免疫細胞活性化を調節する作用剤およびその使用方法
【課題】免疫応答を調節する作用剤を同定する方法
【解決手段】Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する方法。該方法は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＢ７ポリペプチドをもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤と接触させることを含む。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドポリペプチドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを妨げ、したがって、阻害免疫シグナルの伝達を阻害する。ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を阻止することができる。ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供して、シグナル伝達阻害を強化する。
【解決手段】Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する方法。該方法は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＢ７ポリペプチドをもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤と接触させることを含む。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドポリペプチドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを妨げ、したがって、阻害免疫シグナルの伝達を阻害する。ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を阻止することができる。ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供して、シグナル伝達阻害を強化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府財源）
【０００２】
本明細書に開示される発明は、国立衛生研究所により授与されたAI39671、CA84500およびAI41584下にサポートされた。合衆国政府は、それゆえ、本発明の所定の権利を有し得る。
（関連出願）
【０００３】
本発明は、2001年11月13日に提出されたU.S.S.N.60/337,817について優先権を主張する。この出願は、本明細書中に、その全体が引用により組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞が外来ポリペプチドに応答するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により休止Ｔリンパ球に２つのシグナルが提供されなくてはならない（Jenkins, M.およびSchwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller, D.L.ら(1990) J. Immunol. 144:3701-3709）。最初のシグナルは、免疫応答に特異性を付与するものであり、主要組織適合抗原系において提示された外来抗原の認識後にＴ細胞受容体を介して伝達される。次のシグナルは、共刺激と呼ばれるものであり、Ｔ細胞が増殖し、機能的となることを誘導する（Lenschowら(1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233）。共刺激は、抗原特異的でもなく、ＭＨＣにより制限されず、ＡＰＣｓにより発現される１またはそれ以上の異なる表面ポリペプチドにより提供されると考えられている（Jenkins, M.K.ら(1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P.S.ら(1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C.D.ら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; Young, J.W.ら(1992) J. Clin. Invest. 90:229-237; Koulova, L.ら(1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Reiser, H.ら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:271-275; van-Seventer, G.A.ら(1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle, J.M.ら(1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M.I.ら(1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R.J.ら(1992) Nature 357:80-82; Liu, Y.ら(1992) J. Exp. Med. 175:437-445）。
【０００５】
ＡＰＣｓ上に発現されるＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）タンパク質は、重要な共刺激ポリペプチドである（Freemanら(1991) J. Exp. Med. 174:625; Freemanら(1989) J. Immunol. 143:2714; Azumaら(1993) Nature 366:76; Freemanら(1993) Science 262:909）。Ｂ７−２は、一次免疫応答において主な役割を果たしていると思われ、Ｂ７−１は、免疫応答の後期にアップレギュレーションされるものであり、一次Ｔ細胞応答の延長あるいは二次Ｔ細胞応答の共刺激に重要である可能性がある（Bluestone (1995) Immunity 2:555）。
【０００６】
Ｂ７−１およびＢ７−２が結合する１つのリガンドであるＣＤ２８は、休止Ｔ細胞上に構成的に発現され、活性化後の発現において増加する。Ｔ細胞受容体を介するシグナリング後、ＣＤ２８と同時シグナルの伝達との連結により、Ｔ細胞の増殖およびＩＬ−２分泌が誘導される（Linsley, P.S.ら(1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C.D.ら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; June, C.H.ら(1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F.A.ら(1992) Nature 356:607-609）。ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と呼ばれる第２のリガンドは、ＣＤ２８と相同的であるが、休止Ｔ細胞上には発現されず、Ｔ細胞活性化後に出現する（Brunet, J.F.ら(1987) Nature 328:267-270）。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞応答の負の調節に重要であると思われている（Waterhouseら(1995) Science 270:985）。ＣＴＬＡ４のブロックは、阻害シグナルを除去することがわかっているが、ＣＴＬＡ４の凝集は、Ｔ細胞応答をダウンレギュレーションする阻害シグナルを提供することがわかっている（Allison and Krummel (1995) Science 270:932）。Ｂ７分子は、ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ４に対して高いアフィニティーを有し（Linsley, P.S.ら(1991) J. Exp. Med. 174:561-569）、Ｂ７−１およびＢ７−２は、ＣＴＬＡ４分子の異なる領域に結合し、ＣＴＬＡ４への結合に関して異なるキネティクスを有することがわかっている（Linsleyら(1994) Immunity 1:793）。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に関連している新たな分子ＩＣＯＳが、そのリガンドを有するものとして同定されており（Hutloffら(1999) Nature 397:263; WO 98/38216）、ＩＣＯＳは、Ｂ７ファミリーの新たなメンバーである（Aicher A.ら(2000) J. Immunol. 164:4689-96; Mages H.W.ら(2000) Eur. J. Immunol. 30:1040-7; Brodie D.ら(2000) Curr. Biol. 10:333-6; Ling V.ら(2000) J. Immunol. 164:1653-7; Yoshinaga S.K.ら(1999) Nature 402:827-32）。Ｔ細胞が、さらなる共刺激シグナルを受け取ることなくＴ細胞受容体を介して刺激されるだけならば、それらは、無応答性で、アネルギー性となり、あるいは死滅して免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こすようになる。
【０００７】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性は、インビトロといくつかのインビボモデルシステムにおいて証明されている。この共刺激経路をブロックすると、マウスおよびヒト系において抗原特異的な寛容が発生する（Harding,F.A.ら(1992)Nature356:607-609;Lenschow,D.J.ら(1992)Science257:789-792;Turka,L.A.ら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11102-11105;Gimmi,C.D.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6586-6590;Boussiotis,V.ら(1993)J.Exp.Med.178:1753-1763)。反対に、Ｂ７ネガティブなマウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶および腫瘍攻撃に対する長期間持続する防御を伴うＴ細胞により媒介される特異的免疫を誘導する(Chen,L.ら(1992)Cell71:1093-1102;Townsend,S.E.およびAllison,J.P.(1993)Science259:368-370;Baskar,S.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci90:5687-5690)。
【０００８】
共刺激ポリペプチドに結合する阻害受容体も免疫細胞上において同定されている。たとえば、ＣＴＬＡ４の活性化は、Ｔ細胞に負のシグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４を用いることは、ＩＬ−２産生を阻害し、細胞周期停止を誘導することができる（KrummelおよびAllison (1996) J. Exp. Med. 183:2533）。さらに、ＣＴＬＡ４欠損マウスは、リンパ球増殖性の疾病を発症する（Tivolら(1995) Immunity 3:541; Waterhouseら(1995) Science 270:985）。抗体でのＣＴＬＡ４のブロックは、阻害シグナルを除去する可能性があり、抗体とのＣＴＬＡ４の凝集は、阻害シグナルを伝達する。それゆえ、共刺激ポリペプチドが結合する受容体に応じて（すなわち、ＣＤ２８などの共刺激受容体またはＣＴＬＡ４などの阻害受容体）、Ｂ７−４を包含するＢ７ポリペプチドは、Ｔ細胞共刺激または阻害を促進することができる。
【０００９】
ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する受容体として同定されている。ＰＤ−１は、免疫グロブリン遺伝スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１（Ishidaら(1992) EMBO J. 11:3887; Shinoharaら(1994) Genomics 23:704; U.S. Patent 5,698,520）は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメインを含む細胞外領域、ならびに免疫受容体チロシンキナーゼに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域を有している（Ishidaら(1992) supra; Shinoharaら(1994) supra; US Patent 5,698,520）。これらの特徴は、免疫阻害受容体と呼ばれるポリペプチドのより大きなファミリーも定義し、該ファミリーは、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂおよびキラー阻害受容体（ＫＩＲｓ）をも包含する（Vivier and Daeron (1997) Immunology Today 18:286）。これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフが、阻害シグナルを誘導するＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼと相互作用すると仮定されることが多い。これらの免疫阻害受容体の一部のものは、ＭＨＣポリペプチド、たとえばＫＩＲｓに結合し、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７−１およびＢ７−２に結合する。ＭＨＣとＢ７遺伝子との間に系統発生的関連性があると提案されている（Henryら(1999) Immunology Today 20:285-8）。
【００１０】
ＰＤ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ishidaら(1992) EMBO J. 11:3887; Shinoharaら(1994) Genomics 23:704; およびU.S. Patent 5,698,520にて公開されている。ＰＤ−１は、以前、アポトーシス性細胞死に関与するタンパク質に対する選択のためのアプローチに基づく引き算クローニングを用いて同定された。本明細書において、ＰＤ−１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのポリペプチドのメンバーとして同定される。ＣＴＬＡ４のように、ＰＤ−１は、抗ＣＤ３に応答して、Ｔ細胞の表面において迅速に誘発される(Agataら(1996) Int. Immunol. 8:765)。しかし、ＣＴＬＡ４とは逆に、ＰＤ−１は、Ｂ細胞の表面においても誘発される(抗ＩｇＭに応答して)。ＰＤ−１は、一部の胸腺細胞および骨髄細胞においても発現する(Agataら(1996) 前記; Nishimuraら(1996) Int. Immunol. 8:773)。
【００１１】
２つのタイプのヒトＰＤ−１リガンドポリペプチドが同定されている。ＰＤ−１リガンドタンパク質は、シグナル配列、およびＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、膜貫通ドメインならびに短い細胞質尾部を含む。ＰＤ−Ｌ１(配列データについては、Freemanら(2000) J. Exp. Med. 192:1027を参照)およびＰＤ−Ｌ２(配列データについては、 Latchmanら(2001) Nat. Immunol. 2:261を参照)の両方は、Ｂ７ファミリーのポリペプチドのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺および心臓で発現する。ＰＤ−Ｌ２のみが、膵臓、肺および肝臓で発現し、一方、ＰＤ−Ｌ１のみが胎児肝臓で発現する。両方のＰＤ−１リガンドが、活性化された単球および樹状細胞においてアップレギュレートされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合するという事実から、ＰＤ−１がＣＴＬＡ４をもつ阻害受容体のファミリーに置かれる。共刺激受容体を用いることにより、免疫細胞において共刺激シグナルがもたらされるが、たとえば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１などの阻害受容体を用いることにより（架橋または凝集によるなど）、免疫細胞において阻害シグナルの伝達が行われ、免疫細胞応答の下方調節（downmodulation）および／または免疫細胞アネルギーがもたらされる。阻害シグナルの伝達は、免疫細胞応答における下方調節を導く（そして、すべての免疫応答における下方調節がもたらされる）が、免疫細胞における阻害シグナルの阻止（ＰＤ−１に対する非活性化抗体の使用によるなど）は、免疫細胞応答の上方調節を導く（そして、免疫応答の上方調節がもたらされる）。免疫応答の調節に有用なさらなる作用剤の同定は、おおいなる利点となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、少なくとも一部は、ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−１を結合することに加えて、Ｂ７−１に結合するという発見に基づく。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ４と同様に負のシグナルを免疫細胞に伝達する。ＰＤ−１リガンドポリペプチドは、抗原提示細胞の表面上に発現され、共刺激シグナルを免疫細胞に提供するか、またはこれらが結合するポリペプチドに応じて、免疫細胞に下方調節シグナルを伝達することができる。たとえば、ＰＤ−１に結合するＰＤ−１リガンドは、負のシグナルを伝達するが、Ｂ７ポリペプチドに結合するＰＤ−１リガンドは、伝達しない。したがって、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節の結果、免疫応答が調節される。
【００１４】
したがって、本発明の１つの態様は、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する方法に関する。該方法は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＢ７ポリペプチドをもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤と接触させることを含む。１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドポリペプチドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを妨げ、したがって、阻害免疫シグナルの伝達を阻害する。１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を阻止することができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供して、シグナル伝達阻害を強化する。
【００１５】
Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、ＰＤ−Ｌ１は、阻害受容体ＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合も低下させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４に結合するのを可能にして、免疫細胞に阻害シグナルを提供し、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合を促進する作用剤は、ＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合を阻害し、したがって、負のシグナルを阻害する。
【００１６】
１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、ＰＤ−１リガンドは、共刺激受容体ＣＤ２８へのＢ７ポリペプチドの結合も低下させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８に結合するのを可能にして、免疫細胞に共刺激シグナルを提供し、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合を促進する作用剤は、ＣＤ２８へのＢ７ポリペプチドの結合を阻害し、したがって、共刺激シグナルを阻害する。
【００１７】
したがって、本発明の１つの態様は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＢ７ポリペプチドをもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節(阻害または刺激)する作用剤と接触させることによって、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節(阻害または刺激)することを含む、免疫応答を調節(阻害または刺激)する方法に関する。
１つの態様において、作用剤は、抗ＰＤ−１リガンド抗体である。
１つの態様において、作用剤は、抗Ｂ７―１抗体である。
１つの態様において、作用剤は、小分子である。
１つの態様において、作用剤は、ペプチドである。
１つの態様において、作用剤は、融合タンパク質である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＰＤ−１をもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻害する作用剤と接触させることによって、免疫応答を調節することを含む、免疫応答を調節する方法に関する。
１つの態様において、作用剤は、抗ＰＤ−１リガンド抗体、抗ＰＤ−１抗体、ペプチドまたは小分子であり、ここで、作用剤は、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害しない。
１つの態様において、ＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ１である。
１つの態様において、ＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ２である。
１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドは、Ｂ７−１である。
【００１９】
本発明の別の態様は、第１または第２免疫細胞をＰＤ−１リガンドと接触させることによって免疫応答を調節することを含む、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドと第２免疫細胞上のＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、Ｂ７ポリペプチドをもつ免疫細胞またはＣＴＬＡ４ポリペプチドをもつ免疫細胞を、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４ポリペプチドの間の相互作用を阻害するが、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害しない作用剤と接触させることによって、免疫応答を調節することを含む、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、第１または第２免疫細胞をＰＤ−１リガンドと接触させることによって免疫応答を調節することを含む、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドと第２免疫細胞上のＣＤ２８の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、Ｂ７ポリペプチドをもつ免疫細胞またはＣＤ２８をもつ免疫細胞を、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８の間の相互作用を阻害するが、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害しない作用剤と接触させることによって、免疫応答を調節することを含む、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤をスクリーニングし、スクリーニングにおいて同定された作用剤がＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定することを含む、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法に関する［ここで、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用に影響を及ぼさない(たとえば、阻害しない)ことが決定される、スクリーニングにおいて同定される作用剤は、免疫応答を調節する作用剤として同定される］。
【００２４】
本発明の別の態様は、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害する作用剤をスクリーニングし、スクリーニングにおいて同定された作用剤がＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定することを含む、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法に関する［ここで、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用に影響を及ぼさない(たとえば、阻害しない)ことが決定されるが、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害しない、スクリーニングにおいて同定される作用剤は、免疫応答を調節する作用剤として同定される］。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤をスクリーニングし、スクリーニングにおいて同定された作用剤がＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定することを含む、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法に関する［ここで、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用に影響を及ぼさない(たとえば、阻害しない)ことが決定される、スクリーニングにおいて同定される作用剤は、免疫応答を調節する作用剤として同定される］。
【００２６】
（発明の詳細な記載）
Ｉ．定義
本明細書で用いる用語「調節する」は、たとえば、応答を増強または阻害するといったようなアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを包含する。
本明細書で用いる用語「阻害する」は、特定の作用、機能または相互作用などの減少、制限または封鎖を包含する。
本明細書で用いる用語「免疫細胞」は、免疫応答において役割を演じる細胞を意味する。免疫細胞は、造血起源のものであり、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄細胞を包含する。
本明細書で用いる用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を包含する。用語「Ｔ細胞」はさらに、ヘルパーＴ細胞１タイプおよびヘルパーＴ細胞２タイプの両方を包含する。用語「抗原提示細胞」は、プロフェッショナル抗原提示細胞（たとえば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（たとえば、ケラチン生成細胞、内皮細胞、星状細胞、繊維芽細胞、乏突起膠細胞）を包含する。
【００２７】
本明細書で用いる用語「免疫応答」は、Ｔ細胞共刺激の調節により影響を受けるＴ細胞性および／またはＢ細胞性免疫応答を包含する。免疫応答の例は、Ｔ細胞応答、たとえば、サイトカイン産生および細胞毒性を包含する。加えて、免疫応答は、抗体産生（液性応答）などのＴ細胞活性化およびマクロファージの活性化などのサイトカイン反応性細胞の活性化により間接的に影響を受ける免疫応答を包含する。
【００２８】
本明細書で用いる用語「共刺激受容体」は、免疫細胞に共刺激シグナルを伝達する受容体、たとえばＣＤ２８を包含する。本明細書で用いる用語「阻害受容体」は、負のシグナルを免疫細胞に伝達する受容体（たとえば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）を包含する。阻害受容体により変換される阻害シグナルは、共刺激受容体（たとえばＣＤ２８）が免疫細胞上に存在しなくても、したがって阻害受容体と共刺激受容体の間の共刺激ポリペプチドの結合に関する競合の関係でなくとも生じ得る(Fallarinoら(1998)J.Exp.Med.188:205)。阻害シグナルの免疫細胞への伝達は、免疫細胞における不応答性またはアネルギーまたはプログラムされた死をもたらし得る。好ましくは、阻害シグナルの伝達は、アポトーシスに関与しないメカニズムにより作動する。本明細書で用いる用語「アポトーシス」は、当業界において公知の技術を用いて特徴づけることができるプログラムされた細胞死を包含する。アポトーシス細胞死は、たとえば、細胞収縮、膜水疱および細胞断片化において最高に達しているクロマチン凝縮により特徴づけることができる。アポトーシスを受ける細胞は、ヌクレオソーム間ＤＮＡ開裂の特徴的なパターンも示す。
【００２９】
受容体と結合するＰＤ−１リガンドポリペプチドの形態に応じて、たとえば受容体への結合について活性化型のＰＤ−１リガンドポリペプチドと競合することによって、シグナルが伝達され得るか（たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドの多価型または受容体の架橋をもたらすＦｃ受容体に結合するＰＤ−１リガンドポリペプチドの形態）、またはシグナルが阻害され得るか（たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドの可溶性多価型またはＦｃ受容体を欠失しているＰＤ−１リガンドポリペプチドの形態により）のいずれかである。しかしながら、可溶性ポリペプチドが刺激性であり得る例もある。調節作用剤の効果は、本明細書に記載するような慣例的なスクリーニングアッセイを用いて容易に証明することができる。
【００３０】
本明細書で用いる用語、活性化された免疫細胞に関する「共刺激」は、共刺激ポリペプチドが、増殖またはエフェクター機能を誘発する第二の非活性化受容体性シグナル（「共刺激シグナル」）を提供する能力を包含する。たとえば、共刺激シグナルの結果として、サイトカインがたとえばＴ細胞受容体性シグナルを受容したＴ細胞において分泌され得る。細胞−受容体性シグナルを、たとえば活性化受容体を介して、受容した免疫細胞は、本明細書において「活性化免疫細胞」と称する。
【００３１】
本明細書で用いる用語「活性化受容体」は、抗原、複合化抗原（たとえばＭＨＣポリペプチドに関連して）を結合するか、または抗体と結合する免疫細胞受容体を包含する。かかる活性化受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体、およびＦｃ受容体を包含する。
Ｔ細胞受容体はＴ細胞上に存在し、ＣＤ３ポリペプチドと関連する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣポリペプチドに関連する抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）刺激される。ＴＣＲを介したＴ細胞活性化の結果、タンパク質リン酸化、膜脂質変化、イオン流入、環状ヌクレオチド変化、ＲＮＡ転写変化、タンパク質合成変化および細胞体積変化などの種々の変化が生じる。
【００３２】
Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞上に存在する。Ｂ細胞抗原受容体は膜Ｉｇ（ｍＩｇ）と他の膜貫通ポリペプチド（たとえば、ＩｇαおよびＩｇβ）間の複合体である。ｍＩｇのシグナルトランスダクション機能は、オリゴマーまたはマルチマー抗原による受容体ポリペプチドの架橋により引き起こされる。Ｂ細胞は、抗免疫グロブリン抗体によっても活性化されうる。ＢＣＲ活性化により、Ｂ細胞においてチロシンリン酸化を含む多くの変化が起こる。
Ｆｃ受容体は、免疫応答に関与する多くの細胞上で見いだされる。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は免疫グロブリンポリペプチド（Ｉｇ）のＦｃ部分の細胞表面受容体である。現在のところ同定されているヒトＦｃＲには、ＩｇＧ（ＦｃγＲと称する）、ＩｇＥ（ＦｃεＲ１）、ＩｇＡ（Ｆｃα）、および重合ＩｇＭ／Ａ（ＦｃμαＲ）を認識するものが含まれる。ＦｃＲは次の細胞タイプにおいて見いだされる：ＦｃεＲＩ（肥満細胞）、ＦｃεＲ．ＩＩ（多くのリンパ球）、ＦｃαＲ（好中球）、およびＦｃμαＲ（腺上皮、肝細胞）(Hogg,N.(1988)Immunol.Today9:185-86)。広く研究されているＦｃγＲは細胞性免疫防御の中心であり、炎症のメディエーターおよび自己免疫疾患の発生機序に関与する加水分解酵素の放出の刺激の原因である(Unkeless,J.C.ら(1988)Annu.Rev.Immunol.6:251-81)。マクロファージ／単球、多形核白血球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃγＲはＩｇＧにより媒介される特異的認識の要素を賦与するので、ＦｃγＲはエフェクター細胞とＩｇを放出するリンパ球間の非常に重要な結合を提供する。ヒト白血球はＩｇＧ：ｈＦｃγＲＩ（単球／マクロファージ上に見いだされる）、ｈＦｃγＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、おそらくはＢ細胞、およびＫ５６２細胞系上）、およびＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージ上）の少なくとも３つの異なる受容体を有する。
【００３３】
Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞に対する共刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡにより阻害されないシグナリング経路を含む。加えて、共刺激シグナルはＴ細胞においてサイトカイン分泌（たとえば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１０）および／または抗原に対する不応答性の誘発、アネルギーの誘発、Ｔ細胞における細胞死の誘発を防止することができる。
【００３４】
本明細書で用いる用語「阻害シグナル」は、免疫細胞上のポリペプチドについて阻害受容体（たとえばＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）により伝達されるシグナルを意味する。かかるシグナルは、活性化受容体（たとえば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃポリペプチドによる）を介するシグナルを拮抗し、その結果、たとえば第二のメッセンジャー生成の阻害；増殖の阻害；免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、たとえば食作用の低下、抗体産生の低下、細胞毒性の低下、免疫細胞がメディエーター（たとえば、サイトカイン（たとえばＩＬ−２）および／またはアレルギー反応のメディエーター）を産生できないこと；またはアネルギーの発生が起こる。
【００３５】
本明細書で用いる用語「不応答性」は、刺激、たとえば活性化受容体またはサイトカインによる刺激に対する免疫細胞の不応性を包含する。不応答性はたとえば、免疫抑制剤への暴露または高用量の抗原への暴露のために起こり得る。本明細書で用いる用語「アネルギー」または「寛容」は、活性化受容体媒介性刺激に対する不応性を包含する。かかる不応性は、一般に抗原特異的であり、寛容化している抗原への暴露が終わった後にも存続する。たとえば、Ｔ細胞におけるアネルギー（不応答性に対して）はサイトカイン、たとえばＩＬ−２がないことにより特徴づけられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に暴露され、第二シグナル（共刺激シグナル）の不在下で第一シグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３媒介性シグナル）を受容する場合に起こる。これらの条件下で、細胞を同じ抗原に再暴露すると（暴露が共刺激ポリペプチドの存在下で起こる場合でも）、結果としてサイトカインが産生されず、したがって増殖しない。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、関連しない抗原に対する応答を起こし、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−２）とともに培養するならば増殖し得る。たとえば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡにより測定されるようなＴリンパ球によるＩＬ−２産生がないこと、あるいはインジケーター細胞系を用いる増殖分析によりを観察できる。別法として、レポーター遺伝子構築物を用いることができる。たとえば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下でヘテロローガスなプロモーターによるか、またはエンハンサー内に見いだすことができるＡＰ１配列のマルチマーにより誘発されるＩＬ−２遺伝子転写を開始しない(Kangら、(1992)Science257:1134)。
【００３６】
ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドは、ある種の保存された構造的および機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーを含む。同様に、ＰＤ−１タンパク質は、保存された構造的および機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーのメンバーである。「ファミリー」は、タンパク質または核酸分子についていう場合、共通の構造的ドメインまたはモチーフを有し、本明細書において定義するような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する２以上のタンパク質または核酸分子を意味することを意図される。このようなファミリーメンバーは、天然に存在するかまたは天然に存在せず、同じまたは異なる種のいずれかから得ることができる。たとえば、ファミリーはヒト起源の第一のタンパク質、ならびに他のヒト起源の異なるタンパク質を含むことができるか、あるいは別に、ヒト以外の起源の相同物を含むことができる。ファミリーのメンバーはさらに共通の機能的特徴を有し得る。本明細書において記載するＰＤ−１リガンドポリペプチドはポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである。本明細書で用いる用語「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７ポリペプチド」は、Ｂ７ポリペプチド、たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ｈ(Swallowら(1999)Immunity11:423)、および／またはＰＤ−１リガンド(たとえば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２)と配列相同性を共有する共刺激ポリペプチドを含む。たとえば、デフォルトのパラメータを用いてNCBIのBLASTプログラム（ギャップペナルティーが存在１１および拡張１に設定されたBlosurm６２マトリックス（NCBIウェブサイトを参照））を用いて比較した場合に、ヒトＢ７−１およびＢ７−２は約２６％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３７】
好ましいＢ７ポリペプチドは、免疫細胞に共刺激または阻害シグナルを提供でき、これにより免疫細胞応答を促進または阻害できる。たとえば、共刺激受容体と結合するＢ７ファミリーメンバーは、Ｔ細胞活性化を増加させるが、阻害受容体と結合するＢ７ファミリーメンバーは、共刺激を減少させる。さらに、同じＢ７ファミリーメンバーは、Ｔ細胞共刺激を増加または減少させる。たとえば、共刺激受容体に結合する場合、ＰＤ−１リガンドは、免疫細胞の共刺激を誘発するか、またはたとえば溶解型において存在する場合に免疫細胞共刺激を阻害することができる。阻害受容体と結合する場合、ＰＤ−１リガンドポリペプチドは阻害シグナルを免疫細胞に伝達することができる。好ましいＢ７ファミリーのメンバーには、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ｈ、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２およびその可溶性フラグメントもしくは誘導体が含まれる。１つの態様において、Ｂ７ファミリーメンバーは、たとえば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１および／または他の受容体などの免疫細胞上の１つ以上の受容体に結合し、受容体に応じて、免疫細胞、好ましくはＴ細胞に阻害シグナルまたは共刺激シグナルを伝達する能力を有する。
【００３８】
ＰＤ−１ポリペプチドは、免疫細胞に阻害シグナルを伝達することによって、免疫細胞エフェクター機能を阻害する能力をもつか、またはたとえば、可溶性モノマー型で存在する場合に、免疫細胞の共刺激を促進する(たとえば、競合的阻害によって)能力をもつ阻害受容体である。好ましいＰＤ−１ファミリーメンバーは、ＰＤ−１と配列同一性を共有し、たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＰＤ−１リガンドおよび／または抗原提示細胞上の他のポリペプチドなどの１つ以上のＢ７ファミリーメンバーに結合する。
【００３９】
本明細書で用いるたとえば、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドなどのポリペプチドに関する用語「活性」は、このタンパク質の構造に固有の活性を包含する。ＰＤ−１リガンドに関して、用語「活性」は、免疫細胞共刺激を調節する能力（たとえば活性化免疫細胞において共刺激シグナルを調節することにより）、または免疫細胞における阻害シグナルを調節する能力（たとえば免疫細胞上のナチュラル受容体を用いることにより）を包含する。当業者であれば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドの活性化型が、共刺激受容体に結合する場合、免疫細胞内に共刺激シグナルが生成することを理解するであろう。ＰＤ−１リガンドポリペプチドの活性化型が、阻害受容体に結合する場合、免疫細胞内に阻害シグナルが生成する。ＰＤ−１リガンドがＢ７ポリペプチドに結合する場合、ＰＤ−１に結合しているＰＤ−１リガンドの阻害シグナルが阻害されるので、共刺激シグナルが生成する。
【００４０】
本明細書で用いる用語「ＰＤ−１リガンド」は、ＰＤ−Ｌ１(Freemanら(2000) J. Exp. Med. 192:1027)およびＰＤ−Ｌ２(Latchmanら(2001) Nat. Immunol. 2:261)の両方を包含する。
共刺激シグナルを調節すると、免疫細胞のエフェクター機能が調節される。したがって、「ＰＤ−１リガンド活性」なる用語は、ＰＤ−１リガンドポリペプチドがその天然の受容体（たとえば、ＰＤ−１またはＢ７−１など）と結合する能力、免疫細胞共刺激または阻害シグナルを調節する能力および免疫細胞応答を調節する能力を包含する。
【００４１】
ＰＤ−１に関して、用語「活性」は、ＰＤ−１ポリペプチドが、活性化免疫細胞において、たとえば抗原提示細胞上の天然のＰＤ−１リガンドを用いることにより阻害シグナルを調節する能力を包含する。ＰＤ−１は阻害シグナルをＣＴＬＡ４と同様の方法で免疫細胞に伝達する。免疫細胞において阻害シグナルを調節すると、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌が調節される。したがって、用語「ＰＤ−１活性」は、ＰＤ−１ポリペプチドがその天然のリガンドと結合する能力、免疫細胞共刺激または阻害シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力を包含する。
【００４２】
本明細書で用いる用語「相互作用」は、２つの分子間の相互作用を言う場合、１つの分子と他方の分子との物理的接触（たとえば、結合）を意味する。一般に、このような相互作用の結果として、その分子の一方または両方の活性（生物的効果を酸性する）が得られる。活性は、一方または両方の分子の直接的な活性である（たとえば、シグナルトランスダクション）。それとは別に、相互作用における一方または両方の分子をそれらのリガンドとの結合から阻止することができ、したがって、リガンド結合活性に関して不活性であることを保つことができる（たとえば、そのリガンドを結合し、共刺激を引き起こすか阻害する）。このような相互作用を阻害する結果として、一方または両方の分子の活性が破壊される。このような相互作用を増強することとは、物理的接触の可能性を延長または増強すること、あるいは活性の可能性を延長または増強することである。
【００４３】
本明細書で用いる「天然に存在する」核酸ポリペプチドは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（たとえば、天然のタンパク質をコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分ポリペプチドを意味する。
本明細書で用いる「アンチセンス」核酸ポリペプチドは、タンパク質をコードする「センス」核酸配列と相補性、たとえば二本鎖ｃＤＮＡポリペプチドのコーティング鎖と相補性、ｍＲＮＡ配列と相補性、または遺伝子のコーティング鎖と相補性であるヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸ポリペプチドは、センス核酸ポリペプチドと水素結合できる。
【００４４】
本明細書で用いる用語「コーティング領域」とは、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味し、一方、用語「非コーディング領域」は、アミノ酸中に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（たとえば、５’および３’非翻訳領域）を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる用語「ベクター」は、これが結合しているもう１つの核酸を輸送できる核酸を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これはその中に別のＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう１つ別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここにおいては別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートできる。ある種のベクターはこれらが導入される宿主細胞において自己複製できる（たとえば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中へ導入されると宿主細胞のベクター中に組み入れられ、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは操作可能に結合される遺伝子の発現を行うことができる。さらに、かかるベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明はかかる他の発現ベクターの形態、たとえばウイルスベクター（たとえば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含し、これらは同等の機能を果たす。
【００４６】
本明細書で用いる用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターなどの本発明の核酸がその中に導入されている細胞を意味する。「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。かかる用語は特定の対象細胞のみでなく、かかる細胞の子孫または可能性のある子孫も意味すると理解されるべきである。ある種の修飾が突然変異または環境的影響のために次の世代において起こり得るので、かかる子孫は実際には親細胞と同一でないが、それでも本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。
本明細書で用いる用語「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるかあるいは組換えＤＮＡ技術により産生される場合は、他のタンパク質、細胞物質および培地、あるいは化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないタンパク質を意味する。「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なタンパク質それ自体は、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織源から得られる細胞物質または他の汚染タンパク質が実質的にないか、または化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。「細胞物質が実質的にない」なる用語には、タンパク質が、それが単離または組換え産生される細胞の細胞成分から分離される、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドの調製物が含まれる。１つの態様において、「細胞物質が実質的にない」とは、約３０％（乾燥重量）未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質（「汚染されているタンパク質」ともいう）、さらに好ましくは約２０％未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質、最も好ましくは約５％未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質を有する非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質の調製物を包含する。抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質もしくはその生物学的に活性なタンパク質が組換え的に産生される場合、これは好ましくは実質的に培地がない、すなわち、培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満であり、さらに好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００４７】
