免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡ
【課題】 哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを効率的に発現するＤＮＡを提供する。
【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡと、その染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体と、その形質転換体を培養する工程と、培養物から当該ポリペプチドを採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決する。
【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡと、その染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体と、その形質転換体を培養する工程と、培養物から当該ポリペプチドを採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は染色体ＤＮＡ、とりわけ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの単離と、そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、特許文献１及び特許文献２に開示した。このポリペプチドは有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備しているので、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、免疫疾患剤などとして広範な用途が期待されている。
【０００３】
ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断されたり、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特許文献３に記載されているように、ヒト細胞株は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないという問題がある。したがって、現時点で当該ポリペプチドを大量に入手しようとすると、組換えＤＮＡ技術を適用せざるを得ない。組換えＤＮＡ技術を適用しつつ、ポリペプチドにヒト細胞におけると同様なプロセッシングを受けさせるには、宿主に哺乳類由来の細胞を用いることとなる。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２７１８９号公報
【特許文献２】特開平８−１９３０９８号公報
【特許文献３】特開平９−２８９８９６号公報（特願平８−２６９１０５号明細書）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、哺乳類由来の宿主細胞に導入したときに、当該ポリペプチドの産生を効率的に発現するＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
さらに、この発明の第二の課題は、斯かるＤＮＡを導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００７】
加えて、この発明の第三の課題は、斯かる形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者が上記諸課題を解決すべく鋭意研究したところ、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、当該ポリペプチドを効率的に発現することを見出した。しかも、この染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞で発現させて得られるポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを大腸菌で発現させて得られるポリペプチドに比較して、生理活性が有意に高いことを見出した。
【０００９】
すなわち、この発明は上記第一の課題を、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡにより解決するものである。
【００１０】
さらに、この発明は上記第二の課題を、この染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１１】
加えて、この発明は上記第三の課題を、この形質転換体を培養する工程と、培養物から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、この発明の実施の形態につき説明するが、前述のとおり、この発明は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡの発見と、その染色体ＤＮＡが哺乳類由来の宿主細胞に導入したときに、生理活性の高いポリペプチドを効率的に発現するという知見に基づくものである。この発明の染色体ＤＮＡは、通常、２個以上のエクソンを含んでなり、そのうちの１個又は２個以上のエクソンは配列表における配列番号２に示す塩基配列の一部又は全部を有する。斯かるエクソンの具体例としては、例えば、配列表における配列番号３及び４に示す塩基配列のものが挙げられる。ヒトに由来する染色体ＤＮＡは、それ以外に、例えば、配列表における配列番号５乃至７に示す塩基配列のエクソンを含んでなることがある。この発明の染色体ＤＮＡは、哺乳類の染色体ＤＮＡに由来するものであるが故に、哺乳類の染色体ＤＮＡに特徴的なイントロンを含んでなる。イントロンは、通常、２個以上存在し、個々のイントロンとしては、例えば、配列表における配列番号８乃至１２に示す塩基配列のものが挙げられる。
【００１３】
この発明の染色体ＤＮＡのさらに具体的な例としては、例えば、配列表における配列番号１３及び１４に示す塩基配列及びその塩基配列に相補的な塩基配列を有するものが挙げられる。配列表における配列番号１３に示す塩基配列も、配列番号１４に示す塩基配列も本質的に変わるところはなく、例えば、配列番号１４に示す塩基配列はその第１５，６０７乃至１５，６８５番目、第１７，０５７乃至１７，０６８番目及び２０，４５２乃至２０，４６８番目にリーダーペプチドをコードする領域を、第２０，４６９乃至２０，５８６番目、第２１，９２１乃至２２，０５４番目及び第２６，８２８乃至２７，０４６番目に配列表における配列番号１に当該ポリペプチドをコードする領域を、そして、第１５，６８６乃至１７，０５６番目、第１７，０６９乃至２０，４５１番目、第２０，５８７乃至２１，９２０番目及び第２２，０５５乃至２６，８２７番目にイントロンに相当する領域をそれぞれ含んでなる。なお、配列表における配列番号１３に示す塩基配列の染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞中で当該ポリペプチドを発現させるのに好適である。
【００１４】
ところで、斯界においては、一般に、あるポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主中で発現させるに際し、そのＤＮＡの発現効率を改善したり、あるいは、ポリペプチドそのものの物性を改善する目的で、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換したり、ＤＮＡに適宜のプロモーターやエンハンサーを連結することがある。この発明の染色体ＤＮＡにおいても斯かる改変は当然あり得ることであり、具体的には、最終的に得られるポリペプチドの生理活性を実質的に変更しない範囲で、例えば、配列表における配列番号３乃至１４に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換したり、配列番号３、４、５、６、７、１３及び１４に示す塩基配列における５´末端及び／又は３´末端の非翻訳領域やリーダーペプチドに相当する領域を切除したり、あるいは、配列番号１３に示す塩基配列の一端又は両端に適宜オリゴヌクレオチドを連結した場合であっても、当然、この発明の染色体ＤＮＡに包含されることは言うまでもない。
【００１５】
この発明でいう染色体ＤＮＡとは、上記のごとき塩基配列を含んでなる染色体由来のＤＮＡ全般を包含するものとし、それが元の生体から一旦単離されたものであるかぎり、その出所・由来は問わない。この発明の染色体ＤＮＡを得るには、例えば、配列表における配列番号２乃至１４に示す塩基配列に基づき化学合成するか、あるいは、ヒトの染色体ＤＮＡから単離する。ヒトの染色体ＤＮＡから単離するには、常法にしたがってヒト細胞から染色体ＤＮＡを分離する一方、配列表における配列番号２に示す塩基配列の一部又は全部を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、これをプローブ又はプライマーにして染色体ＤＮＡを検索し、顕著な会合を示すＤＮＡを採取する。いずれにしても、この発明の染色体ＤＮＡは、一旦これを入手すれば、常法にしたがって自律複製可能なベクターとの組換えＤＮＡを作製し、この組換えＤＮＡを微生物や動物由来の適宜宿主に導入して培養するか、あるいは、ＰＣＲ法を適用すれば、無限に複製可能である。
【００１６】
この発明の染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、生理活性の高いポリペプチドを効率的に発現するので、組換えＤＮＡ技術による当該ポリペプチドの製造に極めて有用である。この発明は特定の染色体ＤＮＡを用いるポリペプチドの製造方法をも提供するものであり、この発明の製造方法は、当該染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体を培養する工程と、培養物から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程を含んでなる。
【００１７】
この発明によるポリペプチドの製造方法について説明すると、当該染色体ＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主細胞に導入される。組換えＤＮＡはこの発明の染色体ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、染色体ＤＮＡさえ入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。この発明の染色体ＤＮＡを挿入可能なベクターとしては、例えば、ｐｃＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓなどのプラスミドベクターが挙げられる。自律複製可能なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は選択マーカーなどの、この発明の染色体ＤＮＡが個々の宿主細胞において発現するための適宜塩基配列をさらに含んでなる。なお、プロモーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモーターや、あるいは、同じ特許出願人が特開平７−１６３３６８号公報に開示したインターフェロン−αプロモーターを用いるときには、形質転換体における当該染色体ＤＮＡの発現を外部刺激により人為的に制御できることとなる。
【００１８】
斯かるベクターにこの発明の染色体ＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、まず、この発明の染色体ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、つぎに、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、微生物や動物由来の宿主において無限に複製可能である。
【００１９】
宿主細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれらの変異株を始めとする、斯界において宿主として慣用されるヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞であっても、当該ポリペプチドを本来的に産生するヒトのリンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、骨髄芽球、骨髄球、顆粒球、マクロファージなどの造血系細胞や、例えば、肺癌、大腸癌、結腸癌などの固形腫瘍由来の上皮系細胞や間質系細胞であってもよい。後者の造血系細胞の具体例としては、例えば、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖｉｅｗ）』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）などに記載されている骨髄性白血病、前骨髄性白血病、単球性白血病、成人Ｔ細胞白血病及びヘアリー細胞白血病を含む白血病又はリンパ腫由来のＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６）、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）などの白血病細胞株及びそれらの変異株が挙げられる。これらの白血病細胞及び変異株は当該ポリペプチドをプロセッシングする性質が顕著なので、宿主細胞として用いると、生理活性の高いポリペプチドが容易に得られる特徴がある。
