu Phe Ala Asp Arg
Ser Arg Gly Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Lys Asn Val Lys Lys Tyr
His Thr Ala Ala Glu Met Ala Gly Phe Leu His Gln Leu Ile Glu Ser
Asp Ala Ile Val Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Tyr Glu Phe Glu Leu
Arg Gly Pro Leu Phe Asn Tyr Ala Gly
【０１５０】
配列番号３：ggaggcgaat tcatgaaata tacggtgatt
配列番号４：taatcactgc agttatcctg cgtagttgaa
【０１５１】
これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡ ２５ｎｇ 、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ− １ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製） により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで消化したｐＫＫ２２３−３(アマシャム−ファルマシア社製)とＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【０１５２】
形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＥｘＳＤＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１の塩基配列と一致した。）
【０１５３】
（実施例２）
（カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換した大腸菌を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシルー３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの合成）
実施例１で得られたｐＥｘＳＤＲ１をもつ形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（国産化学）で３０℃で１．７時間生育させ、０．１ｍＭになるように イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに３０℃で２０時間培養した。得られた菌体ブロス２ｍＬを遠心分離により集菌し、１００μＬの緩衝液（１０％硫酸ナトリウム、１０％グルコースを含む１００ｍＭトリス（最終ｐＨ９．９））を加えよく混合した。これに３０μＬの１０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、３０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１ｕｎｉｔ／ｍｌ）、合成例２で得られた２０μＬの１０ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）を添加後４０℃で１８時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、２００μＬの２−プロパノールで溶かし、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルを定量した。
【０１５４】
定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＯＤＳカラムＡｃｅｎｔｉｓ Ａｍｉｄｅ（Ｓｐｅｌｃｏ社製 ４．６ｍｍｘ１０ｃｍ） ４０℃
溶離液：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝４０／６０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１５５】
この結果、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの収量は１４．１μｇであった。
【０１５６】
また該遺伝子を含まないプラスミドｐＫＫ２２３−３を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【０１５７】
次に光学純度の測定をＨＰＬＣを用いて行なった。
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＯＤ−ＲＨ（ダイセル社製 ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ） ３０℃
溶離液：４０％アセトニトリル
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体はＲ，Ｒ体であった。
【０１５８】
（実施例３）
（カルボニルレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換した大腸菌を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの合成）
実施例２と同様にして、形質転換体を培養した。得られた菌体ブロス２ｍＬを遠心分離により集菌し、５０μＬの４０％硫酸アンモニウム、５０μＬの５０％グルコース、２０μＬの１Ｍトリスを加えよく混合した。これに３０μＬの１０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、３０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１ｕｎｉｔ／ｍｌ）、合成例２で得られた２０μＬの１０ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル（ＤＭＳＯ溶液）を添加後４０℃で１８時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、２００μＬの２−プロパノールで溶かし、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを実施例１と同様に定量した。