「化学前駆体または他の化学物質が実質的にない」なる表現は、タンパク質が、該タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を包含する。１つの態様において、「化学前駆体または他の化学物質が実質的にない」なる表現は、約３０％（乾燥重量）未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を包含する。
【００４８】
本明細書において用いる用語「抗体」は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も包含する。本明細書で用いる「抗原結合部分」は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを意味する（たとえば、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド）。抗体の抗原結合機能は完全長抗体により実施され得ることが証明されている。抗体の「抗原結合タンパク質」なる用語に含まれる結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合された２のＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；抗体の１つの腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Wardら(1989)Nature341:544-546)；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、これらは組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価ポリペプチド（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とも呼ばれる；たとえば、Birdら(1988)Science242:423-426;およびHustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;およびOsbournら(1998)Natl.Biotechnol.16:778)を形成する１つのタンパク質鎖として調製することができる合成リンカーにより結合できる。このような一本鎖抗体はさらに抗体の「抗体結合部分」なる用語に含まれることを意図される。完全ＩｇＧポリペプチドまたは他のイソタイプをコードする発現ベクターを生じるために、特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列はヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列と結合できる。ＶＨおよびＶ１は、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いてＦａｂ、Ｆｖまたは免疫グロブリンの他のフラグメントの生成において用いることができる。一本鎖抗体の他の形態、たとえば、二重特異性抗体（diabody)も含まれる。二重特異性抗体は、二価、二重特異性抗体であり、ここにおいてＶＨおよびＶＬドメインは一本鎖ポリペプチド上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短すぎ、そのために該ドメインは別の鎖の相補性ドメインと対になり、２つの抗原結合部位を形成する(たとえば、Holliger,P.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.ら(1994)Structure2:1121-1123参照)。
【００４９】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成される、より大きな免疫グロブリン分子の一部である。かかる免疫接着(immunoadhesion)ポリペプチドの例は、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作るためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.ら(1995)Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)および二価およびビオチニル化ｓｃＦｖポリペプチドを作るためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.Mら(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。抗体部分、たとえば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、慣例の技術、たとえば、それぞれ完全抗体のパパインまたはペプシン消化を用いて、完全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載するような標準的組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００５０】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル；外因性、同種異系または同系；あるいはその修飾された形態、たとえばヒト化、キメラなどであってもよい。抗体は、完全にヒトであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドと特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫応答できる抗原結合部位の１種のみを含む抗体ポリペプチドの集団を意味し、一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用できる抗原結合部位の複数腫を含む抗体ポリペプチドの集団を意味する。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫応答する特定の抗原に対する単一の結合親和性を示す。
【００５１】
本明細書で用いる「ヒト化抗体」は、ヒト細胞により製造される抗体にさらによく似た抗体に変更された可変および定常領域を有するヒト以外の細胞により製造される抗体を包含することを意図する。たとえば、非ヒト抗体アミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系配列において見いだされるアミノ酸を組み入れるように変更することによる。本発明のヒト化抗体は、たとえばＣＤＲにおいて、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（たとえば、インビトロでの部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）によりコードされないアミノ酸残基を含み得る。本明細書で用いる用語「ヒト化抗体」はさらに、マウスなどの別の哺乳動物種から誘発されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体も包含する。
【００５２】
本明細書で用いる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を意味することを意図する（たとえば、ＰＤ−１と特異的に結合する単離された抗体は、ＰＤ−１リガンド以外と特異的に結合する抗体が実質的にない）。さらに、単離された抗体は他の細胞物質および／または化学物質が実質的にない。
特定のタンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列間には、遺伝コード（後記）により決められる公知の明確な対応が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と該核酸によりコードされるアミノ酸配列の間には、遺伝コードにより決定されるような公知の明確な対応が存在する。
【００５３】
遺伝コード
アラニン (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
アルギニン (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
アスパラギン (Asn, N) AAC, AAT
アスパラギン酸 (Asp, D) GAC, GAT
システイン (Cys, C) TGC, TGT
グルタミン酸 (Glu, E) GAA, GAG
グルタミン (Gln, Q) CAA, CAG
グリシン (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
ヒスチジン (His, H) CAC, CAT
イソロイシン (Ile, I) ATA, ATC, ATT
ロイシン (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
リジン (Lys, K) AAA, AAG
メチオニン (Met, M) ATG
フェニルアラニン (Phe, F) TTC, TTT
プロリン (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
セリン (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
トレオニン (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
トリプトファン (Trp, W) TGG
チロシン (Tyr, Y) TAC, TAT
バリン (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
終結シグナル (end) TAA, TAG, TGA
【００５４】
遺伝コードの重要でよく知られた特性は、その重複性（redundancy）であり、これにより、タンパク質を製造するために用いられるほとんどのアミノ酸に関して、１つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレットを用いることができる（前記）。したがって、多くの異なるヌクレオチド配列が所定のアミノ酸配列についてコードすることができる。かかるヌクレオチド配列は、結果として全ての生物において同じアミノ酸配列を産生するので、機能的に等価であると考えられる（ある生物はあるアミノ酸配列を他のものよりも有効に翻訳することができるが）。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体を所定のヌクレオチド配列中に見いだすことができる。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
【００５５】
前記事項を考慮すると、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列（またはその任意の部分）は、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳するために遺伝コードを用いて、融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列を誘発するために用いることができる。同様に、融合タンパク質またはポリペプチドに関して、融合タンパク質またはポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列を遺伝コード（その重複性のために、所定のアミノ酸配列について複数の核酸配列を産生するであろう）から推測できる。かくして、融合タンパク質またはポリペプチド配列の本明細書における記載および／または開示は、該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示も包含すると考えられるべきである。同様に、本明細書における融合タンパク質またはポリペプチド配列の記載および／または開示も、アミノ酸配列をコードすることができるあらゆる可能なヌクレオチド配列の記載および／開示も包含すると考えるべきである。
【００５６】
ＩＩ．免疫細胞活性化を調節する作用剤
本発明の作用剤は、免疫系をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができ、それによって免疫応答をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。たとえば、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することにより、免疫応答の調節がもたらされる。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドポリペプチドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを阻止し、したがって、阻害免疫シグナルの送達が阻害される。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を阻止することができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供する。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、阻害受容体ＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供する。別の態様において、ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、共刺激受容体ＣＤ２８へのＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８に結合するのを可能にし、免疫細胞に共刺激シグナルを提供する。
【００５７】
たとえば、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増大させる作用剤は、免疫応答を増強することができるが、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を増強することによって、免疫応答を減少させることができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用の阻害を生じない。別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を増大させる作用剤はまた、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を減少させる。さらに別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を増強または増大させる。例示的な調節（たとえば、免疫応答の低減化など）をするための作用剤として、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害するＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドに対する抗体；ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害する小分子またはペプチド；およびＢ７ポリペプチドまたはＰＤ−１リガンドにそれぞれ結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻止する融合タンパク質（たとえば、抗体のＦｃ部分に融合したＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの細胞外部分）が挙げられる。
【００５８】
別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増大させる作用剤は、Ｂ７ポリペプチドのＣＤ２８に結合する能力を減少させることによって、免疫応答を減少させる。また別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる作用剤は、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８の間の相互作用を増大させることによって、免疫応答を増大させることができる。
【００５９】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤はまた、免疫応答をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするのに用いることができる。たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を増大させる作用剤は、免疫応答を減少させることができるが、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を減少させる作用剤は、免疫応答を増大させることができる。ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節する作用剤が、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節しない（直接的影響をもたない）のが好ましい。別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を増大させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる。さらに別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を減少させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増大させる。例示的な調節（たとえば、免疫応答の増強など）をするための作用剤として、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックするＰＤ−１またはＰＤ−１リガンドに対する抗体；およびＰＤ−１またはＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻止する融合タンパク質（たとえば、抗体のＦｃ部分に融合したＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の細胞外部分）が挙げられる。
【００６０】
別の態様において、Ｂ７ポリペプチドに結合する少なくとも一部のＰＤ−１リガンドまたはこのような部分の模倣物を用いて、Ｂ７ポリペプチドに結合し、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドおよび第２免疫細胞上のＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を増強することができる。
別の態様において、Ｂ７ポリペプチドに結合する少なくとも一部のＰＤ−１リガンドまたはこのような部分の模倣物を用いて、Ｂ７ポリペプチドに結合し、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドおよび第２免疫細胞上のＣＤ２８の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を増強することができる。
【００６１】
単離されたＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８もしくはその部分またはフラグメント（またはこのようなポリペプチドをコードする核酸）は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的技術を用いて、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に結合する抗体を産生するための免疫原として用いることができる。全長ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を用いることができるが、あるいは別法として、本発明は、免疫原として用いるためのＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８ポリペプチドの抗原ペプチドフラグメントに関する。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の抗原ペプチドは、少なくとも８つのアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生じた抗体が、それぞれの全長分子と特異的免疫複合体を形成するように、それぞれの全長分子に存在するエピトープを包含する。抗原ペプチドは、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、親水性領域などのタンパク質の表面にあるＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の領域である。ポリペプチド分子の標準的疎水性分析を行って、親水性領域を同定することができる。抗原ペプチドに含まれる非常に好ましいエピトープは、細胞外ドメインにあり、したがって、結合に関与するポリペプチドの領域である。１つの態様において、このようなエピトープは、マウスまたはヒトといったような１つの種から得られたポリペプチドに対して特異的でありうる（すなわち、種を交差して保存されていないポリペプチド分子の領域に広がる抗原ペプチドは、免疫原として用いられる；このような非保存的残基は、本明細書に記載のアラインメントを用いて決定することができる）。
【００６２】
１つの態様において、抗体は、Ｂ７ポリペプチドまたはＰＤ−１リガンドに結合することなく、ＰＤ−１に実質的に特異的に結合する。別の態様において、抗体は、ＰＤ−１リガンドに実質的に特異的に結合する。別の態様において、抗体はＢ７ポリペプチドに実質的に特異的に結合する。好ましい態様において、抗体は、ＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックする。別の好ましい態様において、抗体は、Ｂ７ポリペプチドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックする。別の好ましい態様において、抗体は、ＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックすることなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする。
【００６３】
免疫原ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８は、典型的には、該免疫原で適当な対象（たとえば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他のほ乳類）を免疫感作することによって抗体を製造するのに用いられる。適当な免疫原調製物には、たとえば、それに対する免疫応答が生じることになる、組換えにより発現された分子または化学的に合成された分子もしくはそのフラグメントを含むことができる。さらに調製物として、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、または類似の免疫刺激剤が挙げられる。免疫原調製物による適当な対象の免疫感作は、それに含まれる抗原ペプチドに対するポリクローナル抗体応答を誘発する。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、前述したように、適当な対象をポリペプチド免疫原で免疫感作することによって製造することができる。免疫感作された対象におけるポリペプチド抗体力価は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などの標準的技術によって、モニターすることができる。所望であれば、抗原に対する抗体を哺乳類（たとえば血液など）から単離し、プロテインＡクロマトグラフィー公知の技術によってさらに精製して、ＩｇＧフラクションを得ることができる。免疫感作後の適当な時点、たとえば、抗体力価が最高になる時点で、対象から抗体産生細胞を得て、最初、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)によって記載されたハイブリドーマ技術(Brownら(1981) J. Immunol. 127:539-46; Brownら(1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yehら(1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31; and Yehら(1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照)、より近年ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Coleら(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)またはトリオーマ技術などの標準的技術によるモノクローナル抗体の製造に用いることができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するテクノロジーは、公知である(一般に、Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402; Gefter, M. L.ら(1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36)を参照。簡単に述べると、上述の免疫原で免疫感作した哺乳類由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）に不死細胞系（典型的には、骨髄腫）を融合させ、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ポリペプチド抗原に好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを同定する。
【００６５】
リンパ球と不死細胞系を融合させるのに用いる多くの公知のプロトコルのいずれもが、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１リガンドまたは抗Ｂ７ポリペプチドモノクローナル抗体の産生のために適用することができる(たとえば、Galfre, G.ら(1977) Nature 266:55052; Gefterら(1977) 前述; Lerner (1981) 前述; Kenneth (1980) 前述を参照)。さらに、有用であるこのような方法の多くのバリエーションがあることは、当業者にば当然のことである。典型的には、不死化細胞系（たとえば、骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳類の種から誘発される。たとえば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫感作されたマウスのリンパ球と不死化マウス細胞系とを融合させることによって、作製することができる。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有培養培地（「HAT培地」）に感受性があるマウス骨髄腫細胞系である。たとえば、P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫系といったような多くの骨髄腫細胞系のいずれもが、標準的技術にしたがって融合パートナーとして用いることができる。これらの骨髄腫系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), Rockville, Mdから入手可能である。典型的には、ポリエチレングリコール（「PEG」）を用いて、HAT感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞に融合させる。次いで、未融合細胞および非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺すHAT培地を用いて、融合から得られるハイブリドーマ細胞を選択する（未融合脾細胞は、形質転換されないので、数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞は、たとえば、標準的ELISAアッセイなどを用いて、所定のポリペプチドを結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００６６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための別法として、組換えコノビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（たとえば、抗体ファージディスプレーライブラリー）を適当なポリペプチドでスクリーニングすることにより、該ポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することによって、上述のポリペプチドの１つに対して特異的なモノクローナル抗体を同定し、単離することができる。ファージディスプレーライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットが市販されている(たとえば、ファルマシアの組換えファージ抗体システム, Catalog No. 27-9400-01;およびストラタジーンのSurfZAPTM ファージディスプレーキット, Catalog No. 240612など)。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作製およびスクリーニングにとって特に受け入れられる方法および試薬の例は、たとえば、LadnerらU.S. Patent No. 5,223,409; KangらInternational Publication No. WO 92/18619; DowerらInternational Publication No. WO 91/17271; WinterらInternational Publication WO 92/20791; MarklandらInternational Publication No. WO 92/15679; BreitlingらInternational Publication WO 93/01288; McCaffertyらInternational Publication No. WO 92/01047; GarrardらInternational Publication No. WO 92/09690; LadnerらInternational Publication No. WO 90/02809; Fuchsら(1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hayら(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huseら(1989) Science 246:1275-1281; Griffithsら(1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkinsら(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarksonら(1991) Nature 352:624-628; Gramら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrardら(1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboomら(1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbasら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; およびMcCaffertyら(1990) Nature 348:552-554に見出すことができる。
【００６７】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができるヒトおよび非ヒト部分の両方を含んでいるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１リガンドまたは抗Ｂ７ポリペプチド抗体は、本発明の範囲に含まれる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、たとえば、RobinsonらInternational Patent Publication PCT/US86/02269; AkiraらEuropean Patent Application 184,187; Taniguchi, M. European Patent Application 171,496; MorrisonらEuropean Patent Application 173,494; NeubergerらPCT Application WO 86/01533; CabillyらU.S. Patent No. 4,816,567; CabillyらEuropean Patent Application 125,023; Betterら(1988) Science 240:1041-1043; Liuら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liuら(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sunら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimuraら(1987) Cancer Res. 47:999-1005; Woodら(1985) Nature 314:446-449; and Shawら(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oiら(1986) Biotechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jonesら(1986) Nature 321:552-525; Verhoeyanら(1988) Science 239:1534; およびBeidlerら(1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用いる当業界で公知の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
【００６８】
さらに、ヒト化抗体は、US patent 5,565,332に開示されたような標準的プロトコルにしたがって作製することができる。別の態様において、たとえば、US patents 5,565,332, 5,871,907または5,733,743に記載されているような当業界で公知の技術を用いて、特異的結合ペアメンバーのポリペプチド鎖と複製可能な一般的ディスプレーパッケージの成分の融合をコードする核酸分子を含むベクターと単一の結合ペアメンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間の組換えによって、抗体鎖または特異的結合ペアのメンバーを作製することができる。細胞内のタンパク質の機能を阻害するための細胞内抗体の使用も当業界で公知である(たとえば、Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S.ら(1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M.ら(1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A.ら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S.ら(1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y.ら(1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, Lら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y.ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R.ら(1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R.ら(1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M.ら(1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H.ら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; PCT Publication No. WO 94/02610 by Marasco et al.;およびPCT Publication No. WO 95/03832 by Duan らを参照)。
【００６９】
さらに、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドに対する完全ヒト抗体が作製された。たとえば、Hoganら, 「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manuel,」 Cold Spring Harbor Laboratoryにしたがって、完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスにおいて作製することができる。簡単に述べると、トランスジェニックマウスを精製ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドで免疫感作する。脾細胞を採集し、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを、それらのＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドに結合する抗体産生能力に基づいて選択する。完全ヒト抗体は、ヒトにおけるこのような抗体の免疫原性を低下させる。
【００７０】
１つの態様において、本発明において使用する抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチド内に２つの異なる抗原に対する結合部位をもつ。抗原結合は、同時または逐次で起こる。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌しうる細胞系の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマによって産生される二重特異性抗体の例は、U.S. Pat. 4,474,893に開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段(Staerzら(1985) Nature 314:628, and Perezら(1985) Nature 316:354)およびハイブリドーマテクノロジー(Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, and Staerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241)によって構築されている。二重特異性抗体は、U.S. patent 5,959,084にも記載されている。二重特異性抗体のフラグメントが、US patent 5,798,229に記載されている。二重特異性作用剤は、異なる抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を融合させ、次いで、両方の抗体を産生し、共構築（co-assembling）するクローンを同定することによりヘテロハイブリドーマを作製することによって作製することもできる。それらは、完全免疫グロブリン鎖またはＦａｂまたはＦｖ配列などのその部分の化学的または遺伝的コンジュゲーションによって作製することもできる。抗体成分は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８ポリペプチドに結合することができる。１つの態様において、二重特異性抗体は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの両方に特異的に結合することができる。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、免疫原ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８またはＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に特有のその免疫原性部分で動物を免疫感作し、次いで、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を動物から単離することを含む工程によって入手しうる抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１リガンドまたは抗Ｂ７ポリペプチド抗体に関する。
【００７２】
本発明の別の態様において、ペプチドまたはペプチド模倣物を用いて、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をアンタゴナイズまたは促進することができる（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を妨害することなく）。１つの態様において、各全長タンパク質の調節作用剤として機能するＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体を、たとえば、トランケーション突然変異体などの突然変異体のコンビナトリアル・ライブラリーをアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定することができる。１つの態様において、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体の変化に富んだライブラリーが、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異誘発によって作成され、該ライブラリーは、変化に富んだ遺伝子ライブラリーをコードする。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体の変化に富んだライブラリーは、たとえば、潜在的ポリペプチド配列の縮重セットが、その中にポリペプチドのセットを含んでいる個々のポリペプチドとして発現されるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって作成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチド変異体のライブラリーを作成するのに用いることができる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲートする。遺伝子の縮重セットの使用により、１つの混合物において、潜在的ポリペプチド配列の所望のセットをコードするすべての配列を提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業界で公知である(たとえば、Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら(1984) Science 198:1056; Ikeら(1983) Nucleic Acid Res. 11:477などを参照）。
【００７３】
さらに、ポリペプチドコーティング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、所定のポリペプチドの変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためのポリペプチドフラグメントの変化に富んだ集団を作製することができる。１つの具体例において、ポリペプチド当たり約１のみニッキングが起こる条件下でポリペプチドコーティング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して異なるニッキング産物からセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼにより再形成された二本鎖物から一本鎖部分を除去し、次いで、得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲートすることによって、コーティン配列フラグメントのライブラリーを作成することができる。この方法によって、Ｎ−末端、Ｃ−末端および種々のサイズのポリペプチドの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００７４】
点突然変異またはトランケーションによって作成されたコンビナトリアル・ライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング用および選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用の幾つかの技術は、当業界で公知である。このような技術は、ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって作成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適している。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析にしやすい最も広範に用いられる技術として、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーによる適当な細胞の形質転換および所望の活性の検出により遺伝子の産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現が挙げられる。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術である再帰的集団突然変異（Recursive ensemble mutagenesis (REM)）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いて、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体を同定することができる(Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagraveら(1993) Protein Eng. 6(3):327-331)。１つの態様において、細胞系アッセイを利用して、変化に富んだポリペプチドライブラリーを分析することができる。たとえば、通常ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を合成する細胞系に、発現ベクターのライブラリーを形質移入することができる。次いで、全長ポリペプチドおよび特定の突然変異ポリペプチドが産生されるように形質移入された細胞を培養し、たとえば、多くの機能アッセイのいずれかによって細胞上清における全長ポリペプチド上の突然変異体の発現を検出することができる。次いで、全長ポリペプチド活性の阻害あるいは潜在化およびさらに特徴づけられた個々のクローンについて評価する細胞からプラスミドＤＮＡを回収することができる。
【００７５】
同じタイプのＤ−アミノ酸によるポリペプチドアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の系統的置換（たとえば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシンなど）を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。さらに、対象となるポリペプチドアミノ酸配列または実質的に同一である配列バリエーションを含む拘束された（constrained）ペプチドは、当業界で公知の方法(RizoおよびGierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387, これは全体を参考文献として本発明に援用される)；たとえば、ペプチドを環化する分子間ジスルフィド橋を形成しうる内部システイン残基を付加することによって作製することができる。
【００７６】
本明細書に開示したアミノ酸配列は、ペプチド配列およびその変異体に対応するポリペプチドを当業者が作製することを可能にする。このようなポリペプチドは、多くはより大きいポリペプチドの一部として、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、原核または真核宿主細胞において産生させることができる。別法として、このようなペプチドは、化学的方法によって合成することができる。組換え宿主における異種タンパク質の発現方法、ポリペプチドの化学的合成およびインビトロ翻訳は、当業界で公知であり、ManiatisらMolecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiserら(1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; およびOfford, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing(これらは全体を参考文献として本発明に援用される)にさらに記載されている。
【００７７】
１つの態様において、ペプチドは、ＰＤ−１リガンドポリペプチドのＢ７結合部位と同一または類似のアミノ酸配列をもつ。別の態様において、ペプチドは、Ｂ７ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１結合部位と同一または類似のアミノ酸配列をもつ。１つの態様において、ペプチドは、Ｂ７ポリペプチドに対する結合についてＰＤ−１リガンドと競合するか、またはペプチドは、ＰＤ−１リガンドに対する結合についてＢ７ポリペプチドと競合する。好ましい態様において、ペプチドは、Ｂ７ポリペプチドへのＰＤ−１リガンドの結合について競合するが、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の結合については競合しない。別の態様において、ペプチドは、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の結合について競合するが、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間については競合しない。
