免疫学的に活性な組成物
本発明は、付着した標的分子の有無にかかわらず、１つ又は複数のタンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質又はその他の生物活性物質からなる微粒子担体系を提供する。さらに、本発明は、免疫修飾組成物並びに、非感染及び感染宿主の両方における防御免疫応答の誘発方法のほか、免疫寛容性の誘導方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、防御免疫又は寛容性を誘導することができる免疫学的に活性な組成物を提供する。非感染及び感染宿主のいずれにおいても防御免疫を誘導する組成物は、抗原エピトープから成るが、免疫「回避」に関与する又は寛容性を誘導するエピトープを、除外又は排除する。防御免疫は、病原体関連分子パターン及び／又は、抗原エピトープを伴う若しくは伴わない担体を含む組成物によっても誘導することができる。寛容性を誘導する別の免疫学的に活性な組成物は、担体の有無にかかわらず、病原体回避（ｐｈａｔｏｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ）に重要なエスケープエピトープ又は分子パターンを含む。さらに、本発明は、このような免疫学的に活性な分子の同定方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学の進歩は、病原体を制御する先天性免疫応答及び適応免疫応答の誘導要件を含む、免疫モジュレーターの開発に不可欠な免疫因子を同定した。
【０００３】
広範な抗生物質耐性の出現に伴い、免疫モジュレーターは、細胞内病原体を含む微生物に対する長期防御を与える最も有効なアプローチとなりえる。免疫モジュレーターに対する現在の関心の中心は、新規ベクター、有効な担体、及びアジュバント系の開発を必要としている。
【０００４】
病原体は、Ｔｈ２応答及び寛容性も誘導することができるため、これを理解することは、自己免疫疾患、移植及びその他の医学的適用に関する免疫モジュレーターの開発に使用されることができる。ほとんどの病原体は、皮膚及び粘膜を介して生体に侵入する。したがって、これらの投与経路は、皮膚、気道、消化管、又は性器を介して侵入する感染に対する免疫調節に特によく適している。従来のワクチンは、実際の感染部位から離れて非経口的に投与され、これらの粘膜応答はあまり顕著ではない。
【０００５】
現在、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の他に、先天性免疫応答に重要な役割を果たす、他の受容体及び経路があることが明らかになっている。この一例が、細胞内微生物の微生物モチーフを認識するヌクレオチド−オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質である。細胞外マトリックスタンパク質であるミンジン（Ｍｉｎｄｉｎ）もまた、幾つかの細菌表面成分に対する炎症反応メディエーターである。これら及びその他の研究は、先天性免疫には、ＴＬＲシグナル伝達とは無関係の別の因子が関与していること、ＮＦκＢ又はＩＬ−１産生が、感染の制御に不十分である可能性があることを示唆している。
【０００６】
感染制御に関与する先天性免疫の典型要素は、以下の通りである。（１）炎症誘発性反応：ＮＦκＢの媒介、多くの炎症物質を活性化し、過剰刺激はショックをもたらすことができる、（２）カチオン性宿主防御ペプチド：細菌病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及びシグナル伝達分子により刺激されたペプチド産生の増加、（３）食細胞の活性化：好中球及びマクロファージにおける細胞内殺菌の増加（いずれも酸化及び非酸化機構が増大し、サイトカイン産生が増加）、（４）走化性：食細胞の内皮接着、感染部位への細胞移動、漏出の増加、（５）細胞外殺菌機構：補体の活性化、鉄キレート化の増大、抗微生物ペプチドの分泌、分解酵素の産生、（６）感染汚染：フィブリノーゲン活性化を介した血栓形成、（７）創傷修復：線維芽細胞の増殖及び接着、血管新生、並びに（８）適応免疫応答：Ｂ及びＴ細胞の活性化（樹状細胞を介すことが多い）。
【０００７】
先天性免疫の刺激は、インターフェロン、モノホスホリル脂質Ａ、イミキモド、ＣｐＧヌクレオチド又はカチオン性ペプチドの使用により実現することができる。しかし、先天性免疫は、感染を回避する能力に限界があり、このようなシナリオでは適応免疫応答がこれに取って代わる。
【０００８】
樹状細胞は、先天性免疫及び適応免疫を結びつけるのに不可欠であることが近年認識されており、この知識により、免疫学者は、免疫原性に乏しい抗原に対する免疫調節戦略をデザインすることが可能になった。樹状細胞（ＤＣ）は、骨髄系及びリンパ系両方の前駆体に由来するが、主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣは、あらゆる組織に存在し、感染期には、侵入病原体との接触を開始する主要な免疫細胞となる。これらは、先天性免疫応答及び適応免疫応答の間の架け橋である。
【０００９】
内皮及び上皮細胞、単球、マクロファージ及び未成熟ＤＣを含むその他の細胞は、病原体パターン認識受容体（ＴＬＲ受容体、レクチンドメイン受容体及びその他の受容体）を発現する。病原体パターン認識受容体は、グラム陰性菌由来のリポ多糖類、グラム陽性菌由来のリポテイコ酸、ペプチドグリカン、ペプチドグリカン関連リポタンパク質、細菌ＤＮＡ並びにグラム陰性菌及びグラム陽性菌由来のフラジェリンのほか、ウイルスＲＮＡなど、病原体により共有された病原体関連分子保存構造（略してＰＡＭＰ）を結合する。異なる細胞は、個々の病原体に適した反応を可能にする異なる受容体を発現する。活性化されると、未成熟な抗原捕捉ＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩ及びクラスＩの状況で抗原を提示することができる、成熟した抗原提示ＤＣへ分化するほか、表面のＣＤ８０及びＣＤ８６などの共刺激分子の発現をアップレギュレートする。
【００１０】
成熟し活性化されたＤＣは、二次リンパ器官（リンパ節、脾臓、パイエル板）へ移動し、そこでＴ細胞領域へ移動する。ＤＣのＴ細胞との相互作用及びＴ細胞刺激は、サイトカイン、ケモカイン、並びに細胞内接着分子（Ｉ−ＣＡＭ）、白血球機能関連分子１（ＬＦＡ−１）、及び樹状細胞特異的ＩＣＡＭグラビングノンインテグリン（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ）（ＤＣ−ＳＩＧＮ）などの接着分子に依存する。
【００１１】
局所サイトカイン環境及び抗原に応じて、細胞性Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ１）免疫応答及び体液性抗体媒介性Ｔｈ２又はＴｒｅｇ指向性免疫応答は、さまざまな程度に誘発される。抗原投与量は、Ｔｈ１／Ｔｈ２分化を方向づけることが明らかにされており、高用量は、Ｔｈ−１応答を、低用量はＴｈ−２応答を優先的に刺激する。抗原タンパク質を表示する担体装置及びＤＮＡワクチンは、未成熟樹状細胞により取り込まれ、免疫応答をもたらすことが明らかにされている。したがって、ＤＣは、免疫系調節開発の唯一の標的ではないものの主要な標的であることを意味する。
【００１２】
粘膜ＤＣは、具体的には、ピノサイトーシス及び受容体媒介性エンドサイトーシスの両方を介して、外からの侵入者を捕食することによる、防御の重要な最前線を提供する。ＤＣは、生体粘膜は、生体の内と外の間のバリアのような働きをするため、膜免疫における必須の役割を果たす。ＤＣは、気道及び腸の内膜に見出すことができる。ランゲルハンス細胞は、皮膚及び粘膜に見られるＤＣ集団である。ＤＣ及びＭ細胞は、抗原を腸の免疫誘導部位である下層のリンパ濾胞へ輸送する。類似の鼻及び気管支関連リンパ組織は、気道で説明されている。この系は、消化管において重要であるが、気道では、下層のＤＣネットワークが、より重要となりうる。
【００１３】
経口投与の場合、免疫モジュレーターは、胃及び上部の腸を未分解状態で通過しなければならない。このような分解は、鼻、眼又は生殖器投与経路では生じそうにない。続いて、免疫モジュレーターは、腸上皮を介して吸収されなければならない。こうして免疫モジュレーターは吸収され、続いて、抗原提示細胞により免疫担当細胞に提示されることができる。免疫担当細胞は、上皮、固有層又は基底膜の下に位置する。したがって、免疫モジュレーターの成分は、これらにこのバリアを通過させる担体により調製されなければならない。粒子担体と結合した場合、分子は、パイエル板のＭ細胞により、バリアを越えて輸送されることができる。
【００１４】
生物活性分子の早期の分解又は放出は、粒子ベースのワクチン及び薬剤送達技術の開発を妨げてきた。これは、公表されている文献においては、注入される対応物と同等の反応を得るのに高用量の抗原／薬剤が未だに必要とされる理由を説明するものと考えられる。抗原及び薬剤の活用の低さを別にすれば、その他の主な批判は、パイエル板（ＰＰ）におけるＭ細胞の粒子輸送能の低さ、ヒトにおいて誘導される免疫及びその他の応答の不十分さについて言及している。パイエル板の上皮Ｍ細胞は、特定の細菌、ウイルス及び原虫の腸からの輸送を可能にすることが知られている。幾つかの研究は、最大直径１０μｍのサイズ依存性取り込みは、Ｍ細胞、ＤＣ及びＣａｃｏ−２細胞により生じうることを示している。
【００１５】
Ｍ細胞並びにＰＰ及びＰＰ周辺に存在するさまざまなタイプの樹状細胞（ＤＣ）による、粒子の取り込みに関する近年の情報は、関与する機構の理解を可能にする。Ｂｅｙｅｒ（Ｂｅｙｅｒ Ｔら、「抗原送達装置としての細菌担体及びウイルス様粒子：抗原提示における樹状細胞の役割（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）」、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ−Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ、２００１年１、２８７〜３０２頁）はベーカー酵母細胞（サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のＰＰへの取り込み及び動態を追跡し、これを、粘膜を介した輸送の不活性モデルと仮定した。
【００１６】
さまざまなタイプの食菌、抗原プロセシングマクロファージ又は樹状細胞への輸送に匹敵する典型的な時間依存性が、Ｍ細胞、Ｍ細胞下の細胞内ポケット、及び基底膜下のスペースにおける酵母細胞の分布についても見られた。ＤＣが位置する場所に応じて、これらは、活性化時に、Ｔｈ１又はＴｈ２指向性サイトカインを産生するＰＰ微小環境において、異なる機能を有することがわかった。サイトカイン及びケモカインの微小環境は、次いで、Ｔｈ細胞のＴｈ１及びＴｈ２サブセットへの分化をそれぞれ決定し、同様にＴ細胞の生存又はアポトーシスに影響するであろう。
【００１７】
さらに、Ｂ細胞の分化及び粘膜形質細胞のホーミングは、別々のサイトカイン（ＴＧＦ−βに加えてＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０）及び特定のホーミング受容体、ａ４ｂ７により制御される。故に、粘膜には利用可能な機構が存在すると思われ、この機構により、免疫系の粘膜調節は、より分化された免疫応答を誘導でき、他の投与経路で得られるよりも自然感染に対する応答をより上手く模倣できると結論することができる。
【００１８】
これまで提案されてきたＤＣ、これらの前駆体及びさまざまなＤＣサブタイプについては、多くのことが知られているが、ＤＣの最大の機能的複雑性及び可塑性は、特定のワクチンが、ＤＣ、並びにこれに続くＴｈ１、Ｔｈ２及びＴｒｅｇ応答に与える影響についての予測を困難にする。しかし、成熟ＤＣに関しインビトロで得られた幾つかの結果は、これらが類似の特徴を示すことから、リンパ器官から単離された成熟ＤＣに外挿することができる（Ｓｈｏｒｔｍａｎ Ｋ．ら、「マウス及びヒトの樹状細胞サブタイプ（Ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ）」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年Ｍａｒ ２（３）：１５１−６１頁）。例えば、マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２の、ＤＣ応答の潜在調節能が、インビトロで研究されている（Ｗｅｉｇｔ Ｈ．ら、「合成マイコプラズマ由来リポペプチドＭＡＬＰ−２は樹状細胞の成熟及び機能を誘導する（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ＭＡＬＰ−２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３年、２０７（３）：２２３〜３３頁）。ＤＣのＭＡＬＰ−２処理は、ＣＤ８０、ＣＤ８６発現、並びに生物活性ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０の放出を誘導したほか、自己リンパ球増殖、並びに後者によるＩＬ−４、ＩＬ−５及びγ−ＩＮＦの産生を誘導した。これらの特徴は、Ｔ細胞を刺激する能力と相互作用するため、インビボにおいてＭＡＬＰ−２がＤＣに影響する可能性を示唆している。
【００１９】
合成担体は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩに関する抗原提示の免疫刺激効果を可能にすることができる。合成担体は、さまざまな応用可能性に合わせることができる、多目的システムに発展させることができる。これらの担体の特徴は、免疫応答の結果及び効率を大幅に左右することができる。粒子などの合成担体は、品質保証並びにワクチン開発及び生産の妥当性確認という障害を容易にし、故に承認及び市場に出すまでの時間を短縮することができる。
【００２０】
さまざまな感染性微生物の幾つかの免疫刺激成分（ペプチド、タンパク質、脂質又は多糖類）は、ワクチン接種に使用することができる。これらの成分は、微生物から合成、精製する、又は組換えＤＮＡ技術により生成することができる。しかし、これらは、遊離可溶型で経口又は非経口投与される場合、適切なアジュバントが必要となる。
【００２１】
幾つかの粒子ベース系が、さまざまな抗原及び薬剤の担体として試験されている。キトサン、ポリ−ＤＬ−乳酸、又はポリアクリルデンプン微粒子は、薬剤担体系としてこれまでに記載がある。このような系の例は、米国特許第５，６０３，９６０号及び第６，５２１，４３１号に記載されている。１つの報告では、モデル抗原である、共有結合されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を伴うデンプン微粒子は、非経口投与された場合、マウスにおける強力なアジュバントとして機能し、微粒子単独では免疫原性を示さないことが観察された。
【００２２】
しかし、取り込みは、担体の構造及び接着特性の可能性に最も依存すると考えられることも、指摘されるべきである。アガロース及びその他の多糖類は、異なる粘膜とのこれらの相互作用を改善し、取り込みを促進することができる、固有の粘膜接着特性を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明により、免疫学的に活性な組成物、又は防御免疫若しくは寛容性を誘導する組成物のための新規の組成物が説明される。非感染及び感染宿主のいずれにおいても防御免疫応答を誘導する組成物は、抗原エピトープから成るが、免疫「回避」に関与する又は寛容性を誘導するエピトープを、除外又は排除する。防御免疫は、病原体関連分子パターン及び／又は、抗原エピトープを伴う若しくは伴わない担体を含む組成物によっても誘導することができる。寛容性を誘導する別の免疫学的に活性な組成物は、担体の有無にかかわらず、病原体回避（ｐｈａｔｏｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ）に重要なエスケープエピトープ（ｅｓｃａｐｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）又は分子パターンを含む。さらに、本発明は、このような免疫学的に活性な分子の同定方法を提供する。適切な例は、修飾マイコプラズマ抗原が付着した又は付着していない、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）認識分子である。こうした分子組成物は、非感染及び感染宿主のいずれにおいても、抗マイコプラズマ免疫応答を調節するように思われる。抗原の幾つかは、寛容性又は免疫回避を誘導する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、本発明の１つの態様は、防御免疫を誘導する免疫学的に活性な組成物であり、
（１）少なくとも１つの病原体関連分子パターンと、
（２）場合により、少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
（３）組成物を生物に送達することにより防御免疫を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む組成物である。
【００２５】
多くの場合、少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープを含むことが望ましい。適切な例は、さらに以下で説明される。一般的に、少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープは、エスケープエピトープを持たない。これは、選択圧を防止する上で重要である。さもなければ、選択圧は、病原体の進化をもたらすことになり、病原体の複製は免疫応答では遮断されない。選択圧が重要であると思われる病原体の例は、急速に変異するインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスの変異はきわめて急速なため、ヒト疾患を引き起こしそうなインフルエンザの特定の株又は複数の株に対し免疫を提供するには、インフルエンザのシーズンごとに新規ワクチンを調製する必要がある。選択圧が重要であると思われる病原体の別の例は、やはり急速に変異するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【００２６】
本発明の別の態様は、寛容性を誘導する免疫学的に活性な組成物であり、
（ａ）少なくとも１種類の病原体関連分子パターンと、
（ｂ）少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
（ｃ）組成物を生物に送達することにより寛容性を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む組成物である。
【００２７】
典型的には、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド、タンパク質、組換えペプチド若しくはマルチペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物、核酸若しくはその他の生物活性分子、又はこれらのいずれかの組合せである。典型的には、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後調節を有する。典型的には、転写後調節は、炭水化物及び／又は脂質部分を含む。典型的には、転写後調節は、末端マンノシル化を含む。この代替では、典型的には、免疫調節の末端マンノシル化物質が、免疫防御組成物から著減している。これらは、酸化ステップにより、酵素処理により、又は糖特異的親和性結合により、著減することができる。或いは、転写後調節は、脂質部分を含み、前記脂質部分は、脱脂により除去される。
【００２８】
典型的には、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後修飾を有さない。また、典型的には、免疫活性ペプチド又はタンパク質は、Ｎ−グリコシル化及び／又はリポイル化が可能なアミノ酸配列を有さない。別の好ましい代替では、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、細胞表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を結合可能なアミノ酸配列を有する。典型的には、これらのアミノ酸配列は、本来多塩基性であり、一般式ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＢＸＢ、ＢＢＢ、ＢＸＢＸＸＸＢＸＢ、又はＢＸＢＸＸＸＸＸＢＸＢを有し、ここで、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘはいずれか他のアミノ酸である。典型的には、ＧＡＧ結合アミノ酸配列は、病原体が細胞表面に結合するのを干渉可能なペプチド又はタンパク質に対する抗体を産生するのに使用される。ＧＡＧは、ヘパリン及びこの類似体からなる群から選択される。免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質は、単独又は抗体と併用して、補体活性化活性を有することができる。免疫活性な抗原エピトープは、単一のマルチペプチドに合体される複数のペプチドであることができる。免疫活性な抗原エピトープは、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの両方を含むことができる。
【００２９】
典型的には、病原体関連分子パターンは、
（１）ＴＬＲ１受容体アゴニストと、
（２）ＴＬＲ２受容体アゴニストと、
（３）ＴＬＲ３受容体アゴニストと、
（４）ＴＬＲ４受容体アゴニストと、
（５）ＴＬＲ５受容体アゴニストと、
（６）ＴＬＲ６受容体アゴニストと、
（７）ＴＬＲ７受容体アゴニストと、
（８）ＴＬＲ８受容体アゴニストと、
（９）ＴＬＲ９受容体アゴニストと、
（１０）ＮＯＤ−１アゴニストと、
（１１）ＮＯＤ−２アゴニストと、
（１２）ＤＣ−ＳＩＧＮと、
（１３）Ｌ−ＳＩＧＮと、
（１４）マンノース受容体と
からなる群から選択される。
【００３０】
病原体関連分子パターンは、ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストである場合、前記ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストは、細菌のペプチドグリカン及び細菌のペプチドグリカン誘導体からなる群から選択することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉することが可能な免疫活性エピトープを同定する方法であり、
（１）ヘパリン吸着を行うステップと、
（２）免疫親和性選択を行うステップと、
（３）場合により、免疫活性ペプチドを生成するため、免疫親和性選択により単離された１種類のタンパク質又は複数のタンパク質のタンパク質分解を行うステップと
を含む。免疫親和性選択は、当技術分野でよく知られた方法、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、「固定化親和性リガンド技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、１９９２年）に記載された方法により行うことができるが、他の方法もまた、当技術分野において既知である。
【００３２】
本発明のなお別の態様は、直鎖多塩基モチーフを用いるバイオインフォマティクス解析法により配列データを解析することを含む、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉可能な免疫活性ペプチドの同定方法である。
【００３３】
本発明のいっそう別の態様は、免疫活性ペプチドを活性化する補体を同定する方法であり、
（１）補体結合抗体の補体タンパク質への結合を行うステップと、
（２）タンパク質抗原の免疫親和性選択に前記抗体を使用するステップと、
（３）場合により、単離されたタンパク質抗原のタンパク質分解を行うステップと
を含む。
【００３４】
これらの方法により生成される免疫活性ペプチドも、本発明の態様である。さらに、防御抗体は、宿主生物における疾患を克服するための、同定された免疫活性ペプチドに基づくことができる。
【００３５】
上述の組成物では、分子は、混合物として存在することができる。或いは、分子は、化学的に結合することができる。担体は、典型的には微粒子である。好ましくは、微粒子は、狭いサイズ分布範囲を有し、多孔性である。典型的には、微粒子は、直径約１０μｍ未満であり、より典型的には、微粒子は、直径約５μｍ未満である。典型的には、微粒子は、生体高分子でできている。１つの代替では、免疫活性な抗原エピトープは、微粒子に非共有結合している。別の代替では、免疫活性な抗原エピトープは、微粒子に共有結合している。１つを超える免疫活性名抗原エピトープ及び１つを超えるパターン認識受容体アゴニストは、微粒子と結合していることができる。１つを超えるパターン認識受容体アゴニストは、微粒子と結合していることができる。
【００３６】
本発明の別の態様は、対象における免疫応答の誘発方法であり、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。組成物は、１つを超える病原体認識受容体アゴニストを含むことができる。
【００３７】
本発明のなお別の態様は、対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であり、微粒子と結合している少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。
【００３８】
本発明のいっそう別の態様は、対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であり、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。
【００３９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であり、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答は、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答又は両方の組合せを含む。
【００４０】
本発明のなお別の態様は、少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であり、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープ（免疫学的回避機構に関与する抗原を除く）と、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。
【００４１】
本発明による投与又は送達方法では、組成物の投与は、粘膜経路、非経口経路、又は皮膚経路を介して起こることができる。或いは、他の投与経路を使用することができる。
【００４２】
本発明による免疫を誘導する方法では、典型的には、免疫応答は、病原性微生物におけるグリコサミノグリカン結合要素を干渉する。
【００４３】
或いは、本発明による組成物は、免疫学的寛容性を誘発する方法に使用することができる。免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発する方法は、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲＲアゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答は、免疫機能又は免疫回避の調節応答又は下方制御を誘導することを含む。組成物は、脂質含有部分を有する免疫活性な抗原エピトープを中に含むことができる。免疫学的に活性な脂質含有部分は、免疫活性な抗原エピトープとは独立に微粒子に結合することができる。免疫学的に活性な脂質含有部分は、炭水化物成分を有することができる。炭水化物成分は、Ｎ−グリコシル化の結果でありうる。免疫活性な抗原エピトープは、アスパラギン、スレオニン及びセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むモチーフを含み、前記モチーフは、Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｐ−Ｘ−Ｔｈｒモチーフであり、ここで、Ｘは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸でありうる。
【００４４】
以下の発明は、明細書、添付の特許請求の範囲、及び添付図面を参照することで理解が深まるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、免疫学的に活性な組成物、特定の細胞集団に対する分子を標的し、動物モデルにおける応答を誘発する方法、及び対象組成物を生成する方法を説明する。
【００４６】
幾つかの疾患又は症状のため、及びワクチンが現在利用不可能であるか又は効果がない病原体から防御するため、より効果的な免疫モジュレーター及び送達賦形剤を作製する必要がある。
【００４７】
弱毒化され、死滅され、又は遺伝子組み換えされた病原体を用いる従来型のワクチンは、病原体の分子パターン、及びこれと、免疫系の病原体認識受容体（ＰＲＲ）との相互作用が決定する免疫応答に限定される。慢性感染を定着することができる成功した病原体は、生体の免疫応答を回避させる分子パターンを有するのに対し、インフルエンザウイルスなどの他の病原体は、自らを維持するため、ウイルス取り込みの増加をもたらす抗体の産生など、結果として回避を生じる変異（抗原不連続変異及び連続変異）を用いる。
【００４８】
一般に、病原体特異的抗体は、幾つかの方法で感染制御に重要な役割を果たす。しかし、幾つかの例では、特異的抗原の存在は、病原体にとって有益となりうる。この活性は、感染の抗体依存性感染増強現象（ＡＤＥ）として知られる。感染のＡＤＥは、病原体特異的抗体が、病原体の、Ｆｃ受容体との相互作用を介した単球／マクロファージ及び顆粒球細胞への侵入（時として、ウイルスなどの病原体の複製）を増強する現象である。この現象は、公衆衛生及び動物衛生において重要な、多数の科及び属を代表する病原体について、インビトロ及びインビボで報告されている。Ｍ．ガリセプティカムなどのこれらの病原体は、マクロファージにおける選択的複製、持続を確立する能力、及び抗原多様性など、幾つかの共通する特徴を共有する。
【００４９】
幾つかの病原体では、感染のＡＤＥは、ワクチン接種による疾患制御にとって大きな関心事項となっている。その結果、ＡＤＥを最小限化した、又はＡＤＥのリスクのないワクチン開発に対する多くのアプローチが行われている。ＡＤＥ又は中和に関連した病原体エピトープの同定は、この目的にとって重要である。さらに、ＡＤＥを介した病原体侵入後の細胞事象を明確に理解することが、効率的な介入法を開発する上で不可欠となっている。しかし、ＡＤＥのメカニズムは、依然としてよく理解されていない。したがって、これらの病原体に対する有効なワクチンを開発することは困難である。したがって、本発明者らは、重要な細胞接着機構の干渉により防御免疫に重要であるモチーフを同定し、回避のない防御免疫を誘導するため、製剤から除外する必要のあるモチーフを同定した。本発明者らは、回避又は寛容性を誘導するモチーフも同定した。
【００５０】
本発明者らは、特定の細胞に対する免疫学的に活性な分子を、天然アガロースなどの多糖類からなる担体で標的し、その結果、先天性及び適応免疫応答、並びに感染からの防御の両方を免疫調節する可能性を調べた。本発明は、他の受容体も同様に他の粒子により標的することができる他の適用において、使用できることは明らかである。アガロースは、天然の多糖類であり、生分解性の、哺乳類細胞に適合することが証明されたＤ−ガラクトースポリマーであるという利点を有する。非経口投与されたアガロース微粒子は、弱いマクロファージ活性能、及び水酸化アルミニウムと同等のアジュバント特性を示すことが見出されている（Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ．ら、「炭水化物ベースの粒子：アレルゲン特異的免疫療法のための新規アジュバント（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ ｎｅｗ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２年１０７、５２３〜５２９頁）。
【００５１】
エンドユーザーの観点から、ワクチン製品は、冷蔵貯蔵を必要とせず、さらに有効期限が長いことが重要である。アガロース粒子は、これらの要件を満足することができる。また、ワクチン又は薬剤送達賦形剤の投与は、できるだけ簡単であることが重要である。これが、ニードルフリーの、粘膜的に、特に経口的に投与可能な組成物が、非経口投与に比べて有利な理由である。しかし、経口適用は、消化系の作用による安定性の問題を抱えている。
【００５２】
本発明者らは、多孔性アガロースマトリックスと結合した抗原は、ＧＩ管内の分解から保護されることができると考えた。リガンド及び粒子の間の結合は、同じ抗原プロセシング細胞が、アジュバント及び抗原を取り込むのを確実にする。また、アガロース微粒子のサイズ（＜５μｍ）は、粒子をパイエル板（ＰＰ）に到達させるのに適したものにすることができる。
【００５３】
アジュバントとしての非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ又はＭＡＬＰ−２の有効性は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）モチーフが、抗原と共固定化された場合、免疫学的に活性な組成物の粘膜表面における取り込みを、適切なＰＡＭＰ受容体を発現するさまざまなＡＰＣにより、標的にするであろうことを示唆する。
【００５４】
さまざまなＤＣサブセット及びその他の免疫成分細胞は、異なるパターン認識受容体を有する。リガンドの組合せにより、細胞の適切なサブセットの標的化を実現することができる。
【００５５】
したがって、本発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、レクチン受容体又はＮＯＤ受容体アゴニストなどの受容体アゴニスト（ＰＡＭＰ受容体）分子は、生物活性分子と共に担体に共固定化されるべきであると考えた。本発明者らは、免疫学的に活性な組成物の接着特性、標的化及び取り込みは、免疫系が、デザインされた「合成微生物」に曝露されるため改善されることができ、これにより、こうした免疫モジュレーターの、標的化された取り込み及び有効性は大幅に高まり、目的に合った免疫応答を得ることができると考えた。目的に合った標的化は、薬物動態を改善し、このようなデザインされた免疫モジュレーターが引き起こす可能性のある副作用を減少することもできるであろう。
【００５６】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びＮＯＤ、レクチン受容体等は、微生物由来分子に対する病原体パターン認識受容体である。これらは、先天性及び適応免疫系の一次センサーである。１０種類のＴＬＲ（ＴＬＲ１〜１０）が、現在同定されている。各々は、１つ又は複数の特異的リガンドを認識し、シグナル伝達を行う。新たに発見された受容体及び受容体相互作用は、細菌産物による細胞活性化に関与することが定期的に見出されている。これら受容体間の連携は、リガンド識別及び反応特異性を精緻化する役目を果たすようになるという証拠が集まっている。脂質ラフトにおける受容体のクラスタリングも、リガンド結合後に見出されている。こうした研究は、骨髄分化の一次応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）依存性及び非依存性経路も明らかにした。
【００５７】
各ＴＬＲは、細胞外ロイシンリッチ領域、及びＴｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒホモロジー（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる保護領域を含有する細胞内タンパク質を有し、活性化されると、ＭｙＤ８８依存型のシグナル伝達においてＭｙＤ８８タンパク質の動員をもたらす、タイプＩ膜貫通受容体である。一部の微生物病原体は、例えば、細胞内グラム陽性菌ペプチドグリカン検出の場合のように、ＴＬＲ、ＮＯＤ−１及びＮＯＤ−２のロイシンリッチ領域により、形質細胞に直接取り込まれ、活性を発揮することもできる。しかし、これらのさまざまな経路は、ＮＦ−кβの核転座及び炎症遺伝子の活性化及び異なるサイトカインの産生に収斂するように思われる。ＴＬＲ７、８及び９のライゲーションは、ＩＦＮ−α及びＩＬ−１２ｐ７０をもたらし、交差提示／ＣＴＬにより強力なＴｈ１応答を誘発する。ＴＬＲ３の活性化は、ＩＦＮ−α及びＴｈ１応答をもたらす一方、ＴＬＲ５は、ＩＬ−１２ｐ７０を介してＴｈ１を誘導し、ＴＬＲ４は、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮ−α産生を介してＴｈ１を誘導し、全てが交差提示／ＣＴＬに至る。しかし、ＴＬＲ１、２及び６のライゲーションは、高いＩＬ−１０レベルにより弱いＩＬ−１２ｐ７０応答を誘導し、ＤＣ−ＳＩＧＮなど、幾つかの他のＰＲＲ（病原体認識受容体）と共にＴｈ０／Ｔｈ２／ＴＲｅｇ応答をもたらす。
【００５８】
ＴＬＲ−４は、この受容体ファミリーのうち、最も幅広く研究されている。ＴＬＲ−４が、グラム陰性菌由来の多糖類及びグラム陽性菌由来のリポテイコ酸を認識するのに対し、ＴＬＲ−２は、細菌のリポタンパク質／リポペプチド、マイコバクテリア又はマイコプラズマの成分を結合することが知られている。
【００５９】