【０１５９】
この結果、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの収量は４８．０μｇであった。また該遺伝子を含まないプラスミドｐＫＫ２２３−３を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【０１６０】
次に光学純度の測定を実施例２と同様にして行なった所、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【０１６１】
（実施例４）
（アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）(IAM12048)による（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの合成）
酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、燐酸１カリウム１ｇ／Ｌ、燐酸２カリウム３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化マンガン０．０１ｇ／Ｌを含んだ培地を作成し、４０ｍｌを２００ｍｌのひだ付き三角フラスコにいれ１２０度２０分間の条件で滅菌した。この培地にアグロバクテリウム ツメファシエンス（ＩＡＭ１２０４８）を植菌し３０度で２４時間培養した。培養液を１ｍｌ遠心し菌体を得た。これに２０ｍＭのトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を５０μｌ、５０％のグルコース液を１０μｌ加え激しく攪拌した。この懸濁液にさらに１％のＮＡＤ+（オリエンタル酵母社製）を１０μｌ、１％のＮＡＤＰ+を１０μｌ、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬製 １ｕｎｉｔ／ｍｌ）を１０μｌ、合成例２で得られた１ｇ／Ｌの２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）を１０μｌ添加し３０度で１８時間反応させた。反応液に２−プロパノールを加え全量を１ｍｌとし、実施例２と同様に定量したところ、２Ｒ，３Ｒ'-２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルは１．７ｍｇ／Ｌの濃度であった。光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【０１６２】
（実施例５）
（各種バクテリアによる２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの合成）
実施例４と同様に表１に記載した各種バクテリアを植菌し３０℃で２４時間培養した。ただしVariovorax paradoxus (DSM66)は1週間培養した。培養液を３０ｍｌ遠心し菌体を得た。５mlの蒸留水を加え超音波破砕し遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液２００μｌに１Ｍのトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を３０μｌ、５０％のグルコース液を１０μｌ加え激しく攪拌した。この懸濁液にさらに１％のＮＡＤ+（オリエンタル酵母社製）を１０μｌ、１％のＮＡＤＰ+を１０μｌ、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬製 １ｕｎｉｔ／ｍｌ）を１０μｌ、合成例３で得られた１０ｇ／Ｌの２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル（ＤＭＳＯ溶液）を１０μｌ添加し３０度で１８時間反応させた。反応液に２−プロパノールを加え全量を１ｍｌとし定量した。定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【０１６３】
カラム：ＯＤＳカラムＡｃｅｎｔｉｓ Ａｍｉｄｅ（Ｓｐｅｌｃｏ社製 ４．６ｍｍｘ１０ｃｍ） ４０℃
溶離液：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝５５／４５
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１６４】
生成した還元体である２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチル量を表１に示す。なおいずれもａｎｔｉ体でありｓｙｎ体は検出されなかった。
【０１６５】
【表１】
【０１６６】
（実施例６）
（各種微生物による２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルの合成）
実施例４と同様に、表２に記載した各種微生物を植菌し３０℃で１から７日十分に生育するまで培養した。培養液を１ｍｌ遠心し菌体を得た。これに0.1Ｍのトリス塩酸バッファー（ｐＨ１０）を１００μｌ、５０％のグルコース液を２０μｌ、１％のＮＡＤ+（オリエンタル酵母社製）を２０μｌ、１％のＮＡＤＰ+を２０μｌ、加え激しく攪拌した。この懸濁液にさらにグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬製 １ｕｎｉｔ／ｍｌ）を１０μｌ、合成例３で得られた２．５ｇ／Ｌの２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）を２０μｌ添加し３０度で1日反応させた。反応液に２−プロパノールを０．３ｍｌ加えＨＰＬＣで定量した。生成した還元体である２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピル量を表２に示す。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【０１６７】
カラム：ＯＤＳカラムＡｃｅｎｔｉｓ Ａｍｉｄｅ（Ｓｐｅｌｃｏ社製 ４．６ｍｍｘ１０ｃｍ） ４０℃
