免疫グロブリン療法によるＮＫ細胞調節に対する応答者及び非応答者の評価のためのアッセイ及び方法
免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答における免疫グロブリンによるＮＫ細胞調節ための患者の感受性を決定する方法であって、該免疫グロブリンによって生じるナチュラルキラー細胞の調節を決定する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の治療、又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、先天性免疫系及び生体防御系の一部である。ＮＫ細胞の考えられる重要な機能は、ウイルスのような侵入者及び腫瘍細胞の攻撃にある。そのメカニズムは、特に、細胞内移行（cell internalisation）及びタンパク質分解後に前記侵入者の特定部分の提示に通常関与する、低いレベル又は皆無のレベルの主要組織適合性遺伝子複合体ＭＨＣクラスＩを有するそれらの細胞の認識に基づくものであると推測されている。このような特徴により、ＮＫ細胞は、それらの攻撃を目的とするために、感染細胞を非感染細胞から識別するかもしれない。 特定のウイルスは、特定の宿主防御を回避し、ＭＨＣクラスＩ分子の輸送を阻むことさえするが、ＮＫ細胞の攻撃のターゲットになる。
【０００３】
ヒト細胞によって発現される特定のＨＬＡ対立遺伝子は自己を示し、上記の認識の特徴との組合せにおいて、「自己」の体細胞は、自己攻撃からの追加の安全機構を提供し、保護される。
【０００４】
殺傷の極めて効果的なメカニズムは、直接のＮＫターゲット細胞の接触を介して媒介される。ＮＫ細胞は、外来細胞に対して分子を放出する。これらの分子は、ＮＫ細胞の粒子から放出され、それゆえに、この効果は、貯蔵されたエフェクタ分子を遊離する脱顆粒と呼ばれており、ＮＫ細胞は、標的の細胞膜にチャンネル、又は標的の重度の損害、その「死」にさえ導く被覆を形成する、いわゆる「パーフォリン」を用いる。他の分子が、この攻撃に関与し、タンパク質分解のような他のメカニズムによって破壊効果を支持し、ここでは、ＮＫ細胞脱顆粒によってまた放出されるグランザイムＢが関与する。サイトカインを含む、それらのシグナル化合物の放出は、他の細胞を攻撃及び活性化し、侵入者に対する複合的な攻撃、及び最終的には下方制御された防衛反応の結果となる。
【０００５】
腫瘍細胞がＮＫ細胞によって攻撃及び破壊される場合、この殺傷力は、独特の癌治療のアプローチのために利用することができる。したがって、特別の化合物及び医療介入（interventions）が、ＮＫ細胞活性を支持し、かつＮＫ細胞をより特異的に腫瘍細胞に対抗するように導くために、探索されている。
【０００６】
ＮＫ細胞は、宿主防御の重要な一部である。しかし、例えば、異なる疾患の理由又は過程において、これらの細胞の調節異常が生じると、それらは、末梢及び脳において臓器構造及び希突起膠細胞の攻撃のような、重大な病態生理学的結果を伴い、「自己構造（self-structures）」に対抗するように自己を導くことができる。このような欠陥及び自己攻撃をもたらすメカニズムは十分に理解されていないが、これらの細胞の制御を取り戻すこと、及びそれらの殺傷力を生理学的に妥当なレベルまで減少させることが必要とされる。殺傷効率は、脱顆粒及びエフェクター分子の放出に密接に関係しているので、このような脱顆粒を制御して、損傷を減少させることが目的である。したがって、ＮＫ細胞の作用を調節することができ、該作用及び続く損傷を減少／防止する、化合物を同定すること及び使用することが目的である。
【０００７】
免疫グロブリンは、多くの異なる化合物、構造及び細胞構造の部分としての構造をも含む標的を認識し、それらの生物学的効果を認識し、かつしばしば中和する、免疫系の先天的な一部である。免疫複合体は、「異質の」分子の除去に迅速に導かれて、消去される。よって、免疫グロブリンレベルを欠いた（或いは、減少した）患者が、重大な再発性の感染を受ける傾向がある事実によって実証されている通り、認識、結合及び除去の機能は、疑いなく重要な意味を持つ。侵入者に対するこの防御機能以上に、免疫グロブリンは、免疫系を平衡化し、かつ調節するに当たり、重要な調節機能を担っている。通常、プールされた献血又は血漿に由来し、専門家によく知られた方法により調整された免疫グロブリンが、ＩＭＩＤ（免疫関与炎症性疾患；immune mediated inflammatory disease）及びいわゆるＡＩＤ（自己免疫疾患；autoimmune diseases）の治療のために用いられているが、それらの定義は、疾患の同一の、又はオーバーラップした特徴を表現するものかもしれない。免疫グロブリン濃縮物は、通常、静脈（ＩＶＩＧ）又は皮下（ＳＣＩＧ）に投与されるが、筋肉内投与、吸入投与、点眼、経口投与、又は局所投与であってもよい。
【０００８】
自己免疫疾患における静脈投与の免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の有効性は１９５０年代に最初に報告されており、その時は、特発性血小板減少性紫斑病を患っていた患者を治療するために用いられた。そのうちに、多くの臨床研究が、自己免疫疾患においてＩＶＩＧの有益な効果を証明した。特に、ＩＶＩＧ治療は、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、川崎症候群、慢性炎症性デミエリニシング多発性神経炎、重症筋無力症、及びコルチコステロイド抵抗性皮膚筋炎（corticosteroid-resistant dermatomyositis）において実績がある（エフレムら、2005；カザチキン及びカベリ、2001；ボロスら、2005（Ephrem et al., 2005; Kazatchkine and Kaveri, 2001; Boros et al., 2005)）。その上、多発性硬化症（ＭＳ）における疾患進行再発率及びＭＲＩ増強病斑へのＩＶＩＧの好ましい効果が、臨床研究により証明された（ソレンセン・ピーエス、2003；ソレンセンら、2002(Sorensen PS, 2003; Sorensen et al., 2002)）。
【０００９】
ＩＶＩＧの作用の完全なメカニズムは未だ不明確であるが、Ｆｃ受容体の発現及び機能の調節、補体活性化の阻害、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化、分化因子、並びにエフェクター機能の調節を引き起こすようである（エフレムら、2005；カザチキン及びカベリ、2001；ボロスら、2005(Ephrem et al., 2005; Kazatchkine and Kaveri, 2001; Boros et al., 2005)）。
【００１０】
ＩＶＩＧの予防及び治療は、多くの患者においてうまく使用されている一方、それらの中には、ＩＶＩＧの適用に不完全に又は全く応答しないケースもある。現在のところ、そのような非応答性を説明したり、又は免疫グロブリンの適用が患者において期待される効果的な働きに至るかどうかの予測を容易にする信頼性のある検査システムは存在しない。最近の研究で、例えば、反復自然流産において、ＮＫ細胞の数及び活性が流産又は正常な妊娠を予測するかもしれないこと、すなわち高い数／活性は不良な予後を生じることが示された。さらに、イン・ビトロで試験された免疫グロブリンとの相関関係が発見され、ＮＫ細胞の殺活性を明らかにした。しかし、ＮＫ細胞活性が、直接的又は間接的な態様で、免疫グロブリンによってどのように影響を受けるかについてのメカニズムは不明のままであり、したがって、進められる試験は、Ｃｒ５１標識細胞株及び対応するＣｒ５１の放出の存在下におけるＮＫ殺活性に注目するものであり、このパラメータによって評価を簡単にするものであった。さらに、上記の兆候が、例えば、ＩＭＩＤ（免疫介在性炎症疾患；immune mediated inflammatory disease）の兆候の代表となるかどうかは、推論的なものである。
【００１１】
臨床及び実験免疫学、２０００、１２１、５０６−５１４におけるアスファルターら（Asphalter et al in Clin Exp Immunol 2000, 121, 506-514）は、ＮＫサブセットへのイン・ビボＩＶＩＧ補充療法及び高用量のＩＶＩＧ（２ｇ／ｋｇ体重）の作用を開示している。ＩＶＩＧ療法（２００−４００ｍｇ／ｋｇ毎３週）の前後においてＮＫ細胞における細胞内ＩＦＮ−ガンマ（IFN-gamma）を測定した、細胞内ＮＫ・ＩＦＮ−ガンマ・アッセイも開示されている。両アッセイのうちの少なくとも一つの測定が治療後に行われたが、応答者及び非応答者を区別する可能性は提供しない。
【００１２】
ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・イミュノロジー、３１（１９９６）、１２５−１４１におけるルイズら（Ruiz. et al. in Journal of Reproductive Immunology, 31 (1996), 125-141）は、それが標的として末梢血リンパ球を用いたＮＫ細胞障害性アッセイに加えられた場合の、イン・ビトロにおいてＮＫ活性を阻害するＩＶＩＧの免疫学的メカニズムに関係する。減少した５１ＣＲ放出は、ＮＫ細胞障害性における減少を示した。Ｃｒは細胞表面に非特異的に結合するので、測定された放射能が脱顆粒に起因するものかは疑わしい。
【００１３】
ブラッド、１１０巻、Ｎｏ．９、9．11月、2007におけるサ−イン・サニャラクら（Tha - In Thanyalak et al. in Blood, Vol 110, No 9, 9. Nov. 2007）は、ＩＶＩＧの存在下において１８時間の間に成熟する樹枝状細胞（ＤＣ’ｓ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞へのそれらの影響に関連する。ＮＫ細胞表現型へのこれらの細胞の作用は、５日後に、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩＩＩの発現の決定により調べられた。ＩＮＦ−ガンマ産生及びＮＫ細胞の脱顆粒も、共培養ＩＶＩＧ−ＤＣ’ｓを用いて、４８時間後に決定され、高含量のインターフェロン−ガンマを示した。最も興味深い点は、ＤＣ’ｓ無しでＩＶＩＧを用いて処理したＮＫ細胞のコントロール・サンプルが周縁部の活性化のみを示したことが観察されたことである。このように、サ−インは、ＩＶＩＧ−ＤＣ’ｓのみが、適切に、ＮＫ細胞の脱顆粒を活性化すると結論付けた。本願（ＩＶＩＧ−ＤＣ’ｓは本発明によって使用されていない）と比較して、異なる細胞を用いて行われた長期に渡るアッセイ（４８時間及び５日）に加えて、疾患の治療に対する応答において免疫グロブリンに対するヒトの感受性の決定のために該発見を使用することについて、何ら指示は見受けられない。加えて、唯一の比較できるアッセイ（ＩＶＩＧを用いて処理したＮＫ細胞）は、本願と比較して矛盾する結果を示し、あいにく、何ら特定の状況は発表されず、実質的な比較は不可能であった（第３２５７頁、左欄、第３−７行）。
【００１４】
アーリー・プリグナンシー、ＩＶ巻、第154〜164頁におけるカワク・ジョアンら（Kwak Joanne Y.H. et al. in EARLY PREGNANCY, Vol IV, pp 154-164）は、追加の他の治療を未だ受けている、上昇したＮＫ細胞レベルを伴った反復流産を有する者においてＩＶＩＧ治療の臨床効果を調査した。ＮＫ細胞障害性及びＣＤ１６＋の発現は、ＩＶＩＧ注入治療の７日後に顕著に抑制されることが判った。疾患の治療に対する応答において免疫グロブリンに対するヒトの感受性の決定のために該発見を使用することについて、何ら指示は見受けられない。
【００１５】
ＥＰ−Ａ−１８０１２３４は、被験者が疾患にかかり易いか、あるいは自己免疫疾患を発病し易いかどうかを、組換え核酸コンストラクトを用いることによって予測するための診断方法に関連する。このようなコンストラクトは、本願によって使用されない。
【００１６】
イミュニティ、第２６巻、Ｎｏ．１、１月、２００７、第67〜78頁におけるパーク−ミン・キャング−ヒュンら（Park-Min Kyung-Hyun et al. in IMMUNITY, vol.26, no. 1, January 2007, pp 67-78）は、インターフェロン−ガンマに対する細胞応答へのＩＶＩＧの影響に関係するいくつかの調査を記載している。これらの調査は、ウィステリア・モノサイトジェネス（Wisteria monocytogenes）の観察及びマクロファージに主に基づくものであり、ＮＫ細胞は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１８０１２３４号（ＥＰ−Ａ−１８０１２３４）