【００２０】
斯かる宿主細胞にこの発明の染色体ＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。形質転換体から当該ポリペプチドを産生するクローンを選択するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、形質転換体を培養培地で培養し、当該ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選択すればよい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などに詳述されている。
【００２１】
斯くして得られる形質転換体は、培養培地で培養すると、細胞内外に当該ポリペプチドを分泌する。培養培地としては、哺乳類由来の細胞を培養するための慣用の培養培地を用いればよく、斯かる培養培地は、通常、緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩素イオンなどの無機イオンと、細胞の代謝能力に応じた微量元素、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを加え、必要に応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長因子、細胞接着因子などを含有せしめて構成される。個々の培養培地としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙げられる。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０４乃至１×１０７個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０５乃至１×１０６個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培地と取替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養すると、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。形質転換体の種類や培養条件にもよるが、斯くして得られる培養物は、通常、当該ポリペプチドを約１乃至１００μｇ／ｍｌ含む。
【００２２】
このようにして得られた培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま用いられることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを細胞又は細胞破砕物から分離し、精製する。精製には細胞又は細胞破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドを最少のコストと労力で得ることができる。
【００２３】
前述のとおり、この発明の方法により得られるポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明の方法により得られるポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の方法により得られるポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、当該ポリペプチドの感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人による特開平９−１５７１８０号公報（特願平８−２８７２２号明細書）に詳述されている。
【００２４】
ところで、この発明の染色体ＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明の染色体ＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックリポソームや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、この状態で、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。また、養子免疫遺伝子療法においては、効果細胞にこの発明の染色体ＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入すると、腫瘍細胞に対する効果細胞の細胞障害性が高まり、養子免疫療法を強化することができる。さらに、腫瘍ワクチン遺伝子療法においては、患者から摘出した腫瘍細胞にこの発明の染色体ＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、生体外で一定数に達するまで増殖させた後、患者に自家移植するのである。移植された腫瘍細胞は患者体内においてワクチンとして作用し、強力且つ抗原特異的な抗腫瘍免疫を発揮する。斯くして、この発明の染色体ＤＮＡは、ウイルス疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患を始めとする各種疾患の遺伝子療法に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ 遺伝子治療の基礎技術』、１９９６年、羊土社発行に詳述されている。
【００２５】
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、そこで用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【実施例１】
【００２６】
＜染色体ＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
【００２７】
＜実施例１−１：部分塩基配列の決定＞
クローンテック製ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡライブラリー『ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ ＤＮＡ ＰｖｕＩＩ Ｌｉｂｒａｒｙ』を５ｎｇとり、これに１０×Ｔｔｈ ＰＣＲ反応溶液を５μｌ、２５ｍＭ酢酸マグネシウムを２．２μｌ、そして、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を４μｌそれぞれ加え、さらに、２単位／μｌのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬと２．２μｇ／μｌのＴｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの４：１の混液を１μｌ、アダプタープライマーとして５´−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３´で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを１０ピコモル、そして、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号２に示す塩基配列の第８８乃至１１５番目の配列に基づき化学合成した５´−ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。この混合物を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９４℃で２５秒間、７２℃で４分間でインキュベートするサイクルを７回繰返して反応させ、次に、９４℃で２５秒間、６７℃で４分間インキュベートするサイクルを３２回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００２８】
滅菌蒸留水で反応物を１００倍希釈した後、その１μｌをとり、これに１０×Ｔｔｈ ＰＣＲ反応溶液を５μｌ、２５ｍＭ酢酸マグネシウムを２．２μｌ、そして、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を４μｌそれぞれ加え、さらに、２単位／μｌのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬと２．２μｇ／μｌのＴｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの４：１の混液を１μｌ、ネステッドアダプタープライマーとして５´−ＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモル、アンチセンスプライマーとして上記と同様にして化学合成した５´−ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で５０μｌとした。この混合物を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９４℃で２５秒間、７２℃で４分間インキュベートするサイクルを５回繰返して反応させ、次に、９４℃で２５秒間、６７℃で４分間インキュベートするサイクルを２２回繰返してＰＣＲ反応させて当該染色体ＤＮＡにおけるＤＮＡ断片の一つを増幅した。なお、染色体ＤＮＡライブラリー及びＰＣＲ反応試薬としては、主として、クローンテック製『ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ ＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ Ｋｉｔｓ』を用いた。
【００２９】
このようにして得たＰＣＲ反応物を適量とり、これにノバジーン製プラスミドベクター『ｐＴ７ Ｂｌｕｅ（Ｒ）』を５０ｎｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼの適量を加え、さらに、１００ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を分離し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第５，１５０乃至６，７０９番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３０】
＜実施例１−２：部分塩基配列の決定＞
実施例１−１における第一回目のＰＣＲ反応において、アンチセンスプライマーとして、実施例１−１で得たＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＡＡＧＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にしてＰＣＲ反応させた。
【００３１】
滅菌蒸留水で反応物を１００倍希釈した後、その１μｌをとり、これをアンチセンスプライマーとして、実施例１−１で得たＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＧＡＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例１−１における第二回目のＰＣＲ反応と同様に反応させて当該染色体ＤＮＡにおける別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００３２】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第１乃至５，２２８番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３３】
＜実施例１−３：部分塩基配列の決定＞
クローンテック製ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡを０．５μｇとり、これに１０×ＬＡ ＰＣＲ反応溶液を５μｌと２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌそれぞれ加え、さらに、５単位／μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼと１．１μｇ／μｌ ＴａｑＳｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの１：１の混液を１μｌ、センスプライマーとして配列表における配列番号２に示す塩基配列の第４６乃至７５番目の配列に基づき化学合成した５´−ＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモル、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号２に示す塩基配列の第２１０乃至２４２番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＡＴＴＧＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。この混合物を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９８℃で２０秒間、７２℃で１０分間インキュベートするサイクルを５回繰返して反応させ、次に、９８℃で２０秒間、６８℃で１０分間インキュベートするサイクルをサイクルを重ねるたびに時間を５秒ずつ延長しながら、２５回繰返しＰＣＲ反応させ、その後、７２℃でさらに１０分間反応させて当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応試薬としては、主として、宝酒造製『ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２』を用いた。
