免疫原性組成物
Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくはその断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸配列とを含むウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ４ｂｐドメインと抗原とを含む免疫原性ウイルスベクター組成物及びワクチンに関し、また、これらを用いてＴ細胞応答の増強をもたらす方法にも関する。
【背景】
【０００２】
ワクチン接種は、疾患、特に、感染性疾患を予防する最も有効な手段の１つであることが分かっている。大半のワクチンは、関連する病原体による感染に対して防御的である抗体を誘導することにより作用する。しかし、多くの新たなワクチンは、免疫系の細胞性装備を標的とし、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞を誘導することにより作用する。これらは、細胞内の病原体及び腫瘍を標的としうる。予防又は治療的に用いうる多くの新たなＴ細胞誘導型ワクチンが開発中である。
【０００３】
ワクチン接種により誘導されるＴ細胞は、様々な形で有用となりうる。それらは被ワクチン接種者における疾患の危険性を低減するほか、これを適合移植プロトコールで用いて、これらの細胞を移植される者における感染又は疾患の危険性を低減することも可能である。それらはまた、診断においても有用でありうる。
【０００４】
免疫応答を誘発するのにますます広く用いられている方法は、対象とする抗原又はエピトープをベクター内にクローニングする方法である。ベクターは、プラスミドベクター、細菌ベクター、又はウイルスベクターでありうる。プラスミドＤＮＡワクチンは集約的な開発下にあり、各種のウイルスベクターはワクチン接種に有用であると考えられる。これらは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルス、鶏痘及びカナリア痘及びＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルス、並びにアデノウイルスを含む。
【０００５】
改善されたベクターにより標的としうる疾患は、マラリア、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、肺炎球菌などの被包性細菌により引き起こされる疾患、リーシュマニア症などの寄生虫疾患、並びにリンパ腫、白血病、黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、及び結腸直腸癌などの広範にわたる腫瘍及び癌を含むがこれらに限定されない。
【０００６】
マラリアは、依然として世界最大の公衆衛生問題の１つである。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染には、毎年５億人を超える人々が罹患する結果、１００万〜２００万人が死亡する１、２。有効なワクチンの開発は、依然として、この疾患の安全で費用効果の高いコントロールにとって重要な目標である。
【０００７】
マラリア感染の血液段階に対する免疫は主に抗体媒介性であり、防御的応答の標的にはメロゾイト表面タンパク質−１（ＭＳＰ−１）を含むメロゾイト表面抗原がある３、４。ＭＳＰ−１は、赤血球侵入時にタンパク質分解処理を受ける１９０〜２３０ｋＤａのポリペプチドとして合成される５。４２ｋＤａのＣ末端（ＭＳＰ−１４２）は、最終的に３３ｋＤａ及び１９ｋＤａの断片（それぞれ、ＭＳＰ−１３３及びＭＳＰ−１１９）に切断され、そのうち、ＭＳＰ−１１９のみがメロゾイト表面と会合したままとなる６。ＭＳＰ−１４２は血液段階におけるマラリアワクチンの主導的な候補抗原であり、主にマラリア感作時におけるＭＳＰ−１１９に対する高力価の抗体応答の存在に応じて、マウス及びサルにおける防御的応答を誘導する能力を有する７〜９。ＭＳＰ−１３３に対する抗体応答は防御的でない１０、１１。
【０００８】
血液段階の免疫に対するＴ細胞応答の寄与は、十分には定義されないままである１２。ＭＳＰ−１４２の場合、多くのプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種では、ＭＳＰ−１３３内にＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープが書き込まれており、これらにより、ＭＳＰ−１１９に対する防御的な抗体応答へのＴ細胞による支援がもたらされる可能性が高い１１、１３。ＭＳＰ−１３３内の（しかし、ＭＳＰ−１１９内ではない）エピトープを認識するＣＤ４＋ Ｔ細胞株はまた、免疫欠損マウス内への適合移植後において、致死的なプラスモジウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の増殖をコントロールする能力も有する１４、１５。ＭＳＰ−１に対する細胞応答は、部分的な免疫を獲得した小児についての研究では防御と相関していることが判明しており、同様に、極めて低用量の血液段階の原虫に対するマウス又はヒトボランティアの反復的な曝露により、抗体応答ではなく細胞応答を特徴とする防御的な免疫が誘導される１６、１７。
【０００９】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、プラスモジウム・ヨエリによるモデルにおける血液段階の免疫には寄与しない１８。しかし、ＭＳＰ−１は、後期赤外シゾント内で発現される２０ので、プラスモジウム・ヨエリのＭＳＰ−１に対するＴ細胞応答は、肝臓段階の原虫に対しても防御的でありうる１９。こうして、ＭＳＰ−１は、ワクチンに誘導される多段階免疫の標的となる。
【００１０】
血液段階におけるマラリアワクチンの開発は、従来、アジュバント含有組み換えタンパク質製剤に焦点が絞られてきた。これらは、動物モデルにおける多数回の免疫感作により防御的な規模の抗体応答を誘導する必要があり、こうしたワクチン候補物質の臨床試験は、不本意なものにとどまる４。組み換えタンパク質ワクチンは、ｉ）正確にフォールディングされた大量のタンパク質を確実に精製すること、及びｉｉ）ヒトに適合する有効なアジュバント中における調合という固有の困難を障害としている。細胞内病原体を標的とするＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導するために、異種初回刺激−追加免疫レジメンにおいて投入されるウイルスワクチンベクターが開発されている２１。これらは上記で概括した困難を回避し、大型抗原構築物のより大きな発現能力を有する。ＭＶＡ２２などの複製欠損型ポックスウイルス、又はより近年では、ＡｄＨｕ５２３などのアデノウイルスが、予防用ワクチンとしてのヒトにおける使用に適する安全性プロファイルを示し、マウスモデルにおける前赤内マラリアに対する優れた有効性を示している２４、２５。抗体応答と合わせた強力な細胞性免疫応答の誘導が、血液段階におけるマラリアワクチンの有効性を増強しうる１つの戦略である。
【００１１】
補体タンパク質であるＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）は、補体経路に対する循環可溶性の阻害剤である２６。国際公開２００５／０１４６５４号パンフレットでは、マウスＣ４ｂｐ α鎖（ｍＣ４ｂｐ）のコアドメインが、病原体抗原に融合すると抗体応答を増強しうる分子アジュバントとして説明されている。この文献では、ｍＣ４ｂｐに融合した組み換えプラスモジウム・ヨエリのＭＳＰ−１１９が、生理食塩液中で投与されると高度に免疫原性であり、フロイントアジュバントにより抗原が注射される場合よりもはるかに高レベルでマウスにおける防御的な規模の抗体を誘導したことが開示されている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ウイルスベクターを含む免疫原性組成物及びワクチンに対するＴ細胞応答が、Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸配列の、対象とする抗原をコードする免疫原性ベクター内への封入により増強されうるという新規な予測外の知見に基づく。
【００１３】
先行技術では、マウスＣ４ｂｐコアドメインの単量体抗原との融合体について説明され、これらにより強力な抗体応答が引き起こされることが示されている。
【００１４】
本発明で見られる、免疫原性のウイルス組成物及びワクチンに対するＣＤ４ Ｔ細胞応答及びＣＤ８ Ｔ細胞応答両者の著明な増大は、Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を用いる抗体応答についての先行研究では予測しえないものであった。実際、抗体応答を増強しうるもののＣＤ８ Ｔ細胞応答を増大させないアジュバントは、例えば、アラム（Ａｌｕｍ）、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、ＭＦ５９など、極めて多く存在する。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様では、Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸とを含むウイルスベクターを含む免疫原性組成物が提供される。
【００１６】
核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましい。
【００１７】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸は、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにあることが好ましい。
【００１８】
Ｃ４ｂｐドメインを哺乳動物又は非哺乳動物のＣ４ｂｐタンパク質又はその断片から誘導しうることは明らかであろう。
【００１９】
本発明がＣ４ｂｐコアタンパク質の誘導体をコードする核酸の使用を含みうることも、さらに明らかであろう。こうした誘導体は、本明細書で説明されるＴ細胞増強特性の維持に従う、アミノ酸の欠失、付加、とりわけ、システイン残基の付加、若しくは置換、Ｃ４ｂｐファミリーの異なるメンバーの部分の融合により形成されるハイブリッド体若しくはキメラ分子、及び／又は円順列タンパク質骨格を含有しうるその変異体を含む。
【００２０】
本発明ではまた、複数の種に由来するＣ４ｂｐコア配列のアラインメントに基づく、人工的なＣ４ｂｐコンセンサス配列を用いることもできる。このクラスの極めて多数の可能なキメラ分子の１つの例を以下の図６ａに示す。
【００２１】
特に好ましい実施形態において、本発明の製品のＣ４ｂｐ成分をコードする核酸は、Ｃ４ｂｐアルファ鎖のコアタンパク質をコードする。こうした実施形態において、Ｃ４ｂｐコアタンパク質をコードする核酸は、図６ａで示されるヒトＣ４ｂｐからなるペプチド若しくはそのホモログの対応する残基、又はヒトＣ４ｂｐの少なくとも４７アミノ酸からなる断片若しくはそのホモログをコードする核酸をコードする。
【００２２】
当技術分野では、多数の哺乳動物Ｃ４ｂｐタンパク質のペプチド配列を使用できる。これらは、ヒトＣ４ｂｐコアタンパク質を含む。当技術分野では、多数のヒトＣ４ｂｐコアタンパク質ホモログも使用できる。２種類のホモログ：オルソログ及びパラログが存在する。オルソログとは、異なる生物中における相同遺伝子として定義される、すなわち、オルソログ遺伝子は、それを発生させた種形成事象と同時に生じた共通の祖先を共有する。パラログとは、遺伝子重複、染色体重複、又はゲノム重複に由来する、同一の生物中における相同遺伝子として定義される、すなわち、パラログ遺伝子の共通の祖先は、最後の種形成事象以後に生じた。
【００２３】
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及び生ゲノムトレース（ｒａｗ ｇｅｎｏｍｉｃ ｔｒａｃｅ）及びＥＳＴ（発現配列タグ）データベースの検索により、チンパンジー、アカゲザル、ウサギ、ラット、イヌ、ウマ、マウス、モルモット、ブタ、及び畜牛を含む種における、哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質ホモログが示される。ヒトＣ４ｂｐのパラログ及びオルソログは、図６ａのアラインメント中に含まれていることが示唆される。
【００２４】
全１９種類の配列は、Ｃ末端において大きなばらつきを伴うが、高度の類似性を有する。さらなるＣ４ｂｐコアタンパク質は、ＢＬＡＳＴなど市販の検索プログラムを用いて、ＤＮＡ配列又はタンパク質配列のデータベースを検索することにより同定することができる。
【００２５】
所望の哺乳動物供給源に由来するＣ４ｂｐタンパク質をコードする核酸がデータベース中で得ることができない場合は、当技術分野で十分に確立された通常のクローニング法を用いてそれを得ることができる。基本的に、こうした技法は、対象とする他の種に由来するＣ４ｂｐドメインの配列を回収及び決定するプローブとして使用できるＣ４ｂｐコアタンパク質の１つをコードする核酸を用いるステップを含む。例えば、ゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの適切な供給源（例えば、胚又は活発に分裂する分化細胞又は腫瘍細胞に由来する）を用いるＰＣＲ増幅法及び遺伝子クローニング法、又は哺乳動物に由来するｃＤＮＡライブラリー、例えば、上述の供給源の１つに由来するｃＤＮＡライブラリーを得るステップと、高度な厳密性に従う培地条件（例えば、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）下で既知のＣ４ｂｐ核酸により前記ライブラリーをプローブするステップと、該哺乳動物のＣ４ｂｐタンパク質の全て若しくは一部をコードするｃＤＮＡを回収するステップとを含む方法によるなど、多種多様な技法がこの目的に使用できる。部分的なｃＤＮＡが得られると、プライマー伸長法により、配列をコードする全長を決定することができる。
【００２６】
Ｃ４ｂｐコアタンパク質の変異体及びその断片をコードする核酸を用いることもできる。変異体は、野生型の哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質又はその断片のアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００２７】
一態様において、Ｃ４ｂｐコアタンパク質は、図６ａで示されるヒトＣ４ｂｐの位置１２に現れるグリシン、位置２８に現れるアラニン、位置２９、３４、３６、及び４１に現れるロイシン、並びに位置３２に現れるチロシン、並びに位置３３に現れるリシン、並びに好ましくは位置６及び１８に現れる２つのシステイン残基を含むコアタンパク質である。変異体は、これらの残基間の相対的な間隔を保持することが望ましい。
【００２８】
上記で指定された同一性の程度は、図６ａで示される配列の任意の１つに対するものである。
【００２９】
配列同一性の程度は、当技術分野で広く用いられ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社（ウィスコンシン州、マジソン、以前のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社）から市販されるアルゴリズムの「ウィスコンシンパッケージ」の一部であるＧＡＰアルゴリズムにより決定することができる。ＧＡＰでは、ニードルマン及びブンシュによるアルゴリズムを用いて、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する形で２つの完全な配列を整列する。ＧＡＰは、類似の長さで密接に関連する短い配列のアラインメントに有用であり、したがって、配列が上述の同一性レベルを満たすかどうかを判定するのに適する。ＧＡＰは、デフォルトのパラメータで用いることができる。
【００３０】
哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質の合成変異体をコードする核酸は、該Ｃ末端又はＮ末端に対する１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入若しくは付加を伴う変異体を含む。置換を特に想定する。置換は保存的置換を含む。保存的置換の例は、デイホフ群としばしば呼ばれる類似のアミノ酸群に関する保存的置換を含む。これらは以下の通りである。
【００３１】
【表１】
【００３２】
Ｎ末端切断又はＣ末端切断以外で配列の欠失を行う場合は、近接してもしなくてもよい１箇所、２箇所、又は３箇所以下の欠失をコードする配列に限定することが好ましい。
【００３３】
挿入又はコアタンパク質配列へのＮ末端伸長若しくはＣ末端伸長を行う場合、コアタンパク質のサイズが野生型配列の長さを、２０アミノ酸を上回らない、好ましくは１５アミノ酸を上回らない、より好ましくは１０アミノ酸を上回らないように数を限定することが望ましい。こうして、ヒトＣ４ｂｐの場合、コアタンパク質をコードする核酸は、挿入又は伸長により改変される場合、全長７７アミノ酸以下のペプチドをコードすることが望ましい。
【００３４】
さらに好ましい実施形態において、Ｃ４ｂｐドメインは、図７で示される配列によりコードされるマウスドメインである。
【００３５】
異なる種に対しては、異なるｃ４ｂｐ配列が適切でありうることは明らかであろう。本発明は、図６又は他の任意のＣ４ｂｐドメインで示される任意のＣ４ｂｐドメインをコードするＤＮＡを含むウイルスベクターを含むことが理解されるであろう。
【００３６】
組成物は、ワクチン組成物でありうる。ワクチン組成物はヒト投与に適し、これを用いて、コードされる抗原に対する防御的免疫応答を引き起こしうることが好ましい。
【００３７】
特に好ましい実施形態において、ワクチンがヒト用である場合、核酸配列は、図６ｂで示される変異Ｃ４ｂｐドメインをコードする。これらのＣ４ｂｐ変異体により、天然Ｃ４ｂｐドメインを用いることによる問題、すなわち、天然に存在する血漿タンパク質断片と同一であるＣ４ｂｐの使用により、ウイルスベクターがコードする組み換えタンパク質中のＣ４ｂｐドメインに対する反応が結果として生じうるだけでなく、内因性の血漿Ｃ４ｂｐタンパク質に対する望ましくない反応もまた誘導されるという問題が克服される。
【００３８】
図６ｂで示される変異体１は、Ｏｓｈｉｕｍｉら（２００５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１７５巻、１７２４〜１７３４頁）の成果に由来する。彼らは、ニワトリにおける補体活性化遺伝子座の調節物質を特徴づけ、彼らがＣＲＥＭ、ＣＲＥＧ、及びＣＲＥＳと呼ぶ３種類のタンパク質を同定した。各遺伝子に由来する転写産物を特徴づけることで、全タンパク質配列の推定が可能となった。これらのタンパク質の１つであるＣＲＥＳタンパク質は、ニワトリＣ４ｂｐ遺伝子として説明され、変異体１のＤＮＡ配列は、このタンパク質をコードするｃＤＮＡから誘導された。
【００３９】
コードされるＣ４ｂｐドメインと対象とする抗原とは、融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００４０】
ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択されることが好ましい。ウイルスベクターは、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターであることがより好ましい。ベクターは、ＭＶＡ又はＡｄＨｕ５であることがさらにより好ましい。
【００４１】
抗原が外因性又は内因性の任意の対象とする抗原でありうることは明らかであろう。外因性抗原は、感染性生物中で見出される全ての分子を含む。例えば、細菌免疫原、寄生虫免疫原、及びウイルス免疫原を含む。
【００４２】
これらの免疫原の細菌による供給源は、細菌性肺炎、髄膜炎、コレラ、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、及びハンセン病の原因となる供給源を含む。
【００４３】
寄生虫による供給源は、プラスモジウム属などのマラリア原虫のほか、トリパノソーマ種及びリーシュマニア種も含む。
【００４４】
ウイルスによる供給源は、ポックスウイルス、例えば、天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、及び伝染性嚢胞性皮膚炎ウイルス；ヘルペスウイルス、例えば、１型及び２型単純ヘルペスウイルス、Ｂウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、及びエプスタイン−バーウイルス；アデノウイルス、例えば、マストアデノウイルス；パポーバウイルス、例えば、ＨＰＶ１６ウイルスなどのパピローマウイルス、及びＢＫウイルス及びＪＣウイルスなどのポリオーマウイルス；パルボウイルス、例えば、アデノ関連ウイルス；レオウイルス、例えば、１型、２型、及び３型レオウイルス；オルビウイルス、例えば、コロラドダニ熱ウイルス；ロタウイルス、例えば、ヒトロタウイルス；アルファウイルス、例えば、東部ウマ脳炎ウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス；ルビウイルス、例えば、風疹ウイルス；フラビウイルス、例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルス；コロナウイルス、例えば、ヒトコロナウイルス；パラミクソウイルス、例えば、１型、２型、３型、及び４型パラインフルエンザウイルス、並びに流行性耳下腺炎ウイルス；モルビリウイルス、例えば、麻疹ウイルス；肺炎ウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス；ベジクロウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルス；リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス；オルトミクソウイルス、例えば、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス；ブンヤウイルス、例えば、ラクロスウイルス；フレボウイルス、例えば、リフトバレー熱ウイルス；ナイロウイルス、例えば、コンゴ出血熱ウイルス；ヘパドナウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス；アレナウイルス、例えば、ｌｃｍウイルス、ラッサウイルス、及びフニンウイルス；レトロウイルス、例えば、ＨＴＬＶ Ｉウイルス、ＨＴＬＶ ＩＩウイルス、ＨＩＶ−１ウイルス、及びＨＩＶ−２ウイルス；エンテロウイルス、例えば、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、及び３型ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、及びノーウォークウイルス；ライノウイルス、例えば、ヒトライノウイルス；並びにフィロウイルス、例えば、マールブルグ（病）ウイルス及びエボラウイルスを含む。
【００４５】
これらの細菌、ウイルス、及び寄生虫供給源由来の抗原は、通常宿主内には存在せず、宿主ゲノム中ではコードされないので、外因性抗原と考えることができる。
【００４６】
これに対し、内因性抗原は通常、宿主内に存在するか若しくは宿主ゲノム中でコードされるか、又はその両方である。内因性抗原に対する免疫応答を発生させる能力は、該抗原を保有する腫瘍を治療するステップ、又は該腫瘍に対する成長因子を中和化するステップにおいて有用である。内因性抗原の第１の種類の例は、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）と呼ばれるモノクローナル抗体の標的であるＨＥＲ２である。成長因子である第２の種類の内因性抗原の例は、一部の前立腺腫瘍に対して栄養作用を及ぼすゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨと呼ばれる）である。
【００４７】
本発明により形成される免疫原性組成物又はワクチンを用いて、複数の疾患に対する同時のワクチン接種を行うこともでき、又は所与の病原体上における複数のエピトープを同時に標的とすることもできる。
【００４８】
好ましい一実施形態において、抗原はマラリア抗原である。抗原は、熱帯熱マラリア原虫抗原であることが好ましい。抗原は、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１、若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１であることがより好ましい。抗原は、血液段階のマラリア抗原であることが最も好ましい。
【００４９】
上記の免疫原性組成物又はワクチンが、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などの薬学的に許容される適切な媒体又は担体と共に、医薬剤形に調合されうることは、当業者に明らかであろう。剤形は、ｐＨ、浸透圧、味、粘稠度、無菌性、親油性、可溶性などの条件を改変する、薬学的に許容される他の賦形剤を含有する場合もあり、また、薬学的に許容されるアジュバントを含有する場合もある。
【００５０】
適切な剤形は、固体剤形、例えば、徐放製剤及び遅延放出製剤を含む、錠剤、カプセル、粉末、分散性顆粒、小袋、及び坐剤を含む。粉末及び錠剤は、一般に、約５％〜約７０％の有効成分を含む。適切な固体担体及び固体賦形剤は、一般に当技術分野で知られ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、ラクトースなどを含む。錠剤、粉末、小袋、及びカプセルは全て、経口投与に適する剤形である。
【００５１】
液体剤形は、溶液、懸濁液、及び乳剤を含む。液体形態製剤は、静脈内、脳内、腹腔内、非経口、又は筋肉内の注射又は注入により投与することができる。無菌の注射用製剤は、非毒性で薬学的に許容される希釈剤又は溶媒中に活性作用物質の無菌の溶液又は懸濁液を含みうる。適切な希釈剤及び溶媒は、滅菌水、リンゲル液、及び等張性の塩化ナトリウム溶液などを含む。液体剤形はまた、鼻腔内投与用の溶液又はスプレーも含む。
【００５２】
吸入に適するエアゾール製剤は、不活性圧縮ガスなどの薬学的に許容される担体と組み合わせうる溶液及び粉末形態の固体を含みうる。
【００５３】
クリーム、ローション、エアゾール、及び／又は乳剤を含む経皮投与用剤形もまた包含される。これらの剤形は、当技術分野で一般に知られる、マトリックス又はリザーバー型の経皮パッチ中にも封入することができる。
【００５４】
医薬製剤は、医薬製剤の標準的な手順により、単位用量形態で調製することが好都合である場合がある。単位用量当たりの活性化合物量は、活性化合物の性質及び意図される投与レジメンによって変化しうる。
【００５５】
活性作用物質は、患者において医学的に望ましい結果をもたらすのに十分な用量を意味するものと理解される「治療的有効量」でヒト対象に投与するものとする。治療的有効量の活性作用物質の正確な投与用量及び投与回数は、活性物質の性質、投与剤形、及び投与経路などの因子に応じて変化する。
【００５６】
本発明の薬剤及び医薬組成物は、全身投与又は局所投与することができる。これは、本発明の使用態様及び方法態様のいずれに対しても同様に適用可能である。全身投与は、任意の既知の全身投与形態、例えば、経口、静脈内、又は腹腔内投与でありうる。局所投与は、任意の既知の局所投与形態、例えば、外用投与でありうる。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００５８】
本発明の第２の態様では、
ａ）第１のウイルスベクターを含む初回刺激組成物であって、前記ウイルスベクターがＣ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片と、少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む初回刺激組成物と、
ｂ）第２のウイルスベクターを含む追加免疫組成物であって、前記第２のウイルスベクターが前記第１のウイルスベクターとは異なり、Ｃ４ｂｐドメインと、初回刺激組成物の病原体又は腫瘍抗原と同じである少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む追加免疫組成物と
を含む製品、組み合わせ、又はキットが提供される。
【００５９】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸は、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにあることが好ましい。
【００６０】
Ｃ４ｂｐドメインは、図６で示されるドメインの１つであることが好ましい。
【００６１】
Ｃ４ｂｐドメインは、図７で示される配列によりコードされることが好ましい。
【００６２】
Ｃ４ｂｐドメイン及び対象とする抗原は、融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００６３】
各ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択されることが好ましい。
【００６４】
前記第１のウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることが好ましい。ＡｄＨｕ５であることがより好ましい。
【００６５】
前記第２のウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターであることが好ましい。ＭＶＡであることがより好ましい。
【００６６】
対象とする抗原が第１の態様との関連で説明される任意の適切な抗原でありうることは、当業者には明らかであろう。
【００６７】
好ましい一実施形態において、抗原はマラリア抗原である。抗原は、熱帯熱マラリア原虫抗原であることが好ましい。抗原は、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１、若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１であることがさらに好ましい。抗原は、血液段階のマラリア抗原であることが最も好ましい。
【００６８】
病原体又は腫瘍の少なくとも１種の標的抗原に対する防御的なＴ細胞応答を対象において発生させるキットを作製するための製品、組み合わせ、又はキットの使用もまた提供される。
【００６９】
対象が任意の動物対象でありうることは、明らかであろう。特に好ましい実施形態において、これは、ヒトを含む哺乳動物対象でありうる。代替的な実施形態において、対象は鳥類対象でありうる。
【００７０】
本発明の第３の態様では、Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸とを含むウイルスベクターが提供される。
【００７１】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸は、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにあることが好ましい。
【００７２】
Ｃ４ｂｐドメインは、図６で示されるドメインの１つであることが好ましい。
【００７３】
Ｃ４ｂｐドメインは、図７で示される配列によりコードされることが好ましい。
【００７４】
Ｃ４ｂｐドメイン及び対象とする抗原は、融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００７５】
ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択されることが好ましい。ウイルスベクターは、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターであることがより好ましい。ベクターは、ＭＶＡ又はＡｄＨｕ５であることがさらにより好ましい。
【００７６】
対象とする抗原が第１の態様との関連で説明される任意の適切な抗原でありうることは、当業者には明らかであろう。
【００７７】
好ましい一実施形態において、抗原はマラリア抗原である。抗原は、熱帯熱マラリア原虫抗原であることが好ましい。抗原は、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１、若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１であることがさらに好ましい。抗原は、血液段階のマラリア抗原であることが最も好ましい。
【００７８】
本発明の第４の態様では、ワクチンとして用いられる第３の態様によるウイルスベクターが提供される。
【００７９】
本発明の第５の態様では、マラリアの予防又は治療用のワクチンの製造における第３の態様によるベクターの使用が提供される。
【００８０】
第６の態様では、マラリアの予防又は治療において用いられる第３の態様によるベクターが提供される。
【００８１】
本発明の第７の態様では、本発明の第１の態様による少なくとも１種の有効量の免疫原性組成物又はワクチンを投与することにより、対象を免疫感作する方法が提供される。
【００８２】
抗原に応じて、予防又は免疫療法の目的で対象を免疫感作しうることは明らかであろう。
【００８３】
好ましい実施形態では、第１の態様による少なくとも２種の免疫原性組成物又はワクチンが提供され、第１の態様による第２の免疫原性組成物又はワクチンが第１の態様による第１の免疫原性組成物又はワクチンの後で投与される、異種初回刺激−追加免疫レジメンを用いて対象を免疫感作する。
【００８４】
当業者は、異種初回刺激−追加免疫が、本発明による免疫原性組成物又はワクチンの第１の単位用量が第１の時点において個体に投与され、その後、本発明による免疫原性組成物又はワクチンの第２の単位用量が第２の時点において投与されるレジメンを指すことを理解するであろう。異種初回刺激−追加免疫レジメンにおいて、第１の単位用量における免疫原性組成物又はワクチンを形成するウイルスベクターと、第２の単位用量における免疫原性組成物又はワクチンを形成するウイルスベクターとは異なることが理解されるであろう。
【００８５】
第１の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンは、アデノウイルスベクターを含むことが好ましい。ＡｄＨｕ５であることがより好ましい。
【００８６】
前出の任意の態様による多くの適用では、アデノウイルスベクターが複製欠損である（これは、ウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子の機能的な欠失又は完全な除去のために複製が不可能とされていることを意味する）ことが好ましいことがさらに理解されるであろう。例を目的として述べると、本発明のベクターは、Ｅ１遺伝子の全て又は一部の除去によって、また場合によって、Ｅ３領域及び／又はＥ４領域の全て又は一部の除去によっても複製欠損とすることができる。
【００８７】
第２の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンは、ポックスウイルスベクターを含むことが好ましい。ＭＶＡであることがより好ましい。
【００８８】
第１の単位用量の投与と第２の単位用量の投与との間の期間は、２〜８週間であることが好ましい。
【００８９】
本発明で用いられる対象という用語が、任意の動物対象に関することは、当業者には容易に明らかであろう。これは、特に、ヒトを含む哺乳動物対象でありうる。
【００９０】
こうして、本発明の製品は、ヒト用だけでなく、獣医学用、例えば、家畜動物（例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ）及び愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、げっ歯動物）を含む飼育哺乳動物の治療、又は動物園で捕獲されている動物などの野生哺乳動物の治療においても有用でありうる。
【００９１】
別の態様において、本発明の製品は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウなどの鳥類を含む非哺乳動物対象の治療にも用いることができる。
【００９２】
単独で又は初回刺激−追加免疫レジメンを用いて、本発明の任意の態様による免疫原性組成物又はワクチンで対象を免疫感作すると、Ｃ４ｂｐドメインを含まない免疫原性組成物又はワクチンでの対象の免疫感作と比べて、抗原に対するＴ細胞応答の増強がもたらされることが理解されるであろう。
【００９３】
本発明を以下の図面及び実施例を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対してＡｄＭ４２ワクチンにより誘導される免疫応答及び防御が、初回刺激−追加免疫間隔に依存することを示す図である。（ａ）Ａｄ４２によりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、ＥＬＩＳＡ法によりＭＳＰ−１１９に対する血清全ＩｇＧ抗体応答を経時的に測定した。（ｂ）Ａｄ４２によりマウスを初回刺激し、Ｍ４２により２週間後又は８週間後に追加免疫した。追加免疫の１４日後において、ＥＬＩＳＡ法によりＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する血清全ＩｇＧ抗体応答を測定した。（ｃ）ＩＣＳ法により、ＭＳＰ−１３３ ＯＬＰによる再刺激後におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を脾臓内において評価した。各時点について、応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊＊＊ｐ≦０．００１により、（ａ）では時点間、又は（ｂ）では２群間の応答を比較する。２つ又は３つの独立した実験で、同様の結果が得られた。追加免疫の１４日後において、１０４個のプラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣにより、（ｄ）免疫未感作対照マウス、（ｅ）ＡｄＭ４２（２週間）免疫感作マウス、又は（ｆ）ＡｄＭ４２（８週間）免疫感作マウスを感作した。説明される通り、感作後第２日から寄生虫血を測定した。代表的な結果を示す（群当たりｎ＝６のマウス）。全ての反復実験を含む生存百分率を角カッコ内に示す（表１ａを参照されたい）。
【図２】血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対してＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐワクチンにより誘導される免疫応答及び防御を示す図である。８週間の初回刺激−追加免疫間隔を用いて、ＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。追加免疫の１４日後において、ＥＬＩＳＡ法により（ａ）ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する血清全ＩｇＧ抗体応答、又は（ｂ）ＭＳＰ−１１９に対するＩｇＧアイソタイプ応答を測定した。（ｃ）前出の通り、ＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を脾臓内において評価した。各アッセイ時点について、応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１により、２群間の応答を比較する。２つ又は３つの独立した実験で、同様の結果が得られた。（ｄ）前出の通り、１０４個のプラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣにより、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ免疫感作マウスを感作した。代表的な結果を示す（群当たりｎ＝６のマウス）。全ての反復実験を含む生存百分率を角カッコ内に示す（表１ｂを参照されたい）。
【図３】プラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣによる感作に対する防御が、ワクチンにより誘導されるＭＳＰ−１１９特異的なＩｇＧ２ａレベルと相関することを示す図である。ＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、５×１０７ｐｆｕ又は１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫した。追加免疫の１４日後において、ＥＬＩＳＡ法により（ａ）ＭＳＰ−１１９に対する血清全ＩｇＧ抗体応答、又は（ｂ）ＭＳＰ−１１９に対するＩｇＧ２ａ応答を測定した。応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１により、（ａ）において同じワクチンを投与される２群間の応答を比較するか、又は（ｂ）における全ての群間を比較する。２つの独立した実験で、同様の結果が得られた。前出の通り、１０４個のプラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣにより、（ｃ）ＡｄＭ４２又は（ｄ）ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐにより免疫感作され、１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫されたマウスを感作した。代表的な結果を示す（群当たりｎ＝５又は６のマウス）。生存百分率を角カッコ内に示す（表１ｄを参照されたい）。
【図４】ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作が、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトによる感作及び肝臓段階における赤外型に対する防御を可能とすることを示す図である。（ａ）ＡｄＭ４２又は（ｂ）ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、５×１０７ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫し、追加免疫の１４日後において、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５０匹により感作した（群当たりｎ＝６のマウス）。生存百分率を角カッコ内に示す（表１ｅを参照されたい）。（ｃ）ＡｄＭ４２又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５，０００匹により感作した。４８時間後に肝臓を回収し、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により肝臓段階の原虫負荷量を評価し、マウスＧＡＰＤＨのコピー数に対して標準化したプラスモジウム・ヨエリ１８Ｓ ｒＲＮＡのコピー数比として表わす。
【図５】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡｄＭ４２及びＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作の免疫原性及び防御効果を示す図である。ＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりマウスを免疫感作した。追加免疫の１４日後において、免疫応答を評価した。（ａ）ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する血清全ＩｇＧ抗体応答。（ｂ）ＩＣＳ法により、ＭＳＰ−１３３ ＯＬＰ若しくはＭＳＰ−１１９ ＯＬＰによる再刺激後におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を、脾臓内において評価した。各応答について、応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊＊＊ｐ≦０．００１により、２群間の応答を比較する。（ｃ）マウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５，０００匹により感作した。前出の通り、４８時間後に肝臓段階の原虫負荷量を評価した。比の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ＝５のマウス）。＊ｐ≦０．０５により、全ての群間を比較する。
【図６ａ】様々な各哺乳動物種に由来するＣ４ｂｐドメインのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図６ｂ】２種類の変異Ｃ４ｂｐドメインのＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
【図７】マウスＣ４ｂｐドメインのＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
【実施例】
【００９５】
材料と方法
ＭＳＰ−１４２を発現する組み換えＭＶＡワクチン及び組み換えＡｄＨｕ５ワクチンの作製
プラスモジウム・ヨエリＹＭ ＭＳＰ−１４２（アミノ酸（ａａ）１３９４〜１７５７）は、Ａ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｒ博士（英国、ＮＩＭＲ）からの寄贈物であるλｐｙＭ４．３プラスミド２７に由来する４２Ｆ順行プライマー５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＴ−３’及び４２Ｒ逆行プライマー５’−ＧＣＡ ＴＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＧＴＴ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＣＡ ＧＡＡ ＴＡＣ−３’を用い、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ）（Ｒｏｃｈｅ社製）により増幅した。プライマーは、５’側におけるＳａｌ Ｉ並びに３’側におけるＢａｍＨ Ｉ及びＳｐｈ Ｉの制限部位と、ＴＧＡ終止コドンとを含んだ。４２Ｒはまた、Ｃ末端側の抗ＰＫモノクローナル抗体認識配列であるＩＰＮＰＬＬＧＬＤもコードする。ＭＳＰ−１のＣ末端側におけるＧＰＩアンカーシグナル配列（アミノ酸１７５８〜１７７３）は除外した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）中にライゲーションし、配列解析により検証した（ドイツ、エーベルスベルク、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）。ＰＣＲ法により、順行プライマー５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＣＡＣ Ｃ−３’及び逆行プライマー５’−ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＴＧ Ｇ−３’を用いて、プラスミド鋳型２８から、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のリーダー配列を増幅した。プライマーは、５’側におけるＢａｍＨ Ｉ及び３’側におけるＸｈｏ Ｉの制限部位のほか、コザック配列（下線部）を含んだ。上記の通りに、遺伝子産物をクローニングし配列決定した。Ｓａｌ Ｉ−ＭＳＰ−１４２−ＰＫ−Ｓｐｈ Ｉ構築物をｔＰＡベクター内にクローニングし、Ｎ末端側のリーダー配列によるインフレーム融合体を創出した。
【００９６】
こうして２つのＢａｍＨ Ｉ部位間に包含される構築物全体を、ＭＶＡシャトルベクターであるｐＭＶＡ．ＧＦＰのＢｇｌ ＩＩ部位にクローニングした。ｐＭＶＡ．ＧＦＰ．ＭＳＰ−１４２というこのベクターは、ワクシニアウイルスｐ７．５初期／後期プロモーターを用いて抗原発現を駆動し、鶏痘ウイルス後期プロモーターであるＦＰ４ｂによりＧＦＰの発現を駆動する。初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ、ＳＰＦグレード）に、ＭＶＡのＴＫ遺伝子座に組み込まれた、ワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターにより駆動される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するＭＶＡ．Ｒｅｄを感染させる。次いで、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（英国、ペイズリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、感染した細胞に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで直鎖化した２μｇのｐＭＶＡ．ＧＦＰ．ＭＳＰ−１４２をトランスフェクトした。蛍光活性化細胞選別装置を用いて、ＧＦＰを発現する組み換え体を感染させたＣＥＦ（相同組み換えに従い、ＴＫ遺伝子座におけるＲＦＰがＭＳＰ−１４２及びＧＦＰにより置換された）を、ＭＶＡ−ＲＦＰを感染させたＣＥＦから濃縮した。蛍光顕微鏡法により可視化されるＧＦＰマーカーを用いて、ＣＥＦ中におけるプラークピッキングの反復により、純粋な組み換えウイルスを単離した。
【００９７】
組み換えＡｄＨｕ５ワクチンは、ビラパワー（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ）アデノウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて構築した。ＤＮＡによるワクチンベクターｐＳＧ２２９に由来する１．９ｋｂｐのＣＭＶプロモーター（調節エレメント、エンハンサー、及びイントロンＡを伴う）、ポリリンカー、及びＢＧＨポリ（Ａ）転写終結配列を、ｐＥＮＴＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）エントリベクター内にクローニングした。ｐＥＮＴＲ４．ＣＭＶ−ＢＧＨのＢａｍＨ Ｉ部位にＭＳＰ−１４２構築物をクローニングした。ＬＲクロナーゼ（ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてこの構築物を、Ｅ１及びＥ３を欠失させた３６ｋｂｐのｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ ＡｄＨｕ５ゲノムベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内に組み換えた。Ｐａｃ Ｉによりベクターを直鎖化し、反転した末端反復配列を露出させ、２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内にトランスフェクトした。製造元の指示書に従い、純粋な組み換えＡｄＨｕ５ウイルスを増殖させた。組み換えアデノウイルスは、アデノピュア（Ａｄｅｎｏｐｕｒｅ）キット（米国、ペンシルベニア州、マルバーン、ＰｕｒｅＳｙｎ社製）を用いて精製した。純粋なウイルスをアリコートに分け、−８０℃で保管した。ＵＶ分光光度計を用いてウイルスストック（水中で１：１００に希釈）の２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、式：
Ａｂｓ２６０×１０１２×希釈倍率＝ｖｐ／ｍＬ
を用いてウイルス粒子（ｖｐ）カウントを計算した。
【００９８】
ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現する組み換えＭＶＡワクチン及び組み換えＡｄＨｕ５ワクチンの作製
ＰＣＲ法により、マウスＣ４ｂｐタンパク質アルファ鎖（アミノ酸４１６〜４６９）のコアドメイン及びＴＡＡ終止コドンを、ｐＭＶＡ．ＧＦＰ．ＭＳＰ−１４２ベクター内にクローニングした。構築物を配列決定して、インフレームの融合体を確認した。もとのＭＳＰ−１４２構築物の最後の３アミノ酸（アミノ酸１７５５〜１７５７）は、Ｃ末端のＰＫエピトープ配列であるため除外した。組み換えＭＶＡ及び組み換えＡｄＨｕ５は、説明した通りに作製した。
【００９９】
動物及び免疫感作
５〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（英国、オックスフォード、ジョンラドクリフ病院、ＢＭＳＵ製）を全ての実験で用いた。全ての手順は、「（科学的手順に関する）英国動物法に基づく内務省による研究プロジェクトライセンス」の条項に従い実施された。エンドトキシンを含まないＰＢＳ中で希釈され、両耳内に投与された１０６ｐｆｕ若しくは５×１０７ｐｆｕのＭＶＡワクチン、又は５×１０１０ｖｐのＡｄＨｕ５ワクチンにより、マウスを皮内（ｉ．ｄ．）免疫感作した。
【０１００】
組み換えＧＳＴ融合タンパク質の作製
プラスモジウム・ヨエリ ＹＭ ＭＳＰ−１１９（アミノ酸１６４９〜１７５７）は、１９Ｆ順行プライマー５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＴＡ ＧＧＴ Ｇ−３’と４２Ｒ逆行プライマーとを用いて、ＰＣＲ法により上記の通りに増幅した。ＭＳＰ−１１９配列は、ＢａｍＨ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉの制限酵素消化により、ｐＧＥＭ−Ｔイージー−ＭＳＰ−１１９−ＰＫベクターから切り出した。ＥｃｏＲ Ｉにより、ＰＫタグ直前のＭＳＰ−１１９コード配列端において切断されるので好都合である。この断片をｐＧＥＸ−２Ｔ（英国、バックス、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現ベクター内にクローニングした後で、ロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞（英国、ノッティンガム、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内に形質転換した。一部の改変を伴いつつ、既に説明された１０通りにタンパク質を作製した。略述すると、０．２５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、形質転換された細菌の一晩にわたる培養物を誘導した。バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）及びベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）エンドヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、細胞を回収し溶解させ、次いで、超遠心分離した。製造元の指示書に従い、ＧＳＴバインド（ＧＳＴ・Ｂｉｎｄ）精製キット（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて透明化された抽出物から、アフィニティークロマトグラフィー法により組み換えタンパク質を精製した。組み換えＧＳＴ−ＭＳＰ−１３３及びＧＳＴ対照１０は、Ａ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｒ博士及びＩ．Ｔ．Ｌｉｎｇ博士（英国、ＮＩＭＲ）からのご厚意による寄贈物であった。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡ法
既に説明された３０通りに、尾静脈血液試料から血清を採取した。組み換えＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴ対照を、室温（ＲＴ）で一晩にわたり、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルのヌンク−イムノマキシソープ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｎｅｔｉｆｉｃ社製）に吸着させた。一部の改変を伴いつつ、既に説明された３０通りに、間接ＥＬＩＳＡ法により、抗体について血清を解析した。略述すると、０．０５％のトゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔ）によりプレートを洗浄し、室温で１時間にわたりＰＢＳ／Ｔ中に１０％のスキムミルク粉末によりブロックした。典型的には１：１００に血清を希釈し、２連ウェルに添加し、系列希釈した。室温で２時間にわたるインキュベーションの後、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス全ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、又はビオチン抱合ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に続き、アイソタイプ解析用のエクストラビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ）アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ社製）とのインキュベーションを用いて、結合した抗体を検出した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ社製）を添加することにより、プレートを成長させた。４０５ｎｍにおいて光学密度を読み取った（ＯＤ４０５）。未感作マウス血清のＯＤ４０５よりも標準偏差の３倍分大きな吸光度値（陽性血清に典型的なカットオフＯＤ４０５＝０．１５）における希釈曲線のｘ軸切片を目標力価とした。高力価の血清試料を、基準対照として全てのアッセイに含めた。
【０１０２】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）法
既に説明された２５通りに、ＩＣＳ法により、マウス脾臓細胞による特異的なＩＦＮ−γ分泌を調べた。略述すると、１０アミノ酸分重複する１５マーペプチドのプール（各ペプチドの最終濃度５μｇ／ｍＬ）により、３７℃で５時間にわたり、ゴルジプラグ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の存在下で、脾臓細胞を再刺激した。重複ペプチド（ＯＬＰ）プールは、５２ペプチドを含有するＭＳＰ−１３３（アミノ酸１３４９〜１６６３）、及び１９ペプチドを含有するＭＳＰ−１１９（アミノ酸１６５４〜１７５７）に対応した。ＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＦｃ受容体をブロックした。ＰＢＳ中で細胞を２度にわたり洗浄し、ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）標識抗ＣＤ８α抗体（クローン５３−６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、４℃で３０分間にわたり表面染色した。ＰＢＳにより細胞を２度にわたり洗浄し、次いで、１００μＬのサイトフィックス／サイトパーム（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ）液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）中、４℃で２０分間にわたり透過処理した。パーム／ウォッシュ（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ）液により細胞を２度にわたり洗浄し、次いで、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抱合抗マウスＩＦＮ−γ抗体（クローンＸＭＧ１．２、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により４℃で３０分間にわたり染色した。パーム／ウォッシュ液中で細胞を２度にわたり洗浄し、１％ホルマリンを含有する１５０μＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。ＦＡＣＳカント（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）（英国、オックスフォード、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）ソフトウェア及びフロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェアを用いて、試料を解析した。非刺激対照細胞におけるバックグラウンド応答は全て≦０．０５％であり、刺激による応答からこれらの値を減じた。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける枯渇
プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー法により、ハイブリドーマ培養物上清からｉｎ ｖｉｖｏにおける枯渇用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を精製した。抗ＣＤ４ ＧＫ１．５（ラットＩｇＧ２ａ）及び抗ＣＤ８ ２．４３（ラットＩｇＧ２ａ）を、滅菌ＰＢＳ中で希釈した。正常ラットＩｇＧ（ｎＲａｔＩｇＧ）は、Ｓｉｇｍａ社から購入し、同じ方法で精製した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇又はＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇の場合、感作第−２日及び第−１日並びに感作日において、２００μｇの関連するｍＡｂをマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。感作後第＋７日、第＋１４日、及び第＋２１日において、同用量のｍＡｂをマウスにさらに投与した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞枯渇の程度は、枯渇マウス及び対照マウスに由来する表面染色脾臓細胞に対するフローサイトメトリー法により評価した。細胞は、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抱合抗マウスＣＤ８α抗体（クローン５３−６．７）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体（クローンＲＭ４−５）、及びＡＰＣ抱合抗マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、上記の通りに表面染色した。
【０１０４】
プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣ及びスポロゾイトによる感作