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】臨床及び実験免疫学、２０００、１２１、５０６−５１４におけるアスファルターら（Asphalter et al in Clin Exp Immunol 2000, 121, 506-514）
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・イミュノロジー、３１（１９９６）、１２５−１４１におけるルイズら（Ruiz. et al. in Journal of Reproductive Immunology, 31 (1996), 125-141）
【非特許文献３】ブラッド、１１０巻、Ｎｏ．９、9．11月、2007におけるサ−イン・サニャラクら（Tha - In Thanyalak et al. in Blood, Vol 110, No 9, 9. Nov. 2007）
【非特許文献４】アーリー・プリグナンシー、ＩＶ巻、第154〜164頁におけるカワク・ジョアンら（Kwak Joanne Y.H. et al. in EARLY PREGNANCY, Vol IV, pp 154-164）
【非特許文献５】イミュニティ、第２６巻、Ｎｏ．１、１月、２００７、第67〜78頁におけるパーク−ミン・キャング−ヒュンら（Park-Min Kyung-Hyun et al. in IMMUNITY, vol.26, no. 1, January 2007, pp 67-78）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の技術的課題は、免疫グロブリンの投与に対する応答者と非応答者とを識別するための方法を提供することである。
【００２０】
驚くべきことに、ＩＶＩＧ産物の形態にさらされた、免疫グロブリンの存在下におけるＮＫ細胞は、イン・ビトロ全血検査システムにおいて調節されることを発見した。特に、ＩＦＮ−ガンマ放出及びＮＫ細胞脱顆粒が誘導され、一方、殺活性は減少する。その上、ＮＫ細胞の細胞表面上のＣＤ１６（ＦＣγＲＩＩＩ）も調節される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の根底にある技術的課題は、免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定する方法であって、該免疫グロブリンによって生じる、ＮＫ細胞の調節、及びナチュラルキラー細胞の脱顆粒の量を決定する、方法によって解決される。
【００２２】
脱顆粒という用語は、当業者に良く知られており、細胞膜との融合による分泌顆粒内容物の放出という意味を有する。
【００２３】
たいてい、細胞間接触によりＮＫ細胞の脱顆粒を誘導するために、ＮＫ細胞標的（標識Ｋ５６２のような）細胞の存在が必要であり、それによって、ＮＫ細胞粒子からの兵器（上記参照）の放出によって、標的細胞の殺傷に影響を及ぼす。（Ｋ５６２を用いて測定したように）全血の免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）への暴露が、標的細胞との細胞間接触と同等、或いはより効果的に、比較できる程の感受性のあるＮＫ細胞のサブセットの脱顆粒を誘導することが発見された。これは、粒子化合物の細胞外間隙への放出を導く。細胞外間隙は、アッセイセットアップにおいて、培地又は溶液によって刺激され得る。特に、ナチュラルキラー細胞の脱顆粒の量は、当業者によって確立することができるイン・ビトロの方法において決定される。
【００２４】
例えば、全血を、約３時間のように特定の時間、ＩＶＩＧインキュベーション又はプラセボコントロールによって刺激した。そして、抗ヒトＣＤ１０７ａ又はアイソタイプコントロールが加えられ、試料を、例えば、約３時間、約３７℃で、２×１０５のＫ５６２標的細胞と共に、インキュベートした。自発的及びＩＶＩＧ誘導脱顆粒を検出するために、コントロール試料は、標的細胞無しにインキュベートした。その後、試料を、抗ＣＤ５６及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて染色し、続いて、検出工程、特に、フローサイトメトリー分析を行った。
【００２５】
ＮＫ細胞の陽性脱顆粒を有する患者は、免疫グロブリンを用いた治療によるＮＫ細胞調節に感受性があるものとして決定される。
【００２６】
本発明の一の実施形態によれば、免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において、患者が示す免疫グロブリンに対する感受性の決定は、転写産物のレベル、タンパク質のレベル、又は転写産物のレベル及びタンパク質のレベルを検出することによって行われる。
【００２７】
本発明の別の実施形態によれば、転写産物のレベル、タンパク質のレベル、又は転写産物のレベル及びタンパク質のレベルは、定量的に決定される。例えば、転写産物のレベルが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸検出方法によって決定され、及び／又は、タンパク質のレベルが、放出されたナチュラルキラー細胞タンパク質、及び／又はナチュラルキラー細胞の表面に発現したタンパク質を用いて決定される。
【００２８】
本発明のさらなる別の実施形態では、全血又は血球を、免疫グロブリンの存在下又は非存在下において、かつ刺激剤の存在下においてインキュベートし、続いて、免疫グロブリンの投与に対する固体の応答性を評価するために、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＰ−１０、ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、グランザイムＢ、パーフォリン、又はそれらの組合せからなる、ＮＫ細胞調節を示す群から選択されるイベント因子の測定を行う。「組合せ」と言う用語は、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０、ＩＦＮ−ガンマ及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、ＩＦＮ−ガンマ及びグランザイムＢ、ＩＦＮ−ガンマ及びパーフォリン；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、ＩＰ１０及びグランザイムＢ、ＩＰ−１０及びパーフォリン；ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ、ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びパーフォリン；グランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体；ＩＦＮ−ガンマ、ＩＰ−１０、グランザイムＢ；ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０及びパーフォリン；ＩＦＮ−ガンマ及びグランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びパーフォリン；ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＮＦ−ガンマ及びＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ及びパーフォリンとして、当業者に十分に理解される。
【００２９】
測定されるイベント因子は、例えば、転写の量、及び／又はタンパク質の発現レベル、特に、イベント因子の定量的測定である。
【００３０】
本発明の一の実施形態では、刺激剤は、リポ多糖体（ＬＰＳ）、フォルボル−１２−ミリステート−１３アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、細胞表面タンパク質に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）又はそれらの組合せから選択される。「組合せ」という用語は、当業者に十分に明確であるが、組合せのリストは以下の通り例示される：ＬＰＳ及びＰＭＡ、ＬＰＳ及びイオノマイシン；ＬＰＳ及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＰＭＡ及びイオノマイシン；ＰＭＡ及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；イオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＬＰＳ及びＰＭＡ及びイオノマイシン；ＬＰＳ及びイオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＰＭＡ及びイオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＬＰＳ及びＰＭＡ及びイオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ。
【００３１】
通常は、アッセイにおいて使用される免疫グロブリンの量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｍＬ、特に、約１〜約５０ｍｇ／ｍＬで変化しても良い。
【００３２】
約１〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲は、この用語によって、少なくとも1及び５０の限定の間の各整数が包含されることを容易に理解する当業者に良く知られるものであり、特に、当業者は、１〜５０の範囲において、1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50；又は2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50の数値の組合せだけでなく、例えば、1，2，3又は2，3，5，6、及び該範囲に入る数値を単に並び替えることによって可能なその他の組合せも読み取る。
【００３３】
本発明の方法により得られる結果は、炎症媒介免疫疾患（inflammatory mediated immune disease）、自己免疫疾患及びアレルギーからなる群から選択される疾患の治療に関係する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＩＶＩＧによる全血（ＷＢ）刺激後のＮＫ細胞の脱顆粒（ｎ＝８）を示す図である。
【図２】約３時間及び約２４時間後の全血試料の上清におけるグランザイムＢを定量した結果を示す図である。
【図３】ＨＤ（ｎ＝１９）（Ａ）及びＭＳ患者（ｎ＝１６）（Ｂ）におけるＩＶＩＧ（転写産物μＬ）によって誘導されたＩＦＮ−ガンマの遺伝子発現を調べた結果を示す図である。
【図４】２４時間後にＩＶＩＧによって誘導されたタンパク質放出（ＩＦＮ−ガンマ）を調べた結果を示す図である。
【図５】ＩＶＩＧ存在下及び免疫グロブリンを含有しないコントロールにおけるＩＰ−１０タンパク質レベルを示す図である。
【図６−１】ＩＶＩｇによるＣＤ１６の下方調節及びＣＤ５６dim（薄暗い）ＮＫ細胞の脱顆粒、（Ａ）ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上のＣＤ１６表面発現（％におけるＭＦＩ、コントロール＝１００％）、ｎ＝１２、（Ｂ、Ｃ）ＩＶＩｇ（Ｃ）又はコントロール（Ｂ）を用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ外在化。ＣＤ１０７ａを発現している総ＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)細胞のパーセントが示されている。