【００３４】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第６，６４０乃至１５，６７１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３５】
＜実施例１−４：部分塩基配列の決定＞
実施例１−３におけるＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第１７５乃至２０７番目の配列に基づき化学合成した５´−ＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第３３４乃至３６０番目の配列に基づき化学合成した５´−ＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用い、さらに、ＰＣＲ反応のサイクルを、先ず、９４℃で１分間インキュベートした後、９８℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰返して反応させ、次に、７２℃で１０分間のサイクルを１回だけ反応させた以外は同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００３６】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第１５，６０４乃至２０，５４３番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３７】
＜実施例１−５：部分塩基配列の決定＞
実施例１−４におけるＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第２７３乃至３０５番目の配列に基づき化学合成した５´−ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第５００乃至５３１番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００３８】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第２０，４５６乃至２２，０４８番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３９】
＜実施例１−６：部分塩基配列の決定＞
実施例１−４におけるＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第４４９乃至４７９番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第７４５乃至７７７番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００４０】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第２１，９９６乃至２７，０６７番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４１】
＜実施例１−７：部分塩基配列の決定＞
実施例１−２における第一回目のＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第５７５乃至６０４番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にしてＰＣＲ反応させた。
【００４２】
滅菌蒸留水で反応物を１００倍希釈した後、その１μｌをとり、これをセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第６２４乃至６５４番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例１−２における第二回目のＰＣＲ反応と同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００４３】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にしてプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第２６，９１４乃至２８，９９４番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４４】
＜実施例１−８：全塩基配列の決定＞
同じ特許出願人が特開平８−１９３０９８号公報に開示したように、当該ポリペプチドをコードすることがすでに判明している配列表における配列番号２に示す塩基配列と、実施例１−１乃至１−７により、この発明で初めて明らかになった部分塩基配列をそれぞれ比較したところ、当該染色体ＤＮＡは、ヒトにおいて、配列表における配列番号１４に示す塩基配列を含んでなることが判明した。配列番号２に示す塩基配列が僅か４７１塩基対からなるのに対して、配列番号１４に示す塩基配列は２８，９９４塩基対と甚だ大きく、このことは、配列番号１４に示す塩基配列が真核細胞に特有のイントロンを含むことを示唆している。
【００４５】
そこで、配列表における配列番号１４に示す塩基配列において、配列番号２に示す塩基配列の一部、すなわち、エクソンがどの領域に位置しているか、さらには、イントロンに固有の供与部位であるＧＴと受容部位であるＡＧがどの領域に位置しているかを調べた。その結果、配列番号１４に示す塩基配列は少なくとも５種類のイントロンを含んでなり、個々のイントロンの塩基配列は配列番号１４に示す塩基配列の５´末端から３´末端に向かって、配列表における配列番号１０、１１、１２、８、９に示す塩基配列の順序で位置していることが判明した。したがって、それらのイントロンにおける隣接するイントロン間に位置する配列はエクソンということになり、個々のエクソンは配列表における配列番号１４に示す塩基配列の５´末端から３´末端に向かって、配列表における配列番号５、６、３、４、７に示す塩基配列の順序で位置していることになる。なお、配列番号７に示す塩基配列は、エクソン以外に、３´末端の非翻訳領域を含んでいる。
【００４６】
以上の考察に基づき決定した配列の特徴を、配列表における配列番号１４に併記した。なお、同じ特許出願人が特願平８−２６９１０５号明細書に開示したように、当該ポリペプチドは、ヒト細胞において、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列に見られるように、Ｎ末端にメチオニンではなく、チロシンを有するポリペプチドとして産生される。このことは、当該ポリペプチドをコードするヒトの染色体ＤＮＡにおいては、当該ポリペプチドをコードする領域の５´末端側にリーダーペプチド領域が連結していることを示唆している。そこで、配列表における配列番号１４に示す塩基配列においては、その第２０，４６９乃至２０，４７１番目のＴＡＣの５´末端側に位置するアミノ酸３６個をリーダーペプチドとして記載している。
【実施例２】
【００４７】
＜発現用組換えＤＮＡ ｐＢＧＨｕＧＦの調製＞
実施例１−４の方法により得た３ｎｇ／５０μｌ ＤＮＡ断片を０．０６ｎｇと実施例１−５の方法により得たＤＮＡ断片を０．０２ｎｇとり、１０×ＬＡ ＰＣＲ反応溶液を５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌそれぞれ加え、さらに、５単位／μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼと１．１μｇ／μｌ ＴａｑＳｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの１：１の混液を１μｌ、センスプライマーとして実施例１−４のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルと、アンチセンスプライマーとして、実施例１−５のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。混液を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９８℃で２０秒間、７２℃で７分間インキュベートするサイクルを５回繰返し、次に、９８℃で２０秒間、６８℃で７分間インキュベートするサイクルを２５回繰返してＰＣＲ反応させた。そして、反応物を常法にしたがって制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩにより切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＳｐｈＩ切断部位を両端に有する約５，９００塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【００４８】
別途、実施例１−５の方法により得たＤＮＡ断片を０．０２ｎｇと実施例１−６の方法により得たＤＮＡ断片を０．０６ｎｇそれぞれとり、これに実施例１−６のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＡＴＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして、また、センスプライマーとして、実施例１−５のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は上記と同様にＰＣＲ反応させた。そして、反応物を常法にしたがって制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｈＩにより切断し、ＮｏｔＩ切断部位とＳｐｈＩ切断部位を両端に有する約５，６００塩基対の別のＤＮＡ断片を得た。
【００４９】
次に、常法にしたがって、サイトメガロウイルスプロモーターを含んでなるインビトロジェン製プラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、得られた約５，５００塩基対のベクター断片に上記で得られた約５，９００塩基対のＤＮＡ断片と約５，６００塩基対のＤＮＡ断片をそれぞれ加え、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを作用させて２種類のＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した。得られた組換えＤＮＡを用い、実施例１−１と同様にして大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、コロニーハイブリダイゼーション法によりプラスミドベクターｐＲＣ／ＣＭＶが導入された形質転換体のコロニーを選別した。この組換えＤＮＡは『ｐＢＧＨｕＧＦ』と命名され、この組換えＤＮＡにおいては、図１に示すように、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡである配列表における配列番号１３に示す塩基配列のＤＮＡが制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位の下流に連結されていた。
【実施例３】
【００５０】
＜ＣＨＯ細胞を宿主とする形質転換体の調製＞
常法にしたがって、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、燐酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）で洗浄した後、細胞密度１×１０７個／ｍｌになるようにＰＢＳに浮遊させた。
【００５１】