プラスモジウム・ヨエリ原虫（ＹＭ株）は、Ｇ．Ａ．Ｂｕｔｃｈｅｒ博士（英国、ロンドン、インペリアルカレッジ）のご厚意により提供され、それを凍結保存するか又はマウス中で定期的に継代した。血液段階感作の場合、マウスには１０４個の寄生赤血球（ｐＲＢＣ）を静脈内（ｉ．ｖ．）経路により感染させた。ギムザ染色された血液塗抹標本の顕微鏡検査により、感作後第２日から寄生虫血をモニターした。寄生虫血レベルは光学顕微鏡法により評価し、ｐＲＢＣ百分率として計算した。５０視野の観察において、マウスは、明らかな寄生虫血の不在下で非感染であるとみなされた。スポロゾイト感作については、感染した雌のステフェンスハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の唾液腺を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中でホモジナイズし、原虫を放出した。静脈内経路を介して５０匹のスポロゾイトによりマウスを感作し、上記の通りに、第５日から血液段階の寄生虫血をモニターした。
【０１０５】
肝臓におけるプラスモジウム・ヨエリ原虫負荷量の定量
上記の通りに、５，０００匹のスポロゾイトによりマウスを感作した。４８時間後に肝臓を回収し、液体窒素中で瞬時凍結させた。８ｍＬのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で全肝臓をホモジナイズした。既に説明された通り３１に、クロロホルムを用いて全肝臓ＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量した。ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により４０μｇのＲＮＡを消化し、ＲＮイージーミネリュートクリーンアップ（ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ）キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ）プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、オリゴ−ｄＴ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ）、及びＲＮアージンプラス（ＲＮａｓｉｎ Ｐｌｕｓ）阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、２μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ローター−ジーン３０００（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００）（オーストラリア、シドニー、Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いる定量的リアルタイムＰＣＲ法により、３連で、プラスモジウム・ヨエリ１８Ｓ ｒＲＮＡ又はマウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｍＧＡＰＤＨ）をコードするｃＤＮＡを増幅した。２０ピコモルの特異的プライマー対のいずれか（ＰｙＦ ５’−ＧＧＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＧＣ Ｇ−３’及びＰｙＲ ５’−ＡＡＧ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＴＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＡＴ−３’；ｍＧＦ ５’−ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＣ−３’及びｍＧＲ ５’−ＧＧＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＧＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＡ−３’）を、ｄｓＤＮＡ特異的蛍光染料であるサイバーグリーンＩ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）を含有するクォンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社製）中に含めた。反応の温度プロファイルは既に説明されている３２。関連する標的ｃＤＮＡ分子を含有するｐＧＥＭ−Ｔイージープラスミドの１０倍段階希釈液を増幅することにより作製した検量線と対比させて読み取ることにより、各ＰＣＲ法の閾値サイクル値（ＣＴ）を、ＤＮＡコピー数相当値に変換した。各試料について、肝臓段階の原虫負荷量を、プラスモジウム・ヨエリ１８Ｓ ｒＲＮＡについて測定されたＤＮＡコピー数相当値の、ｍＧＡＰＤＨの場合のＤＮＡ相当値に対する比として決定した。
【０１０６】
統計学的解析
グラフパッドプリズムフォーウィンドウズバージョン４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖ４）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて、データを解析した。適切な場合は、独立試料による又は対応のあるスチューデントのｔ検定を実施して、２群間における応答の平均を比較した。適切な場合は、ボンフェローニ又はダネットの事後補正による一方向群間ＡＮＯＶＡ法を用いて、２群を超える群間における応答を比較した。全ての場合において、ｐ≦０．０５の値を有意であると考えた。
【０１０７】
結果
ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる初回刺激−追加免疫間隔の延長を用いると、血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対するワクチンに誘導される抗体応答及び防御が増強される。
複製欠損型ウイルスを用いる異種初回刺激−追加免疫感作によるＴ細胞誘導法は、依然として、ＨＩＶ２３、マラリア２１、２４、２５、及び結核３３の領域における主導的なワクチン戦略である。ＡｄＨｕ５及びＭＶＡによるワクチンはまた、抗原特異的抗体も誘導しうる３４、３５。ＡｄＨｕ５による初回刺激及びワクシニアウイルスによる追加免疫を用いる１つの研究により、初回刺激−追加免疫間隔を２週間以上から８週間以上に延長すると、スポロゾイト抗原に対する抗体応答が増強されることが報告された３６。
【０１０８】
本発明者らは、マウスマラリアプラスモジウム・ヨエリに由来するＭＳＰ−１４２を発現するＡｄＨｕ５及びＭＶＡによるワクチン（それぞれ、Ａｄ４２及びＭ４２）を調製した。５×１０１０ｖｐのＡｄ４２により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを１回皮内免疫感作し、以後５６日間にわたるＥＬＩＳＡ法により、ＭＳＰ−１１９特異的な抗体応答をモニターした。図１ａに示す通り、ＭＳＰ−１１９に対する全ＩｇＧ抗体応答は、第１４日と比較して第５６日において著明に高度であった。ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる初回刺激−追加免疫（ＡｄＭ４２）後における免疫応答を評価するため、マウスをＡｄ４２により初回刺激し、次いで、第１４日（２週間後）又は第５６日（８週間後）において５×１０７ｐｆｕのＭ４２により皮内追加免疫した。追加免疫の１４日後において、ＭＳＰ−１４２に対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答を検査した。図１ｂは、８週間の初回刺激−追加免疫レジメン後における方が、ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対して著明により高度な全ＩｇＧ応答が誘導されたことを示す。ＡｄＭ４２（８週間）レジメンの場合においてＭＳＰ−１１９に対して達成された抗体応答は、１０５を超える目標力価を示す極めて強力なものであった。ＭＳＰ−１１９に対応するＯＬＰプールによる再刺激後の脾臓Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ−γ生成は検出されなかった（データは示さない）。図１ｃは、ＭＳＰ−１３３に対する強力なＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答が測定されたことを示す。これらは、ＡｄＭ４２（８週間）群において上昇する傾向にあったが、２週間レジメンと比較して著明に高度ではなかった。図１ｃはまた、いずれの群においても、ＭＳＰ−１３３に対して比較的弱いＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答が測定されうることも示す。
【０１０９】
ＡｄＭ４２ワクチン接種の防御効果を判定するため、本明細書末尾の表１ａで示す通り、追加免疫の２週間後において、１０４個のｐＲＢＣによりマウスを静脈内感作した。図１ｄ及び１ｅは、免疫未感作対照マウス及びＡｄＭ４２（２週間）による初回刺激−追加免疫レジメンを投与されたマウスの全てが、６日間以内にプラスモジウム・ヨエリ感染に罹患したことを示す。図１ｆは、ＡｄＭ４２（８週間）レジメンにより、７６％のマウスが感作に対して防御されたことを示す。ワクチンを介する血液段階での防御は、初回刺激−追加免疫間隔の延長を用いることにより達成される、著明に高度なレベルのＭＳＰ−１４２特異的ＩｇＧと相関した。
【０１１０】
ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作は、Ｔｈ１型抗体応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答を著明に増強し、プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣによる感作に対する防御効果を改善する。
国際公開２００５／０１４６５４号パンフレットでは、ｍＣ４ｂｐ及び別の補体成分ベースの「分子アジュバント」であるＣ３ｄの使用は、組み換え融合タンパク質ワクチン３７を用いる場合に有効であり、また、プラスミドＤＮＡワクチン３８を用いる場合にも有効であることが示されている。しかし、本発明以前に、こうした構築物のウイルスワクチンベクターによる発現は説明されていない。
【０１１１】
本発明者らは、Ｃ末端においてｍＣ４ｂｐに融合したＭＳＰ−１４２を発現するＡｄＨｕ５ベクター及びＭＶＡベクターを作製した。前出の通り、８週間の初回刺激−追加免疫間隔（ＡｄＭ４２対ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス免疫感作し、免疫応答を調べた。図２ａは、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現するベクターにより免疫感作されたマウスの方が、著明により高度な抗原特異的全ＩｇＧ応答を生じたことを示す。本発明者らは、防御的なＭＳＰ−１１９ドメイン１０に対して誘導されたＩｇＧのアイソタイププロファイルに焦点を当てた。注目すべきことに、図２ｂで示す通り、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現するベクターの使用により、ＭＳＰ−１４２を発現するベクターにより免疫感作されたマウスと比較して、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３レベルの著明な上昇、並びにＩｇＧ１レベルの低下を伴う、抗原特異的ＩｇＧのＴｈ１シフトが生じた。２群間で抗体結合活性３８の差は観察されなかった（データは示さない）。図２ｃは、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐベクターにより免疫感作されたマウスでは、ＭＳＰ−１３３特異的な脾臓ＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞百分率の著明な３倍の上昇もまた見られたことを示し、これがおそらく、この群におけるＴｈ１型のＩｇＧアイソタイプレベルの上昇を説明している。図２ｃはまた、ＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞百分率も上昇する傾向にあるが、著明なレベルには達しなかったことも示す。
【０１１２】
図２ｄは、血液段階のマラリア感作後において、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンにより免疫感作された全てのマウスが防御されたことを示す。表１ｂは、ＡｄＭ４２群におけるマウス１７匹中０匹と比較して、感作されたマウス１７匹中１０匹が無菌免疫（以後３０日間にわたる明らかな寄生虫血の不在により定義される）を示したことを示す。したがって、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作は、血液段階での感作に対する完全な防御を提供するだけでなく、血液段階における寄生虫血レベルの低下により定義されるより高品質の防御もまた提供する。
【０１１３】
ｐＲＢＣ感作時におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞枯渇は、ワクチンにより誘導される防御を除去しない。
本モデルにおいてワクチンにより誘導されるＴ細胞応答の防御的寄与を評価するため、前出の通り、最も防御的なレジメン（ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ）によりマウスを免疫感作し、ｐＲＢＣによる感作前にＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を枯渇させた。フローサイトメトリー法による解析は、ｉｎ ｖｉｖｏでの枯渇が＞９９％有効であることを示した（データは示さない）。表１ｃは、Ｔ細胞枯渇が、防御効果に影響を及ぼさなかったことを示す。こうして、ＭＳＰ−１４２に対してワクチンにより誘導される抗体応答は、感作時の本モデルにおけるマウスを完全に防御するのに十分である。
【０１１４】
プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣによる感作に対する防御は、ワクチンにより誘導されるＭＳＰ−１１９特異的ＩｇＧ２ａレベルと相関する。
本発明者らは既に、ＡｄＨｕ５ワクチン用量を増量した場合の免疫感作後における抗原特異的ＩｇＧ誘導の上昇を検出していた（データ非公開）。ＭＶＡに関してこのことを探索するため、ＡｄＨｕ５によりＢＡＬＢ／ｃマウスを初回刺激し、１０６ｐｆｕ又は５×１０７ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫した。図３ａは、いずれのワクチン構築物の場合においても、より低用量のＭＶＡにより追加免疫されたマウスの方が、著明により低度のＭＳＰ−１１９特異的な全ＩｇＧ応答を生じたことを示す。しかし、ＩｇＧアイソタイプ解析後においては、異なる序列が明らかであった。図３ｂは、前出で見られた通り、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現するベクターによる免疫感作の方が、より多くのＴｈ１型ＩｇＧを誘導したことを示す。したがって、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ（１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いる）により免疫感作されたマウスにおける相対的に低度の全ＩｇＧレベルにもかかわらず、ＡｄＭ４２により免疫感作され、図３ｂで見られるいずれかの用量のＭＶＡにより追加免疫されたマウスと比較して、これらのマウスの方が、著明により高度なレベルのＩｇＧ２ａを保有していた。
【０１１５】
図３ｃは、１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫するＡｄＭ４２による免疫感作後では、プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣによる感作後に生存したマウスが４０％に過ぎなかったことを示す。しかし、図３ｄ及び表１ｄから見られる通り、より低用量のＭＶＡを用いるにもかかわらず、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群では全てのマウスが生存し、これらマウスの３分の１が無菌免疫を示した。結果として、ＭＳＰ−１４２へのｍＣ４ｂｐの融合はまた、より低いワクチン用量においても、ＡｄＭワクチン接種による防御効果の増強を維持する。全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａの平均レベル対感作された全群に対する防御百分率の解析は、生存百分率とＭＳＰ−１１９特異的なＩｇＧ２ａとの間では有意な相関（スペアマンによるｒ＝０．９２８、ｐ＝０．０１７）がみられるが、全ＩｇＧ又はＩｇＧ１については同相関がみられないことを示した。
【０１１６】
ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作は、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトによる感作及び肝臓段階における赤外型に対する防御を可能とする。
ｐＲＢＣによるマラリア感作は、蚊媒介動物によるマラリア伝染の通常経路と異なる。こうして、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトによる感作に対するＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作の有効性が探索された。
【０１１７】
前出の通り、ＡｄＭ４２又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ（５×１０７ｐｆｕのＭＶＡによる追加免疫）により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。追加免疫の２週間後において、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５０匹によりマウスを感作した。表１ｅは、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群における１匹のマウスを除いて、全てのマウスが明らかな血液段階の寄生虫血を発現したが、図４ａ〜ｂから見られる通り、これらは全て、血液段階の寄生虫増殖をコントロールし、感染を除去する能力を有した。表１ａ〜ｂ、ｅで見られる通り、ｐＲＢＣによる感作モデルにおいて観察される場合と同様に、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐにより免疫感作されたマウスは、ＡｄＭ４２により免疫感作されたマウスと比較して、［より良質の血液段階免疫による］より低度の原虫密度を示した。表１ｅは、未感作マウスが、１０４個のｐＲＢＣにより感作されたマウスと同一の形で血液段階の感染に罹患したことを示す。
【０１１８】
これらのワクチンによる血液段階における免疫の誘導を踏まえるなら、これらのデータから、スポロゾイトによる感作後の血液段階における寄生虫血の軽減がまた、部分的には肝臓段階における原虫負荷量の低下にも起因するかどうかを見分けることは不可能である。これらのワクチン接種レジメンは、ＭＳＰ−１３３に対する強力なＴ細胞応答を引き起こす（図２ｃを参照されたい）ので、これらのエフェクターＴ細胞による後期赤外シゾントに対する防御が可能でありうる１９。これに取り組むため、マウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５，０００匹により感作した。確立されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ３２を用いて、感作の４８時間後における肝臓段階の原虫負荷量を定量化したところ、図４ｃが示すように、いずれのワクチンレジメンにより免疫感作されたマウスにおいても著明な低下がみられる。これらのデータは、図４ａ及び４ｂで示される前出の感作試験と符合し、これは、肝臓段階における原虫負荷量が平均３５〜４０％低下する結果として無菌免疫がもたらされるわけではなく、したがって血液段階の感染が阻止されるわけでもないことを意味する。したがって、ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作後におけるＭＳＰ−１に対するＴ細胞応答及び抗体応答の誘導により、マラリア感染に対する多段階の防御を提供することができる。
【０１１９】
ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作は、プラスモジウム・ヨエリのＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓段階及び血液段階の原虫に対する防御を可能とする。
プラスモジウム・ヨエリの肝臓段階及び血液段階のいずれの原虫に対する防御も、遺伝子制御下にあることが報告されている４０、４１。この新規の免疫感作戦略がまた、異なる遺伝的バックグラウンドにおけるマウスも防御しうるかどうかを評価するため、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける有効性を評価した。５×１０７ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫する、同じＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりマウスを免疫感作した。免疫応答の評価により、ＢＡＬＢ／ｃマウスで見られたパターンとは異なる免疫原性パターンが示された。図５ａで示される通り、ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する全ＩｇＧ応答は、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群において著明ではないわずかな上昇を示した。ＭＳＰ−１３３特異的なＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答を脾臓において測定することができ、また、図５ｂから見られる通り、ＢＡＬＢ／ｃマウスとは異なり、ＭＳＰ−１３３及びＭＳＰ−１１９のいずれに対してもＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答を検出することができた。図５ｂはまた、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐ構築物を用いると、ＭＳＰ−１１９ではなくＭＳＰ−１３３に対するＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答が著明に増強され、ＭＳＰ−１３３に対するＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答は３倍に増強されたことも示す。表１ｆで示される通り、１０４個のｐＲＢＣによりマウス群を感作したところ、免疫感作された全てのマウスが防御され、ここでもまた、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群におけるマウスの方が、ＡｄＭ４２群と比較してより高度の防御を示した。加えて、図５ｃで示される通り、５，０００匹のスポロゾイトによる感作後のＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群において、肝臓段階の原虫負荷量の著明な低減が観察され、これは、この群におけるＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答の増強を示す図５ｂに由来する結果と相関する。これらのデータは、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作の免疫原性及び防御効果は１つの遺伝的バックグラウンドに限定されず、したがって、熱帯性マラリア原虫ＭＳＰ−１を標的とする同等の戦略が遺伝的に多様なヒト集団において有効でありうることを示す。
【０１２０】
考察
本報告では、初回刺激−追加免疫感作レジメンにおいて血液段階のマラリア、具体的には、ＭＳＰ−１４２を標的とする複製欠損型のアデノウイルス及びＭＶＡによるワクチンベクターの初めての使用について説明される。本免疫感作レジメンは、ＭＳＰ−１４２特異的な細胞性応答に対して高度に免疫原性であるだけでなく、抗体誘導に対しても驚くべき程度に免疫原性である。本発明者らは、同種初回刺激−追加免疫レジメン、又はＤＮＡ−ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＡｄＨｕ５、及びＤＮＡ−ＡｄＨｕ５など他の異種初回刺激−追加免疫レジメンと比較して、ＡｄＨｕ５−ＭＶＡが抜群に最良のレジメンであることを見出した（データは非公開）。Ａｄ４２による単回の免疫感作後、ＭＳＰ−１１９に対する抗体応答は、他の組み換えＡｄＨｕ５ワクチンについて報告される場合３５、４２と同様、２カ月間にわたり上昇し続けた。２週間後ではなく８週間後におけるＭＶＡ追加免疫の投与により抗体レベルの増強がもたらされ、こうして、血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対する防御に必要な高度に防御的な閾値に達した。他の試験において、ＡｄＨｕ５ワクチンは強力な免疫原性を示しており、この期間の延長がＢ細胞及びヘルパーＴ細胞による最適の記憶集団の形成には必要な場合があり、これがＭＶＡによってより有効に追加免疫される。ＡｄＨｕ５と複製能を有する生のワクシニアウイルスを用いてプラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト周囲タンパク質を標的とする場合に、長期のベクター間投与間隔について同様の知見が報告された３６。
【０１２１】
ｍＣ４ｂｐに融合したＭＳＰ−１４２を発現するＡｄＨｕ５−ＭＶＡベクターを用いたところ、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれにおいても、血液段階の感作に対する防御効果の増強が達成された。この構造的モチーフは、組み換えＭＳＰ−１１９に対する体液性免疫応答を補助することが示されている［国際公開２００５／０１４６５４号パンフレット］。本明細書において、本発明者らは、このモチーフがＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＳＰ−１特異的な免疫応答及びＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答を補助するだけでなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答及びＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答もまた補助する能力を有することを報告している。これが生じる機構は未知のままであるが、抗原のオリゴマー化４３、又はこのコアドメインがＣＤ４０４４又はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）４５に結合する能力を含む可能性がある。ＣＲＰが、マウスにおける急性期タンパク質として重要でないことには注意すべきであるが、後二者は、ｍＣ４ｂｐと融合した抗原を標的として抗原提示細胞上の受容体へと導くのに有効でありうる。
【０１２２】
本研究では、ＭＳＰ−１３３に対する抗体が血液段階の免疫において役割を果たすかどうかを評価しなかったが、これらは、プラスモジウム・ヨエリに対して防御的でないことが報告されている１０。ＭＳＰ−１３３又はＭＳＰ−１１９を発現するＡｄＨｕ５ベクター及びＭＶＡベクターの作製がこの問いに答えるであろう。しかしながら、ＭＳＰ−１１９特異的なＩｇＧ２ａレベルは、血液段階における免疫の増強と強く相関した。これは、プラスモジウム・ヨエリモデルにおける他の研究、例えば、ＣｐＧ４６ワクチンアジュバント又はＩＬ−１２４７ワクチンアジュバントを用いる研究、及び熱帯熱マラリア原虫頂端膜抗原−１４８を標的とするワクチンについての研究と符合する。Ｔｈ１型アイソタイプ抗体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）はまた、ヒトにおける生得的免疫とも関連する４９。フロイントなど従来のアジュバントにより非常な高力価まで誘導されるＴｈ２型のＩｇＧ１もまた、防御と相関する９。しかし、わずか２回の免疫感作及び中程度のレベルのＩｇＧ導入後では、Ｔｈ１型ＩｇＧアイソタイプの方が、Ｔｈ２型アイソタイプよりも有効な防御を提供しうる。
【０１２３】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇は、これらのマウスにおける血液段階の免疫を除去しなかった。生理学的な関連性を有するワクチン接種レジメン及びＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇を用いる他の試験では、免疫の喪失が示されないか又は免疫の可変的な低下が示されているが９、４６、ＭＳＰ−１３３に特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞株は、適合移植後においてプラスモジウム・ヨエリに対してマウスを防御することが報告されている１５。プラスモジウム・ヨエリのＭＳＰ−１１９におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープについての説明１４に反して、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるこのドメインに対してＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答のみを検出した。先行研究では、抗原処理に対するＭＳＰ−１１９の不応的性質１３が説明されており、そのため、ＭＳＰ−１３３に対するＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞応答がＭＳＰ−１１９に対する抗体応答にとっても重要である可能性は依然として高い。ＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答は、ＭＳＰ−１３３に対してのみ検出された。肝臓段階の免疫を媒介するその能力は、肝臓段階負荷量の同等の部分的な低下を裏付けた別の研究１９と符合し、ＭＳＰ−１１９ベースのワクチンでなくＭＳＰ−１４２ベースのワクチンの使用を擁護する。
【０１２４】
これらの知見により、血液段階のマラリアに対して、アジュバント含有組み換えタンパク質製剤９、１０の複数回投与と同等の防御的免疫を誘導しうる、新規のワクチン接種戦略が得られる。しかし、これらのタンパク質ワクチンと異なり、これらのベクターを用いる血液段階の抗原に対する強力なＴ細胞応答の誘導はまた、部分的な肝臓段階免疫も提供する可能性があり、部分的に有効な前赤内抗原ベクターとこれらとの組み合わせも可能とするであろう。本発明者らの知る限りにおいて、これは、マラリアに対する完全な多段階免疫が、わずかに２回の免疫感作による動物モデル、又はウイルスベクターワクチンを用いる動物モデルにおいて誘導されうることの最初の裏付けである。この奏功するワクチン接種戦略はまた、強力なＴ細胞及び抗体の両方が防御に必要とされる多数の病原体に適用されるであろう。