【００７８】
ペプチドは、典型的には、直接的化学合成によって作製し、たとえば、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用のアンタゴニストとして用いることができる。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端への共有結合によって結合した非ペプチド部分を含む修飾ペプチドとして作製することができる。ある好ましい態様において、カルボキシ末端もしくはアミノ末端または両方を化学的に修飾する。末端アミノおよびカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化とアミド化である。アシル化（アセチル化など）またはアルキル化（メチル化など）などのアミノ末端修飾およびアミド化などのカルボキシ末端修飾ならびに環化などの他の末端修飾を種々の本発明の態様に組み込むことができる。あるアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列へのペプチド伸長により、安定性の増大、効能および／または効力の増加、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物動態特性などの有利な物理的、化学的および薬理学的特性が提供される。本明細書に開示するペプチドを治療的に用いて、たとえば、患者における共刺激を変更することによって疾病を治療することができる。
【００７９】
ペプチド模倣体は、通常、コンピューター処理による分子モデリングを用いて創り出される(Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; VeberおよびFreidinger (1985) TINS p.392; およびEvansら(1987) J. Med. Chem. 30:1229,これらは全体を参考文献として本発明に援用される)。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣体を用いて、等価の治療または予防効果を生み出すことができる。一般に、ペプチド模倣体は、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性のあるポリペプチド）に構造的に類似するが、必要に応じて、当業界で周知の方法により、-CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (シスおよびトランス), -COCH2-, -CH(OH)CH2-および -CH2SO-から選ばれる結合で置換された１つ以上のペプチド結合を有し、さらに、次の参考文献に記載されている：Spatola, A. F. in 「Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins」 Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, 「Peptide Backbone Modifications」 (general review); Morley, J. S. (1980) Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (general review); Hudson, D.ら(1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F.ら(1986) Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M. (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314 (-CH-CH-, cis and trans); Almquist, R. G.ら(190) J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C.ら(1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M.らEuropean Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W.ら(1983) Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-);および Hruby, V. J. (1982) Life Sci. (1982) 31:189-199 (-CH2-S-);これらは全体を参考文献として本発明に援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、-CH2NH-である。このようなペプチド模倣体は、たとえば、より経済的な製造、より大きい化学的安定性、増進された薬理学的特性（半減期、吸収、効能、効力など）、変更された特異性（広範な生物学的活性など）、低減化された免疫原性などのポリペプチド形態全体にわたる重大な利点を有する。ペプチド模倣体の標識は、通常、定量的構造−活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣体上の非妨害位置への１つ以上の標識の直接的あるいはスペーサー（アミド基など）を介した共有結合を含む。このような非妨害位置とは一般に、ペプチド模倣体が治療的効果を生み出すために結合する、マクロポリペプチドと直接接触しない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化（標識など）は、ペプチド模倣体の所望の生物学的または薬理学的活性を実質的に妨害すべきではない。
【００８０】
本発明には、たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用などの相互作用を調節（増強または阻害）することができる小分子も含まれる。本発明の小分子は、空間的にアドレス可能なパラレル固相または溶液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ・１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法といったような当業界で周知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【００８１】
分子らの合成法の例は、たとえば、DeWittら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erbら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermannら(1994) J. Med. Chem. 37:2678; Choら(1993) Science 261:1303; Carrellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびGallopら(1994) J. Med. Chem. 37:1233など、当業界で見出すことができる。
【００８２】
化合物のライブラリーは、溶液中(e.g., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner USP 5,223,409)、胞子(Ladner USP ’409)、プラスミド(Cullら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)もしくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirlaら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 前述)においても存在することができる。化合物は、細胞ベースまたは非細胞系アッセイにおいてスクリーニングすることができる。化合物は、集合（たとえば、各試験サンプルにおける複数の化合物）または個々の化合物としてスクリーニングすることができる。
【００８３】
１つの態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンド／Ｂ７ポリペプチド相互作用に関与する結合部位またはＤ−１／ＰＤ−１リガンド相互作用に関与する結合部位に結合する。１つの態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をアンタゴナイズする。好ましい態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をアンタゴナイズするが、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドまたはＢ７とＣＴＬＡ４の間の相互作用はアンタゴナイズしない。別の態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をアンタゴナイズすることなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＢ７とＣＴＬＡ４の間の相互作用をアンタゴナイズする。
【００８４】
本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８キメラもしくは融合タンパク質に関する。本明細書で用いるＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８「キメラタンパク質」もしくは「融合タンパク質」は、非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンド、非ＣＴＬＡ４、非ＣＤ２８または非Ｂ７ポリペプチド分子に作動可能に結合したＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子を含む。「ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子」は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するが、「非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンド、非Ｂ７ポリペプチド、非ＣＴＬＡ４または非ＣＤ２８分子」は、たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子とは相異し、同じもしくは相異する微生物から誘導されるタンパク質などの各ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子に実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８融合タンパク質のうち、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８部分は、全長ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子の全部または一部に対応することができる。好ましい態様において、融合タンパク質は、細胞外ドメインなどの、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子の少なくとも１つの生物学的活性部分を含む。融合タンパク質のうち、用語「作動可能に結合した」は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８アミノ酸配列および非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンドまたは非Ｂ７ポリペプチド配列が、独立して融合タンパク質に発現する場合に示される機能を保存するような様式で互いにインフレーム融合することを示すことを異図する。非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンド、非Ｂ７ポリペプチド、非ＣＴＬＡ４または非ＣＤ２８分子は、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８配列のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【００８５】
このような融合タンパク質は、第１ペプチドをコードするヌクレオチド配列と第２ペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え発現によって作製することができる。第２ペプチドは、必要に応じて、たとえば、免疫グロブリン定常領域などの第１ペプチドの溶解度、親和性、安定性または結合価を変更する部分に対応してもよい。好ましくは、第１ペプチドは、活性化した免疫細胞の共刺激または阻害を調節するのに十分なＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の部分からなる。別の態様において、第１ペプチドは、生物学的活性分子の部分（たとえば、ポリペプチドの細胞外部分またはリガンド結合部分など）からなる。第２ペプチドは、たとえば、ヒトＣγ１ドメインまたはCγ4ドメイン(たとえば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域；CaponらUS patent 5,116,964; 5,580,756; 5,844,095などを参照；これらは全体を参考文献として本発明に援用される)などの免疫グロブリン定常領域を含むことができる。このような定常領域は、エフェクター機能（Ｆｃ受容体結合など）を媒介する領域を保持するか、またはエフェクター機能を低下させるように変更する。得られる融合タンパク質は、独立して発現された第１ペプチドに比べて、安定性、結合親和性、安定性および／または結合価（すなわち、ポリペプチド当たりの利用可能な結合部位の数）を変更することができており、タンパク質精製の効率を増加することができる。組換え技術によって作製された融合タンパク質およびペプチドを、タンパク質またはペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌し、単離することができる。別法として、タンパク質またはペプチドを細胞質内に保持し、細胞を採集し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養は、典型的には、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養のための適当な培地は、当業界で周知である。タンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチド精製用の当業界で周知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。宿主細胞に形質移入し、タンパク質およびペプチドを精製するための技術は当業界で周知である。
【００８６】
特に好ましいＩｇ融合タンパク質として、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域など）に結合する、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインが挙げられる。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリン構造に固有のエフェクター活性を減少あるいは削除する遺伝子修飾を含むこともできる。たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の細胞外部分をコードするＤＮＡを、たとえば、WO 97/28267に教示されているような特定部位突然変異誘発によっ修飾されたヒトＩｇＧγ１またはＩｇＧγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合させることができる。
本発明の融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術によって作製されるのが好ましい。たとえば、ライゲーションのための平滑末端またはねじれ末端、適当な末端を得るための制限酵素切断、必要に応じて粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素ライゲーションを用いる慣例の技術にしたがって、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを一緒にインフレームライゲーションさせる。別の態様において、自動ＤＮＡ合成機などの慣例の技術によって融合遺伝子を合成することができる。別法として、続いてアニーリングされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を生じる、２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じさせる２つのアンカープライマーを用いる遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. AusubelらJohn Wiley & Sons: 1992を参照)。融合部分がＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８をコードする配列にインフレーム結合するように、発現ベクターに核酸をコードするポリペプチドをクローニングする。
【００８７】
別の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。ある宿主細胞（たとえば、哺乳動物宿主細胞）において、異種シグナル配列の使用により、ポリペプチドの発現および／または分泌を増加させることができる。
【００８８】
好ましい態様において、融合タンパク質は、ＰＤ−１またはＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックすることなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックする。別の好ましい態様において、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド融合タンパク質は、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックする。
ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８融合タンパク質の使用は、たとえば、自己免疫疾患などの免疫疾患の治療にとって、または移植片拒絶反応の阻止において、治療的に有用である。
【００８９】
本発明の融合タンパク質は、被験者において抗体を産生するための免疫原として用いることができる。このような抗体は、融合タンパク質が作製された各天然のポリペプチドの精製、あるいはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用を阻害するポリペプチドを同定するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。
本明細書に記載する調節的作用剤（たとえば、抗体、小分子、ペプチドまたは融合タンパク質など）は、医薬組成物に組み入れて、患者にインビボで投与することができる。組成物は、本明細書に記載した単一のそのような分子または作用剤または調節的作用剤のいずれかの組み合わせを含んでもよい。
【００９０】
ＩＩＩ．免疫細胞活性を調節する作用剤の選択方法
本発明の別の態様は、共刺激を調節すること（ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用を阻害する作用剤など）によって免疫応答を調節する作用剤（たとえば、抗体、融合タンパク質、ペプチドまたは小分子）の選択方法に関する。このような方法は、細胞ベースおよび非細胞系アッセイなどのスクリーニングアッセイを利用する。１つの態様において、アッセイは、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害しながら、あるいは阻害することなく）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用を阻害する作用剤を同定する方法を提供する。別の態様において、アッセイは、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用；Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の相互作用；および／またはＢ７ポリペプチドとＣＤ２８の相互作用を阻害しながら、あるいは阻害することなく）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤を同定する方法を提供する。
【００９１】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に結合するか、または、たとえば、その同族の結合パートナーと相互作用する（結合するなど）ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の能力を調節するといったような、その活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイに関する。１つの態様において、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法は、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をたとえば増強または阻害するといったような調節する作用剤の能力の決定およびさらに作用剤のＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する能力の決定を含む。１つの態様において、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することなく）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節する作用剤が選択される。別の態様において、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節することなく）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤が選択される。
このような作用剤として、抗体、タンパク質、融合タンパク質および小分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
１つの態様において、免疫応答を増強する作用剤を同定する方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節することなく、あるいは阻害しながら）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増強する候補作用剤の能力の決定を伴う。別の態様において、方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増強調節することなく、あるいは増強しながら）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻害する候補作用剤の能力の決定を含む。
【００９３】
別の態様において、免疫応答を減少させる作用剤を同定する方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節することなく、あるいは増強しながら）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する候補作用剤の能力の決定およびＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤の選択を含む。別の態様において、免疫応答を減少させる作用剤を同定する方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節しない、あるいは阻害する）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を増強する候補作用剤の能力の決定およびＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を増強する作用剤の選択を含む。好ましい態様において、免疫応答を減少させるために選ばれた作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害するが、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻害しない。
【００９４】
１つの態様において、アッセイは、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を発現している細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物のＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８のその結合パートナーへの結合を調節（たとえば、刺激または阻害）する能力を決定することを含む細胞系アッセイである。結合パートナーへ結合するＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの能力または結合パートナーと相互作用するＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの能力の決定は、たとえば、直接結合を測定することによって、あるいは免疫細胞の活性化のパラメーターを測定することによって達成することができる。
【００９５】
たとえば、直接結合アッセイにおいて、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドへのＰＤ−１リガンドの結合が複合体として標識されたタンパク質を検出することによって決定することができるように、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドタンパク質（またはそれぞれの標的ポリペプチド）を放射性同位体または酵素標識と結合させることができる。たとえば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的または間接的にＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を標識し、放射線放出を直接カウントすることによって、あるいはシンチレーションカウントすることによって、放射性同位体を検出することができる。別法として、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を酵素的に標識し、適当な基質の産物への変換を決定することによって酵素標識を検出することができる。
【００９６】
相互作用体のいずれかを標識することなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する化合物の能力を決定することも本発明の範囲内にある。たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチドまたは標的ポリペプチドのいずれかを標識することなく、マイクロフィジオメーターを用いて、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を検出することができる(McConnell, H. M.ら(1992) Science 257:1906-1912)。本明細書で用いる「マイクロフィジオメーター」（たとえば、サイトセンサー）は、光アドレス可能電位計測法（light-addressable potentiometric sensor (LAPS)）を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。酸性化速度の変化を、化合物と受容体の間の相互作用の指標として用いることができる。
【００９７】
好ましい態様において、ポリペプチドの所定のセットをアンタゴナイズするブロッキング剤（たとえば、抗体、融合タンパク質、ペプチドまたは小分子など）の能力の決定は、ポリペプチドのセットの１つ以上のメンバーの活性を決定することによって達成することができる。たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の活性は、細胞の第２メッセンジャー（たとえば、チロシンキナーゼ活性）の誘発を検出すること、適当な基質の触媒／酵素活性を検出すること、リポーター遺伝子（検出可能なマーカー、たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、をコードする核酸に作動可能に結合した標的応答性調節エレメントを含む）の誘発を検出すること、またはＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８によって調節される細胞応答を検出することによって決定することができる。該ポリペプチドに結合する、あるいはポリペプチドと相互作用するブロッキング剤の能力の決定は、たとえば、免疫細胞共刺激または増殖アッセイにおける阻害を調節する化合物の能力を測定するか、または該ポリペプチドの部分を認識する抗体に結合する該ポリペプチドの能力を妨害することによって達成することができる。
【００９８】
ＰＤ−１リガンドと共刺激受容体の相互作用をブロックまたは阻害する作用剤（たとえば、可溶性型のＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１リガンドに対するブロッキング抗体など）ならびにＰＤ−１リガンド媒介性阻害シグナルを促進する作用剤（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックする作用剤など）は、免疫細胞増殖および／またはエフェクター機能を阻害するその能力もしくはインビトロアッセイに加えた場合にアネルギーを誘発するその能力によって同定することができる。たとえば、活性化受容体を介してシグナルトランスダクションを刺激する作用剤の存在下に細胞を培養することができる。多くの認識された細胞活性化の読み出しを利用して、活性化剤の存在下に細胞増殖またはエフェクター機能（たとえば、抗体産生、サイトカイン産生、食作用）を測定することができる。この活性化をブロックする試験作用剤の能力は、当業界で周知の技術を用いて測定される増殖またはエフェクター機能における低下をもたらすその作用剤の能力を測定することによって容易に決定することができる。
【００９９】
たとえば、本発明の作用剤を、Freemanら(2000) J. Exp. Med. 192:1027 and Latchmanら(2001) Nat. Immunol. 2:261に記載されているように、Ｔ細胞アッセイにおいて、共刺激を阻害または増強する能力について試験することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、活性化抗ＣＤ３抗体で刺激することができる。Ｔ細胞の増殖は、３Ｈチミジン取り込みによって測定することができる。アッセイは、ＣＤ２８共刺激があってもなくても行うことができる。類似のアッセイをＰＢＭＣ由来のジャーカットＴ細胞およびＰＨＡ幼若化細胞を用いて行うことができる。
【０１００】
さらに別の態様において、本発明のアッセイは、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８もしくはその生物活性部分を試験化合物と接触させ、ポリペプチドもしくはその生物活性部分に結合する試験化合物の能力を決定する無細胞アッセイである。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８への試験化合物の結語は、上述したように直接的または間接的のいずれかにおいて決定することができる。好ましい態様において、アッセイは、ポリペプチドまたはその生物活性部分をその結合パートナーと接触させて、アッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、次いで、アッセイ混合物中のポリペプチドと相互作用する試験化合物の能力を決定することを含む；ここで、ポリペプチドと相互作用する試験化合物の能力を決定することは、結合パートナーと比較して、ポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
【０１０１】
たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドを用いて、アッセイ混合物を形成し、上述の方法のうちの１つまたは直接結合を決定することにより、ＰＤ−１リガンドを結合するＰＤ−１の能力を決定することおよびＢ７ポリペプチドを結合するＰＤ−１リガンドの能力を決定することによって、この相互作用をブロックするポリペプチドの能力を試験することができる。ＰＤ−１リガンドを結合するＰＤ−１の能力を決定することおよびＢ７を結合するＰＤ−１リガンドの能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Analysis:ＢＩＡ）を用いても達成することができる(Sjolander, S.およびUrbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzaboら(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)。本明細書で用いる「ＢＩＡ」は、相互作用体のいずれも標識することなく、リアルタイムにおいて生体特異的相互作用を研究するためのテクノロジーである（たとえば、BIAcore）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）という工学的現象における変化を、生体ポリペプチドの間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドをBIAcoreチップ上に固定し、多数の作用剤（ブロッキング抗体、融合タンパク質、ペプチドまたは小分子）をＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドへの結合について試験することができる。ＢＩＡテクノロジーを用いる例は、Fitzら(1997) Oncogene 15:613に記載されている。
【０１０２】
本発明の無細胞アッセイは、タンパク質の可溶性および／または膜結合型の両方（たとえば、ＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分またはＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１が結合する結合パートナー）に敏感に反応する。膜結合型タンパク質（たとえば、細胞表面ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１受容体など）を用いる無細胞アッセイの場合、膜結合型のタンパク質が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用するのが望ましい。可溶化剤の例として、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（登録商標） X-100、トリトン（登録商標） X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデイシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモオ］−１−プロパン・スルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン・スルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン・スルホネートなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１０３】
上述したアッセイ方法のうち１つ以上の態様において、一方または両方のタンパク質の未複合体からの複合体の分離を促進し、アッセイの自動化に適応させるために、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドまたは適当な標的ポリペプチドを固定化するのが望ましい。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドへの試験化合物の結合は、反応物を入れるのに適したいずれかの容器内で行うことができる。このような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心分離管が挙げられる。１つの態様において、一方または両方のタンパク質がマトリックスに結合できるようにするドメインを加える融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド融合タンパク質、あるいはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン被覆マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いで、試験化合物と合わせ、複合体形成をもたらす条件下（たとえば、塩およびｐＨについて生理的条件など）で混合物をインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルを洗浄して、未結合の成分、ビーズの場合固定化されたマトリックスを除去し、たとえば、上述したように直接的または間接的に複合体を決定する。別法として、複合体をマトリックス〜解離させ、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド結合のレベルまたは活性を標準的技術を用いて決定することができる。
【０１０４】
別の態様において、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力の決定は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの下流で機能するポリペプチド、たとえば、ＰＤ−１リガンドと相互作用するポリペプチド、または、たとえば、ＰＤ−１の細胞質ドメインと相互作用することによって、ＰＤ−１の下流で機能するポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力を決定することによって達成することができる。たとえば、前述したように、第２メッセンジャーのレベルを決定することができ、適当な標的上のインタラクターポリペプチドの活性を決定することができ、または適当な標的に対するインタラクターの活性を決定することができる。
【０１０５】
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規な作用剤に関する。したがって、本明細に記載の適当な動物モデルにおいて同定された作用剤の使用も本発明の範囲に包含される。たとえば、本明細書に記載の同定された作用剤を動物モデルにおいて用いて、このような作用剤による処置の効力、毒性または副作用を決定することができる。別の態様として、本明細書に記載の同定された作用剤を動物モデルにおいて用いて、このような作用剤の作用のメカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置のための上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規な作用剤の使用に関する。
【０１０６】
ＩＶ．医薬組成物
本発明のＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８調節作用剤（たとえば、ブロッキング抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子といったような、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックすることなくＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用を阻害または促進する作用剤またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックする作用剤など）は、患者への投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。このような組成物は、典型的には抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子および医薬的に許容しうる担体を含む。本明細書で用いる語句「医薬的に許容しうる担体」は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などをすべて包含するものとする。医薬活性剤に関するこのような媒質および薬剤の使用については当該分野では周知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物を組成物中に含有させることもできる。
【０１０７】
本発明医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（例、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分：滅菌希釈剤、たとえば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、たとえばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調節剤、たとえば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。酸または塩基、たとえば塩酸または水酸化ナトリウムによりｐＨを調節することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器またはマルチプルドーズバイアル（multiple dose vial）に封入することができる。
【０１０８】
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、たとえば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得る。たとえば、レシチンのごときコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば糖類、ポリアルコール類、たとえばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。
必要ならば上記成分の１つまたは組み合わせとともに所望量の適当な溶媒に活性化合物（たとえば、該分子のＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８フラグメントに対する抗体；または該ポリペプチドの相互作用をブロックする小分子）を含ませて、次いで、濾過滅菌することにより、滅菌注射可能溶液を調製することができる。一般的には、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤中に活性化合物を含ませることにより分散液を製造する。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておいたその溶液から有効成分に加えて所望の追加的成分からなる粉末を得ることができる。
【０１０９】
一般的には、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入、あるいは錠剤に圧縮成型することができる。経口治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて経口組成物を製造することもでき、流動担体中の化合物は経口適用され、スイッシュ（swish）され、吐き出されるかまたは嚥下される。医薬的に適合し得る結合剤、および／またはアジュバント剤は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または似た性質の化合物：結合剤、たとえば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦形剤、たとえば澱粉または乳糖、崩壊剤、たとえばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ、滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）、滑沢剤、たとえばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、たとえばしょ糖またはサッカリン、または香味料、たとえばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
【０１１０】
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、たとえば気体、たとえば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリバリーされる。
【０１１１】
全身投与を経粘膜または経皮手段で行なってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は一般的に当業界では公知であり、たとえば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。鼻用スプレーまたは坐薬の使用により経粘膜投与を行なうことができる。経皮投与の場合、当業界で一般的に知られているように、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームとして製剤化する。
化合物を直腸デリバリー用の坐薬（例、慣用的坐薬基剤、たとえばカカオバターおよび他のグリセリド類による）または停留浣腸形態として調合することもできる。
【０１１２】
１つの態様において、活性化合物は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調合され、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル封入デリバリー系を包含する除放性製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の製造方法は、当業者に明らかであろう。これらの材料を、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）を医薬的に許容され得る担体として使用することもできる。たとえば米国特許第４５２２８１１号に記載されたような当業者に公知の方法にしたがってこれらを調合することができる。
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤するのは特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態とは、処置される対象にとって単位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含むものをいう。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当業界における制限に直接的に左右される。
【０１１３】
このような化合物の毒性および治療効率を細胞培養物または実験動物における標準製薬方法により測定して、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよい場合、かかる化合物を罹病組織の部位に標的化させるデリバリーシステムを設計して、未感染細胞に対する潜在的ダメージを最小化し、そのことにより副作用を減らすように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための範囲の用量を製剤化するために用いることができる。好ましくは、かかる化合物の用量は、毒性を全くまたはほとんど伴わないＥＤ５０値を包含する循環濃度の範囲内である。使用される用量形態および使用される投与経路に応じて用量をこの範囲内で変化させてもよい。本発明方法で使用される化合物の場合、先ず、細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。用量を動物モデルで製剤化することにより、細胞培養で測定されたＩＣ５０（すなわち、徴候の半−最大阻害を達成する試験化合物の濃度）をを包含する循環血漿濃度範囲が得られる。このような情報を使用することにより、ヒトにおける有用な用量をより正確に測定することができる。血漿レベルを、たとえば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１１４】
上記調節作用剤は、作用剤をコードする発現可能な核酸の形体で投与してもよい。このような核酸およびそれらを含有する組成物もまた、本発明に包含される。たとえば、本発明の核酸分子をベクターに挿入して、遺伝子療法ベクターとして用いることができる。遺伝子療法ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与(U.S. Patent 5,328,470を参照)または定位注射(たとえば、Chenら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照)によって被験者にデリバリーすることができる。遺伝子療法ベクターの医薬製剤は、許容しうる希釈液中に遺伝子療法ベクターを含んでいてもよく、あるいは遺伝子デリバリービヒクルが包埋される遅延放出マトリックスを含んでいてもよい。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクターを組換え細胞から無傷で製造できる場合（たとえば、レトロウイルスベクター）、医薬製剤は遺伝子デリバリー系を生産する１個またはそれ以上の細胞を含んでいてもよい。
医薬組成物を投与に関する使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中に入れることができる。
【０１１５】
Ｖ．本発明の用途および方法
本明細書に記載の調節作用剤は、治療方法に用いることができる（たとえば、免疫応答を上方調節または下方調節することにより）。たとえば、ＰＤ−１に結合しているＰＤ−１リガンドは、負のシグナルを伝達するが、Ｂ７−１などのＢ７ポリペプチドに結合しているＰＤ−１リガンドはしない。したがって、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節の結果として、免疫応答の調節が得られる。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用はまた、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを妨げ、したがって、阻害免疫シグナルのデリバリーを阻害する。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を妨げることができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、阻害受容体ＣＴＬＡ４に結合するＢ７も減少させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。別の態様において、ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、共刺激受容体ＣＤ２８に結合するＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８を結合しうるようにして、免疫細胞に対する共刺激シグナルを提供する。