溶離液：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝４０／６０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１６８】
【表２】
【０１６９】
（実施例７）
実施例２と同様にして培養し得られた形質転換体５．６６ｇに０．１ｍMジチオスレイトール(dithiothreitol)を含む１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０））１８ｍｌを加えよく混合した。この菌体懸濁液を超音波破砕し遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液は蛋白濃度４９g/Lであった。
【０１７０】
（１）カルボニルレダクターゼ活性の測定
カルボニルレダクターゼ活性の測定は100mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、0.32mM NADPH、10mM ３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを含む反応液を3７℃で行った。1Uは上記反応条件で1分間に1μmolのNADPHを酸化する酵素量とした。結果、5U/mlであった。
【０１７１】
合成例６で得られた２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸メチルを１０ｇ／Ｌとなるように、ＤＭＳＯあるいは２−プロパノールで溶解させた。
【０１７２】
粗酵素液１８０μＬあるいは粗酵素液２０μＬに蒸留水１６０μＬ加えたもの、さらにあるいは蒸留水１８０μＬに２５μＬの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０）、１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１０μＬの５０％グルコース液、１０μＬの１０ｇ／Ｌ基質液を添加後３０℃で90分振とう反応させた。反応終了後の反応液に５００μＬの酢酸エチルを添加しよく攪拌後有機層を別の容器に移し乾燥させた。乾燥後２０μＬイソフ゜ロハ゜ノールに溶解させうち２μＬをTLCで分析した。（シリカゲルプレート 展開液 ヘキサン／酢酸エチル＝１／１ ＵＶ照射で検出） 基質を溶かした溶媒がＤＭＳＯの方が還元体生成量が多かった。ＤＭＳＯ溶液で反応させたサンプルをＬＣ−Ｍａｓｓで分析した。
【０１７３】
ＬＣ−Ｍａｓｓ装置：ヒューレットパッカード社１１００ＭＳＤ
ＨＰＬＣカラム：MCI−GEL ＯＤＳ−１ＨＵ(１50 x 4.6 mm)
溶離液A：１０ｍM 酢酸アンモニウム液 溶離液B：１００％アセトニトリル A:B=50:50
流速： ０．５ ml／min
温度：４０℃
ＵＶ２２０ｎｍ
イオン化電圧：２０Ｖ
イオン化法：ＡＰＩ−ＥＳ法
正イオン測定モード
【０１７４】
粗酵素液１８０μＬの条件では変換率は８４％、還元体収率は３０％であった。ディアステレオ選択性は８６％ｄ．ｅ．であり、アンチ体が主であった。また脱炭酸された化合物が（[M＋H]+＝２４８．１）４７％生成していた。
【０１７５】
粗酵素液２０μＬの条件では変換率は２２％、還元体収率は７％であった。ディアステレオ選択性は９１％ｄ．ｅ．であり、アンチ体が主であった。また脱炭酸された化合物が（[M＋H]+＝２４８．１）９％生成していた。
【０１７６】
蒸留水１８０μＬの条件では基質はまったく変換されなかった。
実施例４と同様に光学純度を測定したところ、１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【０１７７】
（実施例８）
実施例７で得られた粗酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製を行った。塩化ナトリウム０〜０．６Ｍのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム付近にピークが見られた。これを粗精製酵素とした。カルボニルレダクターゼ活性は１U/mlであった。
【０１７８】
この粗精製酵素１８０μＬに２５μＬの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０）、１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、５μＬの１Mグルコース液、５μＬの１０ｇ／Ｌ基質液を添加後３０℃で3時間半反応させたところ 変換率は１００％、還元体収率は９９％であった。ディアステレオ選択性は９０％ｄ．ｅ．であり、アンチ体が主であった。
【０１７９】
（実施例９）
（各種（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの合成）
実施例２と同様にして培養し得られた形質転換体２５ｇに１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０））を加え１５０ｍｌとしよく混合した。この菌体懸濁液を超音波破砕し硫酸アンモニウムを３０ｇ添加し溶解させてから遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液はカルボニルレダクターゼ活性２．６U/mlであった。これにさらにグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製）を２ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加した。
【０１８０】
この粗精製酵素８８μＬに２５μＬの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（最終ｐＨ７．０）、１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬの５０％グルコース液、１０μＬの１０ｇ／Ｌ基質液を添加後３０℃で１９時間反応させた。基質は２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル、２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ｎ−プロピルを用いた。エチルエステルは変換率９７％、還元体収率９７％、イソプロピルエステルは変換率７７％、還元体収率７６％、ｎ−プロピルエステルは変換率８７％、還元体収率８２％、であった。
