免疫調節剤として使用される酢酸グラチラマー
種々の疾患、ウイルス感染、又は中毒物質によって引き起こされる肝線維化傷害を治療する方法であって、免疫調節剤として酢酸グラチラマーを使用することを伴う方法。治療対象となる疾患は、肝線維化及び肝細胞癌である。また、炎症性腸疾患の治療における酢酸グラチラマーの使用も開示される。更に、肝線維化、肝細胞癌及び炎症性腸疾患の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、肝線維化の治療における、免疫調節剤、特に酢酸グラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ ａｃｅｔａｔｅ）（コパクソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）［コポリマー−１（Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−１）としても知られている］、Ｔｅｖａ社製）の、随意的にＩＬ−２等の他の免疫活性物質と組み合わせた使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
本発明者らは、既に、ＩＬ−１０によって減弱される肝線維化に、ＣＤ８リンパ球サブセットの増加、及びＣＤ４リンパ球サブセットの減少が介在して関与していることを報告している［Ｓａｆａｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｏｓｔｅｒ ＃３８７、ＡＡＳＬＤ、Ｂｏｓｔｏｎ ２００２、Ｓａｆａｄｉ，Ｒ．ら、Ｏｒａｌ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ＃６１０、ＡＡＳＬＤ、Ｂｏｓｔｏｎ ２００２、及びＳａｆａｄｉ，Ｒ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ ２００４］。ラットインターロイキン１０（ｒＩＬ−１０）を肝細胞で分泌するトランスジェニックマウスを作製し、２種の異なる動物モデルにおける、肝線維形成に対するサイトカインの持続的局所的な発現の影響を評価することにより、この問題にアプローチした。ｒＩＬ−１０の抗線維化作用を確認して、このサイトカインのリンパ球サブセットに対する影響を特徴付け、ＣＤ８リンパ球の特異的減少を確認した。最終的に、肝傷害を有する動物から単離したＣＤ８リンパ球の線維形成活性を、ナイーブ動物への養子移植により試験した。しかし、ＮＫ細胞は、通常、抗原提示を行うＣＤ４細胞及び樹状（ＣＤ１１ｃ陽性）細胞によって活性化される。マウスでは、ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩａ分子に特異的である、ｉＫＩＲ（抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｋｉｌｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ））及びａＫＩＲ（活性化ＫＩＲ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＫＩＲ））を共に発現するが、細胞殺傷（ｋｉｌｌｉｎｇ）は標的細胞上のＭＨＣクラスＩａの減少時にのみ起こる。
【０００３】
このように、本発明者らが用いた実験モデル（以下で詳述する。）において、ＮＫ細胞の抗線維化作用は、活性化ＨＳＣの死滅の増加を伴うＮＫ細胞の活性化を介している。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、線維形成に有利なＣＤ４減少、及び線維形成に不利なＮＫ細胞活性化という、相反する作用が見られる可能性がある。このような知見は、線維化の免疫介在に関する理解を著しく広め、ＣＤ４、ＣＤ８及びＮＫサブセットの操作が、線維化の治療的調節における潜在的オプションであることを示唆するものであり、本発明の基礎をなすものである。
【０００４】
肝線維化は、肝臓における結合組織の蓄積の形で現れる。線維化は、原因にかかわらず、肝臓に対する慢性的な傷害の結果である。肝傷害への応答の際に、肝星細胞は分化転換又は活性化して、増殖性のマトリックス産生細胞になり、この細胞が線維化を生じさせる［Ｖａｎ Ｗａｅｓ，Ｌ．及びＬｉｅｂｅｒ，Ｃ．Ｓ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９７７；７３：６４６−６５０、Ｓｃｈｕｐｐａｎ，Ｄ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００１；２１：３５１−３７２］。活性化星細胞の主要なマーカーとしては、β−ＰＤＧＦ受容体、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、及びα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）が挙げられる［Ｖａｎ Ｗａｅｓ及びＬｉｅｂｅｒ、１９７７、ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｓｃｈｕｐｐｍａｎら（２００１）ｉｄ ｉｂｉｄ．］。星細胞による線維形成は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ１）［Ｒｏｊｋｉｎｄ，Ｍ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９７９；７６：７１０−７１９］、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１０７５６−１０７６４］等の線維化誘導性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）サイトカイン、及びインターロイキン１０、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等の抗線維化サイトカイン［ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９２；１５：９８９−９９７、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：２２４７−２２５０、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、ｅｄ．Ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．２１．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｔｈｉｅｍｅ；２００１、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．１９９６；１４：１０１−１３０、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９５；２２：２８−３６］の活性の反映である。ＩＬ−１０の抗線維化活性は、培養星細胞の研究により示唆されている。この研究では、ＩＬ−１０に対する中和抗体がマトリックスの蓄積を減少させ［ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｒ．Ｆ．ら、１９９２、ｉｄ ｉｂｉｄ．］、実験用の肝炎動物にＩＬ−１０を外部投与すると、線維化が減弱し［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、（１９９６）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ，Ａ，Ｍ．、（１９９５）ｉｄ ｉｂｉｄ．］、また、ＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて、中毒性傷害に応答して、しばしば線維化の増大が見られる［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．及びＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９；８４：１７８０−１７８５、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９３；１９：１１７−１３２］。
【０００５】