【図６−２】ＩＶＩｇによるＣＤ１６の下方調節及びＣＤ５６dim（薄暗い）ＮＫ細胞の脱顆粒、（Ａ）ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上のＣＤ１６表面発現（％におけるＭＦＩ、コントロール＝１００％）、ｎ＝１２、（Ｂ、Ｃ）ＩＶＩｇ（Ｃ）又はコントロール（Ｂ）を用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ外在化。ＣＤ１０７ａを発現している総ＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)細胞のパーセントが示されている。
【図７】ＩＶＩｇは、パーフォリンとして決定された全血におけるＮＫ細胞の脱顆粒を誘導する、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた全血の２４時間のインキュベーション後の上清へのパーフォリン（Ａ）放出（ｐｇ／ｍＬ）（ｎ＝１２、ｐ＜０．００５）。
【図８】ＩＶＩｇは、全血におけるＮＫ細胞の殺作用を減少させる。健常な固体からの全血試料を、約３７℃で、約３時間、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いて処理した。次に、ＮＫ細胞作用を、ＮＫ細胞感受性標的細胞Ｋ５６２に対する４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。１００μＬの全血を用いてＫ５６２細胞の溶解が示されている（ｎ＝１０、ｐ＜０．００５）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
脱顆粒反応それ自身は、
a.)細胞の再構成反応を利用すること（表面分子の検出のような）
及び／又は
b.)化合物を含む粒子の放出
によって、感度良く検出することができる。
【００３６】
a.)の例としては、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）表面発現が、ＮＫ細胞脱顆粒のマーカーとして知られている。フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ、蛍光標識細胞分取）のための標識抗体、断片又は親和性リガンドの特定の検出のような、専門家に知られた方法により測定された、モニターされるシグナル（例えば、蛍光）の増加は、実施例１により詳細に記載されるように、ＩｇＧの暴露に関し脱顆粒の有効性を示す。ＩｇＧ暴露により誘導された脱顆粒の有効性及び状況を検出及び定量するために、脱顆粒に関連する細胞マーカーのその他の変化を利用することができる。このようなＮＫ細胞粒子（溶解性リソソーム）化合物の典型は、タンパク質パーフォリン及びグランザイム（後者はプロテアーゼ、より詳細にはグランザイムＢ）であり、これらは、例えば、ＥＬＩＳＡのような抗原検出システム又は（酵素及びプロテアーゼのための）直接酵素試験によって定量することができる。
【００３７】
記載した反応は、ＩＶＩＧ媒介イン・ビボ効果を予測するために利用することができるが、それは、イン・ビボ（生理学的）調節及びＩＶＩＧ適用によって媒介される効果に関係する重要な反応を構成する。投与された免疫グロブリンによって直接誘導された、コントロール不良のＮＫ細胞の「極度の疲労(exhaustion)」（ＮＫ細胞の兵器の放出）は、特定の期間、ＮＫ細胞の殺傷力を減少することができ、その結果、無調節な病原性の状態において、「自己」構造に対する細胞破壊力を減少させる。結果として、ＮＫ細胞の寄与に関係し、又はＮＫ細胞の寄与によって開始される、病態生理学的なイベントが、ＩＶＩＧ、ＳＣＩＧ及び専門家に知られる他の形態の適用による免疫グロブリン予防及び治療のために示される。
【００３８】
免疫グロブリン予防及び治療の応答者／非応答者の同定は、他のパラメータ、それらの組合せ及び脱顆粒アッセイとの組合せによって達成することができる。この目的のために、全血アッセイだけでなく、分離した細胞についても、イン・ビボにおける免疫グロブリンの有効性を予測するために利用することができる。
【００３９】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）は、それらのパラメータに属する。そのｍＲＮＡ（転写産物）は、全血又は、例えば、ＮＫ細胞のイン・ビトロ適用において誘導され、また、該細胞によって産生されるタンパク質レベルの増加によって示され、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０、他の機能の中でもＴ細胞及びＮＫ細胞のための化学誘引物質）は、通常、ＩＦＮ−ガンマの制御下にあり、すなわち、増加した場合に後者によって刺激される。全血アッセイシステムにおいて（バクテリア由来の）リポ多糖体を用い、それにより、病態生理学的状態を模倣すると、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０の両方が、ｍＲＮＡ転写産物（数）及びタンパク質（放出）レベルで、上方制御される。（ＬＰＳを用いた刺激の上に）添加された免疫グロブリンの存在下において、免疫グロブリン無しのコントロールに比較して、ＩＰ−１０の増加は、免疫グロブリンによって減少することが発見されたが、一方で、ＩＦＮ−ガンマについては、相対的な減少は観察されなかった。この効果は、予想外であり、免疫グロブリンによる免疫調節性状の一部として理解され、このようにして、抗炎症反応として理解できる、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０応答の部分的脱共役に繋がる。これに対応して、この効果は、ＩＶＩＧ適用に対する応答性が有望であるかどうかを評価するために、生体外（ex vivo）検査システム（潜在的なＩＶＩＧ受容者からの全血）において利用することができる。
【００４０】
さらに、免疫グロブリンは、ＦＣ−ガンマ−Ｒ型ＩＩＩ（FC-gamma-R type III）の下方調節を誘導し、そのサブセットは、炎症反応に関係することが報告されているので、このパラメータはＦＣ−ガンマ−受容体調節に関するアッセイと組合せて使用することができる。よって、転写産物及びタンパク質の細胞表面発現の減少は、抗炎症側への生理を導くだろう。
【００４１】
さらに、これらのパラメータは、異なる遺伝的背景の患者を示す、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、インターロイキン−７受容体（ＩＬ７−Ｒ）及びＣＤ５８等の一塩基多型（ＳＮＰ）に関するアッセイと組合せることができる。
【００４２】
本発明及び各アッセイを、以下の実施例により、より詳細に説明する。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
＜ＮＫ細胞脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７a）＞
方法
１００μＬのヒト血液を１００μＬアッセイ培地（１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン含有ＩＭＤＭ）で希釈し、３７℃で３時間、少なくとも一度ＩＶＩＧと共に、また、コントロールとして、少なくとも一度ＩＶＩＧ無しで、インキュベートした。そして、ＰＥ−Ｃｙ５結合抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ又はアイソタイプコントロールを加え、試料を、２〜３時間、３７℃で、２×１０５のＫ５６２標的細胞と共にインキュベートした。自発的及びＩＶＩＧ誘導脱顆粒を検出するために、コントロール試料は、標的細胞無しにインキュベートした。その後、試料を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６ｍＡｂ及びＰＥ結合抗ＣＤ３ｍＡｂを用いて染色し、その後、フローサイトメトリーによる分析を行った。免疫グロブリン（５％又は１０％ＩＶＩＧ、オクタガム、オクトファーマ・ピーピージーエムビーエイチ、ビエンナ、オーストリア（Octagam, Octpharma ppGmbH, Vienna, Austria））を、１０ｍｇ／ｍＬで全血に添加した。マルトース溶液を、マルトースを含有するＩＶＩＧのコントロールとして使用した。
【００４４】
結果
ＮＫ細胞の脱顆粒の誘導は、ＣＤ１０７ａ陽性細胞の増加する数によって証明することができた。８人の健常被験者の結果が図１に示されている。全ての健常被験者において、ＮＫ細胞の脱顆粒が誘導され、コントロール（マルトース）よりも、より顕著に効果的であることが判明した。Ｋ５６２細胞を、ＮＫ殺傷作用の評価のために使用した（コントロール：Ｋ５６２細胞＋マルトース）。とりわけ、より強い効果が、標準Ｋ５６２細胞よりも、ＩＶＩＧによってもたらされた。わずかに増強された脱顆粒の傾向が、ＩＶＩＧ及びＫ５６２細胞を組合せて用いた場合に観察された。
【００４５】
ＮＫ細胞上のＦＣ−ガンマ−ＩＩＩ−受容体（ＣＤ１６）発現
ＮＫ細胞上のＦＣ−ガンマ−ＩＩＩ−受容体（ＣＤ１６）を測定するために、１００μＬのＩＶＩｇ又はコントロールで処理した全血試料（実施例１に記載の通り調整）を、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ１６、ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＣＤ５６、及びパシフィックブルー結合抗ＣＤ３を用いて染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。
【００４６】
ＩＶＩｇ治療は、ＣＤ１６の表面発現を顕著に減少させた（ｐ＜０，００５、ｎ＝１２、図６Ａ）。これらのデータは、ＩＶＩｇ媒介ＣＤ１６の下降調節と一致しており、ＩＶＩｇによるＣＤ１６の直接的な関与を示唆している。ＣＤ１６は、ＣＤ５６bright(明るい)の一方と比較して、より細胞障害性のあるＮＫ細胞のＣＤ５６dim（薄暗い）集団上に発現している。このことは、ＩＶＩｇによるＣＤ１６の直接的な関与は、観察されるＮＫ細胞の自発的な脱顆粒の原因であることを示唆している。この仮説に一致する通り、我々は、ＩＶＩｇは、ＣＤ５６dim（薄暗い）／ＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞集団における、ＣＤ１０７ａの外在化を特異的に誘導することを発見した（図６Ｂ／Ｃ）。
【００４７】
（実施例２）
ＩＶＩＧ誘導脱顆粒によるグランザイムＢ、ＩＦＮ−ガンマ及びパーフォリンの放出
約３時間及び／又は約２４時間後の全血試料の上清におけるグランザイムＢを定量する実験の設定を選択した（ＥＬＩＳＡ、サンクイン試薬(Sanquin Reagents)、アムステルダム、オランダによって測定）。（上記のＩｇＧ暴露により誘導された）グランザイムＢの放出は、図２（３時間、ｎ＝６；２４時間、ｎ＝８）に証明されるように、グランザイムＢ濃度の顕著な増加に繋がった。
【００４８】
ＩＦＮ−ガンマ及びパーフォリンの測定は、約３７℃における約３時間及び／又は約２４時間のインキュベーション後に遠心分離により得られた全血培養物の上清により、ＥＬＩＳＡによって行った。必要であれば、上清は、アッセイまで約−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡは、市販のキットを用いて、製造元（ダイアクロン（Diaclone）、ベサンコン（Besancon）、フランス）のプロトコルに応じて行った。コントロールの測定は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の添加を除いて、同じ条件の下で行った。
【００４９】
全血試料におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの測定により、ＩｇＧ暴露後に自発的脱顆粒を確認した。ＣＤ１０７aのデータと一致するように、ＩＶＩｇは、顕著なグランザイムＢの放出を誘導し（ｐ＝０，００２；ｎ＝１２；ウイルコクソンの符号付き検定を、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて、統計分析に適用した。０．０５未満のＰ値を有意であると考慮した。）、また、標的細胞無しで、パーフォリンにおいてよりわずかな増加（ｐ＜０，００５；ｎ＝１２）を誘導した。パーフォリンの結果は、図７に示されている。
【００５０】
（実施例３）
全血刺激及び免疫グロブリン適用のＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０レベルへの影響