【０１１６】
１．予防方法
１つの態様において、本発明は、不必要あるいは決して望ましくない免疫応答に関連する疾患または身体状態を被験者において予防する方法に関する。本発明の作用剤または方法を処置することによって利益を得ることができる、疾患に対するリスクをもつ被験者を、たとえば、当業界で周知の診断または予知アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。予防薬の投与は、不必要あるいは決して望ましくない免疫応答に関連する症状の出現前に行う。治療に用いる適当な作用剤（たとえば、抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子）は、臨床的兆候によって決定することができ、たとえば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。
【０１１７】
２．治療方法
本発明の別の態様は、たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することによって、免疫応答を調節する治療方法に関する。たとえば、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節の結果として、免疫応答の調節が得られる。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのも妨げ、したがって、阻害免疫シグナルのデリバリーを阻害する。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を妨げることができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、阻害受容体ＣＴＬＡ４に結合するＢ７も減少させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。別の態様において、ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、共刺激受容体ＣＤ２８に結合するＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８を結合しうるようにして、免疫細胞に対する共刺激シグナルを提供する。
【０１１８】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤の例として、たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドに対する抗体；ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドに由来するフラグメントまたはペプチド；ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドの融合タンパク質；およびＰＤ−１とＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を調節する小分子などの本明細書に記載したような作用剤が挙げられる。
【０１１９】
これらの調節作用剤は、インビトロで（たとえば、細胞を作用剤と接触させることによって）、あるいは別法として、インビボで（たとえば、作用剤を被験者に投与することによって）投与することができる。そのようなものとして、本発明は、たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節によるといったような免疫応答の調節が有益である疾患または障害に罹患した個体の治療方法に関する。
【０１２０】
３．免疫応答のダウンレギュレーション
ＰＤ−１リガンドの阻害性機能をアップレギュレーションするか、または共刺激をダウンレギュレーションすることによって免疫応答を調節するための本発明の態様が多く存在する。ダウンレギュレーションは、すでに進行している免疫応答を阻害またはブロックする形態であってもよく、あるいは免疫応答の誘発を妨害することを含むものであってもよい。免疫細胞応答をダウンレギュレーションすることにより、あるいは免疫細胞における特異的アネルギーを誘発することにより、あるいはそれら両方により、活性化された免疫細胞の機能を阻害することができる。活性化免疫細胞の機能は、免疫細胞応答をダウンレギュレーションすること、あるいは免疫細胞における特異的アネルギーを誘発すること、またはその両方によって阻害することができる。
【０１２１】
たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチド（たとえば、ＰＤ−１リガンド−ＩｇなどのＰＤ−１リガンドポリペプチドの可溶性モノマー体）および／またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックする（たとえば、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の間の相互作用に影響を及ぼさずに、または増強しながら）またはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の結合を促進する（Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用に影響を及ぼさずに、あるいは阻害しながら）抗ＰＤ−１リガンド抗体を用いて、免疫応答を下方調節することができる。これらの相互作用をブロックする作用剤の他の例として、抗Ｂ７ポリペプチド、Ｂ７ポリペプチドまたはブロック性小分子が挙げられる。
【０１２２】
Ｂ７ポリペプチドへのＰＤ−１リガンドの結合に影響を及ぼさずに、あるいは減少させながら、ＰＤ−１へのＰＤ−１リガンドの結合またはＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合を促進する作用剤を用いて、免疫応答をダウンレギュレートすることもできる。作用剤の例として、本明細書に記載の方法によって同定されるＰＤ−１ペプチド模倣体が挙げられる。
本発明の１つの態様において、抗原およびＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用ををブロックする作用剤（たとえば、抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子）の併用投与によって、特異的抗原に対する寛容が誘発される。たとえば、特異的的タンパク質に寛容を誘発することができる。１つの態様において、アレルゲンまたは免疫応答が望ましくない外来タンパク質に対する免疫応答を阻害することができる。たとえば、第VIII因子を投与される患者は、この血液凝固因子に対する抗体を産生することが多い。ＰＤ−１リガンド媒介性共刺激シグナルをブロックする作用剤またはＰＤ−１媒介性阻害シグナルを刺激する作用剤と組換え第VIII因子との併用投与（またはたとえば架橋により、物理的に第VIII因子に結合する）の結果として、ダウンレギュレーションが起こりうる。
【０１２３】
１つの態様において、第２ペプチドに融合した第１ＰＤ−１リガンドペプチドを含む融合タンパク質を用いて、免疫細胞上のＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックして、免疫応答をダウンレギュレートすることができる。１つの態様において、第２ペプチドは、別のＢリンパ球抗原（たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−３など）の活性をブロックして、さらに免疫応答をダウンレギュレートする。別法として、免疫応答をダウンレギュレートする２つの別々の作用剤を単一の組成物として組み合わせるか、あるいは別々に（同時または逐次）投与して、より効果的に被験者における免疫細胞媒介性免疫応答をダウンレギュレートことができる。たとえば、ＰＤ−１リガンドをＢ７ポリペプチドと、あるいはブロッキング抗体の組み合わせ（たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドに対する抗体と抗Ｂ７−１および／または抗Ｂ７−２モノクローナル抗体などｄ）と組み合わせることができる。さらに、医薬的有効量の１つ以上の対象作用剤を他のダウンレギュレーション試薬と組み合わせて用いて、免疫応答に影響を及ぼすことができる。他の免疫調節試薬の例として、共刺激シグナルをブロックする抗体（たとえば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳに対する抗体など）、ＣＴＬＡ４のアゴニストとして働く抗体および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（たとえば、ＣＤ４０、ＣＤ４リガンドまたはサイトカインに対する抗体など）、融合タンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃなど）および免疫抑制剤（たとえば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用のダウンレギュレーションまたは妨害、あるいはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用の促進（たとえば、調節することなく、またはさらに増強することによる）にとって、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用（たとえば、ＰＤ−１の負のシグナル伝達の刺激による）が、たとえば、組織、皮膚および臓器移植という状況、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または紅斑性狼瘡もしくは多発性硬化症などの自己免疫疾患における免疫応答をダウンレギュレートするのに有用である。たとえば、免疫細胞機能を遮断する結果として、組織いしょくにおける組織破壊が減少する。典型的には、組織移植片において、移植片の拒絶は、免疫細胞によるその外来物としての認識を介して開始され、続いて、移植片を破壊する免疫反応が起こる。移植前または移植時におけるＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害またはブロックするポリペプチド（ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の可溶性モノマー体など）の単独またはもう一つのダウンレギュレーション作用剤と併用での投与は、阻害シグナルの精製を促進することができる。さらに、ＰＤ−１リガンド共刺激シグナルの阻害、またはＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１阻害シグナルの促進は、免疫細胞をアネルギー化して、被験者に寛容を誘発するのも十分可能である。ＰＤ−１リガンド媒介性共刺激シグナルのブロックによる長期寛容の誘発により、これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の必要性を回避することができる。
【０１２５】
被験者において十分な免疫抑制または寛容を達成するために、他のポリペプチドの共刺激機能をブロックすることも望ましい。たとえば、移植前または移植時に、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２それぞれの活性を有する一組の可溶性型のペプチドを投与し、これらの抗原に対する抗体をブロックまたは小分子をブロックすることによって、これらの抗原の機能をブロックするのが望ましい（シグナル組成において別々または一緒に）。別法として、ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の阻害活性を促進し、Ｂ７−１および／またはＢ７−２の共刺激活性を阻害するのが望ましい。本発明のダウンレギュレーション方法と組み合わせて用いうる他のダウンレギュレーション作用剤として、たとえば、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを伝達する作用剤、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーまたは可溶性型の他の受容体リガンドペアに対する抗体（たとえば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドの相互作用を妨害する作用剤など（たとえば、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体または免疫抑制剤が挙げられる。
【０１２６】
免疫応答のダウンレギュレーションは、自己免疫疾患の治療にも有用である。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾患の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を妨げることにより、疾患の症状を軽減または排除することができる。ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することなく、あるいはダウンレギュレーションしながら、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を破壊することまたはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を促進することによって免疫細胞の共刺激をブロックする試薬の投与は、免疫細胞活性化の阻害および疾患プロセスに関与しうる自己抗体またはサイトカインの産生の妨害に有用である。さらに、ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の阻害機能を促進する作用剤は、自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容を誘発することができ、疾病からの長期救済を導くことができる。自己免疫疾患を予防または緩和する試薬の効力は、多くのヒト自己免疫疾患の十分に特徴付けられた動物モデルを用いて決定することができる。例として、マウス実験用自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける全身紅斑性狼瘡、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスならびにＢＢラットにおける糖尿病およびマウス重症筋無力症が挙げられる(たとえば、Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, Third Edition 1993, chapter 30を参照)。
【０１２７】
免疫細胞活性化の阻害は、たとえば、ＩｇＥ産生の阻害によるアレルギーおよびアレルギー反応の治療において治療的に有用である。ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１阻害機能を促進する作用剤は、患者における免疫細胞によるアレルギー反応を阻害するためにアレルギーの患者に投与することができる。免疫細胞のＰＤ−１リガンド共刺激の阻害あるいはＰＤ−リガンドまたはＰＤ−１阻害経路の刺激は、適当なＭＨＣポリペプチドと組み合わせたアレルゲンへの暴露を伴う。アレルギー反応は、アレルギーの侵入経路および肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥの沈着パターンによって、自然において、全身性または局所性である。したがって、免疫細胞によるアレルギー反応は、ＰＤ−１リガンドと共刺激レセプターとの相互作用を阻害する作用剤、あるいはＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の阻害機能を促進する作用剤の阻害形態の投与により、局所性または全身性である。
【０１２８】
ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を調節することなく、あるいはダウンレギュレートしながらのＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用のブロックまたはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用の促進による免疫細胞活性化の阻害は、免疫細胞のウイルス感染においても治療的に重要である。たとえば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルス複製は免疫細胞活性化により刺激される。これらの相互作用の調節の結果、ウイルス複製が阻害され、それによってＡＩＤＳの進行が改善される。これらの調節は、妊娠の持続を促進するのにも有用である。ＰＤ−１リガンドは、通常、母親と胎児の間の接合部分を形成し、胎児の母性拒絶の防止において役割を果たすと考えられる細胞の層である胎盤栄養膜において高度に発現される。胚または胎児の免疫拒絶のために自然流産の危険のある女性（たとえば、以前に自然流産したことがある女性または妊娠が困難である女性）は、このような相互作用を調節する作用剤で治療することができる。
【０１２９】
ＰＤ−１リガンド／Ｂ７ポリペプチド結合の調節によるか、あるいはＰＤ−１リガンド／ＰＤ−１結合の調節による免疫応答のダウンレギュレーションは、自家組織の自己免疫攻撃の治療においても有用である。たとえば、ＰＤ−１リガンドは、通常、心臓において高度に発現され、心臓を自己免疫攻撃から防御する。これは、Ｂａｌｂ／ｃＰＤ−１ノックアウトマウスが、血栓症の心臓に対して重い自己免疫攻撃を示すという事実により明らかにされる。したがって、自己免疫攻撃により引き起こされるかまたは悪化する状態（たとえば、この例においては、心臓病、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症）は、これらの相互作用の調節によって緩和または改善される。したがって、自己免疫疾患などの自己免疫攻撃によって悪化する状態（ならびに心臓病、心筋梗塞、およびアテローム性動脈硬化症）を調節することは本発明の範囲内である。
【０１３０】
４．免疫応答のアップレギュレーション
免疫応答のアップレギュレーションの手段として、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進すること（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用に影響を及ぼすことなく、あるいは阻害しながら）により、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の相互作用をブロックすることもまた治療的に有用である。Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８の間の相互作用を増強するためにＢ７ポリペプチドトＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックすることもまた免疫応答のアップレギュレーションに有用である。免疫応答のアップレギュレーションは、存在する免疫応答の増強または最初の免疫応答の顕在化という形態をとることができる。たとえば、本発明の組成物および方法を用いる免疫応答の増強は、微生物（たとえば、細菌、ウイルスまたは寄生虫）に対する感染の場合に有用である。１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤は、免疫応答の増強に用いられる。このような作用剤（たとえば、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合をブロックする非活性化抗体）は、抗体のアップレギュレーションおよび細胞媒介性応答が有益である状況において治療的に有用である。好ましい態様において、このような作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害することなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する（たとえば、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを妨げる相互作用）。疾患の例として、疱疹または帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患が挙げられ、このような場合、作用剤は皮膚に局所適用することができる。さらに、インフルエンザ、風邪および脳炎などの全身ウイルス性疾患は、このような作用剤の全身投与によって軽減される。
【０１３１】
別法として、免疫応答は、エキソビボアプローチ、たとえば、免疫細胞を患者から取りだし、免疫細胞をインビトロで、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤と接触させ、次いでインビとロ刺激免疫細胞を患者へ再度導入することにより、感染した患者において高めることができる。
所定の例において、免疫応答をアップレギュレートする他の作用剤、たとえば、免疫応答をさらに高めるように共刺激レセプターを経てシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーのメンバーの形態をさらに投与することが望ましい。
【０１３２】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤（たとえば、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を増強することによって）は、種々のポリペプチド（たとえば、病原体由来のポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に用いることができる。
病原体（たとえば、ウイルス）に対する免疫性を、適当なアジュバント中、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤と共にウイルスタンパク質でワクチン予防接種することにより誘導することができる。
【０１３３】
他の態様において、本明細書に記載するように、免疫応答機能のアップレギュレーションまたは増強は、腫瘍免疫原性の誘発に有用である。
他の態様において、免疫応答を、本明細書に記載の方法によって刺激して、先在している寛容に打ち勝つことができる。たとえば、被験者が有意な免疫応答を構築することができない抗原、たとえば、腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫応答は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤（たとえば、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を増強することによって）を投与することにより、誘導することができる。１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする可溶性ＰＤ−１または可溶性ＰＤ−１リガンドを用いて、たとえば腫瘍細胞に対する免疫応答を高めることができる。１つの態様において、腫瘍特異的抗原などの自己抗原を、併用投与することができる。他の態様において、免疫応答を抗原（たとえば、自己抗原）に対して刺激して、神経疾患を治療することができる。別の態様において、本発明作用剤をアジュバントとして用いて、活性免疫化のプロセスにおいて外来抗原への反応をブーストすることができる。
ることができる。
【０１３４】
１つの態様において、免疫細胞を被験者から得、エキソビボで、本明細書に記載の作用剤の存在下で培養して、免疫細胞集団を増殖させるか、または免疫細胞活性化を増強する。さらなる態様において、次いで、免疫細胞を被験者へ投与する。たとえば、免疫細胞へ一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルを当該分野で周知のごとく提供することにより、免疫細胞をインビトロで刺激することができる。種々の作用剤を用いて、免疫細胞の増殖を共刺激することもできる。１つの態様において、免疫細胞をＰＣＴ出願ＷＯ９４／２９４３６に記載の方法に従いエキソビボで培養する。共刺激ポリペプチドは可溶性であり、細胞膜結合へ結合、またはビーズなどの固体表面へ結合することができる。
【０１３５】
ＶＩ．作用剤の投与
本発明の免疫調節作用剤は、免疫細胞による免疫応答を増強させるかまたは抑制するかのいずれかのために、インビボの医薬的投与に適した生物学的に適合性の形態において被験者に投与される。「インビボ投与に適した生物学的に適合性の形態」とは、任意の有毒な影響よりもタンパク質の治療効果の方が重きをなす、投与されるタンパク質の形態を意味する。「被験者」なる用語は、免疫応答を惹起できる生きている生物、たとえば、哺乳動物を包含することを意図する。被験者の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種を包含する。本明細書に記載の作用剤の投与は、治療有効量の作用剤単独または医薬的に許容しうる担体との組み合わせを包含する薬理学的形態のいずれであってもよい。
【０１３６】
治療有効量の本発明の治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するために必要な用量および時間で有効な量として定義される。たとえば、抗ＰＤ−１リガンド調節作用剤の治療有効量は、個体の疾病の状態、年齢、性別、および体重ならびにペプチドが個体において所望の反応を惹起する能力によって変わり得る。投薬計画は、最適の治療反応を提供するように調節できる。たとえば、いくつかに分割された用量を毎日投与することができ、または治療状況の緊急性により、比例して減少させることができる。
【０１３７】
本明細書に記載した作用剤は、都合のよい様式、たとえば、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与により投与することができる。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を酵素、酸および化合物を不活化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護するために物質中でコーティングすることができる。たとえば、経口投与以外によって作用剤を投与するためには、ペプチドをその不活化を防止する作用剤でコーティングするか、またはペプチドを該作用剤と共に同時投与するのが望ましい。
【０１３８】
作用剤は、個体に、適当な担体、希釈剤またはアジュバント中で投与することができ、酵素阻害剤と同時投与することができ、またはリポソームなどの適当な担体中で投与することができる。医薬的に許容しうる希釈剤は、塩溶液および水性緩衝溶液を包含する。アジュバントはその最も広い意味で用いられ、任意の免疫刺激化合物、たとえばインターフェロンを包含する。本発明において意図されるアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを包含する。酵素阻害剤は、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＥＰ）およびトラシロールを包含する。リポソームは、水中油中水エマルジョンならびに慣用のリポソームを包含する（Sternaら(1984)J.Neuroimmunol.7:27）。
【０１３９】
作用剤は、非経口または腹腔内投与することができる。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油中においても調製できる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の成長を防止するための保存料を含んでもよい。
注射可能な用途に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用滅菌粉末を包含する。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を通過する程度まで流動性でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒体である。適当な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の活動の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合において、等張剤、たとえば、糖、ポリアルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが好ましい。組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、たとえばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることにより、注射可能な組成物の長期にわたる吸収がもたらされる。
【０１４０】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、前記の成分の一つまたは組み合わせと共に必要な量の本発明作用剤（たとえば、抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子）を適当な溶媒中に組み入れることにより調製でき、続いて濾過滅菌する。一般に、活性化合物を、塩基性分散媒体および前記のものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み入れることにより、分散液を調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合において、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分（たとえば、ペプチド）の粉末とあらかじめ濾過滅菌された溶液から得られる追加の所望の成分が得られる。
【０１４１】
前記のように、作用剤が適当に保護される場合、タンパク質を、たとえば不活性希釈剤または同化できる可食担体と共に経口投与できる。本明細書において使用する「医薬的に許容しうる担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。医薬的活性な作用剤についてのこのような媒体および作用剤の使用は、当業界において周知である。任意の慣用の媒体または作用剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用を意図する。補足的活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０１４２】
投与の簡便性および投与量の均一性のために、単位投与剤形の非経口組成物に製剤するのが特に有用である。本発明において使用される「単位投与剤形」とは、処置される哺乳動物被験者の単位投与量として適した物理的に独立した単位を意味し；各単位は所望の治療効果を生じるために計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を必要とされる医薬担体と組み合わせて含む。本発明の単位投与剤形の明細は、（ａ）活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性を治療するためのかかる活性化合物を配合する分野に固有の制限により決定され、直接従属する。
【０１４３】
本発明の１つの態様において、本発明の作用剤は抗体である。本明細書において定義するとおり、治療有効量（すなわち、有効量）の抗体は、約０.００１〜３０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０.０１〜２５ｍｇ／体重ｋｇ、さらに好ましくは約０.１〜２０ｍ／体重ｋｇ、なおいっそう好ましくは約１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、２〜９ｍｇ／体重ｋｇ、３〜８ｍｇ／体重ｋｇ、４〜７ｍｇ／体重ｋｇ、または５〜６ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。当業者らは、疾患または障害の重篤度、以前の治療、被験者の全般的健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を包含するが、これらに限定されないある因子が、被験者を有効に治療するために必要な用量に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の抗体での被験者の治療は、１回の処置を包含するか、または好ましくは一連の処置を包含しうる。好ましい例において、被験者は、約０.１〜２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲の抗体で、１週間に１回約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、さらに好ましくは約３〜７週間、なおいっそう好ましくは約４、５、または６週間処置される。当然のことながら、処置に使用される抗体の有効量は、特定の治療の過程にわたって増加または減少されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】１Ｇ１０（抗Ｂ７−１）抗体、１０Ｆ．９Ｇ２（抗ＰＤ−１）抗体、１０Ｆ．２Ｈ１１（抗ＰＤ−１）抗体およびＰＤ−１ Ｉｇポリペプチドの存在または不在下において、ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞のＢ７−１ Ｉｇへの結合を表すデータの棒グラフである。
【図２】１０Ｆ．９Ｇ２抗体の存在または不在下において、ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞のＰＤ−１ Ｉｇへの結合を表すデータの棒グラフである。データは、１０Ｆ．９Ｇ２抗体が、この相互作用を阻害することを示す。
【図３】ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞のＢ７−１およびＢ７−２への結合を表すデータの棒グラフである。ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞へのＢ７―１およびＢ７−２の結合能力の比較を表す。
【図４】ＦＡＣＳ分析によって得られたデータのグラフ表示であり、マウスＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２へのマウスＰＤ−１結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４５】
本発明を以下の限定的と考えるべきでない実施例によりさらに説明する。本出願全体にわたって引用される全ての文献、特許および公開特許出願ならびに図面は、全体を参考文献として本発明に援用される。
【実施例１】
【０１４６】
結合パートナーとしてのＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドの同定
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４以外の新規Ｂ７−１結合パートナーを同定するために、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４欠損マウス由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｐＡＸＥＦ哺乳類発現ベクターにおけるマウスｃＤＮＡライブラリーを、ＣＤ２８欠損、ＣＴＬＡ４欠損１２９株マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞から調製したＲＮＡから作製した。ＭＡＣＳによって、フローサイトメトリーで確認される純度９５％以上までＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。抗ＣＤ３ｍＡｂ＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）で、Ｔ細胞を活性化した。ＣＤ２８欠損、ＣＴＬＡ４欠損１２９株マウスのＴ−枯渇脾細胞からのＡＰＣを、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０ｍＡｂ３／２３で一夜刺激し、次いで、マイトマイシンＣで処理し（５０μｇ／ｍｌ、３７℃にて４０分間）、洗浄して、Ｔ細胞の刺激に用いた。１６、２４および４０時間後、ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーの製造のために合わせた。
【０１４７】
選択の第１ラウンドのために、８０プレートのＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン操作により、１００ｍｍディッシュ当たり０.２ｇのプラスミドライブラリーＤＮＡでトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理し、翌日リプレートし、４５時間後にＰＢＳ中の０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％アジ化ナトリウムで細胞を採集した。Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ９.５中の１０ｍｌの１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を入れた１００ｍｍのペトリ皿を室温にて１.５時間インキュベートすることによって、パニングプレートを調製した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ＋５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中で一夜ブロックした。次いで、プレートを３ｍｌの１０μｇ／ｍｌマウスＢ７−１−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ、２％ＦＣＳで３回洗浄した。８０プレートからのトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を８パニングプレート上でインキュベートした。室温にて２時間後、プレートをＰＢＳ中の０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％アジ化ナトリウム、２％ＦＣＳで３回洗浄し、０.１５Ｍ ＮａＣｌ中の０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１％ＦＣＳで２回洗浄した。付着細胞からエピソームＤＮＡを調製し、電気穿孔によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に再導入し、スフェロプラストのポリエチレングリコールによる融合によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトさせ、パニングを繰り返す。付着細胞からエピソームＤＮＡを調製し、電気穿孔によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に再導入し、スフェロプラストのポリエチレングリコールによる融合によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトさせ、３回目のパニングを繰り返す。個々のプラスミドＤＮＡを調製し、配列決定した。すべてのプラスミド（配列決定された６個）は、マウスＰＤ−Ｌ１をコードするｃＤＮＡを含むことが見出された。ｃＤＮＡクローンは、５’非翻訳領域の長さにおいてわずかに異なり、ＰＤ−Ｌ１遺伝子が独立して複数回単離されたことを示し、したがって、先に実験室で生成されたクローンの偶発的な単離の可能性が排除された。これらのマウスＰＤ−Ｌ１ ｃＤＮＡクローンを、ＤＥＡＥ−デキストラン操作（４μｇ／１００ｍｍディッシュ）によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、７２時間後に間接的免疫蛍光法およびフローサイトメトリーによってマウスＢ７−１−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質の細胞表面結合を分析した
【実施例２】
【０１４８】
ＰＤ−１リガンド分子のＢ７分子への結合
マウスプレＢ細胞(300.19)を、ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）ベクター、またはｐＡＸＥＦベクターにマウスＰＤ−Ｌ１ ｃＤＮＡを含む発現プラスミドのいずれかで、プロマイシン耐性をコードするプラスミドとともにトランスフェクトした。１０μｇ／ｍｌのプロマイシンを含む培地中で細胞を選択し、ＰＤ−１−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質で染色し、分別し、サブクローニングした。さらなる分析のために、ＰＤ−Ｌ１を高レベルで発現しているクローンを選択した。
３００．１９トランスフェクト体(２.５ｍｌの培地中、５Ｘ１０６細胞)を２.５μｌのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(分子プローブ、ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌ、２’,７’−（ビス−２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン）)で３７℃にて５分間標識した。細胞を２回洗浄し、ウエル当たり５００００細胞／５０μｌを用いた。
【０１４９】
Linbro９６ウエルマイクロタイタープレート（組織培養処置をしていない）を、１００μｌのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体で、４℃にて一夜コーティングした。プレートを吸引し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで２時間ブロックした。次いで、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇ、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２ＩｇまたはＰＤ−１Ｉｇ０.１ｍｌとともにウエルをインキュベートした。５００００ＢＣＥＣＦ−Ａ標識トランスフェクト細胞を、ブロッカーの存在または不在下に加えた。テストしたブロッカーは、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇ、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＰＤ−１Ｉｇ、１Ｇ１０抗体（マウスＢ７−１に結合し、ＣＴＬＡ４との相互作用をブロックする）、１６−１０Ａ１抗体（マウスＢ７−１に結合し、ＣＴＬＡ４との相互作用をブロックする）、１０Ｆ．９Ｇ２抗体（マウスＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１との相互作用をブロックする）および１０Ｆ．２Ｈ１１抗体（マウスＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１との相互作用をブロックする）であった。プレートを７００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、室温で３０分間インキュベートした。各ウエルにおける蛍光（細胞数を示す）を蛍光プレートリーダーで測定した。プレートをディッシュに入れた大量の１％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸し、プレートをゆるやかに反転させ、次いで、室温にて３０分間１ｇで付着細胞を落とすことによって、プレートを１回洗浄した。次いで、洗浄を繰り返した。次いで、プレートをもとどおりにし、各ウエルにおける蛍光（細胞数を示す）を蛍光プレートリーダーで測定した。プレートに結合した細胞のパーセントを決定した。ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、Ｂ７―１Ｉｇプレートに結合したが、Ｂ７―２Ｉｇプレートには結合しなかった。コントロールＩｇもＣＴＬＡ４Ｉｇも、この結合相互反応に競合しなかった（図１）。対照的に、１Ｇ１０、１０Ｆ．９Ｇ２および１０Ｆ．２Ｈ１１抗体ならびに各ＰＤ−１Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１／Ｂ７―１Ｉｇ相互作用の結合に競合し、細胞結合を減少させた（図２）。コントロール実験において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、ＰＤ−１Ｉｇコーティングしたプレートへの結合を示した（図２）。コントロールＩｇ、ＰＤ−１Ｉｇおよび１０Ｆ．２Ｈ１１抗体はすべて、このアッセイにおいて結合に対して競合できなかった（図２）。１０Ｆ．９Ｇ２抗体のみが、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用に対して競合し、細胞結合を減少させた（図２）。
【実施例３】
【０１５０】
ＰＤ−１リガンド分子のＦＡＣＳ分析
３００.１９細胞を、ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）ベクターまたはＩＣＯＳリガンド、ｍＰＤ−Ｌ１またはｍＰＤ−Ｌ２ｃＤＮＡを含む発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。
細胞をｍＩｇＧ２ａ、ｍＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ａ、ｍＢ７−１−ＩｇＧ２ａ、ｍＢ７−２−ＩｇＧ２ａまたはｍＰＤ−１−ＩｇＧ２ａ（０.１ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）とともに４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ＋０.０２％アジ化ナトリウムおよび２％ＦＢＳ)で洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗ｍＩｇＧ２ａ抗体（０.１ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）(Southern Biotech Associates)とともにインキュベートした。ＦＡＣＳ分析を用いて免疫蛍光について細胞を分析し、結果を図４に示した（図４における数は、平均蛍光強度を示す）。ＩＣＯＳリガンドまたはコントロール細胞への結合はなかった。ＰＤ−Ｌ１細胞は、ｍＰＤ−１−ＩｇＧ２ａおよびｍＢ７−１−ＩｇＧ２ａに結合したが、ｍＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ａまたはｍＢ７−２−ＩｇＧ２ａには結合しなかった。ＰＤ−Ｌ２細胞はｍＰＤ−１−ＩｇＧ２ａおよびｍＢ７−１−ＩｇＧ２ａに結合した（弱く）が、ｍＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ａまたはｍＢ７−２−ＩｇＧ２ａには結合しなかった（図４）。
【技術分野】
【０００１】
（政府財源）
【０００２】
本明細書に開示される発明は、国立衛生研究所により授与されたAI39671、CA84500およびAI41584下にサポートされた。合衆国政府は、それゆえ、本発明の所定の権利を有し得る。
（関連出願）
【０００３】
本発明は、2001年11月13日に提出されたU.S.S.N.60/337,817について優先権を主張する。この出願は、本明細書中に、その全体が引用により組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞が外来ポリペプチドに応答するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により休止Ｔリンパ球に２つのシグナルが提供されなくてはならない（Jenkins, M.およびSchwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller, D.L.ら(1990) J. Immunol. 144:3701-3709）。最初のシグナルは、免疫応答に特異性を付与するものであり、主要組織適合抗原系において提示された外来抗原の認識後にＴ細胞受容体を介して伝達される。次のシグナルは、共刺激と呼ばれるものであり、Ｔ細胞が増殖し、機能的となることを誘導する（Lenschowら(1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233）。共刺激は、抗原特異的でもなく、ＭＨＣにより制限されず、ＡＰＣｓにより発現される１またはそれ以上の異なる表面ポリペプチドにより提供されると考えられている（Jenkins, M.K.ら(1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P.S.ら(1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C.D.ら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; Young, J.W.ら(1992) J. Clin. Invest. 90:229-237; Koulova, L.ら(1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Reiser, H.ら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:271-275; van-Seventer, G.A.ら(1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle, J.M.ら(1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M.I.ら(1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R.J.ら(1992) Nature 357:80-82; Liu, Y.ら(1992) J. Exp. Med. 175:437-445）。
【０００５】
ＡＰＣｓ上に発現されるＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）タンパク質は、重要な共刺激ポリペプチドである（Freemanら(1991) J. Exp. Med. 174:625; Freemanら(1989) J. Immunol. 143:2714; Azumaら(1993) Nature 366:76; Freemanら(1993) Science 262:909）。Ｂ７−２は、一次免疫応答において主な役割を果たしていると思われ、Ｂ７−１は、免疫応答の後期にアップレギュレーションされるものであり、一次Ｔ細胞応答の延長あるいは二次Ｔ細胞応答の共刺激に重要である可能性がある（Bluestone (1995) Immunity 2:555）。
