免疫治療用オリゴヌクレオチドおよびサイトカインを用いる免疫系刺激のための方法および産物
【課題】本発明は、免疫刺激的ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの相乗作用的組み合わせに関する。
【解決手段】詳細には、本発明は、化合物およびそれに関する産物の相乗作用的な組み合わせを用いる免疫応答刺激の方法に関する。被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、以下：少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの相乗効果的な抗原特異的免疫応答を誘導するために
有効な量を、抗原に曝露された被験体に投与する工程であって：５’Ｘ1ＣＧＸ2３’ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレオチドである工程、を含む、方法。
【解決手段】詳細には、本発明は、化合物およびそれに関する産物の相乗作用的な組み合わせを用いる免疫応答刺激の方法に関する。被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、以下：少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの相乗効果的な抗原特異的免疫応答を誘導するために
有効な量を、抗原に曝露された被験体に投与する工程であって：５’Ｘ1ＣＧＸ2３’ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレオチドである工程、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの
相乗効果的組み合わせに関する。詳細には、本発明は、化合物およびそれに関連
する産物の相乗効果的組み合わせを用いる免疫応答の刺激方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫監視機構の理論は、免疫系の主要機能が、腫瘍形成の前に腫瘍性細胞を検
出し、そして排除することであるということである。この理論の基礎的な原理は
、癌の細胞が正常な細胞とは抗原的に異なり、従って、免疫学的に不適合の同種
移植片の拒絶を起こす免疫反応と類似する免疫反応を惹起することである。いく
つかの研究が、腫瘍細胞は、抗原の発現において、量的にかまたは質的にのいず
れかで異なることを確認した。例えば、「腫瘍特異的抗原」は、腫瘍細胞とは特
異的に関連するが正常細胞とは関連しない抗原である。腫瘍特異的抗原の例は、
ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスによって誘発される腫瘍におけるウイルス
抗原である。「腫瘍関連」抗原は、腫瘍細胞および正常細胞の両方に存在するが
、腫瘍細胞においては、異なる量または異なる形態で存在する。このような抗原
の例は、腫瘍胎児性抗原（例えば、癌胎児抗原）、分化抗原（例えば、Ｔ抗原お
よびＴｎ抗原）、および癌遺伝子産物（例えば、ＨＥＲ／ｎｅｕ）である。
【０００３】
インビトロおよびインビボで腫瘍標的を殺傷し得る異なる型の細胞は、同定さ
れている：ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ
）、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）および活性化マクロファージ。
ＮＫ細胞は、事前に特定抗原に感作されることなく、腫瘍細胞を殺傷し得、そし
て活性は、標的細胞上での主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードさ
れるクラスＩ抗原の存在を必要としない。ＮＫ細胞は、新生の腫瘍の制御に、お
よび転移性増殖の制御に関与すると考えられる。ＮＫ細胞と対照的に、ＣＴＬは
、ＣＴＬが腫瘍抗原に感作された後で、そしてその標的抗原が、ＭＨＣクラスＩ
も発現する腫瘍細胞上で発現される場合のみ、腫瘍細胞を殺傷し得る。ＣＴＬは
、移植された腫瘍およびＤＮＡウイルスにより生じた腫瘍の拒絶において、エフ
ェクター細胞であると考えられる。ＬＡＫ細胞は、ＮＫおよびＣＴＬ集団とは異
なるヌルリンパ球のサブセットである。活性化マクロファージは、一旦活性化さ
れると、抗原依存性でもなくＭＨＣ拘束でもない様式で腫瘍細胞を殺傷し得る。
活性化マクロファージは、それが浸潤する腫瘍の増殖速度を減じると考えられる
。インビトロアッセイは、他の免疫機構（例えば、抗体依存性、細胞媒介性細胞
傷害性反応および抗体プラス補体による溶解）を同定した。しかし、これらの免
疫エフェクター機構は、インビボにおけるＮＫ、ＣＴＬ、ＬＡＫおよびマクロフ
ァージの機能よりも、インビボにおいてより重要度が低いと考えられる（概説と
しては、Ｐｉｅｓｓｅｎｓ，Ｗ．Ｆ．およびＤａｖｉｄ，Ｊ．「Ｔｕｍｏｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ，第２巻、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎ．Ｙ
．，１〜１３頁，１９９６を参照のこと）。
【０００４】
癌の免疫学における最も複雑な現象の１つは、腫瘍を排除するための免疫系の
不全に関する。１９７０年代に、Ｈｅｗｉｔｔは、ほとんどの腫瘍がどんな腫瘍
特異的抗原もネオ抗原も発現せず、従って、免疫系により「外来」として認識さ
れ得ないという概念を示した。実際のところ、腫瘍特異的であることが見出され
た、抗体により認識される腫瘍細胞表面抗原は実際にはなく、さらに、ほとんど
の自然発症のマウス腫瘍は、同系の宿主に移植された場合にその腫瘍が排除され
得ないことにより規定されるように、「免疫原性に乏しい」と考えられた（Ｈｅ
ｗｉｔｔら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３：２４１〜２５９、１９７６）。し
かし、これらの同じ腫瘍は、新しい抗原が腫瘍細胞表面で発現される場合、変異
誘発によって「免疫原性」を与えられ得る（Ｖａｎ Ｐｅｌ ａｎｄ Ｂｏｏｎ
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４７１８〜４７２２
，１９８２）。免疫系は、ネオ抗原が存在しないことによってではなく、むしろ
インビボにおいて抗原への応答が不十分であることによって腫瘍を排除し得ない
という可能性がある。従って、腫瘍細胞への宿主の免疫応答を増強することによ
る腫瘍細胞の免疫原性を増強するための方法は、免疫療法において重要な進歩を
提供する。
【０００５】
免疫療法の目的は、樹立された腫瘍に対する患者の免疫応答を増強することで
ある。免疫療法の１つの方法としては、アジュバントの使用が挙げられる。微生
物（例えば、ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ）に由来する
アジュバント物質は、免疫応答を高め、そして動物における腫瘍への耐性を増強
する。ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎは、多数の臨床試験
で試験されたが、結果は定まっておらず、そしてこの型の細菌アジュバント療法
の価値は未定のままである（Ｐｉｅｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ，１９９６
、前出）。
【０００６】
多数の細菌産物（例えば、リポ多糖）は、哺乳動物の免疫応答を刺激すること
が公知である。最近、細菌ＤＮＡ自体が、そのような分子の１つであることが報
告されている（例えば、Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７
４：５４６〜９）。細菌ＤＮＡ（強力な免疫刺激因子効果を有する）と脊椎動物
ＤＮＡ（その効果を持たない）との間の主要な差異の１つは、細菌のＤＮＡが、
脊椎動物ＤＮＡが含むよりも、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのより高い頻度
を含むことである。非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含む選択合
成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、免疫学的効果を有し、そしてＢ細
胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、単球およびマクロファー
ジ）の活性化を誘導し得ることが示されている（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら、前出
）。これはまた、活性な免疫応答の発生に参加することが公知のサイトカインの
産生を増強し得る。これには、腫瘍壊死因子−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−６が
挙げられる（例えば、Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２８７９〜２８８３，１９９６）。
【０００７】
細胞へのＤＮＡの結合は、リガンドレセプター相互作用と類似していることが
示されている：結合は、飽和可能、競合的であり、そしてＤＮＡエンドサイトー
シスおよびオリゴヌクレオチドへの分解を導く（Ｂｅｎｎｅ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２、１９９５）。ＤＮＡのように、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドは、配列、温度およびエネルギーと独立しているプ
ロセスで細胞に入り得る（ＪａｒｏｓｚｅｗｓｋｉおよびＣｏｈｅｎ，Ａｄ．Ｄ
ｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．６：２３５，１９９１）。リンパ球オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド取り込みは、細胞活性化により調節されることが示されている（
Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１６１，１９９１）。
【０００８】
ＧＭ−ＣＳＦは、基本条件およびストレス条件の下で、細胞増殖を調節するこ
とが公知であり、そしてマクロファージの腫瘍殺傷能力を活性化することが公知
である。いくつかの研究は、ＧＭ−ＣＳＦおよび標準的誘導化学療法の同時処置
が、化学療法の効力を改善し得ることを示す（Ｅｓｔｅｙ，Ｅ．Ｈ．Ｂｌｏｏｄ
８３：２０１５，１９９４）。コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の
主な利点は、化学療法の合併症の１つである汎血球減少症の処置におけるそれら
の使用であると仮定されている（ＰｉｅｓｓｅｎｓおよびＤａｖｉｄ，１９９６
、前出）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサイトカインの組み合わせを用い
る、相乗効果的な免疫応答を誘導するための方法および産物に関する。１つの局
面では、本発明は、被験体において免疫応答を刺激するための方法である。この
方法は、抗原に曝露された被験体に、相乗効果的抗原特異的免疫応答を誘導する
のに有効な量の、免疫増強サイトカインおよび免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ド（少なくとも以下の式を含む配列を有する）を投与する工程を含む：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドである。
【００１０】
このサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−１
２またはインターフェロンγであり得る。この免疫増強サイトカインはまた、抗
原−サイトカイン融合タンパク質であり得る。好ましい実施態様において、この
抗原−サイトカイン融合タンパク質は、抗原−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質であ
る。
【００１１】
この抗原は、当該分野で公知の任意の型の抗原であり得る。１つの実施態様に
おいて、この抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる群から選
択される。好ましくは、この抗原は、腫瘍抗原である。この実施態様において、
被験体は、腫瘍性の障害を有し得る。１つの実施態様において、この抗原は、ウ
イルス抗原であり、そして被験体は、ウイルス感染を有するかまたは、その危険
性にある。
【００１２】
いくつかの実施態様において、この抗原は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドおよび免疫増強サイトカインを組み合わせて、被験体に投与される。他の実施
態様では、この被験体は、抗原に受動的に曝露される。
【００１３】
他の局面では、本発明は、少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激Ｃ
ｐＧオリゴヌクレオチド、そしてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦａ、Ｆｌｔ３
リガンドおよびＩＬ−３からなる群から選択されるサイトカインの、樹状細胞を
相乗効果的に活性化するために有効な量の組成物であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドである。好ましくはサイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。
【００１４】
この組成物はまた、抗原を含み得る。いくつかの実施態様において、この抗原
は、癌抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる群から選択される。
【００１５】
本発明の別の局面に従って、樹状細胞を活性化するための方法が提供される。
この方法は、抗原に曝露される樹状細胞を、少なくとも以下の式を含む配列を有
する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの、相乗効
果的に樹状細胞を活性化するために有効な量と接触させる工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドである工程、を含む。
【００１６】
このサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−１
２またはインターフェロンγであり得る。この免疫増強サイトカインはまた、抗
原−サイトカイン融合タンパク質であり得る。好ましい実施態様において、この
抗原−サイトカイン融合タンパク質は、抗原−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質であ
る。
【００１７】
この抗原は、当該分野で公知の任意の型の抗原であり得る。１つの実施態様に
おいて、この抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる群から選
択される。好ましくは、この抗原は、腫瘍抗原である。この実施態様において、
被験体は、腫瘍性の障害を有し得る。他の実施態様において、この抗原は、ウイ
ルス抗原であり、そして被験体は、ウイルス感染を有するかまたは、その危険性
にある。
【００１８】
別の局面に従って、本発明は、腫瘍性の障害を有する被験体を処置するための
方法である。この方法は、少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインを、腫瘍性障害を有する被験
体の腫瘍に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドであり、ここで、投与量は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは免
疫増強サイトカイン単独を投与された被験体に関して被験体の生存時間を相乗効
果的に延長するために有効な量である、工程を含む。
【００１９】
好ましくは、この腫瘍は、脳、肺、卵巣、乳房、前立腺、結腸、皮膚および血
液の腫瘍からなる群から選択される。１つの実施態様では、免疫刺激ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは、腫瘍に直接注射される。
【００２０】
本発明の別の局面において、避妊方法が提供される。この方法は、抗原、免疫
増強サイトカインおよび少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧ
オリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドであり、ここでこの抗原は、生殖腺細胞抗原、ならびに生殖線細胞の維
持のために必要な、サイトカインまたはホルモン由来の抗原からなる群から選択
される抗原である工程、を含む。
以上から、本発明は、以下をも含むことが理解される。
（１） 被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、以
下：
少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドお
よび免疫増強サイトカインの相乗効果的な抗原特異的免疫応答を誘導するために
有効な量を、抗原に曝露された被験体に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである工程、
を含む、方法。
（２） 前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、Ｉ
Ｌ−１２およびインターフェロンγからなる群から選択される、項目１に記載
の方法。
（３） 前記免疫増強サイトカインが抗原−サイトカイン融合タンパ
ク質である、項目１に記載の方法。
（４） 前記抗原−サイトカイン融合タンパク質が抗原−ＧＭ−ＣＳ
Ｆ融合タンパク質である、項目３に記載の方法。
（５） 前記抗原が腫瘍抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる
群から選択される、項目１に記載の方法。
（６） 前記抗原が腫瘍抗原である、項目５に記載の方法。
（７） 前記抗原が前記免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび前
記免疫増強サイトカインを組み合わせて、前記被験体に投与される、項目１に
記載の方法。
（８） 前記被験体が前記抗原に受動的に曝露される、項目１に記
載の方法。
（９） 前記被験体が腫瘍性の障害を有する、項目１に記載の方法
。
（１０） 前記被験体がウイルス性の感染を有する、項目１に記載
の方法。
（１１） 組成物であって、以下：
少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチド：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである；ならびに
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦａ、Ｆｌｔ３リガンドおよびＩＬ−３からな
る群から選択されるサイトカイン、
の樹状細胞を相乗効果的に活性化するために有効な量を含む、組成物。
（１２） 前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである、項目１１に記
載の組成物。
（１３） 抗原をさらに含む、項目１１に記載の組成物。
（１４） 前記抗原が、癌抗原、微生物抗原およびアレルゲンからな
る群から選択される、項目１３に記載の組成物。
（１５） 樹状細胞を活性化するための方法であって、以下：
抗原に曝露される樹状細胞を、少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺
激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの相乗効果的に樹状細
胞を活性化するために有効な量と接触させる工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである工程、
を含む、方法。
（１６） 前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、
ＩＬ−１２およびインターフェロンγからなる群から選択される、項目１５に
記載の方法。
（１７） 前記抗原が腫瘍抗原である、項目１５に記載の方法。
（１８） 腫瘍性の障害を有する被験体を処置するための方法であっ
て、以下：
少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドお
よび免疫増強サイトカインを、腫瘍性の障害を有する被験体の腫瘍に、免疫刺激
ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは免疫増強サイトカイン単独を投与された被験体
に関して被験体の生存時間を相乗効果的に延長するために有効な量で投与する工
程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである工程、
を含む、方法。
（１９） 前記腫瘍が脳、肺、卵巣、乳房、前立腺、結腸、皮膚およ
び血液の腫瘍からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（２０） 前記免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび前記免疫増
強サイトカインが腫瘍に直接注射される、項目１８に記載の方法。
（２１） 避妊方法であって、以下：
抗原、免疫増強サイトカインおよび少なくとも以下の式を含む配列を有する免
疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドであり、ここで該抗原は、生殖腺細胞抗原、ならびに生殖線細胞の維持の
ために必要なサイトカインまたはホルモン由来の抗原からなる群から選択される
抗原である工程、
を含む、方法。
【００２１】
本発明のそれぞれの限定は、本発明の種々の実施態様を包含し得る。従って、
任意の１つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む本発明のそれぞれ
の限定が、本発明のそれぞれの局面に含まれ得ることが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、被験体における免疫応答を刺激するための方法および産物に関する
。本発明に従って、免疫増強化合物の組み合わせに対する相乗的な応答を達成し
得ることを発見した。これらの相乗的な効果は、インビトロ、インビボおよびエ
キソビボで観察された。生存率の相乗的な増加は、確立された腫瘍を有する動物
においてさえも観察された。本方法は、抗原に曝露された被験体に、相乗的な抗
原特異的免疫応答を誘導するのに有効量の免疫増強サイトカインおよび免疫刺激
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与することにより行われる。
【００２３】
この知見は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、免疫増強サイトカインと
組み合わせて被験体に投与した場合、生じた免疫応答が相乗的であるという発見
に基づく。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは両方とも、
被験体に投与された場合、独力で免疫応答を生じる能力を有する。しかし、この
２つの組み合わせが共に投与された場合、免疫応答の量および型はシフトする。
例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインを、図３に示さ
れるように、反復免疫を使用して抗原と組み合わせて投与する場合、抗原特異的
なＩｇＧの相乗的な誘導が観察される。さらに、ＣｐＧおよびＧＭ−ＣＳＦを共
に投与した場合、抗体応答はＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１免疫応答の指標）およびＩｇＧ
１（Ｔｈ２免疫応答の指標）の両方を含む免疫応答を発生するのに対して、ＧＭ
−ＣＳＦを単独で投与する場合、ＩｇＧ２ａ抗体が動物の系に依存して検出不可
能であるか、または低い。
【００２４】
驚くべきことに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドと免疫増強サイトカインとの組み
合わせは、腫瘍接種後の数日間投与した場合でさえ、腫瘍を注射した動物の生存
率に関して劇的な効果を有する。この知見は、薬物の組み合わせが確立した腫瘍
を排除し得ることを実証したので、注目すべきことであった。代表的な先行技術
免疫ストラテジーは、一般に、腫瘍の確立を防止するために接種の前に行われる
。マウスに腫瘍を注射しそして続いていずれの腫瘍治療も与えなかった場合、そ
の生存率は０％であった。ＣｐＧオリゴヌクレオチド単独、またはＧＭ−ＣＳＦ
および抗原で処置したマウスは、それぞれ、０％および３０％の生存率を有した
。ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせは、７０％という劇
的な生存率を生じた。この知見は、確立した腫瘍の処置について、ならびに腫瘍
発達の防止について重大な意味を有する。
【００２５】
本発明は１つの局面において、被験体における免疫応答を刺激するための方法
である。本方法は、抗原に曝露された被験体に、相乗的な抗原特異性免疫応答を
誘導するために有効量の免疫増強サイトカインおよび免疫刺激ＣｐＧオリゴヌク
レオチドを投与することにより行われる。免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドは
、少なくとも以下の式を含む配列を有する：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは少なくとも８つのヌクレオチドを含み、Ｃお
よびＧはメチル化されておらず、そしてＸ1およびＸ2はヌクレオチドである。
【００２６】
本明細書中で使用される「抗原」は、免疫応答を引き起こし得る分子である。
抗原としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：細胞、細胞抽出物、多
糖、多糖結合体、脂質、糖脂質、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ウイルス、
およびウイルス抽出物。用語抗原は、宿主免疫系により外来であるとして認識さ
れる任意の型の分子を広範に含む。抗原としては、癌抗原、微生物抗原、および
アレルゲンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明の方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することにより
癌を処置するために有用である。本明細書中で使用されるような「癌抗原」は、
腫瘍または癌細胞の表面に会合する化合物（例えば、ペプチド）であり、そして
この化合物は、ＭＨＣ分子に関連する抗原提示細胞の表面上に発現された場合、
免疫応答を引き起こし得る。癌抗原を、癌細胞の粗抽出物を調製すること（例え
ば、Ｃｏｈｅｎら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５
５に記載される）、これらの抗原を部分的に精製すること、組換え技術、または
公知の抗原のデノボ合成のいずれかによって、癌細胞から調製し得る。癌抗原と
しては、腫瘍または癌の免疫原性部分である抗原または腫瘍全体もしくは癌全体
である抗原が挙げられる。このような抗原は、単離され得るか、または組換え的
にもしくは当該分野で公知の任意の他の手段によって調製され得る。癌または腫
瘍は、以下を含むがそれらに限定されない：胆管癌；脳癌；乳癌；頸部癌；絨毛
癌；結腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；表皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌
（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽腫；口腔癌（ｏｒａｌ ｃ
ａｎｃｅｒ）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲
状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫。
【００２８】
腫瘍は抗原性であり、そして免疫学的な破壊に感受性であり得る。用語「腫瘍
」は、通常、新生物と同一視され、これは文字通り「新生物（ｎｅｗ ｇｒｏｗ
ｔｈ）」を意味し、そして「癌」と交換可能に使用される。「新生物障害」は、
細胞増殖、特に、新生物に関連する任意の障害である。「新生物」は、その出現
を開始した発癌性因子の撤退後に持続しそして増殖する組織の異常な塊である。
２つの型の新生物、すなわち、良性および悪性が存在する。ほとんど全ての良性
腫瘍は被包化され、そして非侵襲性である；対照的に、悪性腫瘍はほとんど全く
被包化されず、浸潤性の破壊性増殖により隣接する組織を浸潤する。この浸潤性
増殖に続いて、腫瘍細胞は、最初の腫瘍と不連続な部位にインプラントし得る。
本発明の方法を使用して、ヒトにおける新生物障害を処置し得る。この新生物障
害としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：肉腫、癌種、線維種、リ
ンパ腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、および神経膠腫、ならびに本明細書中に
記載される他の腫瘍の各々。
【００２９】
本発明はまた、ヒト以外の被験体における癌および腫瘍を処置するために使用
され得る。癌は、愛玩動物（すなわち、ネコおよびイヌ）における死を導く原因
の１つである。癌は、通常、ハウスペットの場合、家族の一員となっている高齢
の動物を襲う。１０歳より高齢の４５％のイヌが、この疾患に屈するようである
。最も通常の処置選択としては、手術、化学療法および放射線治療が挙げられる
。ある程度の成功をもって使用されてきた他の処置様式は、レーザー治療、寒冷
療法、温熱療法および免疫療法である。処置の選択は、癌の型および汎発の程度
に依存する。悪性増殖が身体において別々の領域に制限されなければ、また正常
細胞に影響を及ぼさないで悪性組織のみを取り除くことは困難である。
【００３０】
イヌおよびネコにおいて通常診断される悪性障害としては、以下が挙げられる
がそれらに限定されない：リンパ肉腫、骨肉腫、乳房腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍
、黒色腫、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支癌、線
維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽腫、ユーイング肉
腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小グリア細胞腫、神経芽腫、骨巨細
胞腫、口腔新生物、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫。イヌにおける他の新生
物としては、生殖器扁平上皮癌、感染性静脈腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルト
リ細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫
、角膜扁平上皮癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副
腎癌、口腔乳頭腫、血管内皮腫および嚢胞腺腫。ネコにおいて診断されるさらな
る悪性としては、濾胞リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫および肺扁平上皮癌が
挙げられる。さらにより流行のハウスペットであるフェレットは、インスリノー
マ、リンパ腫、肉腫、神経腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫
および胃腺癌を発生することが公知である。
【００３１】
農業家畜が発症する新生物としては、以下が挙げられる：（畜牛においては）
白血病、血管周囲細胞腫およびウシ眼球新生物（ｂｏｖｉｎｅ ｏｃｕｌａｒ
ｎｅｏｐｌａｓｉａ）；（ウマにおいては）包皮線維肉腫、潰瘍性扁平上皮癌、
包皮癌、結合組織新生物および肥満細胞腫；（ブタにおいては）肝細胞癌；（ヒ
ツジにおいては）リンパ腫および肺腺腫症；（鳥類においては）肺肉腫、リンパ
腫、ラウス肉腫、網状内皮症（ｒｅｔｉｃｕｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ）、
線維肉腫、腎芽腫、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ性白血病；網膜芽腫、肝性新生
物（ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ
腫）、プラズマ細胞白血病（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）お
よび浮き袋肉腫（ｓｗｉｍｂｌａｄｄｅｒ ｓａｒｃｏｍａ）（魚類において）
、乾酪性リンパ節炎（ｃａｓｅｏｕｓ ｌｕｍｐｈａｄｅｎｉｔｉｓ）（ＣＬＡ
）：細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓにより引き起こされるヒツジおよびヤギの慢性性疾患、感染性疾患、伝染性
疾患、ならびに肺線腫症により引き起こされるヒツジの伝染性肺腫瘍。
【００３２】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および抗原提示細胞（例え
ば、単球およびマクロファージ）の活性化において有用であり得る。ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、抗体依存性細胞傷害性を増大し、そして腫瘍チャレンジに対
して防御するために、腫瘍抗原と組み合わせてアジュバントとして使用され得る
（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ら，１９８７，前出；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ
．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１０８３３−１
０８３７，１９９７）。本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サ
イトカインが、腫瘍に対する免疫応答を生じるために相乗的に作用し、その結果
、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強剤の効果は、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チドまたは免疫増強剤のいずれかの個々の効果の合計よりも大きいという知見に
基づく。
【００３３】
本発明の方法において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫増強サイトカイン
と共に使用される。「免疫増強サイトカイン」は、体液性免疫応答および／また
は細胞性免疫応答を刺激する分子および化合物である。用語「サイトカイン」は
、体液性調節因子としてナノモル〜ピコモル濃度で作用し、そして正常状態また
は病的状態のいずれかで個々の細胞および組織の機能的な活性を調節する、多様
な群の可溶性のタンパク質およびペプチドに対する一般的な名称として使用され
る。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接的に媒介し、そして細
胞外環境で起こるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、以下が挙げ
られるがそれらに限定されない：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）
、インターフェロンγ（γ−ＩＮＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、
ＦＬＴ−３リガンド、およびＣＤ４０リガンド。
【００３４】
ＦＬＴ３リガンドは、ＥＰ０６２７４８７Ａ２およびＷＯ９４／２８３９１に
記載される化合物のクラスである。ヒトＦＬＴ３リガンドｃＤＮＡは、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ６
９３８２を与えられた。インターロイキン（Ｉｌ）は、当該分野において広範に
記載されている（例えば、Ｍｏｓｌｅｙら，１９８９，Ｃｅｌｌ，５９：３３５
，Ｉｄｚｅｒｄａら，１９９０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：８６１）。
ＧＭ−ＣＳＦは、サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｎｅ）ロイキン（
ｌｅｕｋｉｎｅ）（Ｉｍｍｕｎｅｘ）として市販されている。
【００３５】
サイトカインは、Ｔ細胞応答の指向に役割を果たす。ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ
細胞は、他の免疫系細胞（他のＴ細胞を含む）に対して作用する可溶性因子の産
生を介して哺乳動物の免疫応答を統合する。ほとんどの成熟ＣＤ４＋Ｔヘルパー
細胞は、２つのサイトカインのプロフィールのうちの一方を発現する：Ｔｈ１ま
たはＴｈ２。Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−
９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦおよび低レベルのＴＮＦ−αを発現
する。ＴＨ１サブセットは、遅延型過敏症、細胞媒介免疫、および免疫グロブリ
ンのＩｇＧ2aへのクラス切り替えを促進する。Ｔｈ２サブセットは、Ｂ細胞を活
性化し、抗体産生を促進し、そしてＩｇＧ1およびＩｇＥへのクラス切り替えを
誘導することにより体液性免疫を誘導する。
【００３６】
腫瘍は「腫瘍特異的抗原」を発現し得、これは、明らかに、腫瘍特異的免疫応
答を強力に刺激し得る抗原である。これらの抗原は正常な遺伝子によりコードさ
れ得、そして以下のいくつかのカテゴリーに分類される：（１）正常なサイレン
トな遺伝子、（２）分化抗原、（３）胚性抗原および胎児性抗原、ならびに（４
）クローン抗原。これらは、少数の正常細胞（例えば、腫瘍が起源する細胞）で
のみ発現される。腫瘍特異的抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓ癌
遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、ｐ５３変異体）のような変異体細胞遺伝子によ
ってコードされ得る。融合タンパク質は、内部欠失または染色体転位から生じる
。腫瘍特異的抗原はまた、ウイルス遺伝子（例えば、ＲＮＡ腫瘍ウイルスまたは
ＤＮＡ腫瘍ウイルス）によりコードされ得る。
【００３７】
リンパ腫の処置において、分泌された免疫グロブリンのイディオタイプは、非
常に特異的な腫瘍関連抗原として作用する。「イディオタイプ」とは、特異的な
抗体または限定されたセットの抗体に対して特異的なＶ領域決定基のコレクショ
ンを意味する。１つの実施態様において、免疫増強サイトカインは、免疫増強サ
イトカインに融合された、リンパ腫により分泌された特定の抗原イディオタイプ
からなるタンパク質（融合タンパク質）である。抗原−サイトカイン融合タンパ
ク質を生成する方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ
．，Ｌｅｖｙ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７５５−７５８，１９９３を参照
のこと）。１つの実施態様おいて、融合タンパク質は、抗原−ＧＭ−ＣＳＦ融合
タンパク質である。
【００３８】
本発明の方法はまた、感染性疾患を処置するために有用である。感染性疾患は
、本明細書中で使用される場合、身体中の外来微生物の存在から生じる疾患であ
る。ＣｐＧおよび免疫増強サイトカインを使用して、微生物の抗原に対するＴ細
胞応答またはＢ細胞応答を活性化し得る抗原特異的な免疫応答を刺激する。本方
法は、抗原が微生物に特異的であることを除いて微生物抗原を使用して、腫瘍に
対して上記と同様の方法で達成される。「微生物抗原」は、本明細書中で使用さ
れる場合、微生物の抗原であり、そして感染性ウイルス、感染性細菌、および感
染性真菌を含むがこれらに限定されない。このような抗原は、完全微生物、なら
びに天然の単離物、およびそれらのフラグメントもしくは誘導体を含み、そして
また、天然の微生物抗原に対して同一または類似する合成化合物を含む。これら
の抗原は、微生物に対して特異的な免疫応答を誘導する。化合物が天然の微生物
抗原に対して免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、この化
合物は天然の微生物抗原に類似する。このような抗原は、当該分野において規定
的に使用され、そして当業者に周知である。
【００３９】
ヒトにおいて見出されている感染性ウイルスの例としては、以下が挙げられる
がそれらに限定されない：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全疾
患ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ
−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとしても言及される）；および他の分
離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオ
ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、
ライノウイルス、ＥＣＨＯウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃
腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、
風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイ
ルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイル
ス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイ
ルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄ
ｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏ
ｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ
（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイル
ス、ＲＳウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエ
ンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンターンウイルス、ブ
ンヤウイルス（ｂｕｎｇａ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイル
ス（Ｎａｉｒｏ ｖｉｒｕｓ））；Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイル
ス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロ
タウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ
型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａ
ｖｉｒｉｄａｅ（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉ
ｄａｅ（主要なアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペス
ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワ
クシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉａｅ（例え
ば、アフリカ豚コレラウイルス）；ならびに分類されていないウイルス（例えば
、海綿状脳障害の病因論的因子、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損
サテライトであると考えられる）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部遺
伝；クラス２＝親遺伝）（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび
関連ウイルス、ならびにアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ））。
【００４０】
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌はともに、脊椎動物において抗原として
作用する。このようなグラム陽性細菌としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げらる
がこれらに限定されない。グラム陰性細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げら
れるがこれらに限定されない。感染性細菌の特定の例としては、以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：
【００４１】
【化１】
。
【００４２】
感染性真菌の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐ
ｓｕｌａｔｕｍ，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ，Ｂｌａｓｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ。他の感染性生物体（すなわち、原
生生物）としては以下が挙げられる：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａ
ｅ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ，ならびにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉ
ｖａｘおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ。
【００４３】
他の医療的に関連する微生物は、文献において広範に記載されている（例えば
、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂ
ａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３（
この内容全体は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【００４４】
本発明の方法はまた、アレルギー疾患を処置するために有用である。この方法
は、抗原がアレルゲンに特異的であるということを除いて、腫瘍免疫治療および
感染性疾患の処置について上記したのと同様の方法で達成される。現在、アレル
ギー疾患は、一般に、低用量の抗原の注射、引き続いて、増加性の用量の抗原の
注射により処置される。この手順は、記憶免疫応答を生じ、さらなるアレルギー
反応を防止すると考えられている。しかし、これらの方法は、アレルギー反応の
ような副作用の危険性を伴う。本発明の方法はこれらの問題を回避する。
【００４５】
「アレルゲン」とは、感受性の被験体においてアレルギー反応またはぜん息反
応を誘起し得る物質（抗原）をいう。アレルゲンの一覧は膨大であり、そしてこ
の一覧は、花粉、昆虫の毒液、動物の麟屑粉塵、真菌の胞子および薬物（例えば
、ペニシリン）を含み得る。天然の、動物および植物のアレルゲンの例としては
、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられるがそれらに限定されない：
【００４６】
【化２】
。
【００４７】
「アレルギー」とは、物質（アレルゲン）に対する後天性過敏症のことをいう