Ｌｐｓ２変異は、ＴＬＲ−３及びＴＬＲ−４ ＭｙＤ８８依存性経路におけるＴＩＲ耐性アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）の役割を同定した。ＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−４の下流における別の細胞内プレーヤーであることが発見されている。ＭｙＤ８８依存性経路は、ＤＣのＬＰＳ媒介性成熟の制御に関与することも示された。ＴＬＲ−１及びＴＬＲ−６は、ＴＬＲ−２受容体を伴うヘテロダイマーの他の部分として機能することが知られている。
【００６０】
ＴＬＲ−３は、ウイルス二本鎖ＲＮＡを認識する。ＴＬＲ−５は、グラム陰性及び陽性菌由来のフラジェリンの受容体として同定され、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達された。ＴＬＲ−７は、一本鎖ＲＮＡ、並びにイミキモド、Ｒ−８４８、ブロピリミン及びロキソリビンなどの小さな合成免疫修飾物質に応答する。ＴＬＲ−９は、非メチル化細菌ＤＮＡを検出することが知られている。ＣｐＧ ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ワクチン開発のため、アジュバントとしての作用能及びヒト樹状細胞の刺激能が現在調べられている。
【００６１】
ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７及びＴＬＲ−９は、ワクチン開発に関して特に重要である。ヒトＴＬＲ−８は、最近、一本鎖ＲＮＡ及びレシキモド（Ｒ−８４８）の受容体として同定された。ＴＬＲ−７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ−９は、最近、リガンドがエンドソーム／リソソーム区画において認識される、ＴＬＲ受容体ファミリーのサブグループと考えられることが提案されている。
【００６２】
Ｃ型（カルシウム依存性）レクチン受容体（ＣＬＲ）も発現されており、これらは、ウイルス、細菌及びその他の病原体の表面糖タンパク質において多く見られる保存オリゴ糖に結合する。ＤＣにより発現されるＣＬＲには、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、ＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）、ランゲリン（ＣＤ２０７）及びＤＣ特異的細胞間接着分子３−グラビングノンインテグリン（ＤＣ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ３−ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ）（ＤＣ−ＳＩＧＮ；ＣＤ２０９）がある。これらの受容体は、ＤＣ及び他の組織のさまざまなサブセットにおいて発現が異なるだけでなく、異なるオリゴ糖も認識するため、異なるリガンド間を識別する。
【００６３】
ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ、エボラウイルス、ＣＭＶ、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどの幾つかのウイルス、及びマイコバクテリアなどの細菌を結合し、インターナライズする、４４ｋＤａのタイプＩＩ膜貫通タンパク質であるが、他の受容体も関与している。他の病原体も、ＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用することができる。これは、ＩＣＡＭ−３を介した天然Ｔ細胞の相互作用を媒介する上でも、及びＤＣ特異的ＩＣＡＭ−２依存性移動プロセスを媒介するローリング受容体としても、ＤＣの機能においてきわめて重要である。
【００６４】
ＴＬＲ及び他の免疫認識受容体の間の連携は、これまでに説明されている。この一例は、デクチン−１及びＴＬＲ２による炎症反応の協同決定である。酵母細胞壁などの複雑な粒子は、ＴＬＲ２〜ＴＬＲ６、デクチン−１及びＣＤ１４を含む複数の先天性免疫受容体により認識される。ＴＬＲ２〜ＴＬＲ６へテロダイマーは、ＮＦ−кＢ並びにケモカイン及びＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生を活性化する。デクチン−１は、細胞壁のα−グルカンを認識し、食作用を引き起こすほか、ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼによる反応性酸素産生を活性化する。さらに、デクチン−１シグナリングは、ＴＬＲ２〜ＴＬＲ６シグナリングと合わさって、ＩＬ−１２などの特定のサイトカイン産生を増強する。
【００６５】
ＴＬＲ受容体間の、及び他の受容体との連携、並びに細胞内分子下流機構間の相互作用のため、リポテイコ酸、ＣｐＧ ＤＮＡ及びペプチドグリカンなどの微生物病原体化合物間の相乗効果を観察することは、驚くにはあたらず、ＴＬＲアクチベーターのアジュバントとしての効果は、免疫モジュレーターの開発に併用される場合、増幅されることができることを示唆している。
【００６６】
適切なＰＲＲ（病原体認識受容体）リガンドの、生物活性分子による共固定化は、免疫応答の標的調節を可能にすることができ、強力な細胞性応答（比較的強力なＴｈ１の影響下）及び／又は体液性応答（Ｔｈ２の影響下）をもたらすことになる。或いは、異なる組成物で免疫された場合は、免疫寛容性が得られる。
【００６７】
強力な細胞性応答は、確立された体液性免疫又は寛容性の存在下でも誘導されることは可能であろう。このように、本発明者らは、非感染及び感染宿主のいずれにおいても、効率的な免疫モジュレーターの開発を期待することができる。このような結果は、ワクチン接種の使用を大いに高めるであろう。
【００６８】
本発明者らは、鶏をマイコプラズマに曝露する前にワクチン接種した場合、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染株に対して著しい防御が得られる鶏モデル系を確立した。さらに、特徴的な病理学的症状の好転も、感染前動物において観察されたことは、こうしたワクチンが感染した群れの治療に有効であることを示唆している。微生物のさまざまな株の抗生物質耐性が広まっていること、並びに抗生物質の家畜への予防的使用を認めることに対する一般市民及び規制当局の関心が高まっていることから、これは重要である。さらに、本発明者らは、この方法で防御反応を誘発するには、１羽あたりごく少量の抗原（１０μｇ）しか必要とせず、抗原を組み込んだ微粒子を用いる、文献に記載された１００μｇ超とは対照的であることを見出した（Ｂｒａｙｄｅｎ，Ｄ．２００１年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４：１８３〜１８９頁）。これは、免疫モジュレーター分子が、鶏の腸を移動中も分解されず、標的化された粘膜免疫細胞へ効果的な形で送達されることを示唆する。これは、既存の免疫学的に活性な組成物に比べ著しい改善である。
【００６９】
しかし、抗原投与量の増加に伴い、防御効果の低下が観察されたことは、免疫親和性精製抗原の中に、免疫抑制成分が存在することを示唆する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、病原体の回避機構に関与している。ＤＣ−ＳＩＧＮは、脂質分子を含有する高マンノースに特異的なＣ型レクチンである。マイコプラズマ膜は、高率の脂質からなり、さまざまなマイコプラズマは、コンカナバリンＡ親和性樹脂を結合することが示されている。このことは、マイコプラズマ表面におけるマンノースの存在を示唆する。本発明者らは、末端マンノース部分を含有する精製タンパク質における転写後リポマンナン修飾を含む、転写後Ｎ−グリコシル化分子を含む免疫学的回避に関与する分子が、この作用を媒介している可能性があると仮定した。次いで、酵素分解又は化学分解による末端マンノースの除去が行われた。さらに、末端マンノシル化リポタンパク質が、マンノース特異的固定化レクチン−コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）カラムに吸着された。
【００７０】
ＣｏｎＡカラムは、精製抗原成分の約三分の一を保持し、この抗原により調製されたワクチンは、抗原濃度の上昇に伴い、最も高い防御効果及び線形の用量反応を示した。一方、ＣｏｎＡカラムから回収された抗原は、鶏において炎症反応の抑制を引き起こしたが、鶏の内臓には、きわめて高レベルの病原体の存在が認められた。これらＭ．ガリセプティカムのマンノシル化成分は、病原体の回避機構に関与し、結果的に免疫抑制及び病原体に対する寛容性の発現をもたらすと考えられる。本発明者らは、適正な抗原特性は、免疫応答を防御又は寛容性のどちらかへシフトさせるのを促すことができることも実証した。これは、本発明者らの仮説を裏付け、リポマンナン転写後修飾は、宿主における病原体寛容性を誘導することができるという、マイコプラズマ固定化膜で行われた観察も裏付けるものである。この理解は今や、寛容性の誘導可能性、又は既存の免疫応答の抑制可能性という特性を付与された免疫調節微粒子を調製するのに使用することができる。抗原の転写後脂質修飾も、病原体に対する寛容性の発現に役割を果たす。したがって、本発明者らは、有効であることが証明された精製抗原の脱アシル化も試み、マイコプラズマの病理学的機構における脂質の役割を確認した。
【００７１】
これらの実験から得られた主な結論は、天然タンパク質の分析から得られたエピトープワクチンは、防御免疫を実現しようとする場合、グリコシル化及び／又はリポイル化を受けることができるアミノ酸（Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）に富むエピトープを含有すべきではないが、これらのアミノ酸モチーフを組み込んだリガンドは、寛容性の誘導に使用されうる、というものである。このことは、本発明による組成物及び方法に多様な使い方をもたらす。
【００７２】
これに続く研究では、本発明者らは、防御に関与する抗原エピトープを同定するため、ワクチン接種され防御された動物由来の血液及び血清を使用した。このように、本発明者らは、大規模なマイコプラズマの生産及び抗原タンパク質の精製は、多くの適用で多大な費用が発生しうるため、エピトープベースのワクチンの科学的根拠を構築することに集中した。先の研究では、本発明者らは、さまざまなマイコプラズマが、ヘパリン及びヘパリンアナログと結合することができることを明らかにした（Ｓｚａｔｈｍａｒｙ，Ｓ．ら「マイコプラズマの固相吸着剤との結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ）」、Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ｈｕｎｇ、２００５年、５３（３）：２９９〜３０７頁）。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、哺乳類細胞表面で発現され、病原体表面のグリコサミノグリカン結合タンパク質は、標的細胞への接着を媒介する（Ｗａｄｓｔｒｏｍ Ｔ、Ｌｊｕｎｇｈ Ａ「組織接着及び侵入におけるグリコサミノグリカン結合微生物タンパク質：微生物病原性の重要事象（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ：ｋｅｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」、Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９９年、４８（３）：２２３〜２３３頁）。ある領域の大部分が塩基性アミノ酸であることを特徴とする、幾つかのタイプのコンセンサス配列が報告されている：ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＢＸＢ、ＢＢＢ、ＢＸＢＸＸＸＢＸＢ、又はＢＸＢＸＸＸＸＸＢＸＢ。ここで、Ｂは、塩基性アミノ酸であり、Ｘは、いずれか他のアミノ酸である。これに対する別の見方は、直鎖塩基モチーフが、病原体機構に関与しているというものである。これらの配列は、病原体による粘膜侵入機構の最初のステップとして恐らく機能する付着にとって不可欠である。したがって、この能力の中和は、感染を防止し、場合によっては、多様な病原微生物に対する広域スペクトル療法の開発を可能にすることができる。この可能性は、ワクチン開発の基盤として以前には認識されてこなかった。本発明者らは、ＧＡＧ結合ドメインに隣接する又は立体的に近接する抗原エピトープは、中和している可能性があり、こうした結合部位が、場合によっては、中和エピトープ内に組み込まれる可能性をもたらすと考えた。
【００７３】
したがって、本発明者らは、Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）における親和性クロマトグラフィーにより、Ｍ．ガリセプティカム由来のヘパリン結合タンパク質の単離を進めた。続いて、本発明者らは、Ｍ．ガリセプティカムに対するワクチンを接種した鶏から得られた中和血清から、ＩｇＧを精製した。精製ＩｇＧは、活性化樹脂のＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）に固定化され、単離されたヘパリン結合タンパク質は、カラムに吸着された。結合タンパク質は、トリプシンをカラムに添加して分解され、ヘパリン結合配列を含む免疫原性エピトープを含有するペプチド断片は、配列情報を得るため、溶出され、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析された。このようなエピトープに対するこのような抗原エピトープ又はモノクローナル抗体により精製されたＩｇＧは、インビボで投与された場合、感染宿主に防御免疫を与えることもできる。或いは、キモトリプシン、エラスターゼ、ブロメライン、Ｖ−８プロテアーゼ、ペプシン、及びサーモリシンなど、当技術分野で既知の他のタンパク質分解酵素を、トリプシンの代わりに使用することができる。
【００７４】
平行実験では、本発明者らは、分離されたヘパリン結合タンパク質を、Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌに再吸着し、結合タンパク質の同様のトリプシン消化を行った。樹脂から回収されたフラグメントも、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで配列情報が分析された。
【００７５】
補体系を利用する、オプソニン食作用に関与するエピトープの同定も重要である。具体的には、補体結合抗体は、固定化されたＣ１ｑカラムにおいて、ワクチン接種された鶏血清から精製され、こうした抗体は、こうした応答を誘導することができるエピトープの同定に使用される。精製ＩｇＧは、続いて固定化され、ＭＧ粗溶解物からタンパク質抗原を得るのに使用される。結合したタンパク質は、カラムにおいてプロテアーゼにより消化され、エピトープ配列が溶出され、配列情報を得るためＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析された。このような抗原エピトープ、又はこのようなエピトープに対するモノクローナル抗体を用いて精製されたＩｇＧは、インビボで投与された場合、感染宿主に防御免疫も与えることができる。
【００７６】
現行の幾つかの微生物ベースのワクチンに関する重要な問題は、免疫刺激エピトープ及び免疫抑制エピトープと、病原体自体に存在するＰＲＲアゴニストの混合物（このうち幾つかは、Ｔｈ１、幾つかのＴｈ２又はＴｒｅｇ応答を誘導する）との同時投与である。これらのワクチンは、宿主におけるさまざまな病原菌の持続を克服せず、これを臨床疾患のない「病原体工場」に変えることができる。このアプローチは、病原体に選択圧を加えることすらでき、より病原性の強い株の発生をもたらすことができる。反対に、本発明者らの戦略は、免疫応答からの病原体の回避に関与するエピトープ及び／又はＰＲＲアゴニストを除外する一方、適切な免疫応答特異的ＰＲＲアゴニスト分子と共に、まさに免疫刺激エピトープを含有する、人工的な「病原体模倣」微粒子の作製であった。同定されたエピトープは、スプライシング配列、又は特定の抗原エピトープペプチド間のリンカーを提示する単一のマルチペプチドに結合することもできる。このアプローチにより、持続性病原体が引き起こす間違った免疫応答は克服され、細胞性及び体液性応答のバランスの取れた混合が生まれ、病原菌の根絶につながる。回避エピトープ又はＰＲＲアゴニストは、望ましくない自己免疫応答を無効にするのに必要な場合、寛容性の発現に利用することができる。
【００７７】
典型的には、生物学的活性分子は、免疫刺激剤、免疫阻害剤、又は免疫学的寛容性を誘導する物質といった、免疫機能を調節する免疫原又は別の分子などの免疫系により、活性となる。
【００７８】
生物活性分子は、微粒子と非共有結合又は共有結合することができる。共有結合の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、「酵素イムノアッセイの実践と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム、１９８５年、ｐｐ．２８３〜２８９頁、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、「タンパク質結合と架橋結合の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン、フロリダ、１９９３年）、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（編）、「タンパク質機能：実践的アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９８９年）、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「バイオコンジュゲート法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６年）に記載されている。これらはみな、参照により本明細書に組み込まれている。典型的には、微粒子がアガロースの場合、生物活性分子は、アガロースのヒドロキシル基に付着する。一般に、多糖類のヒドロキシル残基は、続く求核置換に適した離脱基を含有する媒介反応性誘導体を形成する、特定の化合物により活性化することができる。アミン（例えば、タンパク質又はペプチドにおけるリシン基）などの求核試薬により活性化されたこれらのヒドロキシル基反応は、生物活性分子をアガロースに架橋する、安定な共有結合をもたらす。適切な試薬には、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸誘導体、塩化トレシル、塩化トシル、臭化シアン、ジビニルスルホン、塩化シアヌル、及びビスエポキシドがある。或いは、アガロースなどの炭水化物のヒドロキシル基は、クロロ酢酸で修飾してカルボン酸官能基を生成することができる。別の代替としては、アミン官能基は、多糖類において生成することができる。すなわち、炭水化物分子又は生成したアルデヒドの還元末端は、低鎖長（すなわち、典型的には、鎖中に約６炭素原子未満）のジアミン化合物と反応させて、続く抱合反応に使用することができる、短いアルキルアミンスペーサーを産生することができる。ヒドラジド基は、ビス−ヒドラジド化合物により同様に生成することができる。その結果得られる官能基は、次いで、さまざまな反応により生物活性分子と結合させることができる。例えば、カルボキシル基が生成される場合、これらは、次いで混合酸無水物法、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いるカルボジイミド法、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法により、タンパク質又はペプチドに結合させることができる。脂肪族アミンは、カルボジイミド、トリレン−２，４−ジイソシアナート、若しくはマレミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）化合物、特に、マレミド誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含め、さまざまな方法でタンパク質又はペプチドに結合することができる。このような化合物の例は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸である。別の例は、ｍ−マレイミドメンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。使用することのできるさらに別の試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩である。また、ジメチルピメリミデート、ジメチルアジピミデート、又はジメチルスベリミデートなどの二官能性エステルも、アミノ基含有部分をタンパク質と結合させることができる。ペプチド、タンパク質、及び炭水化物、並びに他の化合物を含む化合物の、固相担体に対する他の共有結合方法は、当技術分野で周知である。非共有結合の方法は、相互作用を安定化することができる水素結合、疎水結合、及び塩結合など、複数の非共有結合性相互作用に左右される。
【００７９】
典型的には、生物活性分子は、１つ又は複数のペプチド、タンパク質、組換えペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、糖タンパク質、又は糖脂質である。これらの組合せも、複数の生物活性分子が同じ微粒子と結合されるように使用することができる。
【００８０】
免疫活性分子がペプチド又はタンパク質の場合、免疫調節性転写後修飾を受けることができる。典型的には、これらは、糖及び／又は脂質部分を含む。例は、末端マンノシル化である。しかし、他の糖残基も、タンパク質又はペプチドに付加することができる。或いは、免疫活性分子は、免疫活性分子製剤が、実質的に末端マンノシル化分子において著減するような方法で分離することができる。この著減は、過ヨウ素酸塩などの酸化工程、典型的には加水分解酵素による酵素処理、又は糖特異的親和性結合、及び続く著減断片の精製により行うことができる。末端マンノシル化残基の他の著減方法も、当技術分野で周知である。
【００８１】
同様に、免疫活性分子は、免疫活性分子製剤が、実質的に免疫調節性転写後修飾部分を含有する脂質において著減するような方法で分離することができる。これは、化学的加水分解により、又はペンタデカン酸による共沈により行うことができる。或いは、免疫調節性転写後修飾部分を含有する脂質は、荷電界面活性剤により遮断することができる。特に適した界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムクロライドである。類似の第４級アンモニウム界面活性剤も、代わりに使用することができる。
【００８２】
場合により存在する標的分子は、典型的には病原体パターン認識分子である。１つの代替では、病原体パターン認識分子は、ＴＬＲ１受容体アゴニスト、ＴＬＲ２受容体アゴニスト、ＴＬＲ３受容体アゴニスト、ＴＬＲ４受容体アゴニスト、ＴＬＲ５受容体アゴニスト、ＴＬＲ６受容体アゴニスト、ＴＬＲ７受容体アゴニスト、ＴＬＲ８受容体アゴニスト、ＴＬＲ９受容体アゴニストなどのＴＬＲ受容体アゴニストである。別の代替では、病原体パターン認識分子は、ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストＮＯＤタンパク質アゴニストである。典型的には、ＮＯＤタンパク質アゴニストは、細菌のペプチドグリカン又は細菌のペプチドグリカン誘導体である。
【００８３】
免疫活性分子などの１つを超える生物活性分子、及び１つを超える病原体パターン認識分子は、存在する場合、組成物に組み込むことができ、安定に微粒子と結合していることができる。
【００８４】
本発明の別の態様は、上述した組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与して、対象における免疫応答を誘発する方法である。典型的には、組成物には、病原体パターン認識分子などの標的分子も含まれる。１つを超える免疫活性分子及び１つを超える病原体パターン認識分子を、組成物に組み込むことができる。
【００８５】
本発明のなお別の態様は、上述した組成物の有効な量を、活性した免疫系を有する生物に投与することを含む、免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法である。この場合もやはり、１つを超える免疫活性分子及び１つを超える病原体パターン認識分子を、組成物に組み込むことができる。免疫学的に活性な組成物のインビボでの送達は、粘膜表面、非経口経路、皮膚経路、又は皮下経路を介することができる。他の投与経路も使用することができる。
【００８６】
本発明のいっそう別の態様は、上述の通り、微粒子と安定に結合している、１つ又は複数の免疫学的に活性な分子（すなわち、免疫原）及びＴＬＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与して、対象における病原体に対する防御免疫応答を誘発することを含む、少なくとも１つの病原体に対する防御免疫を誘発する方法である。防御免疫応答は、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答又はＴｈ１及びＴｈ２応答の両方の組合せを含む。投与は、単回又は複数回により行うことができる。
【００８７】
本発明のなお別の態様は、微粒子と安定に結合している１つ又は複数の免疫学的に活性な分子（すなわち、免疫原）並びにＴＬＲ受容体アゴニスト及びＮＯＤタンパク質アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与して、対象における免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発することを含む、免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発する方法である。免疫学的に活性な分子は、免疫学的に活性な分子の残りの部分とは独立に微粒子に付着することができる、脂質含有部分を有することができる。或いは、免疫学的に活性な脂質含有部分は、さらに炭水化物基を含むことができる。
【００８８】
本発明による組成物の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある量）を決定するための、標準的な薬学的手順により細胞培養物又は実験動物において判定することができる。毒性及び治療効果間の用量比が、治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療指標を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒト又は他の動物で使用するさまざまな投与量を作成するのに使用することができる。このような組成物の投与量は、好ましくは、毒性の少ない、又は毒性のないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態、及び使用される投与経路に応じてこの範囲内で変わることができる。
【００８９】
本発明による任意の組成物では、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に予測することができる。例えば、用量は、細胞培養で判定したＩＣ５０を含む血中血漿濃度範囲（すなわち、免疫系パラメータを測定する際、組成物の効果に関し半分の最大反応を実現する試験組成物の濃度）を得るために、動物モデルで作成することができる。こうした情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿レベルは、例えば、ＨＰＬＣにより測定することができる。
【００９０】
正確な製剤、投与経路及び投与量は、個々の医師により患者の状態を考慮して選択されることができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、１９７５年、第１章、１頁参照）。注意すべきは、担当医が、毒性又は臓器障害のため、どのように、いつ、投与を終了、中断、又は調節するかを知ろうとすることである。反対に、担当医は、臨床反応が適切でない場合、治療を高レベルまで調節する（毒性を除外しつつ）ことも知るであろう。目的とする障害管理における投与量の大きさは、治療する症状の重篤度及び投与経路により変わるであろう。症状の重篤度は、例えば、一部には、標準的な予後評価方法により評価することができる。さらに、用量及び恐らく投与頻度も、年齢、体重、及び個々の患者の反応により変わるであろう。上述したものと匹敵するプログラムは、獣医薬において使用することができる。
【００９１】
本発明の実践のため本明細書に記載された組成物を、全身投与に適した投与量で調製するための、薬学的に許容可能な担体の使用は、本発明の範囲内である。適正な担体の選択及び適当な製造実践により、本発明の組成物、特に、溶液として調製されたものは、静脈注射など、非経口投与することができる。組成物は、当技術分野でよく知られた薬学的に許容可能な担体を用いて、粘膜又は皮下投与に適した投与量に容易に調製することができる。
【００９２】
本発明は、以下の実施例により説明される。これらの実施例は、説明目的のためだけに含まれるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
微粒子の選択
１〜１０μｍ範囲のアガロース微粒子は、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（カールスバッド、ＣＡ）により生成され、Ｓａｔｕｒｎ ＤｉｇｉＳｉｚｅｒ ５２００（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ）により試験された。図１に示されたデータは、粒子分布が、７５％は５μｍ未満、２４％は５〜１０μｍ、１％は１０μｍ超であることを示している。
【００９４】
（実施例２）
マイコプラズマ・ガリセプティカム（ＭＧ）の培養
マイコプラズマ成長培地０．１ｍｌに、Ｍ．ガリセプティカム（Ｋ７８１Ｒ−１６Ｐ）の凍結乾燥形態を添加し、３７℃のインキュベーターの培地１．５ｍＬに入れた。マイコプラズマの増殖を、色の変化（ピンクからオレンジ又は黄色）により、又は寒天プレートにプレーティングしコロニーをチェックしてモニターした。大量（１０〜１５Ｌ）のマイコプラズマ培養物は、感染培養物を新鮮培地に移して成長させた。続いて、培養物を５５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清のＯＤ２８０が０．２未満になるまで、ＰＢＳによりペレットの洗浄を行った（５５００ｒｐｍで２０分間）。ペレットを、２０ｍＬのＰＢＳで再懸濁した。
【００９５】
（実施例３）
ＭＧ抗原精製のための免疫親和性カラムの製造
ステップ１：
抗Ｍ．ガリセプティカム鶏血清６４ｍｌに、脱イオン（ＤＩ）水１２８ｍＬをガラスビーカー中で添加した。溶液のｐＨを、氷酢酸で４．５に調節した。溶液を、急速に攪拌したが、飛沫又は発泡しないように注意した。ＣＡＰ−８沈殿溶液（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）を、１０分間勢いよく振盪した。続いて、ＣＡＰ−８沈殿溶液６４ｍｌを計り分け、１〜２分間の攪拌により形成されたボルテックスの側壁にゆっくり添加した。次いで、攪拌速度を、溶液を動かすだけの速さまで落とした。溶液を室温で３０分間攪拌し、次いで、適当な大きさにした遠心チューブに移し、沈殿物を５５００ｒｐｍで１５分間遠沈した。上清を容器にデカントし、ペレットを２０ｍＭの酢酸ナトリウム２０ｍＬ、ｐＨ４．８バッファで１回洗浄した。上清を、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【００９６】
ステップ２：
ＳＰ Ｔｈｒｕｐｕｔ Ｐｌｕｓカチオン交換樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）を、３ベッドボリュームの１Ｍ ＮａＯＨで１０分間懸濁し、次いで、ＤＩ水で中性になるまで洗浄した。続いて、１０ベッドボリュームの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で洗浄し、次いで、２０ベッドボリュームのＤＩ水で洗浄した。樹脂を、１５ベッドボリュームの２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８と平衡化し、２０ｍＭ 酢酸、ｐＨ４．８パッキングバッファを用いてカラムに充填した。ステップ１の上清を、３ｍＬ／分の流速でカラムに充填し、カラムを２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８バッファで洗浄した。フロースルー及び洗浄液を合わせた。２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８に対するＯＤ２８０を測定した。カラムを５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０バッファ、及び測定したＯＤ２８０溶離剤で溶出した。
【００９７】
ステップ３：
Ａｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤ活性化樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）２０ｍｌに、精製した抗Ｍ．ガリセプティカム鶏ＩｇＧ溶液を１０ｍｇ／ｍＬで添加し、続いて１０．５ｍＬの１Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＡＬＤ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）を添加した。懸濁液を、２０時間、２〜８℃で静かに混合し、続いてＤＩ水で大規模洗浄した。樹脂をＰＢＳ中に、ｐＨ７．０、２〜８℃で貯蔵した。
【００９８】
（実施例４）
ＭＧ抗原の精製
ステップ１：
洗浄したＭＧ濃縮物２０ｍｌに、０．２ｇのＭｅｇａ−１０界面活性剤を添加し、２０時間室温で混合した。２０時間のインキュベーション後、懸濁液に１ｍＬのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００も添加し、室温でさらに１時間混合を続けた。続いて、５，０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。上清をペレットから分離し、２００ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２を上清に添加した。ＭＧタンパク質溶液は、２〜８℃で５日間保管した。
【００９９】
ステップ２：
２０ｍＬベッドボリュームの抗ＭＧ鶏ＩｇＧ−Ａｃｔｉｇｅｌカラムを、５ベッドボリュームのＰＢＳ、ｐＨ７．２で流速３ｍＬ／分にて平衡化した。ＭＧタンパク質溶液を、カラムに８〜１５ｍＬ／分で充填した。フロースルーを別のボトルに回収した。カラムを、１０ベッドボリュームのＰＢＳ、ｐＨ７．２で流速８〜１５ｍＬ／分にて洗浄し、次いで、２０〜４０ｍＬの０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ２．５で同じ流速にて溶出した。溶出液のｐＨは、２ＭのＴｒｉｓで直ちに７．２に調整した。全抗原を吸着するため、この精製を、カラムのフロースルーにより少なくとも５回繰り返した。全溶出液を合わせて、粉糖により透析バッグで一晩、２〜８℃で濃縮した。濃縮液を、５ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して２〜８℃で一晩透析した。ブラッドフォードタンパク質分析を行い、血清アルブミンを基準として精製抗原の濃度を判定した。
【０１００】
（実施例５）
活性化アガロース微粒子
粒子を２つの異なる方法で活性化した。第一の活性化方法は、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（カールスバッド、ＣＡ）により、きわめて安定したリガンド結合を提供する市販の専用アルデヒドリンケージケミストリー（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて行われた。この化学反応の別の利点は、固定化の再現性の高さにある。この専用アルデヒドケミストリーは、さまざまなリガンドの連続固定化を可能にする。
【０１０１】
別の活性化は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化方法を用いて行った。簡単には、アガロース微粒子３０ｍＬに、３０ｍＬの２Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を添加し、氷槽で３〜５分間、混合せずに保管した。次いで、１．５ｇのＣＮＢｒを秤量し、９ｍＬのアセトニトリルで溶解した。直ぐに、ＣＮＢｒ溶液を樹脂混合物に添加し、氷槽で２分間勢いよく混合した。続いて、４，５００ｒｐｍ、２℃で５分間遠沈して、２０ベッドボリュームの氷水で洗浄した。
【０１０２】
（実施例６）
ＭＧ抗原と微粒子のカップリング
カップリング反応は、精製抗原のアミノ基及び微粒子のアルデヒド基又はＣＮＢｒ活性化基の間で起こる。アルデヒド活性化粒子を用いる場合、カップリングは、実施例３で記載したカップリング試薬、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより媒介された。抗原を、１０μｇ／０．２ｍＬ及び５０μｇ／０．２ｍＬ微粒子の濃度で固定化した。
【０１０３】
別のカップリング反応では、ＣＮＢｒ活性化微粒子を、同じ抗原濃度で以下のように使用した。１５ｍＬのＣＮＢｒ活性化微粒子に、精製ＭＧ抗原溶液をｐＨ８．０で添加した。溶液を２〜８℃で２０時間、静かに混合した。上清を遠心分離により分離し、樹脂を１０ベッドボリュームのＤＩ水で洗浄した。
結合樹脂は、ＬＡＬ水中で２〜８℃にて貯蔵した。ブラッドフォードタンパク質分析を用いて上清の非結合タンパク質を測定した。
【０１０４】
（実施例７）
マイコプラズマ膜の調製及びカップリング