健常ドナー（ｎ＝１９）からのヘパリン添加静脈血を、７．５ｍＬチューブ（サーステッド（Sarstedt）、ナンブレチト（Numbrecht）、ドイツ）に回収した。５％ＩＶＩＧ又は１０％ＩＶＩＧのストック溶液（オクタガム、オクトファーマ、ビエンナ、オーストリア（Octagam, Octpharma, Vienna, Austria））を、培地で、１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧの濃度に希釈した（各１：５、１：１０）。免疫グロブリン製剤に応じたプラセボ溶液は、ＩＶＩＧと同じように希釈した（培地において１：５又は１：１０）。
【００５１】
リポ多糖体（ＬＰＳ、シグマ、セントルイス、ユー・エス・エー）を、刺激のために、１００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈した。全血１ｍＬを、３時間、３７℃で、刺激の存在下又は非存在下で、１ｍＬの培地、プラセボを含有する１ｍＬの培地、又は１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧを含有する１ｍＬの培地と共にインキュベートした。
【００５２】
メッセンジャーＲＮＡ及びｃＤＮＡ合成を、標準の方法により行った。サーモサイクラーにおいて、ファースト・ストランドｃＤＮＡ合成キット（ＲＡＳ）及びプライマーとしてオリゴ−（ｄＴ）を用い、製造元のプロトコルを用いて、８．２μＬのｍＲＮＡのアリコートを逆転写した。ｃＤＮＡ合成を停止した後、反応混合物を最終容量５００μＬに希釈し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析まで、−２０℃で保存した。
【００５３】
ライトサイクラー（ＲＡＳ）に最適化したパラメータ特異的プライマーセットを開発し、サーチ・エルシー・ジーエムビーエイチ（SEARCH-LC GmbH）（ヘイデルバーグ（Heidelberg）、ドイツ）から購入した。ＰＣＲを、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡサイバーグリーンＩキット（LightCycler FastStart DNA Sybr Green I kit）（ＲＡＳ）を用いて、該パラメータ特異的キットにおいて提供されているプロトコルに応じて行った。
【００５４】
ＲＮＡインプットは、二つのハウスキーピング遺伝子ベータ−アクチン及びサイクロフィリンＢの平均的発現によって標準化した。データは、ｃＤＮＡμＬ当たりの調製した転写産物として提示されている。
【００５５】
（プラセボに対して）ＩＶＩＧにより刺激した全血におけるサイトカイン及びケモカインの放出を、高感度ＥＬＩＳＡ（ダイアクロン（Diaclone）、ベサンコン（Besancon）、フランス）、又はルミネックス（マルチプレックス）システム（バイオ−プレックス(Bio-Plex)、バイオラッド・ラボラトリーズ、ハークルズ（Hercules）、カリフォルニア、ユー・エス・エー）を用いて、２４時間後に測定した。
【００５６】
３７℃で、３時間の培養後のＬＰＳ刺激全血におけるサイトカイン及びケモカインの放出を測定するために、試料を遠心分離した。上清を直ちに回収して、−８０℃で保存した。上清について、ビーディー・サイトメトリック・ビード・アレイ・キット（BD Cytometric Bead Array kits）（ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡキット、ヒトケモカインＣＢＡキット、両方ともにビーディー・バイオサイエンス（BD Biosciences）、サンディエゴ、ユー・エス・エー）を用い、製造元のプロトコルに従って、測定した。
【００５７】
結果
１８／１９の健常被験者及び１４／１６のＭＳ患者において、ＩＦＮ−ガンマ遺伝子発現が、ＩＶＩＧによって誘導された（図３ａ）及び３ｂ）を参照）。
【００５８】
図３：ＨＤ（ｎ＝１９）及びＭＳ患者（ｎ＝１６）におけるＩＶＩＧ（転写産物μＬ）によって誘導されたＩＦＮ−ガンマの遺伝子発現。
図４は、２４時間後に、ＩＶＩＧによって誘導されたタンパク質放出（ＩＦＮ−ガンマ）を示す（高感度ＥＬＩＳＡ）（ｎ＝１０）。
【００５９】
しかし、添加された免疫グロブリンの暴露に対する反応強度における個々の差を取り消すと、免疫グロブリンを含有しないコントロール（ＬＰＳの存在下における設定）と比較した場合、ＩＰ−１０タンパク質レベル（及び転写産物数、示していない）は、ＩＶＩＧの存在下において、有意に、ほとんど増加しなかった（ｎ＝６）（図５）。
【００６０】
（実施例４）
５１Ｃｒ放出アッセイによるＮＫ細胞障害性の評価
全血５１Ｃｒ放出アッセイを、約３時間、約３７℃で、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いて、アッセイ培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で血液を希釈することにより行い、次いで、Ｖ底９６ウェルプレート上に分布させ、異なる血液希釈で、５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞と混合した。プレートを、約４時間、約３７℃でインキュベートし、上清を回収した。５１Ｃｒ放出をガンマカウンターで測定した。標的比率に対するエフェクターの計算のためにＮＫ細胞の絶対数を決定するために、２００μＬの希釈した血液試料を、ＰＥ−結合抗ＣＤ５６及びＰＥ／Ｃｙ−５結合抗ＣＤ３ｍＡｂ（モノクローナル抗体）と共に、氷上で、約２０分間、インキュベートした。そして、２０．０００のＦＩＴＣ結合ビーズ（ライト・リファレンス・スタンダード（Right Reference Standard）、バングス・ラボラトリーズ（Bangs Laboratories）、フィッシャーズ（Fishers）、インディアナ（ＩＮ）、ユー・エス・エー）を加え、血液試料を、ＦＡＣＳ溶解溶液（FACS Lysing Solution）(ビーディー・バイオサイエンシズ（BD Biosciences）、ヘイテルバーグ（Heidelberg）、ドイツ）を用いて、赤血球溶解に供試した。希釈した血液試料のＮＫ細胞数を、［ＮＫ細胞／μＬ試料］＝［（ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞計数）／（ビーズ計数）］×１００として計算した。
【００６１】
ＩＶＩｇ治療により、ＮＫ標的Ｋ５６２の溶解の有意な減少を生じた（ｐ＜０．００５、ｎ＝１０、図８）。
【００６２】
図１、３〜８に対する凡例：
【００６３】
図１：ＩＶＩＧによる全血（ＷＢ）刺激後のＮＫ細胞の脱顆粒（ｎ＝８）。
【００６４】
図６：ＩＶＩｇによるＣＤ１６の下方調節及びＣＤ５６dim（薄暗い）ＮＫ細胞の脱顆粒、（Ａ）ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上のＣＤ１６表面発現（％におけるＭＦＩ、コントロール＝１００％）、ｎ＝１２、（Ｂ、Ｃ）ＩＶＩｇ（Ｃ）又はコントロール（Ｂ）を用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ外在化。ＣＤ１０７ａを発現している総ＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)細胞のパーセントが示されている。
【００６５】
図７：ＩＶＩｇは、パーフォリンとして決定された全血におけるＮＫ細胞の脱顆粒を誘導する、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた全血の２４時間のインキュベーション後の上清へのパーフォリン（Ａ）放出（ｐｇ／ｍＬ）（ｎ＝１２、ｐ＜０，００５）。
【００６６】
図８：ＩＶＩｇは、全血におけるＮＫ細胞の殺作用を減少させる。健常な固体からの全血試料を、約３７℃で、約３時間、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いて処理した。次に、ＮＫ細胞作用を、ＮＫ細胞感受性標的細胞Ｋ５６２に対する４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。１００μＬの全血を用いてＫ５６２細胞の溶解が示されている（ｎ＝１０、ｐ＜０，００５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の治療、又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、先天性免疫系及び生体防御系の一部である。ＮＫ細胞の考えられる重要な機能は、ウイルスのような侵入者及び腫瘍細胞の攻撃にある。そのメカニズムは、特に、細胞内移行（cell internalisation）及びタンパク質分解後に前記侵入者の特定部分の提示に通常関与する、低いレベル又は皆無のレベルの主要組織適合性遺伝子複合体ＭＨＣクラスＩを有するそれらの細胞の認識に基づくものであると推測されている。このような特徴により、ＮＫ細胞は、それらの攻撃を目的とするために、感染細胞を非感染細胞から識別するかもしれない。 特定のウイルスは、特定の宿主防御を回避し、ＭＨＣクラスＩ分子の輸送を阻むことさえするが、ＮＫ細胞の攻撃のターゲットになる。
【０００３】
ヒト細胞によって発現される特定のＨＬＡ対立遺伝子は自己を示し、上記の認識の特徴との組合せにおいて、「自己」の体細胞は、自己攻撃からの追加の安全機構を提供し、保護される。
【０００４】
殺傷の極めて効果的なメカニズムは、直接のＮＫターゲット細胞の接触を介して媒介される。ＮＫ細胞は、外来細胞に対して分子を放出する。これらの分子は、ＮＫ細胞の粒子から放出され、それゆえに、この効果は、貯蔵されたエフェクタ分子を遊離する脱顆粒と呼ばれており、ＮＫ細胞は、標的の細胞膜にチャンネル、又は標的の重度の損害、その「死」にさえ導く被覆を形成する、いわゆる「パーフォリン」を用いる。他の分子が、この攻撃に関与し、タンパク質分解のような他のメカニズムによって破壊効果を支持し、ここでは、ＮＫ細胞脱顆粒によってまた放出されるグランザイムＢが関与する。サイトカインを含む、それらのシグナル化合物の放出は、他の細胞を攻撃及び活性化し、侵入者に対する複合的な攻撃、及び最終的には下方制御された防衛反応の結果となる。
【０００５】
腫瘍細胞がＮＫ細胞によって攻撃及び破壊される場合、この殺傷力は、独特の癌治療のアプローチのために利用することができる。したがって、特別の化合物及び医療介入（interventions）が、ＮＫ細胞活性を支持し、かつＮＫ細胞をより特異的に腫瘍細胞に対抗するように導くために、探索されている。
【０００６】
ＮＫ細胞は、宿主防御の重要な一部である。しかし、例えば、異なる疾患の理由又は過程において、これらの細胞の調節異常が生じると、それらは、末梢及び脳において臓器構造及び希突起膠細胞の攻撃のような、重大な病態生理学的結果を伴い、「自己構造（self-structures）」に対抗するように自己を導くことができる。このような欠陥及び自己攻撃をもたらすメカニズムは十分に理解されていないが、これらの細胞の制御を取り戻すこと、及びそれらの殺傷力を生理学的に妥当なレベルまで減少させることが必要とされる。殺傷効率は、脱顆粒及びエフェクター分子の放出に密接に関係しているので、このような脱顆粒を制御して、損傷を減少させることが目的である。したがって、ＮＫ細胞の作用を調節することができ、該作用及び続く損傷を減少／防止する、化合物を同定すること及び使用することが目的である。
【０００７】
免疫グロブリンは、多くの異なる化合物、構造及び細胞構造の部分としての構造をも含む標的を認識し、それらの生物学的効果を認識し、かつしばしば中和する、免疫系の先天的な一部である。免疫複合体は、「異質の」分子の除去に迅速に導かれて、消去される。よって、免疫グロブリンレベルを欠いた（或いは、減少した）患者が、重大な再発性の感染を受ける傾向がある事実によって実証されている通り、認識、結合及び除去の機能は、疑いなく重要な意味を持つ。侵入者に対するこの防御機能以上に、免疫グロブリンは、免疫系を平衡化し、かつ調節するに当たり、重要な調節機能を担っている。通常、プールされた献血又は血漿に由来し、専門家によく知られた方法により調整された免疫グロブリンが、ＩＭＩＤ（免疫関与炎症性疾患；immune mediated inflammatory disease）及びいわゆるＡＩＤ（自己免疫疾患；autoimmune diseases）の治療のために用いられているが、それらの定義は、疾患の同一の、又はオーバーラップした特徴を表現するものかもしれない。免疫グロブリン濃縮物は、通常、静脈（ＩＶＩＧ）又は皮下（ＳＣＩＧ）に投与されるが、筋肉内投与、吸入投与、点眼、経口投与、又は局所投与であってもよい。