【０１８１】
（実施例１０）
（化学式１で表される各種３−オキソアミノ酸誘導体からの化学式２で表される各種光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体生成）
実施例２と同様にして培養し得られた形質転換体１０ｇに緩衝液（１０％硫酸ナトリウム、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム-１０ｍＭ炭酸ナトリウム（最終ｐＨ８．５））を加え全量を40mlとしてよく混合した。この菌体懸濁液を超音波破砕し遠心分離により粗酵素液を回収した。この粗酵素液は蛋白濃度80g/Lであった。この粗酵素液はカルボニルレダクターゼ活性５U/mlであった。これにさらにグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製）を１００ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加した。
【０１８２】
この粗酵素液１００μＬに１０μＬの５０ｍMＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、５μＬの５０％グルコース液、１０μＬの１０ｇ／Ｌ 表３に示す化学式１で表される各種３−オキソアミノ酸誘導体（ＤＭＳＯ溶液）を添加後３７℃で１日から2日振とう反応させた。反応終了後の反応液に１０００μＬの２−プロパノールを添加しよく攪拌後LC-Ｍａｓｓで分析した。
【０１８３】
ＬＣ-Ｍａｓｓの条件は以下の通りである。
ＬＣ−Ｍａｓｓ装置：ヒューレットパッカード社１１００ＭＳＤ
ＨＰＬＣカラム：L-column ＯＤＳ−１ＨＵ(250 x 4.6 mm)
溶離液A：１０ｍM 酢酸アンモニウム液 溶離液B：１００％アセトニトリル
グラジェント方法１ A:B=50:50 （０分） → A:B=0:100 （１０分）
A:B=0:100 （10分〜15分）
グラジェント方法２ A:B=40:60 （０分） → A:B=0:100 （１０分）
A:B=0:100 （10分〜15分）
流速：１ ml／min
温度：４０℃
ＵＶ２５４ｎｍ
イオン化電圧：２０Ｖ
イオン化法：ＡＰＩ−ＥＳ法
正イオン測定モード
グラジェント方法１での分析を分析条件１としグラジェント方法２での分析を分析条件２とする。
分析の結果を表３に示す。
【０１８４】
【表３】
【０１８５】
なお表３中の面積％とはｍａｓｓクロマトグラムで得られた還元体と基質のヒ゜ークの面積値の総和に対する比率を表す。還元体のマスイオンおよびリテンションタイムとも３−オキソアミノ酸誘導体を化学的に還元して得られた３−ヒドロキシアミノ酸誘導体と一致した。
【０１８６】
（実施例１１）
実施例１０において反応性が良くジアステロマー過剰度も高い基質に関して、得られた還元体、３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の立体構造を調べるべく反応スケールをあげて実施し、分取ＴＬＣにより還元体を掻き取り酢酸エチルで回収し濃縮した。得られた粗精製体のジアステロマー過剰度(diastereomer excess; de%)および光学純度(enantiomer excess; ee%)を調べた。
【０１８７】
ジアステロマー過剰度の測定は下記の条件のＨＰＬＣを用いて行なった。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ−ＣＮ（ＧＬサイエンス社製 ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）４０℃
溶離液A：8０％１０ｍM酢酸アンモニウム,2０％アセトニトリル液
溶離液B：１００％アセトニトリル
グラジェント方法3 A:B=９０:１０ （０分〜20分） → A:B=0:100 （30分）
A:B=0:100 （30分〜35分）
グラジェント方法4 A:B=8０:2０ （０分〜20分） → A:B=0:100 （30分）
A:B=0:100 （30分〜35分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
グラジェント方法３での分析を分析条件３としグラジェント方法４での分析を分析条件４とする
【０１８８】
光学純度の測定は下記の条件のＨＰＬＣを用いて行なった。
カラム：ＯＤ−Ｈ（ダイセル社製 ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）３０℃
溶離液：溶離液５ Hex/IPA=95/5 溶離液６ Hex/IPA=9０/１０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ230ｎｍ
溶離液５での分析を分析条件５とし溶離液６での分析を分析条件６とする。結果を表４に示す。
【０１８９】
【表４】
【０１９０】
次にこれらをNMRの測定に供した。以下に結果を示す。
【０１９１】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシブタン酸イソプロピル、
【化１２】
【０１９２】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.14(3H,d,J=6.3Hz),1.24(3H,d,J=6.3Hz),1.25(3H,d,J=6.3Hz),
3.66(1H,m),4.25(1H,m),4.78(1H,dd,J=6.6,3.0Hz),5.06(1H,sept,J=6.3Hz),
7.08(1H,brd,J=5.6Hz),7.38-7.50(3H,m),7.76-7.78(2H,m)
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ１８．４８, 21.7３, 59.14, 69.53,
70.23, 127.21,128.69,132.11, 133.28, 168.43, 169.71 ppm