濃縮マイコプラズマ抗原３．０ｍＬに、８０ｍＬの加圧滅菌ＤＩ水を添加し、攪拌棒で３７℃にて１時間混合した。溶液を、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ペレットを、加圧滅菌水で２回洗浄した。ペレットを、１０ｍＬのＰＢＳでもどした。１．５ｍＬのＣＮＢｒ活性化微粒子に、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８で１：３に希釈した０．５ｍＬの精製ペレットを添加した。溶液を、２〜８℃で２０時間、静かに混合した。上清を遠心分離により分離し、樹脂を１０ベッドボリュームのＤＩ水で洗浄した。結合樹脂は、ＬＡＬ水中で２〜８℃にて貯蔵した。ブラッドフォードタンパク質分析を用いて上清の非結合タンパク質を測定した。
【０１０５】
（実施例８）
ＮＯＤ１受容体活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるペプチドグリカン（ＰＧ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中で溶解し、実施例６により調製したＣＮＢｒ活性化微粒子に添加した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０６】
（実施例９）
ＴＬＲ３活性剤と微粒子のカップリング
１０μｇ／０．２ｍＬビーズにおけるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを、実施例６により、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にてＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０７】
（実施例１０）
ＴＬＲ４活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂における細菌のリポ多糖類を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０８】
（実施例１１）
ＴＬＲ５活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるフラジェリンを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０９】
（実施例１２）
ＴＬＲ１及びＴＬＲ６活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるマイコプラズマＭＡＬＰ−２含有表面抗原を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１０】
（実施例１３）
ＴＬＲ７／ＴＬＲ８活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂における一本鎖ＲＮＡ又は抗ウイルス性イミダゾキノリンイミキモド（Ａｌｄａｒａ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１１】
（実施例１４）
ＴＬＲ９活性剤と微粒子のカップリング
１０μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるＣｐＧ ＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によるＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１２】
（実施例１５）
組合せＰＡＭＰ認識受容体アゴニスト分子組成物の微粒子への固定化
ＮＯＤ１アゴニスト並びにＴＬＲアゴニスト４及び９を、それぞれ２μｇ／０．２ｍＬ樹脂、１０μｇ／０．２ｍＬ樹脂及び２μｇ／０．２ｍＬ樹脂において、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて混合し、実施例６によるＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂はＬＡＬ用水で完全に洗浄し、同じＬＡＬ用水に２〜８℃で貯蔵した。
【０１１３】
（実施例１６）
組合せＰＡＭＰ認識受容体アゴニスト分子組成物を伴うＭＧ抗原の微粒子への固定化
ＭＧ抗原を、実施例６に記載の条件下で１時間結合させた。続いて、実施例１３に記載のＴＬＲアゴニスト混合物を添加し、２〜８℃で一晩反応が進むままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１４】
（実施例１７）
動物試験Ｉ
結果は、３つの実験の平均である。
【０１１５】
３日齢のヒヨコ（Ｍ．ガリセプティカム（ＭＧ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ）（ＭＳ）が認められず、ＥＬＩＳＡでＭＧ及びＭＳ母性抗体が検出されない）を、ワクチン接種した。各群を鶏１０羽とした。実験１４日目に、鶏をＭ．ガリセプティカムＲｌｏｗ株に曝露した。試験は、２８日目に終了した。
【０１１６】
各群は、以下のように設定した。
Ｇ１〜Ｇ５ 曝露前に微粒子ワクチン組成物により治療
Ｇ１＝微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療のみ、及び曝露
Ｇ２＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ３＝受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）及び受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、並びに曝露
Ｇ５＝Ｍ．ガリセプティカム膜（１０７／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療
Ｇ６〜Ｇ７ 曝露後に微粒子ワクチン組成物により治療
Ｇ６＝曝露、並びにＭ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）及び受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による曝露後の経口治療
Ｇ７＝曝露、及び受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による曝露後の経口治療
Ｇ８及びＧ９ 陽性及び陰性対照群
Ｇ８＝曝露及び未治療
Ｇ９＝非曝露及び未治療
【０１１７】
タイムライン
１日目：群Ｇ１〜Ｇ９を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの有無を確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの培養用に、鶏１０羽を屠殺した。
【０１１８】
０日目：曝露前にＧ１〜Ｇ５をワクチン接種
【０１１９】
１４日目：群Ｇ１〜Ｇ８の曝露
【０１２０】
１５日目：曝露後に群Ｇ６〜Ｇ７をワクチン接種
【０１２１】
２８日目：Ｇ１〜Ｇ９。特定の臓器（気管、気嚢及び肺）からＭ．ガリセプティカム（ＭＧ）を分離するための安楽死、剖検、及びプレーティング。気管及び肺の組織学的実験を行った。
【０１２２】
１４日目及び２８日目：血清平板凝集（ＳＰＡ）試験及びブロッキングＥＬＩＳＡによりＭＧ特異的抗体を試験するための血清を得るため、鶏を採血した。
【０１２３】
１日目、合計９０羽の、１日齢のブロイラー種鶏を、８群の１つに割り当てた（１０羽／群）。鶏の個体の体重を記録した。鶏は、各群の平均体重が著しく違わないように割り付けた。各鶏は、治療に応じて色付け及び番号付けしたウィングタグで識別し、然るべき形で体重を記録した。
【０１２４】
治療
０日目、Ｇ１〜Ｇ５の鶏を、異なるワクチン組成物（０．２ｍＬ／１ｍＬ ＰＢＳ／鶏）で治療した。用量は上記に記載されている。Ｇ６〜Ｇ７を、曝露後１５日目に治療した。
【０１２５】
曝露
１４日目、８群の鶏Ｇ１〜Ｇ８を、約８．０ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌのウイルス価で、Ｍ．ガリセプティカム毒性Ｒ株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物１０ｍｌを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を０．２２立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、１０ｍｌの新鮮なＭ．ガリセプティカムＲ株培養物を、１気圧下、約１００秒間スプレーし、鶏を２０分間曝露した。（実験室では、この方法により幾つかの実験で好成績が得られた）。
【０１２６】
安楽死及び病変
２８日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、ＭＧに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管：０＝浸出液なし、１＝わずかな発赤及び少量の浸出液、２＝粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢：０＝病変なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢、４＝多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜：０＝浸出液なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性−線維性浸出液
【０１２７】
ＭＧ分離
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天（ＭＡ）にプレーティングし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。２、４、及び７日目に、次いで、１週間間隔で最大３週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをＰＣＲで試験し、Ｍ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエを同定した。
【０１２８】
剖検
ＭＧ曝露に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、粒子プラス受容体アゴニスト（Ｇ３、Ｇ６ ｐ＜０．００１）、粒子プラス精製抗原（Ｇ２、ｐ＜０．００１）及び精製抗原プラス受容体アゴニスト（Ｇ４、Ｇ６ ｐ＜０．００１）で治療した群では、対照（Ｇ８）未治療、曝露群及び粒子のみによる治療群（Ｇ１）に比べて、病変スコアの大幅な低下が記録された。しかし、粒子プラス精製抗原又は粒子プラス精製抗原プラス受容体アゴニストでは、これらが曝露前に投与された場合、曝露後投与に比べて好成績が得られた。Ｇ５を、粒子に固定化したＭ．ガリセプティカム膜で治療した場合、幾つかのケースの病変は、曝露群自体より顕著であった。このことから、Ｍ．ガリセプティカム膜によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
【０１２９】
マイコプラズマの再分離
マイコプラズマは、非ワクチン接種の、感染した対照鶏の内臓から再分離されることができる。非ワクチン接種対照群（Ｇ８、ｐ＜０．０１）及び粒子のみによる治療群（Ｇ１、ｐ＜０．００１〜０．０１）又は粒子プラス受容体アゴニスト治療群（Ｇ３、Ｇ７ ｐ＜０．０５）と比べて、再分離率（呼吸器＋内臓からの）の著しい低下が、受容体アゴニストの有無にかかわらず、粒子プラス精製抗原治療群（Ｇ２、Ｇ４、Ｇ６）で認められた。しかし、粒子プラス受容体アゴニスト治療群（Ｇ３、Ｇ６）及び対照群（Ｇ８）の間には、再分離率の著しい低下（ｐ＜０．０５）があった。実験群の呼吸管（気管、肺、気嚢）又は他の内臓（肝臓、脾臓、腎臓及び心臓）からのマイコプラズマの再分離率を比較した場合、類似する結果が得られた。Ｇ５を、粒子に固定化したＭ．ガリセプティカム膜で治療した場合、幾つかのケースで臓器からのＭ．ガリセプティカムの再分離率は、曝露群自体よりも高かった。このことから、Ｍ．ガリセプティカム膜によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
【０１３０】
結果を表１に示す。
【表１】
【０１３１】
血清学的結果
各群の血清学的応答は、実験の最後に違いが見られた。非治療の、曝露群（Ｇ８）の応答は、粒子のみによる治療群（Ｇ１）と違わなかった。同時に、粒子のみによる治療群（Ｇ１）に比べ、有意に強い応答が、粒子プラス精製抗原及びＰＲＲアゴニスト治療群（Ｇ４）で見られた（ｐ＜０．０５）。粒子プラス精製抗原治療群（Ｇ２）に比べ、ＰＲＲを加えた場合（Ｇ４、Ｇ６）、有意に高い血清学的応答が見られた（ｐ＜０．０５）。抗原及びＰＲＲを伴う粒子を曝露前（Ｇ４）又は曝露後（Ｇ６）に使用した場合、血清学的結果の間に有意差は見られなかった。
【０１３２】
考察
Ｍ．ガリセプティカムは、気管、気嚢及び肺のコロニー形成を伴う著しい炎症を、気嚢及び腹膜で引き起こすことができる。マイコプラズマも、内臓からしばしば検出されうる。本発明者らは、異なるＰＲＲアゴニスト分子と共に共有結合で固定化された免疫親和性精製抗原を有する、微生物のサイズ範囲（＜５μｍ）の微粒子からなる、新しいタイプの「病原体模倣」免疫学的活性組成物を開発した。
【０１３３】
本発明者らの結果は、いかなる修飾も施さない粒子は、いかなる免疫応答も刺激しないことを示した。粒子単独では、Ｍ．ガリセプティカムによって引き起こされた腹膜炎及び気嚢炎から鶏を防御することも、マイコプラズマによる臓器のコロニー形成を防止することもなかった。
【０１３４】
粒子を、抗原を伴わないＰＲＲアゴニストで被膜した場合、マイコプラズマ曝露に対する血清学的応答が影響されることはなかった。しかし、マイコプラズマによる臓器のコロニー形成は減少し、病変スコアは低下した。これは、ＰＲＲアゴニストは、防御の増加をもたらす先天性免疫応答を刺激又は増大するという、本発明者らのインビトロでの観察を裏付けるものである。しかし、適用された免疫モジュレーターの量は、病原性の高い株による大量の曝露から鶏を十分に守ることができなかった。このことは、先天性免疫系についても知られているが、これは、先天性免疫系が一般に、大量の病原体を克服するには不十分なためである。しかし、データは、この新規な免疫モジュレーターは、鶏を少量の曝露から守る可能性があることを示している。
【０１３５】
精製抗原を、ＰＲＲアゴニストで被膜した粒子に添加した場合、マイコプラズマ特異的な血清学的応答を高めることができる。臓器のコロニー形成は、著しく減少し、病変スコアは低かった。この効果は、ワクチンを粘膜的に、及び曝露前に導入した場合、より顕著であったが、類似の好ましい効果は、ワクチンを曝露後に粘膜投与した場合も見られた。
【０１３６】
興味深い観察は、抗原濃度の上昇（最大５０μｇ／投与）は、実際にワクチンの防御効果を低下させる点であった。このことは、親和性精製抗原における免疫抑制成分の存在を示唆する。こうした成分を同定し、これらの影響を排除するため、新たな動物試験をデザインした（以下参照）。
【０１３７】
ワクチン接種後、曝露前に、ワクチン接種した鶏を毎日調べて、ワクチンの安全性を評価した。鶏は、臨床的に健康であることがわかり、ワクチンの副作用は示されなかった。鶏の飼料及び水の消費量は、非ワクチン接種群と比べて変わりなかった。試験の過程で剖検した鶏は、炎症徴候又は臓器サイズ／重量の変化が見られなかった。ワクチンは、安全であると思われる。
【０１３８】
（実施例１８）
親和性精製ＭＧ抗原を、先の実施例に記載されたように調製した。精製抗原を、固定化前に以下の処理のため３群に分けた。
【０１３９】
１．エンドグリコシダーゼＨ分解
抗原５３．６ｍｌ（約１．５ｍｇ）に、２．５単位の酵素を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、混合物を、冷却し固定化したマンナンカラム（５ｍＬ）に通過させ、フロースルーを回収した。この試料をＥｎｄｏＨ抗原と命名した。
【０１４０】
２．過ヨウ素酸塩処理
抗原５３．６ｍＬ（約１．５ｍｇ）に、固体過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度が１５ｍＭになるまで添加し、混合後１時間冷却した。２倍モル過剰でグリセリンを添加し、試料をさらに１時間インキュベートした。ＰＢＳに対し透析を一晩行った。透析した試料を過ヨウ素酸塩（ＰＪ）抗原と命名した。
【０１４１】
３．ＣｏｎＡ結合抗原の除去
精製抗原（５３．６ｍＬ中約１．５ｍｇ）を、２ｍＬ固定化ＣｏｎＡカラムに通過させた。フロースルーを回収した。この試料をＣｏｎＡフロースルーと命名した。結合抗原を、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ９．５中で１Ｍ アルファ−メチルマンノグルコシドにより溶出した。この試料をＣｏｎＡ溶出と命名した。
【０１４２】
抗原処理
抗原の特性を表２に示す。
【表２】
＊ＥｎｄｏＨ処理では、処理した抗原の初期量は、２．５１ｍｇであった。（この製剤５３．６ｍｌ、及び０．０２４６ｍｇ／ｍｌの先のＭ．ガリセプティカム製剤４０．３ｍｌ）
【０１４３】
（実施例１９）
動物試験ＩＩ
結果は、３つの実験の平均である。３日齢のヒヨコ（Ｍ．ガリセプティカム（ＭＧ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ）（ＭＳ）が認められず、ＥＬＩＳＡでＭＧ及びＭＳ母性抗体が検出されない）を、ワクチン接種した。各群を鶏１０羽とした。実験１４日目に、鶏をＭ．ガリセプティカムＲｌｏｗ株に曝露した。試験は、２８日目に終了した。
各群は、以下のように設定した。
Ｇ１＝非曝露及び未治療
Ｇ２＝曝露及び未治療
曝露前２週間に治療
Ｇ３＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）及びＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、並びに曝露
Ｇ４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（５０μｇ／投与）及びＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、並びに曝露
Ｇ５＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ６＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（１０μｇ）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ７＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原（１０μｇ）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ８＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ９＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（５０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１０＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１１＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（５０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１２＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１３＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原（５０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）プラスアミノグアニジン（腹腔内）による７日間の経口治療、及び曝露
Ｇ１５＝ビーズ上のＭ．ガリセプティカム抗原ＣｏｎＡ溶出を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
【０１４４】
タイムライン
１日目：群Ｇ１〜Ｇ１５を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、及びマイコプラズマの有無を確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの培養用に、鶏１０羽を屠殺した。
【０１４５】
０日目：曝露前にＧ３〜Ｇ１４をワクチン接種
１４日目：群Ｇ２〜Ｇ１５の曝露
【０１４６】
２８日目：Ｇ１〜Ｇ１５。特定の臓器（気管、気嚢及び肺）からＭ．ガリセプティカム（ＭＧ）を分離するための安楽死、剖検、及びプレーティング。気管及び肺の組織学的実験を行った。
【０１４７】
１４日目及び２８日目：血清平板凝集（ＳＰＡ）試験及びブロッキングＥＬＩＳＡによりＭＧ特異的抗体を試験するための血清を得るため、鶏を採血した。
【０１４８】
１日目、合計１５０羽の、１日齢のブロイラー種鶏を、１５群の１つに割り当てた（１０羽／群）。鶏の個体の体重を記録した。鶏は、各群の平均体重が著しく違わないように割り付けた。各鶏は、治療に応じて色付け及び番号付けしたウィングタグで識別し、然るべき形で体重を記録した。
【０１４９】
曝露
１４日目、１４群の鶏Ｇ２〜Ｇ１５を、約８．０ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌのウイルス価で、Ｍ．ガリセプティカム毒性Ｒ株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物１０ｍｌを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を０．２２立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、１０ｍｌの新鮮なＭ．ガリセプティカムＲ株培養物を、１気圧下、約１００秒間スプレーし、鶏を２０分間曝露した。（実験室では、この方法により幾つかの実験で好成績が得られた）。
【０１５０】
安楽死及び病変
２８日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、ＭＧに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管：０＝浸出液なし、１＝わずかな発赤及び少量の浸出液、２＝粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢：０＝病変なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢壁、４＝多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜：０＝浸出液なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性−線維性浸出液
【０１５１】
結果
結果を表３に示す。
【表３】
【０１５２】
ＭＧ分離
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天（ＭＡ）にプレーティングし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。２、４、及び７日目に、次いで、１週間間隔で最大３週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをＰＣＲで試験し、Ｍ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエを同定した。
【０１５３】
剖検及び再分離
ＭＧ曝露後に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、精製抗原プラスＴＬＲでワクチン接種した群（このうち最も良好な群は、ＣｏｎＡカラム著減抗原（Ｇ９）であった）は、対照未治療、曝露群に比べて、病変スコア及び再分離率の大幅な低下が記録された。しかし、ＣｏｎＡ溶出抗原画分Ｇ１５では、病変スコアは高く、再分離率は陽性対照群と同じであった。このことから、このＭ．ガリセプティカム抗原画分によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
【０１５４】
考察
これらの実験の結果は、免疫抑制抗原の親和性精製抗原プールからの除去が、ワクチン組成物の防御効果を著しく改善したことを示している。さらに、抗原における転写後修飾を含有する糖の化学修飾又は酵素分解もまた、防御免疫の改善をもたらした。
【０１５５】
反対に、本発明者らは、分離した、微粒子に結合した免疫抑制抗原の投与は、免疫抑制及び、病原体に対する寛容性の発現をもたらすことも見出した。こうして、本発明者らは、適正な抗原特性は、免疫応答を防御又は寛容性のどちらかへシフトさせることができることを実証した。これらは両方とも、免疫応答を調節する合理的な方法を開発する上で重要な意味を持つ。続いて、本発明者らは、免疫応答の発現に関与する別の抗原表面決定基を標的にすることにした。
【０１５６】
（実施例２０）
親和性精製ＭＧ抗原を、先の実施例に記載されたように調製した。精製抗原を、固定化前に以下の処理のため３群に分けた。
【０１５７】
１．ＭＧ抗原脱アシル化
抗原２７ｍＬ（約０．６５ｍｇ）に、８ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ及び１０ｍｇのペンタデカン酸を添加し、溶液を、７０℃で４５分間静かに攪拌した。次いで、ｐＨを８．０に調節し、沈殿物を、３，０００ｒｍｐで５分間、遠心分離により除去した。この試料を脱アシル化抗原と命名した。
【０１５８】
２．過ヨウ素酸塩処理
これは、実施例１８よりストリンジェントな反応を意図したものである。抗原２５ｍＬ（約０．６ｍｇ）に、固体過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度が８０ｍＭになるまで添加し、混合後２．５時間、室温で保管した。次いで、２倍のモルアクセス（ｍｏｌａｒ ａｃｃｅｓｓ）でグリセリンを添加し、試料をさらに１時間インキュベートした。ＰＢＳに対し透析を一晩行った。透析した試料を過ヨウ素酸塩抗原と命名した。
【０１５９】
（実施例２１）
動物試験ＩＩＩ
結果は、３つの実験の平均である。３日齢のヒヨコ（Ｍ．ガリセプティカム（ＭＧ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ）（ＭＳ）が認められず、ＥＬＩＳＡでＭＧ及びＭＳ母性抗体が検出されない）を、ワクチン接種した。各群を鶏１０羽とした。実験１４日目に、鶏をＭ．ガリセプティカムＲｌｏｗ株に曝露した。試験は、２８日目に終了した。
【０１６０】
各群は、以下のように設定した。
Ｇ１＝非曝露及び未治療
Ｇ２＝曝露及び未治療
曝露前２週間に治療：
Ｇ３＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ／投与）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、脱アシル化抗原（１０μｇ／投与）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ５＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（２５μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ＋２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ６＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、過ヨウ素酸塩処理された脱アシル化抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ、及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
曝露後１日目に治療：
Ｇ７＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（２５μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ、及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療
Ｇ８＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、過ヨウ素酸塩処理された脱アシル化抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（２５μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ、及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
【０１６１】
タイムライン
１日目：群Ｇ１〜Ｇ９を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、及びマイコプラズマの有無を確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの培養用に、鶏１０羽を屠殺した。
【０１６２】
０日目：曝露前にＧ３〜Ｇ６をワクチン接種
【０１６３】
１４日目：群Ｇ２〜Ｇ９の曝露
【０１６４】
１５日目：曝露後に群Ｇ７〜Ｇ９をワクチン接種
【０１６５】
２８日目：Ｇ１〜Ｇ９。特定の臓器（気管、気嚢及び肺）からＭ．ガリセプティカム（ＭＧ）を分離するための安楽死、剖検、及びプレーティング。気管及び肺の組織学的実験を行った。
【０１６６】
１４日目及び２８日目：血清平板凝集（ＳＰＡ）試験及びブロッキングＥＬＩＳＡによりＭＧ特異的抗体を試験するための血清を得るため、鶏を採血した。
【０１６７】
１日目、合計９０羽の、１日齢のブロイラー種鶏を、９群の１つに割り当てた（１０羽／群）。鶏の個体の体重を記録した。鶏は、各群の平均体重が著しく違わないように割り付けた。各鶏は、治療に応じて色付け及び番号付けしたウィングタグで識別し、然るべき形で体重を記録した。
【０１６８】
曝露
１４日目、９群の鶏Ｇ２〜Ｇ９を、約８．０ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌのウイルス価で、Ｍ．ガリセプティカム毒性Ｒ株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物１０ｍｌを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を０．２２立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、１０ｍｌの新鮮なＭ．ガリセプティカムＲ株培養物を、１気圧下、約１００秒間スプレーし、鶏を２０分間曝露した。
【０１６９】
安楽死及び病変
２８日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、ＭＧに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管：０＝浸出液なし、１＝わずかな発赤及び少量の浸出液、２＝粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢：０＝病変なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢壁、４＝多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜：０＝浸出液なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性−線維性浸出液
【０１７０】
結果
結果を表４に示す。
【表４】
【０１７１】
ＭＧ分離
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天（ＭＡ）にプレーティングし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。２、４、及び７日目に、次いで、１週間間隔で最大３週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをＰＣＲで試験し、Ｍ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエを同定した。
【０１７２】
剖検及び再分離
ＭＧ曝露後に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、処理された精製抗原プラスＴＬＲ群でワクチン接種した群で、病変スコア及び再分離率の大幅な低下が記録され、全群は同程度の結果であり、対照未治療曝露群に比べ、脱アシル化抗原（Ｇ４）が最も良かった。感染後にワクチン接種した群では、ＣｏｎＡ処理抗原プラスＴＬＲ３、４、９が最も良い結果をもたらした。感染後であっても、この組成物により防御免疫を得ることは可能であるように思われる。
【０１７３】
考察
これらの実験の結果は、免疫抑制回避抗原又は抗原決定基の親和性精製抗原プールからの除去又は遮断が、ワクチン組成物の防御効果を著しく改善したことを示している。さらに、抗原における転写後修飾（Ｎ−グリコシル化）を含有する糖の除去及び化学修飾もまた、防御免疫の改善をもたらした。さらに、抗原の脂質部分が、化学的に除去され、又は遮断されたことも、著しい免疫防御効果につながった。
【０１７４】
本発明者らは、適正な抗原修飾により、免疫応答を防御へシフトさせることができることを再び実証した。これは、免疫応答を調節する合理的なアプローチを開発する上で、きわめて重要な意味を持つ。続いて、本発明者らは、個々の免疫応答を組織培養で再現するインビトロ系を設定した。こうした系は、免疫学的に活性な組成物により生じた免疫応答に関する予測値を有することができ、故に製品開発サイクルを短縮することができる。
【０１７５】
（実施例２２）
インビトロ試験
ＴＮＦ−α分泌を、末梢血から調製したＰＢＭＣで測定し、ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＩ）、細菌ＣｐＧ ＤＮＡ（ＫＭ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、オーロラ、ＯＨ；リムルス変形細胞溶解物アッセイ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｓｓａｙ）で測定したＬＰＳ＜０．２ＥＵ／ｍｌ）、又は両方により処理した。ＴＮＦ−αを、５時間のインキュベーション後、培養上清からＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７６】
先天性免疫系の代表である、単球の組織因子（ＴＦ）を、ＴＮＦ−α分析に使用される、対応するＰＭＢＣ培養物から評価した。ＴＦは、ＴＦ ＥＬＩＳＡ（Ｉｍｕｂｉｎｄキット、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、グリニッチ、ＣＴ）向けにメーカーにより推奨されたＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で接着細胞から抽出した。
【０１７７】
結果を図２に示す（Ｐ及びＤに続く数字はそれぞれ、ＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示している。左から右に、これらはＰ３＋Ｄ１５，Ｐ３＋Ｄ５、Ｐ３＋Ｄ１．５、Ｐ１＋Ｄ１５、Ｐ１＋Ｄ５、Ｐ１＋Ｄ１．５、Ｐ０．３＋Ｄ１５、Ｐ０．３＋Ｄ５，及びＰ０．３＋Ｄ１．５）。ＰｅｐＧ（白いバー）、又は細菌のＣｐＧ ＤＮＡ（黒いバー）、又は単独で添加した場合と同じ濃度で両者を同時に添加（斜線バー）して処理した後の、ＰＢＭＣ（Ａ）及び組織因子（Ｂ）により分泌されたＴＮＦ−α。Ｐ及びＤに続く数字はそれぞれ、ＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示している。試験した全濃度で、ＰｅｐＧ（３又は１．５μｇ／ｍＬ）及びＣｐＧ ＤＮＡの単独での効果の合計を比較した場合、並びにＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡを共に添加した場合、ＴＮＦ−α及びＴＦのｐ＜０．０５；スチューデントＴ検定（ｎ＝４）。これは、３つのうちの代表的な実験である。
【０１７８】
本結果は、ＰＢＭＣにおけるＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡによるＴＮＦ−α及びＴＦの同時誘導、並びに２つの分子間の相乗効果を示している。これには、共通の下流シグナル伝達経路に対する直接的影響、又はＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの作用後に分泌される化合物が媒介する間接的影響が関与していると考えられる。ＴＮＦ−αは、発熱物質に対する宿主反応の重要な初期メディエーターであり、敗血性ショックの代謝、血液動態、組織及びサイトカインカスケード反応の全領域を誘因することが可能な、唯一の内因性メディエーターである。ｂａｃｔＤＮＡ及びＰｅｐＧの相乗効果は、敗血症の病原体に影響する。ここでは、各分子は、インビボでの濃度は低いものの、先に仮定された通り、互いの効果を増幅するように思われる。
【０１７９】
さまざまなＴｈ１及びＴｈ２応答の、さまざまな粒子組成物によるインビトロでの誘導の実証