【０００６】
Ｂ７−１およびＢ７−２が結合する１つのリガンドであるＣＤ２８は、休止Ｔ細胞上に構成的に発現され、活性化後の発現において増加する。Ｔ細胞受容体を介するシグナリング後、ＣＤ２８と同時シグナルの伝達との連結により、Ｔ細胞の増殖およびＩＬ−２分泌が誘導される（Linsley, P.S.ら(1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C.D.ら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; June, C.H.ら(1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F.A.ら(1992) Nature 356:607-609）。ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と呼ばれる第２のリガンドは、ＣＤ２８と相同的であるが、休止Ｔ細胞上には発現されず、Ｔ細胞活性化後に出現する（Brunet, J.F.ら(1987) Nature 328:267-270）。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞応答の負の調節に重要であると思われている（Waterhouseら(1995) Science 270:985）。ＣＴＬＡ４のブロックは、阻害シグナルを除去することがわかっているが、ＣＴＬＡ４の凝集は、Ｔ細胞応答をダウンレギュレーションする阻害シグナルを提供することがわかっている（Allison and Krummel (1995) Science 270:932）。Ｂ７分子は、ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ４に対して高いアフィニティーを有し（Linsley, P.S.ら(1991) J. Exp. Med. 174:561-569）、Ｂ７−１およびＢ７−２は、ＣＴＬＡ４分子の異なる領域に結合し、ＣＴＬＡ４への結合に関して異なるキネティクスを有することがわかっている（Linsleyら(1994) Immunity 1:793）。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に関連している新たな分子ＩＣＯＳが、そのリガンドを有するものとして同定されており（Hutloffら(1999) Nature 397:263; WO 98/38216）、ＩＣＯＳは、Ｂ７ファミリーの新たなメンバーである（Aicher A.ら(2000) J. Immunol. 164:4689-96; Mages H.W.ら(2000) Eur. J. Immunol. 30:1040-7; Brodie D.ら(2000) Curr. Biol. 10:333-6; Ling V.ら(2000) J. Immunol. 164:1653-7; Yoshinaga S.K.ら(1999) Nature 402:827-32）。Ｔ細胞が、さらなる共刺激シグナルを受け取ることなくＴ細胞受容体を介して刺激されるだけならば、それらは、無応答性で、アネルギー性となり、あるいは死滅して免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こすようになる。
【０００７】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性は、インビトロといくつかのインビボモデルシステムにおいて証明されている。この共刺激経路をブロックすると、マウスおよびヒト系において抗原特異的な寛容が発生する（Harding,F.A.ら(1992)Nature356:607-609;Lenschow,D.J.ら(1992)Science257:789-792;Turka,L.A.ら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11102-11105;Gimmi,C.D.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6586-6590;Boussiotis,V.ら(1993)J.Exp.Med.178:1753-1763)。反対に、Ｂ７ネガティブなマウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶および腫瘍攻撃に対する長期間持続する防御を伴うＴ細胞により媒介される特異的免疫を誘導する(Chen,L.ら(1992)Cell71:1093-1102;Townsend,S.E.およびAllison,J.P.(1993)Science259:368-370;Baskar,S.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci90:5687-5690)。
【０００８】
共刺激ポリペプチドに結合する阻害受容体も免疫細胞上において同定されている。たとえば、ＣＴＬＡ４の活性化は、Ｔ細胞に負のシグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４を用いることは、ＩＬ−２産生を阻害し、細胞周期停止を誘導することができる（KrummelおよびAllison (1996) J. Exp. Med. 183:2533）。さらに、ＣＴＬＡ４欠損マウスは、リンパ球増殖性の疾病を発症する（Tivolら(1995) Immunity 3:541; Waterhouseら(1995) Science 270:985）。抗体でのＣＴＬＡ４のブロックは、阻害シグナルを除去する可能性があり、抗体とのＣＴＬＡ４の凝集は、阻害シグナルを伝達する。それゆえ、共刺激ポリペプチドが結合する受容体に応じて（すなわち、ＣＤ２８などの共刺激受容体またはＣＴＬＡ４などの阻害受容体）、Ｂ７−４を包含するＢ７ポリペプチドは、Ｔ細胞共刺激または阻害を促進することができる。
【０００９】
ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する受容体として同定されている。ＰＤ−１は、免疫グロブリン遺伝スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１（Ishidaら(1992) EMBO J. 11:3887; Shinoharaら(1994) Genomics 23:704; U.S. Patent 5,698,520）は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメインを含む細胞外領域、ならびに免疫受容体チロシンキナーゼに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域を有している（Ishidaら(1992) supra; Shinoharaら(1994) supra; US Patent 5,698,520）。これらの特徴は、免疫阻害受容体と呼ばれるポリペプチドのより大きなファミリーも定義し、該ファミリーは、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂおよびキラー阻害受容体（ＫＩＲｓ）をも包含する（Vivier and Daeron (1997) Immunology Today 18:286）。これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフが、阻害シグナルを誘導するＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼと相互作用すると仮定されることが多い。これらの免疫阻害受容体の一部のものは、ＭＨＣポリペプチド、たとえばＫＩＲｓに結合し、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７−１およびＢ７−２に結合する。ＭＨＣとＢ７遺伝子との間に系統発生的関連性があると提案されている（Henryら(1999) Immunology Today 20:285-8）。
【００１０】
ＰＤ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ishidaら(1992) EMBO J. 11:3887; Shinoharaら(1994) Genomics 23:704; およびU.S. Patent 5,698,520にて公開されている。ＰＤ−１は、以前、アポトーシス性細胞死に関与するタンパク質に対する選択のためのアプローチに基づく引き算クローニングを用いて同定された。本明細書において、ＰＤ−１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのポリペプチドのメンバーとして同定される。ＣＴＬＡ４のように、ＰＤ−１は、抗ＣＤ３に応答して、Ｔ細胞の表面において迅速に誘発される(Agataら(1996) Int. Immunol. 8:765)。しかし、ＣＴＬＡ４とは逆に、ＰＤ−１は、Ｂ細胞の表面においても誘発される(抗ＩｇＭに応答して)。ＰＤ−１は、一部の胸腺細胞および骨髄細胞においても発現する(Agataら(1996) 前記; Nishimuraら(1996) Int. Immunol. 8:773)。
【００１１】
２つのタイプのヒトＰＤ−１リガンドポリペプチドが同定されている。ＰＤ−１リガンドタンパク質は、シグナル配列、およびＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、膜貫通ドメインならびに短い細胞質尾部を含む。ＰＤ−Ｌ１(配列データについては、Freemanら(2000) J. Exp. Med. 192:1027を参照)およびＰＤ−Ｌ２(配列データについては、 Latchmanら(2001) Nat. Immunol. 2:261を参照)の両方は、Ｂ７ファミリーのポリペプチドのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺および心臓で発現する。ＰＤ−Ｌ２のみが、膵臓、肺および肝臓で発現し、一方、ＰＤ−Ｌ１のみが胎児肝臓で発現する。両方のＰＤ−１リガンドが、活性化された単球および樹状細胞においてアップレギュレートされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合するという事実から、ＰＤ−１がＣＴＬＡ４をもつ阻害受容体のファミリーに置かれる。共刺激受容体を用いることにより、免疫細胞において共刺激シグナルがもたらされるが、たとえば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１などの阻害受容体を用いることにより（架橋または凝集によるなど）、免疫細胞において阻害シグナルの伝達が行われ、免疫細胞応答の下方調節（downmodulation）および／または免疫細胞アネルギーがもたらされる。阻害シグナルの伝達は、免疫細胞応答における下方調節を導く（そして、すべての免疫応答における下方調節がもたらされる）が、免疫細胞における阻害シグナルの阻止（ＰＤ−１に対する非活性化抗体の使用によるなど）は、免疫細胞応答の上方調節を導く（そして、免疫応答の上方調節がもたらされる）。免疫応答の調節に有用なさらなる作用剤の同定は、おおいなる利点となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、少なくとも一部は、ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−１を結合することに加えて、Ｂ７−１に結合するという発見に基づく。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ４と同様に負のシグナルを免疫細胞に伝達する。ＰＤ−１リガンドポリペプチドは、抗原提示細胞の表面上に発現され、共刺激シグナルを免疫細胞に提供するか、またはこれらが結合するポリペプチドに応じて、免疫細胞に下方調節シグナルを伝達することができる。たとえば、ＰＤ−１に結合するＰＤ−１リガンドは、負のシグナルを伝達するが、Ｂ７ポリペプチドに結合するＰＤ−１リガンドは、伝達しない。したがって、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節の結果、免疫応答が調節される。
【００１４】
したがって、本発明の１つの態様は、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する方法に関する。該方法は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＢ７ポリペプチドをもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤と接触させることを含む。１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドポリペプチドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを妨げ、したがって、阻害免疫シグナルの伝達を阻害する。１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を阻止することができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供して、シグナル伝達阻害を強化する。
【００１５】
Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、ＰＤ−Ｌ１は、阻害受容体ＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合も低下させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４に結合するのを可能にして、免疫細胞に阻害シグナルを提供し、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合を促進する作用剤は、ＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合を阻害し、したがって、負のシグナルを阻害する。
【００１６】
１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、ＰＤ−１リガンドは、共刺激受容体ＣＤ２８へのＢ７ポリペプチドの結合も低下させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８に結合するのを可能にして、免疫細胞に共刺激シグナルを提供し、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合を促進する作用剤は、ＣＤ２８へのＢ７ポリペプチドの結合を阻害し、したがって、共刺激シグナルを阻害する。
【００１７】
したがって、本発明の１つの態様は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＢ７ポリペプチドをもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節(阻害または刺激)する作用剤と接触させることによって、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節(阻害または刺激)することを含む、免疫応答を調節(阻害または刺激)する方法に関する。
１つの態様において、作用剤は、抗ＰＤ−１リガンド抗体である。
１つの態様において、作用剤は、抗Ｂ７―１抗体である。
１つの態様において、作用剤は、小分子である。
１つの態様において、作用剤は、ペプチドである。
１つの態様において、作用剤は、融合タンパク質である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞またはＰＤ−１をもつ免疫細胞を、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻害する作用剤と接触させることによって、免疫応答を調節することを含む、免疫応答を調節する方法に関する。
１つの態様において、作用剤は、抗ＰＤ−１リガンド抗体、抗ＰＤ−１抗体、ペプチドまたは小分子であり、ここで、作用剤は、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害しない。
１つの態様において、ＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ１である。
１つの態様において、ＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ２である。
１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドは、Ｂ７−１である。
【００１９】
本発明の別の態様は、第１または第２免疫細胞をＰＤ−１リガンドと接触させることによって免疫応答を調節することを含む、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドと第２免疫細胞上のＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、Ｂ７ポリペプチドをもつ免疫細胞またはＣＴＬＡ４ポリペプチドをもつ免疫細胞を、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４ポリペプチドの間の相互作用を阻害するが、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害しない作用剤と接触させることによって、免疫応答を調節することを含む、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、第１または第２免疫細胞をＰＤ−１リガンドと接触させることによって免疫応答を調節することを含む、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドと第２免疫細胞上のＣＤ２８の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、Ｂ７ポリペプチドをもつ免疫細胞またはＣＤ２８をもつ免疫細胞を、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８の間の相互作用を阻害するが、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害しない作用剤と接触させることによって、免疫応答を調節することを含む、免疫応答を調節する方法に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤をスクリーニングし、スクリーニングにおいて同定された作用剤がＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定することを含む、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法に関する［ここで、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用に影響を及ぼさない(たとえば、阻害しない)ことが決定される、スクリーニングにおいて同定される作用剤は、免疫応答を調節する作用剤として同定される］。
【００２４】
本発明の別の態様は、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害する作用剤をスクリーニングし、スクリーニングにおいて同定された作用剤がＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定することを含む、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法に関する［ここで、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用に影響を及ぼさない(たとえば、阻害しない)ことが決定されるが、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害しない、スクリーニングにおいて同定される作用剤は、免疫応答を調節する作用剤として同定される］。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤をスクリーニングし、スクリーニングにおいて同定された作用剤がＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定することを含む、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法に関する［ここで、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用に影響を及ぼさない(たとえば、阻害しない)ことが決定される、スクリーニングにおいて同定される作用剤は、免疫応答を調節する作用剤として同定される］。
【００２６】
（発明の詳細な記載）
Ｉ．定義
本明細書で用いる用語「調節する」は、たとえば、応答を増強または阻害するといったようなアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを包含する。
本明細書で用いる用語「阻害する」は、特定の作用、機能または相互作用などの減少、制限または封鎖を包含する。
本明細書で用いる用語「免疫細胞」は、免疫応答において役割を演じる細胞を意味する。免疫細胞は、造血起源のものであり、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄細胞を包含する。
本明細書で用いる用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を包含する。用語「Ｔ細胞」はさらに、ヘルパーＴ細胞１タイプおよびヘルパーＴ細胞２タイプの両方を包含する。用語「抗原提示細胞」は、プロフェッショナル抗原提示細胞（たとえば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（たとえば、ケラチン生成細胞、内皮細胞、星状細胞、繊維芽細胞、乏突起膠細胞）を包含する。
【００２７】
本明細書で用いる用語「免疫応答」は、Ｔ細胞共刺激の調節により影響を受けるＴ細胞性および／またはＢ細胞性免疫応答を包含する。免疫応答の例は、Ｔ細胞応答、たとえば、サイトカイン産生および細胞毒性を包含する。加えて、免疫応答は、抗体産生（液性応答）などのＴ細胞活性化およびマクロファージの活性化などのサイトカイン反応性細胞の活性化により間接的に影響を受ける免疫応答を包含する。
【００２８】
本明細書で用いる用語「共刺激受容体」は、免疫細胞に共刺激シグナルを伝達する受容体、たとえばＣＤ２８を包含する。本明細書で用いる用語「阻害受容体」は、負のシグナルを免疫細胞に伝達する受容体（たとえば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）を包含する。阻害受容体により変換される阻害シグナルは、共刺激受容体（たとえばＣＤ２８）が免疫細胞上に存在しなくても、したがって阻害受容体と共刺激受容体の間の共刺激ポリペプチドの結合に関する競合の関係でなくとも生じ得る(Fallarinoら(1998)J.Exp.Med.188:205)。阻害シグナルの免疫細胞への伝達は、免疫細胞における不応答性またはアネルギーまたはプログラムされた死をもたらし得る。好ましくは、阻害シグナルの伝達は、アポトーシスに関与しないメカニズムにより作動する。本明細書で用いる用語「アポトーシス」は、当業界において公知の技術を用いて特徴づけることができるプログラムされた細胞死を包含する。アポトーシス細胞死は、たとえば、細胞収縮、膜水疱および細胞断片化において最高に達しているクロマチン凝縮により特徴づけることができる。アポトーシスを受ける細胞は、ヌクレオソーム間ＤＮＡ開裂の特徴的なパターンも示す。
【００２９】
受容体と結合するＰＤ−１リガンドポリペプチドの形態に応じて、たとえば受容体への結合について活性化型のＰＤ−１リガンドポリペプチドと競合することによって、シグナルが伝達され得るか（たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドの多価型または受容体の架橋をもたらすＦｃ受容体に結合するＰＤ−１リガンドポリペプチドの形態）、またはシグナルが阻害され得るか（たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドの可溶性多価型またはＦｃ受容体を欠失しているＰＤ−１リガンドポリペプチドの形態により）のいずれかである。しかしながら、可溶性ポリペプチドが刺激性であり得る例もある。調節作用剤の効果は、本明細書に記載するような慣例的なスクリーニングアッセイを用いて容易に証明することができる。
【００３０】
本明細書で用いる用語、活性化された免疫細胞に関する「共刺激」は、共刺激ポリペプチドが、増殖またはエフェクター機能を誘発する第二の非活性化受容体性シグナル（「共刺激シグナル」）を提供する能力を包含する。たとえば、共刺激シグナルの結果として、サイトカインがたとえばＴ細胞受容体性シグナルを受容したＴ細胞において分泌され得る。細胞−受容体性シグナルを、たとえば活性化受容体を介して、受容した免疫細胞は、本明細書において「活性化免疫細胞」と称する。
【００３１】
本明細書で用いる用語「活性化受容体」は、抗原、複合化抗原（たとえばＭＨＣポリペプチドに関連して）を結合するか、または抗体と結合する免疫細胞受容体を包含する。かかる活性化受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体、およびＦｃ受容体を包含する。
Ｔ細胞受容体はＴ細胞上に存在し、ＣＤ３ポリペプチドと関連する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣポリペプチドに関連する抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）刺激される。ＴＣＲを介したＴ細胞活性化の結果、タンパク質リン酸化、膜脂質変化、イオン流入、環状ヌクレオチド変化、ＲＮＡ転写変化、タンパク質合成変化および細胞体積変化などの種々の変化が生じる。
【００３２】
Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞上に存在する。Ｂ細胞抗原受容体は膜Ｉｇ（ｍＩｇ）と他の膜貫通ポリペプチド（たとえば、ＩｇαおよびＩｇβ）間の複合体である。ｍＩｇのシグナルトランスダクション機能は、オリゴマーまたはマルチマー抗原による受容体ポリペプチドの架橋により引き起こされる。Ｂ細胞は、抗免疫グロブリン抗体によっても活性化されうる。ＢＣＲ活性化により、Ｂ細胞においてチロシンリン酸化を含む多くの変化が起こる。
Ｆｃ受容体は、免疫応答に関与する多くの細胞上で見いだされる。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は免疫グロブリンポリペプチド（Ｉｇ）のＦｃ部分の細胞表面受容体である。現在のところ同定されているヒトＦｃＲには、ＩｇＧ（ＦｃγＲと称する）、ＩｇＥ（ＦｃεＲ１）、ＩｇＡ（Ｆｃα）、および重合ＩｇＭ／Ａ（ＦｃμαＲ）を認識するものが含まれる。ＦｃＲは次の細胞タイプにおいて見いだされる：ＦｃεＲＩ（肥満細胞）、ＦｃεＲ．ＩＩ（多くのリンパ球）、ＦｃαＲ（好中球）、およびＦｃμαＲ（腺上皮、肝細胞）(Hogg,N.(1988)Immunol.Today9:185-86)。広く研究されているＦｃγＲは細胞性免疫防御の中心であり、炎症のメディエーターおよび自己免疫疾患の発生機序に関与する加水分解酵素の放出の刺激の原因である(Unkeless,J.C.ら(1988)Annu.Rev.Immunol.6:251-81)。マクロファージ／単球、多形核白血球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃγＲはＩｇＧにより媒介される特異的認識の要素を賦与するので、ＦｃγＲはエフェクター細胞とＩｇを放出するリンパ球間の非常に重要な結合を提供する。ヒト白血球はＩｇＧ：ｈＦｃγＲＩ（単球／マクロファージ上に見いだされる）、ｈＦｃγＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、おそらくはＢ細胞、およびＫ５６２細胞系上）、およびＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージ上）の少なくとも３つの異なる受容体を有する。
【００３３】
Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞に対する共刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡにより阻害されないシグナリング経路を含む。加えて、共刺激シグナルはＴ細胞においてサイトカイン分泌（たとえば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１０）および／または抗原に対する不応答性の誘発、アネルギーの誘発、Ｔ細胞における細胞死の誘発を防止することができる。
【００３４】
本明細書で用いる用語「阻害シグナル」は、免疫細胞上のポリペプチドについて阻害受容体（たとえばＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）により伝達されるシグナルを意味する。かかるシグナルは、活性化受容体（たとえば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃポリペプチドによる）を介するシグナルを拮抗し、その結果、たとえば第二のメッセンジャー生成の阻害；増殖の阻害；免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、たとえば食作用の低下、抗体産生の低下、細胞毒性の低下、免疫細胞がメディエーター（たとえば、サイトカイン（たとえばＩＬ−２）および／またはアレルギー反応のメディエーター）を産生できないこと；またはアネルギーの発生が起こる。
【００３５】
本明細書で用いる用語「不応答性」は、刺激、たとえば活性化受容体またはサイトカインによる刺激に対する免疫細胞の不応性を包含する。不応答性はたとえば、免疫抑制剤への暴露または高用量の抗原への暴露のために起こり得る。本明細書で用いる用語「アネルギー」または「寛容」は、活性化受容体媒介性刺激に対する不応性を包含する。かかる不応性は、一般に抗原特異的であり、寛容化している抗原への暴露が終わった後にも存続する。たとえば、Ｔ細胞におけるアネルギー（不応答性に対して）はサイトカイン、たとえばＩＬ−２がないことにより特徴づけられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に暴露され、第二シグナル（共刺激シグナル）の不在下で第一シグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３媒介性シグナル）を受容する場合に起こる。これらの条件下で、細胞を同じ抗原に再暴露すると（暴露が共刺激ポリペプチドの存在下で起こる場合でも）、結果としてサイトカインが産生されず、したがって増殖しない。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、関連しない抗原に対する応答を起こし、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−２）とともに培養するならば増殖し得る。たとえば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡにより測定されるようなＴリンパ球によるＩＬ−２産生がないこと、あるいはインジケーター細胞系を用いる増殖分析によりを観察できる。別法として、レポーター遺伝子構築物を用いることができる。たとえば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下でヘテロローガスなプロモーターによるか、またはエンハンサー内に見いだすことができるＡＰ１配列のマルチマーにより誘発されるＩＬ−２遺伝子転写を開始しない(Kangら、(1992)Science257:1134)。
【００３６】
ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドは、ある種の保存された構造的および機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーを含む。同様に、ＰＤ−１タンパク質は、保存された構造的および機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーのメンバーである。「ファミリー」は、タンパク質または核酸分子についていう場合、共通の構造的ドメインまたはモチーフを有し、本明細書において定義するような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する２以上のタンパク質または核酸分子を意味することを意図される。このようなファミリーメンバーは、天然に存在するかまたは天然に存在せず、同じまたは異なる種のいずれかから得ることができる。たとえば、ファミリーはヒト起源の第一のタンパク質、ならびに他のヒト起源の異なるタンパク質を含むことができるか、あるいは別に、ヒト以外の起源の相同物を含むことができる。ファミリーのメンバーはさらに共通の機能的特徴を有し得る。本明細書において記載するＰＤ−１リガンドポリペプチドはポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである。本明細書で用いる用語「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７ポリペプチド」は、Ｂ７ポリペプチド、たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ｈ(Swallowら(1999)Immunity11:423)、および／またはＰＤ−１リガンド(たとえば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２)と配列相同性を共有する共刺激ポリペプチドを含む。たとえば、デフォルトのパラメータを用いてNCBIのBLASTプログラム（ギャップペナルティーが存在１１および拡張１に設定されたBlosurm６２マトリックス（NCBIウェブサイトを参照））を用いて比較した場合に、ヒトＢ７−１およびＢ７−２は約２６％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３７】
好ましいＢ７ポリペプチドは、免疫細胞に共刺激または阻害シグナルを提供でき、これにより免疫細胞応答を促進または阻害できる。たとえば、共刺激受容体と結合するＢ７ファミリーメンバーは、Ｔ細胞活性化を増加させるが、阻害受容体と結合するＢ７ファミリーメンバーは、共刺激を減少させる。さらに、同じＢ７ファミリーメンバーは、Ｔ細胞共刺激を増加または減少させる。たとえば、共刺激受容体に結合する場合、ＰＤ−１リガンドは、免疫細胞の共刺激を誘発するか、またはたとえば溶解型において存在する場合に免疫細胞共刺激を阻害することができる。阻害受容体と結合する場合、ＰＤ−１リガンドポリペプチドは阻害シグナルを免疫細胞に伝達することができる。好ましいＢ７ファミリーのメンバーには、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ｈ、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２およびその可溶性フラグメントもしくは誘導体が含まれる。１つの態様において、Ｂ７ファミリーメンバーは、たとえば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１および／または他の受容体などの免疫細胞上の１つ以上の受容体に結合し、受容体に応じて、免疫細胞、好ましくはＴ細胞に阻害シグナルまたは共刺激シグナルを伝達する能力を有する。
【００３８】
ＰＤ−１ポリペプチドは、免疫細胞に阻害シグナルを伝達することによって、免疫細胞エフェクター機能を阻害する能力をもつか、またはたとえば、可溶性モノマー型で存在する場合に、免疫細胞の共刺激を促進する(たとえば、競合的阻害によって)能力をもつ阻害受容体である。好ましいＰＤ−１ファミリーメンバーは、ＰＤ−１と配列同一性を共有し、たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＰＤ−１リガンドおよび／または抗原提示細胞上の他のポリペプチドなどの１つ以上のＢ７ファミリーメンバーに結合する。
【００３９】
本明細書で用いるたとえば、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドなどのポリペプチドに関する用語「活性」は、このタンパク質の構造に固有の活性を包含する。ＰＤ−１リガンドに関して、用語「活性」は、免疫細胞共刺激を調節する能力（たとえば活性化免疫細胞において共刺激シグナルを調節することにより）、または免疫細胞における阻害シグナルを調節する能力（たとえば免疫細胞上のナチュラル受容体を用いることにより）を包含する。当業者であれば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドの活性化型が、共刺激受容体に結合する場合、免疫細胞内に共刺激シグナルが生成することを理解するであろう。ＰＤ−１リガンドポリペプチドの活性化型が、阻害受容体に結合する場合、免疫細胞内に阻害シグナルが生成する。ＰＤ−１リガンドがＢ７ポリペプチドに結合する場合、ＰＤ−１に結合しているＰＤ−１リガンドの阻害シグナルが阻害されるので、共刺激シグナルが生成する。
【００４０】
本明細書で用いる用語「ＰＤ−１リガンド」は、ＰＤ−Ｌ１(Freemanら(2000) J. Exp. Med. 192:1027)およびＰＤ−Ｌ２(Latchmanら(2001) Nat. Immunol. 2:261)の両方を包含する。
共刺激シグナルを調節すると、免疫細胞のエフェクター機能が調節される。したがって、「ＰＤ−１リガンド活性」なる用語は、ＰＤ−１リガンドポリペプチドがその天然の受容体（たとえば、ＰＤ−１またはＢ７−１など）と結合する能力、免疫細胞共刺激または阻害シグナルを調節する能力および免疫細胞応答を調節する能力を包含する。
【００４１】
ＰＤ−１に関して、用語「活性」は、ＰＤ−１ポリペプチドが、活性化免疫細胞において、たとえば抗原提示細胞上の天然のＰＤ−１リガンドを用いることにより阻害シグナルを調節する能力を包含する。ＰＤ−１は阻害シグナルをＣＴＬＡ４と同様の方法で免疫細胞に伝達する。免疫細胞において阻害シグナルを調節すると、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌が調節される。したがって、用語「ＰＤ−１活性」は、ＰＤ−１ポリペプチドがその天然のリガンドと結合する能力、免疫細胞共刺激または阻害シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力を包含する。
【００４２】
本明細書で用いる用語「相互作用」は、２つの分子間の相互作用を言う場合、１つの分子と他方の分子との物理的接触（たとえば、結合）を意味する。一般に、このような相互作用の結果として、その分子の一方または両方の活性（生物的効果を酸性する）が得られる。活性は、一方または両方の分子の直接的な活性である（たとえば、シグナルトランスダクション）。それとは別に、相互作用における一方または両方の分子をそれらのリガンドとの結合から阻止することができ、したがって、リガンド結合活性に関して不活性であることを保つことができる（たとえば、そのリガンドを結合し、共刺激を引き起こすか阻害する）。このような相互作用を阻害する結果として、一方または両方の分子の活性が破壊される。このような相互作用を増強することとは、物理的接触の可能性を延長または増強すること、あるいは活性の可能性を延長または増強することである。
【００４３】
本明細書で用いる「天然に存在する」核酸ポリペプチドは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（たとえば、天然のタンパク質をコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分ポリペプチドを意味する。
本明細書で用いる「アンチセンス」核酸ポリペプチドは、タンパク質をコードする「センス」核酸配列と相補性、たとえば二本鎖ｃＤＮＡポリペプチドのコーティング鎖と相補性、ｍＲＮＡ配列と相補性、または遺伝子のコーティング鎖と相補性であるヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸ポリペプチドは、センス核酸ポリペプチドと水素結合できる。
【００４４】
本明細書で用いる用語「コーティング領域」とは、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味し、一方、用語「非コーディング領域」は、アミノ酸中に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（たとえば、５’および３’非翻訳領域）を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる用語「ベクター」は、これが結合しているもう１つの核酸を輸送できる核酸を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これはその中に別のＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう１つ別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここにおいては別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートできる。ある種のベクターはこれらが導入される宿主細胞において自己複製できる（たとえば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中へ導入されると宿主細胞のベクター中に組み入れられ、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは操作可能に結合される遺伝子の発現を行うことができる。さらに、かかるベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明はかかる他の発現ベクターの形態、たとえばウイルスベクター（たとえば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含し、これらは同等の機能を果たす。
【００４６】
本明細書で用いる用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターなどの本発明の核酸がその中に導入されている細胞を意味する。「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。かかる用語は特定の対象細胞のみでなく、かかる細胞の子孫または可能性のある子孫も意味すると理解されるべきである。ある種の修飾が突然変異または環境的影響のために次の世代において起こり得るので、かかる子孫は実際には親細胞と同一でないが、それでも本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。
本明細書で用いる用語「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるかあるいは組換えＤＮＡ技術により産生される場合は、他のタンパク質、細胞物質および培地、あるいは化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないタンパク質を意味する。「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なタンパク質それ自体は、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織源から得られる細胞物質または他の汚染タンパク質が実質的にないか、または化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。「細胞物質が実質的にない」なる用語には、タンパク質が、それが単離または組換え産生される細胞の細胞成分から分離される、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドの調製物が含まれる。１つの態様において、「細胞物質が実質的にない」とは、約３０％（乾燥重量）未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質（「汚染されているタンパク質」ともいう）、さらに好ましくは約２０％未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質、最も好ましくは約５％未満の非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質を有する非ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７融合タンパク質の調製物を包含する。抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質もしくはその生物学的に活性なタンパク質が組換え的に産生される場合、これは好ましくは実質的に培地がない、すなわち、培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満であり、さらに好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００４７】
「化学前駆体または他の化学物質が実質的にない」なる表現は、タンパク質が、該タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を包含する。１つの態様において、「化学前駆体または他の化学物質が実質的にない」なる表現は、約３０％（乾燥重量）未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を包含する。
【００４８】
本明細書において用いる用語「抗体」は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も包含する。本明細書で用いる「抗原結合部分」は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを意味する（たとえば、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド）。抗体の抗原結合機能は完全長抗体により実施され得ることが証明されている。抗体の「抗原結合タンパク質」なる用語に含まれる結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合された２のＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；抗体の１つの腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Wardら(1989)Nature341:544-546)；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、これらは組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価ポリペプチド（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とも呼ばれる；たとえば、Birdら(1988)Science242:423-426;およびHustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;およびOsbournら(1998)Natl.Biotechnol.16:778)を形成する１つのタンパク質鎖として調製することができる合成リンカーにより結合できる。このような一本鎖抗体はさらに抗体の「抗体結合部分」なる用語に含まれることを意図される。完全ＩｇＧポリペプチドまたは他のイソタイプをコードする発現ベクターを生じるために、特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列はヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列と結合できる。ＶＨおよびＶ１は、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いてＦａｂ、Ｆｖまたは免疫グロブリンの他のフラグメントの生成において用いることができる。一本鎖抗体の他の形態、たとえば、二重特異性抗体（diabody)も含まれる。二重特異性抗体は、二価、二重特異性抗体であり、ここにおいてＶＨおよびＶＬドメインは一本鎖ポリペプチド上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短すぎ、そのために該ドメインは別の鎖の相補性ドメインと対になり、２つの抗原結合部位を形成する(たとえば、Holliger,P.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.ら(1994)Structure2:1121-1123参照)。
【００４９】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成される、より大きな免疫グロブリン分子の一部である。かかる免疫接着(immunoadhesion)ポリペプチドの例は、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作るためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.ら(1995)Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)および二価およびビオチニル化ｓｃＦｖポリペプチドを作るためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.Mら(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。抗体部分、たとえば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、慣例の技術、たとえば、それぞれ完全抗体のパパインまたはペプシン消化を用いて、完全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載するような標準的組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００５０】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル；外因性、同種異系または同系；あるいはその修飾された形態、たとえばヒト化、キメラなどであってもよい。抗体は、完全にヒトであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドと特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫応答できる抗原結合部位の１種のみを含む抗体ポリペプチドの集団を意味し、一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用できる抗原結合部位の複数腫を含む抗体ポリペプチドの集団を意味する。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫応答する特定の抗原に対する単一の結合親和性を示す。