【０１９３】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシペンタン酸イソプロピル、
【化１３】
【０１９４】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.95(3H,t,J=7.5Hz),1.24(3H,d,J=6.3Hz),1.25(d,J=6.3Hz),
1.47(2H,m),3.38(1H,brd,J=7.3Hz),3.92(1H,m),4.77(1H,dd,J=6.8,3.0Hz),
5.07(1H,sept,J=6.3Hz),7.09(1H,brd,J=6.0Hz),7.36-7.49(3H,m),7.73-7.78(2H,m)
【０１９５】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸イソプロピル
【化１４】
【０１９６】
１H NMR（400MHz、CDCl３）：δ1.00(3H, d, J=6.6Hz), 1.05(3H d, J=6.6Hz), 1.31(3H, d, J=6.0Hz), 1.31(3H, d, J=6.0Hz), 1.78(1H, sept, J=6.6Hz), 3.22(1H, brs), 3.64(1H, d, J=7.3Hz), 4.90(1H, dd, J=6.3,3.0Hz), 5.13(1H, sept, J=6.0Hz), 7.19(1H, d, J=6.3Hz), 7.43-7.55(3H, m), 7.82-7.84(2H, m) ppm
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ18.04, 18.12, 20.71, 20.76, 30.67, 55.63, 68.99, 77.92, 126.14, 127.64, 130.94, 132.53, 166.56, 169.42 ppm
【０１９７】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシヘキサン酸イソプロピル、
【化１５】
【０１９８】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86(3H,t,J=7.3Hz),1.24(3H,d,J=6.3Hz),1.25(3H,d,J=6.3Hz),
1.28-1.55(4H.m),3.45(1H,brd,J=7.1Hz),4.02(1H.m),4.77(1H,dd,J=6.6,3.0Hz),
5.07(1H,sept,J=6.3Hz),7.09(1H,brd,J=6.1Hz),7.37-7.49(3H,m),7.76-7.78(2H,m)
【０１９９】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−４，４−ジメチルペンタン酸イソプロピル
【化１６】
【０２００】
１H NMR（400MHz、CDCl３）：δ1.00(9H, s), 1.31(6H, d, J=6.3Hz), 3.58-3.67(1H, brs),3.67(1H, d, J=2.8Hz), 4.92(1H, dd, J=7.6,2.8Hz), 5.07(1H, sept, J=6.3Hz), 7.14(1H, d, J=7.6Hz), 7.42-7.46(2H, m), 7.50-7.55(1H, m), 7.80-7.82(2H, m) ppm
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ20.45, 20.74, 25.15, 34.63, 54.04, 69.08, 80.15, 126.13, 127.66, 130.94, 132.55, 166.39, 170.39 ppm
【０２０１】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸イソプロピル、
【化１７】
【０２０２】
１H NMR（400MHz、CDCl３）：δ1.27(6H, d, J=6.3Hz), 4.73(1H, d, J=6.1Hz), 5.07(1H, sept, J=6.3Hz), 5.17(1H, dd, J=6.6, 3.0Hz), 5.40(1H, m), 6.91(1H, d, J=6.1Hz), 7.26-7.34(5H, m), 7.42-7.46(2H, m), 7.51-7.55(1H, m), 7.73-7.76(2H, m) ppm
13C NMR（100MHz、CDCl３）：δ20.65, 20.71, 58.88, 69.41, 74.52, 125.03, 126.15, 127.02, 127.23, 127.70, 131.14, 132.15, 138.17, 167.81, 167.88 ppm
【０２０３】
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピル
【化１８】
【０２０４】
1H−NMR(400MHz,CD3OD)：δ0.80−1.27(5H,m),1.58−1.79(5H,m),1.96−
1.99(1H,m),3.42(1H,m),4.00(1H,d,J＝2.3Hz)．
【０２０５】
２−ベンゾイルアミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピル、
【化１９】
【０２０６】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.20(3H,d,J=6.4Hz),1.18(3H,d,J=6.4Hz), 5.00(1H,sept,J=6.4Hz), 5.05(1H,dd,J=6.3,2.8Hz),5.29(1H,m), 6.89(1H,brs),7.14-7.23(4H,m),7.34-
7.50(3H,m),7.68(2H,d,J=8.1Hz)
13C NMR（100MHz、CDCl３）δ 20.69、20.72、58.88、69.65、73.93、126.16、126.48、127.37、127.76、131.31、131.88、132.75、136.84、167.65、167.89