末梢血単核細胞を、健常なボランティアからの末梢血のフィコール分離により調製した。単核細胞を、１．５ｍｌ ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で１０６細胞／ｍｌの濃度でプレーティングし、１００ Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン及び３％ウシ胎仔血清を補充し、微粒子０．１５ｍＬ（滅菌ＰＢＳ中）と共に１８時間インキュベートした。微粒子は、ＣｏｎＡにより露出された（Ｃｏｎ Ａ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）又は過ヨウ素酸ナトリウム処理された抗原のほか、以下のグラフに示されたＴＬＲアゴニスト２、３、４及び９を含有した。ビーズの調製は、実施例１９に記載されている。
【０１８０】
結果を、図３（グレーのバー、ＴＮＦ−αｘ１００、黒いバー、ＩＬ−１０）及び図４に示す。ここでは、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１０の比が示されている。
【０１８１】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０比の分析は、ＴＬＲ２、４、８と共固定されたＣｏｎＡ著減抗原が、インビボでの結果との相関が見られる、最も顕著なＴｈ１応答をもたらすことを証明した（実施例１９参照）。この組成物は、動物におけるマイコプラズマ曝露に対する最も高い防御効果を一貫してもたらした。
【０１８２】
（実施例２３）
免疫モジュレーター微粒子に対する細胞性応答の特徴をさらに明らかにするため、本発明者らは、樹状細胞をこうした微粒子に曝露した。本発明者らは、ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ分子、並びに共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６のアップレギュレーションを観察した。どちらかのＰＲＲアゴニストの組合せが存在することは、処理１８時間後の樹状細胞表面におけるＭＨＣ ＩＩの増加を測定するのに必要と思われる。細胞表面のＭＨＣの存在は、動的過程であるため、細胞表面のＭＨＣ分子の増加を観察するには、ＣｏｎＡ Ａｇビーズでは異なるインキュベーション時間が必要となる可能性がある。ＭＨＣは、Ｔ細胞への抗原提示を可能にし、ＣＤ８６は、Ｔ細胞のＣＤ２８と相互作用する。樹状細胞による同時の抗原提示、及びＢ７共刺激リガンド（ＣＤ８０及びＣＤ８６など）相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらす。これらインビトロでのデータは、樹状細胞変異の顕著な特徴であり、先天性及び適応免疫の誘導を必要とする変化を、微粒子が誘導することを示している。
【０１８３】
樹状細胞表面におけるＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ並びにＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、さまざまな微粒子製剤に曝露後１８時間目に決定した：抗原又はＰＲＲアゴニストが固定化されなかった対照微粒子（対照）、及び以下のＰＲＲアゴニストの組合せの有無にかかわらず、ＣｏｎＡ結合抗原が著減したＭ．ガリセプティカム抗原が固定化された微粒子（ＣｏｎＡ Ａｇ）：１）ＰｅｐＧ、ＬＰＳ、細菌ＤＮＡ（ｂａｃｔＤＮＡ）（ＣｏｎＡ Ａｇ＋ＰＲＲ２、４、９）又は２）ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＬＰＳ、ｂａｃｔＤＮＡ（ＣｏｎＡ Ａｇ＋ＰＲＲ３、４、９）。樹状細胞におけるＭＨＣ ＩＩ及びＣＤ８６の誘導を、図５に示す。
【０１８４】
結果は、ＤＣによるＴＮＦ−α分泌に与える微粒子の影響を示している。対照微粒子は、馴化培地におけるＴＮＦ−αの検出可能な分泌を誘導しなかった。微粒子の他の３つのタイプ（ＣｏｎＡ結合抗原著減後のＭ．ガリセプティカム抗原、及びＰｅｐＧに共固定化された類似の抗原、ＬＰＳ、ｂａｃｔＤＮＡ及びｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）は、対照微粒子に比べてＤＣによる多量のＴＮＦ−αを誘導した。興味深いことに、免疫モジュレーターとしての細菌化合物の存在は、抗原単独に比べてＴＮＦ−αの発生は低かった。これらの結果は、微粒子がＤＣと相互作用しており、ＴＬＲ及びＮＯＤ受容体を活性化して、免疫系細胞におけるこれらの分子の既知の効果に応じて生理反応を発生することができることを示している。本発明者らは、微粒子がＤＣを標的にすることができることを実証した。
【０１８５】
（実施例２４）
ヘパリン結合タンパク質のＭＧからの精製
Ｍ．ガリセプティカムを、実施例２に記載の通りに成長させ、濃縮し洗浄したマイコプラズマを、実施例４のステップ１に開示の通りに不活化した。簡単には、ＭＧ膜粗タンパク質７５ｍＬに、０．７５Ｍｅｇａ−１０を添加し、溶液を室温で２０時間混合した。続いて、３．７５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を溶液に添加し、室温でさらに１時間混合した。溶液を５，０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清をペレットから分離した。次いで、Ｔｒｉｓバッファ７５ｍｌ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を上清に添加した。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ａｃｔｉｇｅｌカラムを、５ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファにより流速３ｍｌ／分で平衡化した。ＭＧタンパク質溶液をカラムに流速８〜１５ｍｌ／分で充填し、フロースルーを別のボトルに回収した。カラムを、１０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファにより流速８〜１５ｍｌ／分で洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓバッファにより流速８〜１５ｍｌ／分で溶出した。カラムを１０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファで洗浄後、ＭＧタンパク質溶液をカラムに再び加え、上述した通りに溶出を繰り返した。溶出物をプールし、３，５００ＭＷカットオフ透析チューブ法により、Ｔｒｉｓバッファに対し透析した。タンパク質アッセイを行い、溶出したタンパク質濃度を判定した。
【０１８６】
（実施例２５）
中和血清からのＩｇＧの精製及び免疫親和性カラムの製造
ワクチン接種した、中和鶏血清からのＩｇＧ大量精製及びＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤへの固定化を実施例３により行った。
【０１８７】
（実施例２６）
免疫親和性カラムに結合したヘパリン結合ＭＧタンパク質のトリプシン消化
精製ＭＧタンパク質２ｍｇを、２ｍｌの免疫親和性カラムに添加し、１５分間結合させた。カラムを、１０ｍｌのＴｒｉｓバッファＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄した。トリプシン溶液（ＴｒｉｓバッファＢ中２０μｇ／ｍｌ）を添加し、スラリーを３７℃で１時間、静かに攪拌した。フラグメント及び遊離酵素をＴｒｉｓバッファＢで洗い流し、結合したペプチドを０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．５で溶出した。溶出物を続いてｃｃ．ＮＨ４ＯＨで中和、濃縮し、Ｃ−１８逆相スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）精製し、ペプチド組成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。
【０１８８】
（実施例２７）
ヘパリンカラムに結合したヘパリン結合ＭＧタンパク質のトリプシン消化
精製ＭＧタンパク質２ｍｇを、２ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌカラムに添加し、１時間結合させた。カラムを、１０ｍｌのＴｒｉｓバッファＢで洗浄した。トリプシン溶液（ＴｒｉｓバッファＢ中２０μｇ／ｍｌ）を添加し、スラリーを３７℃で１時間、静かに攪拌した。フラグメントをＴｒｉｓバッファＢで洗い流し、結合したペプチドを１ＭのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓバッファＢで溶出した。溶出物を濃縮し、Ｃ−１８逆相スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製し、ペプチド組成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。
【０１８９】
（実施例２８）
Ｃ１ｑタンパク質の精製及び固定化
Ｃ１ｑの精製を、ＭｃＫａｙ，ＥＪ「さまざまな動物種由来血漿Ｃ１ｑを精製するための簡単な２段階手順（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ Ｃ１ｑ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｉｍａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８１年３：３０３〜３０８頁の方法により行った。精製したＣ１ｑを、米国特許第５，８０１，０６３号に記載された本発明者らの手順の適応により、Ａｍｉｎｏｇｅｌ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）に３ｍｇ／ｍｌで固定化した。
【０１９０】
（実施例２９）
補体結合ＩｇＧの精製及び固定化
実施例２４により精製されたポリクローナル中和抗体を、固定化Ｃ１ｑの１０ｍｌカラムに加え、ＴｒｉｓバッファＢで平衡化し、３０分間結合させた。非結合抗体を、１０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファＢで洗浄して除去し、結合抗体を、１Ｍ ＮａＣｌを含有する同じバッファで溶出した。精製されたＩｇＧを、続いてＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤに３ｍｇ／ｍｌで固定化した。
【０１９１】
（実施例３０）
免疫親和性カラムに結合した補体活性化ＭＧタンパク質のトリプシン消化
Ｍ．ガリセプティカムを、実施例２に記載の通りに成長させ、濃縮し洗浄したマイコプラズマを、実施例４のステップ１に開示の通りに不活化した。固定化した補体活性化抗体の１０ｍＬカラムに、ＭＧ溶解物３０ｍｌを３ｍｌ／分で加えた。カラムを、２０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファＢにより流速８ｍｌ／分で洗浄し、非特異的吸着タンパク質を除去した。トリプシン溶液（ＴｒｉｓバッファＢ中２０μｇ／ｍｌ）を添加し、スラリーを３７℃で１時間、静かに攪拌した。フラグメントをＴｒｉｓバッファＢで洗浄して除去し、結合したペプチドを０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．５で溶出した。溶出物を続いてｃｃ．ＮＨ４ＯＨで中和、濃縮し、Ｃ−１８逆相スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製し、ペプチド組成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。
【０１９２】
免疫学的に活性なペプチドの例は、以下の組成を有することが示されている：Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。重要なことは、このペプチドが、ＧＡＧ／ヘパリン結合領域Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇを含有する点である。別の有用な配列は、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。これらの配列は、エンドプロテイナーゼの切断部位を含有するリンカーペプチドに結合することができる。こうしたリンカー配列の例は、ＬＩＫＦＲＳＮ（Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。他のリンカー配列は、当技術分野で知られている。
【０１９３】
（実施例３１）
抗原ペプチドエピトープ及びマルチエピトープペプチドの合成
抗原ペプチドをＦＭＯＣ方法により合成した。
【０１９４】
（実施例３２）
ワクチンのための防御抗原ペプチドの確認
抗原ペプチドを、ワクチン接種した鶏の中和血清と混合し、固定化したヘパリンに対する結合阻害を競合ＥＬＩＳＡにより判定した。ペプチド試料を、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着した。続いて、ウェルを、ブロッキング溶液でブロックし、免疫及び非免疫対照抗血清を、続いてウェルに添加し、一晩４℃でインキュベートした。非特異的タンパク質を、洗浄液で除去した後、１００μｇ／ｍｌのビオチン標識ヘパリンを添加し、ブロッキングバッファ中で１時間希釈した。非結合ヘパリンを、３回、各１０分間洗浄した後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、ブロッキングバッファ中で１時間、１：３，０００に希釈した。過剰な結合体を、３回、各１０分間、洗浄バッファで洗浄して除去し、３，３’−ジアミノベンジジン溶液を添加して発色させた。シグナルは、中和抗体の存在に反比例する。
【０１９５】
（実施例３３）
病原体抗原タンパク質のバイオインフォマティクス解析は、高い抗原能のエピトープの同定をもたらすこともできる。こうした解析は、これまでにＭ．ガリセプティカムＭＧＡタンパク質について行われている。抗原領域を、直鎖塩基モチーフの文脈でさらに解析した。こうした抗原性の高い予測直鎖モチーフは、以下の配列である：ＭＨＣ Ｉエピトープ １０−ｍｅｒは、ＬＬＡＫＫＴＤＫＳＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＭＨＣ ＩＩ １５−ｍｅｒは、ＬＬＡＫＫＴＤＫＳＶＳＰＡＱＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）である。これらの領域は、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ法（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）により同定した。これは、直鎖塩基モチーフは、実際に抗原性向の高いスポットの内側に含まれていることを示す。バイオインフォマティクス解析は、Ｊ．Ｐｅｖｓｎｅｒ、「バイオインフォマティクス及び機能ゲノミクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．、２００３年）に記載されたものなど、当技術分野で周知の方法により、当技術分野で周知のデータマイニング及びマッチング並びに配列比較のためのデータベース及びコンピュータ解析法を用いて、行うことができる。
【０１９６】
（実施例３４）
抗原エピトープ抗体の精製
精製抗原ペプチドを、末端ビオチン標識で合成する。ビオチン標識ペプチドを、１ｍｇ／ｍｌ濃度でＡｖｉｄｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）に固定化する。ワクチン接種した鶏由来の中和抗血清を、飽和濃度で添加し、非特異的結合タンパク質を、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で洗浄して除去した。特異的抗体は、Ａｃｔｉｓｅｐ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）で溶出する。
【０１９７】
本発明の利点
本発明は、例えば、免疫応答を誘導する、防御免疫応答を誘発する、又は寛容性を誘発するなどの目的に合わせることのできる、改善された免疫調節組成物及び方法を提供する。これらの組成物は、安定であり、免疫応答に所望の効果をもたらすため、幅広い免疫原及び標的分子により調製することができる。これら組成物は、このような物質の非経口投与の追加となる投与経路を提供する。これらは、免疫原及び標的分子の時期尚早の分解又は放出を防止する。粒子は、粒子と粘膜との相互作用を改善し、取り込みを促すことができる固有の粘膜接着特性を有する。これらは、追加のアジュバントを必要としない。
【０１９８】
本発明による方法及び組成物は、ワクチンとして使用することを意図した組成物から適当な回避エピトープを排除して免疫回避の発生を防ぐために、免疫回避におけるＮ−グリコサミノグリカン（マンノシル化）の役割を利用する。これらはまた、グリコサミノグリカン／ヘパリンの直鎖結合モチーフの同定、及びこのような結合を干渉する方法も利用する。本発明による方法及び組成物は、さらに、補体活性化エピトープを同定するために開発された方法を使用する。さらに、本発明による方法及び組成物は、幾つかのＴＬＲアゴニストの使用は、免疫応答を大幅に増強するという発見を利用する。抗原及びＴＬＲアゴニストはみな、粘膜リンパ系の単一細胞を標的にすることができる。本発明の別の改善された態様は、単一粒子における合成Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの使用である。
【０１９９】
本明細書に説明として記載された本発明は、本明細書に具体的には開示されていない、いずれの要素、限定を欠いた状態で、適切に実践することができる。故に、例えば、「含む、含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、広く、限定することなく読まれるべきである。さらに、本明細書で使用された用語及び表現は、限定用語ではなく、説明用語として使用されており、今後示される、及び記載されるいずれかの均等物、又はこのいずれかの部分を除外するような用語及び表現を使用するつもりはなく、本発明の請求の範囲内でさまざまな修正が可能であることがわかる。故に、本発明は、好ましい実施形態及び選択的機能により具体的に開示されているが、本明細書に開示されている本発明の修正及びバリエーションは、当業者により復元されることができること、このような修正及びバリエーションは、本明細書に開示されている本発明の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。本発明は、本明細書で幅広く及び一般的に記載された。一般的な公開の範囲内にあるより狭義の種及び亜属分類もそれぞれ、これらの発明の部分を形成する。これには、削除した物質が具体的にこの中に存在するか否かにかかわらず、いずれかの対象を前記属から除去するという消極的な限定を条件に、各発明の一般的な説明が含まれる。
【０２００】
さらに、ある発明の特徴又は態様が、マーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者であれば、したがって、この発明は、マーカッシュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれかに関して記載されていることがわかるであろう。上記の記載は、例示を意図したものであり、限定を意図したものではないことも理解されよう。上記の記載を検討する際、多くの実施形態が当業者には明白であろう。本発明の範囲はしたがって、上記の記載の参照により決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲、並びにこのような特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲を参照することにより決定されるべきである。特許公報を含め、あらゆる論文及び参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】本発明による微粒子担体組成物での使用に適したアガロース微粒子の粒子分布を示すグラフである（実施例１）。
【図２】ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）（白いバー）、又は細菌のＣｐＧ ＤＮＡ（ｂａｃｔＤＮＡ）（黒いバー）、又は単独で添加した場合と同じ濃度で両者を同時に添加（斜線バー）して処理した後の、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−α分泌（Ａ）又は組織因子の分泌（Ｂ）を示すグラフである。Ｐ及びＤに続く数字はそれぞれ、ＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示している。左から右に、これらはＰ３＋Ｄ１５、Ｐ３＋Ｄ５、Ｐ３＋Ｄ１．５、Ｐ１＋Ｄ１５、Ｐ１＋Ｄ５、Ｐ１＋Ｄ１．５、Ｐ０．３＋Ｄ１５、Ｐ０．３＋Ｄ５，及びＰ０．３＋Ｄ１．５である。
【図３】ＣｏｎＡにより露出された（Ｃｏｎ Ａ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）又は過ヨウ素酸ナトリウム処理された抗原のほか、さまざまな組合せのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、及びＴＬＲ９アゴニストにより、さまざまな方法で調製された粒子によるさまざまなＴｈ１及びＴｈ２応答の誘導を示すグラフである（グレーのバー、ＴＮＦ−αｘ１００、黒いバー、ＩＬ−１０）。
【図４】図３について、さまざまな方法で調製された粒子で処理された単球の、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１０比を示すグラフである。
【図５】微粒子製剤に曝露後の樹状細胞におけるＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６の誘導を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、防御免疫又は寛容性を誘導することができる免疫学的に活性な組成物を提供する。非感染及び感染宿主のいずれにおいても防御免疫を誘導する組成物は、抗原エピトープから成るが、免疫「回避」に関与する又は寛容性を誘導するエピトープを、除外又は排除する。防御免疫は、病原体関連分子パターン及び／又は、抗原エピトープを伴う若しくは伴わない担体を含む組成物によっても誘導することができる。寛容性を誘導する別の免疫学的に活性な組成物は、担体の有無にかかわらず、病原体回避（ｐｈａｔｏｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ）に重要なエスケープエピトープ又は分子パターンを含む。さらに、本発明は、このような免疫学的に活性な分子の同定方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学の進歩は、病原体を制御する先天性免疫応答及び適応免疫応答の誘導要件を含む、免疫モジュレーターの開発に不可欠な免疫因子を同定した。
【０００３】
広範な抗生物質耐性の出現に伴い、免疫モジュレーターは、細胞内病原体を含む微生物に対する長期防御を与える最も有効なアプローチとなりえる。免疫モジュレーターに対する現在の関心の中心は、新規ベクター、有効な担体、及びアジュバント系の開発を必要としている。
【０００４】
病原体は、Ｔｈ２応答及び寛容性も誘導することができるため、これを理解することは、自己免疫疾患、移植及びその他の医学的適用に関する免疫モジュレーターの開発に使用されることができる。ほとんどの病原体は、皮膚及び粘膜を介して生体に侵入する。したがって、これらの投与経路は、皮膚、気道、消化管、又は性器を介して侵入する感染に対する免疫調節に特によく適している。従来のワクチンは、実際の感染部位から離れて非経口的に投与され、これらの粘膜応答はあまり顕著ではない。
【０００５】
現在、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の他に、先天性免疫応答に重要な役割を果たす、他の受容体及び経路があることが明らかになっている。この一例が、細胞内微生物の微生物モチーフを認識するヌクレオチド−オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質である。細胞外マトリックスタンパク質であるミンジン（Ｍｉｎｄｉｎ）もまた、幾つかの細菌表面成分に対する炎症反応メディエーターである。これら及びその他の研究は、先天性免疫には、ＴＬＲシグナル伝達とは無関係の別の因子が関与していること、ＮＦκＢ又はＩＬ−１産生が、感染の制御に不十分である可能性があることを示唆している。
【０００６】
感染制御に関与する先天性免疫の典型要素は、以下の通りである。（１）炎症誘発性反応：ＮＦκＢの媒介、多くの炎症物質を活性化し、過剰刺激はショックをもたらすことができる、（２）カチオン性宿主防御ペプチド：細菌病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及びシグナル伝達分子により刺激されたペプチド産生の増加、（３）食細胞の活性化：好中球及びマクロファージにおける細胞内殺菌の増加（いずれも酸化及び非酸化機構が増大し、サイトカイン産生が増加）、（４）走化性：食細胞の内皮接着、感染部位への細胞移動、漏出の増加、（５）細胞外殺菌機構：補体の活性化、鉄キレート化の増大、抗微生物ペプチドの分泌、分解酵素の産生、（６）感染汚染：フィブリノーゲン活性化を介した血栓形成、（７）創傷修復：線維芽細胞の増殖及び接着、血管新生、並びに（８）適応免疫応答：Ｂ及びＴ細胞の活性化（樹状細胞を介すことが多い）。
【０００７】
先天性免疫の刺激は、インターフェロン、モノホスホリル脂質Ａ、イミキモド、ＣｐＧヌクレオチド又はカチオン性ペプチドの使用により実現することができる。しかし、先天性免疫は、感染を回避する能力に限界があり、このようなシナリオでは適応免疫応答がこれに取って代わる。
【０００８】
樹状細胞は、先天性免疫及び適応免疫を結びつけるのに不可欠であることが近年認識されており、この知識により、免疫学者は、免疫原性に乏しい抗原に対する免疫調節戦略をデザインすることが可能になった。樹状細胞（ＤＣ）は、骨髄系及びリンパ系両方の前駆体に由来するが、主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣは、あらゆる組織に存在し、感染期には、侵入病原体との接触を開始する主要な免疫細胞となる。これらは、先天性免疫応答及び適応免疫応答の間の架け橋である。
【０００９】
内皮及び上皮細胞、単球、マクロファージ及び未成熟ＤＣを含むその他の細胞は、病原体パターン認識受容体（ＴＬＲ受容体、レクチンドメイン受容体及びその他の受容体）を発現する。病原体パターン認識受容体は、グラム陰性菌由来のリポ多糖類、グラム陽性菌由来のリポテイコ酸、ペプチドグリカン、ペプチドグリカン関連リポタンパク質、細菌ＤＮＡ並びにグラム陰性菌及びグラム陽性菌由来のフラジェリンのほか、ウイルスＲＮＡなど、病原体により共有された病原体関連分子保存構造（略してＰＡＭＰ）を結合する。異なる細胞は、個々の病原体に適した反応を可能にする異なる受容体を発現する。活性化されると、未成熟な抗原捕捉ＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩ及びクラスＩの状況で抗原を提示することができる、成熟した抗原提示ＤＣへ分化するほか、表面のＣＤ８０及びＣＤ８６などの共刺激分子の発現をアップレギュレートする。
【００１０】
成熟し活性化されたＤＣは、二次リンパ器官（リンパ節、脾臓、パイエル板）へ移動し、そこでＴ細胞領域へ移動する。ＤＣのＴ細胞との相互作用及びＴ細胞刺激は、サイトカイン、ケモカイン、並びに細胞内接着分子（Ｉ−ＣＡＭ）、白血球機能関連分子１（ＬＦＡ−１）、及び樹状細胞特異的ＩＣＡＭグラビングノンインテグリン（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ）（ＤＣ−ＳＩＧＮ）などの接着分子に依存する。
【００１１】
局所サイトカイン環境及び抗原に応じて、細胞性Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ１）免疫応答及び体液性抗体媒介性Ｔｈ２又はＴｒｅｇ指向性免疫応答は、さまざまな程度に誘発される。抗原投与量は、Ｔｈ１／Ｔｈ２分化を方向づけることが明らかにされており、高用量は、Ｔｈ−１応答を、低用量はＴｈ−２応答を優先的に刺激する。抗原タンパク質を表示する担体装置及びＤＮＡワクチンは、未成熟樹状細胞により取り込まれ、免疫応答をもたらすことが明らかにされている。したがって、ＤＣは、免疫系調節開発の唯一の標的ではないものの主要な標的であることを意味する。
【００１２】
粘膜ＤＣは、具体的には、ピノサイトーシス及び受容体媒介性エンドサイトーシスの両方を介して、外からの侵入者を捕食することによる、防御の重要な最前線を提供する。ＤＣは、生体粘膜は、生体の内と外の間のバリアのような働きをするため、膜免疫における必須の役割を果たす。ＤＣは、気道及び腸の内膜に見出すことができる。ランゲルハンス細胞は、皮膚及び粘膜に見られるＤＣ集団である。ＤＣ及びＭ細胞は、抗原を腸の免疫誘導部位である下層のリンパ濾胞へ輸送する。類似の鼻及び気管支関連リンパ組織は、気道で説明されている。この系は、消化管において重要であるが、気道では、下層のＤＣネットワークが、より重要となりうる。
【００１３】
経口投与の場合、免疫モジュレーターは、胃及び上部の腸を未分解状態で通過しなければならない。このような分解は、鼻、眼又は生殖器投与経路では生じそうにない。続いて、免疫モジュレーターは、腸上皮を介して吸収されなければならない。こうして免疫モジュレーターは吸収され、続いて、抗原提示細胞により免疫担当細胞に提示されることができる。免疫担当細胞は、上皮、固有層又は基底膜の下に位置する。したがって、免疫モジュレーターの成分は、これらにこのバリアを通過させる担体により調製されなければならない。粒子担体と結合した場合、分子は、パイエル板のＭ細胞により、バリアを越えて輸送されることができる。
【００１４】
生物活性分子の早期の分解又は放出は、粒子ベースのワクチン及び薬剤送達技術の開発を妨げてきた。これは、公表されている文献においては、注入される対応物と同等の反応を得るのに高用量の抗原／薬剤が未だに必要とされる理由を説明するものと考えられる。抗原及び薬剤の活用の低さを別にすれば、その他の主な批判は、パイエル板（ＰＰ）におけるＭ細胞の粒子輸送能の低さ、ヒトにおいて誘導される免疫及びその他の応答の不十分さについて言及している。パイエル板の上皮Ｍ細胞は、特定の細菌、ウイルス及び原虫の腸からの輸送を可能にすることが知られている。幾つかの研究は、最大直径１０μｍのサイズ依存性取り込みは、Ｍ細胞、ＤＣ及びＣａｃｏ−２細胞により生じうることを示している。
【００１５】
Ｍ細胞並びにＰＰ及びＰＰ周辺に存在するさまざまなタイプの樹状細胞（ＤＣ）による、粒子の取り込みに関する近年の情報は、関与する機構の理解を可能にする。Ｂｅｙｅｒ（Ｂｅｙｅｒ Ｔら、「抗原送達装置としての細菌担体及びウイルス様粒子：抗原提示における樹状細胞の役割（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）」、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ−Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ、２００１年１、２８７〜３０２頁）はベーカー酵母細胞（サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のＰＰへの取り込み及び動態を追跡し、これを、粘膜を介した輸送の不活性モデルと仮定した。
【００１６】
さまざまなタイプの食菌、抗原プロセシングマクロファージ又は樹状細胞への輸送に匹敵する典型的な時間依存性が、Ｍ細胞、Ｍ細胞下の細胞内ポケット、及び基底膜下のスペースにおける酵母細胞の分布についても見られた。ＤＣが位置する場所に応じて、これらは、活性化時に、Ｔｈ１又はＴｈ２指向性サイトカインを産生するＰＰ微小環境において、異なる機能を有することがわかった。サイトカイン及びケモカインの微小環境は、次いで、Ｔｈ細胞のＴｈ１及びＴｈ２サブセットへの分化をそれぞれ決定し、同様にＴ細胞の生存又はアポトーシスに影響するであろう。
【００１７】
さらに、Ｂ細胞の分化及び粘膜形質細胞のホーミングは、別々のサイトカイン（ＴＧＦ−βに加えてＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０）及び特定のホーミング受容体、ａ４ｂ７により制御される。故に、粘膜には利用可能な機構が存在すると思われ、この機構により、免疫系の粘膜調節は、より分化された免疫応答を誘導でき、他の投与経路で得られるよりも自然感染に対する応答をより上手く模倣できると結論することができる。
【００１８】
これまで提案されてきたＤＣ、これらの前駆体及びさまざまなＤＣサブタイプについては、多くのことが知られているが、ＤＣの最大の機能的複雑性及び可塑性は、特定のワクチンが、ＤＣ、並びにこれに続くＴｈ１、Ｔｈ２及びＴｒｅｇ応答に与える影響についての予測を困難にする。しかし、成熟ＤＣに関しインビトロで得られた幾つかの結果は、これらが類似の特徴を示すことから、リンパ器官から単離された成熟ＤＣに外挿することができる（Ｓｈｏｒｔｍａｎ Ｋ．ら、「マウス及びヒトの樹状細胞サブタイプ（Ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ）」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年Ｍａｒ ２（３）：１５１−６１頁）。例えば、マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２の、ＤＣ応答の潜在調節能が、インビトロで研究されている（Ｗｅｉｇｔ Ｈ．ら、「合成マイコプラズマ由来リポペプチドＭＡＬＰ−２は樹状細胞の成熟及び機能を誘導する（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ＭＡＬＰ−２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３年、２０７（３）：２２３〜３３頁）。ＤＣのＭＡＬＰ−２処理は、ＣＤ８０、ＣＤ８６発現、並びに生物活性ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０の放出を誘導したほか、自己リンパ球増殖、並びに後者によるＩＬ−４、ＩＬ−５及びγ−ＩＮＦの産生を誘導した。これらの特徴は、Ｔ細胞を刺激する能力と相互作用するため、インビボにおいてＭＡＬＰ−２がＤＣに影響する可能性を示唆している。
【００１９】
合成担体は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩに関する抗原提示の免疫刺激効果を可能にすることができる。合成担体は、さまざまな応用可能性に合わせることができる、多目的システムに発展させることができる。これらの担体の特徴は、免疫応答の結果及び効率を大幅に左右することができる。粒子などの合成担体は、品質保証並びにワクチン開発及び生産の妥当性確認という障害を容易にし、故に承認及び市場に出すまでの時間を短縮することができる。
【００２０】
さまざまな感染性微生物の幾つかの免疫刺激成分（ペプチド、タンパク質、脂質又は多糖類）は、ワクチン接種に使用することができる。これらの成分は、微生物から合成、精製する、又は組換えＤＮＡ技術により生成することができる。しかし、これらは、遊離可溶型で経口又は非経口投与される場合、適切なアジュバントが必要となる。
【００２１】
幾つかの粒子ベース系が、さまざまな抗原及び薬剤の担体として試験されている。キトサン、ポリ−ＤＬ−乳酸、又はポリアクリルデンプン微粒子は、薬剤担体系としてこれまでに記載がある。このような系の例は、米国特許第５，６０３，９６０号及び第６，５２１，４３１号に記載されている。１つの報告では、モデル抗原である、共有結合されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を伴うデンプン微粒子は、非経口投与された場合、マウスにおける強力なアジュバントとして機能し、微粒子単独では免疫原性を示さないことが観察された。
【００２２】
しかし、取り込みは、担体の構造及び接着特性の可能性に最も依存すると考えられることも、指摘されるべきである。アガロース及びその他の多糖類は、異なる粘膜とのこれらの相互作用を改善し、取り込みを促進することができる、固有の粘膜接着特性を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明により、免疫学的に活性な組成物、又は防御免疫若しくは寛容性を誘導する組成物のための新規の組成物が説明される。非感染及び感染宿主のいずれにおいても防御免疫応答を誘導する組成物は、抗原エピトープから成るが、免疫「回避」に関与する又は寛容性を誘導するエピトープを、除外又は排除する。防御免疫は、病原体関連分子パターン及び／又は、抗原エピトープを伴う若しくは伴わない担体を含む組成物によっても誘導することができる。寛容性を誘導する別の免疫学的に活性な組成物は、担体の有無にかかわらず、病原体回避（ｐｈａｔｏｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ）に重要なエスケープエピトープ（ｅｓｃａｐｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）又は分子パターンを含む。さらに、本発明は、このような免疫学的に活性な分子の同定方法を提供する。適切な例は、修飾マイコプラズマ抗原が付着した又は付着していない、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）認識分子である。こうした分子組成物は、非感染及び感染宿主のいずれにおいても、抗マイコプラズマ免疫応答を調節するように思われる。抗原の幾つかは、寛容性又は免疫回避を誘導する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、本発明の１つの態様は、防御免疫を誘導する免疫学的に活性な組成物であり、