。アレルギー状態は、湿疹、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性コリーザ、枯
草熱、気管支喘息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ）
）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態を含むが、これらに限定
されない。アレルギー反応を有する被験体は、アレルギーを有するかまたはアレ
ルギーの発症の危険にさらされている被験体である。
【００４８】
アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生によっ
て引き起こされる。非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドによって誘導されるサ
イトカインは主に、細胞免疫応答によって最も良く特徴付けされ、そしてＩＬ−
１２およびＩＦＮ−γならびにＩｇＧ２ａ抗体の産生に関連する「Ｔｈ１」と呼
ばれるクラスである。他の主要な型の免疫応答は、Ｔｈ２免疫応答と呼ばれ、こ
れは１つよりも多いＩｇＧ１抗体免疫応答およびＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ
−１０の産生に関連する。一般に、アレルギー疾患は、Ｔｈ２型免疫応答によっ
て媒介され、そして自己免疫疾患は、Ｔｈ１免疫応答によって媒介されるようで
ある。患者における免疫応答をＴｈ２応答（これはＩｇＥ抗体の産生およびアレ
ルギーに関連し、そしてＧＭ−ＣＳＦ単独に対する応答で産生される）からＴｈ
１応答（これは、アレルギー反応に対して防御性である）へシフトするＣｐＧオ
リゴヌクレオチドと免疫増強サイトカインとの組み合わせの能力に基づき、有効
な用量のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインを被験体へ投与
し、アレルギーを処置または予防し得る。
【００４９】
免疫増強サイトカインとの組み合わせられたＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた
、喘息の処置において有意な治療上の有用性を有し得る。Ｔｈ２サイトカイン、
特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息の被験体の気道において上昇される。これ
らのサイトカインは、ＩｇＥアイソトープ転換、好酸球走化性および好酸球活性
化、ならびに肥満細胞増殖を含む喘息の炎症応答の重要な局面を促進する。Ｔｈ
１サイトカイン、特にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成お
よびＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る。「喘息」とは、炎症によって特徴
付けられる呼吸器系の障害（気道の狭窄および吸入物質に対する気道の増大した
反応性）のことをいう。喘息は、アトピー性症状またはアレルギー性症状に広範
に関連しないが、頻繁である。
【００５０】
同時係属出願の米国特許出願第０８／９６０，７７４号）に記載されるように
、非メチル化ＣｐＧモチーフ（すなわち、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣ
ＧＴＴ；配列番号９３）を含むが、コントロールオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡ
ＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ；配列番号１０３）を含まないオリゴヌクレ
オチドは、喘息のマウスモデルにおいて炎症細胞浸潤および好酸球増加症の発症
を予防した。さらに、好酸性炎症の抑制は、Ｔｈ２応答の抑制およびＴｈ１応答
の誘導に関連した。
【００５１】
「被験体」とは、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、
ニワトリ、霊長類（例えば、サル）、魚（養殖漁業種）（例えば、サケ）、ラッ
トおよびマウスを含むが、これらに限定されない脊椎動物を意味する。
【００５２】
上記の多くの障害は、ヒトの障害に関連するが、本発明はまた、他の非ヒト脊
椎動物を処置するのに有用である。非ヒト脊椎動物はまた、癌、感染、アレルギ
ー、および喘息を発症し得る。例えば、感染性ヒト疾患の処置に加えて、本発明
の方法は、動物の感染を処置するのに有用である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、感染性疾患に関して用いられる場合に用語「処
置する」、「処置した」、または「処置している」とは、病原体による感染に対
して被験体の抵抗力を増大する（すなわち被験体が、病原体に感染する可能性を
低下する）予防的な処置、および感染と闘うための被験体が感染した後の処置（
例えば、感染を減少するかまたは排除するか、あるいは悪化することからそれを
防ぐ）をいう。非ヒト脊椎動物の処置のための多くのワクチンは、Ｂｅｎｎｅｔ
ｔ，Ｋ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，第３版、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ
．，１９９５に開示される。
【００５４】
従って、本発明は、ヒトおよび非ヒト動物における抗原特異的免疫応答を誘導
するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの使用を意図
する。上で議論されるように、ウイルス、細菌ならびに真菌のような感染微生物
を含む抗原およびそれらのフラグメントは、天然の供給源または合成的に誘導さ
れる。ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方の感染ウイルスは、レトロウイルス、Ｒ
ＮＡウイルス、およびＤＮＡウイルスを含む。レトロウイルスのこのグループは
、単純レトロウィルスおよび複合レトロウイルスの両方を含む。この単純レトロ
ウイルスは、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、およびＤ型レトロウイ
ルスのサブグループを含む。Ｂ型レトロウイルスの例は、マウス乳腺癌ウイルス
（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロウイルスは、Ｃ型グループＡ（ラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）、鳥類の白血病ウイルス（ＡＬＶ）、および鳥類骨髄芽球症ウイ
ルス（ＡＭＶ）を含む）およびＣ型グループＢ（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ
）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、テナガ
ザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウ
イルス（ＲＶ）およびサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）のサブグループを含
む。Ｄ型レトロウイルスは、マソン‐ファイザーウイルス（ＭＰＭＶ）およびサ
ルレトロウイルス１型（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロウィルスは、レンチウ
イルス、Ｔ細胞白血病ウィルスおよびフォーミーウイルスのサブグループを含む
。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイル
ス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡ
Ｖ）もまた含む。Ｔ細胞白血病ウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サ
ルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）を
含む。フォーミーウイルスは、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）、サルフォー
ミーウイルス（ＳＦＶ）およびウシフォーミーウイルス（ＢＦＶ）を含む。
【００５５】
脊椎動物における抗原である他のＲＮＡウイルスの例は、以下のファミリーの
メンバーを含むがこれらに限定されない：レオウイルス科ファミリー（オルトレ
オウイルス属（哺乳動物レトロウイルスおよび鳥類レトロウイルスの複数の血清
型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、ユーベナンギー（Ｅｕｇｅｎ
ａｎｇｅｅ）ウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ病ウイルス、およびコ
ロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ仔ウ
シ下痢症ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジ
ロタウイルス、鳥類ロタウイルス）を含む）；エンテロウイルス属（ポリオウイ
ルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、腸細胞障害性（ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｙ
ｔｏｐａｔｈｉｃ）ヒトオーファン（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、
サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、マウスポリオウイル
ス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カーディオウイルス属（
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくと
も１１３のサブタイプを含む、ヒトライノウイルス；他のライノウイルス）、ア
フトウイルス属（口蹄疫（ＦＭＤＶ））を含む、ピコルナウイルス科ファミリー
；ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミグエルアザラシウイルス、ネコピコルナウ
イルス、およびノーウォークウイルスを含む、カルシウイルス科ファミリー；ア
ルファウイルス属（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビス
ウイルス、チクングンヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロス川ウイルス、
ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊
媒介（ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日
本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウエ
ストナイル脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介（ｔｉｃ
ｋ ｂｏｒｎｅ）ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林病ウイル
ス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ル
ビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレラ
ウイルス、ボーダー病ウイルス）を含む、トガウイルス科ファミリー；ブンヤウ
イルス属（ブンヤムウェラ熱ウイルスおよびブンヤムウェラ熱関連ウイルス、カ
リフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シシリー
型（Ｓｃｉｌｉａｎ）ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属
（クリミア‐コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウ
ウクウイルス属（ウウクニエミーウイルスおよびウウクニエミー関連ウイルス）
を含む、ブンヤウイルス科ファミリー；インフルエンザウイルス属（インフルエ
ンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、な
らびに鳥類インフルエンザウイルスおよびウマのインフルエンザウイルス；イン
フルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（考えら
れる別個の属）を含む、オルトミクソウイルス科ファミリー；パラミクソウイル
ス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着性ウイル
ス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行性
耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイ
ルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイルス
（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含む、パラミク
ソウイルス科ファミリー；森林（ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、シンドビスウイルス
、チクングニンウイルス、オニョンニョンウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエ
ラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介（ｍ
ｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウ
イルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウエストナイ
ル脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介（ｔｉｃｋ ｂｏ
ｒｎｅ）ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、跳躍
病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイル
ス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレラウイルス
、ボーダー病ウイルス）を含む、トガウイルス科ファミリー；ブンヤウイルス属
（ブンヤムウェラ熱ウイルスおよびブンヤムウェラ熱関連ウイルス、カリフォル
ニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シシリー型（Ｓｃ
ｉｌｉａｎ）ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミ
ア‐コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウウクウイ
ルス属（ウウクニエミーウイルスおよびウウクニエミー関連ウイルス）を含む、
ブンヤウイルス科ファミリー；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイ
ルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、ならびに鳥
類インフルエンザウイルスおよびウマのインフルエンザウイルス；インフルエン
ザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（考えられる別個
の属）を含む、オルトミクソウイルス科ファミリー；パラミクソウイルス属（パ
ラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着性ウイルス、パラ
インフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎
ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジ
ステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイルス（ＲＳＶ
）、ウシＲＳウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含む、パラミクソウイル
ス科ファミリー；ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）（チャンディプラウイルス、フ
ランダース−ハートパークウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、
魚類ラブドウイルス、および２つの考えられる（ｔｗｏ ｐｒｏｂａｂｌｅ）ラ
ブドウイルス（マルブルクウイルスおよびエボラウイルス）を含む、ラブドウイ
ルス科ファミリー；リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス
複合体、およびラッサウイルスを含む、アレナウイルス科ファミリー；伝染性気
管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸（ｅｎｔｅｒｉｃ）コ
ロナウイルス、およびネコの伝染性腹膜炎（ネココロナウイルス）を含む、コロ
ナウイルス科ファミリー。
【００５６】
脊椎動物において抗原である例示的ＤＮＡウイルスは以下を含むが、これらに
限定されない：オルトポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア
、牛痘、スイギュウポックス（Ｂｕｆｆａｌｏｐｏｘ）、家兎痘、エクトロメリ
ア）、レポリポックスウイルス属（線維性粘液腫、線維腫）、トリポックスウイ
ルス属（鶏痘、他の鳥類ポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘
、ヤギ痘）、スイポックスウイルス（豚痘）、パラポックスウイルス属（感染性
膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含む、ポックス
ウイルス科ファミリー；イリドウイルス科ファミリー（アフリカ豚コレラウイル
ス、カエルウイルス２および３、魚類のリンパ嚢腫ウイルス）；アルファヘルペ
スウイルス（単純ヘルペス１型および２型、水痘‐帯状疱疹、ウマ流産ウイルス
、ウマヘルペスウイルス２および３、仮性狂犬病ウイルス、ウシの伝染性角膜炎
ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気
管支炎ウイルス）、ベータヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、なら
びにブタ、サルおよびげっ歯類のサイトメガロウイルス）、ガンマヘルペスウイ
ルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレク病ウイルス、リスザルヘ
ルペスウイルス、クモザルヘルペスウイルス、ノウサギヘルペスウイルス、モル
モットヘルペスウイルス、ルッケ腫瘍（Ｌｕｃｋｅ ｔｕｍｏｒ）ウイルス）を
含む、ヘルペスウイルス科ファミリー；マストアデノウイルス属（ヒトサブグル
ープＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および非グループ化；サルアデノウイルス（少なくと
も２３の血清型）、イヌの伝染性肝炎、およびウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよ
び多くの他の種のアデノウイルス）、トリアデノウイルス属（鳥類のアデノウイ
ルス）を含む、アデノウイルス科ファミリー；および培養不可能な（ｎｏｎ−ｃ
ｕｌｔｉｖａｔａｂｌｅ）アデノウイルス；パピローマウイルス属（ヒトパピロ
ーマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギ乳頭腫ウイルス、およ
び他の種の種々の病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオ
ーマウイルス、サル空胞形成因子（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（Ｓ
Ｖ−４０）、ウサギ空胞形成因子（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣ
ウイルス、および霊長類ポリオーマウイルス（例えば、リンパ増殖性（ｌｙｍｐ
ｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パピローマウイルス）を含む、パポバウイルス科ファミリ
ー；アデノ関連ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、
ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスな
ど）を含む、パルボウイルス科ファミリー。最後に、ＤＮＡウイルスは、上記の
ファミリーに一致しないウイルス（例えば、クールーウイルスおよびクロイツフ
ェルト−ヤーコプ病ウイルス、ならびに慢性感染神経障害因子（ｃｈｒｏｎｉｃ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｇｅｎｔ）（ＣＨＩＮＡ
ウイルス））を含み得る。
【００５７】
前記のリストのそれぞれは、例示であり、そして限定を意図しない。
【００５８】
ヒトにおいて抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド
および免疫増強サイトカインの組み合わせの使用に加えて、好ましい実施態様の
方法は、トリ（例えば、雌鳥、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル（カモ）、ガ
チョウ、ウズラ、およびキジ）の処置に特によく適している。トリは、多くの型
の感染の主な標的である。
【００５９】
孵化するトリは、誕生後まもなく病原性微生物に曝される。これらのトリは、
始めは母親由来の抗体によって病原体から防御されるが、この防御は一時的に過
ぎず、そしてトリ自身の未成熟な免疫システムが、病原体からトリを防御し始め
なければならない。若いトリが最も感受性である時に、それらにおいて感染を防
ぐことが、しばしば望ましい。特に、トリが閉鎖された区域に入れられる（これ
は疾患の急速な伝播を導く）場合、老齢のトリにおいて感染を防ぐことがまた望
ましい。従って、抗原が存在する場合、抗原特異的免疫応答を増強するために本
発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインをトリに投与する
ことが望ましい。
【００６０】
ニワトリの普通の感染の例は、ニワトリ感染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）であ
る。ＣＩＡＶは、１９７９年日本でマレク病ワクチン接種ブレーク（ｖａｃｃｉ
ｎａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋ）の研究の間に初めて単離された（Ｙｕａｓａら、１
９７９、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２３：３６６−３８５）。この時以来、ＣＩＡＶ
は、全ての主な家禽生産国の養鶏において検出されている（ｖａｎ Ｂｕｌｏｗ
ら、１９９１、６９０−６９９頁、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ，
第九版、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００６１】
ＣＩＡＶ感染は、若い感受性のニワトリにおいて、貧血、出血および免疫抑制
によって特徴づけられる臨床疾患を生じる。ＣＩＡＶ感染したニワトリの胸腺の
萎縮症および骨髄の萎縮症ならびに一貫した病変もまた、ＣＩＡＶ感染の特徴で
ある。胸腺におけるリンパ球の枯渇、および時折ファブリキウス嚢におけるリン
パ球の枯渇は、免疫抑制を生じ、そして二次的なウイルス感染、細菌感染、また
は真菌感染（次いで、これは疾患の経過を複雑にする）に対する感受性を増大さ
せる。免疫抑制は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファルビキウス嚢病、
細網内皮症ウイルス、アデノウイルス、またはレオウイルスの１つ以上に感染後
に疾患を悪化させる原因となり得る。ＭＤＶの病原性は、ＣＩＡＶによって増強
されることが報告されている（ＤｅＢｏｅｒら、１９８９、２８頁、Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３８ｔｈ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｔｅｍｐｅ，Ａｒｉｚ．）。さらに、
ＣＩＡＶが、伝染性ファルビキウス嚢病の徴候を悪化させることが報告されてい
る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９８９、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３３：７０７
−７１３）。ニワトリは、ＣＡＡによって実験的に引き起された疾患に対して年
齢抵抗性（ａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を発生させる。これは、本質的に、
２週齢までに完了するが、老齢のトリは、感染に対して未だ感受性である（Ｙｕ
ａｓａ，Ｎ．ら、１９７９前出；Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、Ａｉａｎ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ ２４，２０２−２０９，１９８０）。しかし、ニワトリを、ＣＡＡおよび
免疫抑制因子（ＩＢＤＶ、ＭＤＶなど）に二重に感染させる場合、この疾患に対
する年齢抵抗性は、遅延される（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、１９７９および１９８０
前出；Ｂｕｌｏｗ ｖｏｎ Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ ３３：９３−１１６，１９８６）。疾患の伝染を増強し得るＣＩＡＶの特
徴は、環境的な不活性化およびいくつかの通常の消毒剤に対する高い抵抗性を含
む。家禽産業に対するＣＩＡＶ感染の経済的影響は、疾患に感染したトリの１０
％〜３０％が、死を突発するという事実から明らかである。
【００６２】
トリのワクチン接種は、他の脊椎動物のように、任意の年齢で行われ得る。通
常、ワクチン接種は、生きた微生物については１２週齢までに行われ、そして不
活性化微生物または他の型のワクチンについては１４〜１８週の間に行われる。
卵内（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン接種については、ワクチン接種が、胚発生の最後
の四半期（ｌａｓｔ ｑｕａｒｔｅｒ）に行われ得る。このワクチンは、皮下、
スプレーによって、経口、眼内、気管内、経鼻、卵内（ｉｎ ｏｖｏ）、または
本明細書中に記載される他の方法によって投与され得る。従って、本発明のＣｐ
Ｇオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは、慣用的なワクチンスケジ
ュールを用いてトリおよび他の非ヒト脊椎動物へ投与され得、そして抗原は、本
明細書中に記載される適切な時間の後に投与される。
【００６３】
ウシおよび家畜もまた、感染に対して感受性である。これらの動物を冒す疾患
は、（特にウシの間で）深刻な経済損失を生じ得る。本発明の方法を用いて、家
畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）における感染に対して防
御し得る。
【００６４】
ウシは、ウシウイルスによって感染され得る。ウシウイルス性下痢性ウイルス
（ＢＶＤＶ）は、小エンベロープ化（ｓｍａｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）プラス
鎖ＲＮＡウイルスであり、そして豚コレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジボ
ーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共に、ペスチウイルス属に分類される。ペスチウ
イルスは、以前にトガウイルス科ファミリーに分類されたが、いくつかの研究は
、フラビウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）グループと共にフラビウイ
ルス科ファミリーへの再分類を提案している（Ｆｒａｎｃｋｉら、１９９１）。
【００６５】
ＢＶＤＶ（これはウシの重要な病原体である）は、細胞培養分析に基づいて、
細胞病原性（ＣＰ）生物型および非細胞病原性（ＮＣＰ）生物型へ区別され得る
。両方の生物型は、ウシにおいて見出され得るが、ＮＣＰ生物型がより広範囲に
及ぶ。妊娠中のウシが、ＮＣＰ株に感染する場合、ウシは、持続的に感染させた
ウシ、すなわち、その一生の間ウイルスを伝播する免疫寛容ウシを出産する。持
続的に感染させたウシは、粘膜疾患で死に得、次いで、両方の生物型が、この動
物から分離され得る。臨床的症状は、流産、奇形発生、ならびに呼吸の問題、粘
膜疾病および軽度の下痢を含み得る。さらに、この動物の死を生じ得る、群れの
伝染病に関連する重篤な血小板減少症が記載されており、そしてこの疾患と関連
する株は、古典的なＢＶＤＶよりも病原性であると思われる。
【００６６】
ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、ウマにおいて無症状疾患から致命的疾患
までにわたる種々の感染を引き起こす、抗原性的に区別された生物学的因子の群
を含む。これらは、ウマにおける遍在性の病原体であるウマヘルペスウイルス−
１（ＥＨＶ−１）を含む。ＥＨＶ−１は、流産、気道疾患、および中枢神経系障
害の流行病に関連する。若いウマの上気道の初期の感染は、８〜１０日間続く熱
病（ｆｅｂｒｉｌｅ ｉｌｌｎｅｓｓ）を生じる。免疫学的経験をした雌馬は、
疾患が明らかになることなしに気道を通じて再感染され得、その結果、流産は、
通常前兆なしに生じる。神経学的症候群は、呼吸疾患、または流産に関連し、任
意の年齢のいずれかの性別の動物を冒し得、共調運動不能、衰弱および後部麻痺
（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐａｒａｌｙｓｉｓ）を導く（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ
．Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９，３０４−３１６，１９９２）。他のＥＨ
Ｖは、ＥＨＶ−２、またはウマサイトメガロウイルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウ
イルス、およびＥＨＶ−４（以前はＥＨＶ−１サブタイプ２に分類された）を含
む。
【００６７】
ヒツジおよびヤギは、ビスナ−マエディを含む種々の危険な微生物によって感
染され得る。
【００６８】
サル（ｍｏｎｋｅｙ）、サル（ａｐｅ）、およびマカクのような霊長類は、サ
ル免疫不全ウイルスによって感染され得る。不活性化細胞−ウイルスおよび無細
胞の全サル免疫不全ワクチンは、マカクに防御をもたらすことが報告されている
（Ｓｔｏｔｔら、（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３６：１５３８−１５４１；Ｄｅ
ｓｒｏｓｉｅｒｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）８６：６３５３−６３５７
；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２９
３−１２９７；およびＣａｒｌｓｏｎら、（１９９０）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕ
ｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ６：１２３９−１２４６）。組換えＨＩＶ
ｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーに防御をもたらすことが報告されている
（Ｂｅｒｍａｎら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：６２２−６２５）。
【００６９】
ネコ（家庭内および野生の両方）は、種々の微生物での感染に感受性である。
例えば、ネコの伝染性腹膜炎は、家ネコ、および野生のネコ（例えば、ライオン
、ヒョウ、チーター、およびジャガー）の両方において生じる疾患である。この
型のおよび他の型の病原性生物体を用いてネコにおける感染を防御することが望
ましい場合、本発明の方法を用いて、ネコにワクチン接種し、感染からネコを防
御し得る。
【００７０】
家ネコは、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）
、内因性Ｃ型オンコルナウイルス（ＲＤ−１１４）、およびネコシンシチア形成
（ｆｏｒｍｉｎｇ）ウイルス（ＦｅＳＦＶ）を含むが、これらに限定されない、
いくつかのレトロウイルスで感染させ得る。これらのうち、ＦｅＬＶは、最も有
意な病原体であり、これは、リンパ性細網（ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）
新生物および骨髄性新生物、貧血、免疫媒介性障害（ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｄｉａ
ｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、およびヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に
類似した免疫不全症候群を含む多様な症状を引き起こす。最近、ＦｅＬＶ−ＡＩ
ＤＳと命名された特定の複製不全（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖ
ｅ）ＦｅＬＶ変異体が、免疫抑制特性とより詳細に関連付けされている。
【００７１】
ネコＴリンパ指向性（Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レンチウイルス（ネコ
免疫不全ともいわれる）の発見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５：７９０−７９３に最初に報告された。ＦＩＶの特徴は、Ｙａｍａ
ｍｏｔｏら（１９８８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２月 補遺 ２：２０４Ｓ−２１
５Ｓ；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２
４６−１２５８；およびＡｃｋｌｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５
６５２−５６５５に報告されている。ＦＩＶのクローニングおよび配列分析は、
Ｏｌｍｓｔｅｄら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：２４４８−２４５２および８６：４３５５−４３６０に報告されている
。
【００７２】
ネコの伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、家ネコ科および野生のネコ科において予測
不可能に生じる散発性疾患である。ＦＩＰは、主に家ネコの疾患であるが、ライ
オン、アメリカライオン、ヒョウ、チーター、およびジャガーにおいて診断され
ている。ＦＩＰに冒されている小型の野生のネコは、ヤマネコおよびカラカル、
サンドキャット（ｓａｎｄ ｃａｔ）、およびパラスキャット（ｐａｌｌａｓ
ｃａｔ）を含む。家ネコにおいて、全ての年齢のネコが感受性であるが、この疾
患は、若い動物において主に生じる。発生率のピークは、６と１２ヶ月齢の間で
生じる。発生率の低下が、５〜１３歳で認められ、次いで１４〜１５歳のネコに
おいて発生率の増加が認められる。
【００７３】
魚類、甲殻類または他の水性生物品種におけるウイルス疾患および細菌疾患は
、養殖漁業産業について深刻な問題を提起する。孵化タンクまたは閉鎖された海
洋養殖領域における動物の高い密度が原因で、感染性疾患は、例えば、魚類設備
、甲殻類設備、または他の水性生物品種設備において大部分のストックを死滅さ
せ得る。疾患の予防は、疾患が進行してすぐの介入よりも、魚類へのこれらの脅
威に対するより好適な救済策である。魚類のワクチン接種は、免疫によって長期
間の防御を提供し得る唯一の予防法である。ワクチン接種に基づく核酸は、Ｄａ
ｖｉｓへ発行された米国特許第５，７８０，４４８号に記載される。
【００７４】
魚類の免疫系は、哺乳動物免疫系に類似した多くの特性を有する（例えば、Ｂ
細胞、Ｔ細胞、リンホカイン、補体、および免疫グロブリンの存在）。魚類は、
哺乳動物のＢ細胞およびＴ細胞のリンパ球サブクラスに多くの点で類似している
と思われる役割を有するリンパ球サブクラスを有する。ワクチンは、経口投与さ
れるか、あるいは液浸または注入によって投与され得る。
【００７５】
養殖漁業種は、魚類、甲殻類または他の水性動物を含むが、これらに限定され
ない。魚類は、全ての魚形脊椎動物を含む。これは、例えば、サケ科、コイ、ナ
マズ、ブリ、タイ、およびスズキのような硬骨魚類または軟骨魚類であり得る。
サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サケ、および北極イワナ（Ａｒｃｔｉｃ
ｃｈａｒ）を含む魚類のファミリーである。甲殻類の例は、ハマグリ、ロブスタ
ー、エビ、カニ、およびカキを含むが、これらに限定されない。他の養殖水性動
物は、ウナギ、イカ、およびタコを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
ウイルス性水性生物病原体のポリペプチドは、ウイルス性出血性敗血症ウイル
ス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質（Ｇ）または核タンパク質（Ｎ）；伝染性造血組
織壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）のＧタンパク質またはＮタンパク質；伝染性膵臓壊
死ウイルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１構造、ＶＰ２構造、ＶＰ３構造、またはＮ構造
タンパク質；コイ春ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣ）のＧタンパク質；ならびに
ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、外被（ｔｅｇｕｍｉｎ）タ
ンパク質およびキャプシドタンパク質または糖タンパク質を含むが、これらに限
定されない。
【００７７】
細菌性病原体のポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：Ａｅｒｏｍｏｎｉｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの鉄調節外膜タンパク質
（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ），およびＡ−タンパク質（これは、
フルンケル多発症を引き起こす）、Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｍｏｎ
ｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質（これは、細菌性腎疾患（ＢＫＤ）を引き起こ
す）、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの主要表面関連抗原（ｍｓａ）、表面発現細胞毒
素（ｍｐｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、および鞭毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅ
ｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭ
Ｐ）、および構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよ
びＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰおよび鞭毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌ
ｏｓｉｓ ｉｃｔａｌｕｒｉおよびＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタ
ンパク質、ａｒｏＡおよびｐｕｒＡ；ならびにＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕ
ｓの表面抗原；ならびにＣｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造タンパ
ク質および調節タンパク質；ならびにＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造タンパク質お
よび調節タンパク質。
【００７８】
寄生虫性病原体のポリペプチドとしては、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ
の表面抗原が挙げられるが、これに限定されない。
【００７９】
被験体を、この抗原に暴露する。本明細書中で使用される場合、用語「曝露さ
れる（する）」とは、被験体を抗原と接触させる能動的工程、またはインビボで
の抗原への被験体の受動的曝露のいずれかをいう。抗原への被験体の能動的曝露
のための方法は、当該分野において周知である。一般には、抗原を、任意の手段
（例えば、静脈内投与、筋内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与
、気管内投与、または皮下投与）によって、被験体に直接的に投与する。抗原は
、全身的にかまたは局所的に投与され得る。抗原およびＣｐＧおよび免疫増強サ
イトカインを投与するための方法は、以下においてより詳細に記載される。抗原
が、身体内の免疫細胞に曝露するために利用可能となる場合、被験体を受動的に
抗原に対して曝露する。被験体を、例えば、身体内に外来病原体の侵入させるこ
とによってか、または表面に外来抗原を発現する腫瘍細胞の発生させることによ
って、抗原に対して受動的に曝露し得る。被験体を抗原に対して受動的に曝露す
る場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌク
レオチドであり、および／またはリン酸改変骨格を有することが好ましい。
【００８０】
被験体を抗原に対して受動的に曝露する方法は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドお
よび免疫増強サイトカインの投与の時期に部分的に特に依存し得る。例えば、癌
もしくは感染性疾患、またはアレルギー性応答もしくは喘息性応答の発症の危険
性がある被験体において、この危険性が最も大きい時（すなわち、アレルギーの
季節、または癌の原因因子への曝露後）に、被験体は、規則的に（ｏｎ ｒｅｇ
ｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカイン
を投与され得る。さらに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカイ
ンは、旅行者が、感染因子への曝露の危険性がある外国に旅行する前に、その旅
行者に対して投与され得る。同様に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強
サイトカインは、生物戦争に曝露される危険性のある軍人または民間人に対して
、それらの被験体がそれに曝露される時および場合に、抗原に対する全身的免疫
応答を誘導するために投与され得る。
【００８１】
癌を発生させる危険性のある被験体はまた、本発明の方法に従って、ＣｐＧお
よび免疫増強サイトカインに続いて抗原に受動的または能動的に曝露することに
よって処置され得る。癌を発症する危険性のある被験体とは、癌を発症する高い
可能性を有する被験体をいう。これらの被験体としては、例えば、遺伝子異常（
その存在が、癌発症のより高い可能性に対して相関性を有することが実証されて
いる）を有する被験体、および癌の原因因子（例えば、タバコ、アスベスト、ま
たは他の化学毒素）に対して曝露された被験体が挙げられる。癌発症の危険性の
ある被験体を、ＣｐＧおよび免疫増強サイトカインで規則的に（例えば、毎月）
処置する場合、被験体は、抗原特異的免疫応答を認識し、そして生成し得る。被
験体において、腫瘍が形成を開始する場合に、被験体は、１つ以上のこの腫瘍抗
原に対して特異的免疫応答を発症する。本発明のこの局面は、被験体が曝露され
る抗原が未知である場合に、特に有利である。例えば、生物戦争に曝露される危
険性のある軍人において、これらの軍人が曝露されるかもしれない生物兵器が何
であるかは、一般的に未知である。
【００８２】
抗原は、単独で、またはキャリアを伴って、被験体の免疫系に送達され得る。
例えば、コロイド分散系が、被験体に抗原を送達するために使用され得る。本明
細書中で使用される場合、「コロイド分散系」とは、被験体中に抗原を送達およ
び放出し得る、細菌学的供給源またはウイルス性供給源由来以外の、天然の分子
または合成分子をいう。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル
（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系
（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げ
られる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームとは、
インビボまたはインビトロの送達ベクターとして有用な人工膜血管である。サイ
ズが０．２〜４．０μの範囲である大きな単層血管（ＬＵＶ）は、水性の内部に
大きな高分子をカプセル化し得、そしてこれらの高分子は生物学的に活性な形態
で細胞に送達され得ることが示されている（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７（１９８１）。
【００８３】
トランスフェクションのための脂質処方物は、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥTM
（特別なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム脂質）およびＳＵＰＥＲ
−ＦＥＣＴTM（新規の作用性デンドリマー技術（ａｃｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｍ
ｅｒｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））としてＱＩＡＧＥＮから、ならびに、例え
ば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥTM（これらは、例え
ば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメ
チルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のようなカチオン性脂質から構成される）としてＧ
ｉｂｃｏ ＢＲＬから市販される。リポソームを作製するための方法は当該分野
において周知であり、そして多くの刊行物に記載されている。リポソームは、Ｇ
ｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ３：２３５−２４１（１９８５）（これは、本明細書中で参考として援用さ
れる）による概説文献に記載された。
【００８４】
抗原が、この抗原をコードする核酸分子において被験体に送達され得、その結
果、この抗原がインビボで発現されるに違いないことが想像される。本発明のこ
れらの実施態様において、この核酸分子はまた、核酸配列中にＣｐＧジヌクレオ