次に、実施例２の方法により得た組換えＤＮＡ ｐＢＧＨｕＧＦを１０μｇとり、上記細胞浮遊液の０．８ｍｌとともにキュベットにとり、１０分間氷冷した。キュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した後、ただちにキュベットを取外し、１０分間氷冷した。細胞浮遊液をキュベットから取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３日間培養した後、培養培地にＧ−４１８を最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加え、同じ条件でさらに３週間培養した。生成した１００個余りのコロニーから４８個を選別し、その一部を４００μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）を分注しておいた培養プレートに接種し、上記と同様に１週間培養した。その後、培養プレートの各ウェルに５．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて細胞を溶解した。
【００５２】
細胞溶解物をそれぞれ５０μｌとり、グリセロールを１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により細胞溶解物中のポリペプチドを分離した。次に、分離したポリペプチドを常法にしたがってニトロセルロース膜に移取り、別途調製した、同じ出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたハイブリドーマＨ−１株の培養上清に１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去した。そして、ニトロセルロース膜を西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体を含むＰＢＳに１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素と０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬して発色させた。その発色状況に基づき、当該ポリペプチドの産生能が高い形質転換体のクローンを選別し、『ＢＧＨｕＧＦ』と命名した。
【実施例４】
【００５３】
＜形質転換体によるポリペプチドの製造と理化学的性質＞
【００５４】
＜実施例４−１：形質転換体によるポリペプチドの製造＞
実施例３の方法により得られた形質転換体ＢＧＨｕＧＦを４００μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１週間培養して増殖させた。増殖細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、マシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ ＵＳＡ）』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結した後、解凍して細胞を破砕し、破砕物を遠心分離し、上清を採取した。
【００５５】
別途、ヒト急性単球性白血病由来のＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を同様に培養し、破砕し、遠心分離して得られた上清の適量を上記で得られた形質転換体ＢＧＨｕＧＦの上清に加え、３７℃で３時間インキュベートして反応させた。反応物をあらかじめ１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）により平衡化しておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−セファロース』のカラムに負加し、カラムを１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で洗浄した後、塩化ナトリウム濃度が０Ｍから０．５Ｍまで段階的に上昇する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。この画分を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析した後、あらかじめ１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化しておいたトーソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負加し、０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００５６】
この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、これをプラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記透析内液をカラムに負加した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮した後、凍結乾燥して精製ポリペプチドの固状物を培養物１ｌ当り１５ｍｇの収率で得た。
【００５７】
＜参考例：大腸菌での発現＞
同じ特許出願人による特開平８−１９３０９８号公報に開示され、宿主としての大腸菌に配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むｃＤＮＡを導入してなる形質転換体ｐＫＨｕＧＦをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＴ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間通気攪拌培養した。遠心分離により培養物から菌体を採取し、１３９ｍＭ塩化ナトリウム／７ｍＭ燐酸水素ナトリウム／３ｍＭ燐酸水素二ナトリウム混液（ｐＨ７．２）に浮遊させ、常法にしたがって超音波を印加して菌体を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を実施例４−１の方法に準じて精製したところ、精製ポリペプチドの固状物が培養物１ｌ当り５ｍｇの収率で得られた。
【００５８】
ポリペプチドの収量に着目して本参考例と実施例４−１を比較すると、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体を用いると、培養物単位量当りのポリペプチド産生が著しく高まることを示している。
【００５９】
＜実施例４−２：ポリペプチドの理化学的性質＞
【００６０】
＜実施例４−２（ａ）：生理作用＞
ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により２倍希釈した。血液をファルマシア製フィコール上に重層し、遠心分離して採取したリンパ球を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により洗浄した後、新鮮な同一培地を細胞密度５×１０６個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１５ｍｌ／ウェルずつ分注した。
【００６１】
別途、実施例４−１の方法により得たポリペプチドを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜濃度に希釈して上記マイクロプレートに０．０５ｍｌ／ウェルずつ分注し、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを含む新鮮な同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γを測定した。同時に、実施例４−１の方法により得たポリペプチドに代えて参考例の方法により得たポリペプチドを用いる系と、ポリペプチドを省略する系を設け、両系を上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γは、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算して表示されている。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１の結果は、当該ポリペプチドを作用させると、免疫担当細胞としてのリンパ球がＩＦＮ−γを産生したことを示している。
【００６４】
さらに注目すべきは、実施例４−１の方法により得たポリペプチドは、参考例の方法により得たポリペプチドと比較して、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生が高いことである。このことと、参考例で述べたポリペプチド産生の違いを併せ考えると、同じアミノ酸配列をコードするという観点からみると実質的に同一のＤＮＡと見做し得る場合であっても、そのＤＮＡがｃＤＮＡであって、これを宿主微生物に導入してなる形質転換体と、この発明の染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体とでは、ＤＮＡの発現効率のみならず、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、生理作用の有意に相違するポリペプチドが産生すると推定される。
【００６５】
＜実施例４−２（ｂ）：分子量＞
実施例４−１の方法により得たポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の主バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，０００ダルトン）であった。
【００６６】
＜実施例４−２（ｃ）：Ｎ末端アミノ酸配列＞
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を用い、常法にしたがって分析したところ、実施例４−１の方法により得たポリペプチドは、そのＮ末端に配列表における配列番号１５に示すアミノ酸配列を有していた。
【００６７】
この結果と、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置に主たるバンドを示すという知見、さらには、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列から計算される分子量が１８，１９９ダルトンであることを総合的に判断すると、実施例４−１の方法により得たポリペプチドは配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を有すると結論される。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上説明したように、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡの発見に基づくものである。この発明の染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、当該ポリペプチドを効率的に発現する。しかも、そのポリペプチドは、ｃＤＮＡを大腸菌で発現させて得られるポリペプチドと比較して、生理活性が高い特徴がある。したがって、この発明の染色体ＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術により、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを製造するのに極めて有用である。なお、この発明の染色体ＤＮＡは、ウイルス性疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患を始めとする種々の疾患の遺伝子療法にも有用である。
【００６９】
この発明は斯くも顕著な効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】この発明の染色体ＤＮＡを含む組換えＤＮＡの制限酵素切断部位を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの切断部位
ＨｕＩＧＩＦ この発明による染色体ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
この発明は染色体ＤＮＡ、とりわけ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの単離と、そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、特許文献１及び特許文献２に開示した。このポリペプチドは有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備しているので、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、免疫疾患剤などとして広範な用途が期待されている。
【０００３】
ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断されたり、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特許文献３に記載されているように、ヒト細胞株は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないという問題がある。したがって、現時点で当該ポリペプチドを大量に入手しようとすると、組換えＤＮＡ技術を適用せざるを得ない。組換えＤＮＡ技術を適用しつつ、ポリペプチドにヒト細胞におけると同様なプロセッシングを受けさせるには、宿主に哺乳類由来の細胞を用いることとなる。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２７１８９号公報