（１）少なくとも１つの病原体関連分子パターンと、
（２）場合により、少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
（３）組成物を生物に送達することにより防御免疫を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む組成物である。
【００２５】
多くの場合、少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープを含むことが望ましい。適切な例は、さらに以下で説明される。一般的に、少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープは、エスケープエピトープを持たない。これは、選択圧を防止する上で重要である。さもなければ、選択圧は、病原体の進化をもたらすことになり、病原体の複製は免疫応答では遮断されない。選択圧が重要であると思われる病原体の例は、急速に変異するインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスの変異はきわめて急速なため、ヒト疾患を引き起こしそうなインフルエンザの特定の株又は複数の株に対し免疫を提供するには、インフルエンザのシーズンごとに新規ワクチンを調製する必要がある。選択圧が重要であると思われる病原体の別の例は、やはり急速に変異するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【００２６】
本発明の別の態様は、寛容性を誘導する免疫学的に活性な組成物であり、
（ａ）少なくとも１種類の病原体関連分子パターンと、
（ｂ）少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
（ｃ）組成物を生物に送達することにより寛容性を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む組成物である。
【００２７】
典型的には、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド、タンパク質、組換えペプチド若しくはマルチペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物、核酸若しくはその他の生物活性分子、又はこれらのいずれかの組合せである。典型的には、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後調節を有する。典型的には、転写後調節は、炭水化物及び／又は脂質部分を含む。典型的には、転写後調節は、末端マンノシル化を含む。この代替では、典型的には、免疫調節の末端マンノシル化物質が、免疫防御組成物から著減している。これらは、酸化ステップにより、酵素処理により、又は糖特異的親和性結合により、著減することができる。或いは、転写後調節は、脂質部分を含み、前記脂質部分は、脱脂により除去される。
【００２８】
典型的には、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後修飾を有さない。また、典型的には、免疫活性ペプチド又はタンパク質は、Ｎ−グリコシル化及び／又はリポイル化が可能なアミノ酸配列を有さない。別の好ましい代替では、免疫活性な抗原エピトープは、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、細胞表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を結合可能なアミノ酸配列を有する。典型的には、これらのアミノ酸配列は、本来多塩基性であり、一般式ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＢＸＢ、ＢＢＢ、ＢＸＢＸＸＸＢＸＢ、又はＢＸＢＸＸＸＸＸＢＸＢを有し、ここで、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘはいずれか他のアミノ酸である。典型的には、ＧＡＧ結合アミノ酸配列は、病原体が細胞表面に結合するのを干渉可能なペプチド又はタンパク質に対する抗体を産生するのに使用される。ＧＡＧは、ヘパリン及びこの類似体からなる群から選択される。免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質は、単独又は抗体と併用して、補体活性化活性を有することができる。免疫活性な抗原エピトープは、単一のマルチペプチドに合体される複数のペプチドであることができる。免疫活性な抗原エピトープは、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの両方を含むことができる。
【００２９】
典型的には、病原体関連分子パターンは、
（１）ＴＬＲ１受容体アゴニストと、
（２）ＴＬＲ２受容体アゴニストと、
（３）ＴＬＲ３受容体アゴニストと、
（４）ＴＬＲ４受容体アゴニストと、
（５）ＴＬＲ５受容体アゴニストと、
（６）ＴＬＲ６受容体アゴニストと、
（７）ＴＬＲ７受容体アゴニストと、
（８）ＴＬＲ８受容体アゴニストと、
（９）ＴＬＲ９受容体アゴニストと、
（１０）ＮＯＤ−１アゴニストと、
（１１）ＮＯＤ−２アゴニストと、
（１２）ＤＣ−ＳＩＧＮと、
（１３）Ｌ−ＳＩＧＮと、
（１４）マンノース受容体と
からなる群から選択される。
【００３０】
病原体関連分子パターンは、ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストである場合、前記ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストは、細菌のペプチドグリカン及び細菌のペプチドグリカン誘導体からなる群から選択することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉することが可能な免疫活性エピトープを同定する方法であり、
（１）ヘパリン吸着を行うステップと、
（２）免疫親和性選択を行うステップと、
（３）場合により、免疫活性ペプチドを生成するため、免疫親和性選択により単離された１種類のタンパク質又は複数のタンパク質のタンパク質分解を行うステップと
を含む。免疫親和性選択は、当技術分野でよく知られた方法、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、「固定化親和性リガンド技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、１９９２年）に記載された方法により行うことができるが、他の方法もまた、当技術分野において既知である。
【００３２】
本発明のなお別の態様は、直鎖多塩基モチーフを用いるバイオインフォマティクス解析法により配列データを解析することを含む、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉可能な免疫活性ペプチドの同定方法である。
【００３３】
本発明のいっそう別の態様は、免疫活性ペプチドを活性化する補体を同定する方法であり、
（１）補体結合抗体の補体タンパク質への結合を行うステップと、
（２）タンパク質抗原の免疫親和性選択に前記抗体を使用するステップと、
（３）場合により、単離されたタンパク質抗原のタンパク質分解を行うステップと
を含む。
【００３４】
これらの方法により生成される免疫活性ペプチドも、本発明の態様である。さらに、防御抗体は、宿主生物における疾患を克服するための、同定された免疫活性ペプチドに基づくことができる。
【００３５】
上述の組成物では、分子は、混合物として存在することができる。或いは、分子は、化学的に結合することができる。担体は、典型的には微粒子である。好ましくは、微粒子は、狭いサイズ分布範囲を有し、多孔性である。典型的には、微粒子は、直径約１０μｍ未満であり、より典型的には、微粒子は、直径約５μｍ未満である。典型的には、微粒子は、生体高分子でできている。１つの代替では、免疫活性な抗原エピトープは、微粒子に非共有結合している。別の代替では、免疫活性な抗原エピトープは、微粒子に共有結合している。１つを超える免疫活性名抗原エピトープ及び１つを超えるパターン認識受容体アゴニストは、微粒子と結合していることができる。１つを超えるパターン認識受容体アゴニストは、微粒子と結合していることができる。
【００３６】
本発明の別の態様は、対象における免疫応答の誘発方法であり、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。組成物は、１つを超える病原体認識受容体アゴニストを含むことができる。
【００３７】
本発明のなお別の態様は、対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であり、微粒子と結合している少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。
【００３８】
本発明のいっそう別の態様は、対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であり、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。
【００３９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であり、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答は、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答又は両方の組合せを含む。
【００４０】
本発明のなお別の態様は、少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であり、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープ（免疫学的回避機構に関与する抗原を除く）と、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある。
【００４１】
本発明による投与又は送達方法では、組成物の投与は、粘膜経路、非経口経路、又は皮膚経路を介して起こることができる。或いは、他の投与経路を使用することができる。
【００４２】
本発明による免疫を誘導する方法では、典型的には、免疫応答は、病原性微生物におけるグリコサミノグリカン結合要素を干渉する。
【００４３】
或いは、本発明による組成物は、免疫学的寛容性を誘発する方法に使用することができる。免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発する方法は、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲＲアゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子は、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答は、免疫機能又は免疫回避の調節応答又は下方制御を誘導することを含む。組成物は、脂質含有部分を有する免疫活性な抗原エピトープを中に含むことができる。免疫学的に活性な脂質含有部分は、免疫活性な抗原エピトープとは独立に微粒子に結合することができる。免疫学的に活性な脂質含有部分は、炭水化物成分を有することができる。炭水化物成分は、Ｎ−グリコシル化の結果でありうる。免疫活性な抗原エピトープは、アスパラギン、スレオニン及びセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むモチーフを含み、前記モチーフは、Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｐ−Ｘ−Ｔｈｒモチーフであり、ここで、Ｘは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸でありうる。
【００４４】
以下の発明は、明細書、添付の特許請求の範囲、及び添付図面を参照することで理解が深まるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、免疫学的に活性な組成物、特定の細胞集団に対する分子を標的し、動物モデルにおける応答を誘発する方法、及び対象組成物を生成する方法を説明する。
【００４６】
幾つかの疾患又は症状のため、及びワクチンが現在利用不可能であるか又は効果がない病原体から防御するため、より効果的な免疫モジュレーター及び送達賦形剤を作製する必要がある。
【００４７】
弱毒化され、死滅され、又は遺伝子組み換えされた病原体を用いる従来型のワクチンは、病原体の分子パターン、及びこれと、免疫系の病原体認識受容体（ＰＲＲ）との相互作用が決定する免疫応答に限定される。慢性感染を定着することができる成功した病原体は、生体の免疫応答を回避させる分子パターンを有するのに対し、インフルエンザウイルスなどの他の病原体は、自らを維持するため、ウイルス取り込みの増加をもたらす抗体の産生など、結果として回避を生じる変異（抗原不連続変異及び連続変異）を用いる。
【００４８】
一般に、病原体特異的抗体は、幾つかの方法で感染制御に重要な役割を果たす。しかし、幾つかの例では、特異的抗原の存在は、病原体にとって有益となりうる。この活性は、感染の抗体依存性感染増強現象（ＡＤＥ）として知られる。感染のＡＤＥは、病原体特異的抗体が、病原体の、Ｆｃ受容体との相互作用を介した単球／マクロファージ及び顆粒球細胞への侵入（時として、ウイルスなどの病原体の複製）を増強する現象である。この現象は、公衆衛生及び動物衛生において重要な、多数の科及び属を代表する病原体について、インビトロ及びインビボで報告されている。Ｍ．ガリセプティカムなどのこれらの病原体は、マクロファージにおける選択的複製、持続を確立する能力、及び抗原多様性など、幾つかの共通する特徴を共有する。
【００４９】
幾つかの病原体では、感染のＡＤＥは、ワクチン接種による疾患制御にとって大きな関心事項となっている。その結果、ＡＤＥを最小限化した、又はＡＤＥのリスクのないワクチン開発に対する多くのアプローチが行われている。ＡＤＥ又は中和に関連した病原体エピトープの同定は、この目的にとって重要である。さらに、ＡＤＥを介した病原体侵入後の細胞事象を明確に理解することが、効率的な介入法を開発する上で不可欠となっている。しかし、ＡＤＥのメカニズムは、依然としてよく理解されていない。したがって、これらの病原体に対する有効なワクチンを開発することは困難である。したがって、本発明者らは、重要な細胞接着機構の干渉により防御免疫に重要であるモチーフを同定し、回避のない防御免疫を誘導するため、製剤から除外する必要のあるモチーフを同定した。本発明者らは、回避又は寛容性を誘導するモチーフも同定した。
【００５０】
本発明者らは、特定の細胞に対する免疫学的に活性な分子を、天然アガロースなどの多糖類からなる担体で標的し、その結果、先天性及び適応免疫応答、並びに感染からの防御の両方を免疫調節する可能性を調べた。本発明は、他の受容体も同様に他の粒子により標的することができる他の適用において、使用できることは明らかである。アガロースは、天然の多糖類であり、生分解性の、哺乳類細胞に適合することが証明されたＤ−ガラクトースポリマーであるという利点を有する。非経口投与されたアガロース微粒子は、弱いマクロファージ活性能、及び水酸化アルミニウムと同等のアジュバント特性を示すことが見出されている（Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ．ら、「炭水化物ベースの粒子：アレルゲン特異的免疫療法のための新規アジュバント（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ ｎｅｗ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２年１０７、５２３〜５２９頁）。
【００５１】
エンドユーザーの観点から、ワクチン製品は、冷蔵貯蔵を必要とせず、さらに有効期限が長いことが重要である。アガロース粒子は、これらの要件を満足することができる。また、ワクチン又は薬剤送達賦形剤の投与は、できるだけ簡単であることが重要である。これが、ニードルフリーの、粘膜的に、特に経口的に投与可能な組成物が、非経口投与に比べて有利な理由である。しかし、経口適用は、消化系の作用による安定性の問題を抱えている。
【００５２】
本発明者らは、多孔性アガロースマトリックスと結合した抗原は、ＧＩ管内の分解から保護されることができると考えた。リガンド及び粒子の間の結合は、同じ抗原プロセシング細胞が、アジュバント及び抗原を取り込むのを確実にする。また、アガロース微粒子のサイズ（＜５μｍ）は、粒子をパイエル板（ＰＰ）に到達させるのに適したものにすることができる。
【００５３】
アジュバントとしての非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ又はＭＡＬＰ−２の有効性は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）モチーフが、抗原と共固定化された場合、免疫学的に活性な組成物の粘膜表面における取り込みを、適切なＰＡＭＰ受容体を発現するさまざまなＡＰＣにより、標的にするであろうことを示唆する。
【００５４】
さまざまなＤＣサブセット及びその他の免疫成分細胞は、異なるパターン認識受容体を有する。リガンドの組合せにより、細胞の適切なサブセットの標的化を実現することができる。
【００５５】
したがって、本発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、レクチン受容体又はＮＯＤ受容体アゴニストなどの受容体アゴニスト（ＰＡＭＰ受容体）分子は、生物活性分子と共に担体に共固定化されるべきであると考えた。本発明者らは、免疫学的に活性な組成物の接着特性、標的化及び取り込みは、免疫系が、デザインされた「合成微生物」に曝露されるため改善されることができ、これにより、こうした免疫モジュレーターの、標的化された取り込み及び有効性は大幅に高まり、目的に合った免疫応答を得ることができると考えた。目的に合った標的化は、薬物動態を改善し、このようなデザインされた免疫モジュレーターが引き起こす可能性のある副作用を減少することもできるであろう。
【００５６】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びＮＯＤ、レクチン受容体等は、微生物由来分子に対する病原体パターン認識受容体である。これらは、先天性及び適応免疫系の一次センサーである。１０種類のＴＬＲ（ＴＬＲ１〜１０）が、現在同定されている。各々は、１つ又は複数の特異的リガンドを認識し、シグナル伝達を行う。新たに発見された受容体及び受容体相互作用は、細菌産物による細胞活性化に関与することが定期的に見出されている。これら受容体間の連携は、リガンド識別及び反応特異性を精緻化する役目を果たすようになるという証拠が集まっている。脂質ラフトにおける受容体のクラスタリングも、リガンド結合後に見出されている。こうした研究は、骨髄分化の一次応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）依存性及び非依存性経路も明らかにした。
【００５７】
各ＴＬＲは、細胞外ロイシンリッチ領域、及びＴｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒホモロジー（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる保護領域を含有する細胞内タンパク質を有し、活性化されると、ＭｙＤ８８依存型のシグナル伝達においてＭｙＤ８８タンパク質の動員をもたらす、タイプＩ膜貫通受容体である。一部の微生物病原体は、例えば、細胞内グラム陽性菌ペプチドグリカン検出の場合のように、ＴＬＲ、ＮＯＤ−１及びＮＯＤ−２のロイシンリッチ領域により、形質細胞に直接取り込まれ、活性を発揮することもできる。しかし、これらのさまざまな経路は、ＮＦ−кβの核転座及び炎症遺伝子の活性化及び異なるサイトカインの産生に収斂するように思われる。ＴＬＲ７、８及び９のライゲーションは、ＩＦＮ−α及びＩＬ−１２ｐ７０をもたらし、交差提示／ＣＴＬにより強力なＴｈ１応答を誘発する。ＴＬＲ３の活性化は、ＩＦＮ−α及びＴｈ１応答をもたらす一方、ＴＬＲ５は、ＩＬ−１２ｐ７０を介してＴｈ１を誘導し、ＴＬＲ４は、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮ−α産生を介してＴｈ１を誘導し、全てが交差提示／ＣＴＬに至る。しかし、ＴＬＲ１、２及び６のライゲーションは、高いＩＬ−１０レベルにより弱いＩＬ−１２ｐ７０応答を誘導し、ＤＣ−ＳＩＧＮなど、幾つかの他のＰＲＲ（病原体認識受容体）と共にＴｈ０／Ｔｈ２／ＴＲｅｇ応答をもたらす。
【００５８】
ＴＬＲ−４は、この受容体ファミリーのうち、最も幅広く研究されている。ＴＬＲ−４が、グラム陰性菌由来の多糖類及びグラム陽性菌由来のリポテイコ酸を認識するのに対し、ＴＬＲ−２は、細菌のリポタンパク質／リポペプチド、マイコバクテリア又はマイコプラズマの成分を結合することが知られている。
【００５９】
Ｌｐｓ２変異は、ＴＬＲ−３及びＴＬＲ−４ ＭｙＤ８８依存性経路におけるＴＩＲ耐性アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）の役割を同定した。ＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−４の下流における別の細胞内プレーヤーであることが発見されている。ＭｙＤ８８依存性経路は、ＤＣのＬＰＳ媒介性成熟の制御に関与することも示された。ＴＬＲ−１及びＴＬＲ−６は、ＴＬＲ−２受容体を伴うヘテロダイマーの他の部分として機能することが知られている。
【００６０】
ＴＬＲ−３は、ウイルス二本鎖ＲＮＡを認識する。ＴＬＲ−５は、グラム陰性及び陽性菌由来のフラジェリンの受容体として同定され、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達された。ＴＬＲ−７は、一本鎖ＲＮＡ、並びにイミキモド、Ｒ−８４８、ブロピリミン及びロキソリビンなどの小さな合成免疫修飾物質に応答する。ＴＬＲ−９は、非メチル化細菌ＤＮＡを検出することが知られている。ＣｐＧ ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ワクチン開発のため、アジュバントとしての作用能及びヒト樹状細胞の刺激能が現在調べられている。
【００６１】
ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７及びＴＬＲ−９は、ワクチン開発に関して特に重要である。ヒトＴＬＲ−８は、最近、一本鎖ＲＮＡ及びレシキモド（Ｒ−８４８）の受容体として同定された。ＴＬＲ−７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ−９は、最近、リガンドがエンドソーム／リソソーム区画において認識される、ＴＬＲ受容体ファミリーのサブグループと考えられることが提案されている。
【００６２】
Ｃ型（カルシウム依存性）レクチン受容体（ＣＬＲ）も発現されており、これらは、ウイルス、細菌及びその他の病原体の表面糖タンパク質において多く見られる保存オリゴ糖に結合する。ＤＣにより発現されるＣＬＲには、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、ＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）、ランゲリン（ＣＤ２０７）及びＤＣ特異的細胞間接着分子３−グラビングノンインテグリン（ＤＣ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ３−ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ）（ＤＣ−ＳＩＧＮ；ＣＤ２０９）がある。これらの受容体は、ＤＣ及び他の組織のさまざまなサブセットにおいて発現が異なるだけでなく、異なるオリゴ糖も認識するため、異なるリガンド間を識別する。
【００６３】
ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ、エボラウイルス、ＣＭＶ、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどの幾つかのウイルス、及びマイコバクテリアなどの細菌を結合し、インターナライズする、４４ｋＤａのタイプＩＩ膜貫通タンパク質であるが、他の受容体も関与している。他の病原体も、ＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用することができる。これは、ＩＣＡＭ−３を介した天然Ｔ細胞の相互作用を媒介する上でも、及びＤＣ特異的ＩＣＡＭ−２依存性移動プロセスを媒介するローリング受容体としても、ＤＣの機能においてきわめて重要である。
【００６４】
ＴＬＲ及び他の免疫認識受容体の間の連携は、これまでに説明されている。この一例は、デクチン−１及びＴＬＲ２による炎症反応の協同決定である。酵母細胞壁などの複雑な粒子は、ＴＬＲ２〜ＴＬＲ６、デクチン−１及びＣＤ１４を含む複数の先天性免疫受容体により認識される。ＴＬＲ２〜ＴＬＲ６へテロダイマーは、ＮＦ−кＢ並びにケモカイン及びＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生を活性化する。デクチン−１は、細胞壁のα−グルカンを認識し、食作用を引き起こすほか、ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼによる反応性酸素産生を活性化する。さらに、デクチン−１シグナリングは、ＴＬＲ２〜ＴＬＲ６シグナリングと合わさって、ＩＬ−１２などの特定のサイトカイン産生を増強する。
【００６５】
ＴＬＲ受容体間の、及び他の受容体との連携、並びに細胞内分子下流機構間の相互作用のため、リポテイコ酸、ＣｐＧ ＤＮＡ及びペプチドグリカンなどの微生物病原体化合物間の相乗効果を観察することは、驚くにはあたらず、ＴＬＲアクチベーターのアジュバントとしての効果は、免疫モジュレーターの開発に併用される場合、増幅されることができることを示唆している。
【００６６】
適切なＰＲＲ（病原体認識受容体）リガンドの、生物活性分子による共固定化は、免疫応答の標的調節を可能にすることができ、強力な細胞性応答（比較的強力なＴｈ１の影響下）及び／又は体液性応答（Ｔｈ２の影響下）をもたらすことになる。或いは、異なる組成物で免疫された場合は、免疫寛容性が得られる。
【００６７】
強力な細胞性応答は、確立された体液性免疫又は寛容性の存在下でも誘導されることは可能であろう。このように、本発明者らは、非感染及び感染宿主のいずれにおいても、効率的な免疫モジュレーターの開発を期待することができる。このような結果は、ワクチン接種の使用を大いに高めるであろう。
【００６８】
本発明者らは、鶏をマイコプラズマに曝露する前にワクチン接種した場合、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染株に対して著しい防御が得られる鶏モデル系を確立した。さらに、特徴的な病理学的症状の好転も、感染前動物において観察されたことは、こうしたワクチンが感染した群れの治療に有効であることを示唆している。微生物のさまざまな株の抗生物質耐性が広まっていること、並びに抗生物質の家畜への予防的使用を認めることに対する一般市民及び規制当局の関心が高まっていることから、これは重要である。さらに、本発明者らは、この方法で防御反応を誘発するには、１羽あたりごく少量の抗原（１０μｇ）しか必要とせず、抗原を組み込んだ微粒子を用いる、文献に記載された１００μｇ超とは対照的であることを見出した（Ｂｒａｙｄｅｎ，Ｄ．２００１年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４：１８３〜１８９頁）。これは、免疫モジュレーター分子が、鶏の腸を移動中も分解されず、標的化された粘膜免疫細胞へ効果的な形で送達されることを示唆する。これは、既存の免疫学的に活性な組成物に比べ著しい改善である。
【００６９】
しかし、抗原投与量の増加に伴い、防御効果の低下が観察されたことは、免疫親和性精製抗原の中に、免疫抑制成分が存在することを示唆する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、病原体の回避機構に関与している。ＤＣ−ＳＩＧＮは、脂質分子を含有する高マンノースに特異的なＣ型レクチンである。マイコプラズマ膜は、高率の脂質からなり、さまざまなマイコプラズマは、コンカナバリンＡ親和性樹脂を結合することが示されている。このことは、マイコプラズマ表面におけるマンノースの存在を示唆する。本発明者らは、末端マンノース部分を含有する精製タンパク質における転写後リポマンナン修飾を含む、転写後Ｎ−グリコシル化分子を含む免疫学的回避に関与する分子が、この作用を媒介している可能性があると仮定した。次いで、酵素分解又は化学分解による末端マンノースの除去が行われた。さらに、末端マンノシル化リポタンパク質が、マンノース特異的固定化レクチン−コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）カラムに吸着された。
【００７０】
ＣｏｎＡカラムは、精製抗原成分の約三分の一を保持し、この抗原により調製されたワクチンは、抗原濃度の上昇に伴い、最も高い防御効果及び線形の用量反応を示した。一方、ＣｏｎＡカラムから回収された抗原は、鶏において炎症反応の抑制を引き起こしたが、鶏の内臓には、きわめて高レベルの病原体の存在が認められた。これらＭ．ガリセプティカムのマンノシル化成分は、病原体の回避機構に関与し、結果的に免疫抑制及び病原体に対する寛容性の発現をもたらすと考えられる。本発明者らは、適正な抗原特性は、免疫応答を防御又は寛容性のどちらかへシフトさせるのを促すことができることも実証した。これは、本発明者らの仮説を裏付け、リポマンナン転写後修飾は、宿主における病原体寛容性を誘導することができるという、マイコプラズマ固定化膜で行われた観察も裏付けるものである。この理解は今や、寛容性の誘導可能性、又は既存の免疫応答の抑制可能性という特性を付与された免疫調節微粒子を調製するのに使用することができる。抗原の転写後脂質修飾も、病原体に対する寛容性の発現に役割を果たす。したがって、本発明者らは、有効であることが証明された精製抗原の脱アシル化も試み、マイコプラズマの病理学的機構における脂質の役割を確認した。
【００７１】
これらの実験から得られた主な結論は、天然タンパク質の分析から得られたエピトープワクチンは、防御免疫を実現しようとする場合、グリコシル化及び／又はリポイル化を受けることができるアミノ酸（Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）に富むエピトープを含有すべきではないが、これらのアミノ酸モチーフを組み込んだリガンドは、寛容性の誘導に使用されうる、というものである。このことは、本発明による組成物及び方法に多様な使い方をもたらす。
【００７２】
これに続く研究では、本発明者らは、防御に関与する抗原エピトープを同定するため、ワクチン接種され防御された動物由来の血液及び血清を使用した。このように、本発明者らは、大規模なマイコプラズマの生産及び抗原タンパク質の精製は、多くの適用で多大な費用が発生しうるため、エピトープベースのワクチンの科学的根拠を構築することに集中した。先の研究では、本発明者らは、さまざまなマイコプラズマが、ヘパリン及びヘパリンアナログと結合することができることを明らかにした（Ｓｚａｔｈｍａｒｙ，Ｓ．ら「マイコプラズマの固相吸着剤との結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ）」、Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ｈｕｎｇ、２００５年、５３（３）：２９９〜３０７頁）。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、哺乳類細胞表面で発現され、病原体表面のグリコサミノグリカン結合タンパク質は、標的細胞への接着を媒介する（Ｗａｄｓｔｒｏｍ Ｔ、Ｌｊｕｎｇｈ Ａ「組織接着及び侵入におけるグリコサミノグリカン結合微生物タンパク質：微生物病原性の重要事象（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ：ｋｅｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」、Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９９年、４８（３）：２２３〜２３３頁）。ある領域の大部分が塩基性アミノ酸であることを特徴とする、幾つかのタイプのコンセンサス配列が報告されている：ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＢＸＢ、ＢＢＢ、ＢＸＢＸＸＸＢＸＢ、又はＢＸＢＸＸＸＸＸＢＸＢ。ここで、Ｂは、塩基性アミノ酸であり、Ｘは、いずれか他のアミノ酸である。これに対する別の見方は、直鎖塩基モチーフが、病原体機構に関与しているというものである。これらの配列は、病原体による粘膜侵入機構の最初のステップとして恐らく機能する付着にとって不可欠である。したがって、この能力の中和は、感染を防止し、場合によっては、多様な病原微生物に対する広域スペクトル療法の開発を可能にすることができる。この可能性は、ワクチン開発の基盤として以前には認識されてこなかった。本発明者らは、ＧＡＧ結合ドメインに隣接する又は立体的に近接する抗原エピトープは、中和している可能性があり、こうした結合部位が、場合によっては、中和エピトープ内に組み込まれる可能性をもたらすと考えた。
【００７３】
したがって、本発明者らは、Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）における親和性クロマトグラフィーにより、Ｍ．ガリセプティカム由来のヘパリン結合タンパク質の単離を進めた。続いて、本発明者らは、Ｍ．ガリセプティカムに対するワクチンを接種した鶏から得られた中和血清から、ＩｇＧを精製した。精製ＩｇＧは、活性化樹脂のＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）に固定化され、単離されたヘパリン結合タンパク質は、カラムに吸着された。結合タンパク質は、トリプシンをカラムに添加して分解され、ヘパリン結合配列を含む免疫原性エピトープを含有するペプチド断片は、配列情報を得るため、溶出され、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析された。このようなエピトープに対するこのような抗原エピトープ又はモノクローナル抗体により精製されたＩｇＧは、インビボで投与された場合、感染宿主に防御免疫を与えることもできる。或いは、キモトリプシン、エラスターゼ、ブロメライン、Ｖ−８プロテアーゼ、ペプシン、及びサーモリシンなど、当技術分野で既知の他のタンパク質分解酵素を、トリプシンの代わりに使用することができる。
【００７４】
平行実験では、本発明者らは、分離されたヘパリン結合タンパク質を、Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌに再吸着し、結合タンパク質の同様のトリプシン消化を行った。樹脂から回収されたフラグメントも、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで配列情報が分析された。
【００７５】
補体系を利用する、オプソニン食作用に関与するエピトープの同定も重要である。具体的には、補体結合抗体は、固定化されたＣ１ｑカラムにおいて、ワクチン接種された鶏血清から精製され、こうした抗体は、こうした応答を誘導することができるエピトープの同定に使用される。精製ＩｇＧは、続いて固定化され、ＭＧ粗溶解物からタンパク質抗原を得るのに使用される。結合したタンパク質は、カラムにおいてプロテアーゼにより消化され、エピトープ配列が溶出され、配列情報を得るためＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析された。このような抗原エピトープ、又はこのようなエピトープに対するモノクローナル抗体を用いて精製されたＩｇＧは、インビボで投与された場合、感染宿主に防御免疫も与えることができる。
【００７６】
現行の幾つかの微生物ベースのワクチンに関する重要な問題は、免疫刺激エピトープ及び免疫抑制エピトープと、病原体自体に存在するＰＲＲアゴニストの混合物（このうち幾つかは、Ｔｈ１、幾つかのＴｈ２又はＴｒｅｇ応答を誘導する）との同時投与である。これらのワクチンは、宿主におけるさまざまな病原菌の持続を克服せず、これを臨床疾患のない「病原体工場」に変えることができる。このアプローチは、病原体に選択圧を加えることすらでき、より病原性の強い株の発生をもたらすことができる。反対に、本発明者らの戦略は、免疫応答からの病原体の回避に関与するエピトープ及び／又はＰＲＲアゴニストを除外する一方、適切な免疫応答特異的ＰＲＲアゴニスト分子と共に、まさに免疫刺激エピトープを含有する、人工的な「病原体模倣」微粒子の作製であった。同定されたエピトープは、スプライシング配列、又は特定の抗原エピトープペプチド間のリンカーを提示する単一のマルチペプチドに結合することもできる。このアプローチにより、持続性病原体が引き起こす間違った免疫応答は克服され、細胞性及び体液性応答のバランスの取れた混合が生まれ、病原菌の根絶につながる。回避エピトープ又はＰＲＲアゴニストは、望ましくない自己免疫応答を無効にするのに必要な場合、寛容性の発現に利用することができる。