【００５１】
本明細書で用いる「ヒト化抗体」は、ヒト細胞により製造される抗体にさらによく似た抗体に変更された可変および定常領域を有するヒト以外の細胞により製造される抗体を包含することを意図する。たとえば、非ヒト抗体アミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系配列において見いだされるアミノ酸を組み入れるように変更することによる。本発明のヒト化抗体は、たとえばＣＤＲにおいて、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（たとえば、インビトロでの部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）によりコードされないアミノ酸残基を含み得る。本明細書で用いる用語「ヒト化抗体」はさらに、マウスなどの別の哺乳動物種から誘発されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体も包含する。
【００５２】
本明細書で用いる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を意味することを意図する（たとえば、ＰＤ−１と特異的に結合する単離された抗体は、ＰＤ−１リガンド以外と特異的に結合する抗体が実質的にない）。さらに、単離された抗体は他の細胞物質および／または化学物質が実質的にない。
特定のタンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列間には、遺伝コード（後記）により決められる公知の明確な対応が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と該核酸によりコードされるアミノ酸配列の間には、遺伝コードにより決定されるような公知の明確な対応が存在する。
【００５３】
遺伝コード
アラニン (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
アルギニン (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
アスパラギン (Asn, N) AAC, AAT
アスパラギン酸 (Asp, D) GAC, GAT
システイン (Cys, C) TGC, TGT
グルタミン酸 (Glu, E) GAA, GAG
グルタミン (Gln, Q) CAA, CAG
グリシン (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
ヒスチジン (His, H) CAC, CAT
イソロイシン (Ile, I) ATA, ATC, ATT
ロイシン (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
リジン (Lys, K) AAA, AAG
メチオニン (Met, M) ATG
フェニルアラニン (Phe, F) TTC, TTT
プロリン (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
セリン (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
トレオニン (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
トリプトファン (Trp, W) TGG
チロシン (Tyr, Y) TAC, TAT
バリン (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
終結シグナル (end) TAA, TAG, TGA
【００５４】
遺伝コードの重要でよく知られた特性は、その重複性（redundancy）であり、これにより、タンパク質を製造するために用いられるほとんどのアミノ酸に関して、１つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレットを用いることができる（前記）。したがって、多くの異なるヌクレオチド配列が所定のアミノ酸配列についてコードすることができる。かかるヌクレオチド配列は、結果として全ての生物において同じアミノ酸配列を産生するので、機能的に等価であると考えられる（ある生物はあるアミノ酸配列を他のものよりも有効に翻訳することができるが）。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体を所定のヌクレオチド配列中に見いだすことができる。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
【００５５】
前記事項を考慮すると、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列（またはその任意の部分）は、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳するために遺伝コードを用いて、融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列を誘発するために用いることができる。同様に、融合タンパク質またはポリペプチドに関して、融合タンパク質またはポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列を遺伝コード（その重複性のために、所定のアミノ酸配列について複数の核酸配列を産生するであろう）から推測できる。かくして、融合タンパク質またはポリペプチド配列の本明細書における記載および／または開示は、該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示も包含すると考えられるべきである。同様に、本明細書における融合タンパク質またはポリペプチド配列の記載および／または開示も、アミノ酸配列をコードすることができるあらゆる可能なヌクレオチド配列の記載および／開示も包含すると考えるべきである。
【００５６】
ＩＩ．免疫細胞活性化を調節する作用剤
本発明の作用剤は、免疫系をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができ、それによって免疫応答をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。たとえば、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することにより、免疫応答の調節がもたらされる。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドポリペプチドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを阻止し、したがって、阻害免疫シグナルの送達が阻害される。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を阻止することができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供する。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、阻害受容体ＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４に結合するのを可能にし、免疫細胞に阻害シグナルを提供する。別の態様において、ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７ポリペプチドに結合することによって、共刺激受容体ＣＤ２８へのＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８に結合するのを可能にし、免疫細胞に共刺激シグナルを提供する。
【００５７】
たとえば、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増大させる作用剤は、免疫応答を増強することができるが、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を増強することによって、免疫応答を減少させることができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用の阻害を生じない。別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を増大させる作用剤はまた、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を減少させる。さらに別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の間の相互作用を増強または増大させる。例示的な調節（たとえば、免疫応答の低減化など）をするための作用剤として、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害するＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドに対する抗体；ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害する小分子またはペプチド；およびＢ７ポリペプチドまたはＰＤ−１リガンドにそれぞれ結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻止する融合タンパク質（たとえば、抗体のＦｃ部分に融合したＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの細胞外部分）が挙げられる。
【００５８】
別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増大させる作用剤は、Ｂ７ポリペプチドのＣＤ２８に結合する能力を減少させることによって、免疫応答を減少させる。また別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる作用剤は、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８の間の相互作用を増大させることによって、免疫応答を増大させることができる。
【００５９】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤はまた、免疫応答をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするのに用いることができる。たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を増大させる作用剤は、免疫応答を減少させることができるが、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を減少させる作用剤は、免疫応答を増大させることができる。ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節する作用剤が、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節しない（直接的影響をもたない）のが好ましい。別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を増大させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を減少させる。さらに別の態様において、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を減少させる作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増大させる。例示的な調節（たとえば、免疫応答の増強など）をするための作用剤として、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックするＰＤ−１またはＰＤ−１リガンドに対する抗体；およびＰＤ−１またはＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻止する融合タンパク質（たとえば、抗体のＦｃ部分に融合したＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の細胞外部分）が挙げられる。
【００６０】
別の態様において、Ｂ７ポリペプチドに結合する少なくとも一部のＰＤ−１リガンドまたはこのような部分の模倣物を用いて、Ｂ７ポリペプチドに結合し、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドおよび第２免疫細胞上のＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を増強することができる。
別の態様において、Ｂ７ポリペプチドに結合する少なくとも一部のＰＤ−１リガンドまたはこのような部分の模倣物を用いて、Ｂ７ポリペプチドに結合し、第１免疫細胞上のＢ７ポリペプチドおよび第２免疫細胞上のＣＤ２８の間の相互作用を阻害することによって、免疫応答を増強することができる。
【００６１】
単離されたＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８もしくはその部分またはフラグメント（またはこのようなポリペプチドをコードする核酸）は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的技術を用いて、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に結合する抗体を産生するための免疫原として用いることができる。全長ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を用いることができるが、あるいは別法として、本発明は、免疫原として用いるためのＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８ポリペプチドの抗原ペプチドフラグメントに関する。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の抗原ペプチドは、少なくとも８つのアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生じた抗体が、それぞれの全長分子と特異的免疫複合体を形成するように、それぞれの全長分子に存在するエピトープを包含する。抗原ペプチドは、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、親水性領域などのタンパク質の表面にあるＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の領域である。ポリペプチド分子の標準的疎水性分析を行って、親水性領域を同定することができる。抗原ペプチドに含まれる非常に好ましいエピトープは、細胞外ドメインにあり、したがって、結合に関与するポリペプチドの領域である。１つの態様において、このようなエピトープは、マウスまたはヒトといったような１つの種から得られたポリペプチドに対して特異的でありうる（すなわち、種を交差して保存されていないポリペプチド分子の領域に広がる抗原ペプチドは、免疫原として用いられる；このような非保存的残基は、本明細書に記載のアラインメントを用いて決定することができる）。
【００６２】
１つの態様において、抗体は、Ｂ７ポリペプチドまたはＰＤ−１リガンドに結合することなく、ＰＤ−１に実質的に特異的に結合する。別の態様において、抗体は、ＰＤ−１リガンドに実質的に特異的に結合する。別の態様において、抗体はＢ７ポリペプチドに実質的に特異的に結合する。好ましい態様において、抗体は、ＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックする。別の好ましい態様において、抗体は、Ｂ７ポリペプチドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックする。別の好ましい態様において、抗体は、ＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックすることなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする。
【００６３】
免疫原ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８は、典型的には、該免疫原で適当な対象（たとえば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他のほ乳類）を免疫感作することによって抗体を製造するのに用いられる。適当な免疫原調製物には、たとえば、それに対する免疫応答が生じることになる、組換えにより発現された分子または化学的に合成された分子もしくはそのフラグメントを含むことができる。さらに調製物として、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、または類似の免疫刺激剤が挙げられる。免疫原調製物による適当な対象の免疫感作は、それに含まれる抗原ペプチドに対するポリクローナル抗体応答を誘発する。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、前述したように、適当な対象をポリペプチド免疫原で免疫感作することによって製造することができる。免疫感作された対象におけるポリペプチド抗体力価は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などの標準的技術によって、モニターすることができる。所望であれば、抗原に対する抗体を哺乳類（たとえば血液など）から単離し、プロテインＡクロマトグラフィー公知の技術によってさらに精製して、ＩｇＧフラクションを得ることができる。免疫感作後の適当な時点、たとえば、抗体力価が最高になる時点で、対象から抗体産生細胞を得て、最初、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)によって記載されたハイブリドーマ技術(Brownら(1981) J. Immunol. 127:539-46; Brownら(1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yehら(1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31; and Yehら(1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照)、より近年ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Coleら(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)またはトリオーマ技術などの標準的技術によるモノクローナル抗体の製造に用いることができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するテクノロジーは、公知である(一般に、Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402; Gefter, M. L.ら(1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36)を参照。簡単に述べると、上述の免疫原で免疫感作した哺乳類由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）に不死細胞系（典型的には、骨髄腫）を融合させ、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ポリペプチド抗原に好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを同定する。
【００６５】
リンパ球と不死細胞系を融合させるのに用いる多くの公知のプロトコルのいずれもが、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１リガンドまたは抗Ｂ７ポリペプチドモノクローナル抗体の産生のために適用することができる(たとえば、Galfre, G.ら(1977) Nature 266:55052; Gefterら(1977) 前述; Lerner (1981) 前述; Kenneth (1980) 前述を参照)。さらに、有用であるこのような方法の多くのバリエーションがあることは、当業者にば当然のことである。典型的には、不死化細胞系（たとえば、骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳類の種から誘発される。たとえば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫感作されたマウスのリンパ球と不死化マウス細胞系とを融合させることによって、作製することができる。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有培養培地（「HAT培地」）に感受性があるマウス骨髄腫細胞系である。たとえば、P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫系といったような多くの骨髄腫細胞系のいずれもが、標準的技術にしたがって融合パートナーとして用いることができる。これらの骨髄腫系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), Rockville, Mdから入手可能である。典型的には、ポリエチレングリコール（「PEG」）を用いて、HAT感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞に融合させる。次いで、未融合細胞および非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺すHAT培地を用いて、融合から得られるハイブリドーマ細胞を選択する（未融合脾細胞は、形質転換されないので、数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞は、たとえば、標準的ELISAアッセイなどを用いて、所定のポリペプチドを結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００６６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための別法として、組換えコノビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（たとえば、抗体ファージディスプレーライブラリー）を適当なポリペプチドでスクリーニングすることにより、該ポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することによって、上述のポリペプチドの１つに対して特異的なモノクローナル抗体を同定し、単離することができる。ファージディスプレーライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットが市販されている(たとえば、ファルマシアの組換えファージ抗体システム, Catalog No. 27-9400-01;およびストラタジーンのSurfZAPTM ファージディスプレーキット, Catalog No. 240612など)。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作製およびスクリーニングにとって特に受け入れられる方法および試薬の例は、たとえば、LadnerらU.S. Patent No. 5,223,409; KangらInternational Publication No. WO 92/18619; DowerらInternational Publication No. WO 91/17271; WinterらInternational Publication WO 92/20791; MarklandらInternational Publication No. WO 92/15679; BreitlingらInternational Publication WO 93/01288; McCaffertyらInternational Publication No. WO 92/01047; GarrardらInternational Publication No. WO 92/09690; LadnerらInternational Publication No. WO 90/02809; Fuchsら(1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hayら(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huseら(1989) Science 246:1275-1281; Griffithsら(1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkinsら(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarksonら(1991) Nature 352:624-628; Gramら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrardら(1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboomら(1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbasら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; およびMcCaffertyら(1990) Nature 348:552-554に見出すことができる。
【００６７】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができるヒトおよび非ヒト部分の両方を含んでいるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１リガンドまたは抗Ｂ７ポリペプチド抗体は、本発明の範囲に含まれる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、たとえば、RobinsonらInternational Patent Publication PCT/US86/02269; AkiraらEuropean Patent Application 184,187; Taniguchi, M. European Patent Application 171,496; MorrisonらEuropean Patent Application 173,494; NeubergerらPCT Application WO 86/01533; CabillyらU.S. Patent No. 4,816,567; CabillyらEuropean Patent Application 125,023; Betterら(1988) Science 240:1041-1043; Liuら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liuら(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sunら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimuraら(1987) Cancer Res. 47:999-1005; Woodら(1985) Nature 314:446-449; and Shawら(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oiら(1986) Biotechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jonesら(1986) Nature 321:552-525; Verhoeyanら(1988) Science 239:1534; およびBeidlerら(1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用いる当業界で公知の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
【００６８】
さらに、ヒト化抗体は、US patent 5,565,332に開示されたような標準的プロトコルにしたがって作製することができる。別の態様において、たとえば、US patents 5,565,332, 5,871,907または5,733,743に記載されているような当業界で公知の技術を用いて、特異的結合ペアメンバーのポリペプチド鎖と複製可能な一般的ディスプレーパッケージの成分の融合をコードする核酸分子を含むベクターと単一の結合ペアメンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間の組換えによって、抗体鎖または特異的結合ペアのメンバーを作製することができる。細胞内のタンパク質の機能を阻害するための細胞内抗体の使用も当業界で公知である(たとえば、Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S.ら(1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M.ら(1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A.ら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S.ら(1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y.ら(1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, Lら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y.ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R.ら(1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R.ら(1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M.ら(1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H.ら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; PCT Publication No. WO 94/02610 by Marasco et al.;およびPCT Publication No. WO 95/03832 by Duan らを参照)。
【００６９】
さらに、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドに対する完全ヒト抗体が作製された。たとえば、Hoganら, 「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manuel,」 Cold Spring Harbor Laboratoryにしたがって、完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスにおいて作製することができる。簡単に述べると、トランスジェニックマウスを精製ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドで免疫感作する。脾細胞を採集し、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを、それらのＰＤ−１リガンド、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドに結合する抗体産生能力に基づいて選択する。完全ヒト抗体は、ヒトにおけるこのような抗体の免疫原性を低下させる。
【００７０】
１つの態様において、本発明において使用する抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチド内に２つの異なる抗原に対する結合部位をもつ。抗原結合は、同時または逐次で起こる。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌しうる細胞系の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマによって産生される二重特異性抗体の例は、U.S. Pat. 4,474,893に開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段(Staerzら(1985) Nature 314:628, and Perezら(1985) Nature 316:354)およびハイブリドーマテクノロジー(Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, and Staerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241)によって構築されている。二重特異性抗体は、U.S. patent 5,959,084にも記載されている。二重特異性抗体のフラグメントが、US patent 5,798,229に記載されている。二重特異性作用剤は、異なる抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を融合させ、次いで、両方の抗体を産生し、共構築（co-assembling）するクローンを同定することによりヘテロハイブリドーマを作製することによって作製することもできる。それらは、完全免疫グロブリン鎖またはＦａｂまたはＦｖ配列などのその部分の化学的または遺伝的コンジュゲーションによって作製することもできる。抗体成分は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８ポリペプチドに結合することができる。１つの態様において、二重特異性抗体は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの両方に特異的に結合することができる。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、免疫原ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８またはＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に特有のその免疫原性部分で動物を免疫感作し、次いで、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を動物から単離することを含む工程によって入手しうる抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１リガンドまたは抗Ｂ７ポリペプチド抗体に関する。
【００７２】
本発明の別の態様において、ペプチドまたはペプチド模倣物を用いて、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をアンタゴナイズまたは促進することができる（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を妨害することなく）。１つの態様において、各全長タンパク質の調節作用剤として機能するＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体を、たとえば、トランケーション突然変異体などの突然変異体のコンビナトリアル・ライブラリーをアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定することができる。１つの態様において、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体の変化に富んだライブラリーが、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異誘発によって作成され、該ライブラリーは、変化に富んだ遺伝子ライブラリーをコードする。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体の変化に富んだライブラリーは、たとえば、潜在的ポリペプチド配列の縮重セットが、その中にポリペプチドのセットを含んでいる個々のポリペプチドとして発現されるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって作成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチド変異体のライブラリーを作成するのに用いることができる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲートする。遺伝子の縮重セットの使用により、１つの混合物において、潜在的ポリペプチド配列の所望のセットをコードするすべての配列を提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業界で公知である(たとえば、Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら(1984) Science 198:1056; Ikeら(1983) Nucleic Acid Res. 11:477などを参照）。
【００７３】
さらに、ポリペプチドコーティング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、所定のポリペプチドの変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためのポリペプチドフラグメントの変化に富んだ集団を作製することができる。１つの具体例において、ポリペプチド当たり約１のみニッキングが起こる条件下でポリペプチドコーティング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して異なるニッキング産物からセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼにより再形成された二本鎖物から一本鎖部分を除去し、次いで、得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲートすることによって、コーティン配列フラグメントのライブラリーを作成することができる。この方法によって、Ｎ−末端、Ｃ−末端および種々のサイズのポリペプチドの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００７４】
点突然変異またはトランケーションによって作成されたコンビナトリアル・ライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング用および選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用の幾つかの技術は、当業界で公知である。このような技術は、ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって作成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適している。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析にしやすい最も広範に用いられる技術として、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーによる適当な細胞の形質転換および所望の活性の検出により遺伝子の産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現が挙げられる。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術である再帰的集団突然変異（Recursive ensemble mutagenesis (REM)）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いて、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の変異体を同定することができる(Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagraveら(1993) Protein Eng. 6(3):327-331)。１つの態様において、細胞系アッセイを利用して、変化に富んだポリペプチドライブラリーを分析することができる。たとえば、通常ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を合成する細胞系に、発現ベクターのライブラリーを形質移入することができる。次いで、全長ポリペプチドおよび特定の突然変異ポリペプチドが産生されるように形質移入された細胞を培養し、たとえば、多くの機能アッセイのいずれかによって細胞上清における全長ポリペプチド上の突然変異体の発現を検出することができる。次いで、全長ポリペプチド活性の阻害あるいは潜在化およびさらに特徴づけられた個々のクローンについて評価する細胞からプラスミドＤＮＡを回収することができる。
【００７５】
同じタイプのＤ−アミノ酸によるポリペプチドアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の系統的置換（たとえば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシンなど）を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。さらに、対象となるポリペプチドアミノ酸配列または実質的に同一である配列バリエーションを含む拘束された（constrained）ペプチドは、当業界で公知の方法(RizoおよびGierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387, これは全体を参考文献として本発明に援用される)；たとえば、ペプチドを環化する分子間ジスルフィド橋を形成しうる内部システイン残基を付加することによって作製することができる。
【００７６】
本明細書に開示したアミノ酸配列は、ペプチド配列およびその変異体に対応するポリペプチドを当業者が作製することを可能にする。このようなポリペプチドは、多くはより大きいポリペプチドの一部として、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、原核または真核宿主細胞において産生させることができる。別法として、このようなペプチドは、化学的方法によって合成することができる。組換え宿主における異種タンパク質の発現方法、ポリペプチドの化学的合成およびインビトロ翻訳は、当業界で公知であり、ManiatisらMolecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiserら(1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; およびOfford, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing(これらは全体を参考文献として本発明に援用される)にさらに記載されている。
【００７７】
１つの態様において、ペプチドは、ＰＤ−１リガンドポリペプチドのＢ７結合部位と同一または類似のアミノ酸配列をもつ。別の態様において、ペプチドは、Ｂ７ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１結合部位と同一または類似のアミノ酸配列をもつ。１つの態様において、ペプチドは、Ｂ７ポリペプチドに対する結合についてＰＤ−１リガンドと競合するか、またはペプチドは、ＰＤ−１リガンドに対する結合についてＢ７ポリペプチドと競合する。好ましい態様において、ペプチドは、Ｂ７ポリペプチドへのＰＤ−１リガンドの結合について競合するが、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の結合については競合しない。別の態様において、ペプチドは、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の結合について競合するが、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間については競合しない。
【００７８】
ペプチドは、典型的には、直接的化学合成によって作製し、たとえば、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用のアンタゴニストとして用いることができる。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端への共有結合によって結合した非ペプチド部分を含む修飾ペプチドとして作製することができる。ある好ましい態様において、カルボキシ末端もしくはアミノ末端または両方を化学的に修飾する。末端アミノおよびカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化とアミド化である。アシル化（アセチル化など）またはアルキル化（メチル化など）などのアミノ末端修飾およびアミド化などのカルボキシ末端修飾ならびに環化などの他の末端修飾を種々の本発明の態様に組み込むことができる。あるアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列へのペプチド伸長により、安定性の増大、効能および／または効力の増加、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物動態特性などの有利な物理的、化学的および薬理学的特性が提供される。本明細書に開示するペプチドを治療的に用いて、たとえば、患者における共刺激を変更することによって疾病を治療することができる。
【００７９】
ペプチド模倣体は、通常、コンピューター処理による分子モデリングを用いて創り出される(Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; VeberおよびFreidinger (1985) TINS p.392; およびEvansら(1987) J. Med. Chem. 30:1229,これらは全体を参考文献として本発明に援用される)。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣体を用いて、等価の治療または予防効果を生み出すことができる。一般に、ペプチド模倣体は、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性のあるポリペプチド）に構造的に類似するが、必要に応じて、当業界で周知の方法により、-CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (シスおよびトランス), -COCH2-, -CH(OH)CH2-および -CH2SO-から選ばれる結合で置換された１つ以上のペプチド結合を有し、さらに、次の参考文献に記載されている：Spatola, A. F. in 「Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins」 Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, 「Peptide Backbone Modifications」 (general review); Morley, J. S. (1980) Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (general review); Hudson, D.ら(1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F.ら(1986) Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M. (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314 (-CH-CH-, cis and trans); Almquist, R. G.ら(190) J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C.ら(1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M.らEuropean Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W.ら(1983) Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-);および Hruby, V. J. (1982) Life Sci. (1982) 31:189-199 (-CH2-S-);これらは全体を参考文献として本発明に援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、-CH2NH-である。このようなペプチド模倣体は、たとえば、より経済的な製造、より大きい化学的安定性、増進された薬理学的特性（半減期、吸収、効能、効力など）、変更された特異性（広範な生物学的活性など）、低減化された免疫原性などのポリペプチド形態全体にわたる重大な利点を有する。ペプチド模倣体の標識は、通常、定量的構造−活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣体上の非妨害位置への１つ以上の標識の直接的あるいはスペーサー（アミド基など）を介した共有結合を含む。このような非妨害位置とは一般に、ペプチド模倣体が治療的効果を生み出すために結合する、マクロポリペプチドと直接接触しない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化（標識など）は、ペプチド模倣体の所望の生物学的または薬理学的活性を実質的に妨害すべきではない。
【００８０】
本発明には、たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用などの相互作用を調節（増強または阻害）することができる小分子も含まれる。本発明の小分子は、空間的にアドレス可能なパラレル固相または溶液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ・１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法といったような当業界で周知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【００８１】
分子らの合成法の例は、たとえば、DeWittら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erbら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermannら(1994) J. Med. Chem. 37:2678; Choら(1993) Science 261:1303; Carrellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびGallopら(1994) J. Med. Chem. 37:1233など、当業界で見出すことができる。
【００８２】
化合物のライブラリーは、溶液中(e.g., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner USP 5,223,409)、胞子(Ladner USP ’409)、プラスミド(Cullら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)もしくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirlaら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 前述)においても存在することができる。化合物は、細胞ベースまたは非細胞系アッセイにおいてスクリーニングすることができる。化合物は、集合（たとえば、各試験サンプルにおける複数の化合物）または個々の化合物としてスクリーニングすることができる。
【００８３】
１つの態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンド／Ｂ７ポリペプチド相互作用に関与する結合部位またはＤ−１／ＰＤ−１リガンド相互作用に関与する結合部位に結合する。１つの態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をアンタゴナイズする。好ましい態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をアンタゴナイズするが、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドまたはＢ７とＣＴＬＡ４の間の相互作用はアンタゴナイズしない。別の態様において、小分子は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をアンタゴナイズすることなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＢ７とＣＴＬＡ４の間の相互作用をアンタゴナイズする。
【００８４】
本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８キメラもしくは融合タンパク質に関する。本明細書で用いるＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８「キメラタンパク質」もしくは「融合タンパク質」は、非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンド、非ＣＴＬＡ４、非ＣＤ２８または非Ｂ７ポリペプチド分子に作動可能に結合したＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子を含む。「ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子」は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するが、「非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンド、非Ｂ７ポリペプチド、非ＣＴＬＡ４または非ＣＤ２８分子」は、たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子とは相異し、同じもしくは相異する微生物から誘導されるタンパク質などの各ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子に実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８融合タンパク質のうち、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８部分は、全長ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子の全部または一部に対応することができる。好ましい態様において、融合タンパク質は、細胞外ドメインなどの、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８分子の少なくとも１つの生物学的活性部分を含む。融合タンパク質のうち、用語「作動可能に結合した」は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８アミノ酸配列および非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンドまたは非Ｂ７ポリペプチド配列が、独立して融合タンパク質に発現する場合に示される機能を保存するような様式で互いにインフレーム融合することを示すことを異図する。非ＰＤ−１、非ＰＤ−１リガンド、非Ｂ７ポリペプチド、非ＣＴＬＡ４または非ＣＤ２８分子は、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８配列のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【００８５】
このような融合タンパク質は、第１ペプチドをコードするヌクレオチド配列と第２ペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え発現によって作製することができる。第２ペプチドは、必要に応じて、たとえば、免疫グロブリン定常領域などの第１ペプチドの溶解度、親和性、安定性または結合価を変更する部分に対応してもよい。好ましくは、第１ペプチドは、活性化した免疫細胞の共刺激または阻害を調節するのに十分なＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の部分からなる。別の態様において、第１ペプチドは、生物学的活性分子の部分（たとえば、ポリペプチドの細胞外部分またはリガンド結合部分など）からなる。第２ペプチドは、たとえば、ヒトＣγ１ドメインまたはCγ4ドメイン(たとえば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域；CaponらUS patent 5,116,964; 5,580,756; 5,844,095などを参照；これらは全体を参考文献として本発明に援用される)などの免疫グロブリン定常領域を含むことができる。このような定常領域は、エフェクター機能（Ｆｃ受容体結合など）を媒介する領域を保持するか、またはエフェクター機能を低下させるように変更する。得られる融合タンパク質は、独立して発現された第１ペプチドに比べて、安定性、結合親和性、安定性および／または結合価（すなわち、ポリペプチド当たりの利用可能な結合部位の数）を変更することができており、タンパク質精製の効率を増加することができる。組換え技術によって作製された融合タンパク質およびペプチドを、タンパク質またはペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌し、単離することができる。別法として、タンパク質またはペプチドを細胞質内に保持し、細胞を採集し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養は、典型的には、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養のための適当な培地は、当業界で周知である。タンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチド精製用の当業界で周知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。宿主細胞に形質移入し、タンパク質およびペプチドを精製するための技術は当業界で周知である。
【００８６】
特に好ましいＩｇ融合タンパク質として、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域など）に結合する、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインが挙げられる。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリン構造に固有のエフェクター活性を減少あるいは削除する遺伝子修飾を含むこともできる。たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の細胞外部分をコードするＤＮＡを、たとえば、WO 97/28267に教示されているような特定部位突然変異誘発によっ修飾されたヒトＩｇＧγ１またはＩｇＧγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合させることができる。
本発明の融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術によって作製されるのが好ましい。たとえば、ライゲーションのための平滑末端またはねじれ末端、適当な末端を得るための制限酵素切断、必要に応じて粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素ライゲーションを用いる慣例の技術にしたがって、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを一緒にインフレームライゲーションさせる。別の態様において、自動ＤＮＡ合成機などの慣例の技術によって融合遺伝子を合成することができる。別法として、続いてアニーリングされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を生じる、２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じさせる２つのアンカープライマーを用いる遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. AusubelらJohn Wiley & Sons: 1992を参照)。融合部分がＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８をコードする配列にインフレーム結合するように、発現ベクターに核酸をコードするポリペプチドをクローニングする。
【００８７】
別の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。ある宿主細胞（たとえば、哺乳動物宿主細胞）において、異種シグナル配列の使用により、ポリペプチドの発現および／または分泌を増加させることができる。
【００８８】
好ましい態様において、融合タンパク質は、ＰＤ−１またはＰＤ−１リガンドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックすることなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックする。別の好ましい態様において、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド融合タンパク質は、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドに結合し、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用をブロックする。
ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８融合タンパク質の使用は、たとえば、自己免疫疾患などの免疫疾患の治療にとって、または移植片拒絶反応の阻止において、治療的に有用である。
【００８９】
本発明の融合タンパク質は、被験者において抗体を産生するための免疫原として用いることができる。このような抗体は、融合タンパク質が作製された各天然のポリペプチドの精製、あるいはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用を阻害するポリペプチドを同定するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。
本明細書に記載する調節的作用剤（たとえば、抗体、小分子、ペプチドまたは融合タンパク質など）は、医薬組成物に組み入れて、患者にインビボで投与することができる。組成物は、本明細書に記載した単一のそのような分子または作用剤または調節的作用剤のいずれかの組み合わせを含んでもよい。
【００９０】
ＩＩＩ．免疫細胞活性を調節する作用剤の選択方法
本発明の別の態様は、共刺激を調節すること（ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用またはＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用を阻害する作用剤など）によって免疫応答を調節する作用剤（たとえば、抗体、融合タンパク質、ペプチドまたは小分子）の選択方法に関する。このような方法は、細胞ベースおよび非細胞系アッセイなどのスクリーニングアッセイを利用する。１つの態様において、アッセイは、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害しながら、あるいは阻害することなく）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用を阻害する作用剤を同定する方法を提供する。別の態様において、アッセイは、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用；Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の相互作用；および／またはＢ７ポリペプチドとＣＤ２８の相互作用を阻害しながら、あるいは阻害することなく）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤を同定する方法を提供する。
【００９１】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８に結合するか、または、たとえば、その同族の結合パートナーと相互作用する（結合するなど）ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の能力を調節するといったような、その活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイに関する。１つの態様において、免疫応答を調節する作用剤を同定する方法は、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をたとえば増強または阻害するといったような調節する作用剤の能力の決定およびさらに作用剤のＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する能力の決定を含む。１つの態様において、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することなく）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節する作用剤が選択される。別の態様において、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節することなく）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤が選択される。
このような作用剤として、抗体、タンパク質、融合タンパク質および小分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
１つの態様において、免疫応答を増強する作用剤を同定する方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節することなく、あるいは阻害しながら）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増強する候補作用剤の能力の決定を伴う。別の態様において、方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を増強調節することなく、あるいは増強しながら）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻害する候補作用剤の能力の決定を含む。
【００９３】
別の態様において、免疫応答を減少させる作用剤を同定する方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節することなく、あるいは増強しながら）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する候補作用剤の能力の決定およびＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤の選択を含む。別の態様において、免疫応答を減少させる作用剤を同定する方法は、（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節しない、あるいは阻害する）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を増強する候補作用剤の能力の決定およびＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を増強する作用剤の選択を含む。好ましい態様において、免疫応答を減少させるために選ばれた作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害するが、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を阻害しない。
【００９４】
１つの態様において、アッセイは、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を発現している細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物のＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８のその結合パートナーへの結合を調節（たとえば、刺激または阻害）する能力を決定することを含む細胞系アッセイである。結合パートナーへ結合するＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの能力または結合パートナーと相互作用するＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの能力の決定は、たとえば、直接結合を測定することによって、あるいは免疫細胞の活性化のパラメーターを測定することによって達成することができる。
【００９５】
たとえば、直接結合アッセイにおいて、ＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドへのＰＤ−１リガンドの結合が複合体として標識されたタンパク質を検出することによって決定することができるように、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドタンパク質（またはそれぞれの標的ポリペプチド）を放射性同位体または酵素標識と結合させることができる。たとえば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的または間接的にＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を標識し、放射線放出を直接カウントすることによって、あるいはシンチレーションカウントすることによって、放射性同位体を検出することができる。別法として、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８を酵素的に標識し、適当な基質の産物への変換を決定することによって酵素標識を検出することができる。
【００９６】
相互作用体のいずれかを標識することなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する化合物の能力を決定することも本発明の範囲内にある。たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチドまたは標的ポリペプチドのいずれかを標識することなく、マイクロフィジオメーターを用いて、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を検出することができる(McConnell, H. M.ら(1992) Science 257:1906-1912)。本明細書で用いる「マイクロフィジオメーター」（たとえば、サイトセンサー）は、光アドレス可能電位計測法（light-addressable potentiometric sensor (LAPS)）を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。酸性化速度の変化を、化合物と受容体の間の相互作用の指標として用いることができる。
【００９７】
好ましい態様において、ポリペプチドの所定のセットをアンタゴナイズするブロッキング剤（たとえば、抗体、融合タンパク質、ペプチドまたは小分子など）の能力の決定は、ポリペプチドのセットの１つ以上のメンバーの活性を決定することによって達成することができる。たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の活性は、細胞の第２メッセンジャー（たとえば、チロシンキナーゼ活性）の誘発を検出すること、適当な基質の触媒／酵素活性を検出すること、リポーター遺伝子（検出可能なマーカー、たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、をコードする核酸に作動可能に結合した標的応答性調節エレメントを含む）の誘発を検出すること、またはＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８によって調節される細胞応答を検出することによって決定することができる。該ポリペプチドに結合する、あるいはポリペプチドと相互作用するブロッキング剤の能力の決定は、たとえば、免疫細胞共刺激または増殖アッセイにおける阻害を調節する化合物の能力を測定するか、または該ポリペプチドの部分を認識する抗体に結合する該ポリペプチドの能力を妨害することによって達成することができる。
【００９８】
ＰＤ−１リガンドと共刺激受容体の相互作用をブロックまたは阻害する作用剤（たとえば、可溶性型のＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１リガンドに対するブロッキング抗体など）ならびにＰＤ−１リガンド媒介性阻害シグナルを促進する作用剤（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックする作用剤など）は、免疫細胞増殖および／またはエフェクター機能を阻害するその能力もしくはインビトロアッセイに加えた場合にアネルギーを誘発するその能力によって同定することができる。たとえば、活性化受容体を介してシグナルトランスダクションを刺激する作用剤の存在下に細胞を培養することができる。多くの認識された細胞活性化の読み出しを利用して、活性化剤の存在下に細胞増殖またはエフェクター機能（たとえば、抗体産生、サイトカイン産生、食作用）を測定することができる。この活性化をブロックする試験作用剤の能力は、当業界で周知の技術を用いて測定される増殖またはエフェクター機能における低下をもたらすその作用剤の能力を測定することによって容易に決定することができる。
【００９９】
たとえば、本発明の作用剤を、Freemanら(2000) J. Exp. Med. 192:1027 and Latchmanら(2001) Nat. Immunol. 2:261に記載されているように、Ｔ細胞アッセイにおいて、共刺激を阻害または増強する能力について試験することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、活性化抗ＣＤ３抗体で刺激することができる。Ｔ細胞の増殖は、３Ｈチミジン取り込みによって測定することができる。アッセイは、ＣＤ２８共刺激があってもなくても行うことができる。類似のアッセイをＰＢＭＣ由来のジャーカットＴ細胞およびＰＨＡ幼若化細胞を用いて行うことができる。
【０１００】
さらに別の態様において、本発明のアッセイは、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８もしくはその生物活性部分を試験化合物と接触させ、ポリペプチドもしくはその生物活性部分に結合する試験化合物の能力を決定する無細胞アッセイである。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８への試験化合物の結語は、上述したように直接的または間接的のいずれかにおいて決定することができる。好ましい態様において、アッセイは、ポリペプチドまたはその生物活性部分をその結合パートナーと接触させて、アッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、次いで、アッセイ混合物中のポリペプチドと相互作用する試験化合物の能力を決定することを含む；ここで、ポリペプチドと相互作用する試験化合物の能力を決定することは、結合パートナーと比較して、ポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
【０１０１】
たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドを用いて、アッセイ混合物を形成し、上述の方法のうちの１つまたは直接結合を決定することにより、ＰＤ−１リガンドを結合するＰＤ−１の能力を決定することおよびＢ７ポリペプチドを結合するＰＤ−１リガンドの能力を決定することによって、この相互作用をブロックするポリペプチドの能力を試験することができる。ＰＤ−１リガンドを結合するＰＤ−１の能力を決定することおよびＢ７を結合するＰＤ−１リガンドの能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Analysis:ＢＩＡ）を用いても達成することができる(Sjolander, S.およびUrbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzaboら(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)。本明細書で用いる「ＢＩＡ」は、相互作用体のいずれも標識することなく、リアルタイムにおいて生体特異的相互作用を研究するためのテクノロジーである（たとえば、BIAcore）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）という工学的現象における変化を、生体ポリペプチドの間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドをBIAcoreチップ上に固定し、多数の作用剤（ブロッキング抗体、融合タンパク質、ペプチドまたは小分子）をＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドへの結合について試験することができる。ＢＩＡテクノロジーを用いる例は、Fitzら(1997) Oncogene 15:613に記載されている。
【０１０２】
本発明の無細胞アッセイは、タンパク質の可溶性および／または膜結合型の両方（たとえば、ＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分またはＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１が結合する結合パートナー）に敏感に反応する。膜結合型タンパク質（たとえば、細胞表面ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１受容体など）を用いる無細胞アッセイの場合、膜結合型のタンパク質が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用するのが望ましい。可溶化剤の例として、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（登録商標） X-100、トリトン（登録商標） X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデイシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモオ］−１−プロパン・スルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン・スルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン・スルホネートなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１０３】
上述したアッセイ方法のうち１つ以上の態様において、一方または両方のタンパク質の未複合体からの複合体の分離を促進し、アッセイの自動化に適応させるために、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドまたは適当な標的ポリペプチドを固定化するのが望ましい。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドへの試験化合物の結合は、反応物を入れるのに適したいずれかの容器内で行うことができる。このような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心分離管が挙げられる。１つの態様において、一方または両方のタンパク質がマトリックスに結合できるようにするドメインを加える融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド融合タンパク質、あるいはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン被覆マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いで、試験化合物と合わせ、複合体形成をもたらす条件下（たとえば、塩およびｐＨについて生理的条件など）で混合物をインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルを洗浄して、未結合の成分、ビーズの場合固定化されたマトリックスを除去し、たとえば、上述したように直接的または間接的に複合体を決定する。別法として、複合体をマトリックス〜解離させ、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチド結合のレベルまたは活性を標準的技術を用いて決定することができる。
【０１０４】
別の態様において、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力の決定は、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンドまたはＢ７ポリペプチドの下流で機能するポリペプチド、たとえば、ＰＤ−１リガンドと相互作用するポリペプチド、または、たとえば、ＰＤ−１の細胞質ドメインと相互作用することによって、ＰＤ−１の下流で機能するポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力を決定することによって達成することができる。たとえば、前述したように、第２メッセンジャーのレベルを決定することができ、適当な標的上のインタラクターポリペプチドの活性を決定することができ、または適当な標的に対するインタラクターの活性を決定することができる。
【０１０５】
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規な作用剤に関する。したがって、本明細に記載の適当な動物モデルにおいて同定された作用剤の使用も本発明の範囲に包含される。たとえば、本明細書に記載の同定された作用剤を動物モデルにおいて用いて、このような作用剤による処置の効力、毒性または副作用を決定することができる。別の態様として、本明細書に記載の同定された作用剤を動物モデルにおいて用いて、このような作用剤の作用のメカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置のための上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規な作用剤の使用に関する。
【０１０６】
ＩＶ．医薬組成物
本発明のＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８調節作用剤（たとえば、ブロッキング抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子といったような、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックすることなくＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの相互作用を阻害または促進する作用剤またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックする作用剤など）は、患者への投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。このような組成物は、典型的には抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子および医薬的に許容しうる担体を含む。本明細書で用いる語句「医薬的に許容しうる担体」は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などをすべて包含するものとする。医薬活性剤に関するこのような媒質および薬剤の使用については当該分野では周知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物を組成物中に含有させることもできる。
【０１０７】
本発明医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（例、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分：滅菌希釈剤、たとえば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、たとえばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調節剤、たとえば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。酸または塩基、たとえば塩酸または水酸化ナトリウムによりｐＨを調節することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器またはマルチプルドーズバイアル（multiple dose vial）に封入することができる。
【０１０８】
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、たとえば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得る。たとえば、レシチンのごときコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば糖類、ポリアルコール類、たとえばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。
必要ならば上記成分の１つまたは組み合わせとともに所望量の適当な溶媒に活性化合物（たとえば、該分子のＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８フラグメントに対する抗体；または該ポリペプチドの相互作用をブロックする小分子）を含ませて、次いで、濾過滅菌することにより、滅菌注射可能溶液を調製することができる。一般的には、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤中に活性化合物を含ませることにより分散液を製造する。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておいたその溶液から有効成分に加えて所望の追加的成分からなる粉末を得ることができる。
【０１０９】
一般的には、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入、あるいは錠剤に圧縮成型することができる。経口治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて経口組成物を製造することもでき、流動担体中の化合物は経口適用され、スイッシュ（swish）され、吐き出されるかまたは嚥下される。医薬的に適合し得る結合剤、および／またはアジュバント剤は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または似た性質の化合物：結合剤、たとえば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦形剤、たとえば澱粉または乳糖、崩壊剤、たとえばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ、滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）、滑沢剤、たとえばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、たとえばしょ糖またはサッカリン、または香味料、たとえばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
【０１１０】
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、たとえば気体、たとえば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリバリーされる。
【０１１１】
全身投与を経粘膜または経皮手段で行なってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は一般的に当業界では公知であり、たとえば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。鼻用スプレーまたは坐薬の使用により経粘膜投与を行なうことができる。経皮投与の場合、当業界で一般的に知られているように、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームとして製剤化する。
化合物を直腸デリバリー用の坐薬（例、慣用的坐薬基剤、たとえばカカオバターおよび他のグリセリド類による）または停留浣腸形態として調合することもできる。
【０１１２】
１つの態様において、活性化合物は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調合され、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル封入デリバリー系を包含する除放性製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の製造方法は、当業者に明らかであろう。これらの材料を、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）を医薬的に許容され得る担体として使用することもできる。たとえば米国特許第４５２２８１１号に記載されたような当業者に公知の方法にしたがってこれらを調合することができる。
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤するのは特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態とは、処置される対象にとって単位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含むものをいう。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当業界における制限に直接的に左右される。
【０１１３】
このような化合物の毒性および治療効率を細胞培養物または実験動物における標準製薬方法により測定して、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよい場合、かかる化合物を罹病組織の部位に標的化させるデリバリーシステムを設計して、未感染細胞に対する潜在的ダメージを最小化し、そのことにより副作用を減らすように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための範囲の用量を製剤化するために用いることができる。好ましくは、かかる化合物の用量は、毒性を全くまたはほとんど伴わないＥＤ５０値を包含する循環濃度の範囲内である。使用される用量形態および使用される投与経路に応じて用量をこの範囲内で変化させてもよい。本発明方法で使用される化合物の場合、先ず、細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。用量を動物モデルで製剤化することにより、細胞培養で測定されたＩＣ５０（すなわち、徴候の半−最大阻害を達成する試験化合物の濃度）をを包含する循環血漿濃度範囲が得られる。このような情報を使用することにより、ヒトにおける有用な用量をより正確に測定することができる。血漿レベルを、たとえば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１１４】
上記調節作用剤は、作用剤をコードする発現可能な核酸の形体で投与してもよい。このような核酸およびそれらを含有する組成物もまた、本発明に包含される。たとえば、本発明の核酸分子をベクターに挿入して、遺伝子療法ベクターとして用いることができる。遺伝子療法ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与(U.S. Patent 5,328,470を参照)または定位注射(たとえば、Chenら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照)によって被験者にデリバリーすることができる。遺伝子療法ベクターの医薬製剤は、許容しうる希釈液中に遺伝子療法ベクターを含んでいてもよく、あるいは遺伝子デリバリービヒクルが包埋される遅延放出マトリックスを含んでいてもよい。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクターを組換え細胞から無傷で製造できる場合（たとえば、レトロウイルスベクター）、医薬製剤は遺伝子デリバリー系を生産する１個またはそれ以上の細胞を含んでいてもよい。
医薬組成物を投与に関する使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中に入れることができる。
【０１１５】
Ｖ．本発明の用途および方法
本明細書に記載の調節作用剤は、治療方法に用いることができる（たとえば、免疫応答を上方調節または下方調節することにより）。たとえば、ＰＤ−１に結合しているＰＤ−１リガンドは、負のシグナルを伝達するが、Ｂ７−１などのＢ７ポリペプチドに結合しているＰＤ−１リガンドはしない。したがって、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節の結果として、免疫応答の調節が得られる。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用はまた、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのを妨げ、したがって、阻害免疫シグナルのデリバリーを阻害する。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を妨げることができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、阻害受容体ＣＴＬＡ４に結合するＢ７も減少させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。別の態様において、ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、共刺激受容体ＣＤ２８に結合するＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８を結合しうるようにして、免疫細胞に対する共刺激シグナルを提供する。
【０１１６】
１．予防方法
１つの態様において、本発明は、不必要あるいは決して望ましくない免疫応答に関連する疾患または身体状態を被験者において予防する方法に関する。本発明の作用剤または方法を処置することによって利益を得ることができる、疾患に対するリスクをもつ被験者を、たとえば、当業界で周知の診断または予知アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。予防薬の投与は、不必要あるいは決して望ましくない免疫応答に関連する症状の出現前に行う。治療に用いる適当な作用剤（たとえば、抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子）は、臨床的兆候によって決定することができ、たとえば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。
【０１１７】
２．治療方法
本発明の別の態様は、たとえば、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することによって、免疫応答を調節する治療方法に関する。たとえば、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節の結果として、免疫応答の調節が得られる。Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１に結合するのも妨げ、したがって、阻害免疫シグナルのデリバリーを阻害する。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする作用剤は、阻害シグナル伝達を妨げることができる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、ＰＤ−１リガンドがＰＤ−１を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、阻害受容体ＣＴＬＡ４に結合するＢ７も減少させる。１つの態様において、ＰＤ−１リガンドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＴＬＡ４を結合しうるようにして、免疫細胞に対する阻害シグナルを提供する。別の態様において、ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドへ結合することによって、共刺激受容体ＣＤ２８に結合するＢ７ポリペプチドの結合も減少させる。したがって、１つの態様において、ＰＤ−１リガンドポリペプチドへのＢ７ポリペプチドの結合をブロックする作用剤は、Ｂ７ポリペプチドがＣＤ２８を結合しうるようにして、免疫細胞に対する共刺激シグナルを提供する。
【０１１８】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する作用剤の例として、たとえば、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドに対する抗体；ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドに由来するフラグメントまたはペプチド；ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７ポリペプチドの融合タンパク質；およびＰＤ−１とＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８、Ｂ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を調節する小分子などの本明細書に記載したような作用剤が挙げられる。
【０１１９】
これらの調節作用剤は、インビトロで（たとえば、細胞を作用剤と接触させることによって）、あるいは別法として、インビボで（たとえば、作用剤を被験者に投与することによって）投与することができる。そのようなものとして、本発明は、たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１またはＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節によるといったような免疫応答の調節が有益である疾患または障害に罹患した個体の治療方法に関する。
【０１２０】
３．免疫応答のダウンレギュレーション
ＰＤ−１リガンドの阻害性機能をアップレギュレーションするか、または共刺激をダウンレギュレーションすることによって免疫応答を調節するための本発明の態様が多く存在する。ダウンレギュレーションは、すでに進行している免疫応答を阻害またはブロックする形態であってもよく、あるいは免疫応答の誘発を妨害することを含むものであってもよい。免疫細胞応答をダウンレギュレーションすることにより、あるいは免疫細胞における特異的アネルギーを誘発することにより、あるいはそれら両方により、活性化された免疫細胞の機能を阻害することができる。活性化免疫細胞の機能は、免疫細胞応答をダウンレギュレーションすること、あるいは免疫細胞における特異的アネルギーを誘発すること、またはその両方によって阻害することができる。
【０１２１】
たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチド（たとえば、ＰＤ−１リガンド−ＩｇなどのＰＤ−１リガンドポリペプチドの可溶性モノマー体）および／またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックする（たとえば、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の間の相互作用に影響を及ぼさずに、または増強しながら）またはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の結合を促進する（Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用に影響を及ぼさずに、あるいは阻害しながら）抗ＰＤ−１リガンド抗体を用いて、免疫応答を下方調節することができる。これらの相互作用をブロックする作用剤の他の例として、抗Ｂ７ポリペプチド、Ｂ７ポリペプチドまたはブロック性小分子が挙げられる。
【０１２２】
Ｂ７ポリペプチドへのＰＤ−１リガンドの結合に影響を及ぼさずに、あるいは減少させながら、ＰＤ−１へのＰＤ−１リガンドの結合またはＣＴＬＡ４へのＢ７ポリペプチドの結合を促進する作用剤を用いて、免疫応答をダウンレギュレートすることもできる。作用剤の例として、本明細書に記載の方法によって同定されるＰＤ−１ペプチド模倣体が挙げられる。
本発明の１つの態様において、抗原およびＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用ををブロックする作用剤（たとえば、抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子）の併用投与によって、特異的抗原に対する寛容が誘発される。たとえば、特異的的タンパク質に寛容を誘発することができる。１つの態様において、アレルゲンまたは免疫応答が望ましくない外来タンパク質に対する免疫応答を阻害することができる。たとえば、第VIII因子を投与される患者は、この血液凝固因子に対する抗体を産生することが多い。ＰＤ−１リガンド媒介性共刺激シグナルをブロックする作用剤またはＰＤ−１媒介性阻害シグナルを刺激する作用剤と組換え第VIII因子との併用投与（またはたとえば架橋により、物理的に第VIII因子に結合する）の結果として、ダウンレギュレーションが起こりうる。
【０１２３】
１つの態様において、第２ペプチドに融合した第１ＰＤ−１リガンドペプチドを含む融合タンパク質を用いて、免疫細胞上のＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用をブロックして、免疫応答をダウンレギュレートすることができる。１つの態様において、第２ペプチドは、別のＢリンパ球抗原（たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−３など）の活性をブロックして、さらに免疫応答をダウンレギュレートする。別法として、免疫応答をダウンレギュレートする２つの別々の作用剤を単一の組成物として組み合わせるか、あるいは別々に（同時または逐次）投与して、より効果的に被験者における免疫細胞媒介性免疫応答をダウンレギュレートことができる。たとえば、ＰＤ−１リガンドをＢ７ポリペプチドと、あるいはブロッキング抗体の組み合わせ（たとえば、ＰＤ−１リガンドポリペプチドに対する抗体と抗Ｂ７−１および／または抗Ｂ７−２モノクローナル抗体などｄ）と組み合わせることができる。さらに、医薬的有効量の１つ以上の対象作用剤を他のダウンレギュレーション試薬と組み合わせて用いて、免疫応答に影響を及ぼすことができる。他の免疫調節試薬の例として、共刺激シグナルをブロックする抗体（たとえば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳに対する抗体など）、ＣＴＬＡ４のアゴニストとして働く抗体および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（たとえば、ＣＤ４０、ＣＤ４リガンドまたはサイトカインに対する抗体など）、融合タンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃなど）および免疫抑制剤（たとえば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用のダウンレギュレーションまたは妨害、あるいはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用の促進（たとえば、調節することなく、またはさらに増強することによる）にとって、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用（たとえば、ＰＤ−１の負のシグナル伝達の刺激による）が、たとえば、組織、皮膚および臓器移植という状況、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または紅斑性狼瘡もしくは多発性硬化症などの自己免疫疾患における免疫応答をダウンレギュレートするのに有用である。たとえば、免疫細胞機能を遮断する結果として、組織いしょくにおける組織破壊が減少する。典型的には、組織移植片において、移植片の拒絶は、免疫細胞によるその外来物としての認識を介して開始され、続いて、移植片を破壊する免疫反応が起こる。移植前または移植時におけるＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を阻害またはブロックするポリペプチド（ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の可溶性モノマー体など）の単独またはもう一つのダウンレギュレーション作用剤と併用での投与は、阻害シグナルの精製を促進することができる。さらに、ＰＤ−１リガンド共刺激シグナルの阻害、またはＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１阻害シグナルの促進は、免疫細胞をアネルギー化して、被験者に寛容を誘発するのも十分可能である。ＰＤ−１リガンド媒介性共刺激シグナルのブロックによる長期寛容の誘発により、これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の必要性を回避することができる。
【０１２５】
被験者において十分な免疫抑制または寛容を達成するために、他のポリペプチドの共刺激機能をブロックすることも望ましい。たとえば、移植前または移植時に、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２それぞれの活性を有する一組の可溶性型のペプチドを投与し、これらの抗原に対する抗体をブロックまたは小分子をブロックすることによって、これらの抗原の機能をブロックするのが望ましい（シグナル組成において別々または一緒に）。別法として、ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の阻害活性を促進し、Ｂ７−１および／またはＢ７−２の共刺激活性を阻害するのが望ましい。本発明のダウンレギュレーション方法と組み合わせて用いうる他のダウンレギュレーション作用剤として、たとえば、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを伝達する作用剤、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーまたは可溶性型の他の受容体リガンドペアに対する抗体（たとえば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドの相互作用を妨害する作用剤など（たとえば、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体または免疫抑制剤が挙げられる。
【０１２６】
免疫応答のダウンレギュレーションは、自己免疫疾患の治療にも有用である。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾患の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を妨げることにより、疾患の症状を軽減または排除することができる。ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することなく、あるいはダウンレギュレーションしながら、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を破壊することまたはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を促進することによって免疫細胞の共刺激をブロックする試薬の投与は、免疫細胞活性化の阻害および疾患プロセスに関与しうる自己抗体またはサイトカインの産生の妨害に有用である。さらに、ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の阻害機能を促進する作用剤は、自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容を誘発することができ、疾病からの長期救済を導くことができる。自己免疫疾患を予防または緩和する試薬の効力は、多くのヒト自己免疫疾患の十分に特徴付けられた動物モデルを用いて決定することができる。例として、マウス実験用自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける全身紅斑性狼瘡、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスならびにＢＢラットにおける糖尿病およびマウス重症筋無力症が挙げられる(たとえば、Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, Third Edition 1993, chapter 30を参照)。
【０１２７】
免疫細胞活性化の阻害は、たとえば、ＩｇＥ産生の阻害によるアレルギーおよびアレルギー反応の治療において治療的に有用である。ＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１阻害機能を促進する作用剤は、患者における免疫細胞によるアレルギー反応を阻害するためにアレルギーの患者に投与することができる。免疫細胞のＰＤ−１リガンド共刺激の阻害あるいはＰＤ−リガンドまたはＰＤ−１阻害経路の刺激は、適当なＭＨＣポリペプチドと組み合わせたアレルゲンへの暴露を伴う。アレルギー反応は、アレルギーの侵入経路および肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥの沈着パターンによって、自然において、全身性または局所性である。したがって、免疫細胞によるアレルギー反応は、ＰＤ−１リガンドと共刺激レセプターとの相互作用を阻害する作用剤、あるいはＰＤ−１リガンドまたはＰＤ−１の阻害機能を促進する作用剤の阻害形態の投与により、局所性または全身性である。
【０１２８】
ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を調節することなく、あるいはダウンレギュレートしながらのＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用のブロックまたはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用の促進による免疫細胞活性化の阻害は、免疫細胞のウイルス感染においても治療的に重要である。たとえば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルス複製は免疫細胞活性化により刺激される。これらの相互作用の調節の結果、ウイルス複製が阻害され、それによってＡＩＤＳの進行が改善される。これらの調節は、妊娠の持続を促進するのにも有用である。ＰＤ−１リガンドは、通常、母親と胎児の間の接合部分を形成し、胎児の母性拒絶の防止において役割を果たすと考えられる細胞の層である胎盤栄養膜において高度に発現される。胚または胎児の免疫拒絶のために自然流産の危険のある女性（たとえば、以前に自然流産したことがある女性または妊娠が困難である女性）は、このような相互作用を調節する作用剤で治療することができる。
【０１２９】
ＰＤ−１リガンド／Ｂ７ポリペプチド結合の調節によるか、あるいはＰＤ−１リガンド／ＰＤ−１結合の調節による免疫応答のダウンレギュレーションは、自家組織の自己免疫攻撃の治療においても有用である。たとえば、ＰＤ−１リガンドは、通常、心臓において高度に発現され、心臓を自己免疫攻撃から防御する。これは、Ｂａｌｂ／ｃＰＤ−１ノックアウトマウスが、血栓症の心臓に対して重い自己免疫攻撃を示すという事実により明らかにされる。したがって、自己免疫攻撃により引き起こされるかまたは悪化する状態（たとえば、この例においては、心臓病、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症）は、これらの相互作用の調節によって緩和または改善される。したがって、自己免疫疾患などの自己免疫攻撃によって悪化する状態（ならびに心臓病、心筋梗塞、およびアテローム性動脈硬化症）を調節することは本発明の範囲内である。
【０１３０】
４．免疫応答のアップレギュレーション
免疫応答のアップレギュレーションの手段として、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進すること（たとえば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用に影響を及ぼすことなく、あるいは阻害しながら）により、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１および／またはＢ７ポリペプチドとＣＴＬＡ４の相互作用をブロックすることもまた治療的に有用である。Ｂ７ポリペプチドとＣＤ２８の間の相互作用を増強するためにＢ７ポリペプチドトＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックすることもまた免疫応答のアップレギュレーションに有用である。免疫応答のアップレギュレーションは、存在する免疫応答の増強または最初の免疫応答の顕在化という形態をとることができる。たとえば、本発明の組成物および方法を用いる免疫応答の増強は、微生物（たとえば、細菌、ウイルスまたは寄生虫）に対する感染の場合に有用である。１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤は、免疫応答の増強に用いられる。このような作用剤（たとえば、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合をブロックする非活性化抗体）は、抗体のアップレギュレーションおよび細胞媒介性応答が有益である状況において治療的に有用である。好ましい態様において、このような作用剤は、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を阻害することなく、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する（たとえば、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを妨げる相互作用）。疾患の例として、疱疹または帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患が挙げられ、このような場合、作用剤は皮膚に局所適用することができる。さらに、インフルエンザ、風邪および脳炎などの全身ウイルス性疾患は、このような作用剤の全身投与によって軽減される。
【０１３１】
別法として、免疫応答は、エキソビボアプローチ、たとえば、免疫細胞を患者から取りだし、免疫細胞をインビトロで、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤と接触させ、次いでインビとロ刺激免疫細胞を患者へ再度導入することにより、感染した患者において高めることができる。
所定の例において、免疫応答をアップレギュレートする他の作用剤、たとえば、免疫応答をさらに高めるように共刺激レセプターを経てシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーのメンバーの形態をさらに投与することが望ましい。
【０１３２】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤（たとえば、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を増強することによって）は、種々のポリペプチド（たとえば、病原体由来のポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に用いることができる。
病原体（たとえば、ウイルス）に対する免疫性を、適当なアジュバント中、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤と共にウイルスタンパク質でワクチン予防接種することにより誘導することができる。
【０１３３】
他の態様において、本明細書に記載するように、免疫応答機能のアップレギュレーションまたは増強は、腫瘍免疫原性の誘発に有用である。
他の態様において、免疫応答を、本明細書に記載の方法によって刺激して、先在している寛容に打ち勝つことができる。たとえば、被験者が有意な免疫応答を構築することができない抗原、たとえば、腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫応答は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする作用剤（たとえば、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を増強することによって）を投与することにより、誘導することができる。１つの態様において、Ｂ７ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節することなく、あるいはアップレギュレートしながら、またはＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの相互作用を促進することによって、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする可溶性ＰＤ−１または可溶性ＰＤ−１リガンドを用いて、たとえば腫瘍細胞に対する免疫応答を高めることができる。１つの態様において、腫瘍特異的抗原などの自己抗原を、併用投与することができる。他の態様において、免疫応答を抗原（たとえば、自己抗原）に対して刺激して、神経疾患を治療することができる。別の態様において、本発明作用剤をアジュバントとして用いて、活性免疫化のプロセスにおいて外来抗原への反応をブーストすることができる。
ることができる。
【０１３４】
１つの態様において、免疫細胞を被験者から得、エキソビボで、本明細書に記載の作用剤の存在下で培養して、免疫細胞集団を増殖させるか、または免疫細胞活性化を増強する。さらなる態様において、次いで、免疫細胞を被験者へ投与する。たとえば、免疫細胞へ一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルを当該分野で周知のごとく提供することにより、免疫細胞をインビトロで刺激することができる。種々の作用剤を用いて、免疫細胞の増殖を共刺激することもできる。１つの態様において、免疫細胞をＰＣＴ出願ＷＯ９４／２９４３６に記載の方法に従いエキソビボで培養する。共刺激ポリペプチドは可溶性であり、細胞膜結合へ結合、またはビーズなどの固体表面へ結合することができる。
【０１３５】
ＶＩ．作用剤の投与
本発明の免疫調節作用剤は、免疫細胞による免疫応答を増強させるかまたは抑制するかのいずれかのために、インビボの医薬的投与に適した生物学的に適合性の形態において被験者に投与される。「インビボ投与に適した生物学的に適合性の形態」とは、任意の有毒な影響よりもタンパク質の治療効果の方が重きをなす、投与されるタンパク質の形態を意味する。「被験者」なる用語は、免疫応答を惹起できる生きている生物、たとえば、哺乳動物を包含することを意図する。被験者の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種を包含する。本明細書に記載の作用剤の投与は、治療有効量の作用剤単独または医薬的に許容しうる担体との組み合わせを包含する薬理学的形態のいずれであってもよい。
【０１３６】
治療有効量の本発明の治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するために必要な用量および時間で有効な量として定義される。たとえば、抗ＰＤ−１リガンド調節作用剤の治療有効量は、個体の疾病の状態、年齢、性別、および体重ならびにペプチドが個体において所望の反応を惹起する能力によって変わり得る。投薬計画は、最適の治療反応を提供するように調節できる。たとえば、いくつかに分割された用量を毎日投与することができ、または治療状況の緊急性により、比例して減少させることができる。
【０１３７】
本明細書に記載した作用剤は、都合のよい様式、たとえば、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与により投与することができる。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を酵素、酸および化合物を不活化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護するために物質中でコーティングすることができる。たとえば、経口投与以外によって作用剤を投与するためには、ペプチドをその不活化を防止する作用剤でコーティングするか、またはペプチドを該作用剤と共に同時投与するのが望ましい。
【０１３８】
作用剤は、個体に、適当な担体、希釈剤またはアジュバント中で投与することができ、酵素阻害剤と同時投与することができ、またはリポソームなどの適当な担体中で投与することができる。医薬的に許容しうる希釈剤は、塩溶液および水性緩衝溶液を包含する。アジュバントはその最も広い意味で用いられ、任意の免疫刺激化合物、たとえばインターフェロンを包含する。本発明において意図されるアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを包含する。酵素阻害剤は、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＥＰ）およびトラシロールを包含する。リポソームは、水中油中水エマルジョンならびに慣用のリポソームを包含する（Sternaら(1984)J.Neuroimmunol.7:27）。
【０１３９】
作用剤は、非経口または腹腔内投与することができる。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油中においても調製できる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の成長を防止するための保存料を含んでもよい。
注射可能な用途に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用滅菌粉末を包含する。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を通過する程度まで流動性でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒体である。適当な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の活動の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合において、等張剤、たとえば、糖、ポリアルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが好ましい。組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、たとえばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることにより、注射可能な組成物の長期にわたる吸収がもたらされる。
【０１４０】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、前記の成分の一つまたは組み合わせと共に必要な量の本発明作用剤（たとえば、抗体、ペプチド、融合タンパク質または小分子）を適当な溶媒中に組み入れることにより調製でき、続いて濾過滅菌する。一般に、活性化合物を、塩基性分散媒体および前記のものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み入れることにより、分散液を調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合において、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分（たとえば、ペプチド）の粉末とあらかじめ濾過滅菌された溶液から得られる追加の所望の成分が得られる。
【０１４１】
前記のように、作用剤が適当に保護される場合、タンパク質を、たとえば不活性希釈剤または同化できる可食担体と共に経口投与できる。本明細書において使用する「医薬的に許容しうる担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。医薬的活性な作用剤についてのこのような媒体および作用剤の使用は、当業界において周知である。任意の慣用の媒体または作用剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用を意図する。補足的活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０１４２】
投与の簡便性および投与量の均一性のために、単位投与剤形の非経口組成物に製剤するのが特に有用である。本発明において使用される「単位投与剤形」とは、処置される哺乳動物被験者の単位投与量として適した物理的に独立した単位を意味し；各単位は所望の治療効果を生じるために計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を必要とされる医薬担体と組み合わせて含む。本発明の単位投与剤形の明細は、（ａ）活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性を治療するためのかかる活性化合物を配合する分野に固有の制限により決定され、直接従属する。
【０１４３】
本発明の１つの態様において、本発明の作用剤は抗体である。本明細書において定義するとおり、治療有効量（すなわち、有効量）の抗体は、約０.００１〜３０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０.０１〜２５ｍｇ／体重ｋｇ、さらに好ましくは約０.１〜２０ｍ／体重ｋｇ、なおいっそう好ましくは約１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、２〜９ｍｇ／体重ｋｇ、３〜８ｍｇ／体重ｋｇ、４〜７ｍｇ／体重ｋｇ、または５〜６ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。当業者らは、疾患または障害の重篤度、以前の治療、被験者の全般的健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を包含するが、これらに限定されないある因子が、被験者を有効に治療するために必要な用量に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の抗体での被験者の治療は、１回の処置を包含するか、または好ましくは一連の処置を包含しうる。好ましい例において、被験者は、約０.１〜２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲の抗体で、１週間に１回約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、さらに好ましくは約３〜７週間、なおいっそう好ましくは約４、５、または６週間処置される。当然のことながら、処置に使用される抗体の有効量は、特定の治療の過程にわたって増加または減少されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】１Ｇ１０（抗Ｂ７−１）抗体、１０Ｆ．９Ｇ２（抗ＰＤ−１）抗体、１０Ｆ．２Ｈ１１（抗ＰＤ−１）抗体およびＰＤ−１ Ｉｇポリペプチドの存在または不在下において、ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞のＢ７−１ Ｉｇへの結合を表すデータの棒グラフである。
【図２】１０Ｆ．９Ｇ２抗体の存在または不在下において、ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞のＰＤ−１ Ｉｇへの結合を表すデータの棒グラフである。データは、１０Ｆ．９Ｇ２抗体が、この相互作用を阻害することを示す。
【図３】ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞のＢ７−１およびＢ７−２への結合を表すデータの棒グラフである。ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞へのＢ７―１およびＢ７−２の結合能力の比較を表す。
【図４】ＦＡＣＳ分析によって得られたデータのグラフ表示であり、マウスＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２へのマウスＰＤ−１結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４５】
本発明を以下の限定的と考えるべきでない実施例によりさらに説明する。本出願全体にわたって引用される全ての文献、特許および公開特許出願ならびに図面は、全体を参考文献として本発明に援用される。
【実施例１】
【０１４６】
結合パートナーとしてのＰＤ−１リガンドおよびＢ７ポリペプチドの同定
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４以外の新規Ｂ７−１結合パートナーを同定するために、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４欠損マウス由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｐＡＸＥＦ哺乳類発現ベクターにおけるマウスｃＤＮＡライブラリーを、ＣＤ２８欠損、ＣＴＬＡ４欠損１２９株マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞から調製したＲＮＡから作製した。ＭＡＣＳによって、フローサイトメトリーで確認される純度９５％以上までＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。抗ＣＤ３ｍＡｂ＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）で、Ｔ細胞を活性化した。ＣＤ２８欠損、ＣＴＬＡ４欠損１２９株マウスのＴ−枯渇脾細胞からのＡＰＣを、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０ｍＡｂ３／２３で一夜刺激し、次いで、マイトマイシンＣで処理し（５０μｇ／ｍｌ、３７℃にて４０分間）、洗浄して、Ｔ細胞の刺激に用いた。１６、２４および４０時間後、ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーの製造のために合わせた。
【０１４７】
選択の第１ラウンドのために、８０プレートのＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン操作により、１００ｍｍディッシュ当たり０.２ｇのプラスミドライブラリーＤＮＡでトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理し、翌日リプレートし、４５時間後にＰＢＳ中の０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％アジ化ナトリウムで細胞を採集した。Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ９.５中の１０ｍｌの１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を入れた１００ｍｍのペトリ皿を室温にて１.５時間インキュベートすることによって、パニングプレートを調製した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ＋５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中で一夜ブロックした。次いで、プレートを３ｍｌの１０μｇ／ｍｌマウスＢ７−１−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ、２％ＦＣＳで３回洗浄した。８０プレートからのトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を８パニングプレート上でインキュベートした。室温にて２時間後、プレートをＰＢＳ中の０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％アジ化ナトリウム、２％ＦＣＳで３回洗浄し、０.１５Ｍ ＮａＣｌ中の０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１％ＦＣＳで２回洗浄した。付着細胞からエピソームＤＮＡを調製し、電気穿孔によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に再導入し、スフェロプラストのポリエチレングリコールによる融合によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトさせ、パニングを繰り返す。付着細胞からエピソームＤＮＡを調製し、電気穿孔によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に再導入し、スフェロプラストのポリエチレングリコールによる融合によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトさせ、３回目のパニングを繰り返す。個々のプラスミドＤＮＡを調製し、配列決定した。すべてのプラスミド（配列決定された６個）は、マウスＰＤ−Ｌ１をコードするｃＤＮＡを含むことが見出された。ｃＤＮＡクローンは、５’非翻訳領域の長さにおいてわずかに異なり、ＰＤ−Ｌ１遺伝子が独立して複数回単離されたことを示し、したがって、先に実験室で生成されたクローンの偶発的な単離の可能性が排除された。これらのマウスＰＤ−Ｌ１ ｃＤＮＡクローンを、ＤＥＡＥ−デキストラン操作（４μｇ／１００ｍｍディッシュ）によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、７２時間後に間接的免疫蛍光法およびフローサイトメトリーによってマウスＢ７−１−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質の細胞表面結合を分析した
【実施例２】
【０１４８】
ＰＤ−１リガンド分子のＢ７分子への結合
マウスプレＢ細胞(300.19)を、ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）ベクター、またはｐＡＸＥＦベクターにマウスＰＤ−Ｌ１ ｃＤＮＡを含む発現プラスミドのいずれかで、プロマイシン耐性をコードするプラスミドとともにトランスフェクトした。１０μｇ／ｍｌのプロマイシンを含む培地中で細胞を選択し、ＰＤ−１−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質で染色し、分別し、サブクローニングした。さらなる分析のために、ＰＤ−Ｌ１を高レベルで発現しているクローンを選択した。
３００．１９トランスフェクト体(２.５ｍｌの培地中、５Ｘ１０６細胞)を２.５μｌのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(分子プローブ、ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌ、２’,７’−（ビス−２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン）)で３７℃にて５分間標識した。細胞を２回洗浄し、ウエル当たり５００００細胞／５０μｌを用いた。
【０１４９】
Linbro９６ウエルマイクロタイタープレート（組織培養処置をしていない）を、１００μｌのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体で、４℃にて一夜コーティングした。プレートを吸引し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで２時間ブロックした。次いで、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇ、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２ＩｇまたはＰＤ−１Ｉｇ０.１ｍｌとともにウエルをインキュベートした。５００００ＢＣＥＣＦ−Ａ標識トランスフェクト細胞を、ブロッカーの存在または不在下に加えた。テストしたブロッカーは、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇ、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＰＤ−１Ｉｇ、１Ｇ１０抗体（マウスＢ７−１に結合し、ＣＴＬＡ４との相互作用をブロックする）、１６−１０Ａ１抗体（マウスＢ７−１に結合し、ＣＴＬＡ４との相互作用をブロックする）、１０Ｆ．９Ｇ２抗体（マウスＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１との相互作用をブロックする）および１０Ｆ．２Ｈ１１抗体（マウスＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１との相互作用をブロックする）であった。プレートを７００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、室温で３０分間インキュベートした。各ウエルにおける蛍光（細胞数を示す）を蛍光プレートリーダーで測定した。プレートをディッシュに入れた大量の１％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸し、プレートをゆるやかに反転させ、次いで、室温にて３０分間１ｇで付着細胞を落とすことによって、プレートを１回洗浄した。次いで、洗浄を繰り返した。次いで、プレートをもとどおりにし、各ウエルにおける蛍光（細胞数を示す）を蛍光プレートリーダーで測定した。プレートに結合した細胞のパーセントを決定した。ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、Ｂ７―１Ｉｇプレートに結合したが、Ｂ７―２Ｉｇプレートには結合しなかった。コントロールＩｇもＣＴＬＡ４Ｉｇも、この結合相互反応に競合しなかった（図１）。対照的に、１Ｇ１０、１０Ｆ．９Ｇ２および１０Ｆ．２Ｈ１１抗体ならびに各ＰＤ−１Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１／Ｂ７―１Ｉｇ相互作用の結合に競合し、細胞結合を減少させた（図２）。コントロール実験において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、ＰＤ−１Ｉｇコーティングしたプレートへの結合を示した（図２）。コントロールＩｇ、ＰＤ−１Ｉｇおよび１０Ｆ．２Ｈ１１抗体はすべて、このアッセイにおいて結合に対して競合できなかった（図２）。１０Ｆ．９Ｇ２抗体のみが、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用に対して競合し、細胞結合を減少させた（図２）。
【実施例３】
【０１５０】
ＰＤ−１リガンド分子のＦＡＣＳ分析
３００.１９細胞を、ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）ベクターまたはＩＣＯＳリガンド、ｍＰＤ−Ｌ１またはｍＰＤ−Ｌ２ｃＤＮＡを含む発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。
細胞をｍＩｇＧ２ａ、ｍＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ａ、ｍＢ７−１−ＩｇＧ２ａ、ｍＢ７−２−ＩｇＧ２ａまたはｍＰＤ−１−ＩｇＧ２ａ（０.１ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）とともに４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ＋０.０２％アジ化ナトリウムおよび２％ＦＢＳ)で洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗ｍＩｇＧ２ａ抗体（０.１ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）(Southern Biotech Associates)とともにインキュベートした。ＦＡＣＳ分析を用いて免疫蛍光について細胞を分析し、結果を図４に示した（図４における数は、平均蛍光強度を示す）。ＩＣＯＳリガンドまたはコントロール細胞への結合はなかった。ＰＤ−Ｌ１細胞は、ｍＰＤ−１−ＩｇＧ２ａおよびｍＢ７−１−ＩｇＧ２ａに結合したが、ｍＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ａまたはｍＢ７−２−ＩｇＧ２ａには結合しなかった。ＰＤ−Ｌ２細胞はｍＰＤ−１−ＩｇＧ２ａおよびｍＢ７−１−ＩｇＧ２ａに結合した（弱く）が、ｍＣＴＬＡ４−ＩｇＧ２ａまたはｍＢ７−２−ＩｇＧ２ａには結合しなかった（図４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定する方法であって、
ａ）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定し；次いで、
ｂ）ステップａにおいて同定した作用剤が、ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する；
［ここで、ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害しないステップｂの作用剤が同定される］
ことを含む方法。
【請求項２】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定する方法であって、
ａ）ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定し；次いで、
ｂ）ステップａにおいて同定した作用剤が、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する；
［ここで、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害しないステップｂの作用剤が同定される］
ことを含む方法。
【請求項３】
Ｂ７−１ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する方法であって、
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの相互作用を阻害する作用剤と
ａ）ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞を接触させるか；または、
ｂ）Ｂ７−１ポリペプチドをもつ免疫細胞を接触させる；
ことを含む方法。
【請求項４】
作用剤が、抗ＰＤ−１リガンド抗体である請求項３記載の方法。
【請求項５】
作用剤が、小分子である請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ１である請求項３記載の方法。
【請求項７】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ２である請求項３記載の方法。
【請求項８】
作用剤が、抗Ｂ７−１抗体である請求項３記載の方法。
【請求項９】
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する方法であって、
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害することなく、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの相互作用を阻害する作用剤と
ａ）ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞を接触させるか；または、
ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをもつ免疫細胞を接触させ；
それによってＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害することを含む方法。
【請求項１０】
作用剤が、抗ＰＤ−１リガンド抗体である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
作用剤が、小分子である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ１である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ２である請求項９記載の方法。
【請求項１４】
作用剤が、抗Ｂ７−１抗体である請求項９記載の方法。
【請求項１】
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定する方法であって、
ａ）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定し；次いで、
ｂ）ステップａにおいて同定した作用剤が、ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する；
［ここで、ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害しないステップｂの作用剤が同定される］
ことを含む方法。
【請求項２】
ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定する方法であって、
ａ）ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する作用剤を同定し；次いで、
ｂ）ステップａにおいて同定した作用剤が、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する；
［ここで、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害しないステップｂの作用剤が同定される］
ことを含む方法。
【請求項３】
Ｂ７−１ポリペプチドとＰＤ−１リガンドの間の相互作用を阻害する方法であって、
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの相互作用を阻害する作用剤と
ａ）ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞を接触させるか；または、
ｂ）Ｂ７−１ポリペプチドをもつ免疫細胞を接触させる；
ことを含む方法。
【請求項４】
作用剤が、抗ＰＤ−１リガンド抗体である請求項３記載の方法。
【請求項５】
作用剤が、小分子である請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ１である請求項３記載の方法。
【請求項７】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ２である請求項３記載の方法。
【請求項８】
作用剤が、抗Ｂ７−１抗体である請求項３記載の方法。
【請求項９】
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害する方法であって、
ＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害することなく、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの相互作用を阻害する作用剤と
ａ）ＰＤ−１リガンドをもつ免疫細胞を接触させるか；または、
ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをもつ免疫細胞を接触させ；
それによってＰＤ−１リガンドとＢ７−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害せずに、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの間の相互作用を阻害することを含む方法。
【請求項１０】
作用剤が、抗ＰＤ−１リガンド抗体である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
作用剤が、小分子である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ１である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
ＰＤ−１リガンドが、ＰＤ−Ｌ２である請求項９記載の方法。
【請求項１４】
作用剤が、抗Ｂ７−１抗体である請求項９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−７８６０６（Ｐ２０１０−７８６０６Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３０４１１（Ｐ２００９−２３０４１１）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【分割の表示】特願２００３−５４４２１６（Ｐ２００３−５４４２１６）の分割
【原出願日】平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２）
【出願人】（５９１１８３９９１）ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【分割の表示】特願２００３−５４４２１６（Ｐ２００３−５４４２１６）の分割
【原出願日】平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２）
【出願人】（５９１１８３９９１）ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【Ｆターム（参考）】
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