【特許文献２】特開平８−１９３０９８号公報
【特許文献３】特開平９−２８９８９６号公報（特願平８−２６９１０５号明細書）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、哺乳類由来の宿主細胞に導入したときに、当該ポリペプチドの産生を効率的に発現するＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
さらに、この発明の第二の課題は、斯かるＤＮＡを導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００７】
加えて、この発明の第三の課題は、斯かる形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者が上記諸課題を解決すべく鋭意研究したところ、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、当該ポリペプチドを効率的に発現することを見出した。しかも、この染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞で発現させて得られるポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを大腸菌で発現させて得られるポリペプチドに比較して、生理活性が有意に高いことを見出した。
【０００９】
すなわち、この発明は上記第一の課題を、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡにより解決するものである。
【００１０】
さらに、この発明は上記第二の課題を、この染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１１】
加えて、この発明は上記第三の課題を、この形質転換体を培養する工程と、培養物から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、この発明の実施の形態につき説明するが、前述のとおり、この発明は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡの発見と、その染色体ＤＮＡが哺乳類由来の宿主細胞に導入したときに、生理活性の高いポリペプチドを効率的に発現するという知見に基づくものである。この発明の染色体ＤＮＡは、通常、２個以上のエクソンを含んでなり、そのうちの１個又は２個以上のエクソンは配列表における配列番号２に示す塩基配列の一部又は全部を有する。斯かるエクソンの具体例としては、例えば、配列表における配列番号３及び４に示す塩基配列のものが挙げられる。ヒトに由来する染色体ＤＮＡは、それ以外に、例えば、配列表における配列番号５乃至７に示す塩基配列のエクソンを含んでなることがある。この発明の染色体ＤＮＡは、哺乳類の染色体ＤＮＡに由来するものであるが故に、哺乳類の染色体ＤＮＡに特徴的なイントロンを含んでなる。イントロンは、通常、２個以上存在し、個々のイントロンとしては、例えば、配列表における配列番号８乃至１２に示す塩基配列のものが挙げられる。
【００１３】
この発明の染色体ＤＮＡのさらに具体的な例としては、例えば、配列表における配列番号１３及び１４に示す塩基配列及びその塩基配列に相補的な塩基配列を有するものが挙げられる。配列表における配列番号１３に示す塩基配列も、配列番号１４に示す塩基配列も本質的に変わるところはなく、例えば、配列番号１４に示す塩基配列はその第１５，６０７乃至１５，６８５番目、第１７，０５７乃至１７，０６８番目及び２０，４５２乃至２０，４６８番目にリーダーペプチドをコードする領域を、第２０，４６９乃至２０，５８６番目、第２１，９２１乃至２２，０５４番目及び第２６，８２８乃至２７，０４６番目に配列表における配列番号１に当該ポリペプチドをコードする領域を、そして、第１５，６８６乃至１７，０５６番目、第１７，０６９乃至２０，４５１番目、第２０，５８７乃至２１，９２０番目及び第２２，０５５乃至２６，８２７番目にイントロンに相当する領域をそれぞれ含んでなる。なお、配列表における配列番号１３に示す塩基配列の染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞中で当該ポリペプチドを発現させるのに好適である。
【００１４】
ところで、斯界においては、一般に、あるポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主中で発現させるに際し、そのＤＮＡの発現効率を改善したり、あるいは、ポリペプチドそのものの物性を改善する目的で、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換したり、ＤＮＡに適宜のプロモーターやエンハンサーを連結することがある。この発明の染色体ＤＮＡにおいても斯かる改変は当然あり得ることであり、具体的には、最終的に得られるポリペプチドの生理活性を実質的に変更しない範囲で、例えば、配列表における配列番号３乃至１４に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換したり、配列番号３、４、５、６、７、１３及び１４に示す塩基配列における５´末端及び／又は３´末端の非翻訳領域やリーダーペプチドに相当する領域を切除したり、あるいは、配列番号１３に示す塩基配列の一端又は両端に適宜オリゴヌクレオチドを連結した場合であっても、当然、この発明の染色体ＤＮＡに包含されることは言うまでもない。
【００１５】
この発明でいう染色体ＤＮＡとは、上記のごとき塩基配列を含んでなる染色体由来のＤＮＡ全般を包含するものとし、それが元の生体から一旦単離されたものであるかぎり、その出所・由来は問わない。この発明の染色体ＤＮＡを得るには、例えば、配列表における配列番号２乃至１４に示す塩基配列に基づき化学合成するか、あるいは、ヒトの染色体ＤＮＡから単離する。ヒトの染色体ＤＮＡから単離するには、常法にしたがってヒト細胞から染色体ＤＮＡを分離する一方、配列表における配列番号２に示す塩基配列の一部又は全部を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、これをプローブ又はプライマーにして染色体ＤＮＡを検索し、顕著な会合を示すＤＮＡを採取する。いずれにしても、この発明の染色体ＤＮＡは、一旦これを入手すれば、常法にしたがって自律複製可能なベクターとの組換えＤＮＡを作製し、この組換えＤＮＡを微生物や動物由来の適宜宿主に導入して培養するか、あるいは、ＰＣＲ法を適用すれば、無限に複製可能である。
【００１６】
この発明の染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、生理活性の高いポリペプチドを効率的に発現するので、組換えＤＮＡ技術による当該ポリペプチドの製造に極めて有用である。この発明は特定の染色体ＤＮＡを用いるポリペプチドの製造方法をも提供するものであり、この発明の製造方法は、当該染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体を培養する工程と、培養物から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程を含んでなる。
【００１７】
この発明によるポリペプチドの製造方法について説明すると、当該染色体ＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主細胞に導入される。組換えＤＮＡはこの発明の染色体ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、染色体ＤＮＡさえ入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。この発明の染色体ＤＮＡを挿入可能なベクターとしては、例えば、ｐｃＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓなどのプラスミドベクターが挙げられる。自律複製可能なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は選択マーカーなどの、この発明の染色体ＤＮＡが個々の宿主細胞において発現するための適宜塩基配列をさらに含んでなる。なお、プロモーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモーターや、あるいは、同じ特許出願人が特開平７−１６３３６８号公報に開示したインターフェロン−αプロモーターを用いるときには、形質転換体における当該染色体ＤＮＡの発現を外部刺激により人為的に制御できることとなる。
【００１８】
斯かるベクターにこの発明の染色体ＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、まず、この発明の染色体ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、つぎに、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、微生物や動物由来の宿主において無限に複製可能である。
【００１９】
宿主細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれらの変異株を始めとする、斯界において宿主として慣用されるヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞であっても、当該ポリペプチドを本来的に産生するヒトのリンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、骨髄芽球、骨髄球、顆粒球、マクロファージなどの造血系細胞や、例えば、肺癌、大腸癌、結腸癌などの固形腫瘍由来の上皮系細胞や間質系細胞であってもよい。後者の造血系細胞の具体例としては、例えば、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖｉｅｗ）』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）などに記載されている骨髄性白血病、前骨髄性白血病、単球性白血病、成人Ｔ細胞白血病及びヘアリー細胞白血病を含む白血病又はリンパ腫由来のＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６）、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）などの白血病細胞株及びそれらの変異株が挙げられる。これらの白血病細胞及び変異株は当該ポリペプチドをプロセッシングする性質が顕著なので、宿主細胞として用いると、生理活性の高いポリペプチドが容易に得られる特徴がある。
【００２０】
斯かる宿主細胞にこの発明の染色体ＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。形質転換体から当該ポリペプチドを産生するクローンを選択するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、形質転換体を培養培地で培養し、当該ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選択すればよい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などに詳述されている。
【００２１】
斯くして得られる形質転換体は、培養培地で培養すると、細胞内外に当該ポリペプチドを分泌する。培養培地としては、哺乳類由来の細胞を培養するための慣用の培養培地を用いればよく、斯かる培養培地は、通常、緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩素イオンなどの無機イオンと、細胞の代謝能力に応じた微量元素、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを加え、必要に応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長因子、細胞接着因子などを含有せしめて構成される。個々の培養培地としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙げられる。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０４乃至１×１０７個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０５乃至１×１０６個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培地と取替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養すると、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。形質転換体の種類や培養条件にもよるが、斯くして得られる培養物は、通常、当該ポリペプチドを約１乃至１００μｇ／ｍｌ含む。