【００７７】
典型的には、生物学的活性分子は、免疫刺激剤、免疫阻害剤、又は免疫学的寛容性を誘導する物質といった、免疫機能を調節する免疫原又は別の分子などの免疫系により、活性となる。
【００７８】
生物活性分子は、微粒子と非共有結合又は共有結合することができる。共有結合の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、「酵素イムノアッセイの実践と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム、１９８５年、ｐｐ．２８３〜２８９頁、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、「タンパク質結合と架橋結合の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン、フロリダ、１９９３年）、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（編）、「タンパク質機能：実践的アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９８９年）、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「バイオコンジュゲート法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６年）に記載されている。これらはみな、参照により本明細書に組み込まれている。典型的には、微粒子がアガロースの場合、生物活性分子は、アガロースのヒドロキシル基に付着する。一般に、多糖類のヒドロキシル残基は、続く求核置換に適した離脱基を含有する媒介反応性誘導体を形成する、特定の化合物により活性化することができる。アミン（例えば、タンパク質又はペプチドにおけるリシン基）などの求核試薬により活性化されたこれらのヒドロキシル基反応は、生物活性分子をアガロースに架橋する、安定な共有結合をもたらす。適切な試薬には、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸誘導体、塩化トレシル、塩化トシル、臭化シアン、ジビニルスルホン、塩化シアヌル、及びビスエポキシドがある。或いは、アガロースなどの炭水化物のヒドロキシル基は、クロロ酢酸で修飾してカルボン酸官能基を生成することができる。別の代替としては、アミン官能基は、多糖類において生成することができる。すなわち、炭水化物分子又は生成したアルデヒドの還元末端は、低鎖長（すなわち、典型的には、鎖中に約６炭素原子未満）のジアミン化合物と反応させて、続く抱合反応に使用することができる、短いアルキルアミンスペーサーを産生することができる。ヒドラジド基は、ビス−ヒドラジド化合物により同様に生成することができる。その結果得られる官能基は、次いで、さまざまな反応により生物活性分子と結合させることができる。例えば、カルボキシル基が生成される場合、これらは、次いで混合酸無水物法、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いるカルボジイミド法、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法により、タンパク質又はペプチドに結合させることができる。脂肪族アミンは、カルボジイミド、トリレン−２，４−ジイソシアナート、若しくはマレミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）化合物、特に、マレミド誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含め、さまざまな方法でタンパク質又はペプチドに結合することができる。このような化合物の例は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸である。別の例は、ｍ−マレイミドメンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。使用することのできるさらに別の試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩である。また、ジメチルピメリミデート、ジメチルアジピミデート、又はジメチルスベリミデートなどの二官能性エステルも、アミノ基含有部分をタンパク質と結合させることができる。ペプチド、タンパク質、及び炭水化物、並びに他の化合物を含む化合物の、固相担体に対する他の共有結合方法は、当技術分野で周知である。非共有結合の方法は、相互作用を安定化することができる水素結合、疎水結合、及び塩結合など、複数の非共有結合性相互作用に左右される。
【００７９】
典型的には、生物活性分子は、１つ又は複数のペプチド、タンパク質、組換えペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、糖タンパク質、又は糖脂質である。これらの組合せも、複数の生物活性分子が同じ微粒子と結合されるように使用することができる。
【００８０】
免疫活性分子がペプチド又はタンパク質の場合、免疫調節性転写後修飾を受けることができる。典型的には、これらは、糖及び／又は脂質部分を含む。例は、末端マンノシル化である。しかし、他の糖残基も、タンパク質又はペプチドに付加することができる。或いは、免疫活性分子は、免疫活性分子製剤が、実質的に末端マンノシル化分子において著減するような方法で分離することができる。この著減は、過ヨウ素酸塩などの酸化工程、典型的には加水分解酵素による酵素処理、又は糖特異的親和性結合、及び続く著減断片の精製により行うことができる。末端マンノシル化残基の他の著減方法も、当技術分野で周知である。
【００８１】
同様に、免疫活性分子は、免疫活性分子製剤が、実質的に免疫調節性転写後修飾部分を含有する脂質において著減するような方法で分離することができる。これは、化学的加水分解により、又はペンタデカン酸による共沈により行うことができる。或いは、免疫調節性転写後修飾部分を含有する脂質は、荷電界面活性剤により遮断することができる。特に適した界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムクロライドである。類似の第４級アンモニウム界面活性剤も、代わりに使用することができる。
【００８２】
場合により存在する標的分子は、典型的には病原体パターン認識分子である。１つの代替では、病原体パターン認識分子は、ＴＬＲ１受容体アゴニスト、ＴＬＲ２受容体アゴニスト、ＴＬＲ３受容体アゴニスト、ＴＬＲ４受容体アゴニスト、ＴＬＲ５受容体アゴニスト、ＴＬＲ６受容体アゴニスト、ＴＬＲ７受容体アゴニスト、ＴＬＲ８受容体アゴニスト、ＴＬＲ９受容体アゴニストなどのＴＬＲ受容体アゴニストである。別の代替では、病原体パターン認識分子は、ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストＮＯＤタンパク質アゴニストである。典型的には、ＮＯＤタンパク質アゴニストは、細菌のペプチドグリカン又は細菌のペプチドグリカン誘導体である。
【００８３】
免疫活性分子などの１つを超える生物活性分子、及び１つを超える病原体パターン認識分子は、存在する場合、組成物に組み込むことができ、安定に微粒子と結合していることができる。
【００８４】
本発明の別の態様は、上述した組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与して、対象における免疫応答を誘発する方法である。典型的には、組成物には、病原体パターン認識分子などの標的分子も含まれる。１つを超える免疫活性分子及び１つを超える病原体パターン認識分子を、組成物に組み込むことができる。
【００８５】
本発明のなお別の態様は、上述した組成物の有効な量を、活性した免疫系を有する生物に投与することを含む、免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法である。この場合もやはり、１つを超える免疫活性分子及び１つを超える病原体パターン認識分子を、組成物に組み込むことができる。免疫学的に活性な組成物のインビボでの送達は、粘膜表面、非経口経路、皮膚経路、又は皮下経路を介することができる。他の投与経路も使用することができる。
【００８６】
本発明のいっそう別の態様は、上述の通り、微粒子と安定に結合している、１つ又は複数の免疫学的に活性な分子（すなわち、免疫原）及びＴＬＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与して、対象における病原体に対する防御免疫応答を誘発することを含む、少なくとも１つの病原体に対する防御免疫を誘発する方法である。防御免疫応答は、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答又はＴｈ１及びＴｈ２応答の両方の組合せを含む。投与は、単回又は複数回により行うことができる。
【００８７】
本発明のなお別の態様は、微粒子と安定に結合している１つ又は複数の免疫学的に活性な分子（すなわち、免疫原）並びにＴＬＲ受容体アゴニスト及びＮＯＤタンパク質アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与して、対象における免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発することを含む、免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発する方法である。免疫学的に活性な分子は、免疫学的に活性な分子の残りの部分とは独立に微粒子に付着することができる、脂質含有部分を有することができる。或いは、免疫学的に活性な脂質含有部分は、さらに炭水化物基を含むことができる。
【００８８】
本発明による組成物の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある量）を決定するための、標準的な薬学的手順により細胞培養物又は実験動物において判定することができる。毒性及び治療効果間の用量比が、治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療指標を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒト又は他の動物で使用するさまざまな投与量を作成するのに使用することができる。このような組成物の投与量は、好ましくは、毒性の少ない、又は毒性のないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態、及び使用される投与経路に応じてこの範囲内で変わることができる。
【００８９】
本発明による任意の組成物では、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に予測することができる。例えば、用量は、細胞培養で判定したＩＣ５０を含む血中血漿濃度範囲（すなわち、免疫系パラメータを測定する際、組成物の効果に関し半分の最大反応を実現する試験組成物の濃度）を得るために、動物モデルで作成することができる。こうした情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿レベルは、例えば、ＨＰＬＣにより測定することができる。
【００９０】
正確な製剤、投与経路及び投与量は、個々の医師により患者の状態を考慮して選択されることができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、１９７５年、第１章、１頁参照）。注意すべきは、担当医が、毒性又は臓器障害のため、どのように、いつ、投与を終了、中断、又は調節するかを知ろうとすることである。反対に、担当医は、臨床反応が適切でない場合、治療を高レベルまで調節する（毒性を除外しつつ）ことも知るであろう。目的とする障害管理における投与量の大きさは、治療する症状の重篤度及び投与経路により変わるであろう。症状の重篤度は、例えば、一部には、標準的な予後評価方法により評価することができる。さらに、用量及び恐らく投与頻度も、年齢、体重、及び個々の患者の反応により変わるであろう。上述したものと匹敵するプログラムは、獣医薬において使用することができる。
【００９１】
本発明の実践のため本明細書に記載された組成物を、全身投与に適した投与量で調製するための、薬学的に許容可能な担体の使用は、本発明の範囲内である。適正な担体の選択及び適当な製造実践により、本発明の組成物、特に、溶液として調製されたものは、静脈注射など、非経口投与することができる。組成物は、当技術分野でよく知られた薬学的に許容可能な担体を用いて、粘膜又は皮下投与に適した投与量に容易に調製することができる。
【００９２】
本発明は、以下の実施例により説明される。これらの実施例は、説明目的のためだけに含まれるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
微粒子の選択
１〜１０μｍ範囲のアガロース微粒子は、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（カールスバッド、ＣＡ）により生成され、Ｓａｔｕｒｎ ＤｉｇｉＳｉｚｅｒ ５２００（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ）により試験された。図１に示されたデータは、粒子分布が、７５％は５μｍ未満、２４％は５〜１０μｍ、１％は１０μｍ超であることを示している。
【００９４】
（実施例２）
マイコプラズマ・ガリセプティカム（ＭＧ）の培養
マイコプラズマ成長培地０．１ｍｌに、Ｍ．ガリセプティカム（Ｋ７８１Ｒ−１６Ｐ）の凍結乾燥形態を添加し、３７℃のインキュベーターの培地１．５ｍＬに入れた。マイコプラズマの増殖を、色の変化（ピンクからオレンジ又は黄色）により、又は寒天プレートにプレーティングしコロニーをチェックしてモニターした。大量（１０〜１５Ｌ）のマイコプラズマ培養物は、感染培養物を新鮮培地に移して成長させた。続いて、培養物を５５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清のＯＤ２８０が０．２未満になるまで、ＰＢＳによりペレットの洗浄を行った（５５００ｒｐｍで２０分間）。ペレットを、２０ｍＬのＰＢＳで再懸濁した。
【００９５】
（実施例３）
ＭＧ抗原精製のための免疫親和性カラムの製造
ステップ１：
抗Ｍ．ガリセプティカム鶏血清６４ｍｌに、脱イオン（ＤＩ）水１２８ｍＬをガラスビーカー中で添加した。溶液のｐＨを、氷酢酸で４．５に調節した。溶液を、急速に攪拌したが、飛沫又は発泡しないように注意した。ＣＡＰ−８沈殿溶液（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）を、１０分間勢いよく振盪した。続いて、ＣＡＰ−８沈殿溶液６４ｍｌを計り分け、１〜２分間の攪拌により形成されたボルテックスの側壁にゆっくり添加した。次いで、攪拌速度を、溶液を動かすだけの速さまで落とした。溶液を室温で３０分間攪拌し、次いで、適当な大きさにした遠心チューブに移し、沈殿物を５５００ｒｐｍで１５分間遠沈した。上清を容器にデカントし、ペレットを２０ｍＭの酢酸ナトリウム２０ｍＬ、ｐＨ４．８バッファで１回洗浄した。上清を、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【００９６】
ステップ２：
ＳＰ Ｔｈｒｕｐｕｔ Ｐｌｕｓカチオン交換樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）を、３ベッドボリュームの１Ｍ ＮａＯＨで１０分間懸濁し、次いで、ＤＩ水で中性になるまで洗浄した。続いて、１０ベッドボリュームの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で洗浄し、次いで、２０ベッドボリュームのＤＩ水で洗浄した。樹脂を、１５ベッドボリュームの２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８と平衡化し、２０ｍＭ 酢酸、ｐＨ４．８パッキングバッファを用いてカラムに充填した。ステップ１の上清を、３ｍＬ／分の流速でカラムに充填し、カラムを２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８バッファで洗浄した。フロースルー及び洗浄液を合わせた。２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８に対するＯＤ２８０を測定した。カラムを５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０バッファ、及び測定したＯＤ２８０溶離剤で溶出した。
【００９７】
ステップ３：
Ａｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤ活性化樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）２０ｍｌに、精製した抗Ｍ．ガリセプティカム鶏ＩｇＧ溶液を１０ｍｇ／ｍＬで添加し、続いて１０．５ｍＬの１Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＡＬＤ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）を添加した。懸濁液を、２０時間、２〜８℃で静かに混合し、続いてＤＩ水で大規模洗浄した。樹脂をＰＢＳ中に、ｐＨ７．０、２〜８℃で貯蔵した。
【００９８】
（実施例４）
ＭＧ抗原の精製
ステップ１：
洗浄したＭＧ濃縮物２０ｍｌに、０．２ｇのＭｅｇａ−１０界面活性剤を添加し、２０時間室温で混合した。２０時間のインキュベーション後、懸濁液に１ｍＬのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００も添加し、室温でさらに１時間混合を続けた。続いて、５，０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。上清をペレットから分離し、２００ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２を上清に添加した。ＭＧタンパク質溶液は、２〜８℃で５日間保管した。
【００９９】
ステップ２：
２０ｍＬベッドボリュームの抗ＭＧ鶏ＩｇＧ−Ａｃｔｉｇｅｌカラムを、５ベッドボリュームのＰＢＳ、ｐＨ７．２で流速３ｍＬ／分にて平衡化した。ＭＧタンパク質溶液を、カラムに８〜１５ｍＬ／分で充填した。フロースルーを別のボトルに回収した。カラムを、１０ベッドボリュームのＰＢＳ、ｐＨ７．２で流速８〜１５ｍＬ／分にて洗浄し、次いで、２０〜４０ｍＬの０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ２．５で同じ流速にて溶出した。溶出液のｐＨは、２ＭのＴｒｉｓで直ちに７．２に調整した。全抗原を吸着するため、この精製を、カラムのフロースルーにより少なくとも５回繰り返した。全溶出液を合わせて、粉糖により透析バッグで一晩、２〜８℃で濃縮した。濃縮液を、５ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して２〜８℃で一晩透析した。ブラッドフォードタンパク質分析を行い、血清アルブミンを基準として精製抗原の濃度を判定した。
【０１００】
（実施例５）
活性化アガロース微粒子
粒子を２つの異なる方法で活性化した。第一の活性化方法は、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（カールスバッド、ＣＡ）により、きわめて安定したリガンド結合を提供する市販の専用アルデヒドリンケージケミストリー（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて行われた。この化学反応の別の利点は、固定化の再現性の高さにある。この専用アルデヒドケミストリーは、さまざまなリガンドの連続固定化を可能にする。
【０１０１】
別の活性化は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化方法を用いて行った。簡単には、アガロース微粒子３０ｍＬに、３０ｍＬの２Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を添加し、氷槽で３〜５分間、混合せずに保管した。次いで、１．５ｇのＣＮＢｒを秤量し、９ｍＬのアセトニトリルで溶解した。直ぐに、ＣＮＢｒ溶液を樹脂混合物に添加し、氷槽で２分間勢いよく混合した。続いて、４，５００ｒｐｍ、２℃で５分間遠沈して、２０ベッドボリュームの氷水で洗浄した。
【０１０２】
（実施例６）
ＭＧ抗原と微粒子のカップリング
カップリング反応は、精製抗原のアミノ基及び微粒子のアルデヒド基又はＣＮＢｒ活性化基の間で起こる。アルデヒド活性化粒子を用いる場合、カップリングは、実施例３で記載したカップリング試薬、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより媒介された。抗原を、１０μｇ／０．２ｍＬ及び５０μｇ／０．２ｍＬ微粒子の濃度で固定化した。
【０１０３】
別のカップリング反応では、ＣＮＢｒ活性化微粒子を、同じ抗原濃度で以下のように使用した。１５ｍＬのＣＮＢｒ活性化微粒子に、精製ＭＧ抗原溶液をｐＨ８．０で添加した。溶液を２〜８℃で２０時間、静かに混合した。上清を遠心分離により分離し、樹脂を１０ベッドボリュームのＤＩ水で洗浄した。
結合樹脂は、ＬＡＬ水中で２〜８℃にて貯蔵した。ブラッドフォードタンパク質分析を用いて上清の非結合タンパク質を測定した。
【０１０４】
（実施例７）
マイコプラズマ膜の調製及びカップリング
濃縮マイコプラズマ抗原３．０ｍＬに、８０ｍＬの加圧滅菌ＤＩ水を添加し、攪拌棒で３７℃にて１時間混合した。溶液を、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ペレットを、加圧滅菌水で２回洗浄した。ペレットを、１０ｍＬのＰＢＳでもどした。１．５ｍＬのＣＮＢｒ活性化微粒子に、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８で１：３に希釈した０．５ｍＬの精製ペレットを添加した。溶液を、２〜８℃で２０時間、静かに混合した。上清を遠心分離により分離し、樹脂を１０ベッドボリュームのＤＩ水で洗浄した。結合樹脂は、ＬＡＬ水中で２〜８℃にて貯蔵した。ブラッドフォードタンパク質分析を用いて上清の非結合タンパク質を測定した。
【０１０５】
（実施例８）
ＮＯＤ１受容体活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるペプチドグリカン（ＰＧ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中で溶解し、実施例６により調製したＣＮＢｒ活性化微粒子に添加した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０６】
（実施例９）
ＴＬＲ３活性剤と微粒子のカップリング
１０μｇ／０．２ｍＬビーズにおけるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを、実施例６により、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にてＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０７】
（実施例１０）
ＴＬＲ４活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂における細菌のリポ多糖類を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０８】
（実施例１１）
ＴＬＲ５活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるフラジェリンを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１０９】
（実施例１２）
ＴＬＲ１及びＴＬＲ６活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるマイコプラズマＭＡＬＰ−２含有表面抗原を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１０】
（実施例１３）
ＴＬＲ７／ＴＬＲ８活性剤と微粒子のカップリング
２μｇ／０．２ｍＬ樹脂における一本鎖ＲＮＡ又は抗ウイルス性イミダゾキノリンイミキモド（Ａｌｄａｒａ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によりＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１１】
（実施例１４）
ＴＬＲ９活性剤と微粒子のカップリング
１０μｇ／０．２ｍＬ樹脂におけるＣｐＧ ＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて溶解し、実施例６によるＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１２】
（実施例１５）
組合せＰＡＭＰ認識受容体アゴニスト分子組成物の微粒子への固定化
ＮＯＤ１アゴニスト並びにＴＬＲアゴニスト４及び９を、それぞれ２μｇ／０．２ｍＬ樹脂、１０μｇ／０．２ｍＬ樹脂及び２μｇ／０．２ｍＬ樹脂において、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて混合し、実施例６によるＣＮＢｒ活性化微粒子に固定化した。２〜８℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂はＬＡＬ用水で完全に洗浄し、同じＬＡＬ用水に２〜８℃で貯蔵した。
【０１１３】
（実施例１６）
組合せＰＡＭＰ認識受容体アゴニスト分子組成物を伴うＭＧ抗原の微粒子への固定化
ＭＧ抗原を、実施例６に記載の条件下で１時間結合させた。続いて、実施例１３に記載のＴＬＲアゴニスト混合物を添加し、２〜８℃で一晩反応が進むままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるＬＡＬ用水で完全に洗浄した。
【０１１４】
（実施例１７）
動物試験Ｉ
結果は、３つの実験の平均である。
【０１１５】
３日齢のヒヨコ（Ｍ．ガリセプティカム（ＭＧ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ）（ＭＳ）が認められず、ＥＬＩＳＡでＭＧ及びＭＳ母性抗体が検出されない）を、ワクチン接種した。各群を鶏１０羽とした。実験１４日目に、鶏をＭ．ガリセプティカムＲｌｏｗ株に曝露した。試験は、２８日目に終了した。
【０１１６】
各群は、以下のように設定した。
Ｇ１〜Ｇ５ 曝露前に微粒子ワクチン組成物により治療
Ｇ１＝微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療のみ、及び曝露
Ｇ２＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ３＝受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）及び受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、並びに曝露
Ｇ５＝Ｍ．ガリセプティカム膜（１０７／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療
Ｇ６〜Ｇ７ 曝露後に微粒子ワクチン組成物により治療
Ｇ６＝曝露、並びにＭ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）及び受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による曝露後の経口治療
Ｇ７＝曝露、及び受容体アゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による曝露後の経口治療
Ｇ８及びＧ９ 陽性及び陰性対照群
Ｇ８＝曝露及び未治療
Ｇ９＝非曝露及び未治療
【０１１７】
タイムライン
１日目：群Ｇ１〜Ｇ９を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの有無を確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの培養用に、鶏１０羽を屠殺した。
【０１１８】
０日目：曝露前にＧ１〜Ｇ５をワクチン接種
【０１１９】
１４日目：群Ｇ１〜Ｇ８の曝露
【０１２０】
１５日目：曝露後に群Ｇ６〜Ｇ７をワクチン接種
【０１２１】
２８日目：Ｇ１〜Ｇ９。特定の臓器（気管、気嚢及び肺）からＭ．ガリセプティカム（ＭＧ）を分離するための安楽死、剖検、及びプレーティング。気管及び肺の組織学的実験を行った。
【０１２２】
１４日目及び２８日目：血清平板凝集（ＳＰＡ）試験及びブロッキングＥＬＩＳＡによりＭＧ特異的抗体を試験するための血清を得るため、鶏を採血した。
【０１２３】
１日目、合計９０羽の、１日齢のブロイラー種鶏を、８群の１つに割り当てた（１０羽／群）。鶏の個体の体重を記録した。鶏は、各群の平均体重が著しく違わないように割り付けた。各鶏は、治療に応じて色付け及び番号付けしたウィングタグで識別し、然るべき形で体重を記録した。
【０１２４】
治療
０日目、Ｇ１〜Ｇ５の鶏を、異なるワクチン組成物（０．２ｍＬ／１ｍＬ ＰＢＳ／鶏）で治療した。用量は上記に記載されている。Ｇ６〜Ｇ７を、曝露後１５日目に治療した。
【０１２５】
曝露
１４日目、８群の鶏Ｇ１〜Ｇ８を、約８．０ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌのウイルス価で、Ｍ．ガリセプティカム毒性Ｒ株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物１０ｍｌを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を０．２２立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、１０ｍｌの新鮮なＭ．ガリセプティカムＲ株培養物を、１気圧下、約１００秒間スプレーし、鶏を２０分間曝露した。（実験室では、この方法により幾つかの実験で好成績が得られた）。
【０１２６】
安楽死及び病変
２８日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、ＭＧに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管：０＝浸出液なし、１＝わずかな発赤及び少量の浸出液、２＝粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢：０＝病変なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢、４＝多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜：０＝浸出液なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性−線維性浸出液
【０１２７】
ＭＧ分離
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天（ＭＡ）にプレーティングし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。２、４、及び７日目に、次いで、１週間間隔で最大３週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをＰＣＲで試験し、Ｍ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエを同定した。
【０１２８】
剖検
ＭＧ曝露に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、粒子プラス受容体アゴニスト（Ｇ３、Ｇ６ ｐ＜０．００１）、粒子プラス精製抗原（Ｇ２、ｐ＜０．００１）及び精製抗原プラス受容体アゴニスト（Ｇ４、Ｇ６ ｐ＜０．００１）で治療した群では、対照（Ｇ８）未治療、曝露群及び粒子のみによる治療群（Ｇ１）に比べて、病変スコアの大幅な低下が記録された。しかし、粒子プラス精製抗原又は粒子プラス精製抗原プラス受容体アゴニストでは、これらが曝露前に投与された場合、曝露後投与に比べて好成績が得られた。Ｇ５を、粒子に固定化したＭ．ガリセプティカム膜で治療した場合、幾つかのケースの病変は、曝露群自体より顕著であった。このことから、Ｍ．ガリセプティカム膜によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
【０１２９】
マイコプラズマの再分離
マイコプラズマは、非ワクチン接種の、感染した対照鶏の内臓から再分離されることができる。非ワクチン接種対照群（Ｇ８、ｐ＜０．０１）及び粒子のみによる治療群（Ｇ１、ｐ＜０．００１〜０．０１）又は粒子プラス受容体アゴニスト治療群（Ｇ３、Ｇ７ ｐ＜０．０５）と比べて、再分離率（呼吸器＋内臓からの）の著しい低下が、受容体アゴニストの有無にかかわらず、粒子プラス精製抗原治療群（Ｇ２、Ｇ４、Ｇ６）で認められた。しかし、粒子プラス受容体アゴニスト治療群（Ｇ３、Ｇ６）及び対照群（Ｇ８）の間には、再分離率の著しい低下（ｐ＜０．０５）があった。実験群の呼吸管（気管、肺、気嚢）又は他の内臓（肝臓、脾臓、腎臓及び心臓）からのマイコプラズマの再分離率を比較した場合、類似する結果が得られた。Ｇ５を、粒子に固定化したＭ．ガリセプティカム膜で治療した場合、幾つかのケースで臓器からのＭ．ガリセプティカムの再分離率は、曝露群自体よりも高かった。このことから、Ｍ．ガリセプティカム膜によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
【０１３０】
結果を表１に示す。
【表１】
【０１３１】
血清学的結果
各群の血清学的応答は、実験の最後に違いが見られた。非治療の、曝露群（Ｇ８）の応答は、粒子のみによる治療群（Ｇ１）と違わなかった。同時に、粒子のみによる治療群（Ｇ１）に比べ、有意に強い応答が、粒子プラス精製抗原及びＰＲＲアゴニスト治療群（Ｇ４）で見られた（ｐ＜０．０５）。粒子プラス精製抗原治療群（Ｇ２）に比べ、ＰＲＲを加えた場合（Ｇ４、Ｇ６）、有意に高い血清学的応答が見られた（ｐ＜０．０５）。抗原及びＰＲＲを伴う粒子を曝露前（Ｇ４）又は曝露後（Ｇ６）に使用した場合、血清学的結果の間に有意差は見られなかった。
【０１３２】
考察
Ｍ．ガリセプティカムは、気管、気嚢及び肺のコロニー形成を伴う著しい炎症を、気嚢及び腹膜で引き起こすことができる。マイコプラズマも、内臓からしばしば検出されうる。本発明者らは、異なるＰＲＲアゴニスト分子と共に共有結合で固定化された免疫親和性精製抗原を有する、微生物のサイズ範囲（＜５μｍ）の微粒子からなる、新しいタイプの「病原体模倣」免疫学的活性組成物を開発した。
【０１３３】
本発明者らの結果は、いかなる修飾も施さない粒子は、いかなる免疫応答も刺激しないことを示した。粒子単独では、Ｍ．ガリセプティカムによって引き起こされた腹膜炎及び気嚢炎から鶏を防御することも、マイコプラズマによる臓器のコロニー形成を防止することもなかった。
【０１３４】
粒子を、抗原を伴わないＰＲＲアゴニストで被膜した場合、マイコプラズマ曝露に対する血清学的応答が影響されることはなかった。しかし、マイコプラズマによる臓器のコロニー形成は減少し、病変スコアは低下した。これは、ＰＲＲアゴニストは、防御の増加をもたらす先天性免疫応答を刺激又は増大するという、本発明者らのインビトロでの観察を裏付けるものである。しかし、適用された免疫モジュレーターの量は、病原性の高い株による大量の曝露から鶏を十分に守ることができなかった。このことは、先天性免疫系についても知られているが、これは、先天性免疫系が一般に、大量の病原体を克服するには不十分なためである。しかし、データは、この新規な免疫モジュレーターは、鶏を少量の曝露から守る可能性があることを示している。
【０１３５】
精製抗原を、ＰＲＲアゴニストで被膜した粒子に添加した場合、マイコプラズマ特異的な血清学的応答を高めることができる。臓器のコロニー形成は、著しく減少し、病変スコアは低かった。この効果は、ワクチンを粘膜的に、及び曝露前に導入した場合、より顕著であったが、類似の好ましい効果は、ワクチンを曝露後に粘膜投与した場合も見られた。
【０１３６】
興味深い観察は、抗原濃度の上昇（最大５０μｇ／投与）は、実際にワクチンの防御効果を低下させる点であった。このことは、親和性精製抗原における免疫抑制成分の存在を示唆する。こうした成分を同定し、これらの影響を排除するため、新たな動物試験をデザインした（以下参照）。
【０１３７】
ワクチン接種後、曝露前に、ワクチン接種した鶏を毎日調べて、ワクチンの安全性を評価した。鶏は、臨床的に健康であることがわかり、ワクチンの副作用は示されなかった。鶏の飼料及び水の消費量は、非ワクチン接種群と比べて変わりなかった。試験の過程で剖検した鶏は、炎症徴候又は臓器サイズ／重量の変化が見られなかった。ワクチンは、安全であると思われる。
【０１３８】
（実施例１８）
親和性精製ＭＧ抗原を、先の実施例に記載されたように調製した。精製抗原を、固定化前に以下の処理のため３群に分けた。
【０１３９】
１．エンドグリコシダーゼＨ分解
抗原５３．６ｍｌ（約１．５ｍｇ）に、２．５単位の酵素を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、混合物を、冷却し固定化したマンナンカラム（５ｍＬ）に通過させ、フロースルーを回収した。この試料をＥｎｄｏＨ抗原と命名した。
【０１４０】
２．過ヨウ素酸塩処理