チドを含み得る。しかしこの場合、この核酸分子は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
と取って代わることはない。抗原は、この核酸分子から離れたＣｐＧオリゴヌク
レオチドとの組合わせにおいて投与されなければならない。抗原をコードする核
酸は、真核生物細胞内での抗原核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に、作動可
能に連結される。「遺伝子発現配列」は、それに対して作動可能に連結される抗
原核酸の効率的な転写および翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオチド配列（例
えば、プロモーター配列、またはプロモーター−エンハンサーの組合わせ）であ
る。遺伝子発現配列とは、例えば、哺乳動物プロモーターまたはウイルス性プロ
モーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）であり得る
。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子についてのプロモーター
が挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β
−アクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーター。真核生物細胞中で構成
的に機能する、例示的なウイルス性プロモーターとしては、例えば、シミアンウ
イルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスおよ
び他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーター由来のプロモーターが挙げられる。他の構成
的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用な
プロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導
因子の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の
金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性
プロモーターは、当業者に公知である。
【００８５】
一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始
に関与する、５’−非転写配列および５’−非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボッ
クス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列など）を含む。特に、そのような５’−非転
写配列は、作動可能に連結された抗原核酸の転写制御についてのプロモーター配
列を含むプロモーター領域を含む。この遺伝子発現配列は、必要に応じてエンハ
ンサー配列、または所望される場合には上流のアクチベーター配列を含む。
【００８６】
抗原核酸は、遺伝子の発現配列に作動可能に連結される。本明細書中で使用さ
れる場合、抗原核酸配列および遺伝子発現配列が、この遺伝子発現配列の影響下
または制御下で、この抗原コード配列の発現あるいは転写および／または翻訳さ
せるように配置するような様式で共有結合される場合に、それらを「作動可能に
連結」されている状態であるという。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列
中のプロモーターの誘導が、抗原配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ
配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）
抗原配列の転写を指向する、プロモーター領域の能力を妨害しない、または（３
）タンパク質に翻訳される、対応するＲＮＡの転写の能力を妨害しない場合に、
作動可能に連結されているという。従って、遺伝子発現配列は、その遺伝子発現
配列が、抗原核酸配列の転写を有効にし得、その結果、得られる転写産物が所望
のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合に、抗原核酸配列に作動可能
に連結される。
【００８７】
本発明の抗原核酸は、単独で、またはベクターと共に、免疫系に送達され得る
。最も広範な意味で、「ベクター」とは、免疫系の細胞、および好ましくはＡＰ
Ｃへの抗原核酸の移行を促進し得、その結果、その抗原がＡＰＣの表面上で発現
および提示され得る、任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクタ
ーの非存在下で生じる崩壊の程度と比較して、崩壊性を低減して免疫細胞に核酸
を輸送する。ベクターは、必要に応じて、ＡＰＣでの抗原核酸の発現を増強する
ために上記の遺伝子発現配列を含む。一般的に、本発明において有用なベクター
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗原核酸配列の挿入ま
たは組込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス
供給源または細菌性供給源由来の他のビヒクル。ウイルスベクターは、ベクター
の好ましい型であり、これは以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれらに限
定されない：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベ
イマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）；
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイル
ス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワ
クシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス（例えば、レトロウ
イルス）。列挙されていないが、当該分野において公知の他のベクターを容易に
使用し得る。
【００８８】
好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子と置き換えら
れている、非細胞障害性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞障害性ウイルスと
しては、その生活環が、引き続き宿主の細胞性ＤＮＡへのプロウイルスの組込み
を伴う、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写に関与するレトロウイルスが
挙げられる。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療試行について認可されている
。最も有用なものは、複製欠損した（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向
し得るが、感染性粒子を生産し得ない）レトロウイルスである。そのような遺伝
的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率性
形質導入について、一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生す
るための標準的プロトコール（外因性の遺伝物質をプラスミドに組込む工程、プ
ラスミドによる、パッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッ
ケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からの
ウイルス粒子の回収工程、およびウイルス粒子を用いた標的細胞の感染工程を含
む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ Ｃ．Ｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．
Ｊ．編「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第７巻
、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ
ｅｙ（１９９１）に提供される。
【００８９】
特定の適用について好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス（二本鎖ＤＮＡ
ウイルス）である。このアデノ随伴ウイルスは、複製欠損となるように操作され
得、そして広範な細胞型および種に感染し得る。これはさらに、熱安定性および
脂質溶媒安定性；多様な系列の細胞（造血細胞を含む）中への高い形質導入頻度
；および重感染阻害の欠如（従って、複数回の連続した形質導入を可能にする）
のような利点を有する。報告されているように、アデノ随伴ウイルスは、ヒトの
細胞ＤＮＡ中に部位特異的様式で組み込み得、それによって挿入変異誘発および
レトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の可変性の可能性を最小化する。
さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００を超える
継代の組織培養に続く。これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安
定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式にお
いても機能し得る。
【００９０】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクタ
ーは、当該分野において広範に記載されており、そして当業者に周知である。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。ここ数年、
プラスミドベクターは、宿主ゲノム中で複製せずそしてその中に組み込まれない
というその能力が理由で、インビボで細胞に遺伝子を送達するために特に有用で
あることが見出された。しかし、宿主細胞に適合性のプロモーターを有するこれ
らのプラスミドは、プラスミド中で作動可能にコードされた遺伝子からペプチド
を発現し得る。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃ
ｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラ
スミドは、制限酵素および連結反応を使用して、ＤＮＡ中の特定のフラグメント
を除去および付加するように特注で設計され得る。
【００９１】
プラスミドを保有する遺伝子は、細菌を使用することによって、免疫系に送達
され得ることが近年発見された。細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の改変
形態は、プラスミドを用いてトランスフェクトされ得、そして送達ビヒクルとし
て使用され得る。細菌性送達ビヒクルは、経口的にか、または他の投与手段によ
って、宿主被験体に投与され得る。細菌は、おそらく腸障壁を通過することによ
って、免疫細胞（例えば、樹状細胞）にプラスミドを送達する。高レベルの免疫
防御は、この方法論を使用して確立された。
【００９２】
従って、本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの
計画的な投与を意図する。このオリゴヌクレオチドは、被験体に毎週または毎月
を基準に投与され得る。被験体が１つまたは複数の抗原への曝露の危険性にある
場合、曝露に際して迅速に抗原を認識し、そして抗原特異的免疫応答を産生する
ように、規則的にＣｐＧおよび免疫増強サイトカインを投与し得る。抗原への曝
露の危険性のある被験体とは、抗原に曝露され、そして抗原への免疫応答を発達
させる高い可能性を有する任意の被験体である。抗原がアレルゲンであり、そし
て被験体がその特定の抗原に対してアレルギー応答を発達させ、そしてその被験
体がその抗原に曝露される場合（すなわち、花粉の時期の間）、その時、被験体
は抗原への曝露の危険性がある。
【００９３】
本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、非メチル化シトシン−グアニンジヌク
レオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ ＤＮＡ」、すなわち５’シトシン、次いで
３’グアノシンを含み、そしてリン酸結合によって連結されているＤＮＡ）を含
み、そして免疫系を活性化させる核酸分子である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは
、二本鎖または一本鎖であり得る。一般的に、二本鎖分子はインビボでより安定
であるが、一本鎖分子は増大した免疫活性を有する。
【００９４】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわ
ち、リン酸基および交換可能な有機塩基（置換ピリミジン（例えば、シトシン（
Ｃ）、チミジン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、ア
デニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））のいずれか）に連結された糖（例えば、
リボースまたはデオキシリボースを含む分子）を意味するために、交換可能に使
用される。本明細書中で使用される場合、この用語はオリゴリボヌクレオチドな
らびにオリゴデオキシリボヌクレオチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオ
シド（すなわち、リン酸を除いたポリヌクレオチド）およびポリマーを含む任意
の他の有機塩基を含む。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムまたは
ｃＤＮＡ）から入手され得るが、好ましくは合成される（例えば、オリゴヌクレ
オチド合成によって生成される）。完全なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、非メチ
ル化であり得るか、または部分的に非メチル化であり得るが、少なくとも５’Ｃ
Ｇ３’のＣは非メチル化されていなければならない。
【００９５】
１つの好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも以下の式：
５’Ｎ1Ｘ1ＣＧＸ2Ｎ2３’
によって示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、少なくとも１
つのヌクレオチドは連続したＣｐＧを分離し；Ｘ1はアデニン、グアニン、また
はチミンであり；Ｘ2はシトシン、アデニン、またはチミンであり；Ｎは任意の
ヌクレオチドであり、そしてＮ1およびＮ2は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配
列である。
【００９６】
別の実施態様において、本発明は、少なくとも以下の式：
５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4Ｎ2３’
によって示される単離されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、少
なくとも１つのヌクレオチドは連続したＣｐＧを分離し；Ｘ1Ｘ2は、ＧｐＴ、Ｇ
ｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＧおよびＡｐＴからなる群から選択され；Ｘ3Ｘ4は、ＴｐＴ
、ＣｐＴ、ＴｐＣ、ＣｐＣおよびＡｐＴからなる群から選択され；Ｎは、任意の
ヌクレオチドであり、そしてＮ1およびＮ2は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配
列である。好ましい実施態様において、核酸のＮ1およびＮ2は、ＣＣＧＧ四量体
（ｑｕａｄｍｅｒ）または１つより多いＣＣＧもしくはＣＧＧ三量体を含まない
。別の好ましい実施態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’ＴＣ
Ｎ1ＴＸ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4３’を有する。
【００９７】
好ましくは、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ
およびＡｐＡからなる群から選択されるＸ1Ｘ2を含み、そしてＸ3Ｘ4は、ＴｐＴ
、ＣｐＴおよびＧｐＴからなる群から選択される。細胞への取り込みを促進する
ために、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜３０塩基長の範囲で
ある。しかし、８ヌクレオチドより大きい任意のサイズ（数ｋｂ長でさえも）の
核酸は、十分な免疫刺激モチーフが存在する場合に、本発明に従って免疫応答を
誘導し得る。なぜなら、より長い核酸は細胞内でオリゴヌクレオチドに分解され
るからである。好ましい合成オリゴヌクレオチドは、ＣＣＧＧ四量体または１つ
より多いＣＣＧもしくはＣＧＧ三量体を、５’末端および／または３’末端また
はその付近に含まない。オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の改変を組み込む場合
には、安定化オリゴヌクレオチドはまた、以下においてより詳細に議論されるよ
うに、好ましい。改変は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエ
ート改変であり得る。好ましくは、リン酸骨格改変は、核酸の５’末端（例えば
、オリゴヌクレオチドの５’末端の、最初の２つのヌクレオチド）で生じる。さ
らに、リン酸骨格改変は、核酸の３’末端（例えば、核酸の３’末端の、最後の
５つのヌクレオチド）で生じ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは完全にか、
または部分的に改変され得る。
【００９８】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８と１００との間の範囲であり、
そしてより好ましくは８ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間のサイズである
。あるいは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、プラスミド中で大量に生成され得、
そしてオリゴヌクレオチドに分解され得る。
【００９９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは、被験体に直接的に
投与され得るか、または核酸送達複合体と組合わせて投与され得る。「核酸／サ
イトカイン送達複合体」とは、標的化手段（例えば、標的細胞へのより高い親和
性結合を生じる分子（例えば、樹状細胞表面および／または標的細胞による細胞
取り込みの増大））と結合した（例えば、それにイオン的にか、もしくは共有結
合的に結合した；または、その中にカプセル化された）、核酸分子および／また
はサイトカインを意味するべきである。核酸／サイトカイン送達複合体の例とし
ては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質
、ビロソーム、またはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、
標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）と結合した核酸／サイ
トカインが挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞によるインターナリゼーシ
ョンの前の有意な脱共役を妨げるために、インビボで十分に安定であるべきであ
る。しかし、複合体は、細胞内において適切な条件下で切断可能であるべきであ
り、その結果、核酸／サイトカインは機能的形態で放出される。
【０１００】
「パリンドローム配列」は、反転反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ
’Ａ’のような配列であって、ここでＡおよびＡ’は、通常のワトソン−クリッ
ク塩基対を形成し得る塩基である）を意味するべきである。インビボでそのよう
な配列は、二本鎖構造を形成し得る。１つの実施態様において、ＣｐＧオリゴヌ
クレオチドはパリンドローム配列を含む。この状況において使用されるパリンド
ローム配列は、ＣｐＧがパリンドロームの一部であり、そして好ましくはそのパ
リンドロームの中心であるパリンドロームをいう。別の実施態様において、Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドはパリンドロームを含まない。パリンドロームを含まない
ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、ＣｐＧジヌクレオチドがパリンドロームの一部
でないＣｐＧオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、Ｃ
ｐＧはそのパリンドロームの一部ではない、パリンドロームを含み得る。
【０１０１】
「安定化核酸分子」とは、インビボでの分解（例えば、エキソヌクレアーゼま
たはエンドヌクレアーゼを介した）に対して、比較的耐性である核酸分子を意味
するべきである。安定化とは、長さまたは二次構造の機能であり得る。数十〜数
百ｋｂ長である非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解に対
して比較的安定である。より短いＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して、二次構造
は安定であり得、そしてそれらの効果を増大させる。例えば、オリゴヌクレオチ
ドの３’末端が、上流領域に対して自己相補性を有する場合、その結果、それは
折り畳み得、そして一種のステムループ構造を形成し得る。次いで、そのオリゴ
ヌクレオチドは安定となり、従ってより高い活性を示す。
【０１０２】
本発明の好ましい安定化オリゴヌクレオチドは、改変骨格を有する。オリゴヌ
クレオチド骨格の改変は、インビボに投与された場合に、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チドの増強した活性を提供することが実証されている。３’末端の多重ホスホロ
チオエート結合中にあるオリゴヌクレオチドの５’末端に、少なくとも２つ（好
ましくは５つ）のホスホロチオエート結合を含むＣｐＧ構築物は、最大の活性を
提供し、そして細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分
解から、このオリゴヌクレオチドを保護する。他の改変オリゴヌクレオチドとし
ては、ホスホジエステル改変オリゴヌクレオチド、ホスホジエステルおよびホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの組合わせ、メチルホスホネート、メチルホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびそれらの組合わせが挙げられ
る。これらの組合わせの各々、および免疫細胞に対するそれらの特定の効果は、
米国特許出願番号第０８／７３８，６５２号、同第０８／９６０，７７４号（そ
れぞれ、１９９６年１０月３０日出願、および１９９７年１０月３０日出願）（
これらの内容全体を、本明細書中で参考として援用する）の優先権を主張する、
同時係属中のＰＣＴ公開特許出願に、より詳細に議論される。これらの改変オリ
ゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞取り込みの増大、タンパク質
結合の増大、および／または細胞内局在化の改変に起因して、より高い刺激活性
を示し得る。
【０１０３】
ＣｐＧモチーフを含むホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌク
レオチドの両方は、樹状細胞のようなＡＰＣにおいて活性である。しかし、Ｃｐ
Ｇ特異的効果を誘導するために必要とされる濃度に基づいて、ヌクレアーゼ耐性
ホスホロチオエート骨格ＣｐＧオリゴヌクレオチドがより強力である（ホスホロ
チオエートについて２μｇ／ｍｌ対し、ホスホジエステルについて９０μｇ／ｍ
ｌの総量）。
【０１０４】
他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、以下を含む：非イオン性ＤＮＡアナ
ログ（例えば、アルキルホスフェートおよびアリールホスフェート、ここで、荷
電したホスホン酸酸素が、アルキル基またはアリール基で置換されている）、ホ
スホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電した酸素部分
はアルキル化されている）。いずれかの末端または両方の末端にジオール（例え
ば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴ
ヌクレオチドはまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示さ
れた。
【０１０５】
免疫リモデリングを誘導するために有用である本発明の核酸配列は、上記に広
範に記載され、そして米国特許出願番号第０８／７３８，６５２号および同第０
８／９６０，７７４号（それぞれ、１９９６年１０月３０日、および１９９７年
１０月３０日出願）に対して優先権を主張するＰＣＴ公開特許出願において開示
される核酸配列である。代表的な配列は、表１および以下に示される免疫刺激性
配列を含むがそれらに限定されない：
【０１０６】
【化３】
特定の免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡの刺激指数は、種々の免疫細胞アッセイにお
いて試験され得る。好ましくは、Ｂ細胞増殖に関する免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡ
の刺激指数は、マウスＢ細胞培養物における3Ｈウリジンの取り込みによって決
定される場合（同時係属中のＰＣＴ特許出願米国特許出願番号第０８／９６０，
７７４号において詳細に記載されるように、この培養物は、２０μＭのオリゴヌ
クレオチドと３７℃にて２０時間接触され、そして１μＣｉの3Ｈウリジンでパ
ルスされており；そして４時間後に収集およびカウントされた）、少なくとも約
５、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約１５、そして最
も好ましくは少なくとも約２０である。例えば、被験体における細胞媒介（局所
的）免疫応答を刺激することによって免疫系不全を処置するインビボでの使用の
ために、免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡが、樹状細胞のようなＡＰＣによるサイトカ
イン分泌を効果的に誘導し得ることが重要である。
【０１０７】
好ましい免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、治療的指示に依存して、実施例において記
載されるアッセイによって決定されるように、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌの
ＴＮＦ−α、１５ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、７０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２
７５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２をもたらすべきであ
る。他の好ましい免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡは、少なくとも約１０％、より好ま
しくは少なくとも約１５％、そして最も好ましくは少なくとも約２０％のＹＡＣ
−１細胞特異的溶解、または少なくとも約３０、より好ましくは少なくとも約３
５、そして最も好ましくは少なくとも約４０％の２Ｃ１１細胞特異的溶解をもた
らすべきである。免疫増強性サイトカインと組み合わせて投与される場合、所望
の免疫応答を生じるために必要とされるＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサイト
カインの両方の量は、より少ない。
【０１０８】
好ましくは、Ｂ細胞増殖に関するＣｐＧオリゴヌクレオチドの刺激指数は、マ
ウスＢ細胞培養物における3Ｈウリジンの取り込みによって決定される場合（こ
の培養物は、米国特許出願番号第０８／７３８，６５２号および同第０８／９６
０，７７４号（それぞれ、１９９６年１０月３０日、および１９９７年１０月３
０日出願）に対して優先権を主張する同時係属中のＰＣＴ公開特許出願において
詳細に記載されるとおり、２０μＭのオリゴヌクレオチドと３７℃にて２０時間
接触され、そして１μＣｉの3Ｈウリジンでパルスされており；そして４時間後
に収集およびカウントされた）、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０
、より好ましくは少なくとも約１５、そして最も好ましくは少なくとも約２０で
ある。例えば、インビボでの使用のために、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサ
イトカインが、樹状細胞のようなＡＰＣの活性化を効果的に誘導し得ることが重
要である。例えば、このことを達成し得るオリゴヌクレオチドは、米国特許出願
番号第０８／７３８，６５２号および同第０８／９６０，７７４号（それぞれ、
１９９６年１０月３０日、および１９９７年１０月３０日出願）に対して優先権
を主張するＰＣＴ公開特許出願において記載されるオリゴヌクレオチドである。
【０１０９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインは、抗原の投与前に
単独で被験体に投与され得る。このオリゴヌクレオチドおよびサイトカインはま
た、即時型抗原特異的応答を提供する抗原と組み合わせて被験体に投与され得る
。次いで、第１の抗原と同じでも異なっていてもよい第２の抗原が、さらなるＣ
ｐＧおよびサイトカインの存在または非存在下でのＣｐＧおよび免疫増強性サイ
トカインの投与後のある時点で被験体に投与され得る。用語「〜と組み合わせて
」は、抗原のわずかに前、またはわずかに後、または同時の、ＣｐＧオリゴヌク
レオチドおよび免疫増強性サイトカインの投与をいう。用語「わずかに前」およ
び「わずかに後」は、２４時間、好ましくは１２時間をいう。ＣｐＧおよびサイ
トカインは、互いに組み合わせて投与され、従ってまた、一緒にまたは別々に投
与され得る。
【０１１０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインが、第１の抗原と組
み合わせて投与される場合、この第１の抗原は、即時型免疫応答の特異性を決定
する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインは、有効な「危
険シグナル」として作用し、そして免疫系を、この領域における新しい抗原に対
して激しく応答させる。この作用様式は、おそらく、主に、樹状細胞および他の
「専門的な」抗原提示細胞に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性
サイトカインの刺激性局所的効果、ならびにＢ細胞に対する同時刺激性効果から
生じる。この効果は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与の際にすぐに生じる。
【０１１１】
治療における使用のために、単独、または核酸／サイトカイン送達複合体とし
て処方された適切なＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインの
有効量は、このオリゴヌクレオチドが適切な標的細胞（例えば、樹状細胞）によ
って取り込まれるのを可能にする任意の様式で被験体に投与され得る。好ましい
投与経路は、経口投与、経皮投与（例えば、パッチを介する）、注射（皮下投与
、静脈内投与、非経口投与、腹腔内投与、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投
与など）、経鼻投与、気管内投与、および粘膜投与を含むがこれらに限定されな
い。注射は、ボーラスまたは連続的注入であり得る。
【０１１２】
用語「有効量」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、所望の生物学的効果を達成す
るに必要または十分な量をいう。例えば、免疫系不全を処置するために少なくと
も１つの非メチル化ＣｐＧを含む有効量のオリゴヌクレオチドは、免疫系の活性
化を生じ、抗原への曝露の際に抗原特異的免疫応答の発生を生じるのに必要な量
であり得る。本明細書中で使用される有効量は、相乗的な免疫応答を生じる量で
ある。相乗作用を引き起こす量は、ＣｐＧ単独またはサイトカイン単独のいずれ
かの個々の効果の合計より大きい、特異的抗原に対する免疫応答を生じる量であ
る。
【０１１３】
任意の特定の適用のために有効な量は、処置される疾患もしくは状態、投与さ
れる特定のＣｐＧオリゴヌクレオチド／サイトカイン（例えば、非メチル化Ｃｐ
Ｇモチーフの数、または核酸におけるそれらの位置）、被験体のサイズ、または
疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して変化し得る。当業者は、過度
な実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチド／サイトカインの有効
量を経験的に決定し得る。
【０１１４】
免疫増強性サイトカインと組み合わせたＣｐＧオリゴヌクレオチドについての
別の使用は、被験体における使用のための避妊方法を与えることである。この特
定の実施態様において、被験体は、好ましくは哺乳動物であり、そして好ましく
は非ヒトである。精巣および卵巣は、「免疫特権（ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌ
ｅｇｅｄ）」である。すなわち、これらは、免疫系とは解剖学的に分かれている
。さらに、精巣および卵巣における細胞は、活性化されたＴ細胞においてアポト
ーシスを誘導するｆａｓリガンドを発現し得る。ｆａｓリガンドの物理的分離お
よび発現はともに、精巣および卵巣における細胞に対する免疫応答を妨げる。免
疫増強性サイトカインと組み合わせて使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドを使
用して、これらの細胞の免疫特権を破壊することによって精巣および卵巣におけ
る細胞を排除または実質的に減少させ、それによって避妊手段を提供し得る。Ｃ
ｐＧオリゴヌクレオチドを、免疫増強性サイトカインと組み合わせて使用し、精
巣および卵巣の細胞の免疫特権を破壊し得る。
【０１１５】
この方法は、被験体に抗原、免疫増強性サイトカイン、および免疫刺激性Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドを投与することによって達成される。ここで、この抗原は
、生殖腺細胞（ｇｏｎａｄａｌ ｃｅｌｌ）抗原、および生殖腺細胞の維持のた
めに必要とされるサイトカインまたはホルモン由来の抗原からなる群から選択さ
れる抗原である。本明細書中で使用される「生殖腺細胞抗原」は、生殖腺細胞（
例えば、精巣細胞または卵巣細胞）の表面上の抗原である。そのような抗原は、
当業者に周知である。生殖腺細胞の維持のために必要とされるサイトカインまた
はホルモン由来の抗原もまた、当該分野において周知である。これらの抗原は、
このサイトカインまたはホルモンに対する免疫応答を引き起こし、従って生殖腺
細胞の損失を生じる。
【０１１６】
本発明の１つの局面において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用して、免疫細
胞、および好ましくはＡＰＣの活性化を誘導する。ＡＰＣは、当該分野において
通常の意味を有し、そして例えば、未成熟樹状細胞および前駆体および前駆体樹
状細胞、ならびに抗原を取り込み、そして発現し得る成熟樹状細胞のような樹状
細胞を含む。ＡＰＣまたは樹状細胞のこのような集団を、ＡＰＣまたは樹状細胞
のプライム化集団（ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）とよぶ。
【０１１７】
樹状細胞は、抗原を提示することによって、そしてそれらの局所的環境中のＬ
ＰＳ様微生物分子を検出するパターン認識レセプターの発現を介して、先天性免
疫系と後天性免疫系との間の連結を形成する。免疫増強性サイトカインおよびＣ
ｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせは、免疫増強性サイトカイン単独でＴｈ２
特異的抗体を産生するのみであった場合に、Ｔｈ１特異的抗体の誘導を示した。
樹状細胞は先天性免疫系と後天性免疫系との間の連結を形成するので、ＣｐＧお
よび免疫増強性サイトカインを用いて樹状細胞を活性化する能力は、癌およびア
レルギー性疾患または感染性疾患のような障害に対する免疫療法のためのＣｐＧ
−免疫増強性サイトカインの組み合わせに基づくストラテジーの使用を支持する
。ＣｐＧおよび免疫増強性サイトカインの組み合わせは、樹状細胞の相乗的活性
化を示す。
【０１１８】
１つの局面において、本発明は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボで
の目的のための樹状細胞を活性化するための方法および産物に関する。本発明に
よって、免疫増強性サイトカインおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせ
は、樹状細胞の強力な活性化因子であることが示された。樹状細胞は、インビボ
での免疫細胞における一次免疫応答の開始のために必須であると考えられる。本
発明によって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインが、ア
ジュバントと類似して、Ｔ細胞における一次免疫応答を開始するように樹状細胞
を活性化し得ることが発見された。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性
サイトカインの組み合わせを使用して樹状細胞を活性化する場合、優勢的にＩｇ
Ｇ２ａそしてより少ないＩｇＧ１の産生が誘導されることが発見された。このこ
とは、この組み合わせが、インビボにおいてＴｈ１免疫応答の発達を増強すると
いう傾向を示す。これらの知見は、ＣｐＧの強力なアジュバント活性を示し、そ
して障害（例えば、癌、感染性疾患、およびアレルギー）の処置における免疫療
法剤としてのＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用の基礎を提供する。１つの局面に
おいて、本発明は、抗原に曝露される樹状細胞を、樹状細胞を相乗的に活性化す
るのに有効な量の免疫増強性サイトカインおよび免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレ
オチドと接触させることによって、樹状細胞を活性化するための方法である。
【０１１９】
樹状細胞は、それが曝露される可溶性の特異的抗原を効率的にインターナライ
ズし、プロセシングし、そして提示する。抗原のインターナリゼーションおよび
提示のプロセスは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）および同時刺激性分
子の発現、サイトカインの産生、ならびにＴ細胞の活性化に関与すると考えられ
ているリンパ器官への移動の迅速なアップレギュレーションを引き起こす。
【０１２０】
本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインの組み合わ
せについての１つの特定の使用は、癌抗原に対する特異的な免疫応答を増強する
目的のために樹状細胞を活性化することである。この免疫応答は、エキソビボ技
術またはインビボ技術を用いて増強され得る。本明細書中で使用される「エキソ
ビボ」方法は、被験体からの樹状細胞の単離、身体の外側でのこの細胞の操作、
およびこの操作された細胞の被験体への再移植を含む方法である。このエキソビ
ボ手順は、自己細胞または異種細胞に対して使用され得るが、好ましくは自己細
胞に対して使用される。好ましい実施態様において、樹状細胞は、末梢血または
骨髄から単離されるが、樹状細胞の任意の供給源から単離され得る。このエキソ
ビボ手順を実施して、特定の癌または他の型の抗原に対して活性な樹状細胞を特
異的に産生する場合、この樹状細胞は、ＣｐＧおよび免疫増強性サイトカインに
加えて、その抗原に曝露され得る。他の場合、この樹状細胞はすでに抗原に曝露
されてい得るが、その表面上でその抗原を効率的に発現してい得ない。あるいは
、その樹状細胞は、直接的な接触または身体における曝露のいずれかによって、
免疫増強性サイトカインに曝露され、そして抗原に曝露され得る。次いでその樹
状細胞は、身体に戻され、続いて全身または局所的のいずれかで被験体に直接的
にＣｐＧが投与される。活性化は、劇的に抗原プロセシングを増加する。次いで
、活性化された樹状細胞は、その表面上に癌抗原を提示する。被験体に戻された
とき、この癌抗原を発現する活性化された樹状細胞は、その癌抗原に特異的であ
るＴ細胞をインビボで活性化する。癌免疫療法のための樹状細胞のエキソビボ操
作は、以下を含む、当該分野におけるいくつかの参考文献に記載されている：Ｅ
ｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、１９９７、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：
１；Ｖａｎ Ｓｃｈｏｏｔｅｎ，Ｗ．ら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ，６月、２５５；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、１９
９６、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４、８４９；およ
びＧｌｕｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｃ．、１９９７、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、３：１８７。本発明の樹
状細胞のエキソビボ活性化は、活性化因子としてのＣｐＧおよび免疫増強性サイ
トカインの使用を除いては、当該分野において公知の慣用的なエキソビボ操作工
程によって実施され得る。
【０１２１】
この樹状細胞はまた、インビボ方法を用いて、ＣｐＧおよび免疫増強性サイト
カインと接触され得る。これを達成するために、ＣｐＧおよび免疫増強性サイト
カインは、免疫療法の必要性のある被験体に直接的に投与される。ＣｐＧおよび
免疫増強性サイトカインは、抗原と組み合わせて投与されても、単独で投与され
てもよい。いくつかの実施態様において、ＣｐＧおよび免疫増強性サイトカイン
は、腫瘍の局所領域に投与されることが好ましく、このことは、当該分野におい
て公知の任意の方法（例えば、腫瘍への直接的注入、薬物の組み合わせを放出す
る移植物を用いる、など）で達成され得る。
【０１２２】
本発明による有用な樹状細胞は、その細胞が、活性な抗原発現樹状細胞を産生
するようにＣｐＧおよびサイトカインによって活性化され得る限り、任意の供給
源から単離され得る。未成熟樹状細胞のいくつかのインビボ供給源が、本発明の
方法によって使用され得る。例えば、骨髄樹状細胞および末梢血樹状細胞はとも
に、ＣｐＧおよびサイトカインによって活性化される未成熟樹状細胞の優れた供
給源である。他の供給源は、当業者によって過度な実験を必要とすることなく容
易に決定され得る。例えば、樹状細胞の初代供給源を単離し、そしてインビトロ
でＣｐＧによる活性化を試験することによる。本発明はまた、その細胞がＣｐＧ
およびサイトカインによって活性化され得る限り、細胞株として培養において維
持される任意の未成熟樹状細胞の使用を含む。そのような細胞型は、当該分野に
おいて公知の標準的なアッセイを用いて慣用的に同定され得る。
【０１２３】
免疫磁気セルソーティングによって単離され、ＣｐＧおよびサイトカインによ
って活性化されている末梢血樹状細胞は、単球由来樹状細胞よりも多くの、樹状
細胞の生理学的細胞集団を示す。未成熟樹状細胞は、骨髄における細胞の約１〜
３％、および末梢血において約１０分の１〜１００分の１を含む。末梢血細胞は
、当該分野において周知のデバイス（例えば、ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓモデルｖ
．５０アフェレーシスデバイス（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ
，ＭＡ））を用いて回収され得る。赤血球および好中球は、遠心分離によって血
液から除去される。境界面に位置する単核細胞が単離される。末梢血からＣＤ４
＋樹状細胞を単離するための方法は、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ Ｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１９９３；１７８：１０６７〜１０７６に記載されている。ＧＭ−ＣＳ
Ｆ単独の存在下で、これらの細胞は、２日以内の特徴的な細胞プロセスを有する
樹状細胞に分化する。分化は、細胞のサイズ、顆粒性、およびＭＨＣ ＩＩ発現
における増加によって付随され、このことは、フローサイトメトリーを用いて容
易に理解され得る。ＧＭ−ＣＳＦの非存在下で培養された新しく単離された樹状
細胞は、迅速にアポトーシスを経る。著しいことに、（ＧＭ−ＣＳＦの添加なし
での）ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下では、細胞生存および分化の両方は、
ＧＭ−ＣＳＦと比較して顕著に改善される。ＣｐＧの存在下で、樹状細胞は、電
子顕微鏡のような超微細構造技術によって試験される場合に、ＧＭ−ＣＳＦとと
もにインキュベートされた樹状細胞中では存在しなかった特徴的な密の多層状細
胞質内体および多小胞構造を示した細胞クラスターを形成する。走査電子顕微鏡
は、細胞間相互作用のために使用されると考えられる長いベールおよびシート様
の突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）、および不規則な細胞形状を示した。対照的に、ＧＭ
−ＣＳＦとともにインキュベートされた細胞は、円形であり、そして少数の細胞
性突起のみを有した。樹状細胞の生存および分化を促進することに加えて、Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドのみの添加は、同時刺激性分子ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）
、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、およびＣＤ４０のアップレギュレーションによって示
されるような活性化を導いた。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの
組み合わせは、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現を相乗的に増強し、このことは、
活性化がＣｐＧ誘導ＧＭ−ＣＳＦに起因しないことを示す。
【０１２４】
（免疫刺激性核酸を作製するための方法）
本発明における使用のために、核酸は、当該分野において周知の多くの手順の
うちのいずれかを使用してデノボ合成され得る。例えば、ｂ−シアノエチルホス
ホロアミダイト法（Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ，１９８１、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホン
酸法（Ｇａｒｅｇｇら、１９８６、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５１
；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９
９〜５４０７；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜
４０５８、Ｇａｆｆｎｅｙら、１９８８）、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜
２６２２。これらの化学は、市場で入手可能な種々の自動化オリゴヌクレオチド
合成機によって実施され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、公知の技術（
例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを使用する
技術）を使用して、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製
され得る。
【０１２５】
インビボでの使用のために、核酸は好ましくは、分解（例えば、エンドヌクレ
アーゼおよびエキソヌクレアーゼを介する分解）に対して比較的耐性である。ス
テムループのような二次構造は、核酸を分解に対して安定にし得る。あるいは、
核酸の安定化は、先に議論されるようなリン酸骨格改変を通じて達成され得る。
好ましい安定化された核酸は、リン酸骨格改変を通じて達成され得る。好ましい
安定化された核酸は、少なくとも部分的なホスホロチオエート改変骨格を有する
。ホスホロチオエートは、ホスホロアミダイト化学またはＨ−ホスホン酸化学の
いずれかを使用する自動化技術を用いて合成され得る。アリールホスホネートお
よびアルキルホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号において
記載されるように作製され得；そしてアルキルホスホトリエステル（ここで、荷
電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許番号０９２
，５７４において記載されるようにアルキル化されている）は、市販の試薬を用
いる自動化固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格改変および置換を作
製するための方法は記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ
，Ａ．、１９９０、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ
．１９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５）。ＣｐＧモチ
ーフを有する２’−Ｏ−メチル核酸もまた、エトキシ改変ＣｐＧ核酸と同様に免
疫活性化を生じる。実際に、ＣｐＧ効果を完全に破壊する骨格改変は見出されて
いないが、ＣｐＧ効果は、Ｃを５−メチルＣで置換することによって非常に低減
される。
【０１２６】
インビボでの投与のために、核酸およびサイトカインは、標的細胞（例えば、
樹状細胞）表面へのより高い親和性の結合、および／または標的細胞による増加
した細胞取り込みを生じ、先に議論されるような「核酸／サイトカイン送達複合
体」を形成する分子と関連し得る。核酸は、当該分野において周知の技術を用い
て、適切な分子とイオン結合または共有結合され得る。種々のカップリング剤ま
たは架橋剤（例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））が使用され得
る。あるいは、核酸は、周知の技術を用いてリポソームまたはヴィロソーム中に
被包され得る。
【０１２７】
活性化樹状細胞、単離されたＣｐＧ核酸分子、サイトカインおよびそれらの混
合物を含む、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な組成物中で投与される。投
与される場合、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な量で適用される。このよ
うな調製物は、通常、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性キャリア、および必要に応じ
て、他の治療剤を含み得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に受容
可能であるべきであるが、薬学的に受容可能でない塩が、それらの薬学的に受容
可能な塩を調製するために都合よく利用され得、そして本発明の範囲から除外さ
れない。このような薬理学的に受容可能な塩および薬学的に受容可能な塩は、以
下の酸：塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サ
リチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩を含むが
、これらに限定されない。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩また
はアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム
塩）として調製され得る。本明細書中で使用される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チド組成物および／または免疫強化サイトカイン組成物は、上記の化合物および
それらの塩を意味する。
【０１２８】
本発明の組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせ得
る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で用いられる場合、ヒ
トまたは他の動物への投与に適切な１つ以上の適合性の固体賦形剤もしくは液体
賦形剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」は、活性
な成分が適用を促進するように組み合わせられる、天然または合成の、有機成分
または無機成分を意味する。薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を
実質的に損なう相互作用が存在しないような様式で、本発明の分子とそして互い
に同時に混合され得る。
【０１２９】
薬学的組成物は、以下を含む適切な緩衝剤を含み得る：酢酸塩；クエン酸塩；
ホウ酸塩；およびリン酸塩。
【０１３０】
薬学的組成物はまた、必要に応じて以下のような適切な防腐剤を含み得る：ベ
ンザルコニウムクロリド；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサール。
【０１３１】
非経口的投与に適切な組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張な、本
発明の組成物の無菌水性調製物を都合よく含み得る。この水性調製物は、適切な
分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の方法に従って、処方され得る
。滅菌した注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤また
は溶媒中の滅菌した注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオ
ール中の溶液のような）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶
媒には、水、リンゲル溶液、および等張な塩化ナトリウム溶液がある。さらに、
滅菌した不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として都合よく使用される。この目
的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激性の低
い不揮発性油が、使用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射可
能な調製物において使用され得る。経口投与、皮下投与、静脈投与、筋肉内投与
などに適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅ
ａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出され得る。
【０１３２】
種々の投与経路が、利用可能である。選択された特定のモードは、もちろん選
択された特定の組成物、処置されている状態の重症度、および治療的有効性に必
要な投与量に依存する。一般的に言えば、本発明の方法は、投与の任意のモード
を使用して実行され得る。このモードは、医学的に受容可能であり、臨床的に受
容不可能な有害な効果を生じることのない有効レベルの活性な化合物を産生する
任意のモードを意味する。このような投与のモードは、経口的経路、直腸経路、
局所経路、経鼻経路、皮内経路、または非経口経路を含む。用語「非経口」は、
皮下、静脈内、筋肉内または注入を含む。静脈内または筋肉内経路は、長期間の
治療および予防に特に適切なわけではない。しかし、それらは、緊急事態に好ま
しく有り得る。経口投与は、予防的処置において好ましい。なぜなら、経口投与
は、患者および投薬計画に都合がいいからである。
【０１３３】
この組成物は、単位用量形態で好都合に提示され得、そして薬学分野で周知の
方法のいずれかにより調製され得る。すべての方法は、本発明の組成物を１つ以
上の補助成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、これら
の組成物は、本発明の組成物を液体キャリア、細かく分割された固体キャリア、
またはその両方と均一かつ親密に会合させ、次いで、必要であれば、産物を成形
することにより調製される。
【０１３４】
経口投与に適した組成物は、それぞれが本発明の組成物の予め決定した量を含
む別々のユニット（例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤）として示され得る
。他の組成物は、水性の液体中の懸濁物または非水性の液体中の懸濁物（例えば
、シロップ、エリキシルまたは乳濁液）を含む。
【０１３５】
他の送達系は、時間放出送達系、遅延放出送達系、または持続放出送達系を含
み得る。このような系は、上記の本発明の組成物の反復投与を避け、被験体およ
び医者の便利さを増す。放出性送達系の多くの型が、利用可能であり、そして当
業者に公知である。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレ
ート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒ
ドロキシ酪酸、およびポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）のようなポリ
マーベースの系を含む。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例え
ば、米国特許第５，０５７，１０９号に記載される。送達系はまた、以下の非ポ
リマー系を含む：コレステロールのようなステロール、コレステロールエステル
および脂肪酸、またはモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドのよ
うな中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉ
ｃ）系；ペプチドに基づいた系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦
形剤を使用する圧縮した錠剤；部分的に融合した移植片など。特定の例は、以下
を含むがそれらに限定されない：（ａ）本発明の組成物が、米国特許第４，４５
２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，４７８，０３４号および同
第５，２３９，６６０号に記載されるような形態でマトリクス内に含まれる、侵
食系、ならびに（ｂ）活性な成分が、制御された速度で米国特許第３，８３２，
２５３号および同第３，８５４，４８０号に記載されるようにポリマーから浸透
する、分散性の系。さらに、ポンプに基づいたハードウェア送達系が、使用され
得、それらのいくつかは、移植に適用される。
【０１３６】
長期間持続放出移植片の使用は、慢性的な状態の処置のために特に適切であり
得る。長期間の放出は、本明細書で使用される場合、移植片が、少なくとも３０
日および好ましくは６０日の間、治療的レベルの活性な成分の送達のために作製
およびアレンジされていることを意味する。長期間持続放出移植片は、当業者に
周知であり、そして上記の放出系のいくつかを含む。
【実施例】
【０１３７】
（実施例）
（実施例１：材料および方法）
腫瘍モデルおよび腫瘍抗原：３８Ｃ１３マウスＢ細胞リンパ腫モデルは、抗体
に基づく治療およびリンパ腫の活性な免疫化の研究において広範に使用されてい
る（Ｋｗａｋ，Ｌ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１０９７２−７、１９９６）。３８Ｃ１３表面ＩｇＭのイディオタイプ（
Ｉｄ）は、非常に特異的な腫瘍関連抗原として作用する（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｙ．
およびＨａｉｍｏｖｉｃｈ，Ｊ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：４１３−
７、１９９７）。Ｉｄは、Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２２
：２４３０（１９７９）に記載されるように３８Ｃ１３ ＩｇＭを分泌する細胞
株の上清から得て、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。精製されたＩｄを、グルタルアルデヒドを使用してキーホールリン
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化し、そして免疫原として使用した。３
８Ｃ１３ Ｉｄ／マウスＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を産生する細胞株を、Ｒｏ
ｎａｌｄ Ｌｅｖｙ博士により親切にも提供していただいた。この細胞株を、中
空繊維リアクター（Ｕｎｉｓｙｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔ
ｏｎ、ＭＡ）中で培養し、そして融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティ
ークロマトグラフィーにより得た。融合タンパク質は、３８Ｃ１３ Ｉｄ重鎖可
変領域および軽鎖可変領域、ヒトＩｇＧ1重鎖定常領域および軽鎖定常領域、な
らびにマウスＧＭ−ＣＳＦ配列からなる（Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．およびＬｅｖｙ，Ｒ
．、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７５５−７５８、１９９３）。二機能性反応性を、
使用前にＥＬＩＳＡにより確認した。プレートを抗Ｉｄを用いて被膜し、融合タ
ンパク質の系列希釈物を添加し、そして抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体とのプロービングに
より、結合したＧＭ−ＣＳＦ部分の存在を評価した。３８Ｃ１３ Ｉｄ／ヒトＧ
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質を、同様の様式により得て、そしてコントロールとし
て使用した。
【０１３８】
免疫化：２つのホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドを、商業的に購
入し、そしてＧＭＰ条件下で生成した（Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．、Ｗｉｌｓｏｎ
ｖｉｌｌｅ、ＯＲ）。両方のオリゴヌクレオチド配列は、全てのアッセイにおい
て同様の効果を有した。他に示さない限り、ＣｐＧオリゴヌクレオチド１７５８
を使用した。オリゴヌクレオチド１７５８は、以下の配列を有し：
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１０４）
そしてオリゴヌクレオチド１８２６は、以下の配列を有した：
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号３）。
【０１３９】
両方のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、メチル化されていなかった。検出可能な
エンドトキシンは、ＬＡＬアッセイではどちらのＣｐＧオリゴヌクレオチドにお
いても存在しなかった。以前の研究が、非免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ア
ジュバント効果をほとんど有さないことを実証した（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８３３−１０８
３７、１９９７）。それゆえ、非免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、この研究に
は含まれなかった。樹状細胞のインビトロ生成のためのマウスＧＭ−ＣＳＦは、
商業的に購入した（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）。イン
ビトロ研究のためのＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｍｍｕｎｅｘにより親切にも提供してい
ただいた（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）。
【０１４０】
Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙから得た雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマ
ウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｕ
ｎｉｔにて飼育し、そして６〜９週齢で使用した。各マウスを、総量２００μｌ
の示した抗原およびアジュバントを、ＰＢＳをビヒクルとして使用して皮下に免
疫した。
【０１４１】
抗ＩｄレベルのＥＬＩＳＡ決定：血清を、メトファン（ｍｅｔｏｐｈａｎｅ）
を用いる吸入麻酔後に、後部眼窩の穿刺によりマウスから得た。マイクロタイタ
ープレートを、５μｇ／ｍｌの３８Ｃ１３ ＩｇＭまたは関係のないＩｇＭを用
いて一晩被膜した。ＩｇＭ被膜プレートを、５％乳汁でブロックし、そして血清
の系列希釈を添加した。既知の濃度のモノクローナル抗Ｉｄを添加したネイティ
ブのマウスからの血清を、標準物として使用した。プレートを洗浄し、そして重
鎖特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ1またはＩｇＧ2a（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａ
Ｌ）を添加し、続いて比色基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加した。プ
レートを、マイクロプレートリーダーを使用して評価した。試験曲線を、標準曲
線と比較し、抗Ｉｄの濃度を決定した。値は、標準曲線およびサンプル曲線が、
同じ形である場合にのみ、有効であると考えた。コントロール（関係のないマウ
スＩｇＭ）との血清の反応性を並行して評価した。そしてそれは、全てのアッセ
イにおいて陰性であった。このことにより、免疫応答が、アイソタイプ応答の発
生のためではないことを確認した。
【０１４２】
インビトロ生存研究：示した抗原およびアジュバントを使用する単回皮下免疫
の３日後、マウスを、１，０００の３８Ｃ１３生細胞を用いて腹腔内接種をした
。細胞は、接種前に、少なくとも４日間対数期で増殖した。腫瘍を発症させたマ
ウスは、鼠径部および腹部に、塊、腹水および悪液質を示した。腫瘍を発症させ
た全てのマウスが死亡した。生存を決定し、そして死ぬまでの時間に対する有意
性を、コックス回帰分析を使用して評価した。統計的な目的のために、６０日の
生存を、腫瘍を有さずに維持したマウスについて設定した。無期限でそのような
全てのマウスを腫瘍を有さずに維持し、そして少なくとも１００日間モニターし
た。
【０１４３】
樹状細胞産生および刺激：樹状細胞を、以前に記載されたアプローチ（Ｚｉｔ
ｖｏｇｅｌ，Ｌ．ら、Ｊ Ｅｘ Ｍｅｄ １８３：８７−９７、１９９６；Ｍａ
ｙｏｒｄｏｍｏ，Ｊ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：１２９７
−３０２、１９９５）を改変したアプローチを使用して得た。簡潔には、骨髄細
胞を、実験されていない６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの大腿骨および脛骨
をフラッシュすることにより得た。赤血球細胞を、溶解し、そしてＴ細胞を、抗
ＣＤ３（１４５．２Ｃ１１）抗体、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）抗体および抗ＣＤ８
（５３．６．７）抗体の混合物を使用して、補体媒介溶解により取り除いた。次
いで、Ｂ細胞を、抗Ｂ−２２０で被膜したフラスコを使用するパニングにより取
り除いた。残った細胞を、一晩固着させた。非固着細胞を、１．２５×１０5細
胞／ｍｌの濃度の、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌの
ｍｕＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を補充した
培地で培養した。培地を４日後に交換し、そして骨髄を採取した７日後に樹状細
胞を採取した。樹状細胞の表現型および形態を、フローサイトメトリー分析およ
び走査型電子顕微鏡により確認した。樹状細胞を、洗浄し、計数し、そして１×
１０5細胞を、最終濃度１００μｇ／ｍｌの抗体および最終濃度５０μｇ／ｍｌ
のＣｐＧオリゴヌクレオチドとともに総容量２００μｌ中で、１８時間培養した
。サイトカインレベルの測定のために、全てのサンプルを、４連で行なった。上
清を採取し、そして記載されるように（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２８７９−８３、１９９６；Ｙ
ｉ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：５５８−６４、１９９６）ＩＬ
−６およびＩＬ−１２の存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１４４】
（実施例２：ＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとして使用した場合、ＣｐＧオリゴ
ヌクレオチドは、Ｉｄ−ＫＬＨ免疫に対する抗体応答の発生を増強する）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＧＭ−ＣＳＦを含む多くのサイトカインのＡＰ
Ｃによる産生を誘導することが公知である（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｄ
ｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：７３−６、１９９６）。ＧＭ−ＣＳ
ＦへのＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加が、免疫応答をさらに増強するかどうか
を決定するために、マウスを、５０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、１０μｇ
のＧＭ−ＣＳＦ、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの混合物
と水溶液中で混合したＰＢＳ中の５０μｇのＩｄ−ＫＬＨの単回の皮下注射によ
り免疫した。血清を毎週採取し、そして抗原特異的ＩｇＧ（抗Ｉｄ ＩｇＧ）の
存在についてＥＬＩＳＡにより評価した。図１に示すように、ＣｐＧオリゴヌク
レオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの両方を使用して免疫したマウスは、最高レベルの
抗Ｉｄ ＩｇＧを発達させた。これらの２つのアジュバントの効果は、相化的で
あることが明らかとなった。
【０１４５】
従って、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせは、抗原
取りこみを増加するＧＭ−ＣＳＦとの免疫応答の誘導における多くの異なる段階
を増強し得る一方で、エフェクター細胞活性化に関与するサイトカインの産生を
含む下流の応答を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが増強する。さらに、ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、抗原レセプターを介したＢ細胞活性化の相乗的な促進により
寄与し、そしてこのことが、抗原特異的Ｂ細胞を優先的に活性化する（Ｋｒｉｅ
ｇ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−９、１９９５）。この上記に
示したデータは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせを
含む免疫ストラテジーが、特に効果的であることを提示した。ＣｐＧオリゴヌク
レオチドおよび可溶性ＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｄ−ＫＬＨでの免疫後に、抗Ｉｄ Ｉ
ｇＧを誘導するその能力においてのみ相加的であった。このことは、マウスＧＭ
−ＣＳＦの短い半減期に起因し得る（Ｋｅｄａｒ，Ｅ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒａｐｙ ２０：１８０−９３、１９９７）。
【０１４６】
（実施例３：ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク
質での免疫に続く抗Ｉｄ抗体の産生を増強する）
３８Ｃ１３可変領域、ヒトＩｇＧ定常領域、およびマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｄ
／ＧＭ−ＣＳＦ）からなるＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、優れた免疫原
であることが示されている（Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．およびＬｅｖｙ，Ｒ．、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６２：７５５−７５８、１９９３）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、Ｉ
ｄ／ＧＭ−ＣＳＦにより誘導される特異的抗体応答をさらに増強し得るか否かを
評価するために、マウスを、Ｉｄ−ＫＬＨまたはアジュバントとしてＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドを含むＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを
含まないＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫した。血清を毎週採取し、そして抗Ｉｄ Ｉ
ｇＧレベルを決定した。どのマウスにおいても毒性は、観察されなかった。図２
に示すように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦに応答して抗
Ｉｄ応答の産生を増強した。
【０１４７】
別の実験において、同じ抗原およびアジュバントを用いて、マウスを０日目に
免疫し、そして１４日目にブーストした。Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせは、２回の免疫後、明らかに高レベルの抗Ｉｄ Ｉ
ｇＧを誘導した（図３）。最後の免疫の１週間後に採取した血清は、２．５ｍｇ
／ｍｌを超える抗Ｉｄ ＩｇＧを含んだ。３８Ｃ１３ＩｄおよびＧＭ−ＣＳＦ（
Ｉｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦ）からなる融合タンパク質を、コントロールとして誘導
した。なぜなら、ヒトＧＭ−ＣＳＦは、マウスの系においては活性ではないから
である。Ｉｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦは、マウスＧＭ−ＣＳＦ配列をヒトＧＭ−ＣＳ
Ｆ配列で置換したことを除いて、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦと同一であった。ＣｐＧオ
リゴヌクレオチドを含むＩｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドを含まないＩｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫した後に産生される抗Ｉｄの
レベルは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ後に見られたレベルより有意に低く、そしてＩｄ
−ＫＬＨで見られたレベルに類似していた。このことは、生物学的に活性なＧＭ
−ＣＳＦが、観察された効果に重要であることを実証する。
【０１４８】
（実施例４：ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＩｇＧ2aアイソタイプの抗原特異
的抗体の産生を増強する）
ＩｇＧ1の増強された産生は、Ｔｈ２応答を反映するが、優勢なＩｇＧ2a産生
は、Ｔｈ１応答を示す（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：
２５５−８、１９８８）。さらに、マウスＩｇＧ2aは、抗体依存細胞傷害性の媒
介においてマウスＩｇＧよりさらに効果的であり、そしてモノクローナルＩｇＧ
2aは、マウスにおいて腫瘍を処置するための治療的抗体のセットとして、同じ可
変領域を有するモノクローナルＩｇＧよりもよく機能する（Ｋａｍｉｎｓｋｉ，
Ｍ．Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３６：１１２３−１１３０、１９８６）。ア
イソタイプを、抗Ｉｄ ＩｇＧに対して分析し、そして抗Ｉｄ ＩｇＧ1および
ＩｇＧ2aの存在を免疫後に評価した（図４）。免疫は、Ｉｄ−ＫＬＨまたはＩｄ
／ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドとの種々の組み
合わせを含んだ。血清を、単回の免疫から４週間後にサンプリングした。ＣｐＧ
オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを有さない対応する条件下で
見られた産生と比較して増強された抗Ｉｄ ＩｇＧ2aの産生を誘導した。同様の
ＩｇＧ1／ＩｇＧ2aの比率が、他の時点でも見られた。
【０１４９】
（実施例５：ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパ
ク質を使用する免疫は、腫瘍増殖からマウスをさらに保護する）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ免疫との有効なアジュ
バントとして作用に得るか否かを評価するために、マウスをＣｐＧオリゴヌクレ
オチドを有するＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドを有さない
Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦで単回免疫した３日後に、腫瘍でチャレンジした。この日程
での免疫は、Ｉｄ−ＫＬＨを用いると最小限の効果にすぎなかった。ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチド１７５８およびＣｐＧオリゴヌクレオチド１８２６は、単独で、
またはＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせで用いた場合、生存の延長に対して同
等に効果的であった。図５に示したこのデータは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド１
７５８およびＣｐＧオリゴヌクレオチド１８２６で処置したマウスの組み合わせ
た結果を示す。全ての非免疫化マウス、および抗原を有さないＣｐＧオリゴヌク
レオチドで処置したマウスは、腫瘍を発達させ、そして５０日以内に死亡した。
Ｉ／ＧＭ−ＣＳＦ単独で免疫したマウスの３０％が、罹患しないままであったが
、一方Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドで免疫したグループ
の７０％が、罹患しないままであった。Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴ
ヌクレオチドで免疫したマウスは、生存していた。このことは、非免疫またはＣ
ｐＧオリゴヌクレオチド単独で処置した場合と比べて統計的に優位であった（Ｐ
＜０．００１）。Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ単独で免疫したもの対ＣｐＧオリゴヌクレ
オチドおよびＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫したものとの間の差異は、統計的有意さ
が類似していた（Ｐ−０．０７２）。
【０１５０】
これらの研究および実施例５の研究において、抗Ｉｄ ＩｇＧの顕著なレベル
が、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドでの反復した免疫後に
達成された。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、可溶性ＧＭ−ＣＳＦおよびＩｄ／Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質での免疫を含む研究した全ての条件下において、Ｉｇ
ＧSAに対する応答を変化させた。このことは、ＴＨ１応答の増強を示唆した。こ
のアプローチを用いる免疫は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオ
チドでの免疫のたった３日後で腫瘍増殖からの保護を生じた。これは、この広範
な研究モデルにおいて、今までのところ報告された最も効果的な保護である。
【０１５１】
（実施例６：樹状細胞表現型に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドの効果）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの相乗的な効果は、これらの薬
剤が、一緒にＡＰＣによる同時刺激分子の発現またはＭＨＣの発現を増強し得る
ことを示唆する。骨髄由来の樹状細胞によるこれらの分子の発現を、評価した。
Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＣｐＧオリゴヌクレオチドでパルスした樹状
細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌ
クレオチドの組み合わせに応答してのクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ発現の
穏やかな増加を実証した。ＣＤ８０およびＣＤ８６発現のベースライン発現は、
高かった。そしてそれは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチド
によって、顕著には変化しなかった（図６）。
【０１５２】
（実施例７：ＣｐＧオリゴヌクレオドはＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦでパルスした樹状
細胞によるＩＬ−１２の産生を増強する）
抗原に対するＴｈ１応答の増強は、樹状細胞のようなＡＰＣによるＩＬ−１２
産生を増強するＣｐＧオリゴヌクレオチドの能力により説明され得た。抗原（Ｉ
ｄ／ＧＭ−ＣＳＦを含む）でパルスされた骨髄由来の樹状細胞によるＩＬ−１２
の産生を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下で評価した。図７に示すように、
ＣｐＧオリゴヌクレオチドで樹状細胞をパルスすることは、特に細胞を、Ｉｄ／
ＧＭ−ＣＳＦでもパルスした場合に、ＩＬ−１２の産生を増加した。樹状細胞に
よるＩＬ−６の産生もまた、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳに対するＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドの添加により増加したが、その効果は、ＩＬ−１２についてよりも低く示され
た。樹状細胞でのサイトカイン産生に対するＧＭ−ＣＳＦ単独の影響は、研究さ
れなかった。なぜならば、これらの細胞は、ＧＭ−ＣＳＦを使用して生成された
からである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドにより誘導された樹状細胞によるＩＬ−
１２の産生の明らかな増強は、少なくとも部分的にＴｈ１応答の増強を説明し得
る。
【０１５３】
（実施例８：ヒトＩＬ−１２分泌を誘導するホスホロチオエートリゴヌクレオ
チドの同定）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＩＬ−１２分泌を誘導する能力は、そのアジュバ
ントの潜在能力、特にＩＬ−１２に高度に依存するＴｈ１免疫応答を誘導するそ
の能力に関する良い指標である。それゆえ、一団のホスホロチオエートリゴヌク
レオチドが、インビトロでヒトＰＢＭＣからＩＬ−１２分泌を誘導する能力を試
験した（表１）。これらの実験は、いくつかのヒトＰＢＭＣにおいて、ほとんど
のＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＩＬ−１２の分泌を誘導し得ることを示した（
例えば、実験１）。しかし、他のドナーは、少数のＣｐＧオリゴヌクレオチドに
のみ応答した（例えば、実験２）。オリゴヌクレオチド２００６は、ほとんどの
被験体からＩＬ−１２分泌の一貫した誘導物質であった（表２）。
【０１５４】
【表２】
（実施例９：ＣｐＧおよびＧＭ−ＣＳＦは、ＤＣに対する同時刺激性分子を相
乗的に増加する）
（方法）
エンドトキシンの検出。ＬＰＳの活性を、リムルスアメーバ様細胞溶解産物（
ＬＡＬ）アッセイを使用してＦＤＡにより標準化する（ＥＵ／ｍｌ）。本発明者
らによるＬＡＬアッセイの検出下限は、０．０３ＥＵ／ｍｌであった（ＬＡＬ−
ａｓｓａｙ Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）
。本研究において使用したＬＰＳサンプル（ネズミチフス菌由来、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、４．３５ｎｇ／ＥＵ
の活性を有した。エンドトキシンは、オリゴヌクレオチドにおいて検出され得な
かった（＜０．０７５ＥＵ／ｍｇ）。
【０１５５】
（結果）
形態学およびＭＨＣ ＩＩの発現の基準によるＤＣの分化は、ＤＣによる特異
的な免疫応答の誘導については十分ではない。同時刺激性分子の発現によるＤＣ
の機能的な活性が必要である。本発明者らは、細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１
、ＣＤ５４）、ならびに同時刺激性表面分子Ｂ７−２（ＣＤ８６）およびＣＤ４
０の発現に対するＣｐＧの効果を試験した。最初、本発明者らは、ＤＣ（分化）
に対するＭＨＣ ＩＩの増強された発現が、ＣＤ５４発現のより反映された活性
化に関連するか否かに興味を持った。陽性の関連を見出し得ず、このことは、分
化が、ＤＣの活性化と必ずしも関連しないことを確認した（図８）。同時刺激性
分子ＣＤ５４（図９、パネルＡ）、ＣＤ８６（図９、パネルＢ）、およびＣＤ４
０（図９、パネルＣ）の発現は、生存可能なＤＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）によ
り、フローサイトメトリーにおいて定量した。全ての実験において、ＣｐＧは、
同時刺激性分子の発現の増強においてＧＭＣＳＦよりも優れていた。細胞のみの
サンプルと比較して、ＣｐＧオリゴヌクレオチド２００６は、ＣＤ５４（２５．
０＋−５．７対７．０＋−１．８；ｐ＝０．０２、ｎ＝５）、ＣＤ８６（３．９
＋−０．８対１．６＋−０．３；ｐ＝０．０１；ｎ＝５）およびＣＤ４０（３．
５＋−１．０対０．９＋−０．１；ｐ＝０．０４、ｎ＝４）の発現を増強した。
ＧＭＣＳＦおよび２００６の組み合わせは、ＣＤ５４（３８．５＋−７．９；ｐ
＝０．０３；ｎ＝５）に対して相加的な効果を示し、そしてＣＤ８６およびＣＤ
４０の発現を相乗的に増加した（ＣＤ８６：７．０＋−１．６；ｐ＝０．０１；
ｎ＝５；ＣＤ４０：８．５＋−１．０；ｐ＜０．０１；ｎ＝４）。
【０１５６】
特異性を２１１７（２００６のメチル化バージョン）および２０７８（２０８
０のＧｐＣバージョン）を使用して試験した。非ＣｐＧオリゴヌクレオチド２１
１７は、ＧＭＣＳＦと組み合わせた場合、ＣＤ４０発現の相乗的な増強を示さな
かった。
【０１５７】
【表１】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに十分であると考
えられる。本願中に引用される全ての参考文献、特許および特許公開は、その全
体が本明細書中に参考として援用される。
脚注：
1ＰＢＭＣを正常ドナーから採取し、そしてＦｉｃｏｌｌ上で遠心分離した。
次いで、ＰＢＭＣを、培養物に６μｇ／ｍｌで添加された、示したオリゴヌクレ
オチドを含むかまたは含まない９６ウェルマイクロタイタープレート中に１０6
細胞／ｍｌで培養した。方法において記載されたように、上清を２４時間で回収
し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＬ−１２レベルについて試験した。標準曲線を
、各実験において作成した。これは異なるドナーを表す。
（配列表）
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【表１−１０】
【表１−１１】
【表１−１２】
【表１−１３】
【表１−１４】
【表１−１５】
【表１−１６】
【表１−１７】
【表１−１８】
【表１−１９】
【表１−２０】
【表１−２１】
【表１−２２】
【表１−２３】
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、ＣｐＧ ＯＤＮおよび可溶性ＧＭ−ＣＳＦの組み合わせを用いた免疫後の抗Ｉｄ ＩｇＧの産生を示すグラフである。マウスは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ ＯＤＮまたはその両方を、水溶液中に混合した、単回の皮下用量として、５０μｇのＩｄ−ＫＬＨで免疫された。血液を毎週得て、そして血清をＥＬＩＳＡを用いて、抗Ｉｄ ＩｇＧの存在について見積もった。既知濃度のモノクローナル抗Ｉｄを追加した正常なマウス血清を標準として用いた。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図２】図２は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質およびＣｐＧ ＯＤＮの組み合わせを用いる免疫が抗原特異的ＩｇＧの産生を増強することを示すグラフである。マウスは、ＣｐＧ ＯＤＮとともに、またはＣｐＧ ＯＤＮなしで、単回の皮下用量として５０μｇのＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫された。血液を、毎週得て、そして血清をＥＬＩＳＡを用いて、抗Ｉｄ ＩｇＧの存在について見積もった。既知濃度のモノクローナル抗Ｉｄを追加した正常なマウス血清を標準として用いた。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図３】図３は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質およびＣｐＧ ＯＤＮの組み合わせを用いる反復した免疫を用いる免疫が、抗原特異的ＩｇＧの高いレベルを誘導することを示すグラフである。マウスは、０週および再度２週に、ＣｐＧ ＯＤＮとともに、またはＣｐＧ ＯＤＮなしで、皮下用量として５０μｇのＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫された。血液を、毎週得て、そして血清をＥＬＩＳＡを用いて、抗Ｉｄ ＩｇＧの存在について見積もった。既知濃度のモノクローナル抗Ｉｄを追加した正常なマウス血清を、標準として用いた。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図４】図４は、ＣｐＧ ＯＤＮがＩｇＧ2aアイソタイプの抗原特異的抗体の産生を増強することを示す棒グラフである。マウスを、Ｉｄ−ＫＬＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質およびＣｐＧ ＯＤＮの種々の組み合わせを用いて単回用量で免疫した。血清を、単回免疫の４週間後に得た。抗Ｉｄ ＩｇＧ1および抗Ｉｄ ＩｇＧ2aを、ＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図５】図５は、ＣｐＧ ＯＤＮが腫瘍増殖に対するＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ防御の防御的効果を増強することを示す生存曲線である。マウスを、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＣｐＧ ＯＤＮの単回注射を用いて免疫し、そして３日後に腫瘍にチャレンジした。生存を、１００日間追跡した。５１日後に生存したすべてのマウスは、全観察期間について腫瘍のないままであった。それぞれの群に２０匹のマウスを含んだ。
【図６】図６は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＣｐＧ ＯＤＮを用いた骨髄由来樹状細胞のパルシング後の、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＣｐＧ ＯＤＮが、Ｉｄ−ＫＬＨまたはＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦでパルスされた樹状細胞によるＩＬ−１２産生を増強することを例証する棒グラフである。骨髄由来樹状細胞を１８時間、ＣｐＧ ＯＤＮと共にまたはＣｐＧ ＯＤＮなしで抗原でパルスし、そしてＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡにより決定した。ＣｐＧ ＯＤＮは、樹状細胞（特にＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質でパルスした樹状細胞）によるＩＬ−１２の産生を顕著に増強した。
【図８】図８は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧに応答する樹状細胞のＩＣＡＭ−１発現およびＭＨＣ ＩＩ発現を実証するＦＡＣＳチャートを示す。前駆樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）および２００６（ＣｐＧホスホロチオエート；６μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間インキュベートした。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＭＨＣＩＩの発現を、フローサイトメトリー（２５００の生存可能細胞がそれぞれのサンプルにおいて計数される）で試験した。
【図９】図９は、ＣｐＧによる樹状細胞上での同時刺激分子発現の誘導を示すいくつかのグラフである。樹状前駆細胞を、示されるようにＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびオリゴヌクレオチド（２００６：ＣｐＧホスホロチオエート；６μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間インキュベートした。ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の発現（パネルＡ）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）の発現（パネルＢ）およびＣＤ４０の発現（パネルＣ）を、フローサイトメトリー（ＭＦＩ，平均蛍光強度）により定量した。ＧＭ−ＣＳＦおよび２００６の組み合わせは、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現増加について相乗作用を示すが、一方、ＣＤ５４への効果は相加的であった。結果は、５つの独立した実験（ＣＤ５４およびＣＤ８６）ならびに４実験（ＣＤ４０）の平均を示す。サンプルのみの細胞と比較した増加の統計的有意性は、*（ｐ＜０．０５）により示される。統計的評価は、対応のないｔ検定により実行され、誤差帯はＳＥＭを示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの
相乗効果的組み合わせに関する。詳細には、本発明は、化合物およびそれに関連
する産物の相乗効果的組み合わせを用いる免疫応答の刺激方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫監視機構の理論は、免疫系の主要機能が、腫瘍形成の前に腫瘍性細胞を検
出し、そして排除することであるということである。この理論の基礎的な原理は
、癌の細胞が正常な細胞とは抗原的に異なり、従って、免疫学的に不適合の同種
移植片の拒絶を起こす免疫反応と類似する免疫反応を惹起することである。いく
つかの研究が、腫瘍細胞は、抗原の発現において、量的にかまたは質的にのいず
れかで異なることを確認した。例えば、「腫瘍特異的抗原」は、腫瘍細胞とは特
異的に関連するが正常細胞とは関連しない抗原である。腫瘍特異的抗原の例は、
ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスによって誘発される腫瘍におけるウイルス
抗原である。「腫瘍関連」抗原は、腫瘍細胞および正常細胞の両方に存在するが
、腫瘍細胞においては、異なる量または異なる形態で存在する。このような抗原
の例は、腫瘍胎児性抗原（例えば、癌胎児抗原）、分化抗原（例えば、Ｔ抗原お
よびＴｎ抗原）、および癌遺伝子産物（例えば、ＨＥＲ／ｎｅｕ）である。
【０００３】
インビトロおよびインビボで腫瘍標的を殺傷し得る異なる型の細胞は、同定さ
れている：ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ
）、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）および活性化マクロファージ。
ＮＫ細胞は、事前に特定抗原に感作されることなく、腫瘍細胞を殺傷し得、そし
て活性は、標的細胞上での主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードさ
れるクラスＩ抗原の存在を必要としない。ＮＫ細胞は、新生の腫瘍の制御に、お
よび転移性増殖の制御に関与すると考えられる。ＮＫ細胞と対照的に、ＣＴＬは
、ＣＴＬが腫瘍抗原に感作された後で、そしてその標的抗原が、ＭＨＣクラスＩ
も発現する腫瘍細胞上で発現される場合のみ、腫瘍細胞を殺傷し得る。ＣＴＬは
、移植された腫瘍およびＤＮＡウイルスにより生じた腫瘍の拒絶において、エフ
ェクター細胞であると考えられる。ＬＡＫ細胞は、ＮＫおよびＣＴＬ集団とは異
なるヌルリンパ球のサブセットである。活性化マクロファージは、一旦活性化さ
れると、抗原依存性でもなくＭＨＣ拘束でもない様式で腫瘍細胞を殺傷し得る。
活性化マクロファージは、それが浸潤する腫瘍の増殖速度を減じると考えられる
。インビトロアッセイは、他の免疫機構（例えば、抗体依存性、細胞媒介性細胞
傷害性反応および抗体プラス補体による溶解）を同定した。しかし、これらの免
疫エフェクター機構は、インビボにおけるＮＫ、ＣＴＬ、ＬＡＫおよびマクロフ
ァージの機能よりも、インビボにおいてより重要度が低いと考えられる（概説と
しては、Ｐｉｅｓｓｅｎｓ，Ｗ．Ｆ．およびＤａｖｉｄ，Ｊ．「Ｔｕｍｏｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ，第２巻、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎ．Ｙ
．，１〜１３頁，１９９６を参照のこと）。
【０００４】
癌の免疫学における最も複雑な現象の１つは、腫瘍を排除するための免疫系の
不全に関する。１９７０年代に、Ｈｅｗｉｔｔは、ほとんどの腫瘍がどんな腫瘍
特異的抗原もネオ抗原も発現せず、従って、免疫系により「外来」として認識さ
れ得ないという概念を示した。実際のところ、腫瘍特異的であることが見出され
た、抗体により認識される腫瘍細胞表面抗原は実際にはなく、さらに、ほとんど
の自然発症のマウス腫瘍は、同系の宿主に移植された場合にその腫瘍が排除され
得ないことにより規定されるように、「免疫原性に乏しい」と考えられた（Ｈｅ
ｗｉｔｔら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３：２４１〜２５９、１９７６）。し
かし、これらの同じ腫瘍は、新しい抗原が腫瘍細胞表面で発現される場合、変異
誘発によって「免疫原性」を与えられ得る（Ｖａｎ Ｐｅｌ ａｎｄ Ｂｏｏｎ
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４７１８〜４７２２
，１９８２）。免疫系は、ネオ抗原が存在しないことによってではなく、むしろ
インビボにおいて抗原への応答が不十分であることによって腫瘍を排除し得ない
という可能性がある。従って、腫瘍細胞への宿主の免疫応答を増強することによ
る腫瘍細胞の免疫原性を増強するための方法は、免疫療法において重要な進歩を
提供する。
【０００５】
免疫療法の目的は、樹立された腫瘍に対する患者の免疫応答を増強することで
ある。免疫療法の１つの方法としては、アジュバントの使用が挙げられる。微生
物（例えば、ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ）に由来する
アジュバント物質は、免疫応答を高め、そして動物における腫瘍への耐性を増強
する。ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎは、多数の臨床試験
で試験されたが、結果は定まっておらず、そしてこの型の細菌アジュバント療法
の価値は未定のままである（Ｐｉｅｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ，１９９６
、前出）。
【０００６】
多数の細菌産物（例えば、リポ多糖）は、哺乳動物の免疫応答を刺激すること
が公知である。最近、細菌ＤＮＡ自体が、そのような分子の１つであることが報
告されている（例えば、Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７
４：５４６〜９）。細菌ＤＮＡ（強力な免疫刺激因子効果を有する）と脊椎動物
ＤＮＡ（その効果を持たない）との間の主要な差異の１つは、細菌のＤＮＡが、
脊椎動物ＤＮＡが含むよりも、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのより高い頻度
を含むことである。非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含む選択合
成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、免疫学的効果を有し、そしてＢ細
胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、単球およびマクロファー
ジ）の活性化を誘導し得ることが示されている（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら、前出
）。これはまた、活性な免疫応答の発生に参加することが公知のサイトカインの
産生を増強し得る。これには、腫瘍壊死因子−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−６が
挙げられる（例えば、Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２８７９〜２８８３，１９９６）。
【０００７】
細胞へのＤＮＡの結合は、リガンドレセプター相互作用と類似していることが
示されている：結合は、飽和可能、競合的であり、そしてＤＮＡエンドサイトー
シスおよびオリゴヌクレオチドへの分解を導く（Ｂｅｎｎｅ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２、１９９５）。ＤＮＡのように、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドは、配列、温度およびエネルギーと独立しているプ
ロセスで細胞に入り得る（ＪａｒｏｓｚｅｗｓｋｉおよびＣｏｈｅｎ，Ａｄ．Ｄ
ｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．６：２３５，１９９１）。リンパ球オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド取り込みは、細胞活性化により調節されることが示されている（
Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１６１，１９９１）。
【０００８】
ＧＭ−ＣＳＦは、基本条件およびストレス条件の下で、細胞増殖を調節するこ
とが公知であり、そしてマクロファージの腫瘍殺傷能力を活性化することが公知
である。いくつかの研究は、ＧＭ−ＣＳＦおよび標準的誘導化学療法の同時処置
が、化学療法の効力を改善し得ることを示す（Ｅｓｔｅｙ，Ｅ．Ｈ．Ｂｌｏｏｄ
８３：２０１５，１９９４）。コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の
主な利点は、化学療法の合併症の１つである汎血球減少症の処置におけるそれら
の使用であると仮定されている（ＰｉｅｓｓｅｎｓおよびＤａｖｉｄ，１９９６
、前出）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサイトカインの組み合わせを用い
る、相乗効果的な免疫応答を誘導するための方法および産物に関する。１つの局
面では、本発明は、被験体において免疫応答を刺激するための方法である。この
方法は、抗原に曝露された被験体に、相乗効果的抗原特異的免疫応答を誘導する
のに有効な量の、免疫増強サイトカインおよび免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ド（少なくとも以下の式を含む配列を有する）を投与する工程を含む：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドである。
【００１０】
このサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−１
２またはインターフェロンγであり得る。この免疫増強サイトカインはまた、抗
原−サイトカイン融合タンパク質であり得る。好ましい実施態様において、この
抗原−サイトカイン融合タンパク質は、抗原−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質であ
る。
【００１１】
この抗原は、当該分野で公知の任意の型の抗原であり得る。１つの実施態様に
おいて、この抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる群から選
択される。好ましくは、この抗原は、腫瘍抗原である。この実施態様において、
被験体は、腫瘍性の障害を有し得る。１つの実施態様において、この抗原は、ウ
イルス抗原であり、そして被験体は、ウイルス感染を有するかまたは、その危険
性にある。
【００１２】
いくつかの実施態様において、この抗原は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドおよび免疫増強サイトカインを組み合わせて、被験体に投与される。他の実施
態様では、この被験体は、抗原に受動的に曝露される。
【００１３】
他の局面では、本発明は、少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激Ｃ
ｐＧオリゴヌクレオチド、そしてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦａ、Ｆｌｔ３
リガンドおよびＩＬ−３からなる群から選択されるサイトカインの、樹状細胞を
相乗効果的に活性化するために有効な量の組成物であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドである。好ましくはサイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。
【００１４】
この組成物はまた、抗原を含み得る。いくつかの実施態様において、この抗原
は、癌抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる群から選択される。
【００１５】
本発明の別の局面に従って、樹状細胞を活性化するための方法が提供される。
この方法は、抗原に曝露される樹状細胞を、少なくとも以下の式を含む配列を有
する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの、相乗効
果的に樹状細胞を活性化するために有効な量と接触させる工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドである工程、を含む。
【００１６】
このサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−１
２またはインターフェロンγであり得る。この免疫増強サイトカインはまた、抗
原−サイトカイン融合タンパク質であり得る。好ましい実施態様において、この
抗原−サイトカイン融合タンパク質は、抗原−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質であ
る。
【００１７】
この抗原は、当該分野で公知の任意の型の抗原であり得る。１つの実施態様に
おいて、この抗原は、腫瘍抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる群から選
択される。好ましくは、この抗原は、腫瘍抗原である。この実施態様において、
被験体は、腫瘍性の障害を有し得る。他の実施態様において、この抗原は、ウイ
ルス抗原であり、そして被験体は、ウイルス感染を有するかまたは、その危険性
にある。
【００１８】
別の局面に従って、本発明は、腫瘍性の障害を有する被験体を処置するための
方法である。この方法は、少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインを、腫瘍性障害を有する被験
体の腫瘍に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドであり、ここで、投与量は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは免
疫増強サイトカイン単独を投与された被験体に関して被験体の生存時間を相乗効
果的に延長するために有効な量である、工程を含む。
【００１９】
好ましくは、この腫瘍は、脳、肺、卵巣、乳房、前立腺、結腸、皮膚および血
液の腫瘍からなる群から選択される。１つの実施態様では、免疫刺激ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは、腫瘍に直接注射される。
【００２０】
本発明の別の局面において、避妊方法が提供される。この方法は、抗原、免疫
増強サイトカインおよび少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧ
オリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌク
レオチドであり、ここでこの抗原は、生殖腺細胞抗原、ならびに生殖線細胞の維
持のために必要な、サイトカインまたはホルモン由来の抗原からなる群から選択
される抗原である工程、を含む。
以上から、本発明は、以下をも含むことが理解される。
（１） 被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、以
下：
少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドお
よび免疫増強サイトカインの相乗効果的な抗原特異的免疫応答を誘導するために
有効な量を、抗原に曝露された被験体に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである工程、
を含む、方法。
（２） 前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、Ｉ
Ｌ−１２およびインターフェロンγからなる群から選択される、項目１に記載
の方法。
（３） 前記免疫増強サイトカインが抗原−サイトカイン融合タンパ
ク質である、項目１に記載の方法。
（４） 前記抗原−サイトカイン融合タンパク質が抗原−ＧＭ−ＣＳ
Ｆ融合タンパク質である、項目３に記載の方法。
（５） 前記抗原が腫瘍抗原、微生物抗原およびアレルゲンからなる
群から選択される、項目１に記載の方法。
（６） 前記抗原が腫瘍抗原である、項目５に記載の方法。
（７） 前記抗原が前記免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび前
記免疫増強サイトカインを組み合わせて、前記被験体に投与される、項目１に
記載の方法。
（８） 前記被験体が前記抗原に受動的に曝露される、項目１に記
載の方法。
（９） 前記被験体が腫瘍性の障害を有する、項目１に記載の方法
。
（１０） 前記被験体がウイルス性の感染を有する、項目１に記載
の方法。
（１１） 組成物であって、以下：
少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチド：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである；ならびに
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦａ、Ｆｌｔ３リガンドおよびＩＬ−３からな
る群から選択されるサイトカイン、
の樹状細胞を相乗効果的に活性化するために有効な量を含む、組成物。
（１２） 前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである、項目１１に記
載の組成物。
（１３） 抗原をさらに含む、項目１１に記載の組成物。
（１４） 前記抗原が、癌抗原、微生物抗原およびアレルゲンからな
る群から選択される、項目１３に記載の組成物。
（１５） 樹状細胞を活性化するための方法であって、以下：
抗原に曝露される樹状細胞を、少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺
激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの相乗効果的に樹状細
胞を活性化するために有効な量と接触させる工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである工程、
を含む、方法。
（１６） 前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、
ＩＬ−１２およびインターフェロンγからなる群から選択される、項目１５に
記載の方法。
（１７） 前記抗原が腫瘍抗原である、項目１５に記載の方法。
（１８） 腫瘍性の障害を有する被験体を処置するための方法であっ
て、以下：
少なくとも以下の式を含む配列を有する免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドお
よび免疫増強サイトカインを、腫瘍性の障害を有する被験体の腫瘍に、免疫刺激
ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは免疫増強サイトカイン単独を投与された被験体
に関して被験体の生存時間を相乗効果的に延長するために有効な量で投与する工
程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドである工程、
を含む、方法。
（１９） 前記腫瘍が脳、肺、卵巣、乳房、前立腺、結腸、皮膚およ
び血液の腫瘍からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（２０） 前記免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび前記免疫増
強サイトカインが腫瘍に直接注射される、項目１８に記載の方法。
（２１） 避妊方法であって、以下：
抗原、免疫増強サイトカインおよび少なくとも以下の式を含む配列を有する免
疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程であって：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、ここ
でＣおよびＧは、非メチル化されており、そして、ここでＸ1およびＸ2はヌクレ
オチドであり、ここで該抗原は、生殖腺細胞抗原、ならびに生殖線細胞の維持の
ために必要なサイトカインまたはホルモン由来の抗原からなる群から選択される
抗原である工程、
を含む、方法。
【００２１】
本発明のそれぞれの限定は、本発明の種々の実施態様を包含し得る。従って、
任意の１つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む本発明のそれぞれ
の限定が、本発明のそれぞれの局面に含まれ得ることが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、被験体における免疫応答を刺激するための方法および産物に関する
。本発明に従って、免疫増強化合物の組み合わせに対する相乗的な応答を達成し
得ることを発見した。これらの相乗的な効果は、インビトロ、インビボおよびエ
キソビボで観察された。生存率の相乗的な増加は、確立された腫瘍を有する動物
においてさえも観察された。本方法は、抗原に曝露された被験体に、相乗的な抗
原特異的免疫応答を誘導するのに有効量の免疫増強サイトカインおよび免疫刺激
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与することにより行われる。
【００２３】
この知見は、免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、免疫増強サイトカインと
組み合わせて被験体に投与した場合、生じた免疫応答が相乗的であるという発見
に基づく。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは両方とも、
被験体に投与された場合、独力で免疫応答を生じる能力を有する。しかし、この
２つの組み合わせが共に投与された場合、免疫応答の量および型はシフトする。
例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインを、図３に示さ
れるように、反復免疫を使用して抗原と組み合わせて投与する場合、抗原特異的
なＩｇＧの相乗的な誘導が観察される。さらに、ＣｐＧおよびＧＭ−ＣＳＦを共
に投与した場合、抗体応答はＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１免疫応答の指標）およびＩｇＧ
１（Ｔｈ２免疫応答の指標）の両方を含む免疫応答を発生するのに対して、ＧＭ
−ＣＳＦを単独で投与する場合、ＩｇＧ２ａ抗体が動物の系に依存して検出不可
能であるか、または低い。
【００２４】
驚くべきことに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドと免疫増強サイトカインとの組み
合わせは、腫瘍接種後の数日間投与した場合でさえ、腫瘍を注射した動物の生存
率に関して劇的な効果を有する。この知見は、薬物の組み合わせが確立した腫瘍
を排除し得ることを実証したので、注目すべきことであった。代表的な先行技術
免疫ストラテジーは、一般に、腫瘍の確立を防止するために接種の前に行われる
。マウスに腫瘍を注射しそして続いていずれの腫瘍治療も与えなかった場合、そ
の生存率は０％であった。ＣｐＧオリゴヌクレオチド単独、またはＧＭ−ＣＳＦ
および抗原で処置したマウスは、それぞれ、０％および３０％の生存率を有した
。ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせは、７０％という劇
的な生存率を生じた。この知見は、確立した腫瘍の処置について、ならびに腫瘍
発達の防止について重大な意味を有する。
【００２５】
本発明は１つの局面において、被験体における免疫応答を刺激するための方法
である。本方法は、抗原に曝露された被験体に、相乗的な抗原特異性免疫応答を
誘導するために有効量の免疫増強サイトカインおよび免疫刺激ＣｐＧオリゴヌク
レオチドを投与することにより行われる。免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドは
、少なくとも以下の式を含む配列を有する：
５’Ｘ1ＣＧＸ2３’
ここで、このオリゴヌクレオチドは少なくとも８つのヌクレオチドを含み、Ｃお
よびＧはメチル化されておらず、そしてＸ1およびＸ2はヌクレオチドである。
【００２６】
本明細書中で使用される「抗原」は、免疫応答を引き起こし得る分子である。
抗原としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：細胞、細胞抽出物、多
糖、多糖結合体、脂質、糖脂質、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ウイルス、
およびウイルス抽出物。用語抗原は、宿主免疫系により外来であるとして認識さ
れる任意の型の分子を広範に含む。抗原としては、癌抗原、微生物抗原、および
アレルゲンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明の方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することにより
癌を処置するために有用である。本明細書中で使用されるような「癌抗原」は、
腫瘍または癌細胞の表面に会合する化合物（例えば、ペプチド）であり、そして
この化合物は、ＭＨＣ分子に関連する抗原提示細胞の表面上に発現された場合、
免疫応答を引き起こし得る。癌抗原を、癌細胞の粗抽出物を調製すること（例え
ば、Ｃｏｈｅｎら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５
５に記載される）、これらの抗原を部分的に精製すること、組換え技術、または
公知の抗原のデノボ合成のいずれかによって、癌細胞から調製し得る。癌抗原と
しては、腫瘍または癌の免疫原性部分である抗原または腫瘍全体もしくは癌全体
である抗原が挙げられる。このような抗原は、単離され得るか、または組換え的
にもしくは当該分野で公知の任意の他の手段によって調製され得る。癌または腫
瘍は、以下を含むがそれらに限定されない：胆管癌；脳癌；乳癌；頸部癌；絨毛
癌；結腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；表皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌
（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽腫；口腔癌（ｏｒａｌ ｃ
ａｎｃｅｒ）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲
状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫。
【００２８】
腫瘍は抗原性であり、そして免疫学的な破壊に感受性であり得る。用語「腫瘍
」は、通常、新生物と同一視され、これは文字通り「新生物（ｎｅｗ ｇｒｏｗ
ｔｈ）」を意味し、そして「癌」と交換可能に使用される。「新生物障害」は、
細胞増殖、特に、新生物に関連する任意の障害である。「新生物」は、その出現
を開始した発癌性因子の撤退後に持続しそして増殖する組織の異常な塊である。
２つの型の新生物、すなわち、良性および悪性が存在する。ほとんど全ての良性
腫瘍は被包化され、そして非侵襲性である；対照的に、悪性腫瘍はほとんど全く
被包化されず、浸潤性の破壊性増殖により隣接する組織を浸潤する。この浸潤性
増殖に続いて、腫瘍細胞は、最初の腫瘍と不連続な部位にインプラントし得る。
本発明の方法を使用して、ヒトにおける新生物障害を処置し得る。この新生物障
害としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：肉腫、癌種、線維種、リ
ンパ腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、および神経膠腫、ならびに本明細書中に
記載される他の腫瘍の各々。
【００２９】
本発明はまた、ヒト以外の被験体における癌および腫瘍を処置するために使用
され得る。癌は、愛玩動物（すなわち、ネコおよびイヌ）における死を導く原因
の１つである。癌は、通常、ハウスペットの場合、家族の一員となっている高齢
の動物を襲う。１０歳より高齢の４５％のイヌが、この疾患に屈するようである
。最も通常の処置選択としては、手術、化学療法および放射線治療が挙げられる
。ある程度の成功をもって使用されてきた他の処置様式は、レーザー治療、寒冷
療法、温熱療法および免疫療法である。処置の選択は、癌の型および汎発の程度
に依存する。悪性増殖が身体において別々の領域に制限されなければ、また正常
細胞に影響を及ぼさないで悪性組織のみを取り除くことは困難である。
【００３０】
イヌおよびネコにおいて通常診断される悪性障害としては、以下が挙げられる
がそれらに限定されない：リンパ肉腫、骨肉腫、乳房腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍
、黒色腫、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支癌、線
維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽腫、ユーイング肉
腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小グリア細胞腫、神経芽腫、骨巨細
胞腫、口腔新生物、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫。イヌにおける他の新生
物としては、生殖器扁平上皮癌、感染性静脈腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルト
リ細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫
、角膜扁平上皮癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副
腎癌、口腔乳頭腫、血管内皮腫および嚢胞腺腫。ネコにおいて診断されるさらな
る悪性としては、濾胞リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫および肺扁平上皮癌が
挙げられる。さらにより流行のハウスペットであるフェレットは、インスリノー
マ、リンパ腫、肉腫、神経腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫
および胃腺癌を発生することが公知である。
【００３１】
農業家畜が発症する新生物としては、以下が挙げられる：（畜牛においては）
白血病、血管周囲細胞腫およびウシ眼球新生物（ｂｏｖｉｎｅ ｏｃｕｌａｒ
ｎｅｏｐｌａｓｉａ）；（ウマにおいては）包皮線維肉腫、潰瘍性扁平上皮癌、
包皮癌、結合組織新生物および肥満細胞腫；（ブタにおいては）肝細胞癌；（ヒ
ツジにおいては）リンパ腫および肺腺腫症；（鳥類においては）肺肉腫、リンパ
腫、ラウス肉腫、網状内皮症（ｒｅｔｉｃｕｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ）、
線維肉腫、腎芽腫、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ性白血病；網膜芽腫、肝性新生
物（ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ
腫）、プラズマ細胞白血病（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）お
よび浮き袋肉腫（ｓｗｉｍｂｌａｄｄｅｒ ｓａｒｃｏｍａ）（魚類において）
、乾酪性リンパ節炎（ｃａｓｅｏｕｓ ｌｕｍｐｈａｄｅｎｉｔｉｓ）（ＣＬＡ
）：細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓにより引き起こされるヒツジおよびヤギの慢性性疾患、感染性疾患、伝染性
疾患、ならびに肺線腫症により引き起こされるヒツジの伝染性肺腫瘍。
【００３２】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および抗原提示細胞（例え
ば、単球およびマクロファージ）の活性化において有用であり得る。ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、抗体依存性細胞傷害性を増大し、そして腫瘍チャレンジに対
して防御するために、腫瘍抗原と組み合わせてアジュバントとして使用され得る
（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ら，１９８７，前出；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ
．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１０８３３−１
０８３７，１９９７）。本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サ
イトカインが、腫瘍に対する免疫応答を生じるために相乗的に作用し、その結果
、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強剤の効果は、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チドまたは免疫増強剤のいずれかの個々の効果の合計よりも大きいという知見に
基づく。
【００３３】
本発明の方法において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫増強サイトカイン
と共に使用される。「免疫増強サイトカイン」は、体液性免疫応答および／また
は細胞性免疫応答を刺激する分子および化合物である。用語「サイトカイン」は
、体液性調節因子としてナノモル〜ピコモル濃度で作用し、そして正常状態また
は病的状態のいずれかで個々の細胞および組織の機能的な活性を調節する、多様
な群の可溶性のタンパク質およびペプチドに対する一般的な名称として使用され
る。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接的に媒介し、そして細
胞外環境で起こるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、以下が挙げ
られるがそれらに限定されない：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）
、インターフェロンγ（γ−ＩＮＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、
ＦＬＴ−３リガンド、およびＣＤ４０リガンド。
【００３４】
ＦＬＴ３リガンドは、ＥＰ０６２７４８７Ａ２およびＷＯ９４／２８３９１に
記載される化合物のクラスである。ヒトＦＬＴ３リガンドｃＤＮＡは、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ６
９３８２を与えられた。インターロイキン（Ｉｌ）は、当該分野において広範に
記載されている（例えば、Ｍｏｓｌｅｙら，１９８９，Ｃｅｌｌ，５９：３３５
，Ｉｄｚｅｒｄａら，１９９０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：８６１）。
ＧＭ−ＣＳＦは、サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｎｅ）ロイキン（
ｌｅｕｋｉｎｅ）（Ｉｍｍｕｎｅｘ）として市販されている。
【００３５】
サイトカインは、Ｔ細胞応答の指向に役割を果たす。ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ
細胞は、他の免疫系細胞（他のＴ細胞を含む）に対して作用する可溶性因子の産
生を介して哺乳動物の免疫応答を統合する。ほとんどの成熟ＣＤ４＋Ｔヘルパー
細胞は、２つのサイトカインのプロフィールのうちの一方を発現する：Ｔｈ１ま
たはＴｈ２。Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−
９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦおよび低レベルのＴＮＦ−αを発現
する。ＴＨ１サブセットは、遅延型過敏症、細胞媒介免疫、および免疫グロブリ
ンのＩｇＧ2aへのクラス切り替えを促進する。Ｔｈ２サブセットは、Ｂ細胞を活
性化し、抗体産生を促進し、そしてＩｇＧ1およびＩｇＥへのクラス切り替えを
誘導することにより体液性免疫を誘導する。
【００３６】
腫瘍は「腫瘍特異的抗原」を発現し得、これは、明らかに、腫瘍特異的免疫応
答を強力に刺激し得る抗原である。これらの抗原は正常な遺伝子によりコードさ
れ得、そして以下のいくつかのカテゴリーに分類される：（１）正常なサイレン
トな遺伝子、（２）分化抗原、（３）胚性抗原および胎児性抗原、ならびに（４
）クローン抗原。これらは、少数の正常細胞（例えば、腫瘍が起源する細胞）で
のみ発現される。腫瘍特異的抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓ癌
遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、ｐ５３変異体）のような変異体細胞遺伝子によ
ってコードされ得る。融合タンパク質は、内部欠失または染色体転位から生じる
。腫瘍特異的抗原はまた、ウイルス遺伝子（例えば、ＲＮＡ腫瘍ウイルスまたは
ＤＮＡ腫瘍ウイルス）によりコードされ得る。
【００３７】
リンパ腫の処置において、分泌された免疫グロブリンのイディオタイプは、非
常に特異的な腫瘍関連抗原として作用する。「イディオタイプ」とは、特異的な
抗体または限定されたセットの抗体に対して特異的なＶ領域決定基のコレクショ
ンを意味する。１つの実施態様において、免疫増強サイトカインは、免疫増強サ
イトカインに融合された、リンパ腫により分泌された特定の抗原イディオタイプ
からなるタンパク質（融合タンパク質）である。抗原−サイトカイン融合タンパ
ク質を生成する方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ
．，Ｌｅｖｙ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７５５−７５８，１９９３を参照
のこと）。１つの実施態様おいて、融合タンパク質は、抗原−ＧＭ−ＣＳＦ融合
タンパク質である。
【００３８】
本発明の方法はまた、感染性疾患を処置するために有用である。感染性疾患は
、本明細書中で使用される場合、身体中の外来微生物の存在から生じる疾患であ
る。ＣｐＧおよび免疫増強サイトカインを使用して、微生物の抗原に対するＴ細
胞応答またはＢ細胞応答を活性化し得る抗原特異的な免疫応答を刺激する。本方
法は、抗原が微生物に特異的であることを除いて微生物抗原を使用して、腫瘍に
対して上記と同様の方法で達成される。「微生物抗原」は、本明細書中で使用さ
れる場合、微生物の抗原であり、そして感染性ウイルス、感染性細菌、および感
染性真菌を含むがこれらに限定されない。このような抗原は、完全微生物、なら
びに天然の単離物、およびそれらのフラグメントもしくは誘導体を含み、そして
また、天然の微生物抗原に対して同一または類似する合成化合物を含む。これら
の抗原は、微生物に対して特異的な免疫応答を誘導する。化合物が天然の微生物
抗原に対して免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、この化
合物は天然の微生物抗原に類似する。このような抗原は、当該分野において規定
的に使用され、そして当業者に周知である。
【００３９】
ヒトにおいて見出されている感染性ウイルスの例としては、以下が挙げられる
がそれらに限定されない：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全疾
患ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ
−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとしても言及される）；および他の分
離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオ
ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、
ライノウイルス、ＥＣＨＯウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃
腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、
風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイ
ルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイル
ス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイ
ルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄ
ｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏ
ｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ
（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイル
ス、ＲＳウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエ
ンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンターンウイルス、ブ
ンヤウイルス（ｂｕｎｇａ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイル
ス（Ｎａｉｒｏ ｖｉｒｕｓ））；Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイル
ス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロ
タウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ
型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａ
ｖｉｒｉｄａｅ（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉ
ｄａｅ（主要なアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペス
ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワ
クシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉａｅ（例え
ば、アフリカ豚コレラウイルス）；ならびに分類されていないウイルス（例えば
、海綿状脳障害の病因論的因子、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損
サテライトであると考えられる）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部遺
伝；クラス２＝親遺伝）（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび
関連ウイルス、ならびにアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ））。
【００４０】
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌はともに、脊椎動物において抗原として
作用する。このようなグラム陽性細菌としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げらる
がこれらに限定されない。グラム陰性細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げら
れるがこれらに限定されない。感染性細菌の特定の例としては、以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：
【００４１】
【化１】
。
【００４２】
感染性真菌の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐ
ｓｕｌａｔｕｍ，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ，Ｂｌａｓｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ。他の感染性生物体（すなわち、原
生生物）としては以下が挙げられる：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａ
ｅ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ，ならびにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉ
ｖａｘおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ。
【００４３】
他の医療的に関連する微生物は、文献において広範に記載されている（例えば
、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂ
ａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３（
この内容全体は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【００４４】
本発明の方法はまた、アレルギー疾患を処置するために有用である。この方法
は、抗原がアレルゲンに特異的であるということを除いて、腫瘍免疫治療および
感染性疾患の処置について上記したのと同様の方法で達成される。現在、アレル
ギー疾患は、一般に、低用量の抗原の注射、引き続いて、増加性の用量の抗原の
注射により処置される。この手順は、記憶免疫応答を生じ、さらなるアレルギー
反応を防止すると考えられている。しかし、これらの方法は、アレルギー反応の
ような副作用の危険性を伴う。本発明の方法はこれらの問題を回避する。
【００４５】
「アレルゲン」とは、感受性の被験体においてアレルギー反応またはぜん息反
応を誘起し得る物質（抗原）をいう。アレルゲンの一覧は膨大であり、そしてこ
の一覧は、花粉、昆虫の毒液、動物の麟屑粉塵、真菌の胞子および薬物（例えば
、ペニシリン）を含み得る。天然の、動物および植物のアレルゲンの例としては
、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられるがそれらに限定されない：
【００４６】
【化２】
。
【００４７】
「アレルギー」とは、物質（アレルゲン）に対する後天性過敏症のことをいう
。アレルギー状態は、湿疹、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性コリーザ、枯
草熱、気管支喘息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ）
）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態を含むが、これらに限定
されない。アレルギー反応を有する被験体は、アレルギーを有するかまたはアレ
ルギーの発症の危険にさらされている被験体である。
【００４８】
アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生によっ
て引き起こされる。非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドによって誘導されるサ
イトカインは主に、細胞免疫応答によって最も良く特徴付けされ、そしてＩＬ−
１２およびＩＦＮ−γならびにＩｇＧ２ａ抗体の産生に関連する「Ｔｈ１」と呼
ばれるクラスである。他の主要な型の免疫応答は、Ｔｈ２免疫応答と呼ばれ、こ
れは１つよりも多いＩｇＧ１抗体免疫応答およびＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ
−１０の産生に関連する。一般に、アレルギー疾患は、Ｔｈ２型免疫応答によっ
て媒介され、そして自己免疫疾患は、Ｔｈ１免疫応答によって媒介されるようで
ある。患者における免疫応答をＴｈ２応答（これはＩｇＥ抗体の産生およびアレ
ルギーに関連し、そしてＧＭ−ＣＳＦ単独に対する応答で産生される）からＴｈ
１応答（これは、アレルギー反応に対して防御性である）へシフトするＣｐＧオ
リゴヌクレオチドと免疫増強サイトカインとの組み合わせの能力に基づき、有効
な用量のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインを被験体へ投与
し、アレルギーを処置または予防し得る。
【００４９】
免疫増強サイトカインとの組み合わせられたＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた
、喘息の処置において有意な治療上の有用性を有し得る。Ｔｈ２サイトカイン、
特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息の被験体の気道において上昇される。これ
らのサイトカインは、ＩｇＥアイソトープ転換、好酸球走化性および好酸球活性
化、ならびに肥満細胞増殖を含む喘息の炎症応答の重要な局面を促進する。Ｔｈ
１サイトカイン、特にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成お
よびＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る。「喘息」とは、炎症によって特徴
付けられる呼吸器系の障害（気道の狭窄および吸入物質に対する気道の増大した
反応性）のことをいう。喘息は、アトピー性症状またはアレルギー性症状に広範
に関連しないが、頻繁である。
【００５０】
同時係属出願の米国特許出願第０８／９６０，７７４号）に記載されるように
、非メチル化ＣｐＧモチーフ（すなわち、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣ
ＧＴＴ；配列番号９３）を含むが、コントロールオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡ
ＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ；配列番号１０３）を含まないオリゴヌクレ
オチドは、喘息のマウスモデルにおいて炎症細胞浸潤および好酸球増加症の発症
を予防した。さらに、好酸性炎症の抑制は、Ｔｈ２応答の抑制およびＴｈ１応答
の誘導に関連した。
【００５１】
「被験体」とは、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、
ニワトリ、霊長類（例えば、サル）、魚（養殖漁業種）（例えば、サケ）、ラッ
トおよびマウスを含むが、これらに限定されない脊椎動物を意味する。
【００５２】
上記の多くの障害は、ヒトの障害に関連するが、本発明はまた、他の非ヒト脊
椎動物を処置するのに有用である。非ヒト脊椎動物はまた、癌、感染、アレルギ
ー、および喘息を発症し得る。例えば、感染性ヒト疾患の処置に加えて、本発明
の方法は、動物の感染を処置するのに有用である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、感染性疾患に関して用いられる場合に用語「処
置する」、「処置した」、または「処置している」とは、病原体による感染に対
して被験体の抵抗力を増大する（すなわち被験体が、病原体に感染する可能性を
低下する）予防的な処置、および感染と闘うための被験体が感染した後の処置（
例えば、感染を減少するかまたは排除するか、あるいは悪化することからそれを
防ぐ）をいう。非ヒト脊椎動物の処置のための多くのワクチンは、Ｂｅｎｎｅｔ
ｔ，Ｋ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，第３版、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ
．，１９９５に開示される。
【００５４】
従って、本発明は、ヒトおよび非ヒト動物における抗原特異的免疫応答を誘導
するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの使用を意図
する。上で議論されるように、ウイルス、細菌ならびに真菌のような感染微生物
を含む抗原およびそれらのフラグメントは、天然の供給源または合成的に誘導さ
れる。ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方の感染ウイルスは、レトロウイルス、Ｒ
ＮＡウイルス、およびＤＮＡウイルスを含む。レトロウイルスのこのグループは
、単純レトロウィルスおよび複合レトロウイルスの両方を含む。この単純レトロ
ウイルスは、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、およびＤ型レトロウイ
ルスのサブグループを含む。Ｂ型レトロウイルスの例は、マウス乳腺癌ウイルス
（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロウイルスは、Ｃ型グループＡ（ラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）、鳥類の白血病ウイルス（ＡＬＶ）、および鳥類骨髄芽球症ウイ
ルス（ＡＭＶ）を含む）およびＣ型グループＢ（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ
）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、テナガ
ザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウ
イルス（ＲＶ）およびサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）のサブグループを含
む。Ｄ型レトロウイルスは、マソン‐ファイザーウイルス（ＭＰＭＶ）およびサ
ルレトロウイルス１型（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロウィルスは、レンチウ
イルス、Ｔ細胞白血病ウィルスおよびフォーミーウイルスのサブグループを含む
。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイル
ス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡ
Ｖ）もまた含む。Ｔ細胞白血病ウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サ
ルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）を
含む。フォーミーウイルスは、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）、サルフォー
ミーウイルス（ＳＦＶ）およびウシフォーミーウイルス（ＢＦＶ）を含む。
【００５５】
脊椎動物における抗原である他のＲＮＡウイルスの例は、以下のファミリーの
メンバーを含むがこれらに限定されない：レオウイルス科ファミリー（オルトレ
オウイルス属（哺乳動物レトロウイルスおよび鳥類レトロウイルスの複数の血清
型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、ユーベナンギー（Ｅｕｇｅｎ
ａｎｇｅｅ）ウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ病ウイルス、およびコ
ロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ仔ウ
シ下痢症ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジ
ロタウイルス、鳥類ロタウイルス）を含む）；エンテロウイルス属（ポリオウイ
ルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、腸細胞障害性（ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｙ
ｔｏｐａｔｈｉｃ）ヒトオーファン（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、
サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、マウスポリオウイル
ス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カーディオウイルス属（
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくと
も１１３のサブタイプを含む、ヒトライノウイルス；他のライノウイルス）、ア
フトウイルス属（口蹄疫（ＦＭＤＶ））を含む、ピコルナウイルス科ファミリー
；ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミグエルアザラシウイルス、ネコピコルナウ
イルス、およびノーウォークウイルスを含む、カルシウイルス科ファミリー；ア
ルファウイルス属（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビス
ウイルス、チクングンヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロス川ウイルス、
ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊
媒介（ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日
本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウエ
ストナイル脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介（ｔｉｃ
ｋ ｂｏｒｎｅ）ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林病ウイル
ス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ル
ビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレラ
ウイルス、ボーダー病ウイルス）を含む、トガウイルス科ファミリー；ブンヤウ
イルス属（ブンヤムウェラ熱ウイルスおよびブンヤムウェラ熱関連ウイルス、カ
リフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シシリー
型（Ｓｃｉｌｉａｎ）ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属
（クリミア‐コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウ
ウクウイルス属（ウウクニエミーウイルスおよびウウクニエミー関連ウイルス）
を含む、ブンヤウイルス科ファミリー；インフルエンザウイルス属（インフルエ
ンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、な
らびに鳥類インフルエンザウイルスおよびウマのインフルエンザウイルス；イン
フルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（考えら
れる別個の属）を含む、オルトミクソウイルス科ファミリー；パラミクソウイル
ス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着性ウイル
ス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行性
耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイ
ルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイルス
（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含む、パラミク
ソウイルス科ファミリー；森林（ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、シンドビスウイルス
、チクングニンウイルス、オニョンニョンウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエ
ラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介（ｍ
ｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウ
イルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウエストナイ
ル脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介（ｔｉｃｋ ｂｏ
ｒｎｅ）ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、跳躍
病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイル
ス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレラウイルス
、ボーダー病ウイルス）を含む、トガウイルス科ファミリー；ブンヤウイルス属
（ブンヤムウェラ熱ウイルスおよびブンヤムウェラ熱関連ウイルス、カリフォル
ニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シシリー型（Ｓｃ
ｉｌｉａｎ）ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミ
ア‐コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウウクウイ
ルス属（ウウクニエミーウイルスおよびウウクニエミー関連ウイルス）を含む、
ブンヤウイルス科ファミリー；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイ
ルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、ならびに鳥
類インフルエンザウイルスおよびウマのインフルエンザウイルス；インフルエン
ザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（考えられる別個
の属）を含む、オルトミクソウイルス科ファミリー；パラミクソウイルス属（パ
ラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着性ウイルス、パラ
インフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎
ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジ
ステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイルス（ＲＳＶ
）、ウシＲＳウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含む、パラミクソウイル
ス科ファミリー；ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）（チャンディプラウイルス、フ
ランダース−ハートパークウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、
魚類ラブドウイルス、および２つの考えられる（ｔｗｏ ｐｒｏｂａｂｌｅ）ラ
ブドウイルス（マルブルクウイルスおよびエボラウイルス）を含む、ラブドウイ
ルス科ファミリー；リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス
複合体、およびラッサウイルスを含む、アレナウイルス科ファミリー；伝染性気
管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸（ｅｎｔｅｒｉｃ）コ
ロナウイルス、およびネコの伝染性腹膜炎（ネココロナウイルス）を含む、コロ
ナウイルス科ファミリー。
【００５６】
脊椎動物において抗原である例示的ＤＮＡウイルスは以下を含むが、これらに
限定されない：オルトポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア
、牛痘、スイギュウポックス（Ｂｕｆｆａｌｏｐｏｘ）、家兎痘、エクトロメリ
ア）、レポリポックスウイルス属（線維性粘液腫、線維腫）、トリポックスウイ
ルス属（鶏痘、他の鳥類ポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘
、ヤギ痘）、スイポックスウイルス（豚痘）、パラポックスウイルス属（感染性
膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含む、ポックス
ウイルス科ファミリー；イリドウイルス科ファミリー（アフリカ豚コレラウイル
ス、カエルウイルス２および３、魚類のリンパ嚢腫ウイルス）；アルファヘルペ
スウイルス（単純ヘルペス１型および２型、水痘‐帯状疱疹、ウマ流産ウイルス
、ウマヘルペスウイルス２および３、仮性狂犬病ウイルス、ウシの伝染性角膜炎
ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気
管支炎ウイルス）、ベータヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、なら
びにブタ、サルおよびげっ歯類のサイトメガロウイルス）、ガンマヘルペスウイ
ルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレク病ウイルス、リスザルヘ
ルペスウイルス、クモザルヘルペスウイルス、ノウサギヘルペスウイルス、モル
モットヘルペスウイルス、ルッケ腫瘍（Ｌｕｃｋｅ ｔｕｍｏｒ）ウイルス）を
含む、ヘルペスウイルス科ファミリー；マストアデノウイルス属（ヒトサブグル
ープＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および非グループ化；サルアデノウイルス（少なくと
も２３の血清型）、イヌの伝染性肝炎、およびウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよ
び多くの他の種のアデノウイルス）、トリアデノウイルス属（鳥類のアデノウイ
ルス）を含む、アデノウイルス科ファミリー；および培養不可能な（ｎｏｎ−ｃ
ｕｌｔｉｖａｔａｂｌｅ）アデノウイルス；パピローマウイルス属（ヒトパピロ
ーマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギ乳頭腫ウイルス、およ
び他の種の種々の病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオ
ーマウイルス、サル空胞形成因子（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（Ｓ
Ｖ−４０）、ウサギ空胞形成因子（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣ
ウイルス、および霊長類ポリオーマウイルス（例えば、リンパ増殖性（ｌｙｍｐ
ｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パピローマウイルス）を含む、パポバウイルス科ファミリ
ー；アデノ関連ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、
ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスな
ど）を含む、パルボウイルス科ファミリー。最後に、ＤＮＡウイルスは、上記の
ファミリーに一致しないウイルス（例えば、クールーウイルスおよびクロイツフ
ェルト−ヤーコプ病ウイルス、ならびに慢性感染神経障害因子（ｃｈｒｏｎｉｃ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｇｅｎｔ）（ＣＨＩＮＡ
ウイルス））を含み得る。
【００５７】
前記のリストのそれぞれは、例示であり、そして限定を意図しない。
【００５８】
ヒトにおいて抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド
および免疫増強サイトカインの組み合わせの使用に加えて、好ましい実施態様の
方法は、トリ（例えば、雌鳥、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル（カモ）、ガ
チョウ、ウズラ、およびキジ）の処置に特によく適している。トリは、多くの型
の感染の主な標的である。
【００５９】
孵化するトリは、誕生後まもなく病原性微生物に曝される。これらのトリは、
始めは母親由来の抗体によって病原体から防御されるが、この防御は一時的に過
ぎず、そしてトリ自身の未成熟な免疫システムが、病原体からトリを防御し始め
なければならない。若いトリが最も感受性である時に、それらにおいて感染を防
ぐことが、しばしば望ましい。特に、トリが閉鎖された区域に入れられる（これ
は疾患の急速な伝播を導く）場合、老齢のトリにおいて感染を防ぐことがまた望
ましい。従って、抗原が存在する場合、抗原特異的免疫応答を増強するために本
発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインをトリに投与する
ことが望ましい。
【００６０】
ニワトリの普通の感染の例は、ニワトリ感染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）であ
る。ＣＩＡＶは、１９７９年日本でマレク病ワクチン接種ブレーク（ｖａｃｃｉ
ｎａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋ）の研究の間に初めて単離された（Ｙｕａｓａら、１
９７９、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２３：３６６−３８５）。この時以来、ＣＩＡＶ
は、全ての主な家禽生産国の養鶏において検出されている（ｖａｎ Ｂｕｌｏｗ
ら、１９９１、６９０−６９９頁、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ，
第九版、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００６１】
ＣＩＡＶ感染は、若い感受性のニワトリにおいて、貧血、出血および免疫抑制
によって特徴づけられる臨床疾患を生じる。ＣＩＡＶ感染したニワトリの胸腺の
萎縮症および骨髄の萎縮症ならびに一貫した病変もまた、ＣＩＡＶ感染の特徴で
ある。胸腺におけるリンパ球の枯渇、および時折ファブリキウス嚢におけるリン
パ球の枯渇は、免疫抑制を生じ、そして二次的なウイルス感染、細菌感染、また
は真菌感染（次いで、これは疾患の経過を複雑にする）に対する感受性を増大さ
せる。免疫抑制は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファルビキウス嚢病、
細網内皮症ウイルス、アデノウイルス、またはレオウイルスの１つ以上に感染後
に疾患を悪化させる原因となり得る。ＭＤＶの病原性は、ＣＩＡＶによって増強
されることが報告されている（ＤｅＢｏｅｒら、１９８９、２８頁、Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３８ｔｈ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｔｅｍｐｅ，Ａｒｉｚ．）。さらに、
ＣＩＡＶが、伝染性ファルビキウス嚢病の徴候を悪化させることが報告されてい
る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９８９、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３３：７０７
−７１３）。ニワトリは、ＣＡＡによって実験的に引き起された疾患に対して年
齢抵抗性（ａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を発生させる。これは、本質的に、
２週齢までに完了するが、老齢のトリは、感染に対して未だ感受性である（Ｙｕ
ａｓａ，Ｎ．ら、１９７９前出；Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、Ａｉａｎ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ ２４，２０２−２０９，１９８０）。しかし、ニワトリを、ＣＡＡおよび
免疫抑制因子（ＩＢＤＶ、ＭＤＶなど）に二重に感染させる場合、この疾患に対
する年齢抵抗性は、遅延される（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、１９７９および１９８０
前出；Ｂｕｌｏｗ ｖｏｎ Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ ３３：９３−１１６，１９８６）。疾患の伝染を増強し得るＣＩＡＶの特
徴は、環境的な不活性化およびいくつかの通常の消毒剤に対する高い抵抗性を含
む。家禽産業に対するＣＩＡＶ感染の経済的影響は、疾患に感染したトリの１０
％〜３０％が、死を突発するという事実から明らかである。
【００６２】
トリのワクチン接種は、他の脊椎動物のように、任意の年齢で行われ得る。通
常、ワクチン接種は、生きた微生物については１２週齢までに行われ、そして不
活性化微生物または他の型のワクチンについては１４〜１８週の間に行われる。
卵内（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン接種については、ワクチン接種が、胚発生の最後
の四半期（ｌａｓｔ ｑｕａｒｔｅｒ）に行われ得る。このワクチンは、皮下、
スプレーによって、経口、眼内、気管内、経鼻、卵内（ｉｎ ｏｖｏ）、または
本明細書中に記載される他の方法によって投与され得る。従って、本発明のＣｐ
Ｇオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは、慣用的なワクチンスケジ
ュールを用いてトリおよび他の非ヒト脊椎動物へ投与され得、そして抗原は、本
明細書中に記載される適切な時間の後に投与される。
【００６３】
ウシおよび家畜もまた、感染に対して感受性である。これらの動物を冒す疾患
は、（特にウシの間で）深刻な経済損失を生じ得る。本発明の方法を用いて、家
畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）における感染に対して防
御し得る。
【００６４】
ウシは、ウシウイルスによって感染され得る。ウシウイルス性下痢性ウイルス
（ＢＶＤＶ）は、小エンベロープ化（ｓｍａｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）プラス
鎖ＲＮＡウイルスであり、そして豚コレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジボ
ーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共に、ペスチウイルス属に分類される。ペスチウ
イルスは、以前にトガウイルス科ファミリーに分類されたが、いくつかの研究は
、フラビウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）グループと共にフラビウイ
ルス科ファミリーへの再分類を提案している（Ｆｒａｎｃｋｉら、１９９１）。
【００６５】
ＢＶＤＶ（これはウシの重要な病原体である）は、細胞培養分析に基づいて、
細胞病原性（ＣＰ）生物型および非細胞病原性（ＮＣＰ）生物型へ区別され得る
。両方の生物型は、ウシにおいて見出され得るが、ＮＣＰ生物型がより広範囲に
及ぶ。妊娠中のウシが、ＮＣＰ株に感染する場合、ウシは、持続的に感染させた
ウシ、すなわち、その一生の間ウイルスを伝播する免疫寛容ウシを出産する。持
続的に感染させたウシは、粘膜疾患で死に得、次いで、両方の生物型が、この動
物から分離され得る。臨床的症状は、流産、奇形発生、ならびに呼吸の問題、粘
膜疾病および軽度の下痢を含み得る。さらに、この動物の死を生じ得る、群れの
伝染病に関連する重篤な血小板減少症が記載されており、そしてこの疾患と関連
する株は、古典的なＢＶＤＶよりも病原性であると思われる。
【００６６】
ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、ウマにおいて無症状疾患から致命的疾患
までにわたる種々の感染を引き起こす、抗原性的に区別された生物学的因子の群
を含む。これらは、ウマにおける遍在性の病原体であるウマヘルペスウイルス−
１（ＥＨＶ−１）を含む。ＥＨＶ−１は、流産、気道疾患、および中枢神経系障
害の流行病に関連する。若いウマの上気道の初期の感染は、８〜１０日間続く熱
病（ｆｅｂｒｉｌｅ ｉｌｌｎｅｓｓ）を生じる。免疫学的経験をした雌馬は、
疾患が明らかになることなしに気道を通じて再感染され得、その結果、流産は、
通常前兆なしに生じる。神経学的症候群は、呼吸疾患、または流産に関連し、任
意の年齢のいずれかの性別の動物を冒し得、共調運動不能、衰弱および後部麻痺
（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐａｒａｌｙｓｉｓ）を導く（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ
．Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９，３０４−３１６，１９９２）。他のＥＨ
Ｖは、ＥＨＶ−２、またはウマサイトメガロウイルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウ
イルス、およびＥＨＶ−４（以前はＥＨＶ−１サブタイプ２に分類された）を含
む。
【００６７】
ヒツジおよびヤギは、ビスナ−マエディを含む種々の危険な微生物によって感
染され得る。
【００６８】
サル（ｍｏｎｋｅｙ）、サル（ａｐｅ）、およびマカクのような霊長類は、サ
ル免疫不全ウイルスによって感染され得る。不活性化細胞−ウイルスおよび無細
胞の全サル免疫不全ワクチンは、マカクに防御をもたらすことが報告されている
（Ｓｔｏｔｔら、（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３６：１５３８−１５４１；Ｄｅ
ｓｒｏｓｉｅｒｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）８６：６３５３−６３５７
；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２９
３−１２９７；およびＣａｒｌｓｏｎら、（１９９０）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕ
ｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ６：１２３９−１２４６）。組換えＨＩＶ
ｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーに防御をもたらすことが報告されている
（Ｂｅｒｍａｎら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：６２２−６２５）。
【００６９】
ネコ（家庭内および野生の両方）は、種々の微生物での感染に感受性である。
例えば、ネコの伝染性腹膜炎は、家ネコ、および野生のネコ（例えば、ライオン
、ヒョウ、チーター、およびジャガー）の両方において生じる疾患である。この
型のおよび他の型の病原性生物体を用いてネコにおける感染を防御することが望
ましい場合、本発明の方法を用いて、ネコにワクチン接種し、感染からネコを防
御し得る。
【００７０】
家ネコは、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）
、内因性Ｃ型オンコルナウイルス（ＲＤ−１１４）、およびネコシンシチア形成
（ｆｏｒｍｉｎｇ）ウイルス（ＦｅＳＦＶ）を含むが、これらに限定されない、
いくつかのレトロウイルスで感染させ得る。これらのうち、ＦｅＬＶは、最も有
意な病原体であり、これは、リンパ性細網（ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）
新生物および骨髄性新生物、貧血、免疫媒介性障害（ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｄｉａ
ｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、およびヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に
類似した免疫不全症候群を含む多様な症状を引き起こす。最近、ＦｅＬＶ−ＡＩ
ＤＳと命名された特定の複製不全（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖ
ｅ）ＦｅＬＶ変異体が、免疫抑制特性とより詳細に関連付けされている。
【００７１】
ネコＴリンパ指向性（Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レンチウイルス（ネコ
免疫不全ともいわれる）の発見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５：７９０−７９３に最初に報告された。ＦＩＶの特徴は、Ｙａｍａ
ｍｏｔｏら（１９８８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２月 補遺 ２：２０４Ｓ−２１
５Ｓ；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２
４６−１２５８；およびＡｃｋｌｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５
６５２−５６５５に報告されている。ＦＩＶのクローニングおよび配列分析は、
Ｏｌｍｓｔｅｄら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：２４４８−２４５２および８６：４３５５−４３６０に報告されている
。
【００７２】
ネコの伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、家ネコ科および野生のネコ科において予測
不可能に生じる散発性疾患である。ＦＩＰは、主に家ネコの疾患であるが、ライ
オン、アメリカライオン、ヒョウ、チーター、およびジャガーにおいて診断され
ている。ＦＩＰに冒されている小型の野生のネコは、ヤマネコおよびカラカル、
サンドキャット（ｓａｎｄ ｃａｔ）、およびパラスキャット（ｐａｌｌａｓ
ｃａｔ）を含む。家ネコにおいて、全ての年齢のネコが感受性であるが、この疾
患は、若い動物において主に生じる。発生率のピークは、６と１２ヶ月齢の間で
生じる。発生率の低下が、５〜１３歳で認められ、次いで１４〜１５歳のネコに
おいて発生率の増加が認められる。
【００７３】
魚類、甲殻類または他の水性生物品種におけるウイルス疾患および細菌疾患は
、養殖漁業産業について深刻な問題を提起する。孵化タンクまたは閉鎖された海
洋養殖領域における動物の高い密度が原因で、感染性疾患は、例えば、魚類設備
、甲殻類設備、または他の水性生物品種設備において大部分のストックを死滅さ
せ得る。疾患の予防は、疾患が進行してすぐの介入よりも、魚類へのこれらの脅
威に対するより好適な救済策である。魚類のワクチン接種は、免疫によって長期
間の防御を提供し得る唯一の予防法である。ワクチン接種に基づく核酸は、Ｄａ
ｖｉｓへ発行された米国特許第５，７８０，４４８号に記載される。
【００７４】
魚類の免疫系は、哺乳動物免疫系に類似した多くの特性を有する（例えば、Ｂ
細胞、Ｔ細胞、リンホカイン、補体、および免疫グロブリンの存在）。魚類は、
哺乳動物のＢ細胞およびＴ細胞のリンパ球サブクラスに多くの点で類似している
と思われる役割を有するリンパ球サブクラスを有する。ワクチンは、経口投与さ
れるか、あるいは液浸または注入によって投与され得る。
【００７５】
養殖漁業種は、魚類、甲殻類または他の水性動物を含むが、これらに限定され
ない。魚類は、全ての魚形脊椎動物を含む。これは、例えば、サケ科、コイ、ナ
マズ、ブリ、タイ、およびスズキのような硬骨魚類または軟骨魚類であり得る。
サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サケ、および北極イワナ（Ａｒｃｔｉｃ
ｃｈａｒ）を含む魚類のファミリーである。甲殻類の例は、ハマグリ、ロブスタ
ー、エビ、カニ、およびカキを含むが、これらに限定されない。他の養殖水性動
物は、ウナギ、イカ、およびタコを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
ウイルス性水性生物病原体のポリペプチドは、ウイルス性出血性敗血症ウイル
ス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質（Ｇ）または核タンパク質（Ｎ）；伝染性造血組
織壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）のＧタンパク質またはＮタンパク質；伝染性膵臓壊
死ウイルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１構造、ＶＰ２構造、ＶＰ３構造、またはＮ構造
タンパク質；コイ春ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣ）のＧタンパク質；ならびに
ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、外被（ｔｅｇｕｍｉｎ）タ
ンパク質およびキャプシドタンパク質または糖タンパク質を含むが、これらに限
定されない。
【００７７】
細菌性病原体のポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：Ａｅｒｏｍｏｎｉｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの鉄調節外膜タンパク質
（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ），およびＡ−タンパク質（これは、
フルンケル多発症を引き起こす）、Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｍｏｎ
ｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質（これは、細菌性腎疾患（ＢＫＤ）を引き起こ
す）、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの主要表面関連抗原（ｍｓａ）、表面発現細胞毒
素（ｍｐｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、および鞭毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅ
ｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭ
Ｐ）、および構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよ
びＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰおよび鞭毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌ
ｏｓｉｓ ｉｃｔａｌｕｒｉおよびＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタ
ンパク質、ａｒｏＡおよびｐｕｒＡ；ならびにＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕ
ｓの表面抗原；ならびにＣｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造タンパ
ク質および調節タンパク質；ならびにＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造タンパク質お
よび調節タンパク質。
【００７８】
寄生虫性病原体のポリペプチドとしては、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ
の表面抗原が挙げられるが、これに限定されない。
【００７９】
被験体を、この抗原に暴露する。本明細書中で使用される場合、用語「曝露さ
れる（する）」とは、被験体を抗原と接触させる能動的工程、またはインビボで
の抗原への被験体の受動的曝露のいずれかをいう。抗原への被験体の能動的曝露
のための方法は、当該分野において周知である。一般には、抗原を、任意の手段
（例えば、静脈内投与、筋内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与
、気管内投与、または皮下投与）によって、被験体に直接的に投与する。抗原は
、全身的にかまたは局所的に投与され得る。抗原およびＣｐＧおよび免疫増強サ
イトカインを投与するための方法は、以下においてより詳細に記載される。抗原
が、身体内の免疫細胞に曝露するために利用可能となる場合、被験体を受動的に
抗原に対して曝露する。被験体を、例えば、身体内に外来病原体の侵入させるこ
とによってか、または表面に外来抗原を発現する腫瘍細胞の発生させることによ
って、抗原に対して受動的に曝露し得る。被験体を抗原に対して受動的に曝露す
る場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌク
レオチドであり、および／またはリン酸改変骨格を有することが好ましい。
【００８０】
被験体を抗原に対して受動的に曝露する方法は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドお
よび免疫増強サイトカインの投与の時期に部分的に特に依存し得る。例えば、癌
もしくは感染性疾患、またはアレルギー性応答もしくは喘息性応答の発症の危険
性がある被験体において、この危険性が最も大きい時（すなわち、アレルギーの
季節、または癌の原因因子への曝露後）に、被験体は、規則的に（ｏｎ ｒｅｇ
ｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカイン
を投与され得る。さらに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカイ
ンは、旅行者が、感染因子への曝露の危険性がある外国に旅行する前に、その旅
行者に対して投与され得る。同様に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強
サイトカインは、生物戦争に曝露される危険性のある軍人または民間人に対して
、それらの被験体がそれに曝露される時および場合に、抗原に対する全身的免疫
応答を誘導するために投与され得る。
【００８１】
癌を発生させる危険性のある被験体はまた、本発明の方法に従って、ＣｐＧお
よび免疫増強サイトカインに続いて抗原に受動的または能動的に曝露することに
よって処置され得る。癌を発症する危険性のある被験体とは、癌を発症する高い
可能性を有する被験体をいう。これらの被験体としては、例えば、遺伝子異常（
その存在が、癌発症のより高い可能性に対して相関性を有することが実証されて
いる）を有する被験体、および癌の原因因子（例えば、タバコ、アスベスト、ま
たは他の化学毒素）に対して曝露された被験体が挙げられる。癌発症の危険性の
ある被験体を、ＣｐＧおよび免疫増強サイトカインで規則的に（例えば、毎月）
処置する場合、被験体は、抗原特異的免疫応答を認識し、そして生成し得る。被
験体において、腫瘍が形成を開始する場合に、被験体は、１つ以上のこの腫瘍抗
原に対して特異的免疫応答を発症する。本発明のこの局面は、被験体が曝露され
る抗原が未知である場合に、特に有利である。例えば、生物戦争に曝露される危
険性のある軍人において、これらの軍人が曝露されるかもしれない生物兵器が何
であるかは、一般的に未知である。
【００８２】
抗原は、単独で、またはキャリアを伴って、被験体の免疫系に送達され得る。
例えば、コロイド分散系が、被験体に抗原を送達するために使用され得る。本明
細書中で使用される場合、「コロイド分散系」とは、被験体中に抗原を送達およ
び放出し得る、細菌学的供給源またはウイルス性供給源由来以外の、天然の分子
または合成分子をいう。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル
（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系
（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げ
られる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームとは、
インビボまたはインビトロの送達ベクターとして有用な人工膜血管である。サイ
ズが０．２〜４．０μの範囲である大きな単層血管（ＬＵＶ）は、水性の内部に
大きな高分子をカプセル化し得、そしてこれらの高分子は生物学的に活性な形態
で細胞に送達され得ることが示されている（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７（１９８１）。
【００８３】
トランスフェクションのための脂質処方物は、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥTM
（特別なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム脂質）およびＳＵＰＥＲ
−ＦＥＣＴTM（新規の作用性デンドリマー技術（ａｃｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｍ
ｅｒｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））としてＱＩＡＧＥＮから、ならびに、例え
ば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥTM（これらは、例え
ば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメ
チルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のようなカチオン性脂質から構成される）としてＧ
ｉｂｃｏ ＢＲＬから市販される。リポソームを作製するための方法は当該分野
において周知であり、そして多くの刊行物に記載されている。リポソームは、Ｇ
ｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ３：２３５−２４１（１９８５）（これは、本明細書中で参考として援用さ
れる）による概説文献に記載された。
【００８４】
抗原が、この抗原をコードする核酸分子において被験体に送達され得、その結
果、この抗原がインビボで発現されるに違いないことが想像される。本発明のこ
れらの実施態様において、この核酸分子はまた、核酸配列中にＣｐＧジヌクレオ
チドを含み得る。しかしこの場合、この核酸分子は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
と取って代わることはない。抗原は、この核酸分子から離れたＣｐＧオリゴヌク
レオチドとの組合わせにおいて投与されなければならない。抗原をコードする核
酸は、真核生物細胞内での抗原核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に、作動可
能に連結される。「遺伝子発現配列」は、それに対して作動可能に連結される抗
原核酸の効率的な転写および翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオチド配列（例
えば、プロモーター配列、またはプロモーター−エンハンサーの組合わせ）であ
る。遺伝子発現配列とは、例えば、哺乳動物プロモーターまたはウイルス性プロ
モーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）であり得る
。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子についてのプロモーター
が挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β
−アクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーター。真核生物細胞中で構成
的に機能する、例示的なウイルス性プロモーターとしては、例えば、シミアンウ
イルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスおよ
び他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーター由来のプロモーターが挙げられる。他の構成
的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用な
プロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導
因子の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の
金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性
プロモーターは、当業者に公知である。
【００８５】
一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始
に関与する、５’−非転写配列および５’−非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボッ
クス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列など）を含む。特に、そのような５’−非転
写配列は、作動可能に連結された抗原核酸の転写制御についてのプロモーター配
列を含むプロモーター領域を含む。この遺伝子発現配列は、必要に応じてエンハ
ンサー配列、または所望される場合には上流のアクチベーター配列を含む。
【００８６】
抗原核酸は、遺伝子の発現配列に作動可能に連結される。本明細書中で使用さ
れる場合、抗原核酸配列および遺伝子発現配列が、この遺伝子発現配列の影響下
または制御下で、この抗原コード配列の発現あるいは転写および／または翻訳さ
せるように配置するような様式で共有結合される場合に、それらを「作動可能に
連結」されている状態であるという。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列
中のプロモーターの誘導が、抗原配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ
配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）
抗原配列の転写を指向する、プロモーター領域の能力を妨害しない、または（３
）タンパク質に翻訳される、対応するＲＮＡの転写の能力を妨害しない場合に、
作動可能に連結されているという。従って、遺伝子発現配列は、その遺伝子発現
配列が、抗原核酸配列の転写を有効にし得、その結果、得られる転写産物が所望
のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合に、抗原核酸配列に作動可能
に連結される。
【００８７】
本発明の抗原核酸は、単独で、またはベクターと共に、免疫系に送達され得る
。最も広範な意味で、「ベクター」とは、免疫系の細胞、および好ましくはＡＰ
Ｃへの抗原核酸の移行を促進し得、その結果、その抗原がＡＰＣの表面上で発現
および提示され得る、任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクタ
ーの非存在下で生じる崩壊の程度と比較して、崩壊性を低減して免疫細胞に核酸
を輸送する。ベクターは、必要に応じて、ＡＰＣでの抗原核酸の発現を増強する
ために上記の遺伝子発現配列を含む。一般的に、本発明において有用なベクター
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗原核酸配列の挿入ま
たは組込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス
供給源または細菌性供給源由来の他のビヒクル。ウイルスベクターは、ベクター
の好ましい型であり、これは以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれらに限
定されない：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベ
イマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）；
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイル
ス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワ
クシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス（例えば、レトロウ
イルス）。列挙されていないが、当該分野において公知の他のベクターを容易に
使用し得る。
【００８８】
好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子と置き換えら
れている、非細胞障害性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞障害性ウイルスと
しては、その生活環が、引き続き宿主の細胞性ＤＮＡへのプロウイルスの組込み
を伴う、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写に関与するレトロウイルスが
挙げられる。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療試行について認可されている
。最も有用なものは、複製欠損した（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向
し得るが、感染性粒子を生産し得ない）レトロウイルスである。そのような遺伝
的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率性
形質導入について、一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生す
るための標準的プロトコール（外因性の遺伝物質をプラスミドに組込む工程、プ
ラスミドによる、パッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッ
ケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からの
ウイルス粒子の回収工程、およびウイルス粒子を用いた標的細胞の感染工程を含
む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ Ｃ．Ｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．
Ｊ．編「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第７巻
、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ
ｅｙ（１９９１）に提供される。
【００８９】
特定の適用について好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス（二本鎖ＤＮＡ
ウイルス）である。このアデノ随伴ウイルスは、複製欠損となるように操作され
得、そして広範な細胞型および種に感染し得る。これはさらに、熱安定性および
脂質溶媒安定性；多様な系列の細胞（造血細胞を含む）中への高い形質導入頻度
；および重感染阻害の欠如（従って、複数回の連続した形質導入を可能にする）
のような利点を有する。報告されているように、アデノ随伴ウイルスは、ヒトの
細胞ＤＮＡ中に部位特異的様式で組み込み得、それによって挿入変異誘発および
レトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の可変性の可能性を最小化する。
さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００を超える
継代の組織培養に続く。これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安
定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式にお
いても機能し得る。
【００９０】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクタ
ーは、当該分野において広範に記載されており、そして当業者に周知である。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。ここ数年、
プラスミドベクターは、宿主ゲノム中で複製せずそしてその中に組み込まれない
というその能力が理由で、インビボで細胞に遺伝子を送達するために特に有用で
あることが見出された。しかし、宿主細胞に適合性のプロモーターを有するこれ
らのプラスミドは、プラスミド中で作動可能にコードされた遺伝子からペプチド
を発現し得る。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃ
ｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラ
スミドは、制限酵素および連結反応を使用して、ＤＮＡ中の特定のフラグメント
を除去および付加するように特注で設計され得る。
【００９１】
プラスミドを保有する遺伝子は、細菌を使用することによって、免疫系に送達
され得ることが近年発見された。細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の改変
形態は、プラスミドを用いてトランスフェクトされ得、そして送達ビヒクルとし
て使用され得る。細菌性送達ビヒクルは、経口的にか、または他の投与手段によ
って、宿主被験体に投与され得る。細菌は、おそらく腸障壁を通過することによ
って、免疫細胞（例えば、樹状細胞）にプラスミドを送達する。高レベルの免疫
防御は、この方法論を使用して確立された。
【００９２】
従って、本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインの
計画的な投与を意図する。このオリゴヌクレオチドは、被験体に毎週または毎月
を基準に投与され得る。被験体が１つまたは複数の抗原への曝露の危険性にある
場合、曝露に際して迅速に抗原を認識し、そして抗原特異的免疫応答を産生する
ように、規則的にＣｐＧおよび免疫増強サイトカインを投与し得る。抗原への曝
露の危険性のある被験体とは、抗原に曝露され、そして抗原への免疫応答を発達
させる高い可能性を有する任意の被験体である。抗原がアレルゲンであり、そし
て被験体がその特定の抗原に対してアレルギー応答を発達させ、そしてその被験
体がその抗原に曝露される場合（すなわち、花粉の時期の間）、その時、被験体
は抗原への曝露の危険性がある。
【００９３】
本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、非メチル化シトシン−グアニンジヌク
レオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ ＤＮＡ」、すなわち５’シトシン、次いで
３’グアノシンを含み、そしてリン酸結合によって連結されているＤＮＡ）を含
み、そして免疫系を活性化させる核酸分子である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは
、二本鎖または一本鎖であり得る。一般的に、二本鎖分子はインビボでより安定
であるが、一本鎖分子は増大した免疫活性を有する。
【００９４】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわ
ち、リン酸基および交換可能な有機塩基（置換ピリミジン（例えば、シトシン（
Ｃ）、チミジン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、ア
デニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））のいずれか）に連結された糖（例えば、
リボースまたはデオキシリボースを含む分子）を意味するために、交換可能に使
用される。本明細書中で使用される場合、この用語はオリゴリボヌクレオチドな
らびにオリゴデオキシリボヌクレオチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオ
シド（すなわち、リン酸を除いたポリヌクレオチド）およびポリマーを含む任意
の他の有機塩基を含む。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムまたは
ｃＤＮＡ）から入手され得るが、好ましくは合成される（例えば、オリゴヌクレ
オチド合成によって生成される）。完全なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、非メチ
ル化であり得るか、または部分的に非メチル化であり得るが、少なくとも５’Ｃ
Ｇ３’のＣは非メチル化されていなければならない。
【００９５】
１つの好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも以下の式：
５’Ｎ1Ｘ1ＣＧＸ2Ｎ2３’
によって示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、少なくとも１
つのヌクレオチドは連続したＣｐＧを分離し；Ｘ1はアデニン、グアニン、また
はチミンであり；Ｘ2はシトシン、アデニン、またはチミンであり；Ｎは任意の
ヌクレオチドであり、そしてＮ1およびＮ2は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配
列である。
【００９６】
別の実施態様において、本発明は、少なくとも以下の式：
５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4Ｎ2３’
によって示される単離されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、少
なくとも１つのヌクレオチドは連続したＣｐＧを分離し；Ｘ1Ｘ2は、ＧｐＴ、Ｇ
ｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＧおよびＡｐＴからなる群から選択され；Ｘ3Ｘ4は、ＴｐＴ
、ＣｐＴ、ＴｐＣ、ＣｐＣおよびＡｐＴからなる群から選択され；Ｎは、任意の
ヌクレオチドであり、そしてＮ1およびＮ2は、各々約０〜２５Ｎからなる核酸配
列である。好ましい実施態様において、核酸のＮ1およびＮ2は、ＣＣＧＧ四量体
（ｑｕａｄｍｅｒ）または１つより多いＣＣＧもしくはＣＧＧ三量体を含まない
。別の好ましい実施態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’ＴＣ
Ｎ1ＴＸ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4３’を有する。
【００９７】
好ましくは、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ
およびＡｐＡからなる群から選択されるＸ1Ｘ2を含み、そしてＸ3Ｘ4は、ＴｐＴ
、ＣｐＴおよびＧｐＴからなる群から選択される。細胞への取り込みを促進する
ために、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜３０塩基長の範囲で
ある。しかし、８ヌクレオチドより大きい任意のサイズ（数ｋｂ長でさえも）の
核酸は、十分な免疫刺激モチーフが存在する場合に、本発明に従って免疫応答を
誘導し得る。なぜなら、より長い核酸は細胞内でオリゴヌクレオチドに分解され
るからである。好ましい合成オリゴヌクレオチドは、ＣＣＧＧ四量体または１つ
より多いＣＣＧもしくはＣＧＧ三量体を、５’末端および／または３’末端また
はその付近に含まない。オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の改変を組み込む場合
には、安定化オリゴヌクレオチドはまた、以下においてより詳細に議論されるよ
うに、好ましい。改変は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエ
ート改変であり得る。好ましくは、リン酸骨格改変は、核酸の５’末端（例えば
、オリゴヌクレオチドの５’末端の、最初の２つのヌクレオチド）で生じる。さ
らに、リン酸骨格改変は、核酸の３’末端（例えば、核酸の３’末端の、最後の
５つのヌクレオチド）で生じ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは完全にか、
または部分的に改変され得る。
【００９８】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８と１００との間の範囲であり、
そしてより好ましくは８ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間のサイズである
。あるいは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、プラスミド中で大量に生成され得、
そしてオリゴヌクレオチドに分解され得る。
【００９９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強サイトカインは、被験体に直接的に
投与され得るか、または核酸送達複合体と組合わせて投与され得る。「核酸／サ
イトカイン送達複合体」とは、標的化手段（例えば、標的細胞へのより高い親和
性結合を生じる分子（例えば、樹状細胞表面および／または標的細胞による細胞
取り込みの増大））と結合した（例えば、それにイオン的にか、もしくは共有結
合的に結合した；または、その中にカプセル化された）、核酸分子および／また
はサイトカインを意味するべきである。核酸／サイトカイン送達複合体の例とし
ては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質
、ビロソーム、またはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、
標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）と結合した核酸／サイ
トカインが挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞によるインターナリゼーシ
ョンの前の有意な脱共役を妨げるために、インビボで十分に安定であるべきであ
る。しかし、複合体は、細胞内において適切な条件下で切断可能であるべきであ
り、その結果、核酸／サイトカインは機能的形態で放出される。
【０１００】
「パリンドローム配列」は、反転反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ
’Ａ’のような配列であって、ここでＡおよびＡ’は、通常のワトソン−クリッ
ク塩基対を形成し得る塩基である）を意味するべきである。インビボでそのよう
な配列は、二本鎖構造を形成し得る。１つの実施態様において、ＣｐＧオリゴヌ
クレオチドはパリンドローム配列を含む。この状況において使用されるパリンド
ローム配列は、ＣｐＧがパリンドロームの一部であり、そして好ましくはそのパ
リンドロームの中心であるパリンドロームをいう。別の実施態様において、Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドはパリンドロームを含まない。パリンドロームを含まない
ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、ＣｐＧジヌクレオチドがパリンドロームの一部
でないＣｐＧオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、Ｃ
ｐＧはそのパリンドロームの一部ではない、パリンドロームを含み得る。
【０１０１】
「安定化核酸分子」とは、インビボでの分解（例えば、エキソヌクレアーゼま
たはエンドヌクレアーゼを介した）に対して、比較的耐性である核酸分子を意味
するべきである。安定化とは、長さまたは二次構造の機能であり得る。数十〜数
百ｋｂ長である非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解に対
して比較的安定である。より短いＣｐＧオリゴヌクレオチドに対して、二次構造
は安定であり得、そしてそれらの効果を増大させる。例えば、オリゴヌクレオチ
ドの３’末端が、上流領域に対して自己相補性を有する場合、その結果、それは
折り畳み得、そして一種のステムループ構造を形成し得る。次いで、そのオリゴ
ヌクレオチドは安定となり、従ってより高い活性を示す。
【０１０２】
本発明の好ましい安定化オリゴヌクレオチドは、改変骨格を有する。オリゴヌ
クレオチド骨格の改変は、インビボに投与された場合に、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チドの増強した活性を提供することが実証されている。３’末端の多重ホスホロ
チオエート結合中にあるオリゴヌクレオチドの５’末端に、少なくとも２つ（好
ましくは５つ）のホスホロチオエート結合を含むＣｐＧ構築物は、最大の活性を
提供し、そして細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分
解から、このオリゴヌクレオチドを保護する。他の改変オリゴヌクレオチドとし
ては、ホスホジエステル改変オリゴヌクレオチド、ホスホジエステルおよびホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの組合わせ、メチルホスホネート、メチルホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびそれらの組合わせが挙げられ
る。これらの組合わせの各々、および免疫細胞に対するそれらの特定の効果は、
米国特許出願番号第０８／７３８，６５２号、同第０８／９６０，７７４号（そ
れぞれ、１９９６年１０月３０日出願、および１９９７年１０月３０日出願）（
これらの内容全体を、本明細書中で参考として援用する）の優先権を主張する、
同時係属中のＰＣＴ公開特許出願に、より詳細に議論される。これらの改変オリ
ゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞取り込みの増大、タンパク質
結合の増大、および／または細胞内局在化の改変に起因して、より高い刺激活性
を示し得る。
【０１０３】
ＣｐＧモチーフを含むホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌク
レオチドの両方は、樹状細胞のようなＡＰＣにおいて活性である。しかし、Ｃｐ
Ｇ特異的効果を誘導するために必要とされる濃度に基づいて、ヌクレアーゼ耐性
ホスホロチオエート骨格ＣｐＧオリゴヌクレオチドがより強力である（ホスホロ
チオエートについて２μｇ／ｍｌ対し、ホスホジエステルについて９０μｇ／ｍ
ｌの総量）。
【０１０４】
他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、以下を含む：非イオン性ＤＮＡアナ
ログ（例えば、アルキルホスフェートおよびアリールホスフェート、ここで、荷
電したホスホン酸酸素が、アルキル基またはアリール基で置換されている）、ホ
スホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電した酸素部分
はアルキル化されている）。いずれかの末端または両方の末端にジオール（例え
ば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴ
ヌクレオチドはまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示さ
れた。
【０１０５】
免疫リモデリングを誘導するために有用である本発明の核酸配列は、上記に広
範に記載され、そして米国特許出願番号第０８／７３８，６５２号および同第０
８／９６０，７７４号（それぞれ、１９９６年１０月３０日、および１９９７年
１０月３０日出願）に対して優先権を主張するＰＣＴ公開特許出願において開示
される核酸配列である。代表的な配列は、表１および以下に示される免疫刺激性
配列を含むがそれらに限定されない：
【０１０６】
【化３】
特定の免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡの刺激指数は、種々の免疫細胞アッセイにお
いて試験され得る。好ましくは、Ｂ細胞増殖に関する免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡ
の刺激指数は、マウスＢ細胞培養物における3Ｈウリジンの取り込みによって決
定される場合（同時係属中のＰＣＴ特許出願米国特許出願番号第０８／９６０，
７７４号において詳細に記載されるように、この培養物は、２０μＭのオリゴヌ
クレオチドと３７℃にて２０時間接触され、そして１μＣｉの3Ｈウリジンでパ
ルスされており；そして４時間後に収集およびカウントされた）、少なくとも約
５、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約１５、そして最
も好ましくは少なくとも約２０である。例えば、被験体における細胞媒介（局所
的）免疫応答を刺激することによって免疫系不全を処置するインビボでの使用の
ために、免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡが、樹状細胞のようなＡＰＣによるサイトカ
イン分泌を効果的に誘導し得ることが重要である。
【０１０７】
好ましい免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、治療的指示に依存して、実施例において記
載されるアッセイによって決定されるように、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌの
ＴＮＦ−α、１５ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、７０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２
７５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２をもたらすべきであ
る。他の好ましい免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡは、少なくとも約１０％、より好ま
しくは少なくとも約１５％、そして最も好ましくは少なくとも約２０％のＹＡＣ
−１細胞特異的溶解、または少なくとも約３０、より好ましくは少なくとも約３
５、そして最も好ましくは少なくとも約４０％の２Ｃ１１細胞特異的溶解をもた
らすべきである。免疫増強性サイトカインと組み合わせて投与される場合、所望
の免疫応答を生じるために必要とされるＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサイト
カインの両方の量は、より少ない。
【０１０８】
好ましくは、Ｂ細胞増殖に関するＣｐＧオリゴヌクレオチドの刺激指数は、マ
ウスＢ細胞培養物における3Ｈウリジンの取り込みによって決定される場合（こ
の培養物は、米国特許出願番号第０８／７３８，６５２号および同第０８／９６
０，７７４号（それぞれ、１９９６年１０月３０日、および１９９７年１０月３
０日出願）に対して優先権を主張する同時係属中のＰＣＴ公開特許出願において
詳細に記載されるとおり、２０μＭのオリゴヌクレオチドと３７℃にて２０時間
接触され、そして１μＣｉの3Ｈウリジンでパルスされており；そして４時間後
に収集およびカウントされた）、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０
、より好ましくは少なくとも約１５、そして最も好ましくは少なくとも約２０で
ある。例えば、インビボでの使用のために、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびサ
イトカインが、樹状細胞のようなＡＰＣの活性化を効果的に誘導し得ることが重
要である。例えば、このことを達成し得るオリゴヌクレオチドは、米国特許出願
番号第０８／７３８，６５２号および同第０８／９６０，７７４号（それぞれ、
１９９６年１０月３０日、および１９９７年１０月３０日出願）に対して優先権
を主張するＰＣＴ公開特許出願において記載されるオリゴヌクレオチドである。
【０１０９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインは、抗原の投与前に
単独で被験体に投与され得る。このオリゴヌクレオチドおよびサイトカインはま
た、即時型抗原特異的応答を提供する抗原と組み合わせて被験体に投与され得る
。次いで、第１の抗原と同じでも異なっていてもよい第２の抗原が、さらなるＣ
ｐＧおよびサイトカインの存在または非存在下でのＣｐＧおよび免疫増強性サイ
トカインの投与後のある時点で被験体に投与され得る。用語「〜と組み合わせて
」は、抗原のわずかに前、またはわずかに後、または同時の、ＣｐＧオリゴヌク
レオチドおよび免疫増強性サイトカインの投与をいう。用語「わずかに前」およ
び「わずかに後」は、２４時間、好ましくは１２時間をいう。ＣｐＧおよびサイ
トカインは、互いに組み合わせて投与され、従ってまた、一緒にまたは別々に投
与され得る。
【０１１０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインが、第１の抗原と組
み合わせて投与される場合、この第１の抗原は、即時型免疫応答の特異性を決定
する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインは、有効な「危
険シグナル」として作用し、そして免疫系を、この領域における新しい抗原に対
して激しく応答させる。この作用様式は、おそらく、主に、樹状細胞および他の
「専門的な」抗原提示細胞に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性
サイトカインの刺激性局所的効果、ならびにＢ細胞に対する同時刺激性効果から
生じる。この効果は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与の際にすぐに生じる。
【０１１１】
治療における使用のために、単独、または核酸／サイトカイン送達複合体とし
て処方された適切なＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインの
有効量は、このオリゴヌクレオチドが適切な標的細胞（例えば、樹状細胞）によ
って取り込まれるのを可能にする任意の様式で被験体に投与され得る。好ましい
投与経路は、経口投与、経皮投与（例えば、パッチを介する）、注射（皮下投与
、静脈内投与、非経口投与、腹腔内投与、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投
与など）、経鼻投与、気管内投与、および粘膜投与を含むがこれらに限定されな
い。注射は、ボーラスまたは連続的注入であり得る。
【０１１２】
用語「有効量」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、所望の生物学的効果を達成す
るに必要または十分な量をいう。例えば、免疫系不全を処置するために少なくと
も１つの非メチル化ＣｐＧを含む有効量のオリゴヌクレオチドは、免疫系の活性
化を生じ、抗原への曝露の際に抗原特異的免疫応答の発生を生じるのに必要な量
であり得る。本明細書中で使用される有効量は、相乗的な免疫応答を生じる量で
ある。相乗作用を引き起こす量は、ＣｐＧ単独またはサイトカイン単独のいずれ
かの個々の効果の合計より大きい、特異的抗原に対する免疫応答を生じる量であ
る。
【０１１３】
任意の特定の適用のために有効な量は、処置される疾患もしくは状態、投与さ
れる特定のＣｐＧオリゴヌクレオチド／サイトカイン（例えば、非メチル化Ｃｐ
Ｇモチーフの数、または核酸におけるそれらの位置）、被験体のサイズ、または
疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して変化し得る。当業者は、過度
な実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチド／サイトカインの有効
量を経験的に決定し得る。
【０１１４】
免疫増強性サイトカインと組み合わせたＣｐＧオリゴヌクレオチドについての
別の使用は、被験体における使用のための避妊方法を与えることである。この特
定の実施態様において、被験体は、好ましくは哺乳動物であり、そして好ましく
は非ヒトである。精巣および卵巣は、「免疫特権（ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌ
ｅｇｅｄ）」である。すなわち、これらは、免疫系とは解剖学的に分かれている
。さらに、精巣および卵巣における細胞は、活性化されたＴ細胞においてアポト
ーシスを誘導するｆａｓリガンドを発現し得る。ｆａｓリガンドの物理的分離お
よび発現はともに、精巣および卵巣における細胞に対する免疫応答を妨げる。免
疫増強性サイトカインと組み合わせて使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドを使
用して、これらの細胞の免疫特権を破壊することによって精巣および卵巣におけ
る細胞を排除または実質的に減少させ、それによって避妊手段を提供し得る。Ｃ
ｐＧオリゴヌクレオチドを、免疫増強性サイトカインと組み合わせて使用し、精
巣および卵巣の細胞の免疫特権を破壊し得る。
【０１１５】
この方法は、被験体に抗原、免疫増強性サイトカイン、および免疫刺激性Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドを投与することによって達成される。ここで、この抗原は
、生殖腺細胞（ｇｏｎａｄａｌ ｃｅｌｌ）抗原、および生殖腺細胞の維持のた
めに必要とされるサイトカインまたはホルモン由来の抗原からなる群から選択さ
れる抗原である。本明細書中で使用される「生殖腺細胞抗原」は、生殖腺細胞（
例えば、精巣細胞または卵巣細胞）の表面上の抗原である。そのような抗原は、
当業者に周知である。生殖腺細胞の維持のために必要とされるサイトカインまた
はホルモン由来の抗原もまた、当該分野において周知である。これらの抗原は、
このサイトカインまたはホルモンに対する免疫応答を引き起こし、従って生殖腺
細胞の損失を生じる。
【０１１６】
本発明の１つの局面において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用して、免疫細
胞、および好ましくはＡＰＣの活性化を誘導する。ＡＰＣは、当該分野において
通常の意味を有し、そして例えば、未成熟樹状細胞および前駆体および前駆体樹
状細胞、ならびに抗原を取り込み、そして発現し得る成熟樹状細胞のような樹状
細胞を含む。ＡＰＣまたは樹状細胞のこのような集団を、ＡＰＣまたは樹状細胞
のプライム化集団（ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）とよぶ。
【０１１７】
樹状細胞は、抗原を提示することによって、そしてそれらの局所的環境中のＬ
ＰＳ様微生物分子を検出するパターン認識レセプターの発現を介して、先天性免
疫系と後天性免疫系との間の連結を形成する。免疫増強性サイトカインおよびＣ
ｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせは、免疫増強性サイトカイン単独でＴｈ２
特異的抗体を産生するのみであった場合に、Ｔｈ１特異的抗体の誘導を示した。
樹状細胞は先天性免疫系と後天性免疫系との間の連結を形成するので、ＣｐＧお
よび免疫増強性サイトカインを用いて樹状細胞を活性化する能力は、癌およびア
レルギー性疾患または感染性疾患のような障害に対する免疫療法のためのＣｐＧ
−免疫増強性サイトカインの組み合わせに基づくストラテジーの使用を支持する
。ＣｐＧおよび免疫増強性サイトカインの組み合わせは、樹状細胞の相乗的活性
化を示す。
【０１１８】
１つの局面において、本発明は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボで
の目的のための樹状細胞を活性化するための方法および産物に関する。本発明に
よって、免疫増強性サイトカインおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせ
は、樹状細胞の強力な活性化因子であることが示された。樹状細胞は、インビボ
での免疫細胞における一次免疫応答の開始のために必須であると考えられる。本
発明によって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインが、ア
ジュバントと類似して、Ｔ細胞における一次免疫応答を開始するように樹状細胞
を活性化し得ることが発見された。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性
サイトカインの組み合わせを使用して樹状細胞を活性化する場合、優勢的にＩｇ
Ｇ２ａそしてより少ないＩｇＧ１の産生が誘導されることが発見された。このこ
とは、この組み合わせが、インビボにおいてＴｈ１免疫応答の発達を増強すると
いう傾向を示す。これらの知見は、ＣｐＧの強力なアジュバント活性を示し、そ
して障害（例えば、癌、感染性疾患、およびアレルギー）の処置における免疫療
法剤としてのＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用の基礎を提供する。１つの局面に
おいて、本発明は、抗原に曝露される樹状細胞を、樹状細胞を相乗的に活性化す
るのに有効な量の免疫増強性サイトカインおよび免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレ
オチドと接触させることによって、樹状細胞を活性化するための方法である。
【０１１９】
樹状細胞は、それが曝露される可溶性の特異的抗原を効率的にインターナライ
ズし、プロセシングし、そして提示する。抗原のインターナリゼーションおよび
提示のプロセスは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）および同時刺激性分
子の発現、サイトカインの産生、ならびにＴ細胞の活性化に関与すると考えられ
ているリンパ器官への移動の迅速なアップレギュレーションを引き起こす。
【０１２０】
本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫増強性サイトカインの組み合わ
せについての１つの特定の使用は、癌抗原に対する特異的な免疫応答を増強する
目的のために樹状細胞を活性化することである。この免疫応答は、エキソビボ技
術またはインビボ技術を用いて増強され得る。本明細書中で使用される「エキソ
ビボ」方法は、被験体からの樹状細胞の単離、身体の外側でのこの細胞の操作、
およびこの操作された細胞の被験体への再移植を含む方法である。このエキソビ
ボ手順は、自己細胞または異種細胞に対して使用され得るが、好ましくは自己細
胞に対して使用される。好ましい実施態様において、樹状細胞は、末梢血または
骨髄から単離されるが、樹状細胞の任意の供給源から単離され得る。このエキソ
ビボ手順を実施して、特定の癌または他の型の抗原に対して活性な樹状細胞を特
異的に産生する場合、この樹状細胞は、ＣｐＧおよび免疫増強性サイトカインに
加えて、その抗原に曝露され得る。他の場合、この樹状細胞はすでに抗原に曝露
されてい得るが、その表面上でその抗原を効率的に発現してい得ない。あるいは
、その樹状細胞は、直接的な接触または身体における曝露のいずれかによって、
免疫増強性サイトカインに曝露され、そして抗原に曝露され得る。次いでその樹
状細胞は、身体に戻され、続いて全身または局所的のいずれかで被験体に直接的
にＣｐＧが投与される。活性化は、劇的に抗原プロセシングを増加する。次いで
、活性化された樹状細胞は、その表面上に癌抗原を提示する。被験体に戻された
とき、この癌抗原を発現する活性化された樹状細胞は、その癌抗原に特異的であ
るＴ細胞をインビボで活性化する。癌免疫療法のための樹状細胞のエキソビボ操
作は、以下を含む、当該分野におけるいくつかの参考文献に記載されている：Ｅ
ｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、１９９７、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：
１；Ｖａｎ Ｓｃｈｏｏｔｅｎ，Ｗ．ら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ，６月、２５５；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、１９
９６、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４、８４９；およ
びＧｌｕｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｃ．、１９９７、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、３：１８７。本発明の樹
状細胞のエキソビボ活性化は、活性化因子としてのＣｐＧおよび免疫増強性サイ
トカインの使用を除いては、当該分野において公知の慣用的なエキソビボ操作工
程によって実施され得る。
【０１２１】
この樹状細胞はまた、インビボ方法を用いて、ＣｐＧおよび免疫増強性サイト
カインと接触され得る。これを達成するために、ＣｐＧおよび免疫増強性サイト
カインは、免疫療法の必要性のある被験体に直接的に投与される。ＣｐＧおよび
免疫増強性サイトカインは、抗原と組み合わせて投与されても、単独で投与され
てもよい。いくつかの実施態様において、ＣｐＧおよび免疫増強性サイトカイン
は、腫瘍の局所領域に投与されることが好ましく、このことは、当該分野におい
て公知の任意の方法（例えば、腫瘍への直接的注入、薬物の組み合わせを放出す
る移植物を用いる、など）で達成され得る。
【０１２２】
本発明による有用な樹状細胞は、その細胞が、活性な抗原発現樹状細胞を産生
するようにＣｐＧおよびサイトカインによって活性化され得る限り、任意の供給
源から単離され得る。未成熟樹状細胞のいくつかのインビボ供給源が、本発明の
方法によって使用され得る。例えば、骨髄樹状細胞および末梢血樹状細胞はとも
に、ＣｐＧおよびサイトカインによって活性化される未成熟樹状細胞の優れた供
給源である。他の供給源は、当業者によって過度な実験を必要とすることなく容
易に決定され得る。例えば、樹状細胞の初代供給源を単離し、そしてインビトロ
でＣｐＧによる活性化を試験することによる。本発明はまた、その細胞がＣｐＧ
およびサイトカインによって活性化され得る限り、細胞株として培養において維
持される任意の未成熟樹状細胞の使用を含む。そのような細胞型は、当該分野に
おいて公知の標準的なアッセイを用いて慣用的に同定され得る。
【０１２３】
免疫磁気セルソーティングによって単離され、ＣｐＧおよびサイトカインによ
って活性化されている末梢血樹状細胞は、単球由来樹状細胞よりも多くの、樹状
細胞の生理学的細胞集団を示す。未成熟樹状細胞は、骨髄における細胞の約１〜
３％、および末梢血において約１０分の１〜１００分の１を含む。末梢血細胞は
、当該分野において周知のデバイス（例えば、ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓモデルｖ
．５０アフェレーシスデバイス（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ
，ＭＡ））を用いて回収され得る。赤血球および好中球は、遠心分離によって血
液から除去される。境界面に位置する単核細胞が単離される。末梢血からＣＤ４
＋樹状細胞を単離するための方法は、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ Ｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１９９３；１７８：１０６７〜１０７６に記載されている。ＧＭ−ＣＳ
Ｆ単独の存在下で、これらの細胞は、２日以内の特徴的な細胞プロセスを有する
樹状細胞に分化する。分化は、細胞のサイズ、顆粒性、およびＭＨＣ ＩＩ発現
における増加によって付随され、このことは、フローサイトメトリーを用いて容
易に理解され得る。ＧＭ−ＣＳＦの非存在下で培養された新しく単離された樹状
細胞は、迅速にアポトーシスを経る。著しいことに、（ＧＭ−ＣＳＦの添加なし
での）ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下では、細胞生存および分化の両方は、
ＧＭ−ＣＳＦと比較して顕著に改善される。ＣｐＧの存在下で、樹状細胞は、電
子顕微鏡のような超微細構造技術によって試験される場合に、ＧＭ−ＣＳＦとと
もにインキュベートされた樹状細胞中では存在しなかった特徴的な密の多層状細
胞質内体および多小胞構造を示した細胞クラスターを形成する。走査電子顕微鏡
は、細胞間相互作用のために使用されると考えられる長いベールおよびシート様
の突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）、および不規則な細胞形状を示した。対照的に、ＧＭ
−ＣＳＦとともにインキュベートされた細胞は、円形であり、そして少数の細胞
性突起のみを有した。樹状細胞の生存および分化を促進することに加えて、Ｃｐ
Ｇオリゴヌクレオチドのみの添加は、同時刺激性分子ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）
、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、およびＣＤ４０のアップレギュレーションによって示
されるような活性化を導いた。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの
組み合わせは、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現を相乗的に増強し、このことは、
活性化がＣｐＧ誘導ＧＭ−ＣＳＦに起因しないことを示す。
【０１２４】
（免疫刺激性核酸を作製するための方法）
本発明における使用のために、核酸は、当該分野において周知の多くの手順の
うちのいずれかを使用してデノボ合成され得る。例えば、ｂ−シアノエチルホス
ホロアミダイト法（Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ，１９８１、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホン
酸法（Ｇａｒｅｇｇら、１９８６、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５１
；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９
９〜５４０７；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜
４０５８、Ｇａｆｆｎｅｙら、１９８８）、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜
２６２２。これらの化学は、市場で入手可能な種々の自動化オリゴヌクレオチド
合成機によって実施され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、公知の技術（
例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを使用する
技術）を使用して、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製
され得る。
【０１２５】
インビボでの使用のために、核酸は好ましくは、分解（例えば、エンドヌクレ
アーゼおよびエキソヌクレアーゼを介する分解）に対して比較的耐性である。ス
テムループのような二次構造は、核酸を分解に対して安定にし得る。あるいは、
核酸の安定化は、先に議論されるようなリン酸骨格改変を通じて達成され得る。
好ましい安定化された核酸は、リン酸骨格改変を通じて達成され得る。好ましい
安定化された核酸は、少なくとも部分的なホスホロチオエート改変骨格を有する
。ホスホロチオエートは、ホスホロアミダイト化学またはＨ−ホスホン酸化学の
いずれかを使用する自動化技術を用いて合成され得る。アリールホスホネートお
よびアルキルホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号において
記載されるように作製され得；そしてアルキルホスホトリエステル（ここで、荷
電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許番号０９２