最近の研究では、サイトカインだけでなく、サイトカインを分泌する炎症細胞、例えば、肝マクロファージ（クッパー細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ（Ｔｈ）、ＣＤ８陽性サブセット等のリンパ球にも、焦点が当てられている［ＭｃＧｕｉｒｅら、（１９９２）ｉｄ ｉｂｉｄ．；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ．］。リンパ球サブセットはまた、Ｔｈ１優勢及びＴｈ２優勢のいずれかのものに大雑把に分類することができる［Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：３０２−３０８］。例えば、Ｔｈ１リンパ球サイトカインであるＩＦＮ−γは、強力な抗線維化活性を有する［Ｗａｎｇら（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｗｉｎｗｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５；２２：３０４−３１５］。インターフェロンγ産生Ｔｈ１細胞のレベルの増加を示すＣ５７ＢＬ／６マウスでは、比較的軽度の線維化が見られ、他方、主にＴｈ２応答を示すＢＡＬＢ／ｃマウスでは、四塩化炭素に応答して重度の線維化が生じる［Ｗａｎｇら（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｙｕ，Ｑ．及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０００；１４：１６３−１７６、Ｎｉｅｔｏ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９９；３０：９８７−９９６］。更に、インターフェロンγ欠損の重症の複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスでは、野生型動物よりも著明な線維化が現れる［Ｗｉｎｗｏｏｄら（１９９５）ｉｄ ｉｂｉｄ．］。これらのデータは、肝線維化が、種々の免疫細胞サブセットの応答に影響されること、及び、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインサブセットが、毒素に対する線維化応答から生じる肝傷害を調節することができることを示唆する。この種の研究が発端となって、マウス及びヒトにおける、線維化の危険性に関連する遺伝子座の探索が開始されている（そのような遺伝子座が、免疫応答を調節する遺伝子をコードしている可能性があるという仮定の下に行われている）［Ｎｉｅｔｏ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９９；３０：９８７−９９６、Ｓｖｅｇｌｉａｔｉ−Ｂａｒｏｎｉ，Ｇ．ら、Ｌｉｖｅｒ ２００１；２１：１−１２］。
【０００６】
免疫が介在する、ヒトの肝線維化の制御がますます重要視され、免疫抑制が重要な刺激条件として同定されている。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者では、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に同時感染すると、肝傷害の程度と関係なく、線維化の危険性が加速度的に高まる［Ｂａｃｈｅｍ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９；２７：５５５−５６５、Ｃａｓｉｎｉ，Ａ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７；２５：３６１−３６７、Ｗｉｎｎｏｃｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９５；１０：Ｓ４３−Ｓ４６］。同様に、肝硬変への進行は、ＨＣＶに慢性的に感染した肝移植患者（長期間の免疫抑制治療を必要とする。）において、自然感染の患者に比べて大きく加速し［Ｃａｓｉｎｉら（１９９７）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｗｉｎｎｏｃｋら（１９９５）ｉｄ ｉｂｉｄ．］、また、一部は、急速に進行する線維形成症候群（１年以内に再発性の肝硬変を招く可能性がある。）を発症する。［Ｇｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；２７１：９８４−９８７］。
【０００７】
線維化は、慢性肝傷害を有するほとんどすべての患者で生じる可逆的な瘢痕化応答である。最終的に、肝線維化は、結節形成及び器官収縮によって特徴付けられる肝硬変を招く。肝硬変の原因にはいくつかあり、先天性、代謝性、炎症性及び中毒性の肝疾患が含まれる。例として、住血吸虫症、特発性の門脈線維症、アルコール、メトトレキサート、イソニアジド、ビタミンＡ、アミオダロン、慢性のＨＢＶ及びＨＣＶ、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、自己免疫性慢性肝炎、慢性受動性うっ血、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、α１−アンチトリプシン欠損症、炭水化物代謝障害、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、嚢胞性線維症、胆道閉鎖症／新生児肝炎、先天性胆嚢嚢胞、非アルコール性脂肪性肝炎、及び静脈閉塞性疾患が挙げられる。すべて合わせると、標的となる肝線維化集団は、全世界で何千万の患者になる。従って、効果的な抗線維化療法の開発が非常に重要になる。このような療法の目的は、肝傷害部位における活性化肝星細胞（ＨＳＣ）の蓄積を阻害し、細胞外マトリックスの沈着を予防することにある。このような手法の多くは肝線維化の実験モデルでは有効であるが、ヒトにおける有効性及び安全性はまだ分かっていない。これまで、ヒトにおける抗線維化剤として認められている薬物はない。
【０００８】
星細胞活性化のパラダイムから、抗線維化療法の部位／標的を決定するための重要な枠組みが得られる［総説については、Ｂａｔａｌｌｅｒ，Ｒ．及びＢｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００１；２１：４３７−４５２を参照のこと］。このような戦略には、（Ａ）原疾患を治療して、傷害を予防すること、（Ｂ）星細胞活性化を刺激するのを避けるために、炎症又は宿主応答を低減させること、（Ｃ）星細胞活性化を直接下方制御すること、（Ｄ）星細胞の増殖応答、線維形成応答、収縮応答及び／又は炎症誘発応答を無効にすること、（Ｅ）星細胞のアポトーシスを刺激すること、並びに（Ｆ）マトリックスプロテアーゼを生成する細胞を刺激し、そのインヒビターを減少させ、或いはマトリックスプロテアーゼを直接投与することにより、瘢痕マトリックスの分解を増大させることが含まれる。
【０００９】
肝線維化及び肝硬変は、どのような原因から生じたものであっても、肝細胞癌（ＨＣＣ）の主要な原因となる。ＨＣＣは、主に肝硬変の患者に合併症として生じる腫瘍群のうちの１つである。外科的切除、化学塞栓、腫瘍内へのアルコール注入等の対症療法により生存期間が延長されるが、一般に患者の大多数の予後は依然改善されてない［Ｆａｒｍｅｒ Ｄ．Ｇ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１９９４；２１９：２３６−２４７］。ＨＢＶが関与するＨＣＣはＨＢｓＡｇを細胞表面に発現するが、これは、特定の状況下で腫瘍関連抗原として働く可能性がある［Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８；８５：８２７６−８２８０］。
【００１０】
サイトカインを用いて培養した肝臓ＭＮＣから精製された、ＣＤ５６陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、ＨｕＨ−７ ＨＣＣ細胞に対して強力な細胞毒性を示し、他方、同様に精製された通常のＴ細胞は、そのような細胞毒性を示さないが、このことは、硬変肝におけるＣＤ５６陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の数の減少が、それらの細胞のＨＣＣに対する感受性に関与している可能性があることを示唆する［Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０００；３２（５）：９６２−９］。ＮＫ細胞活性は、ＨＣＣ患者において、コントロール群に比べて有意に低下するが、このことは、ＨＣＣ患者における肝切除後の再発及び予後を予測するのに、手術前のＮＫ細胞活性が役立つことを示唆する［Ｔａｋｅｔｏｍｉ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；８３（１）：５８−６３］。
【００１１】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞増殖因子として十分認められている。ＩＬ−２は、転移性黒色腫、急性骨髄性白血病、及び転移性腎細胞癌を治療するための有望な免疫療法剤である。高用量のＩＬ−２レジメンが黒色腫及び腎細胞癌の治療において臨床上有利であるが、用量規定毒性が重いため、広範な患者群において、臨床使用が制限されている。低用量のＩＬ−２療法は、黒色腫では、期待外れの臨床的寛解率（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅ）しか得られていない。低用量のＩＬ−２に対する寛解率は、腎細胞癌の方が良かったが、このような反応の質は、高用量ＩＬ−２療法の場合と比べて、依然として懸念される。化学療法レジメン（生化学療法）にＩＬ−２を追加すると、転移性黒色腫患者において、全体として最大６０％の寛解率が見られたが、これはまだ、生存率の改善が確実になったと解釈されていない。ＩＬ−２ベースのレジメンを更に改変した場合、又はＩＬ−２に新たな薬剤を追加した場合に、より良い抗腫瘍応答が生じ、生存率が改善されるかどうかは、まだ確認されていない。
【００１２】