【００２２】
このようにして得られた培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま用いられることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを細胞又は細胞破砕物から分離し、精製する。精製には細胞又は細胞破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドを最少のコストと労力で得ることができる。
【００２３】
前述のとおり、この発明の方法により得られるポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明の方法により得られるポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の方法により得られるポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、当該ポリペプチドの感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人による特開平９−１５７１８０号公報（特願平８−２８７２２号明細書）に詳述されている。
【００２４】
ところで、この発明の染色体ＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明の染色体ＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックリポソームや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、この状態で、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。また、養子免疫遺伝子療法においては、効果細胞にこの発明の染色体ＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入すると、腫瘍細胞に対する効果細胞の細胞障害性が高まり、養子免疫療法を強化することができる。さらに、腫瘍ワクチン遺伝子療法においては、患者から摘出した腫瘍細胞にこの発明の染色体ＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、生体外で一定数に達するまで増殖させた後、患者に自家移植するのである。移植された腫瘍細胞は患者体内においてワクチンとして作用し、強力且つ抗原特異的な抗腫瘍免疫を発揮する。斯くして、この発明の染色体ＤＮＡは、ウイルス疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患を始めとする各種疾患の遺伝子療法に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ 遺伝子治療の基礎技術』、１９９６年、羊土社発行に詳述されている。
【００２５】
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、そこで用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【実施例１】
【００２６】
＜染色体ＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
【００２７】
＜実施例１−１：部分塩基配列の決定＞
クローンテック製ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡライブラリー『ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ ＤＮＡ ＰｖｕＩＩ Ｌｉｂｒａｒｙ』を５ｎｇとり、これに１０×Ｔｔｈ ＰＣＲ反応溶液を５μｌ、２５ｍＭ酢酸マグネシウムを２．２μｌ、そして、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を４μｌそれぞれ加え、さらに、２単位／μｌのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬと２．２μｇ／μｌのＴｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの４：１の混液を１μｌ、アダプタープライマーとして５´−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３´で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを１０ピコモル、そして、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号２に示す塩基配列の第８８乃至１１５番目の配列に基づき化学合成した５´−ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。この混合物を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９４℃で２５秒間、７２℃で４分間でインキュベートするサイクルを７回繰返して反応させ、次に、９４℃で２５秒間、６７℃で４分間インキュベートするサイクルを３２回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００２８】
滅菌蒸留水で反応物を１００倍希釈した後、その１μｌをとり、これに１０×Ｔｔｈ ＰＣＲ反応溶液を５μｌ、２５ｍＭ酢酸マグネシウムを２．２μｌ、そして、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を４μｌそれぞれ加え、さらに、２単位／μｌのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬと２．２μｇ／μｌのＴｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの４：１の混液を１μｌ、ネステッドアダプタープライマーとして５´−ＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモル、アンチセンスプライマーとして上記と同様にして化学合成した５´−ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で５０μｌとした。この混合物を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９４℃で２５秒間、７２℃で４分間インキュベートするサイクルを５回繰返して反応させ、次に、９４℃で２５秒間、６７℃で４分間インキュベートするサイクルを２２回繰返してＰＣＲ反応させて当該染色体ＤＮＡにおけるＤＮＡ断片の一つを増幅した。なお、染色体ＤＮＡライブラリー及びＰＣＲ反応試薬としては、主として、クローンテック製『ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ ＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ Ｋｉｔｓ』を用いた。
【００２９】
このようにして得たＰＣＲ反応物を適量とり、これにノバジーン製プラスミドベクター『ｐＴ７ Ｂｌｕｅ（Ｒ）』を５０ｎｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼの適量を加え、さらに、１００ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を分離し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第５，１５０乃至６，７０９番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３０】
＜実施例１−２：部分塩基配列の決定＞
実施例１−１における第一回目のＰＣＲ反応において、アンチセンスプライマーとして、実施例１−１で得たＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＡＡＧＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にしてＰＣＲ反応させた。
【００３１】
滅菌蒸留水で反応物を１００倍希釈した後、その１μｌをとり、これをアンチセンスプライマーとして、実施例１−１で得たＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＧＡＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例１−１における第二回目のＰＣＲ反応と同様に反応させて当該染色体ＤＮＡにおける別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００３２】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第１乃至５，２２８番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３３】
＜実施例１−３：部分塩基配列の決定＞
クローンテック製ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡを０．５μｇとり、これに１０×ＬＡ ＰＣＲ反応溶液を５μｌと２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌそれぞれ加え、さらに、５単位／μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼと１．１μｇ／μｌ ＴａｑＳｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの１：１の混液を１μｌ、センスプライマーとして配列表における配列番号２に示す塩基配列の第４６乃至７５番目の配列に基づき化学合成した５´−ＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモル、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号２に示す塩基配列の第２１０乃至２４２番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＡＴＴＧＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。この混合物を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９８℃で２０秒間、７２℃で１０分間インキュベートするサイクルを５回繰返して反応させ、次に、９８℃で２０秒間、６８℃で１０分間インキュベートするサイクルをサイクルを重ねるたびに時間を５秒ずつ延長しながら、２５回繰返しＰＣＲ反応させ、その後、７２℃でさらに１０分間反応させて当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応試薬としては、主として、宝酒造製『ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２』を用いた。
【００３４】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第６，６４０乃至１５，６７１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３５】
＜実施例１−４：部分塩基配列の決定＞
実施例１−３におけるＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第１７５乃至２０７番目の配列に基づき化学合成した５´−ＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第３３４乃至３６０番目の配列に基づき化学合成した５´−ＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用い、さらに、ＰＣＲ反応のサイクルを、先ず、９４℃で１分間インキュベートした後、９８℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰返して反応させ、次に、７２℃で１０分間のサイクルを１回だけ反応させた以外は同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００３６】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第１５，６０４乃至２０，５４３番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３７】