【０２０７】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル
【化２０】
【０２０８】
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.22(3H,d,J=6.3Hz),1.24(1H,d,J=6.0Hz), 5.03(1H,sept,J=6.0Hz), 5.16(1H,dd,J=7.4,3.3Hz),5.60(1H,m),6.83-6.89(2H,m), 6.98(1H,brd,J=6.1Hz), 7.17(1H,m), 7.37-7.72(3H,m),7.74(2H,m)
13C NMR（100MHz、CDCl３）δ 20.69、20.72、58.71、6975、71.60、123.49、124.24、125.55、126.26、127.73、131.28、131.99、141.53、167.31、168.34
【０２０９】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−３−（ナフタレン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル、
【化２１】
【０２１０】
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.16(6H,d,J=6.3Hz),5.00(1H,sept,J=6.3Hz)5.18(1H,dd,J=6.8,3.0Hz),5.50(1H,d,J=3.0Hz),6.56(1H,brd,J=6.6Hz),7.33-7.47(6H,m),7.67-7.76(6H,m)
13C NMR（100MHz、CDCl３）δ 20.64、20.70、58.95、69.46、74.64、122.97、124.13、
124.99、125.17、126.16、126.66、126.94、126.98、127.70、131.16、132.03、132.11、
132.14、135.76、167.84、167.89
【０２１１】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシトリデカン酸イソプロピル、
【化２２】
【０２１２】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ0.82(3H,t,J=6.9Hz), 1.12-1.21(14H,m), 1.23(3H,d,J=6.2Hz), 1.25(3H,d,J=6.2Hz), 1.26-1.57(4H,m), 3.50(1H,brs),
3.97-4.04(1H,m), 4.77(1H,dd,J=6.8,3.0Hz), 5.01-5.12(1H,m), 7.10(1H,d,J=6.8Hz),
7.36-7.42(2H,m), 7.44-7.49(1H,m), 7.75-7.78(2H,m) ppm.
13C−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ13.09, 20.75, 21.66, 24.69, 28.30,
28.47, 28.48, 28.55, 28.58, 30.88, 32.27, 57.53, 69.08, 72.40, 126.21, 127.66,
131.03, 132.39, 167.09, 168.93 ppm.
【０２１３】
３−ヒドロキシ−３−フェニル−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
【化２３】
【０２１４】
３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル、
【化２４】
【０２１５】
MeCN/50mMAcONH4 ＝60/40 230nm L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃ 4.84min
anti:rt 7.45 min, syn:rt8.01 min
【０２１６】
３−ヒドロキシ−２−ピバロイルアミノ−３−（チオフェン−２−イル）プロピオン酸イソプロピル、
【化２５】
【０２１７】
MeCN/50mMAcONH4 ＝60/40 230nm L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃
anti:rt 5.58 min,, syn:rt5.91 min
【０２１８】
２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸フェニル
【化２６】
【０２１９】
MeCN/50mMAcONH4=2/8-(15min)-1/0(5minHOLD), 254nm L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃ anti：rt14.10 min, syn：ｒｔ14.29 min
【０２２０】
３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシ−２−ピバロイルアミノプロピオン酸イソプロピル
【化２７】
【０２２１】
MeCN/50mMAcONH4=55/45, 230nm
L-column ODS (4.6×250mm)、1 mL/min、40℃ anti：rt11.42 min, syn：ｒｔ10.96 min
【０２２２】
２−ベンゾイルアミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸ベンジル、
【化２８】
【０２２３】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ0.88(3H,d,J=6.6Hz), 0.94(3H,d,J=6.6Hz), 1.60-1.67(1H,m), 3.56(1H,dd,J=8.6,3.0Hz), 4.93(1H,dd,J=7.1,3.0Hz),
5.16(1H,d,J=12.4Hz), 5.22(1H,d,J=12.4Hz), 7.07(1H,d,J=7.1Hz), 7.24-7.34(5H,m),
7.35-7.41(2H,m), 7.44-7.49(1H,m), 7.72-7.77(2H,m) ppm.