ＩＬ−２は、切除不能ＨＣＣの、有効かつ耐容性が良好な治療剤と考えられている。腎細胞癌及び黒色腫のＩＬ−２による治療は、最初は、毒性の高さ故に、治療関連死亡を伴っていた。但し、ＩＬ−２は、適切な状況下であれば、安全に投与することができる。低用量のＩＬ−２は、切除不能肝細胞癌の、有効かつ耐容性が良好な治療剤と考えることができる。肝硬変を基礎とする進行ＨＣＣが組織学的に確認されている１組の患者１８例（男性１４例及び女性４例、年齢中央値６６歳、範囲４９〜８２歳）において、ＩＬ−２が長期間、超低用量（増悪するまでは１ＭＩＵ／ｄ）で持続的に皮下投与された後、中央値１９．５か月の経過観察期間が報告された。２例で完全寛解（腫瘍消散（ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）と定義される。）が観察され（１１．１％）（それぞれ３５か月及び４６か月持続した）、一例で部分寛解（５．５％）が記録された（全寛解率１６．６％、９５％ＣＩ：０〜３３．８％）。１３例の患者（７２．３％、９５％ＣＩ：６１．６〜８２．７）で、疾患の安定状態が少なくとも４か月続き、これらの患者のうち一例では、肺転移の完全寛解が得られた。無増悪期間の中央値は１５．３か月であった（９５％ＣＩ：１０〜３３）。全生存期間の中央値は２４．５か月であった（９５％ＣＩ：１２〜４３）。２例の患者（１１．１％）で治療中に増悪した。毒性は局所的なものにすぎなかった（通常は注射部位の疼痛及び水疱）［Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００２；２５（３）：２２４−６］。一部の癌患者の治療に、インターロイキン２を用いた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）へのＥｘ ｖｉｖｏ刺激が用いられており、これが大きな成功を収めている。６例の肝細胞癌（ＨＣＣ）患者から得られた腫瘍浸潤リンパ球の細胞殺傷活性が、自己単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を用いて増強された。自己樹状細胞（同じ患者からのもの）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＧ−４）の存在下で６日間培養したＣＤ１４陽性単球から生成した。これらのプロフェッショナル抗原提示細胞には、全自己肝腫瘍ライセートがパルスされた（ｐＤＣ）。ＴＩＬは、ｐＤＣ又はパルスしていない（ｕｎｐｕｌｓｅｄ）ＤＣと共培養された。ＴＩＬの細胞毒性は、標準の細胞毒性試験において、ＴＩＬが標的腫瘍細胞Ｋ６５２、Ｄａｕｄｉ細胞株及び同種ＨＣＣ細胞を溶解することができるかどうかで評価された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された標的腫瘍細胞の腫瘍浸潤リンパ球による溶解は不十分であり、Ｔ細胞の反応性低下が示された。対照的に、Ｄａｕｄｉ（９．１５％＋／−７．５）及び同種ＨＣＣ（１８．２％＋／−９．２）の標的腫瘍に対するＨＣＣ由来ＴＩＬの細胞殺傷活性は、ｐＤＣで刺激すると、有意に増強することができた（Ｄａｕｄｉ：３８％＋／−６．８、同種のＨＣＣ：５５％＋／−１０）。Ｋ５６２に対するＴＩＬの細胞殺傷活性は、ｐＤＣの影響を受けなかった。このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＣＣ由来ＴＩＬの低い細胞毒性プロファイルは、腫瘍ライセートをパルスした樹状細胞によって増大させることができる。従って、養子免疫療法で用いると、ｉｎ ｖｉｖｏで、より効果的である可能性がある［Ｆｒｉｅｄｌ，Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００；１５：４７７−８６］。
【００１３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管の一般的な免疫介在性疾患である。Ｔｈ１炎症性サブタイプとＴｈ２抗炎症性サブタイプの間の免疫応答の不均衡は、このような障害の発生に関与している［Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ＤＫ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９１；３２５：９２８−９３５、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ．Ａ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３：８４７−８５６、Ａｄｏｒｉｎｉ Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９９７；１８：２０９−２１１］。実験的大腸炎及びＩＢＤ患者のいずれにおいても、上記疾患はＴｈ１媒介性の免疫障害であり、大腸に対する、生涯に渡る炎症応答を引き起こす。ＩＦＮ−γ等の炎症性サイトカインの分泌については、文献［Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１９９７；１８：６１−６４］に記載がある。ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ１媒介性サイトカインの炎症作用を下方制御し、それにより上記疾患を緩和する［Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９６；１８３：２６０５−２６１６、Ｍａｄｓｅｎ ＫＬ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：１５１−１５９、Ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ Ｓａｎｄｅｒ Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：３８３−３８９］。
【００１４】
ＩＢＤの発生には、毒性、伝染性、又は免疫介在性の作用の結果である、特異的な腸粘膜のエピトープの暴露が関与している［Ｈｉｂｉ Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３；５４：１６３−１６８、Ｄａｓ ＫＭ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９０；９８：４６４−４６９、Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ＤＫ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９１；３２５：９２８−９３５、Ｄａｓｇｕｐｔａ Ａ．ら、Ｇｕｔ．１９９４；３５：１７１２−１７１７、Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９５；１８２：１２８１−１２９０］。このような潜在性の抗原は、能動自己免疫による炎症性応答を刺激する［Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｆ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９８５；７６：３１１−３１８、Ｚ’ｇｒａｇｇｅｎ Ｋ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：８０８−８１６］。ＩＢＤを有するヒト、及びＴＮＢＳで誘発された実験的大腸炎を有する動物のいずれにおいても、上記疾患はＴｈ１型免疫介在性障害である［Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ａ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９６；１８３：８４７−８５６、Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９５；１８２：１２８１−１２９０］。炎症を起こした粘膜において刺激された細胞は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の産生量の増加、及びＩＬ−４の産生量の減少を引き起こし、それにより炎症細胞を誘引し、粘膜構造を破壊する。対照的に、ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ１サイトカインの炎症誘発作用を下方制御し、場合により上記疾患を緩和する［Ｍａｄｓｅｎ ＫＬ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：１５１−１５９］。
【００１５】
酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））は、４種のアミノ酸のランダムな混合物からなる合成コポリマーであり、これは、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）に特徴的な、ＣＮＳに対する自己免疫応答を改変することができる。この自己免疫反応は、ＣＮＳの炎症、及び脱髄を引き起こし、最終的に軸索を消失させる。ＲＲＭＳ患者に対する３種の無作為二重盲検において、酢酸グラチラマーの皮下投与（２０ｍｇ／日）は、平均再発率、非再発患者の割合、及び磁気共鳴映像法［ＭＲＩ］スキャンで見られるガドリニウム造影病巣の数から見て、極めて効果的であることが示されている。酢酸グラチラマーはまた、一連のＭＲＩ測定を用いた欧州／カナダの研究における評価において、疾患の活動性及び疾患の負担を有意に低減させることも示されている。酢酸グラチラマーで治療されたＲＲＭＳ患者では、障害が減弱される可能性がはるかに高く、全体的な障害状態は大きく改善された。酢酸グラチラマーは通常、耐容性が良好である。すなわち、最もよく報告されている治療関連有害事象は、局所的な注射部位反応、及び注射後の一過性全身反応であり、いずれの反応も通常、軽度で自己制限的なものであった。酢酸グラチラマーは、インターフェロンβでＲＲＭＳを治療された患者で報告されている、インフルエンザ様症候群又は中和抗体を伴わない。利用可能なデータ及び最新の管理ガイドラインに基づくと、酢酸グラチラマーは、ＲＲＭＳ患者の治療のための有用な第一選択薬である［Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｄ．ら、２００２；１６（１２）：８２５−８５０、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００３；１７（３）：２０７−１０］。