【０００８】
自己免疫疾患における静脈投与の免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の有効性は１９５０年代に最初に報告されており、その時は、特発性血小板減少性紫斑病を患っていた患者を治療するために用いられた。そのうちに、多くの臨床研究が、自己免疫疾患においてＩＶＩＧの有益な効果を証明した。特に、ＩＶＩＧ治療は、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、川崎症候群、慢性炎症性デミエリニシング多発性神経炎、重症筋無力症、及びコルチコステロイド抵抗性皮膚筋炎（corticosteroid-resistant dermatomyositis）において実績がある（エフレムら、2005；カザチキン及びカベリ、2001；ボロスら、2005（Ephrem et al., 2005; Kazatchkine and Kaveri, 2001; Boros et al., 2005)）。その上、多発性硬化症（ＭＳ）における疾患進行再発率及びＭＲＩ増強病斑へのＩＶＩＧの好ましい効果が、臨床研究により証明された（ソレンセン・ピーエス、2003；ソレンセンら、2002(Sorensen PS, 2003; Sorensen et al., 2002)）。
【０００９】
ＩＶＩＧの作用の完全なメカニズムは未だ不明確であるが、Ｆｃ受容体の発現及び機能の調節、補体活性化の阻害、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化、分化因子、並びにエフェクター機能の調節を引き起こすようである（エフレムら、2005；カザチキン及びカベリ、2001；ボロスら、2005(Ephrem et al., 2005; Kazatchkine and Kaveri, 2001; Boros et al., 2005)）。
【００１０】
ＩＶＩＧの予防及び治療は、多くの患者においてうまく使用されている一方、それらの中には、ＩＶＩＧの適用に不完全に又は全く応答しないケースもある。現在のところ、そのような非応答性を説明したり、又は免疫グロブリンの適用が患者において期待される効果的な働きに至るかどうかの予測を容易にする信頼性のある検査システムは存在しない。最近の研究で、例えば、反復自然流産において、ＮＫ細胞の数及び活性が流産又は正常な妊娠を予測するかもしれないこと、すなわち高い数／活性は不良な予後を生じることが示された。さらに、イン・ビトロで試験された免疫グロブリンとの相関関係が発見され、ＮＫ細胞の殺活性を明らかにした。しかし、ＮＫ細胞活性が、直接的又は間接的な態様で、免疫グロブリンによってどのように影響を受けるかについてのメカニズムは不明のままであり、したがって、進められる試験は、Ｃｒ５１標識細胞株及び対応するＣｒ５１の放出の存在下におけるＮＫ殺活性に注目するものであり、このパラメータによって評価を簡単にするものであった。さらに、上記の兆候が、例えば、ＩＭＩＤ（免疫介在性炎症疾患；immune mediated inflammatory disease）の兆候の代表となるかどうかは、推論的なものである。
【００１１】
臨床及び実験免疫学、２０００、１２１、５０６−５１４におけるアスファルターら（Asphalter et al in Clin Exp Immunol 2000, 121, 506-514）は、ＮＫサブセットへのイン・ビボＩＶＩＧ補充療法及び高用量のＩＶＩＧ（２ｇ／ｋｇ体重）の作用を開示している。ＩＶＩＧ療法（２００−４００ｍｇ／ｋｇ毎３週）の前後においてＮＫ細胞における細胞内ＩＦＮ−ガンマ（IFN-gamma）を測定した、細胞内ＮＫ・ＩＦＮ−ガンマ・アッセイも開示されている。両アッセイのうちの少なくとも一つの測定が治療後に行われたが、応答者及び非応答者を区別する可能性は提供しない。
【００１２】
ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・イミュノロジー、３１（１９９６）、１２５−１４１におけるルイズら（Ruiz. et al. in Journal of Reproductive Immunology, 31 (1996), 125-141）は、それが標的として末梢血リンパ球を用いたＮＫ細胞障害性アッセイに加えられた場合の、イン・ビトロにおいてＮＫ活性を阻害するＩＶＩＧの免疫学的メカニズムに関係する。減少した５１ＣＲ放出は、ＮＫ細胞障害性における減少を示した。Ｃｒは細胞表面に非特異的に結合するので、測定された放射能が脱顆粒に起因するものかは疑わしい。
【００１３】
ブラッド、１１０巻、Ｎｏ．９、9．11月、2007におけるサ−イン・サニャラクら（Tha - In Thanyalak et al. in Blood, Vol 110, No 9, 9. Nov. 2007）は、ＩＶＩＧの存在下において１８時間の間に成熟する樹枝状細胞（ＤＣ’ｓ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞へのそれらの影響に関連する。ＮＫ細胞表現型へのこれらの細胞の作用は、５日後に、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩＩＩの発現の決定により調べられた。ＩＮＦ−ガンマ産生及びＮＫ細胞の脱顆粒も、共培養ＩＶＩＧ−ＤＣ’ｓを用いて、４８時間後に決定され、高含量のインターフェロン−ガンマを示した。最も興味深い点は、ＤＣ’ｓ無しでＩＶＩＧを用いて処理したＮＫ細胞のコントロール・サンプルが周縁部の活性化のみを示したことが観察されたことである。このように、サ−インは、ＩＶＩＧ−ＤＣ’ｓのみが、適切に、ＮＫ細胞の脱顆粒を活性化すると結論付けた。本願（ＩＶＩＧ−ＤＣ’ｓは本発明によって使用されていない）と比較して、異なる細胞を用いて行われた長期に渡るアッセイ（４８時間及び５日）に加えて、疾患の治療に対する応答において免疫グロブリンに対するヒトの感受性の決定のために該発見を使用することについて、何ら指示は見受けられない。加えて、唯一の比較できるアッセイ（ＩＶＩＧを用いて処理したＮＫ細胞）は、本願と比較して矛盾する結果を示し、あいにく、何ら特定の状況は発表されず、実質的な比較は不可能であった（第３２５７頁、左欄、第３−７行）。
【００１４】
アーリー・プリグナンシー、ＩＶ巻、第154〜164頁におけるカワク・ジョアンら（Kwak Joanne Y.H. et al. in EARLY PREGNANCY, Vol IV, pp 154-164）は、追加の他の治療を未だ受けている、上昇したＮＫ細胞レベルを伴った反復流産を有する者においてＩＶＩＧ治療の臨床効果を調査した。ＮＫ細胞障害性及びＣＤ１６＋の発現は、ＩＶＩＧ注入治療の７日後に顕著に抑制されることが判った。疾患の治療に対する応答において免疫グロブリンに対するヒトの感受性の決定のために該発見を使用することについて、何ら指示は見受けられない。
【００１５】
ＥＰ−Ａ−１８０１２３４は、被験者が疾患にかかり易いか、あるいは自己免疫疾患を発病し易いかどうかを、組換え核酸コンストラクトを用いることによって予測するための診断方法に関連する。このようなコンストラクトは、本願によって使用されない。
【００１６】
イミュニティ、第２６巻、Ｎｏ．１、１月、２００７、第67〜78頁におけるパーク−ミン・キャング−ヒュンら（Park-Min Kyung-Hyun et al. in IMMUNITY, vol.26, no. 1, January 2007, pp 67-78）は、インターフェロン−ガンマに対する細胞応答へのＩＶＩＧの影響に関係するいくつかの調査を記載している。これらの調査は、ウィステリア・モノサイトジェネス（Wisteria monocytogenes）の観察及びマクロファージに主に基づくものであり、ＮＫ細胞は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１８０１２３４号（ＥＰ−Ａ−１８０１２３４）
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】臨床及び実験免疫学、２０００、１２１、５０６−５１４におけるアスファルターら（Asphalter et al in Clin Exp Immunol 2000, 121, 506-514）
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・イミュノロジー、３１（１９９６）、１２５−１４１におけるルイズら（Ruiz. et al. in Journal of Reproductive Immunology, 31 (1996), 125-141）
【非特許文献３】ブラッド、１１０巻、Ｎｏ．９、9．11月、2007におけるサ−イン・サニャラクら（Tha - In Thanyalak et al. in Blood, Vol 110, No 9, 9. Nov. 2007）
【非特許文献４】アーリー・プリグナンシー、ＩＶ巻、第154〜164頁におけるカワク・ジョアンら（Kwak Joanne Y.H. et al. in EARLY PREGNANCY, Vol IV, pp 154-164）
【非特許文献５】イミュニティ、第２６巻、Ｎｏ．１、１月、２００７、第67〜78頁におけるパーク−ミン・キャング−ヒュンら（Park-Min Kyung-Hyun et al. in IMMUNITY, vol.26, no. 1, January 2007, pp 67-78）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の技術的課題は、免疫グロブリンの投与に対する応答者と非応答者とを識別するための方法を提供することである。
【００２０】
驚くべきことに、ＩＶＩＧ産物の形態にさらされた、免疫グロブリンの存在下におけるＮＫ細胞は、イン・ビトロ全血検査システムにおいて調節されることを発見した。特に、ＩＦＮ−ガンマ放出及びＮＫ細胞脱顆粒が誘導され、一方、殺活性は減少する。その上、ＮＫ細胞の細胞表面上のＣＤ１６（ＦＣγＲＩＩＩ）も調節される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の根底にある技術的課題は、免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定する方法であって、該免疫グロブリンによって生じる、ＮＫ細胞の調節、及びナチュラルキラー細胞の脱顆粒の量を決定する、方法によって解決される。
【００２２】
脱顆粒という用語は、当業者に良く知られており、細胞膜との融合による分泌顆粒内容物の放出という意味を有する。
【００２３】
たいてい、細胞間接触によりＮＫ細胞の脱顆粒を誘導するために、ＮＫ細胞標的（標識Ｋ５６２のような）細胞の存在が必要であり、それによって、ＮＫ細胞粒子からの兵器（上記参照）の放出によって、標的細胞の殺傷に影響を及ぼす。（Ｋ５６２を用いて測定したように）全血の免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）への暴露が、標的細胞との細胞間接触と同等、或いはより効果的に、比較できる程の感受性のあるＮＫ細胞のサブセットの脱顆粒を誘導することが発見された。これは、粒子化合物の細胞外間隙への放出を導く。細胞外間隙は、アッセイセットアップにおいて、培地又は溶液によって刺激され得る。特に、ナチュラルキラー細胞の脱顆粒の量は、当業者によって確立することができるイン・ビトロの方法において決定される。
【００２４】
例えば、全血を、約３時間のように特定の時間、ＩＶＩＧインキュベーション又はプラセボコントロールによって刺激した。そして、抗ヒトＣＤ１０７ａ又はアイソタイプコントロールが加えられ、試料を、例えば、約３時間、約３７℃で、２×１０５のＫ５６２標的細胞と共に、インキュベートした。自発的及びＩＶＩＧ誘導脱顆粒を検出するために、コントロール試料は、標的細胞無しにインキュベートした。その後、試料を、抗ＣＤ５６及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて染色し、続いて、検出工程、特に、フローサイトメトリー分析を行った。
【００２５】
ＮＫ細胞の陽性脱顆粒を有する患者は、免疫グロブリンを用いた治療によるＮＫ細胞調節に感受性があるものとして決定される。
【００２６】
本発明の一の実施形態によれば、免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において、患者が示す免疫グロブリンに対する感受性の決定は、転写産物のレベル、タンパク質のレベル、又は転写産物のレベル及びタンパク質のレベルを検出することによって行われる。
【００２７】
本発明の別の実施形態によれば、転写産物のレベル、タンパク質のレベル、又は転写産物のレベル及びタンパク質のレベルは、定量的に決定される。例えば、転写産物のレベルが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸検出方法によって決定され、及び／又は、タンパク質のレベルが、放出されたナチュラルキラー細胞タンパク質、及び／又はナチュラルキラー細胞の表面に発現したタンパク質を用いて決定される。
【００２８】
本発明のさらなる別の実施形態では、全血又は血球を、免疫グロブリンの存在下又は非存在下において、かつ刺激剤の存在下においてインキュベートし、続いて、免疫グロブリンの投与に対する固体の応答性を評価するために、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＰ−１０、ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、グランザイムＢ、パーフォリン、又はそれらの組合せからなる、ＮＫ細胞調節を示す群から選択されるイベント因子の測定を行う。「組合せ」と言う用語は、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０、ＩＦＮ−ガンマ及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、ＩＦＮ−ガンマ及びグランザイムＢ、ＩＦＮ−ガンマ及びパーフォリン；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、ＩＰ１０及びグランザイムＢ、ＩＰ−１０及びパーフォリン；ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ、ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びパーフォリン；グランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体；ＩＦＮ−ガンマ、ＩＰ−１０、グランザイムＢ；ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０及びパーフォリン；ＩＦＮ−ガンマ及びグランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びパーフォリン；ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＮＦ−ガンマ及びＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ；ＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ及びパーフォリン；ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０及びＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体及びグランザイムＢ及びパーフォリンとして、当業者に十分に理解される。
【００２９】
測定されるイベント因子は、例えば、転写の量、及び／又はタンパク質の発現レベル、特に、イベント因子の定量的測定である。
【００３０】
本発明の一の実施形態では、刺激剤は、リポ多糖体（ＬＰＳ）、フォルボル−１２−ミリステート−１３アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、細胞表面タンパク質に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）又はそれらの組合せから選択される。「組合せ」という用語は、当業者に十分に明確であるが、組合せのリストは以下の通り例示される：ＬＰＳ及びＰＭＡ、ＬＰＳ及びイオノマイシン；ＬＰＳ及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＰＭＡ及びイオノマイシン；ＰＭＡ及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；イオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＬＰＳ及びＰＭＡ及びイオノマイシン；ＬＰＳ及びイオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＰＭＡ及びイオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ；ＬＰＳ及びＰＭＡ及びイオノマイシン及び細胞表面タンパク質に結合するｍＡｂｓ。
【００３１】
通常は、アッセイにおいて使用される免疫グロブリンの量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｍＬ、特に、約１〜約５０ｍｇ／ｍＬで変化しても良い。
【００３２】
約１〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲は、この用語によって、少なくとも1及び５０の限定の間の各整数が包含されることを容易に理解する当業者に良く知られるものであり、特に、当業者は、１〜５０の範囲において、1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50；又は2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50の数値の組合せだけでなく、例えば、1，2，3又は2，3，5，6、及び該範囲に入る数値を単に並び替えることによって可能なその他の組合せも読み取る。
【００３３】
本発明の方法により得られる結果は、炎症媒介免疫疾患（inflammatory mediated immune disease）、自己免疫疾患及びアレルギーからなる群から選択される疾患の治療に関係する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＩＶＩＧによる全血（ＷＢ）刺激後のＮＫ細胞の脱顆粒（ｎ＝８）を示す図である。
【図２】約３時間及び約２４時間後の全血試料の上清におけるグランザイムＢを定量した結果を示す図である。
【図３】ＨＤ（ｎ＝１９）（Ａ）及びＭＳ患者（ｎ＝１６）（Ｂ）におけるＩＶＩＧ（転写産物μＬ）によって誘導されたＩＦＮ−ガンマの遺伝子発現を調べた結果を示す図である。
【図４】２４時間後にＩＶＩＧによって誘導されたタンパク質放出（ＩＦＮ−ガンマ）を調べた結果を示す図である。
【図５】ＩＶＩＧ存在下及び免疫グロブリンを含有しないコントロールにおけるＩＰ−１０タンパク質レベルを示す図である。
【図６−１】ＩＶＩｇによるＣＤ１６の下方調節及びＣＤ５６dim（薄暗い）ＮＫ細胞の脱顆粒、（Ａ）ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上のＣＤ１６表面発現（％におけるＭＦＩ、コントロール＝１００％）、ｎ＝１２、（Ｂ、Ｃ）ＩＶＩｇ（Ｃ）又はコントロール（Ｂ）を用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ外在化。ＣＤ１０７ａを発現している総ＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)細胞のパーセントが示されている。
【図６−２】ＩＶＩｇによるＣＤ１６の下方調節及びＣＤ５６dim（薄暗い）ＮＫ細胞の脱顆粒、（Ａ）ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上のＣＤ１６表面発現（％におけるＭＦＩ、コントロール＝１００％）、ｎ＝１２、（Ｂ、Ｃ）ＩＶＩｇ（Ｃ）又はコントロール（Ｂ）を用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ外在化。ＣＤ１０７ａを発現している総ＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)細胞のパーセントが示されている。
【図７】ＩＶＩｇは、パーフォリンとして決定された全血におけるＮＫ細胞の脱顆粒を誘導する、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた全血の２４時間のインキュベーション後の上清へのパーフォリン（Ａ）放出（ｐｇ／ｍＬ）（ｎ＝１２、ｐ＜０．００５）。
【図８】ＩＶＩｇは、全血におけるＮＫ細胞の殺作用を減少させる。健常な固体からの全血試料を、約３７℃で、約３時間、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いて処理した。次に、ＮＫ細胞作用を、ＮＫ細胞感受性標的細胞Ｋ５６２に対する４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。１００μＬの全血を用いてＫ５６２細胞の溶解が示されている（ｎ＝１０、ｐ＜０．００５）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
脱顆粒反応それ自身は、
a.)細胞の再構成反応を利用すること（表面分子の検出のような）
及び／又は
b.)化合物を含む粒子の放出
によって、感度良く検出することができる。
【００３６】
a.)の例としては、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）表面発現が、ＮＫ細胞脱顆粒のマーカーとして知られている。フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ、蛍光標識細胞分取）のための標識抗体、断片又は親和性リガンドの特定の検出のような、専門家に知られた方法により測定された、モニターされるシグナル（例えば、蛍光）の増加は、実施例１により詳細に記載されるように、ＩｇＧの暴露に関し脱顆粒の有効性を示す。ＩｇＧ暴露により誘導された脱顆粒の有効性及び状況を検出及び定量するために、脱顆粒に関連する細胞マーカーのその他の変化を利用することができる。このようなＮＫ細胞粒子（溶解性リソソーム）化合物の典型は、タンパク質パーフォリン及びグランザイム（後者はプロテアーゼ、より詳細にはグランザイムＢ）であり、これらは、例えば、ＥＬＩＳＡのような抗原検出システム又は（酵素及びプロテアーゼのための）直接酵素試験によって定量することができる。
【００３７】
記載した反応は、ＩＶＩＧ媒介イン・ビボ効果を予測するために利用することができるが、それは、イン・ビボ（生理学的）調節及びＩＶＩＧ適用によって媒介される効果に関係する重要な反応を構成する。投与された免疫グロブリンによって直接誘導された、コントロール不良のＮＫ細胞の「極度の疲労(exhaustion)」（ＮＫ細胞の兵器の放出）は、特定の期間、ＮＫ細胞の殺傷力を減少することができ、その結果、無調節な病原性の状態において、「自己」構造に対する細胞破壊力を減少させる。結果として、ＮＫ細胞の寄与に関係し、又はＮＫ細胞の寄与によって開始される、病態生理学的なイベントが、ＩＶＩＧ、ＳＣＩＧ及び専門家に知られる他の形態の適用による免疫グロブリン予防及び治療のために示される。
【００３８】
免疫グロブリン予防及び治療の応答者／非応答者の同定は、他のパラメータ、それらの組合せ及び脱顆粒アッセイとの組合せによって達成することができる。この目的のために、全血アッセイだけでなく、分離した細胞についても、イン・ビボにおける免疫グロブリンの有効性を予測するために利用することができる。
【００３９】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）は、それらのパラメータに属する。そのｍＲＮＡ（転写産物）は、全血又は、例えば、ＮＫ細胞のイン・ビトロ適用において誘導され、また、該細胞によって産生されるタンパク質レベルの増加によって示され、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０、他の機能の中でもＴ細胞及びＮＫ細胞のための化学誘引物質）は、通常、ＩＦＮ−ガンマの制御下にあり、すなわち、増加した場合に後者によって刺激される。全血アッセイシステムにおいて（バクテリア由来の）リポ多糖体を用い、それにより、病態生理学的状態を模倣すると、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０の両方が、ｍＲＮＡ転写産物（数）及びタンパク質（放出）レベルで、上方制御される。（ＬＰＳを用いた刺激の上に）添加された免疫グロブリンの存在下において、免疫グロブリン無しのコントロールに比較して、ＩＰ−１０の増加は、免疫グロブリンによって減少することが発見されたが、一方で、ＩＦＮ−ガンマについては、相対的な減少は観察されなかった。この効果は、予想外であり、免疫グロブリンによる免疫調節性状の一部として理解され、このようにして、抗炎症反応として理解できる、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０応答の部分的脱共役に繋がる。これに対応して、この効果は、ＩＶＩＧ適用に対する応答性が有望であるかどうかを評価するために、生体外（ex vivo）検査システム（潜在的なＩＶＩＧ受容者からの全血）において利用することができる。
【００４０】
さらに、免疫グロブリンは、ＦＣ−ガンマ−Ｒ型ＩＩＩ（FC-gamma-R type III）の下方調節を誘導し、そのサブセットは、炎症反応に関係することが報告されているので、このパラメータはＦＣ−ガンマ−受容体調節に関するアッセイと組合せて使用することができる。よって、転写産物及びタンパク質の細胞表面発現の減少は、抗炎症側への生理を導くだろう。
【００４１】
さらに、これらのパラメータは、異なる遺伝的背景の患者を示す、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、インターロイキン−７受容体（ＩＬ７−Ｒ）及びＣＤ５８等の一塩基多型（ＳＮＰ）に関するアッセイと組合せることができる。
【００４２】
本発明及び各アッセイを、以下の実施例により、より詳細に説明する。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
＜ＮＫ細胞脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７a）＞
方法
１００μＬのヒト血液を１００μＬアッセイ培地（１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン含有ＩＭＤＭ）で希釈し、３７℃で３時間、少なくとも一度ＩＶＩＧと共に、また、コントロールとして、少なくとも一度ＩＶＩＧ無しで、インキュベートした。そして、ＰＥ−Ｃｙ５結合抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ又はアイソタイプコントロールを加え、試料を、２〜３時間、３７℃で、２×１０５のＫ５６２標的細胞と共にインキュベートした。自発的及びＩＶＩＧ誘導脱顆粒を検出するために、コントロール試料は、標的細胞無しにインキュベートした。その後、試料を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６ｍＡｂ及びＰＥ結合抗ＣＤ３ｍＡｂを用いて染色し、その後、フローサイトメトリーによる分析を行った。免疫グロブリン（５％又は１０％ＩＶＩＧ、オクタガム、オクトファーマ・ピーピージーエムビーエイチ、ビエンナ、オーストリア（Octagam, Octpharma ppGmbH, Vienna, Austria））を、１０ｍｇ／ｍＬで全血に添加した。マルトース溶液を、マルトースを含有するＩＶＩＧのコントロールとして使用した。
【００４４】
結果
ＮＫ細胞の脱顆粒の誘導は、ＣＤ１０７ａ陽性細胞の増加する数によって証明することができた。８人の健常被験者の結果が図１に示されている。全ての健常被験者において、ＮＫ細胞の脱顆粒が誘導され、コントロール（マルトース）よりも、より顕著に効果的であることが判明した。Ｋ５６２細胞を、ＮＫ殺傷作用の評価のために使用した（コントロール：Ｋ５６２細胞＋マルトース）。とりわけ、より強い効果が、標準Ｋ５６２細胞よりも、ＩＶＩＧによってもたらされた。わずかに増強された脱顆粒の傾向が、ＩＶＩＧ及びＫ５６２細胞を組合せて用いた場合に観察された。
【００４５】
ＮＫ細胞上のＦＣ−ガンマ−ＩＩＩ−受容体（ＣＤ１６）発現
ＮＫ細胞上のＦＣ−ガンマ−ＩＩＩ−受容体（ＣＤ１６）を測定するために、１００μＬのＩＶＩｇ又はコントロールで処理した全血試料（実施例１に記載の通り調整）を、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ１６、ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＣＤ５６、及びパシフィックブルー結合抗ＣＤ３を用いて染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。
【００４６】
ＩＶＩｇ治療は、ＣＤ１６の表面発現を顕著に減少させた（ｐ＜０，００５、ｎ＝１２、図６Ａ）。これらのデータは、ＩＶＩｇ媒介ＣＤ１６の下降調節と一致しており、ＩＶＩｇによるＣＤ１６の直接的な関与を示唆している。ＣＤ１６は、ＣＤ５６bright(明るい)の一方と比較して、より細胞障害性のあるＮＫ細胞のＣＤ５６dim（薄暗い）集団上に発現している。このことは、ＩＶＩｇによるＣＤ１６の直接的な関与は、観察されるＮＫ細胞の自発的な脱顆粒の原因であることを示唆している。この仮説に一致する通り、我々は、ＩＶＩｇは、ＣＤ５６dim（薄暗い）／ＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞集団における、ＣＤ１０７ａの外在化を特異的に誘導することを発見した（図６Ｂ／Ｃ）。
【００４７】
（実施例２）
ＩＶＩＧ誘導脱顆粒によるグランザイムＢ、ＩＦＮ−ガンマ及びパーフォリンの放出
約３時間及び／又は約２４時間後の全血試料の上清におけるグランザイムＢを定量する実験の設定を選択した（ＥＬＩＳＡ、サンクイン試薬(Sanquin Reagents)、アムステルダム、オランダによって測定）。（上記のＩｇＧ暴露により誘導された）グランザイムＢの放出は、図２（３時間、ｎ＝６；２４時間、ｎ＝８）に証明されるように、グランザイムＢ濃度の顕著な増加に繋がった。
【００４８】
ＩＦＮ−ガンマ及びパーフォリンの測定は、約３７℃における約３時間及び／又は約２４時間のインキュベーション後に遠心分離により得られた全血培養物の上清により、ＥＬＩＳＡによって行った。必要であれば、上清は、アッセイまで約−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡは、市販のキットを用いて、製造元（ダイアクロン（Diaclone）、ベサンコン（Besancon）、フランス）のプロトコルに応じて行った。コントロールの測定は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の添加を除いて、同じ条件の下で行った。
【００４９】
全血試料におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの測定により、ＩｇＧ暴露後に自発的脱顆粒を確認した。ＣＤ１０７aのデータと一致するように、ＩＶＩｇは、顕著なグランザイムＢの放出を誘導し（ｐ＝０，００２；ｎ＝１２；ウイルコクソンの符号付き検定を、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて、統計分析に適用した。０．０５未満のＰ値を有意であると考慮した。）、また、標的細胞無しで、パーフォリンにおいてよりわずかな増加（ｐ＜０，００５；ｎ＝１２）を誘導した。パーフォリンの結果は、図７に示されている。
【００５０】
（実施例３）
全血刺激及び免疫グロブリン適用のＩＦＮ−ガンマ及びＩＰ−１０レベルへの影響
健常ドナー（ｎ＝１９）からのヘパリン添加静脈血を、７．５ｍＬチューブ（サーステッド（Sarstedt）、ナンブレチト（Numbrecht）、ドイツ）に回収した。５％ＩＶＩＧ又は１０％ＩＶＩＧのストック溶液（オクタガム、オクトファーマ、ビエンナ、オーストリア（Octagam, Octpharma, Vienna, Austria））を、培地で、１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧの濃度に希釈した（各１：５、１：１０）。免疫グロブリン製剤に応じたプラセボ溶液は、ＩＶＩＧと同じように希釈した（培地において１：５又は１：１０）。
【００５１】
リポ多糖体（ＬＰＳ、シグマ、セントルイス、ユー・エス・エー）を、刺激のために、１００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈した。全血１ｍＬを、３時間、３７℃で、刺激の存在下又は非存在下で、１ｍＬの培地、プラセボを含有する１ｍＬの培地、又は１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧを含有する１ｍＬの培地と共にインキュベートした。
【００５２】
メッセンジャーＲＮＡ及びｃＤＮＡ合成を、標準の方法により行った。サーモサイクラーにおいて、ファースト・ストランドｃＤＮＡ合成キット（ＲＡＳ）及びプライマーとしてオリゴ−（ｄＴ）を用い、製造元のプロトコルを用いて、８．２μＬのｍＲＮＡのアリコートを逆転写した。ｃＤＮＡ合成を停止した後、反応混合物を最終容量５００μＬに希釈し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析まで、−２０℃で保存した。
【００５３】
ライトサイクラー（ＲＡＳ）に最適化したパラメータ特異的プライマーセットを開発し、サーチ・エルシー・ジーエムビーエイチ（SEARCH-LC GmbH）（ヘイデルバーグ（Heidelberg）、ドイツ）から購入した。ＰＣＲを、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡサイバーグリーンＩキット（LightCycler FastStart DNA Sybr Green I kit）（ＲＡＳ）を用いて、該パラメータ特異的キットにおいて提供されているプロトコルに応じて行った。
【００５４】
ＲＮＡインプットは、二つのハウスキーピング遺伝子ベータ−アクチン及びサイクロフィリンＢの平均的発現によって標準化した。データは、ｃＤＮＡμＬ当たりの調製した転写産物として提示されている。
【００５５】
（プラセボに対して）ＩＶＩＧにより刺激した全血におけるサイトカイン及びケモカインの放出を、高感度ＥＬＩＳＡ（ダイアクロン（Diaclone）、ベサンコン（Besancon）、フランス）、又はルミネックス（マルチプレックス）システム（バイオ−プレックス(Bio-Plex)、バイオラッド・ラボラトリーズ、ハークルズ（Hercules）、カリフォルニア、ユー・エス・エー）を用いて、２４時間後に測定した。
【００５６】
３７℃で、３時間の培養後のＬＰＳ刺激全血におけるサイトカイン及びケモカインの放出を測定するために、試料を遠心分離した。上清を直ちに回収して、−８０℃で保存した。上清について、ビーディー・サイトメトリック・ビード・アレイ・キット（BD Cytometric Bead Array kits）（ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡキット、ヒトケモカインＣＢＡキット、両方ともにビーディー・バイオサイエンス（BD Biosciences）、サンディエゴ、ユー・エス・エー）を用い、製造元のプロトコルに従って、測定した。
【００５７】
結果
１８／１９の健常被験者及び１４／１６のＭＳ患者において、ＩＦＮ−ガンマ遺伝子発現が、ＩＶＩＧによって誘導された（図３ａ）及び３ｂ）を参照）。
【００５８】
図３：ＨＤ（ｎ＝１９）及びＭＳ患者（ｎ＝１６）におけるＩＶＩＧ（転写産物μＬ）によって誘導されたＩＦＮ−ガンマの遺伝子発現。
図４は、２４時間後に、ＩＶＩＧによって誘導されたタンパク質放出（ＩＦＮ−ガンマ）を示す（高感度ＥＬＩＳＡ）（ｎ＝１０）。
【００５９】
しかし、添加された免疫グロブリンの暴露に対する反応強度における個々の差を取り消すと、免疫グロブリンを含有しないコントロール（ＬＰＳの存在下における設定）と比較した場合、ＩＰ−１０タンパク質レベル（及び転写産物数、示していない）は、ＩＶＩＧの存在下において、有意に、ほとんど増加しなかった（ｎ＝６）（図５）。
【００６０】
（実施例４）
５１Ｃｒ放出アッセイによるＮＫ細胞障害性の評価
全血５１Ｃｒ放出アッセイを、約３時間、約３７℃で、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いて、アッセイ培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で血液を希釈することにより行い、次いで、Ｖ底９６ウェルプレート上に分布させ、異なる血液希釈で、５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞と混合した。プレートを、約４時間、約３７℃でインキュベートし、上清を回収した。５１Ｃｒ放出をガンマカウンターで測定した。標的比率に対するエフェクターの計算のためにＮＫ細胞の絶対数を決定するために、２００μＬの希釈した血液試料を、ＰＥ−結合抗ＣＤ５６及びＰＥ／Ｃｙ−５結合抗ＣＤ３ｍＡｂ（モノクローナル抗体）と共に、氷上で、約２０分間、インキュベートした。そして、２０．０００のＦＩＴＣ結合ビーズ（ライト・リファレンス・スタンダード（Right Reference Standard）、バングス・ラボラトリーズ（Bangs Laboratories）、フィッシャーズ（Fishers）、インディアナ（ＩＮ）、ユー・エス・エー）を加え、血液試料を、ＦＡＣＳ溶解溶液（FACS Lysing Solution）(ビーディー・バイオサイエンシズ（BD Biosciences）、ヘイテルバーグ（Heidelberg）、ドイツ）を用いて、赤血球溶解に供試した。希釈した血液試料のＮＫ細胞数を、［ＮＫ細胞／μＬ試料］＝［（ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞計数）／（ビーズ計数）］×１００として計算した。
【００６１】
ＩＶＩｇ治療により、ＮＫ標的Ｋ５６２の溶解の有意な減少を生じた（ｐ＜０．００５、ｎ＝１０、図８）。
【００６２】
図１、３〜８に対する凡例：
【００６３】
図１：ＩＶＩＧによる全血（ＷＢ）刺激後のＮＫ細胞の脱顆粒（ｎ＝８）。
【００６４】
図６：ＩＶＩｇによるＣＤ１６の下方調節及びＣＤ５６dim（薄暗い）ＮＫ細胞の脱顆粒、（Ａ）ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上のＣＤ１６表面発現（％におけるＭＦＩ、コントロール＝１００％）、ｎ＝１２、（Ｂ、Ｃ）ＩＶＩｇ（Ｃ）又はコントロール（Ｂ）を用いた３時間のインキュベーション後の全血におけるＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ外在化。ＣＤ１０７ａを発現している総ＣＤ５６dim（薄暗い）及びＣＤ５６bright(明るい)細胞のパーセントが示されている。
【００６５】
図７：ＩＶＩｇは、パーフォリンとして決定された全血におけるＮＫ細胞の脱顆粒を誘導する、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いた全血の２４時間のインキュベーション後の上清へのパーフォリン（Ａ）放出（ｐｇ／ｍＬ）（ｎ＝１２、ｐ＜０，００５）。
【００６６】
図８：ＩＶＩｇは、全血におけるＮＫ細胞の殺作用を減少させる。健常な固体からの全血試料を、約３７℃で、約３時間、ＩＶＩｇ又はコントロールを用いて処理した。次に、ＮＫ細胞作用を、ＮＫ細胞感受性標的細胞Ｋ５６２に対する４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。１００μＬの全血を用いてＫ５６２細胞の溶解が示されている（ｎ＝１０、ｐ＜０，００５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンを用いたＮＫ細胞撹乱による疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定する方法であって、前記免疫グロブリンによるＮＫ細胞調節を決定することによって行われる方法。
【請求項２】
ナチュラルキラー細胞の脱顆粒の量が、イン・ビトロ法で決定される、請求項１の方法。
【請求項３】
ナチュラルキラー細胞の陽性脱顆粒を有する患者は、免疫グロブリンを用いた治療に対して感受性があると決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定することが、転写産物レベル、タンパク質レベル、又は転写産物レベル及びタンパク質レベルの検出によって行われる、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
転写産物レベル、タンパク質レベル、又は転写産物レベル及びタンパク質レベルが、定量的に決定される、請求項４の方法。
【請求項６】
転写産物レベルが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）如く核酸検出法によって決定される、請求項１〜５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
タンパク質レベルが、放出されたナチュラルキラー細胞タンパク質、及び／又はナチュラルキラー細胞表面上に発現するタンパク質を用いて決定される、請求項１〜６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
全血又は血球を、免疫グロブリンの存在下における少なくとも一のアッセイにおいて、かつコントロールとして免疫グロブリンの非存在下における少なくとも一のアッセイにおいて、刺激物の存在下で、インキュベートし、続いて、免疫グロブリンの投与に対する固体の応答性を評価するために、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＰ−１０、ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、グランザイムＢ、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ、又はこれらの組合せからなる群から選択される、ＮＫ細胞調節を示す因子の発現によって、イベントの測定を行う、請求項１〜７のいずれか１項の方法。
【請求項９】
測定されるイベントは、前記因子の転写の存在量及び又はタンパク質発現レベル、特に前記イベントの定量的測定である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激物は、リポ多糖体（ＬＰＳ）、フォルボル−１２−ミリステート−１３アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、細胞表面タンパク質に結合するモノクローナル抗体又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイに用いられる免疫グロブリンの量が、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｍＬ、特に約１〜約５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が、炎症媒介免疫疾患、自己免疫疾患、及びアレルギーからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
免疫グロブリンを用いたＮＫ細胞撹乱による疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定する方法であって、前記免疫グロブリンによるＮＫ細胞調節を決定することによって行われる方法。
【請求項２】
ナチュラルキラー細胞の脱顆粒の量が、イン・ビトロ法で決定される、請求項１の方法。
【請求項３】
ナチュラルキラー細胞の陽性脱顆粒を有する患者は、免疫グロブリンを用いた治療に対して感受性があると決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
免疫グロブリンを用いた疾患の治療又は疾患の予防に対する応答において患者が示す免疫グロブリンに対する感受性を決定することが、転写産物レベル、タンパク質レベル、又は転写産物レベル及びタンパク質レベルの検出によって行われる、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
転写産物レベル、タンパク質レベル、又は転写産物レベル及びタンパク質レベルが、定量的に決定される、請求項４の方法。
【請求項６】
転写産物レベルが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）如く核酸検出法によって決定される、請求項１〜５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
タンパク質レベルが、放出されたナチュラルキラー細胞タンパク質、及び／又はナチュラルキラー細胞表面上に発現するタンパク質を用いて決定される、請求項１〜６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
全血又は血球を、免疫グロブリンの存在下における少なくとも一のアッセイにおいて、かつコントロールとして免疫グロブリンの非存在下における少なくとも一のアッセイにおいて、刺激物の存在下で、インキュベートし、続いて、免疫グロブリンの投与に対する固体の応答性を評価するために、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＰ−１０、ＦＣ−ガンマＩＩＩ受容体、グランザイムＢ、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ、又はこれらの組合せからなる群から選択される、ＮＫ細胞調節を示す因子の発現によって、イベントの測定を行う、請求項１〜７のいずれか１項の方法。
【請求項９】
測定されるイベントは、前記因子の転写の存在量及び又はタンパク質発現レベル、特に前記イベントの定量的測定である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激物は、リポ多糖体（ＬＰＳ）、フォルボル−１２−ミリステート−１３アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、細胞表面タンパク質に結合するモノクローナル抗体又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイに用いられる免疫グロブリンの量が、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｍＬ、特に約１〜約５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が、炎症媒介免疫疾患、自己免疫疾患、及びアレルギーからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５０９４０６（Ｐ２０１１−５０９４０６Ａ）
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１７９２（Ｐ２０１０−５４１７９２）
【出願日】平成２１年１月９日（２００９．１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７２１９
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０００５０４０２）オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月９日（２００９．１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７２１９
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０００５０４０２）オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト (9)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]