＜実施例１−５：部分塩基配列の決定＞
実施例１−４におけるＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第２７３乃至３０５番目の配列に基づき化学合成した５´−ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第５００乃至５３１番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００３８】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第２０，４５６乃至２２，０４８番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３９】
＜実施例１−６：部分塩基配列の決定＞
実施例１−４におけるＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第４４９乃至４７９番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第７４５乃至７７７番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００４０】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第２１，９９６乃至２７，０６７番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４１】
＜実施例１−７：部分塩基配列の決定＞
実施例１−２における第一回目のＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第５７５乃至６０４番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にしてＰＣＲ反応させた。
【００４２】
滅菌蒸留水で反応物を１００倍希釈した後、その１μｌをとり、これをセンスプライマーとして、配列表における配列番号２に示す塩基配列の第６２４乃至６５４番目の配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例１−２における第二回目のＰＣＲ反応と同様にして当該染色体ＤＮＡにおけるさらに別のＤＮＡ断片を増幅した。
【００４３】
このＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にしてプラスミドベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌で複製した後、採取し、分析したところ、本例の組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１４に示す塩基配列の第２６，９１４乃至２８，９９４番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４４】
＜実施例１−８：全塩基配列の決定＞
同じ特許出願人が特開平８−１９３０９８号公報に開示したように、当該ポリペプチドをコードすることがすでに判明している配列表における配列番号２に示す塩基配列と、実施例１−１乃至１−７により、この発明で初めて明らかになった部分塩基配列をそれぞれ比較したところ、当該染色体ＤＮＡは、ヒトにおいて、配列表における配列番号１４に示す塩基配列を含んでなることが判明した。配列番号２に示す塩基配列が僅か４７１塩基対からなるのに対して、配列番号１４に示す塩基配列は２８，９９４塩基対と甚だ大きく、このことは、配列番号１４に示す塩基配列が真核細胞に特有のイントロンを含むことを示唆している。
【００４５】
そこで、配列表における配列番号１４に示す塩基配列において、配列番号２に示す塩基配列の一部、すなわち、エクソンがどの領域に位置しているか、さらには、イントロンに固有の供与部位であるＧＴと受容部位であるＡＧがどの領域に位置しているかを調べた。その結果、配列番号１４に示す塩基配列は少なくとも５種類のイントロンを含んでなり、個々のイントロンの塩基配列は配列番号１４に示す塩基配列の５´末端から３´末端に向かって、配列表における配列番号１０、１１、１２、８、９に示す塩基配列の順序で位置していることが判明した。したがって、それらのイントロンにおける隣接するイントロン間に位置する配列はエクソンということになり、個々のエクソンは配列表における配列番号１４に示す塩基配列の５´末端から３´末端に向かって、配列表における配列番号５、６、３、４、７に示す塩基配列の順序で位置していることになる。なお、配列番号７に示す塩基配列は、エクソン以外に、３´末端の非翻訳領域を含んでいる。
【００４６】
以上の考察に基づき決定した配列の特徴を、配列表における配列番号１４に併記した。なお、同じ特許出願人が特願平８−２６９１０５号明細書に開示したように、当該ポリペプチドは、ヒト細胞において、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列に見られるように、Ｎ末端にメチオニンではなく、チロシンを有するポリペプチドとして産生される。このことは、当該ポリペプチドをコードするヒトの染色体ＤＮＡにおいては、当該ポリペプチドをコードする領域の５´末端側にリーダーペプチド領域が連結していることを示唆している。そこで、配列表における配列番号１４に示す塩基配列においては、その第２０，４６９乃至２０，４７１番目のＴＡＣの５´末端側に位置するアミノ酸３６個をリーダーペプチドとして記載している。
【実施例２】
【００４７】
＜発現用組換えＤＮＡ ｐＢＧＨｕＧＦの調製＞
実施例１−４の方法により得た３ｎｇ／５０μｌ ＤＮＡ断片を０．０６ｎｇと実施例１−５の方法により得たＤＮＡ断片を０．０２ｎｇとり、１０×ＬＡ ＰＣＲ反応溶液を５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌそれぞれ加え、さらに、５単位／μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼと１．１μｇ／μｌ ＴａｑＳｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙの１：１の混液を１μｌ、センスプライマーとして実施例１−４のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルと、アンチセンスプライマーとして、実施例１−５のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを１０ピコモルそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。混液を９４℃で１分間インキュベートした後、先ず、９８℃で２０秒間、７２℃で７分間インキュベートするサイクルを５回繰返し、次に、９８℃で２０秒間、６８℃で７分間インキュベートするサイクルを２５回繰返してＰＣＲ反応させた。そして、反応物を常法にしたがって制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩにより切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＳｐｈＩ切断部位を両端に有する約５，９００塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【００４８】
別途、実施例１−５の方法により得たＤＮＡ断片を０．０２ｎｇと実施例１−６の方法により得たＤＮＡ断片を０．０６ｎｇそれぞれとり、これに実施例１−６のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＡＴＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして、また、センスプライマーとして、実施例１−５のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は上記と同様にＰＣＲ反応させた。そして、反応物を常法にしたがって制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｈＩにより切断し、ＮｏｔＩ切断部位とＳｐｈＩ切断部位を両端に有する約５，６００塩基対の別のＤＮＡ断片を得た。
【００４９】
次に、常法にしたがって、サイトメガロウイルスプロモーターを含んでなるインビトロジェン製プラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、得られた約５，５００塩基対のベクター断片に上記で得られた約５，９００塩基対のＤＮＡ断片と約５，６００塩基対のＤＮＡ断片をそれぞれ加え、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを作用させて２種類のＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した。得られた組換えＤＮＡを用い、実施例１−１と同様にして大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、コロニーハイブリダイゼーション法によりプラスミドベクターｐＲＣ／ＣＭＶが導入された形質転換体のコロニーを選別した。この組換えＤＮＡは『ｐＢＧＨｕＧＦ』と命名され、この組換えＤＮＡにおいては、図１に示すように、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡである配列表における配列番号１３に示す塩基配列のＤＮＡが制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位の下流に連結されていた。
【実施例３】
【００５０】
＜ＣＨＯ細胞を宿主とする形質転換体の調製＞
常法にしたがって、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、燐酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）で洗浄した後、細胞密度１×１０７個／ｍｌになるようにＰＢＳに浮遊させた。
【００５１】
次に、実施例２の方法により得た組換えＤＮＡ ｐＢＧＨｕＧＦを１０μｇとり、上記細胞浮遊液の０．８ｍｌとともにキュベットにとり、１０分間氷冷した。キュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した後、ただちにキュベットを取外し、１０分間氷冷した。細胞浮遊液をキュベットから取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３日間培養した後、培養培地にＧ−４１８を最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加え、同じ条件でさらに３週間培養した。生成した１００個余りのコロニーから４８個を選別し、その一部を４００μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）を分注しておいた培養プレートに接種し、上記と同様に１週間培養した。その後、培養プレートの各ウェルに５．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて細胞を溶解した。
【００５２】
細胞溶解物をそれぞれ５０μｌとり、グリセロールを１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により細胞溶解物中のポリペプチドを分離した。次に、分離したポリペプチドを常法にしたがってニトロセルロース膜に移取り、別途調製した、同じ出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたハイブリドーマＨ−１株の培養上清に１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去した。そして、ニトロセルロース膜を西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体を含むＰＢＳに１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素と０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬して発色させた。その発色状況に基づき、当該ポリペプチドの産生能が高い形質転換体のクローンを選別し、『ＢＧＨｕＧＦ』と命名した。
【実施例４】
【００５３】
＜形質転換体によるポリペプチドの製造と理化学的性質＞
【００５４】
＜実施例４−１：形質転換体によるポリペプチドの製造＞
実施例３の方法により得られた形質転換体ＢＧＨｕＧＦを４００μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１週間培養して増殖させた。増殖細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、マシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ ＵＳＡ）』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結した後、解凍して細胞を破砕し、破砕物を遠心分離し、上清を採取した。
【００５５】
別途、ヒト急性単球性白血病由来のＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を同様に培養し、破砕し、遠心分離して得られた上清の適量を上記で得られた形質転換体ＢＧＨｕＧＦの上清に加え、３７℃で３時間インキュベートして反応させた。反応物をあらかじめ１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）により平衡化しておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−セファロース』のカラムに負加し、カラムを１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で洗浄した後、塩化ナトリウム濃度が０Ｍから０．５Ｍまで段階的に上昇する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。この画分を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析した後、あらかじめ１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化しておいたトーソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負加し、０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００５６】
この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、これをプラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記透析内液をカラムに負加した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮した後、凍結乾燥して精製ポリペプチドの固状物を培養物１ｌ当り１５ｍｇの収率で得た。
【００５７】
＜参考例：大腸菌での発現＞
同じ特許出願人による特開平８−１９３０９８号公報に開示され、宿主としての大腸菌に配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むｃＤＮＡを導入してなる形質転換体ｐＫＨｕＧＦをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＴ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間通気攪拌培養した。遠心分離により培養物から菌体を採取し、１３９ｍＭ塩化ナトリウム／７ｍＭ燐酸水素ナトリウム／３ｍＭ燐酸水素二ナトリウム混液（ｐＨ７．２）に浮遊させ、常法にしたがって超音波を印加して菌体を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を実施例４−１の方法に準じて精製したところ、精製ポリペプチドの固状物が培養物１ｌ当り５ｍｇの収率で得られた。
【００５８】
ポリペプチドの収量に着目して本参考例と実施例４−１を比較すると、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体を用いると、培養物単位量当りのポリペプチド産生が著しく高まることを示している。
【００５９】
＜実施例４−２：ポリペプチドの理化学的性質＞
【００６０】
＜実施例４−２（ａ）：生理作用＞
ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により２倍希釈した。血液をファルマシア製フィコール上に重層し、遠心分離して採取したリンパ球を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により洗浄した後、新鮮な同一培地を細胞密度５×１０６個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１５ｍｌ／ウェルずつ分注した。
【００６１】
別途、実施例４−１の方法により得たポリペプチドを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜濃度に希釈して上記マイクロプレートに０．０５ｍｌ／ウェルずつ分注し、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを含む新鮮な同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γを測定した。同時に、実施例４−１の方法により得たポリペプチドに代えて参考例の方法により得たポリペプチドを用いる系と、ポリペプチドを省略する系を設け、両系を上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γは、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算して表示されている。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１の結果は、当該ポリペプチドを作用させると、免疫担当細胞としてのリンパ球がＩＦＮ−γを産生したことを示している。
【００６４】
さらに注目すべきは、実施例４−１の方法により得たポリペプチドは、参考例の方法により得たポリペプチドと比較して、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生が高いことである。このことと、参考例で述べたポリペプチド産生の違いを併せ考えると、同じアミノ酸配列をコードするという観点からみると実質的に同一のＤＮＡと見做し得る場合であっても、そのＤＮＡがｃＤＮＡであって、これを宿主微生物に導入してなる形質転換体と、この発明の染色体ＤＮＡを哺乳類由来の宿主細胞に導入してなる形質転換体とでは、ＤＮＡの発現効率のみならず、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、生理作用の有意に相違するポリペプチドが産生すると推定される。
【００６５】
＜実施例４−２（ｂ）：分子量＞
実施例４−１の方法により得たポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の主バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，０００ダルトン）であった。
【００６６】
＜実施例４−２（ｃ）：Ｎ末端アミノ酸配列＞
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を用い、常法にしたがって分析したところ、実施例４−１の方法により得たポリペプチドは、そのＮ末端に配列表における配列番号１５に示すアミノ酸配列を有していた。
【００６７】
この結果と、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置に主たるバンドを示すという知見、さらには、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列から計算される分子量が１８，１９９ダルトンであることを総合的に判断すると、実施例４−１の方法により得たポリペプチドは配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を有すると結論される。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上説明したように、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡの発見に基づくものである。この発明の染色体ＤＮＡは、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、当該ポリペプチドを効率的に発現する。しかも、そのポリペプチドは、ｃＤＮＡを大腸菌で発現させて得られるポリペプチドと比較して、生理活性が高い特徴がある。したがって、この発明の染色体ＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術により、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを製造するのに極めて有用である。なお、この発明の染色体ＤＮＡは、ウイルス性疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患を始めとする種々の疾患の遺伝子療法にも有用である。
【００６９】
この発明は斯くも顕著な効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】この発明の染色体ＤＮＡを含む組換えＤＮＡの制限酵素切断部位を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの切断部位
ＨｕＩＧＩＦ この発明による染色体ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１３に示す塩基配列を含有する染色体ＤＮＡを適宜のベクターに組み込み、それを哺乳類由来の適宜の宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を培養して培養物を得る工程と、当該培養物を破砕して抽出上清液を得る工程と、当該抽出上清液から、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含有し、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
配列表における配列番号１３に示す塩基配列を含有する染色体ＤＮＡを適宜のベクターに組み込み、それを哺乳類由来の適宜の宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を培養して培養物を得る工程と、当該培養物を破砕して抽出上清液を得る工程と、当該抽出上清液をヒト急性単球性白血病由来の細胞株の抽出上清液に接触させる工程と、得られた混合液から配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含有し、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法。
【請求項１】
配列表における配列番号１３に示す塩基配列を含有する染色体ＤＮＡを適宜のベクターに組み込み、それを哺乳類由来の適宜の宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を培養して培養物を得る工程と、当該培養物を破砕して抽出上清液を得る工程と、当該抽出上清液から、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含有し、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
配列表における配列番号１３に示す塩基配列を含有する染色体ＤＮＡを適宜のベクターに組み込み、それを哺乳類由来の適宜の宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を培養して培養物を得る工程と、当該培養物を破砕して抽出上清液を得る工程と、当該抽出上清液をヒト急性単球性白血病由来の細胞株の抽出上清液に接触させる工程と、得られた混合液から配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含有し、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１３５６０６（Ｐ２００７−１３５６０６Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４５４４３（Ｐ２００７−４５４４３）
【出願日】平成１９年２月２６日（２００７．２．２６）
【分割の表示】特願平９−１８７４１８の分割
【原出願日】平成９年６月２７日（１９９７．６．２７）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２６日（２００７．２．２６）
【分割の表示】特願平９−１８７４１８の分割
【原出願日】平成９年６月２７日（１９９７．６．２７）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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