【００１６】
酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｅｖａ社製）は、実験的自己免疫性脳脊髄炎における樹状細胞の調節を通じて、Ｔｈ２ ＣＤ４細胞の発育を促進し、ＩＬ−１０の産生を増加させることが報告されている［Ｃｏｐａｘｏｎｅ：Ｖｉｅｉｒａ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３］。
【００１７】
酢酸グラチラマーは、移植片対宿主病を予防し、免疫拒絶の種々の症状を妨げる。皮膚及び甲状腺の移植アッセイの２種の移植系において、酢酸グラチラマー処置は、皮膚移植片の生存期間を延長し、甲状腺移植片の機能的な悪化を阻害した。酢酸グラチラマーは、刺激性の同種細胞と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすると、移植片特異的なＴ細胞株の増殖、並びにそのインターロイキン２及びインターフェロンγの分泌を阻害した。酢酸グラチラマー処置は、移植片に対するＴｈ１応答を阻害し、酢酸グラチラマー及び移植片細胞に応答したＴｈ２のサイトカイン分泌を誘発し、移植片の生存期間及び機能の改善をもたらした［Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００１］。
【００１８】
本発明の目的である、肝線維化の治療に有効な薬剤の探索において、本発明者らは、マウスの肝線維形成に対するＣｏｐａｘｏｎｅの影響をｉｎ ｖｉｖｏで調査した。
【００１９】
更に、これは本発明の別の目的であるが、随意的にＩＬ−２と組み合わせたＣｏｐａｘｏｎｅによる抗線維化免疫調節は、線維化関連ＨＣＣに対して拮抗的に作用しうることが示唆されている。
【００２０】
別の一態様では、炎症性腸疾患に罹患した患者へのＣｏｐａｘｏｎｅの投与は、新たな治療戦略を生み出す可能性がある。
【００２１】
本発明の上記その他の目的は、説明が進むにつれて明らかになる。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、肝線維化を治療する方法であって、それを必要とする個体に免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法に関する。
【００２３】
より詳細には、本発明は、肝線維化を治療する方法であって、それを必要とする個体に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤を投与することを含む方法に関する。
【００２４】
免疫調節剤としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
【００２５】
本発明の方法は特に、ヒトの治療に使用されるものである。
【００２６】
本発明は更に、肝線維化を治療するための医薬組成物の調製における免疫調節剤、特に肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤の使用に関する。
【００２７】
この態様において、本発明は、好ましくは、肝線維化を治療するための医薬組成物の調製における酢酸グラチラマーの使用に関する。
【００２８】
更に、本発明は、肝線維化の治療に使用する免疫調節剤、特に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす薬剤、最も好ましくは酢酸グラチラマーに関する。
【００２９】
更に別の態様において、本発明は、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こすことにより肝線維化を治療する方法であって、このような治療を必要とする個体に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤を投与することを含む方法に関する。投与すべき免疫調節剤としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
【００３０】
免疫調節剤は、線維化肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こし、それにより肝線維化を低減させるために使用される。免疫調節剤としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
【００３１】
更なる一態様において、本発明は、肝線維化の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）被験物質を提供するステップと、（ｂ）線維化を誘発させたモデル動物、及び非線維化モデル動物を提供するステップと、（ｃ）前記被験物質を前記線維化動物及び非線維化動物に投与するステップと、（ｄ）前記動物から肝組織の試料を採取するステップと、（ｅ）前記試料における、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＮＫ細胞数、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比、及び線維化組織の面積、並びに少なくとも１種の一般的な線維化パラメータ、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、（ｆ）線維化を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非線維化動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇、及び／又は線維化組織の面積の縮小、及び／又は前記一般的な線維化パラメータの低下が、前記被験物質が肝線維化の治療に有用であることを示す方法に関する。
【００３２】
一般的な肝傷害パラメータとしては、ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＩｓｈａｋ傷害スコア（Ｉｓｈａｋ ｉｎｊｕｒｙ ｓｃｏｒｅ）が挙げられる。しかし、線維化パラメータは、Ｉｓｈａｋ線維化スコア（Ｉｓｈａｋ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｃｏｒｅ）、コンピューター（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ）Ｂｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）による定量、及びウェスタンブロッティング分析を用いたα平滑筋アクチンの評価である。
【００３３】
別の態様において、本発明は、肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つを治療する方法であって、それを必要とする個体に、肝組織又は腸組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす少なくとも１種の免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法に関する。
【００３４】
好ましくは、ヒト個体を治療するための免疫調節剤は、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである。
【００３５】
より具体的には、肝組織又は腸組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤、望ましくは随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーは、肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つを治療するための医薬組成物の調製に使用することができる。
【００３６】
略語：
本願明細書では以下の略語を用いる。
ｉＫＩＲ：抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｋｉｌｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
ａＫＩＲ：活性化キラー免疫グロブリン様受容体（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｋｉｌｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
ＮＫ：ナチュラルキラー細胞
ＨＳＣ：肝星細胞
Ｉ．Ｐ．：腹腔内
ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＡＬＴ：アラニントランスアミナーゼ
ＥＣＭ：細胞外マトリックス
ＨＣＣ：肝細胞癌
ＨＳＣ：肝星細胞
【発明の詳細な説明】
【００３７】
下記の実施例で示すように、本発明者らが用いた実験モデルにおいて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の抗線維化作用は、刺激されたＨＳＣの死滅の増加を伴うＮＫ細胞の活性化を介している。すなわち、本発明者らが用いた実験モデルにおいて、ＮＫ細胞の抗線維化作用は、活性化ＨＳＣの死滅の増加を伴うＮＫ細胞の活性化を介している。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、線維形成に有利なＣＤ４減少、及び線維形成に不利なＮＫ細胞活性化という、相反する作用が生じる可能性がある。このような知見は、免疫系の線維化プロセスへの関与に関する理解を著しく広め、ＣＤ４、ＣＤ８及びＮＫサブセットの操作が、線維化を調節する治療的アプローチにおける潜在的オプションであることを示唆する。
【００３８】
肝線維化の治療及び／又は予防に使用可能な薬剤を見出すことを目的として、本発明者らは、線維化肝組織においてＣＤ４：ＣＤ８比を上昇させ、それによりＮＫ細胞数を増加させると、線維化が抑制される可能性があることを提唱した。
【００３９】
本研究において、本発明者らは、線維化を誘発させたマウスを、酢酸グラチラマー等の免疫調節剤で治療すると、ＣＤ４：ＣＤ８比が増大し、いくつかのスコアで測定される疾患状態が改善されることを見出した。
【００４０】
下記の実施例、特に図２、図４及び図５に示すように、線維化は、線維化の程度を評価するための一般的なパラメータである、Ｉｓｈａｋ肝線維化スコアリング及びコンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）解析によって測定したところ、すべてのＣＣｌ４誘発群で有意に増大した。酢酸グラチラマーで処置した動物では、有意に低いスコアが示された。また、Ｉｓｈａｋ肝傷害スコアリングにおいても、線維化は、線維化誘発後、すべての線維化群で有意に増大したが、酢酸グラチラマー処置群及びリノマイシン（ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）処置群で有意に低くなった。
【００４１】
図７で見られるように、ＣＤ４：ＣＤ８比は、酢酸グラチラマー処置群において、コントロール群（ＣＣｌ４誘発非処置線維化群）に比べて有意に上昇した。ＮＫ細胞の総数も、処置群（酢酸グラチラマー群及びリノリン（ｌｉｎｏｌｉｎ）群）で増加した（図８）。更に、処置群では、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の顕著な変化が観察された（図９）。
【００４２】
このように、本発明者らは、免疫調節剤、特に酢酸グラチラマー（コパクソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））は、用いた動物モデルにおいて顕著な抗線維化作用を有することを明らかにした。この作用が、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及びこれによるＮＫ細胞の総数の増加を介していたことが、理論的制約なしに示唆される。これらのＮＫ細胞は、活性化星細胞を抑制するように刺激され、活性化されることによって、線維化を低減させた。
【００４３】
このように、本発明は、肝線維化の治療における免疫調節剤、特に酢酸グラチラマーの使用に関する。更に、本発明は、必要な患者に、本発明の免疫調節剤を治療有効量投与することにより肝線維化を治療する方法、及び上記疾患を治療するための上記薬剤を含有する組成物を提供するものである。
【００４４】
本発明の免疫調節剤としては、肝組織、特に線維化肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こすことができるものが特に好ましい。
【００４５】
薬剤としては、酢酸グラチラマーが最も好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、本発明の免疫調節剤、特に酢酸グラチラマーを有効成分として含有し、更に、別の治療剤、及び／又は薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を随意的に含有してもよい。
【００４７】
医薬組成物の調製は当技術分野で周知であり、また、多くの論文及びテキストに記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、特にｐｐ．１５２１−１７１２を参照のこと（当該文献は、参照することにより、本明細書にそのまま組み込まれる）。
【００４８】
本発明の医薬組成物の投与、及び用量決定は、適切な医療慣行に従って行うことができる。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等、種々の方法で実施することができる。但し、経口投与等、他の投与方法も可能である。
【００４９】
本発明の組成物は、遊離型の活性物質を含有し、治療対象の個体に直接投与することができる。或いは、本発明の組成物は、活性分子のサイズに応じて、担体と結合させて投与するのが望ましい。治療製剤は、通常のいかなる投与剤形でも投与することができる。製剤は通常、１種又は複数の許容される担体と共に、少なくとも１種の上述の有効成分を含有する。
【００５０】
各担体は、他の成分と適合し、かつ患者に無害であるという意味で、薬学的に、かつ生理学的に許容されるものである必要がある。製剤には、経口、直腸、経鼻、又は非経口（皮下、筋肉内、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、及び皮内を含む。）投与に適したものが含まれる。製剤は、好都合なことに単位剤形で提供することができ、また、製薬学の分野で周知のいかなる方法によって調製することもできる。そのような化合物のすべてについて、性質、有効性、供給源、及び投与方法（個体において望ましい効果を生じさせるのに必要な有効量を含む。）は、当技術分野で周知であり、本明細書で更に説明する必要はない。
【００５１】
より具体的には、本発明の活性薬剤又はそれを含有する組成物は、経口投与、静脈内投与、非経口投与、経皮投与、皮下投与、腟内投与、鼻腔内投与、粘膜投与、舌下投与、局所投与、及び直腸投与、並びにそれらの任意の組合せから選択される経路によって投与することができる。これらの免疫調節剤又は組成物は、ＩＶ注射又はＩＰ注射することが好ましい。
【００５２】
注射用に適した薬剤形態としては、無菌の水溶液剤又は分散剤、並びに、無菌の注射用溶液剤又は分散剤を即時調製するための無菌の散剤が挙げられる。いずれの場合も、薬剤形態は、無菌でなければならず、また、容易に注射可能な程度の流動性を有しなければならない。組成物は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、また、細菌、菌類等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００５３】
微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含有するのが好ましい。吸収遅延剤を組成物中で用いることにより、注射用組成物の吸収を引き延ばすことができる。
【００５４】
無菌の注射用溶液剤の調製は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙した他の種々の成分と共に加え、次いで、ろ過滅菌することによって行う。分散剤の調製は、一般に、滅菌した種々の有効成分を、ベースとなる分散媒と、上に列挙したものから選ばれる他の必要な成分と、を含有する無菌のビヒクル中に加えることによって調製する。
【００５５】
無菌の注射用溶液剤を調製するための無菌散剤の場合、調製方法としては、予めろ過滅菌した溶液から、有効成分及びその他の所望成分の散剤を生み出す、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術が好ましい。
【００５６】
本発明の医薬組成物は通常、緩衝剤、及びそのオスモル濃度を調節する薬剤を含有し、更に、当技術分野で知られている１種又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は添加剤を随意的に含有する。また、この組成物は、補助的な有効成分を含有してもよい。担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、植物油等の、溶媒又は分散媒を用いることができる。適正な流動性を維持するには、例えば、レシチン等のコーティング剤を用いたり、必要な粒子サイズを維持したり（分散剤の場合）、界面活性剤を用いたりすればよい。
【００５７】
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤等が含まれる。このような媒体及び薬剤を薬学的に有効な物質のために用いることは、当技術分野で周知である。通常のいかなる媒体又は薬剤も、有効成分と不適合なものでない限り、治療組成物中で用いることが想定されている。
【００５８】
用量は、体重、年齢、性別、疾患の重症度、及び耐容性に応じて決まり、主治医によって決定される。ヒトにおける用法は、好ましくは、２年間、１日１回、約１５〜約２０ｍｇを皮下注射するか、又は１日当たり約５〜約５０ｍｇを経口投与することであり、最も好ましくは、２年間、１日１回、２０ｍｇを皮下注射することである。
【００５９】
本発明はまた、肝障害を治療又は予防する方法であって、本発明の薬剤、又は本発明の医薬組成物、或いはその好ましい実施形態の１つを、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
【００６０】
本発明はまた、肝臓の障害又は疾患を治療するための治療剤を、このような治療を必要とする患者に投与する方法であって、前記患者に本発明の活性薬剤及び前記治療剤を投与するステップを含む方法に関する。上記治療剤の投与は、本発明の免疫調節剤の投与と同時に行っても、また、その前後いずれに行ってもよい。
【００６１】
本発明者らの知見を利用して、肝線維化の治療に使用できる治療剤をスクリーニングすることができる。すなわち、更なる態様において、本発明は、肝線維化の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）被験物質を提供するステップと、（ｂ）線維化を誘発させたモデル動物、及び非線維化モデル動物を提供するステップと、（ｃ）前記被験物質を前記線維化動物及び非線維化動物に投与するステップと、（ｄ）前記動物から肝組織の試料を採取するステップと、（ｅ）前記試料における、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＮＫ細胞数、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比、線維化組織の面積、及び一般的な線維化パラメータ、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、（ｆ）線維化を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非線維化動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇、及び／又は線維化組織の面積の縮小、及び／又は前記一般的な線維化パラメータの低下が、前記被験物質が肝線維化の治療に有用であることを示す方法に関する。
【００６２】
一般的な線維化パラメータとしては、例えば、Ｉｓｈａｋ肝線維化スコアリング、コンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）解析、及びヒドロキシプロリン（ＨＰ）が好ましいが、線維化の改善を示す適切な評価項目であれば、いかなるものを本発明のスクリーニング方法で用いてもよい。ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＩｓｈａｋ傷害スコアは、肝傷害パラメータとして認められている。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法では、前記コントロール、すなわち非線維化動物の代わりに、又はそれに加えて、肝線維化スコアの基準値を比較のために用いてもよい。
【００６４】
また、本発明のスクリーニング方法は、適当な動物モデル及び臨床パラメータを用いた場合にＨＣＣ及びＩＢＤの治療に有利な結果を示すことができる免疫調節剤を同定するために用いることもできる。
【００６５】
継続的な肝細胞傷害を伴う慢性活動性肝炎は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症する危険性を劇的に増大させる。慢性炎症プロセスは、肝臓の細胞の死滅及び再生を伴い、最終的に肝細胞における形質転換変異（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を招く可能性がある。ＨＣＣ細胞における共通の事象であるウイルスＤＮＡの組込みは、宿主細胞の遺伝子制御を妨害し、悪性化（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を招く可能性がある。マウスにおいて、ＨＢＶ感染は、ＨＢＶ遺伝子の直接的微量注入によって克服することができる。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子が組み込まれ、高レベルで発現すると、肝細胞傷害及びＨＣＣが発現する。また、Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質（ＨＢｘ）遺伝子のみが高レベルで発現すると、肝癌を引き起こす可能性がある。従って、ＨＣＣの動物モデルとしては、種々のＨＢＶトランスジェニックマウスを用いることができる。ＨＣＶトランスジェニックマウスもＨＣＣの適当なモデルである。
【００６６】
肝損傷は、次の病理学的パラメータ：門脈浸潤、肝内転移、肝静脈浸潤、漿膜浸潤、腫瘍被膜の欠如、又は被膜浸潤の存在、をスコア化することによって評価することができる。或いは、チャイルドピューステージ（Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ ｓｔａｇｅ）、腫瘍の形態及び拡大、血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル、及び門脈血栓症パラメータを含むＣＬＩＰスコアを考慮することもできる。
【００６７】
ＩＢＤに関しては、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与によって誘発された実験的大腸炎の動物モデルが好ましい。大腸損傷は、細胞死、組織崩壊及び浮腫の程度の違いによって明らかとなる。これらのパラメータは、組織固定及びＨ＆Ｅ染色の後に測定することができる。組織学的損傷スコア（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄａｍａｇｅ ｓｃｏｒｅ）は、例えば、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）の陰窩スコアリング（ｃｒｙｐｔ ｓｃｏｒｉｎｇ）の方法によって決定することができる。［Ｃｏｏｐｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；６９：２３８−２４９］。
【００６８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法も、本発明の範囲内のものとして想定されている。
【００６９】
更なる一態様において、本発明は、ＨＣＣの治療における酢酸グラチラマーの、随意的にＩＬ−２と組み合わせた使用に関する。上述の通り、肝線維化及び肝硬変は、どのような原因から生じたものであっても、肝細胞癌（ＨＣＣ）の主要な原因となる。下記の実施例に示すように、ＣＤ４／ＣＤ８比の減少は線維形成に有利に働くが、ＮＫ細胞は、活性化ＨＳＣのアポトーシスの増加を介する抗線維化作用を有する。動物モデルでは、酢酸グラチラマー処置の後、ＮＫ細胞及びＣＤ４／ＣＤ８比が増加し、同時に線維化が低減した。ＨＩＶ患者において、ＩＬ−２処置がＣＤ４数を増加させること、及びＮＫ細胞が抗ＨＣＣ作用を有することが示唆されたことから、線維化が関与する肝臓腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答は、ＮＫ細胞誘発及びＣＤ４／ＣＤ８比を増大させることによって改善可能であることが提唱される。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が関与するＨＣＣは、ＨＢｓＡｇを細胞表面上に発現する。そして、このＨＣＣは、腫瘍関連抗原として働く可能性がある。提案する治療の詳細は、下記の実施例に示す。随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーは、ＮＫ細胞の刺激及び絶対数の増大、及びＣＤ４／ＣＤ８比の上昇を介する、ＨＣＣに対する十分な抗腫瘍作用を示す可能性がある。各化合物の作用を試験して、それらを組み合わせた処置の、ありうる相乗効果について知ることができる。また、各化合物の作用を試験して、それらの作用が直接的な抗腫瘍作用かどうか、或いはそれらの作用が抗線維化作用を介するものかどうかを確認することができる。いずれの化合物もヒトの臨床において他の適応症に使用されており、安全性及び耐容性が十分認められているので、この研究の結果は、特にＨＣＣに関して、また、一般に他の腫瘍の多くに関しても、新たな治療的アプローチを切り開く可能性がある。
【００７０】
本発明のこの態様では、ＨＣＣの治療及び／又は予防のための医薬組成物であって、酢酸グラチラマーを含有し、更に、ＩＬ−２等の別の免疫調節剤（ＩＬ−２に限定されない。）を随意的に含有する医薬組成物も想定されている。酢酸グラチラマーを単独で、又はＩＬ−２と組み合わせて用いて、ＨＣＣを治療する方法も包含される。
【００７１】
更なる一態様において、本発明は、炎症性腸疾患、主に潰瘍性大腸炎及びクローン病の治療における酢酸グラチラマーの、随意的にＩＬ−２と組み合わせた使用に関する。炎症性腸疾患は主に大腸の炎症性傷害であること、及び酢酸グラチラマーが線維化モデルの肝傷害を低減させたことから、酢酸グラチラマー及びＩＬ−２は、単独で、又は組み合わせることによって、ＮＫ細胞の刺激及び絶対数の増大、及びＣＤ４／ＣＤ８比の上昇を介する、炎症性腸疾患に対する十分な抗炎症作用を示す可能性がある。各化合物の作用を試験して、それらを組み合わせた処置の、ありうる相乗効果について知ることができる。また、各化合物の作用を試験して、それらの作用が直接的な抗炎症作用かどうかを確認することができる。いずれの化合物もヒトの臨床において他の適応症に使用されており、安全性及び耐容性が十分認められているので、この研究の結果は、特に炎症性腸疾患に関して、また、一般に他の炎症性疾患の多くに関しても、新たな治療的アプローチを切り開く可能性がある。
【００７２】
本発明のこの態様では、炎症性腸疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物であって、酢酸グラチラマーを含有し、更に、ＩＬ−２等の別の免疫調節剤（ＩＬ−２に限定されない。）を随意的に含有する医薬組成物も想定されている。酢酸グラチラマーを単独で、又はＩＬ−２と組み合わせて用いて、炎症性腸疾患を治療する方法も包含される。
【００７３】
本明細書を通じて、種々の刊行物が引用される。このような刊行物は、そこで引用された刊行物も含めて、参照することにより、本明細書にそのまま組み込まれる。
【００７４】
開示及び説明が行われているが、本発明が、本明細書で開示された特定の実施例、処理ステップ及び材料に限定されるわけではなく、このような処理ステップ及び材料が、いくらか異なるものとなる可能性があることは理解されるはずである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物のみによって限定されるので、本明細書で用いる用語が、特定の実施形態を説明する目的で用いられているにすぎず、限定的なものとして意図されていないことも理解されるはずである。
【００７５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容上明確に断っていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００７６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含有する、含む）」という語、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形体は、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、記載した１つの完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）若しくはステップ、又は完全体若しくはステップの群を包含することを意味すること、及び、他のいかなる完全体若しくはステップ、又は完全体若しくはステップの群も除外することを意味するわけではないことが理解されるはずである。
【００７７】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らが用いた技術の代表例である。これらの技術が、本発明を実施するための好ましい実施形態を例示するものであること、及び、当業者が、本明細書の開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの改変を行うことが可能であることを認識することは理解されるはずである。
【実施例】
【００７８】
（材料）
四塩化炭素（ＣＣｌ４、Ｓｉｇｍａ社製、Ｃ−５３３１）、組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｅｖａ社製）。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、セントルイス、米国ミズーリ州）。
【００７９】
動物： 次の３群のＢＡＬＢ／ｃマウス：Ａ）野生型（ＷＴ）、Ｂ）重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス（Ｂ細胞及びＴ細胞が欠失）、及びＣ）ＳＣＩＤベージュ（Ｂｅｉｇｅ）（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が欠失）、を用い、これらを第４の非処置ＷＴ群と比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型及びＳＣＩＤ）も用いた。動物の取扱いは、米国国立衛生研究所のガイドラインに従った。
【００８０】
実験計画：
（Ｉ）肝線維化におけるＮＫ細胞の役割：
本研究では、次の３群のＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齡、雄）：Ａ）野生型（ＷＴ）、Ｂ）重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス（Ｂ細胞及びＴ細胞が欠失）、及びＣ）ＳＣＩＤベージュ（Ｂｅｉｇｅ）（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が欠失）、に、四塩化炭素（ＣＣｌ４）を４週間腹腔内投与することにより肝線維化を誘発させ、これらを第４の非処置ＷＴ群と比較した。肝線維化の評価は、肝臓エキスから得たα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）のウェスタンブロッティングによって、また、シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ）染色した肝組織切片（動物１個体当り３６個）をＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）形態計測システムで分析することによって行った。ＦＡＣＳ解析のために、非処置ＷＴ動物及びＣＣｌ４線維化ＷＴ動物から、脾細胞、肝内リンパ球（ＩＨＬ）及び肝星細胞（ＨＳＣ）を単離した。
【００８１】
（ＩＩ）肝線維化の免疫療法：
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（８週齡、雄）に、ＣＣｌ４を６週間ＩＰ投与することにより肝線維化を誘発させた。また、最後の２週間に、動物には、２００マイクログラム／日のＣｏｐａｘｏｎｅをＩＰ投与し（Ａ群）、又は１ｍｇ／ｍｌのＬｉｎｏｍｙｃｉｎを飲料水で投与し（Ｂ群）、又は生理食塩水で処置し（Ｃ群）、ナイーブマウス（Ｄ群）と比較した。各群には８匹の動物が含まれた。肝線維化の評価は、Ｉｓｈａｋ Ｋｎｏｄｅｌｌスコア［Ｋｎｏｄｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９８１；１（５）：４３１−５］及びヒドロキシプロリンによって、また、シリウスレッド染色した肝組織切片（動物１個体当り３６個）をＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）形態計測システムで分析することによって行った。ＦＡＣＳ解析のために、すべての動物群から脾細胞を単離した。肝線維化と、脾細胞におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞、ｉＫＩＲ及びａＫＩＲの発現と、の相関関係を評価した。
【００８２】
（ＩＩＩ）肝細胞癌の免疫療法：
ＨＣＣ動物モデルにおける脾細胞の再構成に続いて、マウスに、（Ａ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ、（Ｂ）ＩＬ−２、又は（Ｃ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ及びＩＬ−２、による処置を２週間行い、或いは（Ｄ）追加処置を行わない。これらの処置プロトコールを、肝線維化を誘発させたマウスに適用し、４つの追加群（それぞれ（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ））を設けた。各群は１０匹の雄の動物を含む。
【００８３】
脾細胞の再構成に続いて、マウスの生存及び腫瘍サイズについて２週間観察する。ケタミン／キシラジンによる麻酔の後、動物を屠殺し、ＣＣｌ４の最終投与の３日後に、血清、肝臓及び細胞を採取する。血液試料を採取し、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ（下記参照）、及びＡＦＰのレベルを検査するまで−２０℃で凍結させる。脾細胞亜集団は、ＣＤ４及びＣＤ８、ＮＫマーカー、並びにキラー細胞抑制性受容体（ｋｉｌｌｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びキラー細胞活性化受容体（ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）についてＦＡＣＳ解析する。肝臓は、線維化の重症度について評価する。
【００８４】
（ＩＶ）炎症性腸疾患の免疫療法：
大腸炎の誘発の後、マウスに、（Ａ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ、（Ｂ）ＩＬ−２、又は（Ｃ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ及びＩＬ−２、による処置を１２日間行い、或いは（Ｄ）追加処置を行わない。各群は１０匹の雄の動物を含む。
【００８５】
ケタミン／キシラジンによる麻酔の後、動物を屠殺し、１２日目に血清及び大腸を採取する。血液試料を採取し、サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＦＮｇ、ＩＬ１０及びＴＧＦｂ）レベルを検査するまで−２０℃で凍結させる。脾細胞亜集団は、ＣＤ４及びＣＤ８、ＮＫマーカー、並びに抑制性キラー受容体及び活性化キラー受容体についてＦＡＣＳ解析する。大腸は、炎症の重症度について評価する。
【００８６】
動物モデル：
肝線維化動物モデル： マウス（８週齡、雄）に、ＣＣｌ４（コーン油で１０％に希釈）を体重１ｇ当たり５マイクロリットル、４〜６週間ＩＰ投与することにより肝線維化を誘発させた。
【００８７】
ＨＣＣ動物モデル： Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が関与するＨＣＣは、ＨＢｓＡｇを細胞表面上に発現し、腫瘍関連抗原として働く。層流フード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）内の滅菌ケージ中でレシピエントのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ社製、米国）を飼育し、照射済み食品及び無菌酸性水を与える。このマウスを致死量以下の放射線（６００ｃＧｙ）に曝す。放射線照射の２４時間後、動物の右肩に１０７のヒト肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＨＢｓＡｇを発現）を皮下注射する。放射線照射の７日後、胸腺欠損マウスに、骨髄細胞８０％及び脾臓細胞２０％の混合物を２×１０６細胞／マウスだけ投与し［Ｉｌａｎ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２７：１７０−１７６、１９９７］、その後、更に２週間観察する。
【００８８】
大腸炎を誘発させた炎症性腸疾患動物モデル： 文献［Ｔｒｏｐ Ｓ、Ｓａｍｓｏｎｏｖ Ｄ、Ｇｏｔｓｍａｎ Ｉ、Ａｌｐｅｒ Ｒ、Ｄｉｍｅｎｔ Ｊ及びＩｌａｎ Ｙ（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２９：７４６−７５５］に記載の通り、５０％エタノール１００μｌ中に溶解させたＴＮＢＳを１ｍｇ／マウスだけ直腸に点滴注入して、ＴＮＢＳ−大腸炎を誘発させた。
【００８９】
（方法）
肝臓及び大腸の組織検査： 肝臓の後部３分の１及び直腸Ｓ状部大腸を１０％ホルマリン中で２４時間固定し、次いで、自動組織処理装置（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）でパラフィン包埋した。各動物標本から７ミリメートルの切片を切り出した。各動物切片について、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。
【００９０】
肝臓切片（１５μｍ）を飽和ピクリン酸中で、０．１％シリウスレッドＦ３Ｂで染色した（いずれもＳｉｇｍａ社製）。更に、製造元の使用説明書に従って、ＤＡＫＯキット（カタログ番号Ｕ７０３３、ＥＰＯＳ社製、モノクローナル）を用いて、α平滑筋アクチンの免疫組織化学検査を実施した。
【００９１】
肝線維化の定量： シリウスレッド染色した肝切片（動物１個体当り３６個）を分析することにより、相対的線維化面積（肝臓総面積に対する百分率で示す。）を評価した。各領域（ｆｉｅｌｄ）の像を１０倍の倍率で得た後、コンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）形態計測システムを用いて分析した。相対的線維化面積を評価するために、測定したコラーゲン面積を正味領域面積で割り、更に１００を掛けた。総領域面積から血管腔面積を引いて、最終的な正味線維化面積を算出した。
【００９２】
脾細胞の単離： 屠殺時に脾臓を摘出し、７０μｍナイロンのセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通して分画した。ＲＢＣ溶解の後、脾細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で懸濁させ、ＦＡＣＳ解析まで４℃で保存した。
【００９３】
ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）解析： 脾細胞の分析は、Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製、米国）を用いた標準の技法に従って、１組の抗体（Ａｂ）を用いた直接免疫蛍光法により行う。要約すると、３×１０５個の脾細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合したＡｂと共に、４℃で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド含有固定液中で再懸濁させて分析する。脾細胞の染色に用いる抗体は、ＰＥ及びＦＩＴＣがそれぞれ結合したモノクローナル抗マウスＣＤ４及びＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の染色には、ＡＰＣが結合したラット抗マウスＣＤ４９ｂ／Ｐａｎ−ＮＫ細胞モノクローナル抗体を用いる。この抗体により、大多数のＮＫ細胞が同定される。キラー細胞抑制性受容体（ｉＫＩＲ）については、ＰＥが結合したモノクローナルマウス抗マウスＬｙ−４９Ｃ及びＬｙ４９Ｉを用いる。キラー細胞活性化受容体（ａＫＩＲ）については、ＦＩＴＣが結合したラット抗マウスＬｙ−４９Ｄモノクローナル抗体を用いた。制御性Ｔ細胞の役割を明らかにするために、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いた。リンパ球を同定するために、ペリジニンクロロフィル−αタンパク質（Ｐｅｒ−ＣＰ）が結合したラット抗マウスＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）による染色を用いた。
【００９４】
リンパ球サブセットは、ＣＤ４５陽性細胞に対する百分率で示す。
【００９５】
ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、及びα−フェトプロテインを検出するラジオイムノアッセイ： 市販の固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ａｕｓｒｉａ ＩＩ及びＡｕｓａｂ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ノースシカゴ、米国イリノイ州）により、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｓＡｇに対する抗体を測定する。ＲＩＡによる抗ＨＢｓの定量分析は、世界保健機関の標準血清を用いて、また、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒの式を利用して行い、データはｍＩｕ／ｍｌで示す。（２２）。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、ＲＩＡ（ＡＦＰ、Ｂｒｉｄｇｅ Ｓｅｒｏｎｏ社製、イタリア）によって測定し、ｎｇ／ｍｌで示す。
【００９６】
α平滑筋アクチンの免疫ブロッティング： 既に記載した方法［ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１７４：９１５−９２４］に修正を加えて、肝臓エキス中のα−ＳＭＡの免疫ブロッティングを実施する。
【００９７】
全肝臓タンパク質抽出物を、肝臓ホモジナイズ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及びＥＤＴＡフリーコンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、マンハイム、ドイツ））中で調製した。次いで、タンパク質（１レーン当り３０μｇ）を還元条件下、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離させた。免疫ブロッティングのために、タンパク質をＰｒｏｔｒａｎメンブランに移し、５％脱脂乳含有ブロッキング緩衝液中、４℃で一晩インキュベートした。抗ＳＭＡマウスモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製、カタログ番号Ｍ０８５１）、及びペルオキシダーゼが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐ．Ａ．Ｒ．Ｉ．Ｓ．、コンピエーニュ、フランス）、並びに高感度化学発光法（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いた。
【００９８】
統計： 統計的有意差については、スチューデントの検定を用いた。
【００９９】
（結果）
（Ｉ）肝線維化におけるＮＫ細胞の役割：
相対的線維化面積は、ＣＣｌ４ ＷＴでは肝臓総面積の２．３２％（±１．３９）、ＣＣｌ４ ＳＣＩＤでは１．１１％（±６．４）、ＣＣｌ４ ＳＣＩＤベージュでは１．８５％（±１．１９）、ナイーブＷＴでは０．３％（±０．３７）であった。すべてのＣＣｌ４処置群では、コントロールに比べて肝線維化が有意に増大した（Ｐ＝０．００１）。ＳＣＩＤベージュ群では、ＳＣＩＤ群に比べて線維化が有意に増大した（Ｐ＝０．０００１）。すべての群において、相対的線維化はα−ＳＭＡの発現と密接な相関関係があった。脾細胞のＦＡＣＳ解析により、ＷＴマウスでは、線維化の後、ＮＫ細胞及びＣＤ１１ｃ細胞の絶対数、並びにクラスＩの提示が有意に変化せず、ＣＤ４細胞が２６％±５．７から１９％±３．８に有意に減少し（Ｐ＝０．０１）、ＮＫ細胞におけるａＫＩＲ：ｉＫＩＲ比は０．７６±０．２１から２．７９±０．９８に有意に上昇する（Ｐ＝０．００３）ことが明らかになった。肝内リンパ球（ＩＨＬ）の分析でも、類似の結果が得られた。このような知見は、線維化誘発の後、ＮＫ細胞が機能的に活性化されることを示唆する。同時に、線維化の後、肝星細胞（ＨＳＣ）におけるクラスＩ分子の平均発現量は、８１％±１５から３７％±１２に有意に減少した（Ｐ＝０．００１）（基礎値の５１％±１３に低下）。ＨＳＣクラスