光阻害免疫能力回復剤及びその製造方法
【課題】 自然界に多量に存在し、容易に入手可能な原料を用いて、強力な光阻害免疫能力回復作用を有し、外用剤として使用し得る新規な光阻害免疫能力回復剤を提供する。
【解決手段】 オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤とする。
【解決手段】 オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線その他の放射線によりそこなわれた皮膚の免疫能力を回復して健常状態の皮膚にするための光阻害免疫能力回復剤及びそれをオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）を原料として、製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人体が有する最も重要な生体防御機能の１つに皮膚免疫機能がある。皮膚は生体の最外層にある器官であり、外部からの物理的、化学的又は生物学的攻撃を最も受けやすく、その被害が内部組織に浸透するのを防ぐための免疫機能を備えている。
【０００３】
この皮膚は、角化細胞、ランゲルハンス細胞からなる表皮組織と、樹状細胞、血管内皮細胞、マクロファージなどからなる真皮組織により構成され、その中のランゲルハンス細胞は、外部からの異物としての抗原の進入に対し、それを速やかに処理して、その情報をリンパ節を介してＴ細胞に伝達し、一連の免疫上の対応をするための重要な役割を果すことが知られている。
【０００４】
ところで、皮膚が紫外線のような放射線に長時間暴露されると、細胞が損傷を受け、上記の免疫機能が失われ、皮膚の防御機能が低下する。
このため、失われた皮膚の免疫機能を賦活するための研究が行われ、例えばオゴノリ属に属する海藻より水性溶媒で抽出された物質を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献１参照）、紅藻類に属する海藻から酸性多糖を水性溶媒で抽出し、固液分離して得られる抽出液に、該酸性多糖を加水分解する能力を有するβ−アガラーゼを作用させて酸性多糖を低粘性化して得られる溶液、又は上記海藻をβ−アガラーゼを含有する水性溶媒と接触させ、酸性多糖を抽出と同時に低粘性化したのち、固液分離して得られる溶液、又はこれらの溶液の精製液から分離した固形分を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献２参照）、ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマトグラフィー処理してグリコマクロペプチドに富む画分を得、この画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロマトグラフィーで処理することによって得られる免疫賦活物質（特許文献３参照）などが提案されている。
これらの免疫賦活剤は、経口的に投与することにより低下した皮膚免疫機能を復元させるものであるが、このような薬剤の皮膚免疫賦活における作用機序は解明されていないので、これを外用剤としたときに、同じ効果を奏するか否かは全く不明である。
また、外用剤として適用を得る皮膚免疫賦活剤については、グルタチオンと、カロチン類、キサンチン類、フラン類、トコフェロール類、アミノ酸類などとの組合せを含有する皮膚免疫賦活剤が提案されている（特許文献４参照）、効果の点で必ずしも満足し得るものとはいえない。
【０００５】
ところで、赤血球凝集素は、各動物の赤血球に対し特異的な挙動を示すので、医療、製薬、生化学分野などにおける検査用試薬や分離用材料として広く用いられている。この赤血球凝集素は、動物由来のものと植物由来のものとに大別されるが、大量に入手しうること、処理しやすいことなどを考慮して、植物由来のものが実用上注目されている。
【０００６】
これまで、これらの植物由来の赤血球凝集素としては、陸上植物由来のものとしてタチナタマメからのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）や小麦からの小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）などや（非特許文献１参照）、海洋植物由来のものとしてオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｖｅｒｒｕｃｏｓａ）からのＧＶＡＩ、カギイバラノリ（Ｈｙｐｎｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ）からのＨｙｐｎｉｎ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ（非特許文献２参照）などが知られている。
【０００７】
しかしながら、陸上植物由来のものは、凝集活性の高い標品は比較的容易に得ることができるが、単糖類や二糖類のような単純な糖によっても赤血球凝集活性が阻害されるため、認識糖鎖選択性が低いという欠点がある。海洋植物由来のものは、単糖類や二糖類によって赤血球凝集活性が阻害されず、フェツイン、アシアロフェツインのような糖タンパク質によって阻害されるため、認識糖鎖選択性が高いと考えられるが、凝集活性の高い標品を得ることが困難であるという欠点を有する。両者ともイオン強度の変化により凝集活性の制御を行うことができないという欠点をもっている。
また、一般に赤血球凝集素については１００℃での熱処理によって、その糖鎖結合能力を喪失するという欠点がある。
【０００８】
赤血球凝集素の細胞に対する生物活性の中で、画期的なものとしてリンパ球との反応を挙げることができる。リンパ球を非常に低い濃度の赤血球凝集素とともに培養すると、リンパ球が増殖し、分裂するようになる。このように静止期にあるリンパ球を成長・増殖する状態へと引き金を引く効果はマイトジェン刺激と呼ばれ、異物（抗原）に対する生体の免疫反応の鍵となる重要な現象である。マイトジェン刺激機能は細胞性免疫能力賦活機能の一つであり、赤血球凝集素の自然免疫増強活性の指標となる。
【０００９】
マイトジェンとして主に利用される赤血球凝集素はコンカナバリン エイ（Ｃｏｎ Ａ）、インゲンマメレクチン ピイ（ＰＨＡ−Ｐ）、インゲンマメレクチン エル（ＰＨＡ−Ｌ）、アメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）などで、これらをリンパ球とともに４８〜７２時間培養し、ＤＮＡに取り込まれた標識チミジンの増加率を測定することにより検定される。
【００１０】
マイトジェン能をもつ赤血球凝集素は細胞の抗原特異性とは無関係に、活性化可能なリンパ球のほとんどを活性化できるため、細胞の増殖による変化を追求したり、研究したりするのが容易である。また赤血球凝集素がＴリンパ球に対し、細胞傷害活性を誘導させることも明らかとなっている。誘導されたＴ細胞の細胞傷害活性は抗原非特異的であることから、様々な正常細胞や悪性化細胞に対して発揮される。
【００１１】
このように、赤血球凝集素によるマイトジェン活性化は、使用が容易で簡単なことから、エイズを含む様々な病気の患者の免疫能を判定する手段となっている。また種々の免疫抑制効果や免疫療法の効果を調べる目的にも使われている。さらに最近では、ガンの新しい治療法であるＬＡＫ療法におけるリンパ球の分裂促進剤としても注目されている。
【００１２】
赤血球凝集素は糖鎖を特異的に認識し、結合する能力を有している。この性質は、マイトジェンとして生体内への直接投与あるいは皮膚へ経皮投与した場合、細胞表層糖鎖を認識し、細胞と結合できるため、糖鎖結合能力を持たないマイトジェンと比べて、細胞表層の糖鎖と結合して細胞表層に接近できるなどして、より効果的にマイトジェンとして機能を発揮することが考えられる。
【００１３】
しかし、これらマイトジェン能をもつ赤血球凝集素は、タンパク質が主成分であり、高温（約１００℃）での熱処理や４０〜５０℃でも長時間放置をすると糖結合能力を失ってしまうため、生体内投与に際しての他試薬との併合や、皮膚への塗布のためのクリームや軟膏として使用する際の他成分との併用は制限されるのを免れない。したがって、熱処理後も糖鎖結合能力を保持することができるマイトジェン能をもつ赤血球凝集素が求められており、本発明者らは先にオゴノリ属紅藻類から高活性赤血球凝集素を製造する方法を提案した（特許文献１）。しかしながら、その高活性赤血球凝集素が光阻害免疫能力回復作用のような生理活性を有することは知られていなかった。
【００１４】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」、１９３６年、第３２巻、第２２７−２３７ページ（特許請求の範囲その他）
【非特許文献２】「ブレタン・オブ・ジャパニーズ・ソサエティ・オブ・サイエンティフィック・フィッシェリイズ（Ｂｕｌ．Ｊａｐ．ｓｏｃ．ｓｃｉ．Ｆｉｓｈｅ．）」、１９８１年、第４７巻、第１０７９−１０８４ページ（特許請求の範囲その他）
【非特許文献３】日本生化学会編「生化学実験講座１」タンパク質の化学Ｉ分離精製、東京化学同人発行（１９７６年）
【特許文献１】特開平５−１３９９８８号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献２】特開平６−２５６２０８号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献３】特開平９−１２４７４号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献４】特開平１１−２９２７３７号公報（特許請求の範囲その他）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、自然界に多量に存在し、容易に入手可能な原料を用いて、強力な光阻害免疫能力回復作用を有し、外用剤として使用し得る新規な光阻害免疫能力回復剤を提供することを目的としてなされたものである。
ここで、光阻害免疫能力回復剤とは、紫外線その他の放射線の照射によりそこなわれた皮膚器官の免疫機能を回復し、元の免疫能力を有する器官の再生する能力をもつ物質を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、海藻由来の生体高分子物質特に赤血球凝集素の生理活性について、種々研究を重ねた結果、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物が、細胞免疫能力賦活活性を示し、光阻害免疫能力回復剤として有効であることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤を提供するものである。
この光阻害免疫能力回復剤は、例えば次に示す方法（１）〜（３）により製造される。
【００１８】
（１）オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とする方法、
（２）オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収する方法、及び
（３）オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿分離して細胞性免疫能力賦活活性を示す溶液を得る方法。
【００１９】
そして、このようにして得られる光阻害免疫能力回復剤は、以下に示す点（イ）ないし（リ）のいずれか１つにより特徴付けられている。
（イ）オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出され、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類であること、
（ロ）オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出され、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類由来の非成熟性単藻培養株であること、
（ハ）液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツィン又はアシアロフェツィンで阻害されること、
（ニ）液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化すること、
（ホ）液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有すること、
（ヘ）液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進すること、
（ト）液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有すること、
（チ）液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下であること、
（リ）液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出すること。
【００２０】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｌａ ｓｐ．）から塩類水溶液で抽出される抽出液に、最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶液で溶解し、透析と同時に等電点沈殿処理した透析同時等電点沈殿処理した粗活性画分、又は上記の透析同時等電点沈殿処理の前後で１００℃、１〜１０分間の熱処理によって夾雑タンパク質を除去した熱処理済みの粗活性画分、又はクロマトグラフィーにより成分を分離し、細胞性免疫能力賦活性特に光免疫抑制された細胞の自己免疫増強・光免疫抑制回復活性を示す画分を捕集することによって得られるクロマト精製活性画分、又はゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画することによって得られる液状体などの形で用いられる。
【００２１】
上記の硫酸アンモニウムの飽和濃度は、「グリーン及びヒューズ（Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．＆ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｗ．Ｌ．）著（１９５５）「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、第６７〜９０ページ」に記載されている［結晶硫酸アンモニウムの添加量と濃度（％飽和）との関係に関する表］に基づいて、規定されるものである。
【００２２】
本発明方法における塩類水溶液としては、例えば生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液などがあり、特に、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液が好ましい。
【００２３】
上記で得た液状体は、糖を主成分とする赤血球凝集素を含んでいる。このような糖としては、糖を構成している単糖の中のガラクトースの割合が７０〜１００％、特には９０から１００％のものが好ましい。本発明の光阻害免疫能力回復剤として上記液状体を用いる場合、糖のほかに糖の質量に対してタンパク質の質量が０．４以下であるタンパク質を含んでいてもよい。
【００２４】
なお、糖の定量は、標準試料としてガラクトースを用いて、フェノール硫酸法によって行い、タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって行う。
【００２５】
本発明の原料としては、オゴノリ属紅藻類が用いられるが、特にオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）、それらの亜種が好ましく、天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類がより好ましく、天然で成熟体として雌雄配偶対が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類から作成された非成熟性単藻培養株が最も好ましい。本発明においてオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）とは、（１）オゴノリ属海藻（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）に分類される海藻、あるいは、（２）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に分類される海藻、あるいは、（３）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に過去に分類された海藻を含む。
【００２６】
例えば、日本産海藻では、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）とは、非特許文献「新日本海藻誌日本産海藻類総覧、吉田忠生著、内田老鶴圃発行、１９９８年」においてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ：グラシラリアレス）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ：グラシラリアシー）に分類されている海藻を含む。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。
【００２７】
本発明の光阻害免疫能力回復剤を好適に製造するには、上記の紅藻類原料に（イ）水溶性画分の抽出工程、（ロ）粗活性画分の分取工程、及び、必要に応じて、（ハ）凝集素の精製工程を順次施す。
【００２８】
前記各工程について、さらに詳細に説明すると、まず（イ）工程においては、原料の紅藻類に塩類含有水溶液、例えば、生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液、好ましくは、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液を加えてホモゲナイズしたのち、遠心分離処理し、上澄である粗抽出液を得る。
【００２９】
次に（ロ）工程においては、前記（イ）工程で得られた抽出液に、まず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により除去する。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去される。次いで、遠心分離処理で得た上澄に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて２段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により分別したのち、この沈殿画分を塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液で再溶解し、所望に応じ、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対する透析等により精製して粗活性画分を得る。この粗活性画分は、光阻害免疫能力回復活性としては高いが、比活性は高くない、すなわち以前夾雑物がのこっている。したがってこの粗活性画分をそのまま本発明の光阻害免疫能力回復剤として用いるのは好ましくない。
【００３０】
次いでこの粗活性画分を透析チューブに収納し、蒸留水に二酸化炭素を吹き込んだ透析液あるいは適当なｐＨの水溶液を透析液として、透析と同時に等電点沈殿処理を行い（以下透析同時等電点沈殿処理という）、沈殿物と可溶性画分を分離することにより粗活性画分よりも単位質量当りの比活性が高い沈殿物である透析同時等電点沈殿処理済みの粗活性画分を回収するか、あるいは可溶性粗活性画分よりも単位質量当りの比活性が高い可溶性画分である透析同時等電点沈殿処理済みの粗活性画分を分離し、捕集する。
【００３１】
このときの透析液は等電点沈殿処理するタンパク質など生体高分子の等電点によりｐＨを選べばよい。透析液としてｐＨ５．５の透析液を調製するには、（１）蒸留水に炭酸ガスを吹き込んでｐＨを調整する方法、（２）４ｍＭほどの薄い緩衝液の使用等が考えられるが、蒸留水製造装置で蒸留した蒸留水のｐＨもｐＨ５．５付近なのでそのまま用いることができる。なお、本発明での透析同時等電点沈殿処理は４℃で行う。
【００３２】
例えば、オゴノリの光阻害免疫能力回復剤の粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を精製する手順例を以下に示す。（１）粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を最少量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解する。（２）粗活性画分再溶解液の硫酸アンモニウム濃度が濃い間は、最初の内は透析液として緩衝作用のない蒸留水は、ｐＨが極端に変化するために使用しない方がよい、そこで、粗活性画分再溶解液約５０ｍｌを収容した透析チューブ８本当たり、２．５リットルの緩衝液Ａで透析を開始する。透析液の交換は２回／日とする。（３）透析液の硫酸イオンをイオンクロマトで分析し、硫酸アンモニウムの濃度が低下したことを見極めてから、透析液を緩衝液Ｂ［０．１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］にして透析を２回、緩衝液Ｃ［０．０１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］にして透析を２回した後、透析液をｐＨ５．５の蒸留水にする。
透析チューブは分画分子量８，０００の膜を使用した。
【００３３】
さらに、所望に応じ、（ロ）工程の最後、あるいは透析同時等電点沈殿処理の前に、粗活性画分あるいは透析同時等電点沈殿処理した粗活性画分を１００℃、１〜１０分間熱処理し沈殿した夾雑タンパク質を除去することにより、熱処理済みの粗活性画分を得る。以上の操作により、得られた透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分が得られる。透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分は、塩析のみで得た粗活性画分に比べて、共雑物が少なく、比活性が高いため、そのまま本発明の光阻害免疫能力回復剤として用いることができる。
【００３４】
この透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分については、所望に応じ、さらに（ハ）工程を行うことができる。（ハ）工程においては、さらには、所望に応じ、前記（ロ）工程で得られた透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分を、クロマトグラフィーにより成分を分離し、細胞性免疫能力賦活性特に光阻害免疫能力回復活性を示す画分を捕集することによってクロマト精製活性画分を得ることができる。この段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲルろ過クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーあるいはそれらの組合せを用いるのが有利である。
【００３５】
さらにゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画することによって液状態の光阻害免疫能力回復剤の精製画分・精製評品を得ることができる。
【００３６】
ここでいう、分子量１０万以上の画分とは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、球状タンパク質を標準分子量物質として用い、溶出画分の分子量を算出した結果が１０万以上の分子量に相当する画分をいう。
【００３７】
本発明の光阻害免疫能力回復剤を好適に製造するには、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素精製標品の０．１ミリリットルをＴＳＫゲルＧ３０００ ＰＷＸＬカラムに添加し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムから０．１ｍｌずつ溶出画分を集める。この際、標準分子量物質として、チログロブリン（分子量６６９，０００）、フェリチン（分子量４４０，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）を用いる。その結果、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素の溶出した画分を示す凝集活性を有するピークの頂点は分子量５．６４×１０５に相当することが分った。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の光阻害免疫能力回復剤は、紅藻類由来の新規なものであって、イオン強度により凝集活性が制御でき、認識糖鎖選択性に優れ、細胞性免疫能力賦活など自己免疫増強活性を有し、１００℃、１０分間の熱処理後も糖結合活性を有するという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００４１】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分（沈殿状態の粗活性画分）を、最少量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解し、液状の粗活性画分を得た。次いで粗活性画分の一部を０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、ウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を測定した結果、２５６単位であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
【００４２】
次いで、透析同時等電点沈殿処理すなわち粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を最低量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解して得た液状の粗活性画分を透析チューブに収容し、透析液を適当な時間間隔で変えながら透析と同時に等電点沈殿処理を行った。液状の粗活性画分の硫酸アンモニウム濃度が濃い間は、最初の内は透析液として緩衝作用のない蒸留水溶液は、ｐＨが極端に変化するために使用しない方がよい、そこで、粗活性画分再溶解液約５０ミリリットルを収納した透析チューブ８本当たり、２．５リットルの緩衝液Ａで透析を開始する。透析液の交換は２回／日とする。透析液の硫酸イオンをイオンクロマトで分析し、硫酸アンモニウムの濃度が低下したことを見極めてから、透析液を緩衝液Ｂ［０．１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更し透析を２回、さらに緩衝液Ｃ［０．０１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更して透析を２回した後、透析液を蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）にした。透析チューブは分画分子量８，０００の膜を使用した。この操作は４℃の低温室内で行った。
【００４３】
透析液を蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）に変更後、３日後（透析液交換６回）に透析内液の透明度が低下してきた。更に透析を１日（透析液交換２回）続けると透析チューブ内底部に沈殿の蓄積が確認できた。その後透析を１日（透析液交換２回）行った後、透析チューブの上下両端を手で持ち、透析チューブを上下に動かし、沈殿を懸濁させた。懸濁液を遠心分離により、沈殿と可溶性画分に分別した。沈殿を適当な溶媒に溶解して沈殿再溶解画分を得た。沈殿再溶解画分及び可溶性画分について所望の生体高分子の活性を測定する。
このようにして透析同時等電点処理した粗活性画分を得ることができる。
【００４４】
上記の透析同時等電点処理した粗活性画分を温度１００℃で１０分間加熱処理を行い、遠心分離により夾雑タンパク質を除去し、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分を得た。
【００４５】
（ハ）凝集素の精製工程
次にこのようにして得られた透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分をＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５Ｐｗを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、ゲルろ過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、精製標品を得た。得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は０．４３８μｇ／ｍｌであった。以上の結果から、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分る。
【００４６】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は４０９６単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００４７】
精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は４０９６単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の光阻害免疫能力回復剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分る。
【００４８】
精製標品についてマイトジェン活性を調べるために、ヒトリンパ球幼若化試験を行った。リンパ球幼若化試験は、患者や健常人の末梢血リンパ球のＤＮＡ合成能を測定、比較するのによく用いられ、一般的な細胞性免疫反応能力を示すと考えられている。測定方法としては、固定染色標本で染色体の出現した細胞数を数える方法、形態学的に観察する方法等もあるが、本例では、３Ｈ−チミジンの細胞核への取り込みを測定する方法を行った。健常人３名分の検体からのリンパ球を用いて実験した。
【００４９】
培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ３０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量に合わせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。
【００５０】
比較用マイトジェンとしてインゲンマメレクチンを培養液に溶解して濃度１０〜５０μｇ／ｍｌに調製した。滅菌小試験管に分注、密栓して−２０℃で保存した。
【００５１】
リンパ球の分離は次のように行った。すなわち、ヘパリン添加血液よりフィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）法にてリンパ球を分離し、ＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。分離したリンパ球を培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０５個／ｍｌに調整したリンパ球浮遊液を得た。
【００５２】
リンパ球の培養は次のように行った。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注した。次いでマイトジェン溶液として、精製標品、陽性コントロールとしての比較用マイトジェン、陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずっ分注した。次いでＣＯ２濃度５％、３７℃の空気中、湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に３Ｈ−チミジンを培養液中の最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００５３】
活性の測定は次のように行った。すなわち、Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨを用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。十分に乾燥させた後、液体シンチレーターとしてトルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。結果を１検体あたり３回の測定の平均値として表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
この表から、本発明の光阻害免疫能力回復剤は、従来知られている陸上植物由来の赤血球凝集素よりも高いマイトジェン活性を示すことが分かる。
【実施例２】
【００５６】
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿質量５００ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−３０℃で凍結した。３０ｍＭ塩化カリウムと３μＭ硫酸亜鉛、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含んだ０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻（ツルシラモ湿質量５００ｇ相当）に対し、抽出用緩衝液８００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００５７】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分（沈殿状態の粗活性画分）を、最少量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解し、液状の粗活性画分を得た。次いで粗活性画分の一部を０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、ウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を測定した結果、２５６単位であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
【００５８】
次いで、透析同時等電点沈殿処理を行う。すなわち、粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を最低量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解して得た液状の粗活性画分を透析チューブに収容し、透析液を適当な時間間隔で変えながら透析と同時に等電点沈殿処理を行った。液状の粗活性画分の硫酸アンモニウム濃度が濃い間は、最初の内は透析液として緩衝作用のない蒸留水は、ｐＨが極端に変化するために使用しない方がよい、そこで、粗活性画分再溶解液約５０ミリリットルを収納した透析チューブ８本当たり、２．５リットルの緩衝液Ａで透析を開始する。透析液の交換は２回／日とする。透析液の硫酸イオンをイオンクロマトで分析し、硫酸アンモニウムの濃度が低下したことを見極めてから、透析液を緩衝液Ｂ［０．１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更し透析を２回、さらに緩衝液Ｃ［０．０１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更して透析を２回した後、透析液を蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）にした。
【００５９】
透析液を蒸留水蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）に変更後、３日後（透析液交換６回）に試料液の透明度が低下してきた。更に透析を１日（透析液交換２回）続けると透析チューブ内底部に沈殿の蓄積が確認できた。その後透析を１日（透析液交換２回）行った後、透析チューブの上下両端を手で持ち、透析チューブを上下に動かし、沈殿を懸濁させた。懸濁液を遠心分離により、沈殿と可溶性画分に分別した。沈殿を適当な溶媒に溶解して沈殿再溶解画分を得た。沈殿再溶解画分及び可溶性画分について所望の生体高分子の活性を測定する。このようにして透析同時等電点処理した粗活性画分を得ることができる。
【００６０】
透析同時等電点処理した粗活性画分を温度１００℃で１０分間加熱処理を行い、遠心分離により夾雑タンパク質を除去し、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分を得た。
【００６１】
（ハ）凝集素の精製工程
次にこのようにして得られた透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分をＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、精製標品を得た。このようにして得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４０９６単位であった。以上のことから、本発明の光阻害免疫能力回復剤がその活性を保持したまま得られることが分かる。
【００６２】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は４０９６単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００６３】
精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は４０９６単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の光阻害免疫能力回復剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分る。
【００６４】
粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製評品についてマイトジェン活性を測定した。ヒトリンパ球幼若化試験を行った。
【００６５】
次に、３Ｈ−チミジンの取り込みによる、ヒトリンパ球幼若化試験を行って、粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製評品についてのマイトジェン活性を測定した。この場合、すべての細胞培養に要する材料、マイクロプレート、セルハーベスター、グラスファイバーフィルター、カウンティングバイアル、３Ｈ−チミジン、トルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）、液体シンチレーションカウンターの準備及びこれらを用いて行う操作はいずれも無菌的に行った。
【００６６】
次に、培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ３ ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量にあわせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。この状態で２か月は保存使用可能であった。使用時には使い切るようにし、凍結融解は繰り返さないようにした。
【００６７】
リンパ球は、ヘパリン添加血液からフィコール・コンレイ法により分離した。次いでＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄したのち、培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５ｘ１０５個／ｍｌに調整した。
【００６８】
リンパ球の培養は、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注して行った。
【００６９】
次いで、リンパ球の入ったマイクロプレートをクリーンブース内に置いた。３つの実験区により実験を行った。紫外線照射を行わず、３０分間クリーンブース内に放置した対照実験区を実験区Ａとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を３０分間行った実験区を実験区Ｂとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を１６時間行った実験区を実験区Ｃとした。紫外線照射は次のように行った。マイクロプレートをクロマトビューポータブル暗箱（フナコシ株式会社製）に入れ、暗箱上部取り付けた６ワット・ハンディ型ＵＶランプＵＶＬ−５６型ブラックレイランプ（フナコシ株式会社製）より、長波長（３６５ｎｍ）の紫外線を照射した。この際の３６５ｎｍの紫外線強度は、デジタル式ＵＶＸ ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ紫外線強度計（フナコシ株式会社製）にＭＯＤＥＬ ＵＶＸ−３６センサー（フナコシ株式会社製）を接続して測定した。マイクロプレートの位置での紫外線強度は、０．６３ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００７０】
次いで、それぞれの実験区に対して、マイトジェン溶液として、粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製標品、リン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。粗活性画分はじめそれぞれの画分あるいは精製評品は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、実験に供した。粗活性画分はじめそれぞれの画分あるいは精製評品での３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。次いで５％ＣＯ２含有空気中３７℃の湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に３Ｈ−チミジンを培養液当りの最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００７１】
活性の測定は次のように行った。Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨ等を用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。次いで充分乾燥させた後、液体シンチレーター ５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。実施例１で用いた３人とは別の３人の検体（以下、検体ａ、ｂ及びｃという）からのリンパ球を用いて実験した。ある実験条件での実験数を３回とし、平均は３回の測定の平均値を表に示す。その検体ａについての結果を表２、検体ｂについての結果を表３、検体ｃについての結果を表４にそれぞれ示す。粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分の比活性については、その検体ａについての結果を表５、検体ｂについての結果を表６、検体ｃについての結果を表７にそれぞれ示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
【表７】
【００７８】
表２ないし４の実験区Ａから明らかなように、実施例２で得られた粗活性画分及び精製標品からなる本発明の光阻害免疫能力回復剤は、陰性コントロールと比べて、３Ｈ−チミジンの取り込み量がそれぞれ６００倍以上及び３７００倍以上と著しく多いので、優れたマイトジェン活性を示すことが分かる。
また、表２ないし４の陰性コントロールの平均値から明らかなように、紫外線を照射すると、３Ｈ−チミジンの取り込み量、すなわち免疫力が低下することが分かるが、実験区Ｂ及びＣの結果から明らかなように、本発明の光阻害免疫能力回復剤を添加することにより、紫外線を照射しても３Ｈ−チミジンの取り込みが促進されることが分かる。
以上の結果から、光阻害免疫機能回復成分の粗活性画分・精製標品を紫外線照射処理によりＤＮＡ合成能力（３Ｈ−チミジンの取り込みなど）など免疫力が低下したヒトリンパ球に対して添加することにより、当該リンパ球のＤＮＡ合成能力など免疫力を増強させることができる。また、紫外線照射時間が３０分以内であれば、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に光阻害免疫機能回復成分を添加した場合と同等のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができる。紫外線を１６時間照射しても、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合の５０％以上のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができるし、紫外線を照射しなかった陰性コントロールと比較すると、３Ｈ−チミジンの取り込み量がはるかに多いことが分かる。
【実施例３】
【００７９】
（ハ）水溶性画分の抽出工程
オゴノリ属紅藻類として、ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿重量５００ｇを使う代わりにツルシラモ（勝浦川河口産）由来の非成熟性単類培養株湿質量５００ｇを原料に用いた以外は、実施例２と同様にして、光阻害免疫能力回復剤の製造を行った。オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類である、ツルシラモを徳島県徳島市勝浦側河口の勝浦川の中より採取した。本発明では、このツルシラモをツルシラモ勝浦川河口産という。
【００８０】
ツルシラモ（勝浦川河口産）から得られた粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製標品、および陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）について、用いるリンパ球が、実施例２とは異なる別の３人の検体（以下、検体ｄ、ｅ及びｆという）からのリンパ球である以外は実施例２と同様にして光阻害免疫能力回復剤の活性測定を行った。
ある実験条件での実験数を３回とし、平均は３回の測定の平均値を示す。その検体ｄについての結果を表８、検体ｅについての結果を表９、検体ｆについての結果を表１０にそれぞれ示す。粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分の比活性については、その検体ｄについての結果を表１１、検体ｅについての結果を表１２、検体ｆについての結果を表１３にそれぞれ示す。
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
【表１３】
【００８７】
比較例１
実施例１−（ロ）の粗活性画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エタノールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２７巻、第２０６３〜２０６７ページ（１９８８年）参照］を行った以外は、実施例１と同様にして粗活性画分を得た。この粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４単位、比活性は５３．４単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は５．０％であった。これらの結果を表１４に示す。比較のために実施例１の結果も併記した。
【００８８】
比較例２
常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って、紅藻類由来の赤血球凝集素を得た。得られた粗活性画分の赤血球凝集活性は１６単位、比活性は１４９．５単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は１９．５％であった。これらの結果を表１４に示す。また、精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は３２．６μｇ／ｍｌであり、実施例１の約１／４０の比活性に相当した。
【００８９】
【表１４】
【００９０】
比較例３
紅藻類から常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って精製した分子量５０，０００の凝集素について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに１０２４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は見られなかった。これらの結果を表１５に示す。比較のために実施例１の結果も併記した。
【００９１】
比較例４
Ｃｏｎ Ａ［和光純薬（株）製］２５ｍｇをリン酸緩衝液１００ｍｌに溶解し、ウサギ赤血球凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに６４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は見られなかった。これらの結果を表１５に示す。
【００９２】
【表１５】
【００９３】
Ｃｏｎ Ａを１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は検出されず、熱処理により凝集活性の消失が認められた。
【００９４】
表１４から明らかなように、実施例１で得られた粗活性画分からなる本発明の光阻害免疫能力回復剤は、比較例１及び２のものに比べて、凝集活性、比活性、活性回収率がいずれも高く、活性回収率は比較例１の約１２倍、比較例２の約３倍、比活性は比較例１の約６３倍、比較例２の約２３倍である。また、表１５から実施例１の精製凝集素は比較例３及び４のものと異なり、ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により制御されることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の光阻害免疫能力回復剤は、臨床分野、医療分野、生化学工業分野における治療用、検査用材料など、及び化粧品分野の添加剤として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線その他の放射線によりそこなわれた皮膚の免疫能力を回復して健常状態の皮膚にするための光阻害免疫能力回復剤及びそれをオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）を原料として、製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人体が有する最も重要な生体防御機能の１つに皮膚免疫機能がある。皮膚は生体の最外層にある器官であり、外部からの物理的、化学的又は生物学的攻撃を最も受けやすく、その被害が内部組織に浸透するのを防ぐための免疫機能を備えている。
【０００３】
この皮膚は、角化細胞、ランゲルハンス細胞からなる表皮組織と、樹状細胞、血管内皮細胞、マクロファージなどからなる真皮組織により構成され、その中のランゲルハンス細胞は、外部からの異物としての抗原の進入に対し、それを速やかに処理して、その情報をリンパ節を介してＴ細胞に伝達し、一連の免疫上の対応をするための重要な役割を果すことが知られている。
【０００４】
ところで、皮膚が紫外線のような放射線に長時間暴露されると、細胞が損傷を受け、上記の免疫機能が失われ、皮膚の防御機能が低下する。
このため、失われた皮膚の免疫機能を賦活するための研究が行われ、例えばオゴノリ属に属する海藻より水性溶媒で抽出された物質を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献１参照）、紅藻類に属する海藻から酸性多糖を水性溶媒で抽出し、固液分離して得られる抽出液に、該酸性多糖を加水分解する能力を有するβ−アガラーゼを作用させて酸性多糖を低粘性化して得られる溶液、又は上記海藻をβ−アガラーゼを含有する水性溶媒と接触させ、酸性多糖を抽出と同時に低粘性化したのち、固液分離して得られる溶液、又はこれらの溶液の精製液から分離した固形分を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献２参照）、ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマトグラフィー処理してグリコマクロペプチドに富む画分を得、この画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロマトグラフィーで処理することによって得られる免疫賦活物質（特許文献３参照）などが提案されている。
これらの免疫賦活剤は、経口的に投与することにより低下した皮膚免疫機能を復元させるものであるが、このような薬剤の皮膚免疫賦活における作用機序は解明されていないので、これを外用剤としたときに、同じ効果を奏するか否かは全く不明である。
また、外用剤として適用を得る皮膚免疫賦活剤については、グルタチオンと、カロチン類、キサンチン類、フラン類、トコフェロール類、アミノ酸類などとの組合せを含有する皮膚免疫賦活剤が提案されている（特許文献４参照）、効果の点で必ずしも満足し得るものとはいえない。
【０００５】
ところで、赤血球凝集素は、各動物の赤血球に対し特異的な挙動を示すので、医療、製薬、生化学分野などにおける検査用試薬や分離用材料として広く用いられている。この赤血球凝集素は、動物由来のものと植物由来のものとに大別されるが、大量に入手しうること、処理しやすいことなどを考慮して、植物由来のものが実用上注目されている。
【０００６】
これまで、これらの植物由来の赤血球凝集素としては、陸上植物由来のものとしてタチナタマメからのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）や小麦からの小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）などや（非特許文献１参照）、海洋植物由来のものとしてオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｖｅｒｒｕｃｏｓａ）からのＧＶＡＩ、カギイバラノリ（Ｈｙｐｎｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ）からのＨｙｐｎｉｎ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ（非特許文献２参照）などが知られている。
【０００７】
しかしながら、陸上植物由来のものは、凝集活性の高い標品は比較的容易に得ることができるが、単糖類や二糖類のような単純な糖によっても赤血球凝集活性が阻害されるため、認識糖鎖選択性が低いという欠点がある。海洋植物由来のものは、単糖類や二糖類によって赤血球凝集活性が阻害されず、フェツイン、アシアロフェツインのような糖タンパク質によって阻害されるため、認識糖鎖選択性が高いと考えられるが、凝集活性の高い標品を得ることが困難であるという欠点を有する。両者ともイオン強度の変化により凝集活性の制御を行うことができないという欠点をもっている。
また、一般に赤血球凝集素については１００℃での熱処理によって、その糖鎖結合能力を喪失するという欠点がある。
【０００８】
赤血球凝集素の細胞に対する生物活性の中で、画期的なものとしてリンパ球との反応を挙げることができる。リンパ球を非常に低い濃度の赤血球凝集素とともに培養すると、リンパ球が増殖し、分裂するようになる。このように静止期にあるリンパ球を成長・増殖する状態へと引き金を引く効果はマイトジェン刺激と呼ばれ、異物（抗原）に対する生体の免疫反応の鍵となる重要な現象である。マイトジェン刺激機能は細胞性免疫能力賦活機能の一つであり、赤血球凝集素の自然免疫増強活性の指標となる。
【０００９】
マイトジェンとして主に利用される赤血球凝集素はコンカナバリン エイ（Ｃｏｎ Ａ）、インゲンマメレクチン ピイ（ＰＨＡ−Ｐ）、インゲンマメレクチン エル（ＰＨＡ−Ｌ）、アメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）などで、これらをリンパ球とともに４８〜７２時間培養し、ＤＮＡに取り込まれた標識チミジンの増加率を測定することにより検定される。
【００１０】
マイトジェン能をもつ赤血球凝集素は細胞の抗原特異性とは無関係に、活性化可能なリンパ球のほとんどを活性化できるため、細胞の増殖による変化を追求したり、研究したりするのが容易である。また赤血球凝集素がＴリンパ球に対し、細胞傷害活性を誘導させることも明らかとなっている。誘導されたＴ細胞の細胞傷害活性は抗原非特異的であることから、様々な正常細胞や悪性化細胞に対して発揮される。
【００１１】
このように、赤血球凝集素によるマイトジェン活性化は、使用が容易で簡単なことから、エイズを含む様々な病気の患者の免疫能を判定する手段となっている。また種々の免疫抑制効果や免疫療法の効果を調べる目的にも使われている。さらに最近では、ガンの新しい治療法であるＬＡＫ療法におけるリンパ球の分裂促進剤としても注目されている。
【００１２】
赤血球凝集素は糖鎖を特異的に認識し、結合する能力を有している。この性質は、マイトジェンとして生体内への直接投与あるいは皮膚へ経皮投与した場合、細胞表層糖鎖を認識し、細胞と結合できるため、糖鎖結合能力を持たないマイトジェンと比べて、細胞表層の糖鎖と結合して細胞表層に接近できるなどして、より効果的にマイトジェンとして機能を発揮することが考えられる。
【００１３】
しかし、これらマイトジェン能をもつ赤血球凝集素は、タンパク質が主成分であり、高温（約１００℃）での熱処理や４０〜５０℃でも長時間放置をすると糖結合能力を失ってしまうため、生体内投与に際しての他試薬との併合や、皮膚への塗布のためのクリームや軟膏として使用する際の他成分との併用は制限されるのを免れない。したがって、熱処理後も糖鎖結合能力を保持することができるマイトジェン能をもつ赤血球凝集素が求められており、本発明者らは先にオゴノリ属紅藻類から高活性赤血球凝集素を製造する方法を提案した（特許文献１）。しかしながら、その高活性赤血球凝集素が光阻害免疫能力回復作用のような生理活性を有することは知られていなかった。
【００１４】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」、１９３６年、第３２巻、第２２７−２３７ページ（特許請求の範囲その他）
【非特許文献２】「ブレタン・オブ・ジャパニーズ・ソサエティ・オブ・サイエンティフィック・フィッシェリイズ（Ｂｕｌ．Ｊａｐ．ｓｏｃ．ｓｃｉ．Ｆｉｓｈｅ．）」、１９８１年、第４７巻、第１０７９−１０８４ページ（特許請求の範囲その他）
【非特許文献３】日本生化学会編「生化学実験講座１」タンパク質の化学Ｉ分離精製、東京化学同人発行（１９７６年）
【特許文献１】特開平５−１３９９８８号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献２】特開平６−２５６２０８号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献３】特開平９−１２４７４号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献４】特開平１１−２９２７３７号公報（特許請求の範囲その他）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、自然界に多量に存在し、容易に入手可能な原料を用いて、強力な光阻害免疫能力回復作用を有し、外用剤として使用し得る新規な光阻害免疫能力回復剤を提供することを目的としてなされたものである。
ここで、光阻害免疫能力回復剤とは、紫外線その他の放射線の照射によりそこなわれた皮膚器官の免疫機能を回復し、元の免疫能力を有する器官の再生する能力をもつ物質を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、海藻由来の生体高分子物質特に赤血球凝集素の生理活性について、種々研究を重ねた結果、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物が、細胞免疫能力賦活活性を示し、光阻害免疫能力回復剤として有効であることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤を提供するものである。
この光阻害免疫能力回復剤は、例えば次に示す方法（１）〜（３）により製造される。
【００１８】
（１）オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とする方法、
（２）オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収する方法、及び
（３）オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿分離して細胞性免疫能力賦活活性を示す溶液を得る方法。
【００１９】
そして、このようにして得られる光阻害免疫能力回復剤は、以下に示す点（イ）ないし（リ）のいずれか１つにより特徴付けられている。
（イ）オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出され、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類であること、
（ロ）オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出され、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類由来の非成熟性単藻培養株であること、
（ハ）液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツィン又はアシアロフェツィンで阻害されること、
（ニ）液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化すること、
（ホ）液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有すること、
（ヘ）液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進すること、
（ト）液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有すること、
（チ）液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下であること、
（リ）液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出すること。
【００２０】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｌａ ｓｐ．）から塩類水溶液で抽出される抽出液に、最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶液で溶解し、透析と同時に等電点沈殿処理した透析同時等電点沈殿処理した粗活性画分、又は上記の透析同時等電点沈殿処理の前後で１００℃、１〜１０分間の熱処理によって夾雑タンパク質を除去した熱処理済みの粗活性画分、又はクロマトグラフィーにより成分を分離し、細胞性免疫能力賦活性特に光免疫抑制された細胞の自己免疫増強・光免疫抑制回復活性を示す画分を捕集することによって得られるクロマト精製活性画分、又はゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画することによって得られる液状体などの形で用いられる。
【００２１】
上記の硫酸アンモニウムの飽和濃度は、「グリーン及びヒューズ（Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．＆ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｗ．Ｌ．）著（１９５５）「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、第６７〜９０ページ」に記載されている［結晶硫酸アンモニウムの添加量と濃度（％飽和）との関係に関する表］に基づいて、規定されるものである。
【００２２】
本発明方法における塩類水溶液としては、例えば生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液などがあり、特に、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液が好ましい。
【００２３】
上記で得た液状体は、糖を主成分とする赤血球凝集素を含んでいる。このような糖としては、糖を構成している単糖の中のガラクトースの割合が７０〜１００％、特には９０から１００％のものが好ましい。本発明の光阻害免疫能力回復剤として上記液状体を用いる場合、糖のほかに糖の質量に対してタンパク質の質量が０．４以下であるタンパク質を含んでいてもよい。
【００２４】
なお、糖の定量は、標準試料としてガラクトースを用いて、フェノール硫酸法によって行い、タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって行う。
【００２５】
本発明の原料としては、オゴノリ属紅藻類が用いられるが、特にオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）、それらの亜種が好ましく、天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類がより好ましく、天然で成熟体として雌雄配偶対が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類から作成された非成熟性単藻培養株が最も好ましい。本発明においてオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）とは、（１）オゴノリ属海藻（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）に分類される海藻、あるいは、（２）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に分類される海藻、あるいは、（３）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に過去に分類された海藻を含む。
【００２６】
例えば、日本産海藻では、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）とは、非特許文献「新日本海藻誌日本産海藻類総覧、吉田忠生著、内田老鶴圃発行、１９９８年」においてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ：グラシラリアレス）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ：グラシラリアシー）に分類されている海藻を含む。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。
【００２７】
本発明の光阻害免疫能力回復剤を好適に製造するには、上記の紅藻類原料に（イ）水溶性画分の抽出工程、（ロ）粗活性画分の分取工程、及び、必要に応じて、（ハ）凝集素の精製工程を順次施す。
【００２８】
前記各工程について、さらに詳細に説明すると、まず（イ）工程においては、原料の紅藻類に塩類含有水溶液、例えば、生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液、好ましくは、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液を加えてホモゲナイズしたのち、遠心分離処理し、上澄である粗抽出液を得る。
【００２９】
次に（ロ）工程においては、前記（イ）工程で得られた抽出液に、まず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により除去する。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去される。次いで、遠心分離処理で得た上澄に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて２段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により分別したのち、この沈殿画分を塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液で再溶解し、所望に応じ、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対する透析等により精製して粗活性画分を得る。この粗活性画分は、光阻害免疫能力回復活性としては高いが、比活性は高くない、すなわち以前夾雑物がのこっている。したがってこの粗活性画分をそのまま本発明の光阻害免疫能力回復剤として用いるのは好ましくない。
【００３０】
次いでこの粗活性画分を透析チューブに収納し、蒸留水に二酸化炭素を吹き込んだ透析液あるいは適当なｐＨの水溶液を透析液として、透析と同時に等電点沈殿処理を行い（以下透析同時等電点沈殿処理という）、沈殿物と可溶性画分を分離することにより粗活性画分よりも単位質量当りの比活性が高い沈殿物である透析同時等電点沈殿処理済みの粗活性画分を回収するか、あるいは可溶性粗活性画分よりも単位質量当りの比活性が高い可溶性画分である透析同時等電点沈殿処理済みの粗活性画分を分離し、捕集する。
【００３１】
このときの透析液は等電点沈殿処理するタンパク質など生体高分子の等電点によりｐＨを選べばよい。透析液としてｐＨ５．５の透析液を調製するには、（１）蒸留水に炭酸ガスを吹き込んでｐＨを調整する方法、（２）４ｍＭほどの薄い緩衝液の使用等が考えられるが、蒸留水製造装置で蒸留した蒸留水のｐＨもｐＨ５．５付近なのでそのまま用いることができる。なお、本発明での透析同時等電点沈殿処理は４℃で行う。
【００３２】
例えば、オゴノリの光阻害免疫能力回復剤の粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を精製する手順例を以下に示す。（１）粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を最少量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解する。（２）粗活性画分再溶解液の硫酸アンモニウム濃度が濃い間は、最初の内は透析液として緩衝作用のない蒸留水は、ｐＨが極端に変化するために使用しない方がよい、そこで、粗活性画分再溶解液約５０ｍｌを収容した透析チューブ８本当たり、２．５リットルの緩衝液Ａで透析を開始する。透析液の交換は２回／日とする。（３）透析液の硫酸イオンをイオンクロマトで分析し、硫酸アンモニウムの濃度が低下したことを見極めてから、透析液を緩衝液Ｂ［０．１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］にして透析を２回、緩衝液Ｃ［０．０１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］にして透析を２回した後、透析液をｐＨ５．５の蒸留水にする。
透析チューブは分画分子量８，０００の膜を使用した。
【００３３】
さらに、所望に応じ、（ロ）工程の最後、あるいは透析同時等電点沈殿処理の前に、粗活性画分あるいは透析同時等電点沈殿処理した粗活性画分を１００℃、１〜１０分間熱処理し沈殿した夾雑タンパク質を除去することにより、熱処理済みの粗活性画分を得る。以上の操作により、得られた透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分が得られる。透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分は、塩析のみで得た粗活性画分に比べて、共雑物が少なく、比活性が高いため、そのまま本発明の光阻害免疫能力回復剤として用いることができる。
【００３４】
この透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分については、所望に応じ、さらに（ハ）工程を行うことができる。（ハ）工程においては、さらには、所望に応じ、前記（ロ）工程で得られた透析同時等電点沈殿処理及び熱処理済みの粗活性画分を、クロマトグラフィーにより成分を分離し、細胞性免疫能力賦活性特に光阻害免疫能力回復活性を示す画分を捕集することによってクロマト精製活性画分を得ることができる。この段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲルろ過クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーあるいはそれらの組合せを用いるのが有利である。
【００３５】
さらにゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画することによって液状態の光阻害免疫能力回復剤の精製画分・精製評品を得ることができる。
【００３６】
ここでいう、分子量１０万以上の画分とは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、球状タンパク質を標準分子量物質として用い、溶出画分の分子量を算出した結果が１０万以上の分子量に相当する画分をいう。
【００３７】
本発明の光阻害免疫能力回復剤を好適に製造するには、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素精製標品の０．１ミリリットルをＴＳＫゲルＧ３０００ ＰＷＸＬカラムに添加し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムから０．１ｍｌずつ溶出画分を集める。この際、標準分子量物質として、チログロブリン（分子量６６９，０００）、フェリチン（分子量４４０，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）を用いる。その結果、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素の溶出した画分を示す凝集活性を有するピークの頂点は分子量５．６４×１０５に相当することが分った。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の光阻害免疫能力回復剤は、紅藻類由来の新規なものであって、イオン強度により凝集活性が制御でき、認識糖鎖選択性に優れ、細胞性免疫能力賦活など自己免疫増強活性を有し、１００℃、１０分間の熱処理後も糖結合活性を有するという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００４１】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分（沈殿状態の粗活性画分）を、最少量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解し、液状の粗活性画分を得た。次いで粗活性画分の一部を０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、ウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を測定した結果、２５６単位であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
【００４２】
次いで、透析同時等電点沈殿処理すなわち粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を最低量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解して得た液状の粗活性画分を透析チューブに収容し、透析液を適当な時間間隔で変えながら透析と同時に等電点沈殿処理を行った。液状の粗活性画分の硫酸アンモニウム濃度が濃い間は、最初の内は透析液として緩衝作用のない蒸留水溶液は、ｐＨが極端に変化するために使用しない方がよい、そこで、粗活性画分再溶解液約５０ミリリットルを収納した透析チューブ８本当たり、２．５リットルの緩衝液Ａで透析を開始する。透析液の交換は２回／日とする。透析液の硫酸イオンをイオンクロマトで分析し、硫酸アンモニウムの濃度が低下したことを見極めてから、透析液を緩衝液Ｂ［０．１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更し透析を２回、さらに緩衝液Ｃ［０．０１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更して透析を２回した後、透析液を蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）にした。透析チューブは分画分子量８，０００の膜を使用した。この操作は４℃の低温室内で行った。
【００４３】
透析液を蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）に変更後、３日後（透析液交換６回）に透析内液の透明度が低下してきた。更に透析を１日（透析液交換２回）続けると透析チューブ内底部に沈殿の蓄積が確認できた。その後透析を１日（透析液交換２回）行った後、透析チューブの上下両端を手で持ち、透析チューブを上下に動かし、沈殿を懸濁させた。懸濁液を遠心分離により、沈殿と可溶性画分に分別した。沈殿を適当な溶媒に溶解して沈殿再溶解画分を得た。沈殿再溶解画分及び可溶性画分について所望の生体高分子の活性を測定する。
このようにして透析同時等電点処理した粗活性画分を得ることができる。
【００４４】
上記の透析同時等電点処理した粗活性画分を温度１００℃で１０分間加熱処理を行い、遠心分離により夾雑タンパク質を除去し、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分を得た。
【００４５】
（ハ）凝集素の精製工程
次にこのようにして得られた透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分をＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５Ｐｗを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、ゲルろ過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、精製標品を得た。得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は０．４３８μｇ／ｍｌであった。以上の結果から、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分る。
【００４６】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は４０９６単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００４７】
精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は４０９６単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の光阻害免疫能力回復剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分る。
【００４８】
精製標品についてマイトジェン活性を調べるために、ヒトリンパ球幼若化試験を行った。リンパ球幼若化試験は、患者や健常人の末梢血リンパ球のＤＮＡ合成能を測定、比較するのによく用いられ、一般的な細胞性免疫反応能力を示すと考えられている。測定方法としては、固定染色標本で染色体の出現した細胞数を数える方法、形態学的に観察する方法等もあるが、本例では、３Ｈ−チミジンの細胞核への取り込みを測定する方法を行った。健常人３名分の検体からのリンパ球を用いて実験した。
【００４９】
培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ３０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量に合わせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。
【００５０】
比較用マイトジェンとしてインゲンマメレクチンを培養液に溶解して濃度１０〜５０μｇ／ｍｌに調製した。滅菌小試験管に分注、密栓して−２０℃で保存した。
【００５１】
リンパ球の分離は次のように行った。すなわち、ヘパリン添加血液よりフィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）法にてリンパ球を分離し、ＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。分離したリンパ球を培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０５個／ｍｌに調整したリンパ球浮遊液を得た。
【００５２】
リンパ球の培養は次のように行った。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注した。次いでマイトジェン溶液として、精製標品、陽性コントロールとしての比較用マイトジェン、陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずっ分注した。次いでＣＯ２濃度５％、３７℃の空気中、湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に３Ｈ−チミジンを培養液中の最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００５３】
活性の測定は次のように行った。すなわち、Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨを用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。十分に乾燥させた後、液体シンチレーターとしてトルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。結果を１検体あたり３回の測定の平均値として表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
この表から、本発明の光阻害免疫能力回復剤は、従来知られている陸上植物由来の赤血球凝集素よりも高いマイトジェン活性を示すことが分かる。
【実施例２】
【００５６】
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿質量５００ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−３０℃で凍結した。３０ｍＭ塩化カリウムと３μＭ硫酸亜鉛、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含んだ０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻（ツルシラモ湿質量５００ｇ相当）に対し、抽出用緩衝液８００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００５７】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分（沈殿状態の粗活性画分）を、最少量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解し、液状の粗活性画分を得た。次いで粗活性画分の一部を０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、ウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を測定した結果、２５６単位であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
【００５８】
次いで、透析同時等電点沈殿処理を行う。すなわち、粗活性画分の硫酸アンモニウム塩析沈殿を最低量の緩衝液Ａ［３０ｍＭ 塩化カリウム、３μＭ 硫酸亜鉛、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］に溶解して得た液状の粗活性画分を透析チューブに収容し、透析液を適当な時間間隔で変えながら透析と同時に等電点沈殿処理を行った。液状の粗活性画分の硫酸アンモニウム濃度が濃い間は、最初の内は透析液として緩衝作用のない蒸留水は、ｐＨが極端に変化するために使用しない方がよい、そこで、粗活性画分再溶解液約５０ミリリットルを収納した透析チューブ８本当たり、２．５リットルの緩衝液Ａで透析を開始する。透析液の交換は２回／日とする。透析液の硫酸イオンをイオンクロマトで分析し、硫酸アンモニウムの濃度が低下したことを見極めてから、透析液を緩衝液Ｂ［０．１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更し透析を２回、さらに緩衝液Ｃ［０．０１５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］に変更して透析を２回した後、透析液を蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）にした。
【００５９】
透析液を蒸留水蒸留水（ｐＨは約ｐＨ５．５）に変更後、３日後（透析液交換６回）に試料液の透明度が低下してきた。更に透析を１日（透析液交換２回）続けると透析チューブ内底部に沈殿の蓄積が確認できた。その後透析を１日（透析液交換２回）行った後、透析チューブの上下両端を手で持ち、透析チューブを上下に動かし、沈殿を懸濁させた。懸濁液を遠心分離により、沈殿と可溶性画分に分別した。沈殿を適当な溶媒に溶解して沈殿再溶解画分を得た。沈殿再溶解画分及び可溶性画分について所望の生体高分子の活性を測定する。このようにして透析同時等電点処理した粗活性画分を得ることができる。
【００６０】
透析同時等電点処理した粗活性画分を温度１００℃で１０分間加熱処理を行い、遠心分離により夾雑タンパク質を除去し、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分を得た。
【００６１】
（ハ）凝集素の精製工程
次にこのようにして得られた透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分をＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、精製標品を得た。このようにして得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４０９６単位であった。以上のことから、本発明の光阻害免疫能力回復剤がその活性を保持したまま得られることが分かる。
【００６２】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は４０９６単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００６３】
精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は４０９６単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の光阻害免疫能力回復剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分る。
【００６４】
粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製評品についてマイトジェン活性を測定した。ヒトリンパ球幼若化試験を行った。
【００６５】
次に、３Ｈ−チミジンの取り込みによる、ヒトリンパ球幼若化試験を行って、粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製評品についてのマイトジェン活性を測定した。この場合、すべての細胞培養に要する材料、マイクロプレート、セルハーベスター、グラスファイバーフィルター、カウンティングバイアル、３Ｈ−チミジン、トルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）、液体シンチレーションカウンターの準備及びこれらを用いて行う操作はいずれも無菌的に行った。
【００６６】
次に、培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ３ ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量にあわせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。この状態で２か月は保存使用可能であった。使用時には使い切るようにし、凍結融解は繰り返さないようにした。
【００６７】
リンパ球は、ヘパリン添加血液からフィコール・コンレイ法により分離した。次いでＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄したのち、培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５ｘ１０５個／ｍｌに調整した。
【００６８】
リンパ球の培養は、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注して行った。
【００６９】
次いで、リンパ球の入ったマイクロプレートをクリーンブース内に置いた。３つの実験区により実験を行った。紫外線照射を行わず、３０分間クリーンブース内に放置した対照実験区を実験区Ａとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を３０分間行った実験区を実験区Ｂとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を１６時間行った実験区を実験区Ｃとした。紫外線照射は次のように行った。マイクロプレートをクロマトビューポータブル暗箱（フナコシ株式会社製）に入れ、暗箱上部取り付けた６ワット・ハンディ型ＵＶランプＵＶＬ−５６型ブラックレイランプ（フナコシ株式会社製）より、長波長（３６５ｎｍ）の紫外線を照射した。この際の３６５ｎｍの紫外線強度は、デジタル式ＵＶＸ ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ紫外線強度計（フナコシ株式会社製）にＭＯＤＥＬ ＵＶＸ−３６センサー（フナコシ株式会社製）を接続して測定した。マイクロプレートの位置での紫外線強度は、０．６３ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００７０】
次いで、それぞれの実験区に対して、マイトジェン溶液として、粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製標品、リン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。粗活性画分はじめそれぞれの画分あるいは精製評品は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、実験に供した。粗活性画分はじめそれぞれの画分あるいは精製評品での３Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。次いで５％ＣＯ２含有空気中３７℃の湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に３Ｈ−チミジンを培養液当りの最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００７１】
活性の測定は次のように行った。Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨ等を用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。次いで充分乾燥させた後、液体シンチレーター ５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。実施例１で用いた３人とは別の３人の検体（以下、検体ａ、ｂ及びｃという）からのリンパ球を用いて実験した。ある実験条件での実験数を３回とし、平均は３回の測定の平均値を表に示す。その検体ａについての結果を表２、検体ｂについての結果を表３、検体ｃについての結果を表４にそれぞれ示す。粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分の比活性については、その検体ａについての結果を表５、検体ｂについての結果を表６、検体ｃについての結果を表７にそれぞれ示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
【表７】
【００７８】
表２ないし４の実験区Ａから明らかなように、実施例２で得られた粗活性画分及び精製標品からなる本発明の光阻害免疫能力回復剤は、陰性コントロールと比べて、３Ｈ−チミジンの取り込み量がそれぞれ６００倍以上及び３７００倍以上と著しく多いので、優れたマイトジェン活性を示すことが分かる。
また、表２ないし４の陰性コントロールの平均値から明らかなように、紫外線を照射すると、３Ｈ−チミジンの取り込み量、すなわち免疫力が低下することが分かるが、実験区Ｂ及びＣの結果から明らかなように、本発明の光阻害免疫能力回復剤を添加することにより、紫外線を照射しても３Ｈ−チミジンの取り込みが促進されることが分かる。
以上の結果から、光阻害免疫機能回復成分の粗活性画分・精製標品を紫外線照射処理によりＤＮＡ合成能力（３Ｈ−チミジンの取り込みなど）など免疫力が低下したヒトリンパ球に対して添加することにより、当該リンパ球のＤＮＡ合成能力など免疫力を増強させることができる。また、紫外線照射時間が３０分以内であれば、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に光阻害免疫機能回復成分を添加した場合と同等のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができる。紫外線を１６時間照射しても、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合の５０％以上のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができるし、紫外線を照射しなかった陰性コントロールと比較すると、３Ｈ−チミジンの取り込み量がはるかに多いことが分かる。
【実施例３】
【００７９】
（ハ）水溶性画分の抽出工程
オゴノリ属紅藻類として、ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿重量５００ｇを使う代わりにツルシラモ（勝浦川河口産）由来の非成熟性単類培養株湿質量５００ｇを原料に用いた以外は、実施例２と同様にして、光阻害免疫能力回復剤の製造を行った。オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類である、ツルシラモを徳島県徳島市勝浦側河口の勝浦川の中より採取した。本発明では、このツルシラモをツルシラモ勝浦川河口産という。
【００８０】
ツルシラモ（勝浦川河口産）から得られた粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分、精製標品、および陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）について、用いるリンパ球が、実施例２とは異なる別の３人の検体（以下、検体ｄ、ｅ及びｆという）からのリンパ球である以外は実施例２と同様にして光阻害免疫能力回復剤の活性測定を行った。
ある実験条件での実験数を３回とし、平均は３回の測定の平均値を示す。その検体ｄについての結果を表８、検体ｅについての結果を表９、検体ｆについての結果を表１０にそれぞれ示す。粗活性画分、透析同時等電点処理した粗活性画分、透析同時等電点処理後に熱処理した粗活性画分、透析同時等電点沈殿処理せずに熱処理した粗活性画分の比活性については、その検体ｄについての結果を表１１、検体ｅについての結果を表１２、検体ｆについての結果を表１３にそれぞれ示す。
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
【表１３】
【００８７】
比較例１
実施例１−（ロ）の粗活性画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エタノールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２７巻、第２０６３〜２０６７ページ（１９８８年）参照］を行った以外は、実施例１と同様にして粗活性画分を得た。この粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４単位、比活性は５３．４単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は５．０％であった。これらの結果を表１４に示す。比較のために実施例１の結果も併記した。
【００８８】
比較例２
常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って、紅藻類由来の赤血球凝集素を得た。得られた粗活性画分の赤血球凝集活性は１６単位、比活性は１４９．５単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は１９．５％であった。これらの結果を表１４に示す。また、精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は３２．６μｇ／ｍｌであり、実施例１の約１／４０の比活性に相当した。
【００８９】
【表１４】
【００９０】
比較例３
紅藻類から常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って精製した分子量５０，０００の凝集素について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに１０２４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は見られなかった。これらの結果を表１５に示す。比較のために実施例１の結果も併記した。
【００９１】
比較例４
Ｃｏｎ Ａ［和光純薬（株）製］２５ｍｇをリン酸緩衝液１００ｍｌに溶解し、ウサギ赤血球凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに６４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は見られなかった。これらの結果を表１５に示す。
【００９２】
【表１５】
【００９３】
Ｃｏｎ Ａを１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は検出されず、熱処理により凝集活性の消失が認められた。
【００９４】
表１４から明らかなように、実施例１で得られた粗活性画分からなる本発明の光阻害免疫能力回復剤は、比較例１及び２のものに比べて、凝集活性、比活性、活性回収率がいずれも高く、活性回収率は比較例１の約１２倍、比較例２の約３倍、比活性は比較例１の約６３倍、比較例２の約２３倍である。また、表１５から実施例１の精製凝集素は比較例３及び４のものと異なり、ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により制御されることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の光阻害免疫能力回復剤は、臨床分野、医療分野、生化学工業分野における治療用、検査用材料など、及び化粧品分野の添加剤として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤。
【請求項２】
オゴノリ属紅藻類がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項３】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項４】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類由来の非成熟性単藻培養株である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項５】
液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項６】
液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項７】
液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし６のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項８】
液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし７のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項９】
液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１０】
液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし９のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１１】
液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下である請求項１ないし１０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１２】
液状抽出物が１〜６０質量％の硫酸を含む請求項１ないし１１のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１３】
液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし１２のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１４】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とすることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１５】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１６】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿分離して細胞性免疫能力賦活活性を示す溶液を得ることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１７】
透析液が二酸化炭素でｐＨ調整された蒸留水又は緩衝液である請求項１５又は１６記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１８】
透析膜が再生セルロースチューブである請求項１５ないし１７のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１９】
透析膜と接触させるに先立って、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を、１００℃において、１〜１０分間熱して、あらかじめその中の夾雑タンパク質を除去しておく請求項１５ないし１８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２０】
請求項１５ないし１９のいずれかに記載の方法により得られた光阻害免疫能力回復剤をさらにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、分子量１０万以上の画分を捕集することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２１】
塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１４ないし２０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２２】
塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１４ないし２０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤。
【請求項２】
オゴノリ属紅藻類がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項３】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項４】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類由来の非成熟性単藻培養株あるいは非成熟性単藻培養株が増殖した藻体である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項５】
液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項６】
液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項７】
液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし６のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項８】
液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし７のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項９】
液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１０】
液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし９のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１１】
液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下である請求項１ないし１０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１２】
液状抽出物が１〜６０質量％の硫酸を含む請求項１ないし１１のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１３】
液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１０万以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし１２のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１４】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞性免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とすることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１５】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞性免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とした後で、１００℃、１０分間の熱処理を行うことにより夾雑物を沈殿させた活性画分を得ることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１６】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１７】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿分離して細胞性免疫能力賦活活性を示す溶液を得ることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１８】
透析液が二酸化炭素でｐＨ調整された蒸留水又は緩衝液である請求項１６又は１７記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１９】
透析膜が再生セルロースチューブである請求項１６ないし１８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２０】
透析膜と接触させるに先立って、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を、１００℃において、１〜１０分間熱して、あらかじめその中の夾雑タンパク質を除去しておく請求項１６ないし１９のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２１】
請求項１６ないし２０のいずれかに記載の方法により得られた光阻害免疫能力回復剤をさらにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、分子量１０万以上の画分を捕集することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２２】
塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１４ないし２１のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２３】
塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１４ないし２２のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤。
【請求項２】
オゴノリ属紅藻類がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項３】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項４】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類由来の非成熟性単藻培養株である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項５】
液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項６】
液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項７】
液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし６のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項８】
液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし７のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項９】
液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１０】
液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし９のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１１】
液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下である請求項１ないし１０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１２】
液状抽出物が１〜６０質量％の硫酸を含む請求項１ないし１１のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１３】
液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし１２のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１４】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とすることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１５】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１６】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿分離して細胞性免疫能力賦活活性を示す溶液を得ることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１７】
透析液が二酸化炭素でｐＨ調整された蒸留水又は緩衝液である請求項１５又は１６記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１８】
透析膜が再生セルロースチューブである請求項１５ないし１７のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１９】
透析膜と接触させるに先立って、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を、１００℃において、１〜１０分間熱して、あらかじめその中の夾雑タンパク質を除去しておく請求項１５ないし１８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２０】
請求項１５ないし１９のいずれかに記載の方法により得られた光阻害免疫能力回復剤をさらにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、分子量１０万以上の画分を捕集することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２１】
塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１４ないし２０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２２】
塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１４ないし２０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした光阻害免疫能力回復剤。
【請求項２】
オゴノリ属紅藻類がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項３】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項４】
オゴノリ属紅藻類が天然で成熟体として雌雄配偶体が検出されず、四分胞子体のみの成熟体が検出される特徴をもち、淡水混入天然海水域で繁殖するオゴノリ属紅藻類由来の非成熟性単藻培養株あるいは非成熟性単藻培養株が増殖した藻体である請求項１又は２記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項５】
液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項６】
液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項７】
液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし６のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項８】
液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし７のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項９】
液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１０】
液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし９のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１１】
液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下である請求項１ないし１０のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１２】
液状抽出物が１〜６０質量％の硫酸を含む請求項１ないし１１のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１３】
液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１０万以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし１２のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤。
【請求項１４】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞性免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とすることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１５】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として細胞性免疫能力賦活活性を示す粗活性画分を回収し、場合により回収した沈殿を溶媒に溶解して溶液とした後で、１００℃、１０分間の熱処理を行うことにより夾雑物を沈殿させた活性画分を得ることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１６】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１７】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、生成した沈殿を分離したのち、緩衝液に溶解して細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を調製し、次いでこの溶液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿分離して細胞性免疫能力賦活活性を示す溶液を得ることを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１８】
透析液が二酸化炭素でｐＨ調整された蒸留水又は緩衝液である請求項１６又は１７記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項１９】
透析膜が再生セルロースチューブである請求項１６ないし１８のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２０】
透析膜と接触させるに先立って、細胞性免疫能力賦活活性を示す物質と不純分を含む溶液を、１００℃において、１〜１０分間熱して、あらかじめその中の夾雑タンパク質を除去しておく請求項１６ないし１９のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２１】
請求項１６ないし２０のいずれかに記載の方法により得られた光阻害免疫能力回復剤をさらにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、分子量１０万以上の画分を捕集することを特徴とする光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２２】
塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１４ないし２１のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【請求項２３】
塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１４ないし２２のいずれかに記載の光阻害免疫能力回復剤の製造方法。
【公開番号】特開２００６−１０４１８０（Ｐ２００６−１０４１８０Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１８５６６（Ｐ２００４−３１８５６６）
【出願日】平成１６年１０月４日（２００４．１０．４）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月４日（２００４．１０．４）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]