13C−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ17.92, 18.03, 30.55, 55.27, 66.58,
77.91, 126.15, 127.36, 127.59, 127.65, 127.66, 130.99, 132.46, 133.94, 166.50,
169.81 ppm.
【０２２４】
（実施例１２）
（変異型カルボニルレダクターゼを共現させた大腸菌を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルおよび（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの合成）
配列番号２の８８番目のアミノ酸のフェニルアラニンがイソロイシンに変換された変異型カルボニルレダクターゼをコードする遺伝子を用いる以外は実施例１から２と同様に行った。得られた菌体ブロス１ｍＬを遠心分離により集菌し、７０μＬの緩衝液（１０％硫酸アンモニウム、３％グルコースを含む１００ｍＭトリス（最終ｐＨ７．５））を加えよく混合した。これに１０μＬの１ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋（オリエンタル酵母社製）、１０μＬのグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１０μＬの５０％グルコース、１０μＬの２．５ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸イソプロピル（ＤＭＳＯ溶液）あるいは１０ｇ／Ｌ ２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル（ＤＭＳＯ溶液）を添加後３３℃で２４時間振とう反応させた。反応終了後の反応液に７５０μＬの２−プロパノールを加え、還元体を定量した。（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸イソプロピルおよび（２Ｒ，３Ｒ）−２−ベンゾイルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルはそれぞれ６．２μｇ、２９．３μｇ生成されていた。ディアステレオ選択性は１００％ｄ．ｅ．であり、アンチであった。光学純度は１００％ｅ．ｅ．であり、立体は２Ｒ，３Ｒ体であった。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】図１は、合成例における反応の概要を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２２６】
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> API Corporation
<120> A method for producing an optically active hydroxyl amino acid derivative
<130> A61442A
<160> 4
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Exiguobacterium sp.
<400> 1
atgaaatata cggtgattac tggagcaagt tcaggaattg gatatgagac ggcaaaacta 60
ctcgcaggaa aaggaaaatc actcgttctc gtcgcgcgac ggacgtctga gctcgaaaaa 120
cttcgggatg aagtcaaaca aatctcacca gatagtgatg tcatcctcaa gtcggtcgat 180
ctcgcagata accaaaatgt ccatgattta tatgagggat taaaggaact cgacatcgaa 240
acgtggatca acaatgctgg attcggcgat tttgatctcg tccaggacat tgagctcggg 300
aaaatcgaga aaatgcttcg cttgaacatc gaggcgctaa cgattctatc gagtctgttc 360
gtccgcgatc atcatgacat cgaaggaacg acgctcgtca atatctcgtc agcaggtggc 420
taccggatcg tgccgaacgc ggtcacgtat tgcgcgacga agttctatgt cagtgcttat 480
acagaagggc tcgcgcaaga actgcaaaaa ggtggggcaa aacttcgggc gaaagtactg 540
gcaccagctg cgactgagac agagtttgcg gatcgttcgc gcggcgaagc aggtttcgac 600
tacagcaaga acgtcaaaaa gtaccatacg gcggctgaaa tggcaggctt cctgcatcag 660
ttgattgaaa gcgacgcgat cgtcggcatc gtcgacggtg agacgtatga gttcgaattg 720
cgtggtccat tgttcaacta cgcaggataa 750
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> Exiguobacterium sp.