抗原５３．６ｍＬ（約１．５ｍｇ）に、固体過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度が１５ｍＭになるまで添加し、混合後１時間冷却した。２倍モル過剰でグリセリンを添加し、試料をさらに１時間インキュベートした。ＰＢＳに対し透析を一晩行った。透析した試料を過ヨウ素酸塩（ＰＪ）抗原と命名した。
【０１４１】
３．ＣｏｎＡ結合抗原の除去
精製抗原（５３．６ｍＬ中約１．５ｍｇ）を、２ｍＬ固定化ＣｏｎＡカラムに通過させた。フロースルーを回収した。この試料をＣｏｎＡフロースルーと命名した。結合抗原を、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ９．５中で１Ｍ アルファ−メチルマンノグルコシドにより溶出した。この試料をＣｏｎＡ溶出と命名した。
【０１４２】
抗原処理
抗原の特性を表２に示す。
【表２】
＊ＥｎｄｏＨ処理では、処理した抗原の初期量は、２．５１ｍｇであった。（この製剤５３．６ｍｌ、及び０．０２４６ｍｇ／ｍｌの先のＭ．ガリセプティカム製剤４０．３ｍｌ）
【０１４３】
（実施例１９）
動物試験ＩＩ
結果は、３つの実験の平均である。３日齢のヒヨコ（Ｍ．ガリセプティカム（ＭＧ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ）（ＭＳ）が認められず、ＥＬＩＳＡでＭＧ及びＭＳ母性抗体が検出されない）を、ワクチン接種した。各群を鶏１０羽とした。実験１４日目に、鶏をＭ．ガリセプティカムＲｌｏｗ株に曝露した。試験は、２８日目に終了した。
各群は、以下のように設定した。
Ｇ１＝非曝露及び未治療
Ｇ２＝曝露及び未治療
曝露前２週間に治療
Ｇ３＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（１０μｇ／投与）及びＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、並びに曝露
Ｇ４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製抗原（５０μｇ／投与）及びＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、並びに曝露
Ｇ５＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ６＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（１０μｇ）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ７＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原（１０μｇ）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ８＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ９＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（５０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１０＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１１＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（５０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１２＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１３＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原（５０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ１４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＥｎｄｏＨ分解抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）プラスアミノグアニジン（腹腔内）による７日間の経口治療、及び曝露
Ｇ１５＝ビーズ上のＭ．ガリセプティカム抗原ＣｏｎＡ溶出を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
【０１４４】
タイムライン
１日目：群Ｇ１〜Ｇ１５を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、及びマイコプラズマの有無を確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの培養用に、鶏１０羽を屠殺した。
【０１４５】
０日目：曝露前にＧ３〜Ｇ１４をワクチン接種
１４日目：群Ｇ２〜Ｇ１５の曝露
【０１４６】
２８日目：Ｇ１〜Ｇ１５。特定の臓器（気管、気嚢及び肺）からＭ．ガリセプティカム（ＭＧ）を分離するための安楽死、剖検、及びプレーティング。気管及び肺の組織学的実験を行った。
【０１４７】
１４日目及び２８日目：血清平板凝集（ＳＰＡ）試験及びブロッキングＥＬＩＳＡによりＭＧ特異的抗体を試験するための血清を得るため、鶏を採血した。
【０１４８】
１日目、合計１５０羽の、１日齢のブロイラー種鶏を、１５群の１つに割り当てた（１０羽／群）。鶏の個体の体重を記録した。鶏は、各群の平均体重が著しく違わないように割り付けた。各鶏は、治療に応じて色付け及び番号付けしたウィングタグで識別し、然るべき形で体重を記録した。
【０１４９】
曝露
１４日目、１４群の鶏Ｇ２〜Ｇ１５を、約８．０ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌのウイルス価で、Ｍ．ガリセプティカム毒性Ｒ株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物１０ｍｌを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を０．２２立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、１０ｍｌの新鮮なＭ．ガリセプティカムＲ株培養物を、１気圧下、約１００秒間スプレーし、鶏を２０分間曝露した。（実験室では、この方法により幾つかの実験で好成績が得られた）。
【０１５０】
安楽死及び病変
２８日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、ＭＧに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管：０＝浸出液なし、１＝わずかな発赤及び少量の浸出液、２＝粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢：０＝病変なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢壁、４＝多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜：０＝浸出液なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性−線維性浸出液
【０１５１】
結果
結果を表３に示す。
【表３】
【０１５２】
ＭＧ分離
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天（ＭＡ）にプレーティングし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。２、４、及び７日目に、次いで、１週間間隔で最大３週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをＰＣＲで試験し、Ｍ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエを同定した。
【０１５３】
剖検及び再分離
ＭＧ曝露後に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、精製抗原プラスＴＬＲでワクチン接種した群（このうち最も良好な群は、ＣｏｎＡカラム著減抗原（Ｇ９）であった）は、対照未治療、曝露群に比べて、病変スコア及び再分離率の大幅な低下が記録された。しかし、ＣｏｎＡ溶出抗原画分Ｇ１５では、病変スコアは高く、再分離率は陽性対照群と同じであった。このことから、このＭ．ガリセプティカム抗原画分によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
【０１５４】
考察
これらの実験の結果は、免疫抑制抗原の親和性精製抗原プールからの除去が、ワクチン組成物の防御効果を著しく改善したことを示している。さらに、抗原における転写後修飾を含有する糖の化学修飾又は酵素分解もまた、防御免疫の改善をもたらした。
【０１５５】
反対に、本発明者らは、分離した、微粒子に結合した免疫抑制抗原の投与は、免疫抑制及び、病原体に対する寛容性の発現をもたらすことも見出した。こうして、本発明者らは、適正な抗原特性は、免疫応答を防御又は寛容性のどちらかへシフトさせることができることを実証した。これらは両方とも、免疫応答を調節する合理的な方法を開発する上で重要な意味を持つ。続いて、本発明者らは、免疫応答の発現に関与する別の抗原表面決定基を標的にすることにした。
【０１５６】
（実施例２０）
親和性精製ＭＧ抗原を、先の実施例に記載されたように調製した。精製抗原を、固定化前に以下の処理のため３群に分けた。
【０１５７】
１．ＭＧ抗原脱アシル化
抗原２７ｍＬ（約０．６５ｍｇ）に、８ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ及び１０ｍｇのペンタデカン酸を添加し、溶液を、７０℃で４５分間静かに攪拌した。次いで、ｐＨを８．０に調節し、沈殿物を、３，０００ｒｍｐで５分間、遠心分離により除去した。この試料を脱アシル化抗原と命名した。
【０１５８】
２．過ヨウ素酸塩処理
これは、実施例１８よりストリンジェントな反応を意図したものである。抗原２５ｍＬ（約０．６ｍｇ）に、固体過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度が８０ｍＭになるまで添加し、混合後２．５時間、室温で保管した。次いで、２倍のモルアクセス（ｍｏｌａｒ ａｃｃｅｓｓ）でグリセリンを添加し、試料をさらに１時間インキュベートした。ＰＢＳに対し透析を一晩行った。透析した試料を過ヨウ素酸塩抗原と命名した。
【０１５９】
（実施例２１）
動物試験ＩＩＩ
結果は、３つの実験の平均である。３日齢のヒヨコ（Ｍ．ガリセプティカム（ＭＧ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．Ｓｙｎｏｖｉａｅ）（ＭＳ）が認められず、ＥＬＩＳＡでＭＧ及びＭＳ母性抗体が検出されない）を、ワクチン接種した。各群を鶏１０羽とした。実験１４日目に、鶏をＭ．ガリセプティカムＲｌｏｗ株に曝露した。試験は、２８日目に終了した。
【０１６０】
各群は、以下のように設定した。
Ｇ１＝非曝露及び未治療
Ｇ２＝曝露及び未治療
曝露前２週間に治療：
Ｇ３＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ／投与）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ４＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、脱アシル化抗原（１０μｇ／投与）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ細菌ＤＮＡ（大腸菌）＋２μｇ大腸菌ＬＰＳ及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ５＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（２５μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ＋２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
Ｇ６＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、過ヨウ素酸塩処理された脱アシル化抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（１０μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ、及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
曝露後１日目に治療：
Ｇ７＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製ＣｏｎＡ吸着抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（２５μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ、及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療
Ｇ８＝Ｍ．ガリセプティカム親和性精製、過ヨウ素酸塩処理された脱アシル化抗原（１０μｇ）＋ＴＬＲアゴニスト（２５μｇ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ＋１０μｇ細菌ＤＮＡ、及び２μｇペプチドグリカン／投与）を伴う微粒子（０．２ｍＬ／鶏）による経口治療、及び曝露
【０１６１】
タイムライン
１日目：群Ｇ１〜Ｇ９を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、及びマイコプラズマの有無を確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ、並びにＭ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエの培養用に、鶏１０羽を屠殺した。
【０１６２】
０日目：曝露前にＧ３〜Ｇ６をワクチン接種
【０１６３】
１４日目：群Ｇ２〜Ｇ９の曝露
【０１６４】
１５日目：曝露後に群Ｇ７〜Ｇ９をワクチン接種
【０１６５】
２８日目：Ｇ１〜Ｇ９。特定の臓器（気管、気嚢及び肺）からＭ．ガリセプティカム（ＭＧ）を分離するための安楽死、剖検、及びプレーティング。気管及び肺の組織学的実験を行った。
【０１６６】
１４日目及び２８日目：血清平板凝集（ＳＰＡ）試験及びブロッキングＥＬＩＳＡによりＭＧ特異的抗体を試験するための血清を得るため、鶏を採血した。
【０１６７】
１日目、合計９０羽の、１日齢のブロイラー種鶏を、９群の１つに割り当てた（１０羽／群）。鶏の個体の体重を記録した。鶏は、各群の平均体重が著しく違わないように割り付けた。各鶏は、治療に応じて色付け及び番号付けしたウィングタグで識別し、然るべき形で体重を記録した。
【０１６８】
曝露
１４日目、９群の鶏Ｇ２〜Ｇ９を、約８．０ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌのウイルス価で、Ｍ．ガリセプティカム毒性Ｒ株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物１０ｍｌを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を０．２２立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、１０ｍｌの新鮮なＭ．ガリセプティカムＲ株培養物を、１気圧下、約１００秒間スプレーし、鶏を２０分間曝露した。
【０１６９】
安楽死及び病変
２８日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、ＭＧに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管：０＝浸出液なし、１＝わずかな発赤及び少量の浸出液、２＝粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢：０＝病変なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢壁、４＝多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜：０＝浸出液なし、１＝漿液性浸出液、２＝フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、３＝漿液性−線維性浸出液
【０１７０】
結果
結果を表４に示す。
【表４】
【０１７１】
ＭＧ分離
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天（ＭＡ）にプレーティングし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。２、４、及び７日目に、次いで、１週間間隔で最大３週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをＰＣＲで試験し、Ｍ．ガリセプティカム及びＭ．シノビエを同定した。
【０１７２】
剖検及び再分離
ＭＧ曝露後に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、処理された精製抗原プラスＴＬＲ群でワクチン接種した群で、病変スコア及び再分離率の大幅な低下が記録され、全群は同程度の結果であり、対照未治療曝露群に比べ、脱アシル化抗原（Ｇ４）が最も良かった。感染後にワクチン接種した群では、ＣｏｎＡ処理抗原プラスＴＬＲ３、４、９が最も良い結果をもたらした。感染後であっても、この組成物により防御免疫を得ることは可能であるように思われる。
【０１７３】
考察
これらの実験の結果は、免疫抑制回避抗原又は抗原決定基の親和性精製抗原プールからの除去又は遮断が、ワクチン組成物の防御効果を著しく改善したことを示している。さらに、抗原における転写後修飾（Ｎ−グリコシル化）を含有する糖の除去及び化学修飾もまた、防御免疫の改善をもたらした。さらに、抗原の脂質部分が、化学的に除去され、又は遮断されたことも、著しい免疫防御効果につながった。
【０１７４】
本発明者らは、適正な抗原修飾により、免疫応答を防御へシフトさせることができることを再び実証した。これは、免疫応答を調節する合理的なアプローチを開発する上で、きわめて重要な意味を持つ。続いて、本発明者らは、個々の免疫応答を組織培養で再現するインビトロ系を設定した。こうした系は、免疫学的に活性な組成物により生じた免疫応答に関する予測値を有することができ、故に製品開発サイクルを短縮することができる。
【０１７５】
（実施例２２）
インビトロ試験
ＴＮＦ−α分泌を、末梢血から調製したＰＢＭＣで測定し、ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＩ）、細菌ＣｐＧ ＤＮＡ（ＫＭ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、オーロラ、ＯＨ；リムルス変形細胞溶解物アッセイ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｓｓａｙ）で測定したＬＰＳ＜０．２ＥＵ／ｍｌ）、又は両方により処理した。ＴＮＦ−αを、５時間のインキュベーション後、培養上清からＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７６】
先天性免疫系の代表である、単球の組織因子（ＴＦ）を、ＴＮＦ−α分析に使用される、対応するＰＭＢＣ培養物から評価した。ＴＦは、ＴＦ ＥＬＩＳＡ（Ｉｍｕｂｉｎｄキット、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、グリニッチ、ＣＴ）向けにメーカーにより推奨されたＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で接着細胞から抽出した。
【０１７７】
結果を図２に示す（Ｐ及びＤに続く数字はそれぞれ、ＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示している。左から右に、これらはＰ３＋Ｄ１５，Ｐ３＋Ｄ５、Ｐ３＋Ｄ１．５、Ｐ１＋Ｄ１５、Ｐ１＋Ｄ５、Ｐ１＋Ｄ１．５、Ｐ０．３＋Ｄ１５、Ｐ０．３＋Ｄ５，及びＰ０．３＋Ｄ１．５）。ＰｅｐＧ（白いバー）、又は細菌のＣｐＧ ＤＮＡ（黒いバー）、又は単独で添加した場合と同じ濃度で両者を同時に添加（斜線バー）して処理した後の、ＰＢＭＣ（Ａ）及び組織因子（Ｂ）により分泌されたＴＮＦ−α。Ｐ及びＤに続く数字はそれぞれ、ＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示している。試験した全濃度で、ＰｅｐＧ（３又は１．５μｇ／ｍＬ）及びＣｐＧ ＤＮＡの単独での効果の合計を比較した場合、並びにＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡを共に添加した場合、ＴＮＦ−α及びＴＦのｐ＜０．０５；スチューデントＴ検定（ｎ＝４）。これは、３つのうちの代表的な実験である。
【０１７８】
本結果は、ＰＢＭＣにおけるＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡによるＴＮＦ−α及びＴＦの同時誘導、並びに２つの分子間の相乗効果を示している。これには、共通の下流シグナル伝達経路に対する直接的影響、又はＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの作用後に分泌される化合物が媒介する間接的影響が関与していると考えられる。ＴＮＦ−αは、発熱物質に対する宿主反応の重要な初期メディエーターであり、敗血性ショックの代謝、血液動態、組織及びサイトカインカスケード反応の全領域を誘因することが可能な、唯一の内因性メディエーターである。ｂａｃｔＤＮＡ及びＰｅｐＧの相乗効果は、敗血症の病原体に影響する。ここでは、各分子は、インビボでの濃度は低いものの、先に仮定された通り、互いの効果を増幅するように思われる。
【０１７９】
さまざまなＴｈ１及びＴｈ２応答の、さまざまな粒子組成物によるインビトロでの誘導の実証
末梢血単核細胞を、健常なボランティアからの末梢血のフィコール分離により調製した。単核細胞を、１．５ｍｌ ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で１０６細胞／ｍｌの濃度でプレーティングし、１００ Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン及び３％ウシ胎仔血清を補充し、微粒子０．１５ｍＬ（滅菌ＰＢＳ中）と共に１８時間インキュベートした。微粒子は、ＣｏｎＡにより露出された（Ｃｏｎ Ａ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）又は過ヨウ素酸ナトリウム処理された抗原のほか、以下のグラフに示されたＴＬＲアゴニスト２、３、４及び９を含有した。ビーズの調製は、実施例１９に記載されている。
【０１８０】
結果を、図３（グレーのバー、ＴＮＦ−αｘ１００、黒いバー、ＩＬ−１０）及び図４に示す。ここでは、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１０の比が示されている。
【０１８１】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０比の分析は、ＴＬＲ２、４、８と共固定されたＣｏｎＡ著減抗原が、インビボでの結果との相関が見られる、最も顕著なＴｈ１応答をもたらすことを証明した（実施例１９参照）。この組成物は、動物におけるマイコプラズマ曝露に対する最も高い防御効果を一貫してもたらした。
【０１８２】
（実施例２３）
免疫モジュレーター微粒子に対する細胞性応答の特徴をさらに明らかにするため、本発明者らは、樹状細胞をこうした微粒子に曝露した。本発明者らは、ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ分子、並びに共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６のアップレギュレーションを観察した。どちらかのＰＲＲアゴニストの組合せが存在することは、処理１８時間後の樹状細胞表面におけるＭＨＣ ＩＩの増加を測定するのに必要と思われる。細胞表面のＭＨＣの存在は、動的過程であるため、細胞表面のＭＨＣ分子の増加を観察するには、ＣｏｎＡ Ａｇビーズでは異なるインキュベーション時間が必要となる可能性がある。ＭＨＣは、Ｔ細胞への抗原提示を可能にし、ＣＤ８６は、Ｔ細胞のＣＤ２８と相互作用する。樹状細胞による同時の抗原提示、及びＢ７共刺激リガンド（ＣＤ８０及びＣＤ８６など）相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらす。これらインビトロでのデータは、樹状細胞変異の顕著な特徴であり、先天性及び適応免疫の誘導を必要とする変化を、微粒子が誘導することを示している。
【０１８３】
樹状細胞表面におけるＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ並びにＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、さまざまな微粒子製剤に曝露後１８時間目に決定した：抗原又はＰＲＲアゴニストが固定化されなかった対照微粒子（対照）、及び以下のＰＲＲアゴニストの組合せの有無にかかわらず、ＣｏｎＡ結合抗原が著減したＭ．ガリセプティカム抗原が固定化された微粒子（ＣｏｎＡ Ａｇ）：１）ＰｅｐＧ、ＬＰＳ、細菌ＤＮＡ（ｂａｃｔＤＮＡ）（ＣｏｎＡ Ａｇ＋ＰＲＲ２、４、９）又は２）ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＬＰＳ、ｂａｃｔＤＮＡ（ＣｏｎＡ Ａｇ＋ＰＲＲ３、４、９）。樹状細胞におけるＭＨＣ ＩＩ及びＣＤ８６の誘導を、図５に示す。
【０１８４】
結果は、ＤＣによるＴＮＦ−α分泌に与える微粒子の影響を示している。対照微粒子は、馴化培地におけるＴＮＦ−αの検出可能な分泌を誘導しなかった。微粒子の他の３つのタイプ（ＣｏｎＡ結合抗原著減後のＭ．ガリセプティカム抗原、及びＰｅｐＧに共固定化された類似の抗原、ＬＰＳ、ｂａｃｔＤＮＡ及びｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）は、対照微粒子に比べてＤＣによる多量のＴＮＦ−αを誘導した。興味深いことに、免疫モジュレーターとしての細菌化合物の存在は、抗原単独に比べてＴＮＦ−αの発生は低かった。これらの結果は、微粒子がＤＣと相互作用しており、ＴＬＲ及びＮＯＤ受容体を活性化して、免疫系細胞におけるこれらの分子の既知の効果に応じて生理反応を発生することができることを示している。本発明者らは、微粒子がＤＣを標的にすることができることを実証した。
【０１８５】
（実施例２４）
ヘパリン結合タンパク質のＭＧからの精製
Ｍ．ガリセプティカムを、実施例２に記載の通りに成長させ、濃縮し洗浄したマイコプラズマを、実施例４のステップ１に開示の通りに不活化した。簡単には、ＭＧ膜粗タンパク質７５ｍＬに、０．７５Ｍｅｇａ−１０を添加し、溶液を室温で２０時間混合した。続いて、３．７５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を溶液に添加し、室温でさらに１時間混合した。溶液を５，０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清をペレットから分離した。次いで、Ｔｒｉｓバッファ７５ｍｌ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を上清に添加した。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ａｃｔｉｇｅｌカラムを、５ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファにより流速３ｍｌ／分で平衡化した。ＭＧタンパク質溶液をカラムに流速８〜１５ｍｌ／分で充填し、フロースルーを別のボトルに回収した。カラムを、１０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファにより流速８〜１５ｍｌ／分で洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓバッファにより流速８〜１５ｍｌ／分で溶出した。カラムを１０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファで洗浄後、ＭＧタンパク質溶液をカラムに再び加え、上述した通りに溶出を繰り返した。溶出物をプールし、３，５００ＭＷカットオフ透析チューブ法により、Ｔｒｉｓバッファに対し透析した。タンパク質アッセイを行い、溶出したタンパク質濃度を判定した。
【０１８６】
（実施例２５）
中和血清からのＩｇＧの精製及び免疫親和性カラムの製造
ワクチン接種した、中和鶏血清からのＩｇＧ大量精製及びＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤへの固定化を実施例３により行った。
【０１８７】
（実施例２６）
免疫親和性カラムに結合したヘパリン結合ＭＧタンパク質のトリプシン消化
精製ＭＧタンパク質２ｍｇを、２ｍｌの免疫親和性カラムに添加し、１５分間結合させた。カラムを、１０ｍｌのＴｒｉｓバッファＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄した。トリプシン溶液（ＴｒｉｓバッファＢ中２０μｇ／ｍｌ）を添加し、スラリーを３７℃で１時間、静かに攪拌した。フラグメント及び遊離酵素をＴｒｉｓバッファＢで洗い流し、結合したペプチドを０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．５で溶出した。溶出物を続いてｃｃ．ＮＨ４ＯＨで中和、濃縮し、Ｃ−１８逆相スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）精製し、ペプチド組成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。
【０１８８】
（実施例２７）
ヘパリンカラムに結合したヘパリン結合ＭＧタンパク質のトリプシン消化
精製ＭＧタンパク質２ｍｇを、２ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌカラムに添加し、１時間結合させた。カラムを、１０ｍｌのＴｒｉｓバッファＢで洗浄した。トリプシン溶液（ＴｒｉｓバッファＢ中２０μｇ／ｍｌ）を添加し、スラリーを３７℃で１時間、静かに攪拌した。フラグメントをＴｒｉｓバッファＢで洗い流し、結合したペプチドを１ＭのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓバッファＢで溶出した。溶出物を濃縮し、Ｃ−１８逆相スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製し、ペプチド組成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。
【０１８９】
（実施例２８）
Ｃ１ｑタンパク質の精製及び固定化
Ｃ１ｑの精製を、ＭｃＫａｙ，ＥＪ「さまざまな動物種由来血漿Ｃ１ｑを精製するための簡単な２段階手順（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ Ｃ１ｑ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｉｍａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８１年３：３０３〜３０８頁の方法により行った。精製したＣ１ｑを、米国特許第５，８０１，０６３号に記載された本発明者らの手順の適応により、Ａｍｉｎｏｇｅｌ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）に３ｍｇ／ｍｌで固定化した。
【０１９０】
（実施例２９）
補体結合ＩｇＧの精製及び固定化
実施例２４により精製されたポリクローナル中和抗体を、固定化Ｃ１ｑの１０ｍｌカラムに加え、ＴｒｉｓバッファＢで平衡化し、３０分間結合させた。非結合抗体を、１０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファＢで洗浄して除去し、結合抗体を、１Ｍ ＮａＣｌを含有する同じバッファで溶出した。精製されたＩｇＧを、続いてＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤに３ｍｇ／ｍｌで固定化した。
【０１９１】
（実施例３０）
免疫親和性カラムに結合した補体活性化ＭＧタンパク質のトリプシン消化
Ｍ．ガリセプティカムを、実施例２に記載の通りに成長させ、濃縮し洗浄したマイコプラズマを、実施例４のステップ１に開示の通りに不活化した。固定化した補体活性化抗体の１０ｍＬカラムに、ＭＧ溶解物３０ｍｌを３ｍｌ／分で加えた。カラムを、２０ベッドボリュームのＴｒｉｓバッファＢにより流速８ｍｌ／分で洗浄し、非特異的吸着タンパク質を除去した。トリプシン溶液（ＴｒｉｓバッファＢ中２０μｇ／ｍｌ）を添加し、スラリーを３７℃で１時間、静かに攪拌した。フラグメントをＴｒｉｓバッファＢで洗浄して除去し、結合したペプチドを０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．５で溶出した。溶出物を続いてｃｃ．ＮＨ４ＯＨで中和、濃縮し、Ｃ−１８逆相スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製し、ペプチド組成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。
【０１９２】
免疫学的に活性なペプチドの例は、以下の組成を有することが示されている：Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。重要なことは、このペプチドが、ＧＡＧ／ヘパリン結合領域Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇを含有する点である。別の有用な配列は、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。これらの配列は、エンドプロテイナーゼの切断部位を含有するリンカーペプチドに結合することができる。こうしたリンカー配列の例は、ＬＩＫＦＲＳＮ（Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。他のリンカー配列は、当技術分野で知られている。
【０１９３】
（実施例３１）
抗原ペプチドエピトープ及びマルチエピトープペプチドの合成
抗原ペプチドをＦＭＯＣ方法により合成した。
【０１９４】
（実施例３２）
ワクチンのための防御抗原ペプチドの確認
抗原ペプチドを、ワクチン接種した鶏の中和血清と混合し、固定化したヘパリンに対する結合阻害を競合ＥＬＩＳＡにより判定した。ペプチド試料を、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着した。続いて、ウェルを、ブロッキング溶液でブロックし、免疫及び非免疫対照抗血清を、続いてウェルに添加し、一晩４℃でインキュベートした。非特異的タンパク質を、洗浄液で除去した後、１００μｇ／ｍｌのビオチン標識ヘパリンを添加し、ブロッキングバッファ中で１時間希釈した。非結合ヘパリンを、３回、各１０分間洗浄した後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、ブロッキングバッファ中で１時間、１：３，０００に希釈した。過剰な結合体を、３回、各１０分間、洗浄バッファで洗浄して除去し、３，３’−ジアミノベンジジン溶液を添加して発色させた。シグナルは、中和抗体の存在に反比例する。
【０１９５】
（実施例３３）
病原体抗原タンパク質のバイオインフォマティクス解析は、高い抗原能のエピトープの同定をもたらすこともできる。こうした解析は、これまでにＭ．ガリセプティカムＭＧＡタンパク質について行われている。抗原領域を、直鎖塩基モチーフの文脈でさらに解析した。こうした抗原性の高い予測直鎖モチーフは、以下の配列である：ＭＨＣ Ｉエピトープ １０−ｍｅｒは、ＬＬＡＫＫＴＤＫＳＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＭＨＣ ＩＩ １５−ｍｅｒは、ＬＬＡＫＫＴＤＫＳＶＳＰＡＱＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）である。これらの領域は、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ法（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）により同定した。これは、直鎖塩基モチーフは、実際に抗原性向の高いスポットの内側に含まれていることを示す。バイオインフォマティクス解析は、Ｊ．Ｐｅｖｓｎｅｒ、「バイオインフォマティクス及び機能ゲノミクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．、２００３年）に記載されたものなど、当技術分野で周知の方法により、当技術分野で周知のデータマイニング及びマッチング並びに配列比較のためのデータベース及びコンピュータ解析法を用いて、行うことができる。
【０１９６】
（実施例３４）
抗原エピトープ抗体の精製