【０１２５】
簡便なアジュバント投与戦略によるＴ細胞免疫原性の増強は、長期にわたり模索されてきたワクチン学の目標であった。本発明者らは、本明細書において、Ｃ４ｂｐコアドメインをコードするベクターにおいて、単に抗原遺伝子に延長部分を付加することによる、ＣＤ４ Ｔ細胞応答及びＣＤ８ Ｔ細胞応答の実質的な増強の導入について報告している。異なる種における免疫原性の最適の増強を達成するには、例えば、Ｃ４ｂｐコア配列をワクチン配列にマッチさせることによる、配列の適切な調整を必要としうることが想定される。様々な種に由来するＣ４ｂｐコア配列は、既知であるか又は分子生物学的方法により容易に決定される。
【０１２６】
表１
【表２】
【０１２７】
表１続き
【表３】
【０１２８】
表１は、各種のワクチンによる免疫感作がもたらす、プラスモジウム・ヨエリによるマラリア感作に対する防御を示す。説明された通り、マウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣ １０４個又はプラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５０匹により感作した。マウスの株、用いられた免疫感作レジメン、ＭＶＡ用量、及び防御されたマウス数が示される。防御された群では、感作後に生存したマウスについて、血液段階における寄生虫血百分率ピーク値の中央値及び範囲を示す。† この群内における１７匹中１０匹のマウスが、無菌免疫（感作後３０日間にわたる明らかな寄生虫血の不在により定義される）を示した。††、††† これらの群内における６匹中２匹（††）及び６匹中１匹（†††）のマウスが、無菌免疫を示した。
【０１２９】
参照
１． Ｓｎｏｗ， Ｒ．Ｗ．， Ｇｕｅｒｒａ， Ｃ．Ａ．， Ｎｏｏｒ， Ａ．Ｍ．， Ｍｙｉｎｔ， Ｈ．Ｙ． ＆ Ｈａｙ， Ｓ．Ｉ． Ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ． Ｎａｔｕｒｅ ４３４， ２１４−７ （２００５）．
２． Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｂ．Ｍ．， Ｂｏｊａｎｇ， Ｋ．， Ｗｈｉｔｔｙ， Ｃ．Ｊ． ＆ Ｔａｒｇｅｔｔ， Ｇ．Ａ． Ｍａｌａｒｉａ． Ｌａｎｃｅｔ ３６５， １４８７−９８ （２００５）．
３． Ｒｉｌｅｙ， Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰｆＭＳＰ１） ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ． Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４， ３２１−３７ （１９９２）．
４． Ｍａｈａｎｔｙ， Ｓ．， Ｓａｕｌ， Ａ． ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｈ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ ２０６， ３７８１−８ （２００３）．
５． Ｈｏｌｄｅｒ， Ａ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９４ （Ｐｔ ２）， １９９−２０８ （１９８７）．
【０１３０】
６． Ｂｌａｃｋｍａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｈｅｉｄｒｉｃｈ， Ｈ．Ｇ．， Ｄｏｎａｃｈｉｅ， Ｓ．， ＭｃＢｒｉｄｅ， Ｊ．Ｓ． ＆ Ｈｏｌｄｅｒ， Ａ．Ａ． Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍａｌａｒｉａ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｍａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｅ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７２， ３７９−８２ （１９９０）．
７． Ｔｉａｎ， Ｊ．Ｈ．， Ｋｕｍａｒ， Ｓ．， Ｋａｓｌｏｗ， Ｄ．Ｃ． ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｈ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５， ３０３２−６ （１９９７）．
８． Ｄａｒｋｏ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ ４２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＦＶＯ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ａｏｔｕｓ ｎａｎｃｙｍａｉ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ−ｓｔａｇｅ ｐａｒａｓｉｔｅｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３， ２８７−９７ （２００５）．
９． Ｈｉｒｕｎｐｅｔｃｈａｒａｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ （ＭＳＰ１［１９］） ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９， ３４００−１１ （１９９７）．
１０． Ａｈｌｂｏｒｇ， Ｎ．， Ｌｉｎｇ， Ｉ．Ｔ．， Ｈｏｗａｒｄ， Ｗ．， Ｈｏｌｄｅｒ， Ａ．Ａ． ＆ Ｒｉｌｅｙ， Ｅ．Ｍ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ４２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ （ｋＤａ） ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ １９−ｋＤａ ｒｅｇｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｊａｃｅｎｔ ３３−ｋＤａ ｒｅｇｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， ８２０−５ （２００２）．
【０１３１】
１１． Ｙｕｅｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ３３−ｋＤａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １， ＭＳＰ１： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２５， ４９０−９ （２００７）．
１２． Ｇｏｏｄ， Ｍ．Ｆ．， Ｘｕ， Ｈ．， Ｗｙｋｅｓ， Ｍ． ＆ Ｅｎｇｗｅｒｄａ， Ｃ．Ｒ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３， ６９−９９ （２００５）．
１３． Ｈｅｎｓｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ ｉｍｐｅｄｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４， ６３９−４８ （２００４）．
１４． Ｔｉａｎ， Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ １９ ｋＤａ ｃａｒｂｏｘｙｌｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＭＳＰ１（１９）） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｍａｌａｒｉａ． Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０， ２６３−７８ （１９９８）．
１５． Ｗｉｐａｓａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ３３−ｋＤａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９， ９４４−５１ （２００２）．
【０１３２】
１６． Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｓ．Ｒ．， Ｋｕｎｓ， Ｒ．Ｄ． ＆ Ｇｏｏｄ， Ｍ．Ｆ． Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｓｕｂｐａｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３， ２４７８−８５ （２００５）．
１７． Ｐｏｍｂｏ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｍａｌａｒｉａ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ． Ｌａｎｃｅｔ ３６０， ６１０−７ （２００２）．
１８． Ｖｉｎｅｔｚ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｉｍａｌｓ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４， １０６９−７４ （１９９０）．
１９． Ｋａｗａｂａｔａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， ６０７５−８２ （２００２）．
２０． Ｓａｃｃｉ， Ｊ．Ｂ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｖｅｒ ｓｔａｇｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ １４２， １７７−８３ （２００５）．
【０１３３】
２１． Ｄｕｎａｃｈｉｅ， Ｓ．Ｊ． ＆ Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． Ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ ２０６， ３７７１−９ （２００３）．
２２． Ｂｅｊｏｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓａｆｅｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｏｗｌｐｏｘ ｓｔｒａｉｎ ＦＰ９ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｒ ｅｉｔｈｅｒ ｏｆ ２ ｐｒｅｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｍａｌａｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ， ＭＥ−ＴＲＡＰ ｏｒ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ Ｋｅｎｙａ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４２， １１０２−１０ （２００６）．
２３． Ｃａｔａｎｚａｒｏ， Ａ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｓｅ １ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｌａｄｅ ＨＩＶ−１ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９４， １６３８−４９ （２００６）．
２４． Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０， １０３９−４５ （２００２）．
２５． Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ． ｂｅｒｇｈｅｉ． Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ （２００７）．
【０１３４】
２６． Ｂｌｏｍ， Ａ．Ｍ．， Ｖｉｌｌｏｕｔｒｅｉｘ， Ｂ．Ｏ． ＆ Ｄａｈｌｂａｃｋ， Ｂ． Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｉｅｎｄ ｏｒ ｆｏｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ？ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０， １３３３−４６ （２００４）．
２７． Ｌｅｗｉｓ， Ａ．Ｐ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ２３０−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ３６， ２７１−８２ （１９８９）．
２８． ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ．， Ｂｅｈｂｏｕｄｉ， Ｓ．， Ｇｏｏｎｅｔｉｌｌｅｋｅ， Ｎ．， Ｂｒｏｏｋｅｓ， Ｒ． ＆ Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ＣＤ８（＋）− ａｎｄ ＣＤ４（＋）−Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， １６２３−６ （２００２）．
２９． ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ．， Ｂｒｏｏｋｅｓ， Ｒ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｓ．Ｃ． ＆ Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＤ４（＋） ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９， ６８１−６ （２００１）．
３０． Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ， Ｃ．Ｌ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｓ．Ｃ．， Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． ＆ Ｍｏｏｒｅ， Ａ．Ｃ． Ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｘｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５， ５９９−６０６ （２００５）．
【０１３５】
３１． Ｂｒｉｏｎｅｓ， Ｍ．Ｒ．， Ｔｓｕｊｉ， Ｍ． ＆ Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ， Ｖ． Ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｍｉｃｅ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｅｎｔｅｒ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ７７， ７−１７ （１９９６）．
３２． Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｉｔｅ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ３１， １４９９−５０２ （２００１）．
３３． ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ａ ｂｏｏｓｔｓ ＢＣＧ−ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａｎｔｉｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １０， １２４０−４ （２００４）．
３４． Ｃｈｅｎ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９， ２６７８−８８ （２００５）．
３５． Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｎ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４２４， ６８１−４ （２００３）．
【０１３６】
３６． Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ， Ｏ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａ， Ｇ．， Ｈａｆａｌｌａ， Ｊ．Ｃ．， Ｔｓｕｊｉ， Ｍ． ＆ Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ， Ｒ．Ｓ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ， ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｏｆ ｍｉｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｌａｓｍｏｄｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， １１４９１−６ （２００１）．
３７． Ｄｅｍｐｓｅｙ， Ｐ．Ｗ．， Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｋｋａｒａｊｕ， Ｓ．， Ｇｏｏｄｎｏｗ， Ｃ．Ｃ． ＆ Ｆｅａｒｏｎ， Ｄ．Ｔ． Ｃ３ｄ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｄｊｕｖａｎｔ： ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１， ３４８−５０ （１９９６）．
３８． Ｒｏｓｓ， Ｔ．Ｍ．， Ｘｕ， Ｙ．， Ｂｒｉｇｈｔ， Ｒ．Ａ． ＆ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ．Ｌ． Ｃ３ｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １， １２７−３１ （２０００）．
３９． Ｄｏｏｌａｎ， Ｄ．Ｌ． ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｓ．Ｌ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５， １４５３−６２ （２０００）．
４０． Ｔｉａｎ， Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｏｎｇｅｎｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７， １１７６−８３ （１９９６）．
【０１３７】
４１． Ｗｅｉｓｓ， Ｗ．Ｒ．， Ｇｏｏｄ， Ｍ．Ｆ．， Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ， Ｍ．Ｒ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｈ． ＆ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ， Ｊ．Ａ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３， ４２６３−６ （１９８９）．
４２． Ｇａｏ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０， １９５９−６４ （２００６）．
４３． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｏｃｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４， ４６７２−８ （２０００）．
４４． Ｂｒｏｄｅｕｒ， Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｃ４ＢＰ） ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＣＤ４０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８， ８３７−４８ （２００３）．
４５． Ｓｊｏｂｅｒｇ， Ａ．Ｐ．， Ｔｒｏｕｗ， Ｌ．Ａ．， ＭｃＧｒａｔｈ， Ｆ．Ｄ．， Ｈａｃｋ， Ｃ．Ｅ． ＆ Ｂｌｏｍ， Ａ．Ｍ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６， ７６１２−２０ （２００６）．
【０１３８】
４６． Ｈｉｒｕｎｐｅｔｃｈａｒａｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｙｅａｓｔ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ １９ ｋＤａ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ （ＭＳＰ１（１９）） ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２１， ２９２３−３２ （２００３）．
４７． Ｓａｋａｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｇｕｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｉｎ Ａ／Ｊ ｍｉｃｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２１， １４３２−４４ （２００３）．
４８． Ｍｕｌｌｅｎ， Ｇ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＭＡ１−Ｃ１／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ， ａ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ， ｗｉｔｈ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２４， ２４９７−５０５ （２００６）．
４９． Ｂｏｕｈａｒｏｕｎ−Ｔａｙｏｕｎ， Ｈ． ＆ Ｄｒｕｉｌｈｅ， Ｐ． Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｉｓｏｔｙｐｅ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｌａｙｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６０， １４７３−８１ （１９９２）．
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ４ｂｐドメインと抗原とを含む免疫原性ウイルスベクター組成物及びワクチンに関し、また、これらを用いてＴ細胞応答の増強をもたらす方法にも関する。
【背景】
【０００２】
ワクチン接種は、疾患、特に、感染性疾患を予防する最も有効な手段の１つであることが分かっている。大半のワクチンは、関連する病原体による感染に対して防御的である抗体を誘導することにより作用する。しかし、多くの新たなワクチンは、免疫系の細胞性装備を標的とし、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞を誘導することにより作用する。これらは、細胞内の病原体及び腫瘍を標的としうる。予防又は治療的に用いうる多くの新たなＴ細胞誘導型ワクチンが開発中である。
【０００３】
ワクチン接種により誘導されるＴ細胞は、様々な形で有用となりうる。それらは被ワクチン接種者における疾患の危険性を低減するほか、これを適合移植プロトコールで用いて、これらの細胞を移植される者における感染又は疾患の危険性を低減することも可能である。それらはまた、診断においても有用でありうる。
【０００４】
免疫応答を誘発するのにますます広く用いられている方法は、対象とする抗原又はエピトープをベクター内にクローニングする方法である。ベクターは、プラスミドベクター、細菌ベクター、又はウイルスベクターでありうる。プラスミドＤＮＡワクチンは集約的な開発下にあり、各種のウイルスベクターはワクチン接種に有用であると考えられる。これらは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルス、鶏痘及びカナリア痘及びＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルス、並びにアデノウイルスを含む。
【０００５】
改善されたベクターにより標的としうる疾患は、マラリア、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、肺炎球菌などの被包性細菌により引き起こされる疾患、リーシュマニア症などの寄生虫疾患、並びにリンパ腫、白血病、黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、及び結腸直腸癌などの広範にわたる腫瘍及び癌を含むがこれらに限定されない。
【０００６】
マラリアは、依然として世界最大の公衆衛生問題の１つである。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染には、毎年５億人を超える人々が罹患する結果、１００万〜２００万人が死亡する１、２。有効なワクチンの開発は、依然として、この疾患の安全で費用効果の高いコントロールにとって重要な目標である。
【０００７】
マラリア感染の血液段階に対する免疫は主に抗体媒介性であり、防御的応答の標的にはメロゾイト表面タンパク質−１（ＭＳＰ−１）を含むメロゾイト表面抗原がある３、４。ＭＳＰ−１は、赤血球侵入時にタンパク質分解処理を受ける１９０〜２３０ｋＤａのポリペプチドとして合成される５。４２ｋＤａのＣ末端（ＭＳＰ−１４２）は、最終的に３３ｋＤａ及び１９ｋＤａの断片（それぞれ、ＭＳＰ−１３３及びＭＳＰ−１１９）に切断され、そのうち、ＭＳＰ−１１９のみがメロゾイト表面と会合したままとなる６。ＭＳＰ−１４２は血液段階におけるマラリアワクチンの主導的な候補抗原であり、主にマラリア感作時におけるＭＳＰ−１１９に対する高力価の抗体応答の存在に応じて、マウス及びサルにおける防御的応答を誘導する能力を有する７〜９。ＭＳＰ−１３３に対する抗体応答は防御的でない１０、１１。
【０００８】
血液段階の免疫に対するＴ細胞応答の寄与は、十分には定義されないままである１２。ＭＳＰ−１４２の場合、多くのプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種では、ＭＳＰ−１３３内にＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープが書き込まれており、これらにより、ＭＳＰ−１１９に対する防御的な抗体応答へのＴ細胞による支援がもたらされる可能性が高い１１、１３。ＭＳＰ−１３３内の（しかし、ＭＳＰ−１１９内ではない）エピトープを認識するＣＤ４＋ Ｔ細胞株はまた、免疫欠損マウス内への適合移植後において、致死的なプラスモジウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の増殖をコントロールする能力も有する１４、１５。ＭＳＰ−１に対する細胞応答は、部分的な免疫を獲得した小児についての研究では防御と相関していることが判明しており、同様に、極めて低用量の血液段階の原虫に対するマウス又はヒトボランティアの反復的な曝露により、抗体応答ではなく細胞応答を特徴とする防御的な免疫が誘導される１６、１７。
【０００９】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、プラスモジウム・ヨエリによるモデルにおける血液段階の免疫には寄与しない１８。しかし、ＭＳＰ−１は、後期赤外シゾント内で発現される２０ので、プラスモジウム・ヨエリのＭＳＰ−１に対するＴ細胞応答は、肝臓段階の原虫に対しても防御的でありうる１９。こうして、ＭＳＰ−１は、ワクチンに誘導される多段階免疫の標的となる。
【００１０】
血液段階におけるマラリアワクチンの開発は、従来、アジュバント含有組み換えタンパク質製剤に焦点が絞られてきた。これらは、動物モデルにおける多数回の免疫感作により防御的な規模の抗体応答を誘導する必要があり、こうしたワクチン候補物質の臨床試験は、不本意なものにとどまる４。組み換えタンパク質ワクチンは、ｉ）正確にフォールディングされた大量のタンパク質を確実に精製すること、及びｉｉ）ヒトに適合する有効なアジュバント中における調合という固有の困難を障害としている。細胞内病原体を標的とするＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導するために、異種初回刺激−追加免疫レジメンにおいて投入されるウイルスワクチンベクターが開発されている２１。これらは上記で概括した困難を回避し、大型抗原構築物のより大きな発現能力を有する。ＭＶＡ２２などの複製欠損型ポックスウイルス、又はより近年では、ＡｄＨｕ５２３などのアデノウイルスが、予防用ワクチンとしてのヒトにおける使用に適する安全性プロファイルを示し、マウスモデルにおける前赤内マラリアに対する優れた有効性を示している２４、２５。抗体応答と合わせた強力な細胞性免疫応答の誘導が、血液段階におけるマラリアワクチンの有効性を増強しうる１つの戦略である。
【００１１】
補体タンパク質であるＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）は、補体経路に対する循環可溶性の阻害剤である２６。国際公開２００５／０１４６５４号パンフレットでは、マウスＣ４ｂｐ α鎖（ｍＣ４ｂｐ）のコアドメインが、病原体抗原に融合すると抗体応答を増強しうる分子アジュバントとして説明されている。この文献では、ｍＣ４ｂｐに融合した組み換えプラスモジウム・ヨエリのＭＳＰ−１１９が、生理食塩液中で投与されると高度に免疫原性であり、フロイントアジュバントにより抗原が注射される場合よりもはるかに高レベルでマウスにおける防御的な規模の抗体を誘導したことが開示されている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ウイルスベクターを含む免疫原性組成物及びワクチンに対するＴ細胞応答が、Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸配列の、対象とする抗原をコードする免疫原性ベクター内への封入により増強されうるという新規な予測外の知見に基づく。
【００１３】