<400> 2
Met Lys Tyr Thr Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Ala Lys Leu Leu Ala Gly Lys Gly Lys Ser Leu Val Leu Val Ala
20 25 30
Arg Arg Thr Ser Glu Leu Glu Lys Leu Arg Asp Glu Val Lys Gln Ile
35 40 45
Ser Pro Asp Ser Asp Val Ile Leu Lys Ser Val Asp Leu Ala Asp Asn
50 55 60
Gln Asn Val His Asp Leu Tyr Glu Gly Leu Lys Glu Leu Asp Ile Glu
65 70 75 80
Thr Trp Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Asp Phe Asp Leu Val Gln Asp
85 90 95
Ile Glu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Met Leu Arg Leu Asn Ile Glu Ala
100 105 110
Leu Thr Ile Leu Ser Ser Leu Phe Val Arg Asp His His Asp Ile Glu
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Val Asn Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Arg Ile Val
130 135 140
Pro Asn Ala Val Thr Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Tyr Val Ser Ala Tyr
145 150 155 160
Thr Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Gln Lys Gly Gly Ala Lys Leu Arg
165 170 175
Ala Lys Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Glu Thr Glu Phe Ala Asp Arg
180 185 190
Ser Arg Gly Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Lys Asn Val Lys Lys Tyr
195 200 205
His Thr Ala Ala Glu Met Ala Gly Phe Leu His Gln Leu Ile Glu Ser
210 215 220
Asp Ala Ile Val Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Tyr Glu Phe Glu Leu
225 230 235 240
Arg Gly Pro Leu Phe Asn Tyr Ala Gly
245
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
ggaggcgaat tcatgaaata tacggtgatt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
taatcactgc agttatcctg cgtagttgaa 30
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ2は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ1からＲ3におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
で表される３−オキソアミノ酸誘導体のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、前記一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用させて、下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は前記と同義である）
で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成させることを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
微生物がアブシディア（Absidia）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、シトロバクター（Citrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、デルフティア（Delftia）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディイデス（Nocardioides）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス（Paracoccus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドコッカス（Rhodococccus）属、セラチア（Serratia）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、バリドボラックス（Variovorax）属、又はエクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
微生物が下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡを発現させた形質転換体である、請求項１に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
形質転換体が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換されたものである、請求項３に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
形質転換体が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体である、請求項３に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
一般式（１）および（２）の化合物において、Ｒ2がアリール基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
一般式（２）の光学純度が９８％ｅｅである請求項１〜６のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項８】
一般式（２）の絶対配置が下記一般式（３）で表されるように２Ｒ，３Ｒであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【化３】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ1はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ2は炭素数４以上のアルキル基、炭素数４以上のアルコキシ基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ3はアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ1からＲ3におけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基及びヘテロ環基は置換されていてもよい）
で表される３−オキソアミノ酸誘導体のβ位のカルボニル基を立体特異的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、前記一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体に作用させて、下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は前記と同義である）
で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成させることを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
微生物がアブシディア（Absidia）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、シトロバクター（Citrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、デルフティア（Delftia）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディイデス（Nocardioides）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス（Paracoccus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドコッカス（Rhodococccus）属、セラチア（Serratia）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、バリドボラックス（Variovorax）属、又はエクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
微生物が下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡを発現させた形質転換体である、請求項１に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（１）で表される３−オキソアミノ酸誘導体を一般式（２）で表される光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
形質転換体が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換されたものである、請求項３に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
形質転換体が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体である、請求項３に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
一般式（１）および（２）の化合物において、Ｒ2がアリール基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
一般式（２）の光学純度が９８％ｅｅである請求項１〜６のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項８】
一般式（２）の絶対配置が下記一般式（３）で表されるように２Ｒ，３Ｒであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の光学活性３−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法。
【化３】
【図１】
【公開番号】特開２００７−２９０８９（Ｐ２００７−２９０８９Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７２１９０（Ｐ２００６−１７２１９０）
【出願日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（３９６０２０４６４）株式会社エーピーアイ コーポレーション (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（３９６０２０４６４）株式会社エーピーアイ コーポレーション (39)
【Ｆターム（参考）】
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