，５７４において記載されるようにアルキル化されている）は、市販の試薬を用
いる自動化固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格改変および置換を作
製するための方法は記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ
，Ａ．、１９９０、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ
．１９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５）。ＣｐＧモチ
ーフを有する２’−Ｏ−メチル核酸もまた、エトキシ改変ＣｐＧ核酸と同様に免
疫活性化を生じる。実際に、ＣｐＧ効果を完全に破壊する骨格改変は見出されて
いないが、ＣｐＧ効果は、Ｃを５−メチルＣで置換することによって非常に低減
される。
【０１２６】
インビボでの投与のために、核酸およびサイトカインは、標的細胞（例えば、
樹状細胞）表面へのより高い親和性の結合、および／または標的細胞による増加
した細胞取り込みを生じ、先に議論されるような「核酸／サイトカイン送達複合
体」を形成する分子と関連し得る。核酸は、当該分野において周知の技術を用い
て、適切な分子とイオン結合または共有結合され得る。種々のカップリング剤ま
たは架橋剤（例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））が使用され得
る。あるいは、核酸は、周知の技術を用いてリポソームまたはヴィロソーム中に
被包され得る。
【０１２７】
活性化樹状細胞、単離されたＣｐＧ核酸分子、サイトカインおよびそれらの混
合物を含む、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な組成物中で投与される。投
与される場合、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な量で適用される。このよ
うな調製物は、通常、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性キャリア、および必要に応じ
て、他の治療剤を含み得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に受容
可能であるべきであるが、薬学的に受容可能でない塩が、それらの薬学的に受容
可能な塩を調製するために都合よく利用され得、そして本発明の範囲から除外さ
れない。このような薬理学的に受容可能な塩および薬学的に受容可能な塩は、以
下の酸：塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サ
リチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩を含むが
、これらに限定されない。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩また
はアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム
塩）として調製され得る。本明細書中で使用される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チド組成物および／または免疫強化サイトカイン組成物は、上記の化合物および
それらの塩を意味する。
【０１２８】
本発明の組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせ得
る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で用いられる場合、ヒ
トまたは他の動物への投与に適切な１つ以上の適合性の固体賦形剤もしくは液体
賦形剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」は、活性
な成分が適用を促進するように組み合わせられる、天然または合成の、有機成分
または無機成分を意味する。薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を
実質的に損なう相互作用が存在しないような様式で、本発明の分子とそして互い
に同時に混合され得る。
【０１２９】
薬学的組成物は、以下を含む適切な緩衝剤を含み得る：酢酸塩；クエン酸塩；
ホウ酸塩；およびリン酸塩。
【０１３０】
薬学的組成物はまた、必要に応じて以下のような適切な防腐剤を含み得る：ベ
ンザルコニウムクロリド；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサール。
【０１３１】
非経口的投与に適切な組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張な、本
発明の組成物の無菌水性調製物を都合よく含み得る。この水性調製物は、適切な
分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の方法に従って、処方され得る
。滅菌した注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤また
は溶媒中の滅菌した注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオ
ール中の溶液のような）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶
媒には、水、リンゲル溶液、および等張な塩化ナトリウム溶液がある。さらに、
滅菌した不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として都合よく使用される。この目
的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激性の低
い不揮発性油が、使用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射可
能な調製物において使用され得る。経口投与、皮下投与、静脈投与、筋肉内投与
などに適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅ
ａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出され得る。
【０１３２】
種々の投与経路が、利用可能である。選択された特定のモードは、もちろん選
択された特定の組成物、処置されている状態の重症度、および治療的有効性に必
要な投与量に依存する。一般的に言えば、本発明の方法は、投与の任意のモード
を使用して実行され得る。このモードは、医学的に受容可能であり、臨床的に受
容不可能な有害な効果を生じることのない有効レベルの活性な化合物を産生する
任意のモードを意味する。このような投与のモードは、経口的経路、直腸経路、
局所経路、経鼻経路、皮内経路、または非経口経路を含む。用語「非経口」は、
皮下、静脈内、筋肉内または注入を含む。静脈内または筋肉内経路は、長期間の
治療および予防に特に適切なわけではない。しかし、それらは、緊急事態に好ま
しく有り得る。経口投与は、予防的処置において好ましい。なぜなら、経口投与
は、患者および投薬計画に都合がいいからである。
【０１３３】
この組成物は、単位用量形態で好都合に提示され得、そして薬学分野で周知の
方法のいずれかにより調製され得る。すべての方法は、本発明の組成物を１つ以
上の補助成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、これら
の組成物は、本発明の組成物を液体キャリア、細かく分割された固体キャリア、
またはその両方と均一かつ親密に会合させ、次いで、必要であれば、産物を成形
することにより調製される。
【０１３４】
経口投与に適した組成物は、それぞれが本発明の組成物の予め決定した量を含
む別々のユニット（例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤）として示され得る
。他の組成物は、水性の液体中の懸濁物または非水性の液体中の懸濁物（例えば
、シロップ、エリキシルまたは乳濁液）を含む。
【０１３５】
他の送達系は、時間放出送達系、遅延放出送達系、または持続放出送達系を含
み得る。このような系は、上記の本発明の組成物の反復投与を避け、被験体およ
び医者の便利さを増す。放出性送達系の多くの型が、利用可能であり、そして当
業者に公知である。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレ
ート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒ
ドロキシ酪酸、およびポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）のようなポリ
マーベースの系を含む。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例え
ば、米国特許第５，０５７，１０９号に記載される。送達系はまた、以下の非ポ
リマー系を含む：コレステロールのようなステロール、コレステロールエステル
および脂肪酸、またはモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドのよ
うな中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉ
ｃ）系；ペプチドに基づいた系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦
形剤を使用する圧縮した錠剤；部分的に融合した移植片など。特定の例は、以下
を含むがそれらに限定されない：（ａ）本発明の組成物が、米国特許第４，４５
２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，４７８，０３４号および同
第５，２３９，６６０号に記載されるような形態でマトリクス内に含まれる、侵
食系、ならびに（ｂ）活性な成分が、制御された速度で米国特許第３，８３２，
２５３号および同第３，８５４，４８０号に記載されるようにポリマーから浸透
する、分散性の系。さらに、ポンプに基づいたハードウェア送達系が、使用され
得、それらのいくつかは、移植に適用される。
【０１３６】
長期間持続放出移植片の使用は、慢性的な状態の処置のために特に適切であり
得る。長期間の放出は、本明細書で使用される場合、移植片が、少なくとも３０
日および好ましくは６０日の間、治療的レベルの活性な成分の送達のために作製
およびアレンジされていることを意味する。長期間持続放出移植片は、当業者に
周知であり、そして上記の放出系のいくつかを含む。
【実施例】
【０１３７】
（実施例）
（実施例１：材料および方法）
腫瘍モデルおよび腫瘍抗原：３８Ｃ１３マウスＢ細胞リンパ腫モデルは、抗体
に基づく治療およびリンパ腫の活性な免疫化の研究において広範に使用されてい
る（Ｋｗａｋ，Ｌ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１０９７２−７、１９９６）。３８Ｃ１３表面ＩｇＭのイディオタイプ（
Ｉｄ）は、非常に特異的な腫瘍関連抗原として作用する（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｙ．
およびＨａｉｍｏｖｉｃｈ，Ｊ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：４１３−
７、１９９７）。Ｉｄは、Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２２
：２４３０（１９７９）に記載されるように３８Ｃ１３ ＩｇＭを分泌する細胞
株の上清から得て、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。精製されたＩｄを、グルタルアルデヒドを使用してキーホールリン
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化し、そして免疫原として使用した。３
８Ｃ１３ Ｉｄ／マウスＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を産生する細胞株を、Ｒｏ
ｎａｌｄ Ｌｅｖｙ博士により親切にも提供していただいた。この細胞株を、中
空繊維リアクター（Ｕｎｉｓｙｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔ
ｏｎ、ＭＡ）中で培養し、そして融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティ
ークロマトグラフィーにより得た。融合タンパク質は、３８Ｃ１３ Ｉｄ重鎖可
変領域および軽鎖可変領域、ヒトＩｇＧ1重鎖定常領域および軽鎖定常領域、な
らびにマウスＧＭ−ＣＳＦ配列からなる（Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．およびＬｅｖｙ，Ｒ
．、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７５５−７５８、１９９３）。二機能性反応性を、
使用前にＥＬＩＳＡにより確認した。プレートを抗Ｉｄを用いて被膜し、融合タ
ンパク質の系列希釈物を添加し、そして抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体とのプロービングに
より、結合したＧＭ−ＣＳＦ部分の存在を評価した。３８Ｃ１３ Ｉｄ／ヒトＧ
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質を、同様の様式により得て、そしてコントロールとし
て使用した。
【０１３８】
免疫化：２つのホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドを、商業的に購
入し、そしてＧＭＰ条件下で生成した（Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．、Ｗｉｌｓｏｎ
ｖｉｌｌｅ、ＯＲ）。両方のオリゴヌクレオチド配列は、全てのアッセイにおい
て同様の効果を有した。他に示さない限り、ＣｐＧオリゴヌクレオチド１７５８
を使用した。オリゴヌクレオチド１７５８は、以下の配列を有し：
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１０４）
そしてオリゴヌクレオチド１８２６は、以下の配列を有した：
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号３）。
【０１３９】
両方のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、メチル化されていなかった。検出可能な
エンドトキシンは、ＬＡＬアッセイではどちらのＣｐＧオリゴヌクレオチドにお
いても存在しなかった。以前の研究が、非免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ア
ジュバント効果をほとんど有さないことを実証した（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８３３−１０８
３７、１９９７）。それゆえ、非免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、この研究に
は含まれなかった。樹状細胞のインビトロ生成のためのマウスＧＭ−ＣＳＦは、
商業的に購入した（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）。イン
ビトロ研究のためのＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｍｍｕｎｅｘにより親切にも提供してい
ただいた（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）。
【０１４０】
Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙから得た雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマ
ウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｕ
ｎｉｔにて飼育し、そして６〜９週齢で使用した。各マウスを、総量２００μｌ
の示した抗原およびアジュバントを、ＰＢＳをビヒクルとして使用して皮下に免
疫した。
【０１４１】
抗ＩｄレベルのＥＬＩＳＡ決定：血清を、メトファン（ｍｅｔｏｐｈａｎｅ）
を用いる吸入麻酔後に、後部眼窩の穿刺によりマウスから得た。マイクロタイタ
ープレートを、５μｇ／ｍｌの３８Ｃ１３ ＩｇＭまたは関係のないＩｇＭを用
いて一晩被膜した。ＩｇＭ被膜プレートを、５％乳汁でブロックし、そして血清
の系列希釈を添加した。既知の濃度のモノクローナル抗Ｉｄを添加したネイティ
ブのマウスからの血清を、標準物として使用した。プレートを洗浄し、そして重
鎖特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ1またはＩｇＧ2a（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａ
Ｌ）を添加し、続いて比色基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加した。プ
レートを、マイクロプレートリーダーを使用して評価した。試験曲線を、標準曲
線と比較し、抗Ｉｄの濃度を決定した。値は、標準曲線およびサンプル曲線が、
同じ形である場合にのみ、有効であると考えた。コントロール（関係のないマウ
スＩｇＭ）との血清の反応性を並行して評価した。そしてそれは、全てのアッセ
イにおいて陰性であった。このことにより、免疫応答が、アイソタイプ応答の発
生のためではないことを確認した。
【０１４２】
インビトロ生存研究：示した抗原およびアジュバントを使用する単回皮下免疫
の３日後、マウスを、１，０００の３８Ｃ１３生細胞を用いて腹腔内接種をした
。細胞は、接種前に、少なくとも４日間対数期で増殖した。腫瘍を発症させたマ
ウスは、鼠径部および腹部に、塊、腹水および悪液質を示した。腫瘍を発症させ
た全てのマウスが死亡した。生存を決定し、そして死ぬまでの時間に対する有意
性を、コックス回帰分析を使用して評価した。統計的な目的のために、６０日の
生存を、腫瘍を有さずに維持したマウスについて設定した。無期限でそのような
全てのマウスを腫瘍を有さずに維持し、そして少なくとも１００日間モニターし
た。
【０１４３】
樹状細胞産生および刺激：樹状細胞を、以前に記載されたアプローチ（Ｚｉｔ
ｖｏｇｅｌ，Ｌ．ら、Ｊ Ｅｘ Ｍｅｄ １８３：８７−９７、１９９６；Ｍａ
ｙｏｒｄｏｍｏ，Ｊ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：１２９７
−３０２、１９９５）を改変したアプローチを使用して得た。簡潔には、骨髄細
胞を、実験されていない６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの大腿骨および脛骨
をフラッシュすることにより得た。赤血球細胞を、溶解し、そしてＴ細胞を、抗
ＣＤ３（１４５．２Ｃ１１）抗体、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）抗体および抗ＣＤ８
（５３．６．７）抗体の混合物を使用して、補体媒介溶解により取り除いた。次
いで、Ｂ細胞を、抗Ｂ−２２０で被膜したフラスコを使用するパニングにより取
り除いた。残った細胞を、一晩固着させた。非固着細胞を、１．２５×１０5細
胞／ｍｌの濃度の、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌの
ｍｕＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を補充した
培地で培養した。培地を４日後に交換し、そして骨髄を採取した７日後に樹状細
胞を採取した。樹状細胞の表現型および形態を、フローサイトメトリー分析およ
び走査型電子顕微鏡により確認した。樹状細胞を、洗浄し、計数し、そして１×
１０5細胞を、最終濃度１００μｇ／ｍｌの抗体および最終濃度５０μｇ／ｍｌ
のＣｐＧオリゴヌクレオチドとともに総容量２００μｌ中で、１８時間培養した
。サイトカインレベルの測定のために、全てのサンプルを、４連で行なった。上
清を採取し、そして記載されるように（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２８７９−８３、１９９６；Ｙ
ｉ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：５５８−６４、１９９６）ＩＬ
−６およびＩＬ−１２の存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１４４】
（実施例２：ＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとして使用した場合、ＣｐＧオリゴ
ヌクレオチドは、Ｉｄ−ＫＬＨ免疫に対する抗体応答の発生を増強する）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＧＭ−ＣＳＦを含む多くのサイトカインのＡＰ
Ｃによる産生を誘導することが公知である（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｄ
ｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：７３−６、１９９６）。ＧＭ−ＣＳ
ＦへのＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加が、免疫応答をさらに増強するかどうか
を決定するために、マウスを、５０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、１０μｇ
のＧＭ−ＣＳＦ、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの混合物
と水溶液中で混合したＰＢＳ中の５０μｇのＩｄ−ＫＬＨの単回の皮下注射によ
り免疫した。血清を毎週採取し、そして抗原特異的ＩｇＧ（抗Ｉｄ ＩｇＧ）の
存在についてＥＬＩＳＡにより評価した。図１に示すように、ＣｐＧオリゴヌク
レオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの両方を使用して免疫したマウスは、最高レベルの
抗Ｉｄ ＩｇＧを発達させた。これらの２つのアジュバントの効果は、相化的で
あることが明らかとなった。
【０１４５】
従って、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせは、抗原
取りこみを増加するＧＭ−ＣＳＦとの免疫応答の誘導における多くの異なる段階
を増強し得る一方で、エフェクター細胞活性化に関与するサイトカインの産生を
含む下流の応答を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが増強する。さらに、ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、抗原レセプターを介したＢ細胞活性化の相乗的な促進により
寄与し、そしてこのことが、抗原特異的Ｂ細胞を優先的に活性化する（Ｋｒｉｅ
ｇ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−９、１９９５）。この上記に
示したデータは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの組み合わせを
含む免疫ストラテジーが、特に効果的であることを提示した。ＣｐＧオリゴヌク
レオチドおよび可溶性ＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｄ−ＫＬＨでの免疫後に、抗Ｉｄ Ｉ
ｇＧを誘導するその能力においてのみ相加的であった。このことは、マウスＧＭ
−ＣＳＦの短い半減期に起因し得る（Ｋｅｄａｒ，Ｅ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒａｐｙ ２０：１８０−９３、１９９７）。
【０１４６】
（実施例３：ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク
質での免疫に続く抗Ｉｄ抗体の産生を増強する）
３８Ｃ１３可変領域、ヒトＩｇＧ定常領域、およびマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｄ
／ＧＭ−ＣＳＦ）からなるＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、優れた免疫原
であることが示されている（Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．およびＬｅｖｙ，Ｒ．、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６２：７５５−７５８、１９９３）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、Ｉ
ｄ／ＧＭ−ＣＳＦにより誘導される特異的抗体応答をさらに増強し得るか否かを
評価するために、マウスを、Ｉｄ−ＫＬＨまたはアジュバントとしてＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドを含むＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを
含まないＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫した。血清を毎週採取し、そして抗Ｉｄ Ｉ
ｇＧレベルを決定した。どのマウスにおいても毒性は、観察されなかった。図２
に示すように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦに応答して抗
Ｉｄ応答の産生を増強した。
【０１４７】
別の実験において、同じ抗原およびアジュバントを用いて、マウスを０日目に
免疫し、そして１４日目にブーストした。Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせは、２回の免疫後、明らかに高レベルの抗Ｉｄ Ｉ
ｇＧを誘導した（図３）。最後の免疫の１週間後に採取した血清は、２．５ｍｇ
／ｍｌを超える抗Ｉｄ ＩｇＧを含んだ。３８Ｃ１３ＩｄおよびＧＭ−ＣＳＦ（
Ｉｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦ）からなる融合タンパク質を、コントロールとして誘導
した。なぜなら、ヒトＧＭ−ＣＳＦは、マウスの系においては活性ではないから
である。Ｉｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦは、マウスＧＭ−ＣＳＦ配列をヒトＧＭ−ＣＳ
Ｆ配列で置換したことを除いて、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦと同一であった。ＣｐＧオ
リゴヌクレオチドを含むＩｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドを含まないＩｄ／ヒトＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫した後に産生される抗Ｉｄの
レベルは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ後に見られたレベルより有意に低く、そしてＩｄ
−ＫＬＨで見られたレベルに類似していた。このことは、生物学的に活性なＧＭ
−ＣＳＦが、観察された効果に重要であることを実証する。
【０１４８】
（実施例４：ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＩｇＧ2aアイソタイプの抗原特異
的抗体の産生を増強する）
ＩｇＧ1の増強された産生は、Ｔｈ２応答を反映するが、優勢なＩｇＧ2a産生
は、Ｔｈ１応答を示す（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：
２５５−８、１９８８）。さらに、マウスＩｇＧ2aは、抗体依存細胞傷害性の媒
介においてマウスＩｇＧよりさらに効果的であり、そしてモノクローナルＩｇＧ
2aは、マウスにおいて腫瘍を処置するための治療的抗体のセットとして、同じ可
変領域を有するモノクローナルＩｇＧよりもよく機能する（Ｋａｍｉｎｓｋｉ，
Ｍ．Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３６：１１２３−１１３０、１９８６）。ア
イソタイプを、抗Ｉｄ ＩｇＧに対して分析し、そして抗Ｉｄ ＩｇＧ1および
ＩｇＧ2aの存在を免疫後に評価した（図４）。免疫は、Ｉｄ−ＫＬＨまたはＩｄ
／ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドとの種々の組み
合わせを含んだ。血清を、単回の免疫から４週間後にサンプリングした。ＣｐＧ
オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを有さない対応する条件下で
見られた産生と比較して増強された抗Ｉｄ ＩｇＧ2aの産生を誘導した。同様の
ＩｇＧ1／ＩｇＧ2aの比率が、他の時点でも見られた。
【０１４９】
（実施例５：ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパ
ク質を使用する免疫は、腫瘍増殖からマウスをさらに保護する）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ免疫との有効なアジュ
バントとして作用に得るか否かを評価するために、マウスをＣｐＧオリゴヌクレ
オチドを有するＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドを有さない
Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦで単回免疫した３日後に、腫瘍でチャレンジした。この日程
での免疫は、Ｉｄ−ＫＬＨを用いると最小限の効果にすぎなかった。ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチド１７５８およびＣｐＧオリゴヌクレオチド１８２６は、単独で、
またはＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせで用いた場合、生存の延長に対して同
等に効果的であった。図５に示したこのデータは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド１
７５８およびＣｐＧオリゴヌクレオチド１８２６で処置したマウスの組み合わせ
た結果を示す。全ての非免疫化マウス、および抗原を有さないＣｐＧオリゴヌク
レオチドで処置したマウスは、腫瘍を発達させ、そして５０日以内に死亡した。
Ｉ／ＧＭ−ＣＳＦ単独で免疫したマウスの３０％が、罹患しないままであったが
、一方Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドで免疫したグループ
の７０％が、罹患しないままであった。Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴ
ヌクレオチドで免疫したマウスは、生存していた。このことは、非免疫またはＣ
ｐＧオリゴヌクレオチド単独で処置した場合と比べて統計的に優位であった（Ｐ
＜０．００１）。Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ単独で免疫したもの対ＣｐＧオリゴヌクレ
オチドおよびＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫したものとの間の差異は、統計的有意さ
が類似していた（Ｐ−０．０７２）。
【０１５０】
これらの研究および実施例５の研究において、抗Ｉｄ ＩｇＧの顕著なレベル
が、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドでの反復した免疫後に
達成された。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、可溶性ＧＭ−ＣＳＦおよびＩｄ／Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質での免疫を含む研究した全ての条件下において、Ｉｇ
ＧSAに対する応答を変化させた。このことは、ＴＨ１応答の増強を示唆した。こ
のアプローチを用いる免疫は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌクレオ
チドでの免疫のたった３日後で腫瘍増殖からの保護を生じた。これは、この広範
な研究モデルにおいて、今までのところ報告された最も効果的な保護である。
【０１５１】
（実施例６：樹状細胞表現型に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドの効果）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦの相乗的な効果は、これらの薬
剤が、一緒にＡＰＣによる同時刺激分子の発現またはＭＨＣの発現を増強し得る
ことを示唆する。骨髄由来の樹状細胞によるこれらの分子の発現を、評価した。
Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＣｐＧオリゴヌクレオチドでパルスした樹状
細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴヌ
クレオチドの組み合わせに応答してのクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ発現の
穏やかな増加を実証した。ＣＤ８０およびＣＤ８６発現のベースライン発現は、
高かった。そしてそれは、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＣｐＧオリゴヌクレオチド
によって、顕著には変化しなかった（図６）。
【０１５２】
（実施例７：ＣｐＧオリゴヌクレオドはＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦでパルスした樹状
細胞によるＩＬ−１２の産生を増強する）
抗原に対するＴｈ１応答の増強は、樹状細胞のようなＡＰＣによるＩＬ−１２
産生を増強するＣｐＧオリゴヌクレオチドの能力により説明され得た。抗原（Ｉ
ｄ／ＧＭ−ＣＳＦを含む）でパルスされた骨髄由来の樹状細胞によるＩＬ−１２
の産生を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下で評価した。図７に示すように、
ＣｐＧオリゴヌクレオチドで樹状細胞をパルスすることは、特に細胞を、Ｉｄ／
ＧＭ−ＣＳＦでもパルスした場合に、ＩＬ−１２の産生を増加した。樹状細胞に
よるＩＬ−６の産生もまた、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳに対するＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドの添加により増加したが、その効果は、ＩＬ−１２についてよりも低く示され
た。樹状細胞でのサイトカイン産生に対するＧＭ−ＣＳＦ単独の影響は、研究さ
れなかった。なぜならば、これらの細胞は、ＧＭ−ＣＳＦを使用して生成された
からである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドにより誘導された樹状細胞によるＩＬ−
１２の産生の明らかな増強は、少なくとも部分的にＴｈ１応答の増強を説明し得
る。
【０１５３】
（実施例８：ヒトＩＬ−１２分泌を誘導するホスホロチオエートリゴヌクレオ
チドの同定）
ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＩＬ−１２分泌を誘導する能力は、そのアジュバ
ントの潜在能力、特にＩＬ−１２に高度に依存するＴｈ１免疫応答を誘導するそ
の能力に関する良い指標である。それゆえ、一団のホスホロチオエートリゴヌク
レオチドが、インビトロでヒトＰＢＭＣからＩＬ−１２分泌を誘導する能力を試
験した（表１）。これらの実験は、いくつかのヒトＰＢＭＣにおいて、ほとんど
のＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＩＬ−１２の分泌を誘導し得ることを示した（
例えば、実験１）。しかし、他のドナーは、少数のＣｐＧオリゴヌクレオチドに
のみ応答した（例えば、実験２）。オリゴヌクレオチド２００６は、ほとんどの
被験体からＩＬ−１２分泌の一貫した誘導物質であった（表２）。
【０１５４】
【表２】
（実施例９：ＣｐＧおよびＧＭ−ＣＳＦは、ＤＣに対する同時刺激性分子を相
乗的に増加する）
（方法）
エンドトキシンの検出。ＬＰＳの活性を、リムルスアメーバ様細胞溶解産物（
ＬＡＬ）アッセイを使用してＦＤＡにより標準化する（ＥＵ／ｍｌ）。本発明者
らによるＬＡＬアッセイの検出下限は、０．０３ＥＵ／ｍｌであった（ＬＡＬ−
ａｓｓａｙ Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）
。本研究において使用したＬＰＳサンプル（ネズミチフス菌由来、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、４．３５ｎｇ／ＥＵ
の活性を有した。エンドトキシンは、オリゴヌクレオチドにおいて検出され得な
かった（＜０．０７５ＥＵ／ｍｇ）。
【０１５５】
（結果）
形態学およびＭＨＣ ＩＩの発現の基準によるＤＣの分化は、ＤＣによる特異
的な免疫応答の誘導については十分ではない。同時刺激性分子の発現によるＤＣ
の機能的な活性が必要である。本発明者らは、細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１
、ＣＤ５４）、ならびに同時刺激性表面分子Ｂ７−２（ＣＤ８６）およびＣＤ４
０の発現に対するＣｐＧの効果を試験した。最初、本発明者らは、ＤＣ（分化）
に対するＭＨＣ ＩＩの増強された発現が、ＣＤ５４発現のより反映された活性
化に関連するか否かに興味を持った。陽性の関連を見出し得ず、このことは、分
化が、ＤＣの活性化と必ずしも関連しないことを確認した（図８）。同時刺激性
分子ＣＤ５４（図９、パネルＡ）、ＣＤ８６（図９、パネルＢ）、およびＣＤ４
０（図９、パネルＣ）の発現は、生存可能なＤＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）によ
り、フローサイトメトリーにおいて定量した。全ての実験において、ＣｐＧは、
同時刺激性分子の発現の増強においてＧＭＣＳＦよりも優れていた。細胞のみの
サンプルと比較して、ＣｐＧオリゴヌクレオチド２００６は、ＣＤ５４（２５．
０＋−５．７対７．０＋−１．８；ｐ＝０．０２、ｎ＝５）、ＣＤ８６（３．９
＋−０．８対１．６＋−０．３；ｐ＝０．０１；ｎ＝５）およびＣＤ４０（３．
５＋−１．０対０．９＋−０．１；ｐ＝０．０４、ｎ＝４）の発現を増強した。
ＧＭＣＳＦおよび２００６の組み合わせは、ＣＤ５４（３８．５＋−７．９；ｐ
＝０．０３；ｎ＝５）に対して相加的な効果を示し、そしてＣＤ８６およびＣＤ
４０の発現を相乗的に増加した（ＣＤ８６：７．０＋−１．６；ｐ＝０．０１；
ｎ＝５；ＣＤ４０：８．５＋−１．０；ｐ＜０．０１；ｎ＝４）。
【０１５６】
特異性を２１１７（２００６のメチル化バージョン）および２０７８（２０８
０のＧｐＣバージョン）を使用して試験した。非ＣｐＧオリゴヌクレオチド２１
１７は、ＧＭＣＳＦと組み合わせた場合、ＣＤ４０発現の相乗的な増強を示さな
かった。
【０１５７】
【表１】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに十分であると考
えられる。本願中に引用される全ての参考文献、特許および特許公開は、その全
体が本明細書中に参考として援用される。
脚注：
1ＰＢＭＣを正常ドナーから採取し、そしてＦｉｃｏｌｌ上で遠心分離した。
次いで、ＰＢＭＣを、培養物に６μｇ／ｍｌで添加された、示したオリゴヌクレ
オチドを含むかまたは含まない９６ウェルマイクロタイタープレート中に１０6
細胞／ｍｌで培養した。方法において記載されたように、上清を２４時間で回収
し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＬ−１２レベルについて試験した。標準曲線を
、各実験において作成した。これは異なるドナーを表す。
（配列表）
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【表１−１０】
【表１−１１】
【表１−１２】
【表１−１３】
【表１−１４】
【表１−１５】
【表１−１６】
【表１−１７】
【表１−１８】
【表１−１９】
【表１−２０】
【表１−２１】
【表１−２２】
【表１−２３】
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、ＣｐＧ ＯＤＮおよび可溶性ＧＭ−ＣＳＦの組み合わせを用いた免疫後の抗Ｉｄ ＩｇＧの産生を示すグラフである。マウスは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ ＯＤＮまたはその両方を、水溶液中に混合した、単回の皮下用量として、５０μｇのＩｄ−ＫＬＨで免疫された。血液を毎週得て、そして血清をＥＬＩＳＡを用いて、抗Ｉｄ ＩｇＧの存在について見積もった。既知濃度のモノクローナル抗Ｉｄを追加した正常なマウス血清を標準として用いた。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図２】図２は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質およびＣｐＧ ＯＤＮの組み合わせを用いる免疫が抗原特異的ＩｇＧの産生を増強することを示すグラフである。マウスは、ＣｐＧ ＯＤＮとともに、またはＣｐＧ ＯＤＮなしで、単回の皮下用量として５０μｇのＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫された。血液を、毎週得て、そして血清をＥＬＩＳＡを用いて、抗Ｉｄ ＩｇＧの存在について見積もった。既知濃度のモノクローナル抗Ｉｄを追加した正常なマウス血清を標準として用いた。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図３】図３は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質およびＣｐＧ ＯＤＮの組み合わせを用いる反復した免疫を用いる免疫が、抗原特異的ＩｇＧの高いレベルを誘導することを示すグラフである。マウスは、０週および再度２週に、ＣｐＧ ＯＤＮとともに、またはＣｐＧ ＯＤＮなしで、皮下用量として５０μｇのＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦで免疫された。血液を、毎週得て、そして血清をＥＬＩＳＡを用いて、抗Ｉｄ ＩｇＧの存在について見積もった。既知濃度のモノクローナル抗Ｉｄを追加した正常なマウス血清を、標準として用いた。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図４】図４は、ＣｐＧ ＯＤＮがＩｇＧ2aアイソタイプの抗原特異的抗体の産生を増強することを示す棒グラフである。マウスを、Ｉｄ−ＫＬＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質およびＣｐＧ ＯＤＮの種々の組み合わせを用いて単回用量で免疫した。血清を、単回免疫の４週間後に得た。抗Ｉｄ ＩｇＧ1および抗Ｉｄ ＩｇＧ2aを、ＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの群に３匹のマウスを含んだ。
【図５】図５は、ＣｐＧ ＯＤＮが腫瘍増殖に対するＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ防御の防御的効果を増強することを示す生存曲線である。マウスを、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＣｐＧ ＯＤＮの単回注射を用いて免疫し、そして３日後に腫瘍にチャレンジした。生存を、１００日間追跡した。５１日後に生存したすべてのマウスは、全観察期間について腫瘍のないままであった。それぞれの群に２０匹のマウスを含んだ。
【図６】図６は、Ｉｄ／ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＣｐＧ ＯＤＮを用いた骨髄由来樹状細胞のパルシング後の、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＣｐＧ ＯＤＮが、Ｉｄ−ＫＬＨまたはＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦでパルスされた樹状細胞によるＩＬ−１２産生を増強することを例証する棒グラフである。骨髄由来樹状細胞を１８時間、ＣｐＧ ＯＤＮと共にまたはＣｐＧ ＯＤＮなしで抗原でパルスし、そしてＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡにより決定した。ＣｐＧ ＯＤＮは、樹状細胞（特にＩｄ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質でパルスした樹状細胞）によるＩＬ−１２の産生を顕著に増強した。
【図８】図８は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧに応答する樹状細胞のＩＣＡＭ−１発現およびＭＨＣ ＩＩ発現を実証するＦＡＣＳチャートを示す。前駆樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）および２００６（ＣｐＧホスホロチオエート；６μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間インキュベートした。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＭＨＣＩＩの発現を、フローサイトメトリー（２５００の生存可能細胞がそれぞれのサンプルにおいて計数される）で試験した。
【図９】図９は、ＣｐＧによる樹状細胞上での同時刺激分子発現の誘導を示すいくつかのグラフである。樹状前駆細胞を、示されるようにＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびオリゴヌクレオチド（２００６：ＣｐＧホスホロチオエート；６μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間インキュベートした。ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の発現（パネルＡ）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）の発現（パネルＢ）およびＣＤ４０の発現（パネルＣ）を、フローサイトメトリー（ＭＦＩ，平均蛍光強度）により定量した。ＧＭ−ＣＳＦおよび２００６の組み合わせは、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現増加について相乗作用を示すが、一方、ＣＤ５４への効果は相加的であった。結果は、５つの独立した実験（ＣＤ５４およびＣＤ８６）ならびに４実験（ＣＤ４０）の平均を示す。サンプルのみの細胞と比較した増加の統計的有意性は、*（ｐ＜０．０５）により示される。統計的評価は、対応のないｔ検定により実行され、誤差帯はＳＥＭを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２１４３５７（Ｐ２００８−２１４３５７Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１３２３５（Ｐ２００８−１１３２３５）
【出願日】平成２０年４月２３日（２００８．４．２３）
【分割の表示】特願２０００−５４２０３０（Ｐ２０００−５４２０３０）の分割
【原出願日】平成１１年４月２日（１９９９．４．２）
【出願人】（３９９０３６４９７）ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２３日（２００８．４．２３）
【分割の表示】特願２０００−５４２０３０（Ｐ２０００−５４２０３０）の分割
【原出願日】平成１１年４月２日（１９９９．４．２）
【出願人】（３９９０３６４９７）ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション (2)
【Ｆターム（参考）】
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