先行技術では、マウスＣ４ｂｐコアドメインの単量体抗原との融合体について説明され、これらにより強力な抗体応答が引き起こされることが示されている。
【００１４】
本発明で見られる、免疫原性のウイルス組成物及びワクチンに対するＣＤ４ Ｔ細胞応答及びＣＤ８ Ｔ細胞応答両者の著明な増大は、Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を用いる抗体応答についての先行研究では予測しえないものであった。実際、抗体応答を増強しうるもののＣＤ８ Ｔ細胞応答を増大させないアジュバントは、例えば、アラム（Ａｌｕｍ）、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、ＭＦ５９など、極めて多く存在する。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様では、Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸とを含むウイルスベクターを含む免疫原性組成物が提供される。
【００１６】
核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましい。
【００１７】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸は、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにあることが好ましい。
【００１８】
Ｃ４ｂｐドメインを哺乳動物又は非哺乳動物のＣ４ｂｐタンパク質又はその断片から誘導しうることは明らかであろう。
【００１９】
本発明がＣ４ｂｐコアタンパク質の誘導体をコードする核酸の使用を含みうることも、さらに明らかであろう。こうした誘導体は、本明細書で説明されるＴ細胞増強特性の維持に従う、アミノ酸の欠失、付加、とりわけ、システイン残基の付加、若しくは置換、Ｃ４ｂｐファミリーの異なるメンバーの部分の融合により形成されるハイブリッド体若しくはキメラ分子、及び／又は円順列タンパク質骨格を含有しうるその変異体を含む。
【００２０】
本発明ではまた、複数の種に由来するＣ４ｂｐコア配列のアラインメントに基づく、人工的なＣ４ｂｐコンセンサス配列を用いることもできる。このクラスの極めて多数の可能なキメラ分子の１つの例を以下の図６ａに示す。
【００２１】
特に好ましい実施形態において、本発明の製品のＣ４ｂｐ成分をコードする核酸は、Ｃ４ｂｐアルファ鎖のコアタンパク質をコードする。こうした実施形態において、Ｃ４ｂｐコアタンパク質をコードする核酸は、図６ａで示されるヒトＣ４ｂｐからなるペプチド若しくはそのホモログの対応する残基、又はヒトＣ４ｂｐの少なくとも４７アミノ酸からなる断片若しくはそのホモログをコードする核酸をコードする。
【００２２】
当技術分野では、多数の哺乳動物Ｃ４ｂｐタンパク質のペプチド配列を使用できる。これらは、ヒトＣ４ｂｐコアタンパク質を含む。当技術分野では、多数のヒトＣ４ｂｐコアタンパク質ホモログも使用できる。２種類のホモログ：オルソログ及びパラログが存在する。オルソログとは、異なる生物中における相同遺伝子として定義される、すなわち、オルソログ遺伝子は、それを発生させた種形成事象と同時に生じた共通の祖先を共有する。パラログとは、遺伝子重複、染色体重複、又はゲノム重複に由来する、同一の生物中における相同遺伝子として定義される、すなわち、パラログ遺伝子の共通の祖先は、最後の種形成事象以後に生じた。
【００２３】
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及び生ゲノムトレース（ｒａｗ ｇｅｎｏｍｉｃ ｔｒａｃｅ）及びＥＳＴ（発現配列タグ）データベースの検索により、チンパンジー、アカゲザル、ウサギ、ラット、イヌ、ウマ、マウス、モルモット、ブタ、及び畜牛を含む種における、哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質ホモログが示される。ヒトＣ４ｂｐのパラログ及びオルソログは、図６ａのアラインメント中に含まれていることが示唆される。
【００２４】
全１９種類の配列は、Ｃ末端において大きなばらつきを伴うが、高度の類似性を有する。さらなるＣ４ｂｐコアタンパク質は、ＢＬＡＳＴなど市販の検索プログラムを用いて、ＤＮＡ配列又はタンパク質配列のデータベースを検索することにより同定することができる。
【００２５】
所望の哺乳動物供給源に由来するＣ４ｂｐタンパク質をコードする核酸がデータベース中で得ることができない場合は、当技術分野で十分に確立された通常のクローニング法を用いてそれを得ることができる。基本的に、こうした技法は、対象とする他の種に由来するＣ４ｂｐドメインの配列を回収及び決定するプローブとして使用できるＣ４ｂｐコアタンパク質の１つをコードする核酸を用いるステップを含む。例えば、ゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの適切な供給源（例えば、胚又は活発に分裂する分化細胞又は腫瘍細胞に由来する）を用いるＰＣＲ増幅法及び遺伝子クローニング法、又は哺乳動物に由来するｃＤＮＡライブラリー、例えば、上述の供給源の１つに由来するｃＤＮＡライブラリーを得るステップと、高度な厳密性に従う培地条件（例えば、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）下で既知のＣ４ｂｐ核酸により前記ライブラリーをプローブするステップと、該哺乳動物のＣ４ｂｐタンパク質の全て若しくは一部をコードするｃＤＮＡを回収するステップとを含む方法によるなど、多種多様な技法がこの目的に使用できる。部分的なｃＤＮＡが得られると、プライマー伸長法により、配列をコードする全長を決定することができる。
【００２６】
Ｃ４ｂｐコアタンパク質の変異体及びその断片をコードする核酸を用いることもできる。変異体は、野生型の哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質又はその断片のアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００２７】
一態様において、Ｃ４ｂｐコアタンパク質は、図６ａで示されるヒトＣ４ｂｐの位置１２に現れるグリシン、位置２８に現れるアラニン、位置２９、３４、３６、及び４１に現れるロイシン、並びに位置３２に現れるチロシン、並びに位置３３に現れるリシン、並びに好ましくは位置６及び１８に現れる２つのシステイン残基を含むコアタンパク質である。変異体は、これらの残基間の相対的な間隔を保持することが望ましい。
【００２８】
上記で指定された同一性の程度は、図６ａで示される配列の任意の１つに対するものである。
【００２９】
配列同一性の程度は、当技術分野で広く用いられ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社（ウィスコンシン州、マジソン、以前のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社）から市販されるアルゴリズムの「ウィスコンシンパッケージ」の一部であるＧＡＰアルゴリズムにより決定することができる。ＧＡＰでは、ニードルマン及びブンシュによるアルゴリズムを用いて、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する形で２つの完全な配列を整列する。ＧＡＰは、類似の長さで密接に関連する短い配列のアラインメントに有用であり、したがって、配列が上述の同一性レベルを満たすかどうかを判定するのに適する。ＧＡＰは、デフォルトのパラメータで用いることができる。
【００３０】
哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質の合成変異体をコードする核酸は、該Ｃ末端又はＮ末端に対する１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入若しくは付加を伴う変異体を含む。置換を特に想定する。置換は保存的置換を含む。保存的置換の例は、デイホフ群としばしば呼ばれる類似のアミノ酸群に関する保存的置換を含む。これらは以下の通りである。
【００３１】
【表１】
【００３２】
Ｎ末端切断又はＣ末端切断以外で配列の欠失を行う場合は、近接してもしなくてもよい１箇所、２箇所、又は３箇所以下の欠失をコードする配列に限定することが好ましい。
【００３３】
挿入又はコアタンパク質配列へのＮ末端伸長若しくはＣ末端伸長を行う場合、コアタンパク質のサイズが野生型配列の長さを、２０アミノ酸を上回らない、好ましくは１５アミノ酸を上回らない、より好ましくは１０アミノ酸を上回らないように数を限定することが望ましい。こうして、ヒトＣ４ｂｐの場合、コアタンパク質をコードする核酸は、挿入又は伸長により改変される場合、全長７７アミノ酸以下のペプチドをコードすることが望ましい。
【００３４】
さらに好ましい実施形態において、Ｃ４ｂｐドメインは、図７で示される配列によりコードされるマウスドメインである。
【００３５】
異なる種に対しては、異なるｃ４ｂｐ配列が適切でありうることは明らかであろう。本発明は、図６又は他の任意のＣ４ｂｐドメインで示される任意のＣ４ｂｐドメインをコードするＤＮＡを含むウイルスベクターを含むことが理解されるであろう。
【００３６】
組成物は、ワクチン組成物でありうる。ワクチン組成物はヒト投与に適し、これを用いて、コードされる抗原に対する防御的免疫応答を引き起こしうることが好ましい。
【００３７】
特に好ましい実施形態において、ワクチンがヒト用である場合、核酸配列は、図６ｂで示される変異Ｃ４ｂｐドメインをコードする。これらのＣ４ｂｐ変異体により、天然Ｃ４ｂｐドメインを用いることによる問題、すなわち、天然に存在する血漿タンパク質断片と同一であるＣ４ｂｐの使用により、ウイルスベクターがコードする組み換えタンパク質中のＣ４ｂｐドメインに対する反応が結果として生じうるだけでなく、内因性の血漿Ｃ４ｂｐタンパク質に対する望ましくない反応もまた誘導されるという問題が克服される。
【００３８】
図６ｂで示される変異体１は、Ｏｓｈｉｕｍｉら（２００５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１７５巻、１７２４〜１７３４頁）の成果に由来する。彼らは、ニワトリにおける補体活性化遺伝子座の調節物質を特徴づけ、彼らがＣＲＥＭ、ＣＲＥＧ、及びＣＲＥＳと呼ぶ３種類のタンパク質を同定した。各遺伝子に由来する転写産物を特徴づけることで、全タンパク質配列の推定が可能となった。これらのタンパク質の１つであるＣＲＥＳタンパク質は、ニワトリＣ４ｂｐ遺伝子として説明され、変異体１のＤＮＡ配列は、このタンパク質をコードするｃＤＮＡから誘導された。
【００３９】
コードされるＣ４ｂｐドメインと対象とする抗原とは、融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００４０】
ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択されることが好ましい。ウイルスベクターは、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターであることがより好ましい。ベクターは、ＭＶＡ又はＡｄＨｕ５であることがさらにより好ましい。
【００４１】
抗原が外因性又は内因性の任意の対象とする抗原でありうることは明らかであろう。外因性抗原は、感染性生物中で見出される全ての分子を含む。例えば、細菌免疫原、寄生虫免疫原、及びウイルス免疫原を含む。
【００４２】
これらの免疫原の細菌による供給源は、細菌性肺炎、髄膜炎、コレラ、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、及びハンセン病の原因となる供給源を含む。
【００４３】
寄生虫による供給源は、プラスモジウム属などのマラリア原虫のほか、トリパノソーマ種及びリーシュマニア種も含む。
【００４４】
ウイルスによる供給源は、ポックスウイルス、例えば、天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、及び伝染性嚢胞性皮膚炎ウイルス；ヘルペスウイルス、例えば、１型及び２型単純ヘルペスウイルス、Ｂウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、及びエプスタイン−バーウイルス；アデノウイルス、例えば、マストアデノウイルス；パポーバウイルス、例えば、ＨＰＶ１６ウイルスなどのパピローマウイルス、及びＢＫウイルス及びＪＣウイルスなどのポリオーマウイルス；パルボウイルス、例えば、アデノ関連ウイルス；レオウイルス、例えば、１型、２型、及び３型レオウイルス；オルビウイルス、例えば、コロラドダニ熱ウイルス；ロタウイルス、例えば、ヒトロタウイルス；アルファウイルス、例えば、東部ウマ脳炎ウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス；ルビウイルス、例えば、風疹ウイルス；フラビウイルス、例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルス；コロナウイルス、例えば、ヒトコロナウイルス；パラミクソウイルス、例えば、１型、２型、３型、及び４型パラインフルエンザウイルス、並びに流行性耳下腺炎ウイルス；モルビリウイルス、例えば、麻疹ウイルス；肺炎ウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス；ベジクロウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルス；リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス；オルトミクソウイルス、例えば、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス；ブンヤウイルス、例えば、ラクロスウイルス；フレボウイルス、例えば、リフトバレー熱ウイルス；ナイロウイルス、例えば、コンゴ出血熱ウイルス；ヘパドナウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス；アレナウイルス、例えば、ｌｃｍウイルス、ラッサウイルス、及びフニンウイルス；レトロウイルス、例えば、ＨＴＬＶ Ｉウイルス、ＨＴＬＶ ＩＩウイルス、ＨＩＶ−１ウイルス、及びＨＩＶ−２ウイルス；エンテロウイルス、例えば、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、及び３型ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、及びノーウォークウイルス；ライノウイルス、例えば、ヒトライノウイルス；並びにフィロウイルス、例えば、マールブルグ（病）ウイルス及びエボラウイルスを含む。
【００４５】
これらの細菌、ウイルス、及び寄生虫供給源由来の抗原は、通常宿主内には存在せず、宿主ゲノム中ではコードされないので、外因性抗原と考えることができる。
【００４６】
これに対し、内因性抗原は通常、宿主内に存在するか若しくは宿主ゲノム中でコードされるか、又はその両方である。内因性抗原に対する免疫応答を発生させる能力は、該抗原を保有する腫瘍を治療するステップ、又は該腫瘍に対する成長因子を中和化するステップにおいて有用である。内因性抗原の第１の種類の例は、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）と呼ばれるモノクローナル抗体の標的であるＨＥＲ２である。成長因子である第２の種類の内因性抗原の例は、一部の前立腺腫瘍に対して栄養作用を及ぼすゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨと呼ばれる）である。
【００４７】
本発明により形成される免疫原性組成物又はワクチンを用いて、複数の疾患に対する同時のワクチン接種を行うこともでき、又は所与の病原体上における複数のエピトープを同時に標的とすることもできる。
【００４８】
好ましい一実施形態において、抗原はマラリア抗原である。抗原は、熱帯熱マラリア原虫抗原であることが好ましい。抗原は、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１、若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１であることがより好ましい。抗原は、血液段階のマラリア抗原であることが最も好ましい。
【００４９】
上記の免疫原性組成物又はワクチンが、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などの薬学的に許容される適切な媒体又は担体と共に、医薬剤形に調合されうることは、当業者に明らかであろう。剤形は、ｐＨ、浸透圧、味、粘稠度、無菌性、親油性、可溶性などの条件を改変する、薬学的に許容される他の賦形剤を含有する場合もあり、また、薬学的に許容されるアジュバントを含有する場合もある。
【００５０】
適切な剤形は、固体剤形、例えば、徐放製剤及び遅延放出製剤を含む、錠剤、カプセル、粉末、分散性顆粒、小袋、及び坐剤を含む。粉末及び錠剤は、一般に、約５％〜約７０％の有効成分を含む。適切な固体担体及び固体賦形剤は、一般に当技術分野で知られ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、ラクトースなどを含む。錠剤、粉末、小袋、及びカプセルは全て、経口投与に適する剤形である。
【００５１】
液体剤形は、溶液、懸濁液、及び乳剤を含む。液体形態製剤は、静脈内、脳内、腹腔内、非経口、又は筋肉内の注射又は注入により投与することができる。無菌の注射用製剤は、非毒性で薬学的に許容される希釈剤又は溶媒中に活性作用物質の無菌の溶液又は懸濁液を含みうる。適切な希釈剤及び溶媒は、滅菌水、リンゲル液、及び等張性の塩化ナトリウム溶液などを含む。液体剤形はまた、鼻腔内投与用の溶液又はスプレーも含む。
【００５２】
吸入に適するエアゾール製剤は、不活性圧縮ガスなどの薬学的に許容される担体と組み合わせうる溶液及び粉末形態の固体を含みうる。
【００５３】
クリーム、ローション、エアゾール、及び／又は乳剤を含む経皮投与用剤形もまた包含される。これらの剤形は、当技術分野で一般に知られる、マトリックス又はリザーバー型の経皮パッチ中にも封入することができる。
【００５４】
医薬製剤は、医薬製剤の標準的な手順により、単位用量形態で調製することが好都合である場合がある。単位用量当たりの活性化合物量は、活性化合物の性質及び意図される投与レジメンによって変化しうる。
【００５５】
活性作用物質は、患者において医学的に望ましい結果をもたらすのに十分な用量を意味するものと理解される「治療的有効量」でヒト対象に投与するものとする。治療的有効量の活性作用物質の正確な投与用量及び投与回数は、活性物質の性質、投与剤形、及び投与経路などの因子に応じて変化する。
【００５６】
本発明の薬剤及び医薬組成物は、全身投与又は局所投与することができる。これは、本発明の使用態様及び方法態様のいずれに対しても同様に適用可能である。全身投与は、任意の既知の全身投与形態、例えば、経口、静脈内、又は腹腔内投与でありうる。局所投与は、任意の既知の局所投与形態、例えば、外用投与でありうる。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００５８】
本発明の第２の態様では、
ａ）第１のウイルスベクターを含む初回刺激組成物であって、前記ウイルスベクターがＣ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片と、少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む初回刺激組成物と、
ｂ）第２のウイルスベクターを含む追加免疫組成物であって、前記第２のウイルスベクターが前記第１のウイルスベクターとは異なり、Ｃ４ｂｐドメインと、初回刺激組成物の病原体又は腫瘍抗原と同じである少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む追加免疫組成物と
を含む製品、組み合わせ、又はキットが提供される。
【００５９】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸は、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにあることが好ましい。
【００６０】
Ｃ４ｂｐドメインは、図６で示されるドメインの１つであることが好ましい。
【００６１】
Ｃ４ｂｐドメインは、図７で示される配列によりコードされることが好ましい。
【００６２】
Ｃ４ｂｐドメイン及び対象とする抗原は、融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００６３】
各ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択されることが好ましい。
【００６４】
前記第１のウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることが好ましい。ＡｄＨｕ５であることがより好ましい。
【００６５】
前記第２のウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターであることが好ましい。ＭＶＡであることがより好ましい。
【００６６】
対象とする抗原が第１の態様との関連で説明される任意の適切な抗原でありうることは、当業者には明らかであろう。
【００６７】
好ましい一実施形態において、抗原はマラリア抗原である。抗原は、熱帯熱マラリア原虫抗原であることが好ましい。抗原は、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１、若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１であることがさらに好ましい。抗原は、血液段階のマラリア抗原であることが最も好ましい。
【００６８】
病原体又は腫瘍の少なくとも１種の標的抗原に対する防御的なＴ細胞応答を対象において発生させるキットを作製するための製品、組み合わせ、又はキットの使用もまた提供される。
【００６９】
対象が任意の動物対象でありうることは、明らかであろう。特に好ましい実施形態において、これは、ヒトを含む哺乳動物対象でありうる。代替的な実施形態において、対象は鳥類対象でありうる。
【００７０】
本発明の第３の態様では、Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸とを含むウイルスベクターが提供される。
【００７１】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸は、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにあることが好ましい。
【００７２】
Ｃ４ｂｐドメインは、図６で示されるドメインの１つであることが好ましい。
【００７３】
Ｃ４ｂｐドメインは、図７で示される配列によりコードされることが好ましい。
【００７４】
Ｃ４ｂｐドメイン及び対象とする抗原は、融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００７５】
ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択されることが好ましい。ウイルスベクターは、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターであることがより好ましい。ベクターは、ＭＶＡ又はＡｄＨｕ５であることがさらにより好ましい。
【００７６】
対象とする抗原が第１の態様との関連で説明される任意の適切な抗原でありうることは、当業者には明らかであろう。
【００７７】
好ましい一実施形態において、抗原はマラリア抗原である。抗原は、熱帯熱マラリア原虫抗原であることが好ましい。抗原は、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１、若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１であることがさらに好ましい。抗原は、血液段階のマラリア抗原であることが最も好ましい。
【００７８】
本発明の第４の態様では、ワクチンとして用いられる第３の態様によるウイルスベクターが提供される。
【００７９】
本発明の第５の態様では、マラリアの予防又は治療用のワクチンの製造における第３の態様によるベクターの使用が提供される。
【００８０】
第６の態様では、マラリアの予防又は治療において用いられる第３の態様によるベクターが提供される。
【００８１】
本発明の第７の態様では、本発明の第１の態様による少なくとも１種の有効量の免疫原性組成物又はワクチンを投与することにより、対象を免疫感作する方法が提供される。
【００８２】
抗原に応じて、予防又は免疫療法の目的で対象を免疫感作しうることは明らかであろう。
【００８３】
好ましい実施形態では、第１の態様による少なくとも２種の免疫原性組成物又はワクチンが提供され、第１の態様による第２の免疫原性組成物又はワクチンが第１の態様による第１の免疫原性組成物又はワクチンの後で投与される、異種初回刺激−追加免疫レジメンを用いて対象を免疫感作する。
【００８４】
当業者は、異種初回刺激−追加免疫が、本発明による免疫原性組成物又はワクチンの第１の単位用量が第１の時点において個体に投与され、その後、本発明による免疫原性組成物又はワクチンの第２の単位用量が第２の時点において投与されるレジメンを指すことを理解するであろう。異種初回刺激−追加免疫レジメンにおいて、第１の単位用量における免疫原性組成物又はワクチンを形成するウイルスベクターと、第２の単位用量における免疫原性組成物又はワクチンを形成するウイルスベクターとは異なることが理解されるであろう。
【００８５】
第１の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンは、アデノウイルスベクターを含むことが好ましい。ＡｄＨｕ５であることがより好ましい。
【００８６】
前出の任意の態様による多くの適用では、アデノウイルスベクターが複製欠損である（これは、ウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子の機能的な欠失又は完全な除去のために複製が不可能とされていることを意味する）ことが好ましいことがさらに理解されるであろう。例を目的として述べると、本発明のベクターは、Ｅ１遺伝子の全て又は一部の除去によって、また場合によって、Ｅ３領域及び／又はＥ４領域の全て又は一部の除去によっても複製欠損とすることができる。
【００８７】
第２の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンは、ポックスウイルスベクターを含むことが好ましい。ＭＶＡであることがより好ましい。
【００８８】
第１の単位用量の投与と第２の単位用量の投与との間の期間は、２〜８週間であることが好ましい。
【００８９】
本発明で用いられる対象という用語が、任意の動物対象に関することは、当業者には容易に明らかであろう。これは、特に、ヒトを含む哺乳動物対象でありうる。
【００９０】
こうして、本発明の製品は、ヒト用だけでなく、獣医学用、例えば、家畜動物（例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ）及び愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、げっ歯動物）を含む飼育哺乳動物の治療、又は動物園で捕獲されている動物などの野生哺乳動物の治療においても有用でありうる。
【００９１】
別の態様において、本発明の製品は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウなどの鳥類を含む非哺乳動物対象の治療にも用いることができる。
【００９２】
単独で又は初回刺激−追加免疫レジメンを用いて、本発明の任意の態様による免疫原性組成物又はワクチンで対象を免疫感作すると、Ｃ４ｂｐドメインを含まない免疫原性組成物又はワクチンでの対象の免疫感作と比べて、抗原に対するＴ細胞応答の増強がもたらされることが理解されるであろう。
【００９３】
本発明を以下の図面及び実施例を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対してＡｄＭ４２ワクチンにより誘導される免疫応答及び防御が、初回刺激−追加免疫間隔に依存することを示す図である。（ａ）Ａｄ４２によりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、ＥＬＩＳＡ法によりＭＳＰ−１１９に対する血清全ＩｇＧ抗体応答を経時的に測定した。（ｂ）Ａｄ４２によりマウスを初回刺激し、Ｍ４２により２週間後又は８週間後に追加免疫した。追加免疫の１４日後において、ＥＬＩＳＡ法によりＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する血清全ＩｇＧ抗体応答を測定した。（ｃ）ＩＣＳ法により、ＭＳＰ−１３３ ＯＬＰによる再刺激後におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を脾臓内において評価した。各時点について、応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊＊＊ｐ≦０．００１により、（ａ）では時点間、又は（ｂ）では２群間の応答を比較する。２つ又は３つの独立した実験で、同様の結果が得られた。追加免疫の１４日後において、１０４個のプラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣにより、（ｄ）免疫未感作対照マウス、（ｅ）ＡｄＭ４２（２週間）免疫感作マウス、又は（ｆ）ＡｄＭ４２（８週間）免疫感作マウスを感作した。説明される通り、感作後第２日から寄生虫血を測定した。代表的な結果を示す（群当たりｎ＝６のマウス）。全ての反復実験を含む生存百分率を角カッコ内に示す（表１ａを参照されたい）。
【図２】血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対してＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐワクチンにより誘導される免疫応答及び防御を示す図である。８週間の初回刺激−追加免疫間隔を用いて、ＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。追加免疫の１４日後において、ＥＬＩＳＡ法により（ａ）ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する血清全ＩｇＧ抗体応答、又は（ｂ）ＭＳＰ−１１９に対するＩｇＧアイソタイプ応答を測定した。（ｃ）前出の通り、ＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を脾臓内において評価した。各アッセイ時点について、応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１により、２群間の応答を比較する。２つ又は３つの独立した実験で、同様の結果が得られた。（ｄ）前出の通り、１０４個のプラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣにより、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ免疫感作マウスを感作した。代表的な結果を示す（群当たりｎ＝６のマウス）。全ての反復実験を含む生存百分率を角カッコ内に示す（表１ｂを参照されたい）。
【図３】プラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣによる感作に対する防御が、ワクチンにより誘導されるＭＳＰ−１１９特異的なＩｇＧ２ａレベルと相関することを示す図である。ＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、５×１０７ｐｆｕ又は１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫した。追加免疫の１４日後において、ＥＬＩＳＡ法により（ａ）ＭＳＰ−１１９に対する血清全ＩｇＧ抗体応答、又は（ｂ）ＭＳＰ−１１９に対するＩｇＧ２ａ応答を測定した。応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１により、（ａ）において同じワクチンを投与される２群間の応答を比較するか、又は（ｂ）における全ての群間を比較する。２つの独立した実験で、同様の結果が得られた。前出の通り、１０４個のプラスモジウム・ヨエリｐＲＢＣにより、（ｃ）ＡｄＭ４２又は（ｄ）ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐにより免疫感作され、１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫されたマウスを感作した。代表的な結果を示す（群当たりｎ＝５又は６のマウス）。生存百分率を角カッコ内に示す（表１ｄを参照されたい）。
【図４】ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作が、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトによる感作及び肝臓段階における赤外型に対する防御を可能とすることを示す図である。（ａ）ＡｄＭ４２又は（ｂ）ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、５×１０７ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫し、追加免疫の１４日後において、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５０匹により感作した（群当たりｎ＝６のマウス）。生存百分率を角カッコ内に示す（表１ｅを参照されたい）。（ｃ）ＡｄＭ４２又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５，０００匹により感作した。４８時間後に肝臓を回収し、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により肝臓段階の原虫負荷量を評価し、マウスＧＡＰＤＨのコピー数に対して標準化したプラスモジウム・ヨエリ１８Ｓ ｒＲＮＡのコピー数比として表わす。
【図５】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡｄＭ４２及びＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作の免疫原性及び防御効果を示す図である。ＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりマウスを免疫感作した。追加免疫の１４日後において、免疫応答を評価した。（ａ）ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する血清全ＩｇＧ抗体応答。（ｂ）ＩＣＳ法により、ＭＳＰ−１３３ ＯＬＰ若しくはＭＳＰ−１１９ ＯＬＰによる再刺激後におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を、脾臓内において評価した。各応答について、応答の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ≧６のマウス）。＊＊＊ｐ≦０．００１により、２群間の応答を比較する。（ｃ）マウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５，０００匹により感作した。前出の通り、４８時間後に肝臓段階の原虫負荷量を評価した。比の平均±ＳＥＭを示す（群当たりｎ＝５のマウス）。＊ｐ≦０．０５により、全ての群間を比較する。
【図６ａ】様々な各哺乳動物種に由来するＣ４ｂｐドメインのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図６ｂ】２種類の変異Ｃ４ｂｐドメインのＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
【図７】マウスＣ４ｂｐドメインのＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
【実施例】
【００９５】
材料と方法
ＭＳＰ−１４２を発現する組み換えＭＶＡワクチン及び組み換えＡｄＨｕ５ワクチンの作製
プラスモジウム・ヨエリＹＭ ＭＳＰ−１４２（アミノ酸（ａａ）１３９４〜１７５７）は、Ａ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｒ博士（英国、ＮＩＭＲ）からの寄贈物であるλｐｙＭ４．３プラスミド２７に由来する４２Ｆ順行プライマー５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＴ−３’及び４２Ｒ逆行プライマー５’−ＧＣＡ ＴＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＧＴＴ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＣＡ ＧＡＡ ＴＡＣ−３’を用い、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ）（Ｒｏｃｈｅ社製）により増幅した。プライマーは、５’側におけるＳａｌ Ｉ並びに３’側におけるＢａｍＨ Ｉ及びＳｐｈ Ｉの制限部位と、ＴＧＡ終止コドンとを含んだ。４２Ｒはまた、Ｃ末端側の抗ＰＫモノクローナル抗体認識配列であるＩＰＮＰＬＬＧＬＤもコードする。ＭＳＰ−１のＣ末端側におけるＧＰＩアンカーシグナル配列（アミノ酸１７５８〜１７７３）は除外した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）中にライゲーションし、配列解析により検証した（ドイツ、エーベルスベルク、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）。ＰＣＲ法により、順行プライマー５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＣＡＣ Ｃ−３’及び逆行プライマー５’−ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＴＧ Ｇ−３’を用いて、プラスミド鋳型２８から、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のリーダー配列を増幅した。プライマーは、５’側におけるＢａｍＨ Ｉ及び３’側におけるＸｈｏ Ｉの制限部位のほか、コザック配列（下線部）を含んだ。上記の通りに、遺伝子産物をクローニングし配列決定した。Ｓａｌ Ｉ−ＭＳＰ−１４２−ＰＫ−Ｓｐｈ Ｉ構築物をｔＰＡベクター内にクローニングし、Ｎ末端側のリーダー配列によるインフレーム融合体を創出した。
【００９６】
こうして２つのＢａｍＨ Ｉ部位間に包含される構築物全体を、ＭＶＡシャトルベクターであるｐＭＶＡ．ＧＦＰのＢｇｌ ＩＩ部位にクローニングした。ｐＭＶＡ．ＧＦＰ．ＭＳＰ−１４２というこのベクターは、ワクシニアウイルスｐ７．５初期／後期プロモーターを用いて抗原発現を駆動し、鶏痘ウイルス後期プロモーターであるＦＰ４ｂによりＧＦＰの発現を駆動する。初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ、ＳＰＦグレード）に、ＭＶＡのＴＫ遺伝子座に組み込まれた、ワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターにより駆動される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するＭＶＡ．Ｒｅｄを感染させる。次いで、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（英国、ペイズリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、感染した細胞に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで直鎖化した２μｇのｐＭＶＡ．ＧＦＰ．ＭＳＰ−１４２をトランスフェクトした。蛍光活性化細胞選別装置を用いて、ＧＦＰを発現する組み換え体を感染させたＣＥＦ（相同組み換えに従い、ＴＫ遺伝子座におけるＲＦＰがＭＳＰ−１４２及びＧＦＰにより置換された）を、ＭＶＡ−ＲＦＰを感染させたＣＥＦから濃縮した。蛍光顕微鏡法により可視化されるＧＦＰマーカーを用いて、ＣＥＦ中におけるプラークピッキングの反復により、純粋な組み換えウイルスを単離した。
【００９７】
組み換えＡｄＨｕ５ワクチンは、ビラパワー（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ）アデノウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて構築した。ＤＮＡによるワクチンベクターｐＳＧ２２９に由来する１．９ｋｂｐのＣＭＶプロモーター（調節エレメント、エンハンサー、及びイントロンＡを伴う）、ポリリンカー、及びＢＧＨポリ（Ａ）転写終結配列を、ｐＥＮＴＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）エントリベクター内にクローニングした。ｐＥＮＴＲ４．ＣＭＶ−ＢＧＨのＢａｍＨ Ｉ部位にＭＳＰ−１４２構築物をクローニングした。ＬＲクロナーゼ（ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてこの構築物を、Ｅ１及びＥ３を欠失させた３６ｋｂｐのｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ ＡｄＨｕ５ゲノムベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内に組み換えた。Ｐａｃ Ｉによりベクターを直鎖化し、反転した末端反復配列を露出させ、２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内にトランスフェクトした。製造元の指示書に従い、純粋な組み換えＡｄＨｕ５ウイルスを増殖させた。組み換えアデノウイルスは、アデノピュア（Ａｄｅｎｏｐｕｒｅ）キット（米国、ペンシルベニア州、マルバーン、ＰｕｒｅＳｙｎ社製）を用いて精製した。純粋なウイルスをアリコートに分け、−８０℃で保管した。ＵＶ分光光度計を用いてウイルスストック（水中で１：１００に希釈）の２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、式：
Ａｂｓ２６０×１０１２×希釈倍率＝ｖｐ／ｍＬ
を用いてウイルス粒子（ｖｐ）カウントを計算した。
【００９８】
ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現する組み換えＭＶＡワクチン及び組み換えＡｄＨｕ５ワクチンの作製
ＰＣＲ法により、マウスＣ４ｂｐタンパク質アルファ鎖（アミノ酸４１６〜４６９）のコアドメイン及びＴＡＡ終止コドンを、ｐＭＶＡ．ＧＦＰ．ＭＳＰ−１４２ベクター内にクローニングした。構築物を配列決定して、インフレームの融合体を確認した。もとのＭＳＰ−１４２構築物の最後の３アミノ酸（アミノ酸１７５５〜１７５７）は、Ｃ末端のＰＫエピトープ配列であるため除外した。組み換えＭＶＡ及び組み換えＡｄＨｕ５は、説明した通りに作製した。
【００９９】
動物及び免疫感作
５〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（英国、オックスフォード、ジョンラドクリフ病院、ＢＭＳＵ製）を全ての実験で用いた。全ての手順は、「（科学的手順に関する）英国動物法に基づく内務省による研究プロジェクトライセンス」の条項に従い実施された。エンドトキシンを含まないＰＢＳ中で希釈され、両耳内に投与された１０６ｐｆｕ若しくは５×１０７ｐｆｕのＭＶＡワクチン、又は５×１０１０ｖｐのＡｄＨｕ５ワクチンにより、マウスを皮内（ｉ．ｄ．）免疫感作した。
【０１００】
組み換えＧＳＴ融合タンパク質の作製
プラスモジウム・ヨエリ ＹＭ ＭＳＰ−１１９（アミノ酸１６４９〜１７５７）は、１９Ｆ順行プライマー５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＴＡ ＧＧＴ Ｇ−３’と４２Ｒ逆行プライマーとを用いて、ＰＣＲ法により上記の通りに増幅した。ＭＳＰ−１１９配列は、ＢａｍＨ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉの制限酵素消化により、ｐＧＥＭ−Ｔイージー−ＭＳＰ−１１９−ＰＫベクターから切り出した。ＥｃｏＲ Ｉにより、ＰＫタグ直前のＭＳＰ−１１９コード配列端において切断されるので好都合である。この断片をｐＧＥＸ−２Ｔ（英国、バックス、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現ベクター内にクローニングした後で、ロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞（英国、ノッティンガム、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内に形質転換した。一部の改変を伴いつつ、既に説明された１０通りにタンパク質を作製した。略述すると、０．２５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、形質転換された細菌の一晩にわたる培養物を誘導した。バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）及びベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）エンドヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、細胞を回収し溶解させ、次いで、超遠心分離した。製造元の指示書に従い、ＧＳＴバインド（ＧＳＴ・Ｂｉｎｄ）精製キット（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて透明化された抽出物から、アフィニティークロマトグラフィー法により組み換えタンパク質を精製した。組み換えＧＳＴ−ＭＳＰ−１３３及びＧＳＴ対照１０は、Ａ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｒ博士及びＩ．Ｔ．Ｌｉｎｇ博士（英国、ＮＩＭＲ）からのご厚意による寄贈物であった。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡ法
既に説明された３０通りに、尾静脈血液試料から血清を採取した。組み換えＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴ対照を、室温（ＲＴ）で一晩にわたり、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルのヌンク−イムノマキシソープ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｎｅｔｉｆｉｃ社製）に吸着させた。一部の改変を伴いつつ、既に説明された３０通りに、間接ＥＬＩＳＡ法により、抗体について血清を解析した。略述すると、０．０５％のトゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔ）によりプレートを洗浄し、室温で１時間にわたりＰＢＳ／Ｔ中に１０％のスキムミルク粉末によりブロックした。典型的には１：１００に血清を希釈し、２連ウェルに添加し、系列希釈した。室温で２時間にわたるインキュベーションの後、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス全ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、又はビオチン抱合ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に続き、アイソタイプ解析用のエクストラビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ）アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ社製）とのインキュベーションを用いて、結合した抗体を検出した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ社製）を添加することにより、プレートを成長させた。４０５ｎｍにおいて光学密度を読み取った（ＯＤ４０５）。未感作マウス血清のＯＤ４０５よりも標準偏差の３倍分大きな吸光度値（陽性血清に典型的なカットオフＯＤ４０５＝０．１５）における希釈曲線のｘ軸切片を目標力価とした。高力価の血清試料を、基準対照として全てのアッセイに含めた。
【０１０２】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）法
既に説明された２５通りに、ＩＣＳ法により、マウス脾臓細胞による特異的なＩＦＮ−γ分泌を調べた。略述すると、１０アミノ酸分重複する１５マーペプチドのプール（各ペプチドの最終濃度５μｇ／ｍＬ）により、３７℃で５時間にわたり、ゴルジプラグ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の存在下で、脾臓細胞を再刺激した。重複ペプチド（ＯＬＰ）プールは、５２ペプチドを含有するＭＳＰ−１３３（アミノ酸１３４９〜１６６３）、及び１９ペプチドを含有するＭＳＰ−１１９（アミノ酸１６５４〜１７５７）に対応した。ＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＦｃ受容体をブロックした。ＰＢＳ中で細胞を２度にわたり洗浄し、ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）標識抗ＣＤ８α抗体（クローン５３−６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、４℃で３０分間にわたり表面染色した。ＰＢＳにより細胞を２度にわたり洗浄し、次いで、１００μＬのサイトフィックス／サイトパーム（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ）液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）中、４℃で２０分間にわたり透過処理した。パーム／ウォッシュ（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ）液により細胞を２度にわたり洗浄し、次いで、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抱合抗マウスＩＦＮ−γ抗体（クローンＸＭＧ１．２、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により４℃で３０分間にわたり染色した。パーム／ウォッシュ液中で細胞を２度にわたり洗浄し、１％ホルマリンを含有する１５０μＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。ＦＡＣＳカント（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）（英国、オックスフォード、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）ソフトウェア及びフロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェアを用いて、試料を解析した。非刺激対照細胞におけるバックグラウンド応答は全て≦０．０５％であり、刺激による応答からこれらの値を減じた。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける枯渇
プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー法により、ハイブリドーマ培養物上清からｉｎ ｖｉｖｏにおける枯渇用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を精製した。抗ＣＤ４ ＧＫ１．５（ラットＩｇＧ２ａ）及び抗ＣＤ８ ２．４３（ラットＩｇＧ２ａ）を、滅菌ＰＢＳ中で希釈した。正常ラットＩｇＧ（ｎＲａｔＩｇＧ）は、Ｓｉｇｍａ社から購入し、同じ方法で精製した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇又はＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇の場合、感作第−２日及び第−１日並びに感作日において、２００μｇの関連するｍＡｂをマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。感作後第＋７日、第＋１４日、及び第＋２１日において、同用量のｍＡｂをマウスにさらに投与した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞枯渇の程度は、枯渇マウス及び対照マウスに由来する表面染色脾臓細胞に対するフローサイトメトリー法により評価した。細胞は、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抱合抗マウスＣＤ８α抗体（クローン５３−６．７）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体（クローンＲＭ４−５）、及びＡＰＣ抱合抗マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、上記の通りに表面染色した。
【０１０４】
プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣ及びスポロゾイトによる感作
プラスモジウム・ヨエリ原虫（ＹＭ株）は、Ｇ．Ａ．Ｂｕｔｃｈｅｒ博士（英国、ロンドン、インペリアルカレッジ）のご厚意により提供され、それを凍結保存するか又はマウス中で定期的に継代した。血液段階感作の場合、マウスには１０４個の寄生赤血球（ｐＲＢＣ）を静脈内（ｉ．ｖ．）経路により感染させた。ギムザ染色された血液塗抹標本の顕微鏡検査により、感作後第２日から寄生虫血をモニターした。寄生虫血レベルは光学顕微鏡法により評価し、ｐＲＢＣ百分率として計算した。５０視野の観察において、マウスは、明らかな寄生虫血の不在下で非感染であるとみなされた。スポロゾイト感作については、感染した雌のステフェンスハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の唾液腺を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中でホモジナイズし、原虫を放出した。静脈内経路を介して５０匹のスポロゾイトによりマウスを感作し、上記の通りに、第５日から血液段階の寄生虫血をモニターした。
【０１０５】
肝臓におけるプラスモジウム・ヨエリ原虫負荷量の定量
上記の通りに、５，０００匹のスポロゾイトによりマウスを感作した。４８時間後に肝臓を回収し、液体窒素中で瞬時凍結させた。８ｍＬのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で全肝臓をホモジナイズした。既に説明された通り３１に、クロロホルムを用いて全肝臓ＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量した。ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により４０μｇのＲＮＡを消化し、ＲＮイージーミネリュートクリーンアップ（ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ）キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ）プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、オリゴ−ｄＴ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ）、及びＲＮアージンプラス（ＲＮａｓｉｎ Ｐｌｕｓ）阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、２μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ローター−ジーン３０００（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ３０００）（オーストラリア、シドニー、Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いる定量的リアルタイムＰＣＲ法により、３連で、プラスモジウム・ヨエリ１８Ｓ ｒＲＮＡ又はマウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｍＧＡＰＤＨ）をコードするｃＤＮＡを増幅した。２０ピコモルの特異的プライマー対のいずれか（ＰｙＦ ５’−ＧＧＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＧＣ Ｇ−３’及びＰｙＲ ５’−ＡＡＧ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＴＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＡＴ−３’；ｍＧＦ ５’−ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＣ−３’及びｍＧＲ ５’−ＧＧＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＧＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＡ−３’）を、ｄｓＤＮＡ特異的蛍光染料であるサイバーグリーンＩ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）を含有するクォンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社製）中に含めた。反応の温度プロファイルは既に説明されている３２。関連する標的ｃＤＮＡ分子を含有するｐＧＥＭ−Ｔイージープラスミドの１０倍段階希釈液を増幅することにより作製した検量線と対比させて読み取ることにより、各ＰＣＲ法の閾値サイクル値（ＣＴ）を、ＤＮＡコピー数相当値に変換した。各試料について、肝臓段階の原虫負荷量を、プラスモジウム・ヨエリ１８Ｓ ｒＲＮＡについて測定されたＤＮＡコピー数相当値の、ｍＧＡＰＤＨの場合のＤＮＡ相当値に対する比として決定した。
【０１０６】
統計学的解析
グラフパッドプリズムフォーウィンドウズバージョン４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖ４）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて、データを解析した。適切な場合は、独立試料による又は対応のあるスチューデントのｔ検定を実施して、２群間における応答の平均を比較した。適切な場合は、ボンフェローニ又はダネットの事後補正による一方向群間ＡＮＯＶＡ法を用いて、２群を超える群間における応答を比較した。全ての場合において、ｐ≦０．０５の値を有意であると考えた。
【０１０７】
結果
ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる初回刺激−追加免疫間隔の延長を用いると、血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対するワクチンに誘導される抗体応答及び防御が増強される。
複製欠損型ウイルスを用いる異種初回刺激−追加免疫感作によるＴ細胞誘導法は、依然として、ＨＩＶ２３、マラリア２１、２４、２５、及び結核３３の領域における主導的なワクチン戦略である。ＡｄＨｕ５及びＭＶＡによるワクチンはまた、抗原特異的抗体も誘導しうる３４、３５。ＡｄＨｕ５による初回刺激及びワクシニアウイルスによる追加免疫を用いる１つの研究により、初回刺激−追加免疫間隔を２週間以上から８週間以上に延長すると、スポロゾイト抗原に対する抗体応答が増強されることが報告された３６。
【０１０８】
本発明者らは、マウスマラリアプラスモジウム・ヨエリに由来するＭＳＰ−１４２を発現するＡｄＨｕ５及びＭＶＡによるワクチン（それぞれ、Ａｄ４２及びＭ４２）を調製した。５×１０１０ｖｐのＡｄ４２により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを１回皮内免疫感作し、以後５６日間にわたるＥＬＩＳＡ法により、ＭＳＰ−１１９特異的な抗体応答をモニターした。図１ａに示す通り、ＭＳＰ−１１９に対する全ＩｇＧ抗体応答は、第１４日と比較して第５６日において著明に高度であった。ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる初回刺激−追加免疫（ＡｄＭ４２）後における免疫応答を評価するため、マウスをＡｄ４２により初回刺激し、次いで、第１４日（２週間後）又は第５６日（８週間後）において５×１０７ｐｆｕのＭ４２により皮内追加免疫した。追加免疫の１４日後において、ＭＳＰ−１４２に対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答を検査した。図１ｂは、８週間の初回刺激−追加免疫レジメン後における方が、ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対して著明により高度な全ＩｇＧ応答が誘導されたことを示す。ＡｄＭ４２（８週間）レジメンの場合においてＭＳＰ−１１９に対して達成された抗体応答は、１０５を超える目標力価を示す極めて強力なものであった。ＭＳＰ−１１９に対応するＯＬＰプールによる再刺激後の脾臓Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ−γ生成は検出されなかった（データは示さない）。図１ｃは、ＭＳＰ−１３３に対する強力なＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答が測定されたことを示す。これらは、ＡｄＭ４２（８週間）群において上昇する傾向にあったが、２週間レジメンと比較して著明に高度ではなかった。図１ｃはまた、いずれの群においても、ＭＳＰ−１３３に対して比較的弱いＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答が測定されうることも示す。
【０１０９】
ＡｄＭ４２ワクチン接種の防御効果を判定するため、本明細書末尾の表１ａで示す通り、追加免疫の２週間後において、１０４個のｐＲＢＣによりマウスを静脈内感作した。図１ｄ及び１ｅは、免疫未感作対照マウス及びＡｄＭ４２（２週間）による初回刺激−追加免疫レジメンを投与されたマウスの全てが、６日間以内にプラスモジウム・ヨエリ感染に罹患したことを示す。図１ｆは、ＡｄＭ４２（８週間）レジメンにより、７６％のマウスが感作に対して防御されたことを示す。ワクチンを介する血液段階での防御は、初回刺激−追加免疫間隔の延長を用いることにより達成される、著明に高度なレベルのＭＳＰ−１４２特異的ＩｇＧと相関した。
【０１１０】
ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作は、Ｔｈ１型抗体応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答を著明に増強し、プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣによる感作に対する防御効果を改善する。
国際公開２００５／０１４６５４号パンフレットでは、ｍＣ４ｂｐ及び別の補体成分ベースの「分子アジュバント」であるＣ３ｄの使用は、組み換え融合タンパク質ワクチン３７を用いる場合に有効であり、また、プラスミドＤＮＡワクチン３８を用いる場合にも有効であることが示されている。しかし、本発明以前に、こうした構築物のウイルスワクチンベクターによる発現は説明されていない。
【０１１１】
本発明者らは、Ｃ末端においてｍＣ４ｂｐに融合したＭＳＰ−１４２を発現するＡｄＨｕ５ベクター及びＭＶＡベクターを作製した。前出の通り、８週間の初回刺激−追加免疫間隔（ＡｄＭ４２対ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス免疫感作し、免疫応答を調べた。図２ａは、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現するベクターにより免疫感作されたマウスの方が、著明により高度な抗原特異的全ＩｇＧ応答を生じたことを示す。本発明者らは、防御的なＭＳＰ−１１９ドメイン１０に対して誘導されたＩｇＧのアイソタイププロファイルに焦点を当てた。注目すべきことに、図２ｂで示す通り、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現するベクターの使用により、ＭＳＰ−１４２を発現するベクターにより免疫感作されたマウスと比較して、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３レベルの著明な上昇、並びにＩｇＧ１レベルの低下を伴う、抗原特異的ＩｇＧのＴｈ１シフトが生じた。２群間で抗体結合活性３８の差は観察されなかった（データは示さない）。図２ｃは、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐベクターにより免疫感作されたマウスでは、ＭＳＰ−１３３特異的な脾臓ＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞百分率の著明な３倍の上昇もまた見られたことを示し、これがおそらく、この群におけるＴｈ１型のＩｇＧアイソタイプレベルの上昇を説明している。図２ｃはまた、ＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞百分率も上昇する傾向にあるが、著明なレベルには達しなかったことも示す。
【０１１２】
図２ｄは、血液段階のマラリア感作後において、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンにより免疫感作された全てのマウスが防御されたことを示す。表１ｂは、ＡｄＭ４２群におけるマウス１７匹中０匹と比較して、感作されたマウス１７匹中１０匹が無菌免疫（以後３０日間にわたる明らかな寄生虫血の不在により定義される）を示したことを示す。したがって、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作は、血液段階での感作に対する完全な防御を提供するだけでなく、血液段階における寄生虫血レベルの低下により定義されるより高品質の防御もまた提供する。
【０１１３】
ｐＲＢＣ感作時におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞枯渇は、ワクチンにより誘導される防御を除去しない。
本モデルにおいてワクチンにより誘導されるＴ細胞応答の防御的寄与を評価するため、前出の通り、最も防御的なレジメン（ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ）によりマウスを免疫感作し、ｐＲＢＣによる感作前にＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を枯渇させた。フローサイトメトリー法による解析は、ｉｎ ｖｉｖｏでの枯渇が＞９９％有効であることを示した（データは示さない）。表１ｃは、Ｔ細胞枯渇が、防御効果に影響を及ぼさなかったことを示す。こうして、ＭＳＰ−１４２に対してワクチンにより誘導される抗体応答は、感作時の本モデルにおけるマウスを完全に防御するのに十分である。
【０１１４】
プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣによる感作に対する防御は、ワクチンにより誘導されるＭＳＰ−１１９特異的ＩｇＧ２ａレベルと相関する。
本発明者らは既に、ＡｄＨｕ５ワクチン用量を増量した場合の免疫感作後における抗原特異的ＩｇＧ誘導の上昇を検出していた（データ非公開）。ＭＶＡに関してこのことを探索するため、ＡｄＨｕ５によりＢＡＬＢ／ｃマウスを初回刺激し、１０６ｐｆｕ又は５×１０７ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫した。図３ａは、いずれのワクチン構築物の場合においても、より低用量のＭＶＡにより追加免疫されたマウスの方が、著明により低度のＭＳＰ−１１９特異的な全ＩｇＧ応答を生じたことを示す。しかし、ＩｇＧアイソタイプ解析後においては、異なる序列が明らかであった。図３ｂは、前出で見られた通り、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐを発現するベクターによる免疫感作の方が、より多くのＴｈ１型ＩｇＧを誘導したことを示す。したがって、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ（１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いる）により免疫感作されたマウスにおける相対的に低度の全ＩｇＧレベルにもかかわらず、ＡｄＭ４２により免疫感作され、図３ｂで見られるいずれかの用量のＭＶＡにより追加免疫されたマウスと比較して、これらのマウスの方が、著明により高度なレベルのＩｇＧ２ａを保有していた。
【０１１５】
図３ｃは、１０６ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫するＡｄＭ４２による免疫感作後では、プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣによる感作後に生存したマウスが４０％に過ぎなかったことを示す。しかし、図３ｄ及び表１ｄから見られる通り、より低用量のＭＶＡを用いるにもかかわらず、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群では全てのマウスが生存し、これらマウスの３分の１が無菌免疫を示した。結果として、ＭＳＰ−１４２へのｍＣ４ｂｐの融合はまた、より低いワクチン用量においても、ＡｄＭワクチン接種による防御効果の増強を維持する。全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａの平均レベル対感作された全群に対する防御百分率の解析は、生存百分率とＭＳＰ−１１９特異的なＩｇＧ２ａとの間では有意な相関（スペアマンによるｒ＝０．９２８、ｐ＝０．０１７）がみられるが、全ＩｇＧ又はＩｇＧ１については同相関がみられないことを示した。
【０１１６】
ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作は、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトによる感作及び肝臓段階における赤外型に対する防御を可能とする。
ｐＲＢＣによるマラリア感作は、蚊媒介動物によるマラリア伝染の通常経路と異なる。こうして、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトによる感作に対するＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作の有効性が探索された。
【０１１７】
前出の通り、ＡｄＭ４２又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ（５×１０７ｐｆｕのＭＶＡによる追加免疫）により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。追加免疫の２週間後において、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５０匹によりマウスを感作した。表１ｅは、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群における１匹のマウスを除いて、全てのマウスが明らかな血液段階の寄生虫血を発現したが、図４ａ〜ｂから見られる通り、これらは全て、血液段階の寄生虫増殖をコントロールし、感染を除去する能力を有した。表１ａ〜ｂ、ｅで見られる通り、ｐＲＢＣによる感作モデルにおいて観察される場合と同様に、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐにより免疫感作されたマウスは、ＡｄＭ４２により免疫感作されたマウスと比較して、［より良質の血液段階免疫による］より低度の原虫密度を示した。表１ｅは、未感作マウスが、１０４個のｐＲＢＣにより感作されたマウスと同一の形で血液段階の感染に罹患したことを示す。
【０１１８】
これらのワクチンによる血液段階における免疫の誘導を踏まえるなら、これらのデータから、スポロゾイトによる感作後の血液段階における寄生虫血の軽減がまた、部分的には肝臓段階における原虫負荷量の低下にも起因するかどうかを見分けることは不可能である。これらのワクチン接種レジメンは、ＭＳＰ−１３３に対する強力なＴ細胞応答を引き起こす（図２ｃを参照されたい）ので、これらのエフェクターＴ細胞による後期赤外シゾントに対する防御が可能でありうる１９。これに取り組むため、マウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５，０００匹により感作した。確立されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ３２を用いて、感作の４８時間後における肝臓段階の原虫負荷量を定量化したところ、図４ｃが示すように、いずれのワクチンレジメンにより免疫感作されたマウスにおいても著明な低下がみられる。これらのデータは、図４ａ及び４ｂで示される前出の感作試験と符合し、これは、肝臓段階における原虫負荷量が平均３５〜４０％低下する結果として無菌免疫がもたらされるわけではなく、したがって血液段階の感染が阻止されるわけでもないことを意味する。したがって、ＡｄＨｕ５−ＭＶＡによる免疫感作後におけるＭＳＰ−１に対するＴ細胞応答及び抗体応答の誘導により、マラリア感染に対する多段階の防御を提供することができる。
【０１１９】
ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作は、プラスモジウム・ヨエリのＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓段階及び血液段階の原虫に対する防御を可能とする。
プラスモジウム・ヨエリの肝臓段階及び血液段階のいずれの原虫に対する防御も、遺伝子制御下にあることが報告されている４０、４１。この新規の免疫感作戦略がまた、異なる遺伝的バックグラウンドにおけるマウスも防御しうるかどうかを評価するため、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける有効性を評価した。５×１０７ｐｆｕのＭＶＡを用いて追加免疫する、同じＡｄＭ４２レジメン又はＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐレジメンによりマウスを免疫感作した。免疫応答の評価により、ＢＡＬＢ／ｃマウスで見られたパターンとは異なる免疫原性パターンが示された。図５ａで示される通り、ＭＳＰ−１１９及びＭＳＰ−１３３に対する全ＩｇＧ応答は、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群において著明ではないわずかな上昇を示した。ＭＳＰ−１３３特異的なＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答を脾臓において測定することができ、また、図５ｂから見られる通り、ＢＡＬＢ／ｃマウスとは異なり、ＭＳＰ−１３３及びＭＳＰ−１１９のいずれに対してもＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答を検出することができた。図５ｂはまた、ＭＳＰ−１４２−Ｃ４ｂｐ構築物を用いると、ＭＳＰ−１１９ではなくＭＳＰ−１３３に対するＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答が著明に増強され、ＭＳＰ−１３３に対するＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答は３倍に増強されたことも示す。表１ｆで示される通り、１０４個のｐＲＢＣによりマウス群を感作したところ、免疫感作された全てのマウスが防御され、ここでもまた、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群におけるマウスの方が、ＡｄＭ４２群と比較してより高度の防御を示した。加えて、図５ｃで示される通り、５，０００匹のスポロゾイトによる感作後のＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐ群において、肝臓段階の原虫負荷量の著明な低減が観察され、これは、この群におけるＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答の増強を示す図５ｂに由来する結果と相関する。これらのデータは、ＡｄＭ４２−Ｃ４ｂｐによる免疫感作の免疫原性及び防御効果は１つの遺伝的バックグラウンドに限定されず、したがって、熱帯性マラリア原虫ＭＳＰ−１を標的とする同等の戦略が遺伝的に多様なヒト集団において有効でありうることを示す。
【０１２０】
考察
本報告では、初回刺激−追加免疫感作レジメンにおいて血液段階のマラリア、具体的には、ＭＳＰ−１４２を標的とする複製欠損型のアデノウイルス及びＭＶＡによるワクチンベクターの初めての使用について説明される。本免疫感作レジメンは、ＭＳＰ−１４２特異的な細胞性応答に対して高度に免疫原性であるだけでなく、抗体誘導に対しても驚くべき程度に免疫原性である。本発明者らは、同種初回刺激−追加免疫レジメン、又はＤＮＡ−ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＡｄＨｕ５、及びＤＮＡ−ＡｄＨｕ５など他の異種初回刺激−追加免疫レジメンと比較して、ＡｄＨｕ５−ＭＶＡが抜群に最良のレジメンであることを見出した（データは非公開）。Ａｄ４２による単回の免疫感作後、ＭＳＰ−１１９に対する抗体応答は、他の組み換えＡｄＨｕ５ワクチンについて報告される場合３５、４２と同様、２カ月間にわたり上昇し続けた。２週間後ではなく８週間後におけるＭＶＡ追加免疫の投与により抗体レベルの増強がもたらされ、こうして、血液段階のプラスモジウム・ヨエリに対する防御に必要な高度に防御的な閾値に達した。他の試験において、ＡｄＨｕ５ワクチンは強力な免疫原性を示しており、この期間の延長がＢ細胞及びヘルパーＴ細胞による最適の記憶集団の形成には必要な場合があり、これがＭＶＡによってより有効に追加免疫される。ＡｄＨｕ５と複製能を有する生のワクシニアウイルスを用いてプラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト周囲タンパク質を標的とする場合に、長期のベクター間投与間隔について同様の知見が報告された３６。
【０１２１】
ｍＣ４ｂｐに融合したＭＳＰ−１４２を発現するＡｄＨｕ５−ＭＶＡベクターを用いたところ、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれにおいても、血液段階の感作に対する防御効果の増強が達成された。この構造的モチーフは、組み換えＭＳＰ−１１９に対する体液性免疫応答を補助することが示されている［国際公開２００５／０１４６５４号パンフレット］。本明細書において、本発明者らは、このモチーフがＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＳＰ−１特異的な免疫応答及びＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答を補助するだけでなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答及びＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答もまた補助する能力を有することを報告している。これが生じる機構は未知のままであるが、抗原のオリゴマー化４３、又はこのコアドメインがＣＤ４０４４又はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）４５に結合する能力を含む可能性がある。ＣＲＰが、マウスにおける急性期タンパク質として重要でないことには注意すべきであるが、後二者は、ｍＣ４ｂｐと融合した抗原を標的として抗原提示細胞上の受容体へと導くのに有効でありうる。
【０１２２】
本研究では、ＭＳＰ−１３３に対する抗体が血液段階の免疫において役割を果たすかどうかを評価しなかったが、これらは、プラスモジウム・ヨエリに対して防御的でないことが報告されている１０。ＭＳＰ−１３３又はＭＳＰ−１１９を発現するＡｄＨｕ５ベクター及びＭＶＡベクターの作製がこの問いに答えるであろう。しかしながら、ＭＳＰ−１１９特異的なＩｇＧ２ａレベルは、血液段階における免疫の増強と強く相関した。これは、プラスモジウム・ヨエリモデルにおける他の研究、例えば、ＣｐＧ４６ワクチンアジュバント又はＩＬ−１２４７ワクチンアジュバントを用いる研究、及び熱帯熱マラリア原虫頂端膜抗原−１４８を標的とするワクチンについての研究と符合する。Ｔｈ１型アイソタイプ抗体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）はまた、ヒトにおける生得的免疫とも関連する４９。フロイントなど従来のアジュバントにより非常な高力価まで誘導されるＴｈ２型のＩｇＧ１もまた、防御と相関する９。しかし、わずか２回の免疫感作及び中程度のレベルのＩｇＧ導入後では、Ｔｈ１型ＩｇＧアイソタイプの方が、Ｔｈ２型アイソタイプよりも有効な防御を提供しうる。
【０１２３】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇は、これらのマウスにおける血液段階の免疫を除去しなかった。生理学的な関連性を有するワクチン接種レジメン及びＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇を用いる他の試験では、免疫の喪失が示されないか又は免疫の可変的な低下が示されているが９、４６、ＭＳＰ−１３３に特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞株は、適合移植後においてプラスモジウム・ヨエリに対してマウスを防御することが報告されている１５。プラスモジウム・ヨエリのＭＳＰ−１１９におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープについての説明１４に反して、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるこのドメインに対してＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答のみを検出した。先行研究では、抗原処理に対するＭＳＰ−１１９の不応的性質１３が説明されており、そのため、ＭＳＰ−１３３に対するＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞応答がＭＳＰ−１１９に対する抗体応答にとっても重要である可能性は依然として高い。ＣＤ８＋ ＩＦＮ−γ＋ Ｔ細胞応答は、ＭＳＰ−１３３に対してのみ検出された。肝臓段階の免疫を媒介するその能力は、肝臓段階負荷量の同等の部分的な低下を裏付けた別の研究１９と符合し、ＭＳＰ−１１９ベースのワクチンでなくＭＳＰ−１４２ベースのワクチンの使用を擁護する。
【０１２４】
これらの知見により、血液段階のマラリアに対して、アジュバント含有組み換えタンパク質製剤９、１０の複数回投与と同等の防御的免疫を誘導しうる、新規のワクチン接種戦略が得られる。しかし、これらのタンパク質ワクチンと異なり、これらのベクターを用いる血液段階の抗原に対する強力なＴ細胞応答の誘導はまた、部分的な肝臓段階免疫も提供する可能性があり、部分的に有効な前赤内抗原ベクターとこれらとの組み合わせも可能とするであろう。本発明者らの知る限りにおいて、これは、マラリアに対する完全な多段階免疫が、わずかに２回の免疫感作による動物モデル、又はウイルスベクターワクチンを用いる動物モデルにおいて誘導されうることの最初の裏付けである。この奏功するワクチン接種戦略はまた、強力なＴ細胞及び抗体の両方が防御に必要とされる多数の病原体に適用されるであろう。
【０１２５】
簡便なアジュバント投与戦略によるＴ細胞免疫原性の増強は、長期にわたり模索されてきたワクチン学の目標であった。本発明者らは、本明細書において、Ｃ４ｂｐコアドメインをコードするベクターにおいて、単に抗原遺伝子に延長部分を付加することによる、ＣＤ４ Ｔ細胞応答及びＣＤ８ Ｔ細胞応答の実質的な増強の導入について報告している。異なる種における免疫原性の最適の増強を達成するには、例えば、Ｃ４ｂｐコア配列をワクチン配列にマッチさせることによる、配列の適切な調整を必要としうることが想定される。様々な種に由来するＣ４ｂｐコア配列は、既知であるか又は分子生物学的方法により容易に決定される。
【０１２６】
表１
【表２】
【０１２７】
表１続き
【表３】
【０１２８】
表１は、各種のワクチンによる免疫感作がもたらす、プラスモジウム・ヨエリによるマラリア感作に対する防御を示す。説明された通り、マウスを免疫感作し、プラスモジウム・ヨエリのｐＲＢＣ １０４個又はプラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト５０匹により感作した。マウスの株、用いられた免疫感作レジメン、ＭＶＡ用量、及び防御されたマウス数が示される。防御された群では、感作後に生存したマウスについて、血液段階における寄生虫血百分率ピーク値の中央値及び範囲を示す。† この群内における１７匹中１０匹のマウスが、無菌免疫（感作後３０日間にわたる明らかな寄生虫血の不在により定義される）を示した。††、††† これらの群内における６匹中２匹（††）及び６匹中１匹（†††）のマウスが、無菌免疫を示した。
【０１２９】
参照
１． Ｓｎｏｗ， Ｒ．Ｗ．， Ｇｕｅｒｒａ， Ｃ．Ａ．， Ｎｏｏｒ， Ａ．Ｍ．， Ｍｙｉｎｔ， Ｈ．Ｙ． ＆ Ｈａｙ， Ｓ．Ｉ． Ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ． Ｎａｔｕｒｅ ４３４， ２１４−７ （２００５）．
２． Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｂ．Ｍ．， Ｂｏｊａｎｇ， Ｋ．， Ｗｈｉｔｔｙ， Ｃ．Ｊ． ＆ Ｔａｒｇｅｔｔ， Ｇ．Ａ． Ｍａｌａｒｉａ． Ｌａｎｃｅｔ ３６５， １４８７−９８ （２００５）．
３． Ｒｉｌｅｙ， Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰｆＭＳＰ１） ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ． Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４， ３２１−３７ （１９９２）．
４． Ｍａｈａｎｔｙ， Ｓ．， Ｓａｕｌ， Ａ． ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｈ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ ２０６， ３７８１−８ （２００３）．
５． Ｈｏｌｄｅｒ， Ａ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９４ （Ｐｔ ２）， １９９−２０８ （１９８７）．
【０１３０】
６． Ｂｌａｃｋｍａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｈｅｉｄｒｉｃｈ， Ｈ．Ｇ．， Ｄｏｎａｃｈｉｅ， Ｓ．， ＭｃＢｒｉｄｅ， Ｊ．Ｓ． ＆ Ｈｏｌｄｅｒ， Ａ．Ａ． Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍａｌａｒｉａ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｍａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｅ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７２， ３７９−８２ （１９９０）．
７． Ｔｉａｎ， Ｊ．Ｈ．， Ｋｕｍａｒ， Ｓ．， Ｋａｓｌｏｗ， Ｄ．Ｃ． ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｈ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５， ３０３２−６ （１９９７）．
８． Ｄａｒｋｏ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ ４２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＦＶＯ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ａｏｔｕｓ ｎａｎｃｙｍａｉ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ−ｓｔａｇｅ ｐａｒａｓｉｔｅｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３， ２８７−９７ （２００５）．
９． Ｈｉｒｕｎｐｅｔｃｈａｒａｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ （ＭＳＰ１［１９］） ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９， ３４００−１１ （１９９７）．
１０． Ａｈｌｂｏｒｇ， Ｎ．， Ｌｉｎｇ， Ｉ．Ｔ．， Ｈｏｗａｒｄ， Ｗ．， Ｈｏｌｄｅｒ， Ａ．Ａ． ＆ Ｒｉｌｅｙ， Ｅ．Ｍ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ４２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ （ｋＤａ） ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ １９−ｋＤａ ｒｅｇｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｊａｃｅｎｔ ３３−ｋＤａ ｒｅｇｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， ８２０−５ （２００２）．
【０１３１】
１１． Ｙｕｅｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ３３−ｋＤａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １， ＭＳＰ１： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２５， ４９０−９ （２００７）．
１２． Ｇｏｏｄ， Ｍ．Ｆ．， Ｘｕ， Ｈ．， Ｗｙｋｅｓ， Ｍ． ＆ Ｅｎｇｗｅｒｄａ， Ｃ．Ｒ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３， ６９−９９ （２００５）．
１３． Ｈｅｎｓｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ ｉｍｐｅｄｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４， ６３９−４８ （２００４）．
１４． Ｔｉａｎ， Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ １９ ｋＤａ ｃａｒｂｏｘｙｌｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＭＳＰ１（１９）） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｍａｌａｒｉａ． Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０， ２６３−７８ （１９９８）．
１５． Ｗｉｐａｓａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ３３−ｋＤａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９， ９４４−５１ （２００２）．
【０１３２】
１６． Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｓ．Ｒ．， Ｋｕｎｓ， Ｒ．Ｄ． ＆ Ｇｏｏｄ， Ｍ．Ｆ． Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｓｕｂｐａｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３， ２４７８−８５ （２００５）．
１７． Ｐｏｍｂｏ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｍａｌａｒｉａ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ． Ｌａｎｃｅｔ ３６０， ６１０−７ （２００２）．
１８． Ｖｉｎｅｔｚ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｉｍａｌｓ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４， １０６９−７４ （１９９０）．
１９． Ｋａｗａｂａｔａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， ６０７５−８２ （２００２）．
２０． Ｓａｃｃｉ， Ｊ．Ｂ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｌｉｖｅｒ ｓｔａｇｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ １４２， １７７−８３ （２００５）．
【０１３３】
２１． Ｄｕｎａｃｈｉｅ， Ｓ．Ｊ． ＆ Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． Ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ ２０６， ３７７１−９ （２００３）．
２２． Ｂｅｊｏｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓａｆｅｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｏｗｌｐｏｘ ｓｔｒａｉｎ ＦＰ９ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｒ ｅｉｔｈｅｒ ｏｆ ２ ｐｒｅｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｍａｌａｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ， ＭＥ−ＴＲＡＰ ｏｒ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ Ｋｅｎｙａ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４２， １１０２−１０ （２００６）．
２３． Ｃａｔａｎｚａｒｏ， Ａ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｓｅ １ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｌａｄｅ ＨＩＶ−１ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９４， １６３８−４９ （２００６）．
２４． Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０， １０３９−４５ （２００２）．
２５． Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ． ｂｅｒｇｈｅｉ． Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ （２００７）．
【０１３４】
２６． Ｂｌｏｍ， Ａ．Ｍ．， Ｖｉｌｌｏｕｔｒｅｉｘ， Ｂ．Ｏ． ＆ Ｄａｈｌｂａｃｋ， Ｂ． Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｉｅｎｄ ｏｒ ｆｏｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ？ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０， １３３３−４６ （２００４）．
２７． Ｌｅｗｉｓ， Ａ．Ｐ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ２３０−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ３６， ２７１−８２ （１９８９）．
２８． ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ．， Ｂｅｈｂｏｕｄｉ， Ｓ．， Ｇｏｏｎｅｔｉｌｌｅｋｅ， Ｎ．， Ｂｒｏｏｋｅｓ， Ｒ． ＆ Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ＣＤ８（＋）− ａｎｄ ＣＤ４（＋）−Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， １６２３−６ （２００２）．
２９． ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ．， Ｂｒｏｏｋｅｓ， Ｒ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｓ．Ｃ． ＆ Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＤ４（＋） ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９， ６８１−６ （２００１）．
３０． Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ， Ｃ．Ｌ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｓ．Ｃ．， Ｈｉｌｌ， Ａ．Ｖ． ＆ Ｍｏｏｒｅ， Ａ．Ｃ． Ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｘｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５， ５９９−６０６ （２００５）．
【０１３５】
３１． Ｂｒｉｏｎｅｓ， Ｍ．Ｒ．， Ｔｓｕｊｉ， Ｍ． ＆ Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ， Ｖ． Ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｍｉｃｅ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｅｎｔｅｒ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ７７， ７−１７ （１９９６）．
３２． Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｉｔｅ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ３１， １４９９−５０２ （２００１）．
３３． ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ａ ｂｏｏｓｔｓ ＢＣＧ−ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａｎｔｉｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １０， １２４０−４ （２００４）．
３４． Ｃｈｅｎ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９， ２６７８−８８ （２００５）．
３５． Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｎ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４２４， ６８１−４ （２００３）．
【０１３６】
３６． Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ， Ｏ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａ， Ｇ．， Ｈａｆａｌｌａ， Ｊ．Ｃ．， Ｔｓｕｊｉ， Ｍ． ＆ Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ， Ｒ．Ｓ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ， ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｏｆ ｍｉｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｌａｓｍｏｄｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， １１４９１−６ （２００１）．
３７． Ｄｅｍｐｓｅｙ， Ｐ．Ｗ．， Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｋｋａｒａｊｕ， Ｓ．， Ｇｏｏｄｎｏｗ， Ｃ．Ｃ． ＆ Ｆｅａｒｏｎ， Ｄ．Ｔ． Ｃ３ｄ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｄｊｕｖａｎｔ： ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１， ３４８−５０ （１９９６）．
３８． Ｒｏｓｓ， Ｔ．Ｍ．， Ｘｕ， Ｙ．， Ｂｒｉｇｈｔ， Ｒ．Ａ． ＆ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ．Ｌ． Ｃ３ｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １， １２７−３１ （２０００）．
３９． Ｄｏｏｌａｎ， Ｄ．Ｌ． ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｓ．Ｌ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５， １４５３−６２ （２０００）．
４０． Ｔｉａｎ， Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｏｎｇｅｎｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７， １１７６−８３ （１９９６）．
【０１３７】
４１． Ｗｅｉｓｓ， Ｗ．Ｒ．， Ｇｏｏｄ， Ｍ．Ｆ．， Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ， Ｍ．Ｒ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｈ． ＆ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ， Ｊ．Ａ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３， ４２６３−６ （１９８９）．
４２． Ｇａｏ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０， １９５９−６４ （２００６）．
４３． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｏｃｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４， ４６７２−８ （２０００）．
４４． Ｂｒｏｄｅｕｒ， Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｃ４ＢＰ） ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＣＤ４０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８， ８３７−４８ （２００３）．
４５． Ｓｊｏｂｅｒｇ， Ａ．Ｐ．， Ｔｒｏｕｗ， Ｌ．Ａ．， ＭｃＧｒａｔｈ， Ｆ．Ｄ．， Ｈａｃｋ， Ｃ．Ｅ． ＆ Ｂｌｏｍ， Ａ．Ｍ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６， ７６１２−２０ （２００６）．
【０１３８】
４６． Ｈｉｒｕｎｐｅｔｃｈａｒａｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｙｅａｓｔ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ １９ ｋＤａ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ （ＭＳＰ１（１９）） ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２１， ２９２３−３２ （２００３）．
４７． Ｓａｋａｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｇｕｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｉｎ Ａ／Ｊ ｍｉｃｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２１， １４３２−４４ （２００３）．
４８． Ｍｕｌｌｅｎ， Ｇ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＭＡ１−Ｃ１／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ， ａ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ， ｗｉｔｈ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２４， ２４９７−５０５ （２００６）．
４９． Ｂｏｕｈａｒｏｕｎ−Ｔａｙｏｕｎ， Ｈ． ＆ Ｄｒｕｉｌｈｅ， Ｐ． Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｉｓｏｔｙｐｅ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｌａｙｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６０， １４７３−８１ （１９９２）．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸配列とを含むウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸が、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにある、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
コードされたＣ４ｂｐドメインが、図６又は図７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｃ４ｂｐドメインと対象とする抗原とが融合タンパク質として発現される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ウイルスベクターが、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
抗原がマラリア抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
抗原が、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１である、請求項７又は８に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
抗原が血液段階のマラリア抗原である、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
１種又は複数種の薬学的に許容される媒体、担体、希釈剤、又はアジュバントと混合した、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項１２】
ａ）第１のウイルスベクターを含む初回刺激組成物であって、前記ウイルスベクターがＣ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片と、少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む初回刺激組成物と、
ｂ）第２のウイルスベクターを含む追加免疫組成物であって、前記第２のウイルスベクターが前記第１のウイルスベクターとは異なり、Ｃ４ｂｐドメインと、初回刺激組成物の病原体又は腫瘍抗原と同じである少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む追加免疫組成物と、を含む、製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１３】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸が、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにある、請求項１２に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１４】
コードされたＣ４ｂｐドメインが、図６又は図７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１５】
各ベクター内のＣ４ｂｐドメインと対象とする抗原とが融合タンパク質として発現される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１６】
各ウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１７】
前記第１のウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１８】
前記第２のウイルスベクターがポックスウイルスベクターである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１９】
抗原がマラリア抗原である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ、又はキット。
【請求項２０】
Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸とを含むウイルスベクター。
【請求項２１】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸が、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにある、請求項２０に記載のウイルスベクター。
【請求項２２】
コードされたＣ４ｂｐドメインが、図６又は図７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項２０又は２１に記載のウイルスベクター。
【請求項２３】
Ｃ４ｂｐドメインと対象とする抗原とが融合タンパク質として発現される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２４】
ウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２５】
ウイルスベクターが、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２６】
抗原がマラリア抗原である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２７】
免疫原性組成物又はワクチンとして用いられる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２８】
マラリアの予防又は治療用の免疫原性組成物又はワクチンの製造における、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項２９】
マラリアの予防又は治療用の免疫原性組成物又はワクチンによる製剤において用いられる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項３０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、少なくとも１種の有効量の免疫原性組成物を投与することにより、個体を免疫感作する方法。
【請求項３１】
異種初回刺激−追加免疫レジメンを用いて個体を免疫感作する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第１の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンがアデノウイルスベクターを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンがポックスウイルスベクターを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１の単位用量の投与と第２の単位用量の投与との間の期間が２〜８週間である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
病原体又は腫瘍の少なくとも１種の標的抗原に対する防御的なＴ細胞応答を対象において発生させるための、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ、又はキットの使用。
【請求項３５】
ワクチンとして用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
マラリアの治療又は予防用の、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１】
Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸配列とを含むウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸が、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにある、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
コードされたＣ４ｂｐドメインが、図６又は図７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｃ４ｂｐドメインと対象とする抗原とが融合タンパク質として発現される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ウイルスベクターが、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
抗原がマラリア抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
抗原が、ＭＥ−ＴＲＡＰ、ＣＳＰ、ＭＳＰ−１若しくはこれらの断片、又はＡＭＡ１である、請求項７又は８に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
抗原が血液段階のマラリア抗原である、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
１種又は複数種の薬学的に許容される媒体、担体、希釈剤、又はアジュバントと混合した、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項１２】
ａ）第１のウイルスベクターを含む初回刺激組成物であって、前記ウイルスベクターがＣ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片と、少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む初回刺激組成物と、
ｂ）第２のウイルスベクターを含む追加免疫組成物であって、前記第２のウイルスベクターが前記第１のウイルスベクターとは異なり、Ｃ４ｂｐドメインと、初回刺激組成物の病原体又は腫瘍抗原と同じである少なくとも１種の病原体又は腫瘍抗原とをコードする核酸をさらに含む追加免疫組成物と、を含む、製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１３】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸が、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにある、請求項１２に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１４】
コードされたＣ４ｂｐドメインが、図６又は図７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１５】
各ベクター内のＣ４ｂｐドメインと対象とする抗原とが融合タンパク質として発現される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１６】
各ウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１７】
前記第１のウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１８】
前記第２のウイルスベクターがポックスウイルスベクターである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１９】
抗原がマラリア抗原である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ、又はキット。
【請求項２０】
Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくは断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸とを含むウイルスベクター。
【請求項２１】
Ｃ４ｂｐドメインをコードする核酸が、対象とする抗原をコードする核酸とインフレームにある、請求項２０に記載のウイルスベクター。
【請求項２２】
コードされたＣ４ｂｐドメインが、図６又は図７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項２０又は２１に記載のウイルスベクター。
【請求項２３】
Ｃ４ｂｐドメインと対象とする抗原とが融合タンパク質として発現される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２４】
ウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、鶏痘、カナリア痘、又はＡＬＶＡＣなどのアビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペス及びＣＭＶを含む）、アルファウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２５】
ウイルスベクターが、ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２６】
抗原がマラリア抗原である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２７】
免疫原性組成物又はワクチンとして用いられる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２８】
マラリアの予防又は治療用の免疫原性組成物又はワクチンの製造における、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項２９】
マラリアの予防又は治療用の免疫原性組成物又はワクチンによる製剤において用いられる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項３０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、少なくとも１種の有効量の免疫原性組成物を投与することにより、個体を免疫感作する方法。
【請求項３１】
異種初回刺激−追加免疫レジメンを用いて個体を免疫感作する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第１の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンがアデノウイルスベクターを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の単位用量を形成する免疫原性組成物又はワクチンがポックスウイルスベクターを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１の単位用量の投与と第２の単位用量の投与との間の期間が２〜８週間である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
病原体又は腫瘍の少なくとも１種の標的抗原に対する防御的なＴ細胞応答を対象において発生させるための、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の製品、組み合わせ、又はキットの使用。
【請求項３５】
ワクチンとして用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
マラリアの治療又は予防用の、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２３１３８（Ｐ２０１０−５２３１３８Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２５７０（Ｐ２０１０−５０２５７０）
【出願日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２７１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２２８１７
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５０３３４２６４９）アイシス イノヴェイション リミテッド (13)
【出願人】（５０９２７８７２６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２７１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２２８１７
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５０３３４２６４９）アイシス イノヴェイション リミテッド (13)
【出願人】（５０９２７８７２６）
【Ｆターム（参考）】
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