精製抗原ペプチドを、末端ビオチン標識で合成する。ビオチン標識ペプチドを、１ｍｇ／ｍｌ濃度でＡｖｉｄｉｎ Ａｃｔｉｇｅｌ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）に固定化する。ワクチン接種した鶏由来の中和抗血清を、飽和濃度で添加し、非特異的結合タンパク質を、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で洗浄して除去した。特異的抗体は、Ａｃｔｉｓｅｐ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カールスバッド、ＣＡ）で溶出する。
【０１９７】
本発明の利点
本発明は、例えば、免疫応答を誘導する、防御免疫応答を誘発する、又は寛容性を誘発するなどの目的に合わせることのできる、改善された免疫調節組成物及び方法を提供する。これらの組成物は、安定であり、免疫応答に所望の効果をもたらすため、幅広い免疫原及び標的分子により調製することができる。これら組成物は、このような物質の非経口投与の追加となる投与経路を提供する。これらは、免疫原及び標的分子の時期尚早の分解又は放出を防止する。粒子は、粒子と粘膜との相互作用を改善し、取り込みを促すことができる固有の粘膜接着特性を有する。これらは、追加のアジュバントを必要としない。
【０１９８】
本発明による方法及び組成物は、ワクチンとして使用することを意図した組成物から適当な回避エピトープを排除して免疫回避の発生を防ぐために、免疫回避におけるＮ−グリコサミノグリカン（マンノシル化）の役割を利用する。これらはまた、グリコサミノグリカン／ヘパリンの直鎖結合モチーフの同定、及びこのような結合を干渉する方法も利用する。本発明による方法及び組成物は、さらに、補体活性化エピトープを同定するために開発された方法を使用する。さらに、本発明による方法及び組成物は、幾つかのＴＬＲアゴニストの使用は、免疫応答を大幅に増強するという発見を利用する。抗原及びＴＬＲアゴニストはみな、粘膜リンパ系の単一細胞を標的にすることができる。本発明の別の改善された態様は、単一粒子における合成Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの使用である。
【０１９９】
本明細書に説明として記載された本発明は、本明細書に具体的には開示されていない、いずれの要素、限定を欠いた状態で、適切に実践することができる。故に、例えば、「含む、含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、広く、限定することなく読まれるべきである。さらに、本明細書で使用された用語及び表現は、限定用語ではなく、説明用語として使用されており、今後示される、及び記載されるいずれかの均等物、又はこのいずれかの部分を除外するような用語及び表現を使用するつもりはなく、本発明の請求の範囲内でさまざまな修正が可能であることがわかる。故に、本発明は、好ましい実施形態及び選択的機能により具体的に開示されているが、本明細書に開示されている本発明の修正及びバリエーションは、当業者により復元されることができること、このような修正及びバリエーションは、本明細書に開示されている本発明の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。本発明は、本明細書で幅広く及び一般的に記載された。一般的な公開の範囲内にあるより狭義の種及び亜属分類もそれぞれ、これらの発明の部分を形成する。これには、削除した物質が具体的にこの中に存在するか否かにかかわらず、いずれかの対象を前記属から除去するという消極的な限定を条件に、各発明の一般的な説明が含まれる。
【０２００】
さらに、ある発明の特徴又は態様が、マーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者であれば、したがって、この発明は、マーカッシュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれかに関して記載されていることがわかるであろう。上記の記載は、例示を意図したものであり、限定を意図したものではないことも理解されよう。上記の記載を検討する際、多くの実施形態が当業者には明白であろう。本発明の範囲はしたがって、上記の記載の参照により決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲、並びにこのような特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲を参照することにより決定されるべきである。特許公報を含め、あらゆる論文及び参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】本発明による微粒子担体組成物での使用に適したアガロース微粒子の粒子分布を示すグラフである（実施例１）。
【図２】ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）（白いバー）、又は細菌のＣｐＧ ＤＮＡ（ｂａｃｔＤＮＡ）（黒いバー）、又は単独で添加した場合と同じ濃度で両者を同時に添加（斜線バー）して処理した後の、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−α分泌（Ａ）又は組織因子の分泌（Ｂ）を示すグラフである。Ｐ及びＤに続く数字はそれぞれ、ＰｅｐＧ及びｂａｃｔＤＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示している。左から右に、これらはＰ３＋Ｄ１５、Ｐ３＋Ｄ５、Ｐ３＋Ｄ１．５、Ｐ１＋Ｄ１５、Ｐ１＋Ｄ５、Ｐ１＋Ｄ１．５、Ｐ０．３＋Ｄ１５、Ｐ０．３＋Ｄ５，及びＰ０．３＋Ｄ１．５である。
【図３】ＣｏｎＡにより露出された（Ｃｏｎ Ａ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）又は過ヨウ素酸ナトリウム処理された抗原のほか、さまざまな組合せのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、及びＴＬＲ９アゴニストにより、さまざまな方法で調製された粒子によるさまざまなＴｈ１及びＴｈ２応答の誘導を示すグラフである（グレーのバー、ＴＮＦ−αｘ１００、黒いバー、ＩＬ−１０）。
【図４】図３について、さまざまな方法で調製された粒子で処理された単球の、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１０比を示すグラフである。
【図５】微粒子製剤に曝露後の樹状細胞におけるＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６の誘導を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
防御免疫を誘導する免疫学的に活性な組成物であって、
（ａ）少なくとも１種類の病原体関連分子パターンと、
（ｂ）場合により、少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
（ｃ）前記組成物を生物に送達することにより防御免疫を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む、上記組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープを含む、請求項１に記載の免疫学的に活性な組成物。
【請求項３】
寛容性を誘導する免疫学的に活性な組成物であって、
（ａ）少なくとも１種類の病原体関連分子パターンと、
（ｂ）少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープと、
（ｃ）前記組成物を生物に送達することにより寛容性を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む、上記組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープが、エスケープエピトープを持たない、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド、タンパク質、組換えペプチド若しくはマルチペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物、核酸若しくはその他の生物活性分子、又はこれらのいずれかの組合せである、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項６】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後調節を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
転写後調節が、炭水化物及び／又は脂質部分を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
転写後調節が、末端マンノシル化を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
免疫調節の末端マンノシル化物質が、免疫防御組成物から著減した、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
末端マンノシル化免疫活性物質が、酸化ステップにより組成物から著減した、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
末端マンノシル化免疫活性物質が、酵素処理により組成物から著減した、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
末端マンノシル化免疫活性物質が、糖特異的親和性結合により組成物から著減した、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
転写後調節が、脂質部分を含み、前記脂質部分は、脱脂により除去される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後修飾を有さない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、Ｎ−グリコシル化及び／又はリポイル化が可能なアミノ酸配列を有さない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性なタンパク質又はペプチドは、細胞表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項１７】
アミノ酸配列が、本来多塩基性であり、一般式ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＢＸＢ、ＢＢＢ、ＢＸＢＸＸＸＢＸＢ、又はＢＸＢＸＸＸＸＸＢＸＢを有し、ここで、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘはいずれか他のアミノ酸である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＧＡＧ結合アミノ酸配列が、病原体が細胞表面に結合するのを干渉可能なペプチド又はタンパク質に対する抗体を産生するのに使用される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫活性な抗原エピトープが、病原体がＧＡＧを介して細胞表面に結合するのを干渉可能なエピトープに対する抗体を産生するのに使用される、請求項２に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質が、ヘパリン及びこの類似体からなる群から選択されるＧＡＧを結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質が、単独又は抗体と併用して、補体活性化活性を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
免疫活性な抗原エピトープが、単一のマルチペプチドに合体される複数のペプチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項２３】
免疫活性な抗原エピトープが、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの両方を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項２４】
病原体関連分子パターンが、
（ａ）ＴＬＲ１受容体アゴニストと、
（ｂ）ＴＬＲ２受容体アゴニストと、
（ｃ）ＴＬＲ３受容体アゴニストと、
（ｄ）ＴＬＲ４受容体アゴニストと、
（ｅ）ＴＬＲ５受容体アゴニストと、
（ｆ）ＴＬＲ６受容体アゴニストと、
（ｇ）ＴＬＲ７受容体アゴニストと、
（ｈ）ＴＬＲ８受容体アゴニストと、
（ｉ）ＴＬＲ９受容体アゴニストと、
（ｊ）ＮＯＤ−１アゴニストと、
（ｋ）ＮＯＤ−２アゴニストと、
（ｌ）ＤＣ−ＳＩＧＮと、
（ｍ）Ｌ−ＳＩＧＮと、
（ｎ）マンノース受容体と
からなる群から選択される、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項２５】
病原体関連分子パターンが、ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストであり、前記ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストは、細菌のペプチドグリカン及び細菌のペプチドグリカン誘導体からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
（ａ）ヘパリン吸着を行うステップと、
（ｂ）免疫親和性選択を行うステップと、
（ｃ）場合により、免疫活性ペプチドを生成するため、免疫親和性選択により単離された１種類のタンパク質又は複数のタンパク質のタンパク質分解を行うステップと
を含む、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉可能な免疫活性ペプチドを同定する方法。
【請求項２７】
直鎖多塩基モチーフを用いるバイオインフォマティクス解析法により配列データを解析することを含む、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉することが可能な免疫活性ペプチドを同定する方法。
【請求項２８】
（ａ）補体結合抗体の補体タンパク質への結合を行うステップと、
（ｂ）タンパク質抗原の免疫親和性選択に前記抗体を使用するステップと、
（ｃ）場合により、単離されたタンパク質抗原のタンパク質分解を行うステップと
からなるステップを含む、免疫活性ペプチドを活性化する補体を同定する方法。
【請求項２９】
請求項２６、２７、又は２８に記載の方法で生成される免疫活性ペプチド。
【請求項３０】
宿主生物における疾患を克服するための、請求項２９に記載の同定された免疫活性ペプチドに基づく防御抗体。
【請求項３１】
分子が、混合物として存在する、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項３２】
分子が、化学的に結合している、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項３３】
担体が、微粒子である、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項３４】
微粒子が、狭いサイズ分布範囲を有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
微粒子が、多孔性である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
微粒子が、直径約１０μｍ未満である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
微粒子が、直径約５μｍ未満である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
微粒子が、生体高分子でできている、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３９】
免疫活性な抗原エピトープが、微粒子に非共有結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４０】
免疫活性な抗原エピトープが、微粒子に共有結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４１】
対象における免疫応答を誘発する方法であって、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項４２】
組成物が、１つを超える病原体認識受容体アゴニストを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
１つを超える免疫活性な抗原エピトープ及び１つを超えるパターン認識受容体アゴニストが、微粒子と結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４４】
１つを超える免疫活性な抗原エピトープが、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの両方を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
１つを超えるパターン認識受容体アゴニストが、微粒子と結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４６】
対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であって、微粒子と結合している少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項４７】
対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であって、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項４８】
組成物の投与が、粘膜経路を介して起こる、請求項４１、４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
組成物の投与が、非経口経路を介して起こる、請求項４１、４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
組成物の投与が、皮膚経路を介して起こる、請求項４１、４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であって、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答が、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答又は両方の組合せを含む、上記方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であって、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープ（免疫学的回避機構に関与する抗原を除く）と、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項５３】
免疫応答が、病原微生物におけるグリコサミノグリカン結合要素を干渉する、請求項４１、４６、４７、５１、又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発する方法であって、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲＲアゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、前記免疫応答が、免疫機能又は免疫回避の調節応答又は下方制御を誘導することを含む、上記方法。
【請求項５５】
組成物が、脂質含有部分を有する免疫活性な抗原エピトープを中に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
免疫学的に活性な脂質含有部分が、免疫活性な抗原エピトープとは独立に微粒子に結合した、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
免疫学的に活性な脂質含有部分が、炭水化物成分を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
炭水化物成分が、Ｎ−グリコシル化の結果である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫活性な抗原エピトープが、アスパラギン、スレオニン及びセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むモチーフを含み、前記モチーフは、Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｐ−Ｘ−Ｔｈｒモチーフであり、ここで、Ｘは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸でありうる、請求項５４に記載の方法。
【請求項１】
防御免疫を誘導する免疫学的に活性な組成物であって、
（ａ）少なくとも１種類の病原体関連分子パターンと、
（ｂ）場合により、少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
（ｃ）前記組成物を生物に送達することにより防御免疫を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む、上記組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープを含む、請求項１に記載の免疫学的に活性な組成物。
【請求項３】
寛容性を誘導する免疫学的に活性な組成物であって、
（ａ）少なくとも１種類の病原体関連分子パターンと、
（ｂ）少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープと、
（ｃ）前記組成物を生物に送達することにより寛容性を誘導するのに有効な、少なくとも１つの担体と
を含む、上記組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープが、エスケープエピトープを持たない、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド、タンパク質、組換えペプチド若しくはマルチペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物、核酸若しくはその他の生物活性分子、又はこれらのいずれかの組合せである、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項６】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後調節を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
転写後調節が、炭水化物及び／又は脂質部分を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
転写後調節が、末端マンノシル化を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
免疫調節の末端マンノシル化物質が、免疫防御組成物から著減した、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
末端マンノシル化免疫活性物質が、酸化ステップにより組成物から著減した、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
末端マンノシル化免疫活性物質が、酵素処理により組成物から著減した、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
末端マンノシル化免疫活性物質が、糖特異的親和性結合により組成物から著減した、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
転写後調節が、脂質部分を含み、前記脂質部分は、脱脂により除去される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後修飾を有さない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、Ｎ−グリコシル化及び／又はリポイル化が可能なアミノ酸配列を有さない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性なタンパク質又はペプチドは、細胞表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項１７】
アミノ酸配列が、本来多塩基性であり、一般式ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＢＸＢ、ＢＢＢ、ＢＸＢＸＸＸＢＸＢ、又はＢＸＢＸＸＸＸＸＢＸＢを有し、ここで、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘはいずれか他のアミノ酸である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＧＡＧ結合アミノ酸配列が、病原体が細胞表面に結合するのを干渉可能なペプチド又はタンパク質に対する抗体を産生するのに使用される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫活性な抗原エピトープが、病原体がＧＡＧを介して細胞表面に結合するのを干渉可能なエピトープに対する抗体を産生するのに使用される、請求項２に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質が、ヘパリン及びこの類似体からなる群から選択されるＧＡＧを結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質が、単独又は抗体と併用して、補体活性化活性を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
免疫活性な抗原エピトープが、単一のマルチペプチドに合体される複数のペプチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項２３】
免疫活性な抗原エピトープが、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの両方を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項２４】
病原体関連分子パターンが、
（ａ）ＴＬＲ１受容体アゴニストと、
（ｂ）ＴＬＲ２受容体アゴニストと、
（ｃ）ＴＬＲ３受容体アゴニストと、
（ｄ）ＴＬＲ４受容体アゴニストと、
（ｅ）ＴＬＲ５受容体アゴニストと、
（ｆ）ＴＬＲ６受容体アゴニストと、
（ｇ）ＴＬＲ７受容体アゴニストと、
（ｈ）ＴＬＲ８受容体アゴニストと、
（ｉ）ＴＬＲ９受容体アゴニストと、
（ｊ）ＮＯＤ−１アゴニストと、
（ｋ）ＮＯＤ−２アゴニストと、
（ｌ）ＤＣ−ＳＩＧＮと、
（ｍ）Ｌ−ＳＩＧＮと、
（ｎ）マンノース受容体と
からなる群から選択される、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項２５】
病原体関連分子パターンが、ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストであり、前記ＮＯＤ−１アゴニスト又はＮＯＤ−２アゴニストは、細菌のペプチドグリカン及び細菌のペプチドグリカン誘導体からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
（ａ）ヘパリン吸着を行うステップと、
（ｂ）免疫親和性選択を行うステップと、
（ｃ）場合により、免疫活性ペプチドを生成するため、免疫親和性選択により単離された１種類のタンパク質又は複数のタンパク質のタンパク質分解を行うステップと
を含む、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉可能な免疫活性ペプチドを同定する方法。
【請求項２７】
直鎖多塩基モチーフを用いるバイオインフォマティクス解析法により配列データを解析することを含む、病原体のグリコサミノグリカン結合を干渉することが可能な免疫活性ペプチドを同定する方法。
【請求項２８】
（ａ）補体結合抗体の補体タンパク質への結合を行うステップと、
（ｂ）タンパク質抗原の免疫親和性選択に前記抗体を使用するステップと、
（ｃ）場合により、単離されたタンパク質抗原のタンパク質分解を行うステップと
からなるステップを含む、免疫活性ペプチドを活性化する補体を同定する方法。
【請求項２９】
請求項２６、２７、又は２８に記載の方法で生成される免疫活性ペプチド。
【請求項３０】
宿主生物における疾患を克服するための、請求項２９に記載の同定された免疫活性ペプチドに基づく防御抗体。
【請求項３１】
分子が、混合物として存在する、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項３２】
分子が、化学的に結合している、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項３３】
担体が、微粒子である、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項３４】
微粒子が、狭いサイズ分布範囲を有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
微粒子が、多孔性である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
微粒子が、直径約１０μｍ未満である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
微粒子が、直径約５μｍ未満である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
微粒子が、生体高分子でできている、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３９】
免疫活性な抗原エピトープが、微粒子に非共有結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４０】
免疫活性な抗原エピトープが、微粒子に共有結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４１】
対象における免疫応答を誘発する方法であって、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項４２】
組成物が、１つを超える病原体認識受容体アゴニストを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
１つを超える免疫活性な抗原エピトープ及び１つを超えるパターン認識受容体アゴニストが、微粒子と結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４４】
１つを超える免疫活性な抗原エピトープが、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの両方を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
１つを超えるパターン認識受容体アゴニストが、微粒子と結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４６】
対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であって、微粒子と結合している少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項４７】
対象における免疫応答を誘発するための免疫学的に活性な組成物のインビボ送達の方法であって、微粒子と結合している少なくとも１つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも１つの病原体認識（ＰＲ）受容体アゴニストを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項４８】
組成物の投与が、粘膜経路を介して起こる、請求項４１、４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
組成物の投与が、非経口経路を介して起こる、請求項４１、４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
組成物の投与が、皮膚経路を介して起こる、請求項４１、４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であって、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答が、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答又は両方の組合せを含む、上記方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であって、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープ（免疫学的回避機構に関与する抗原を除く）と、ＰＲ受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を、単回又は複数回投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記方法。
【請求項５３】
免疫応答が、病原微生物におけるグリコサミノグリカン結合要素を干渉する、請求項４１、４６、４７、５１、又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
免疫学的に活性な物質に対する寛容性を誘発する方法であって、微粒子と結合している１つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、ＰＲＲアゴニストの組合せとを含む組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含み、前記微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、前記免疫応答が、免疫機能又は免疫回避の調節応答又は下方制御を誘導することを含む、上記方法。
【請求項５５】
組成物が、脂質含有部分を有する免疫活性な抗原エピトープを中に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
免疫学的に活性な脂質含有部分が、免疫活性な抗原エピトープとは独立に微粒子に結合した、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
免疫学的に活性な脂質含有部分が、炭水化物成分を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
炭水化物成分が、Ｎ−グリコシル化の結果である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫活性な抗原エピトープが、アスパラギン、スレオニン及びセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むモチーフを含み、前記モチーフは、Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｐ−Ｘ−Ｔｈｒモチーフであり、ここで、Ｘは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸でありうる、請求項５４に記載の方法。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５２９９７６（Ｐ２００８−５２９９７６Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５３３５０（Ｐ２００７−５５３３５０）
【出願日】平成１８年１月３０日（２００６．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３３４９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８１５７６
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【出願人】（５０７２５５０８６）ガレンバイオ、インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３０日（２００６．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３３４９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８１５７６
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【出願人】（５０７２５５０８６）ガレンバイオ、インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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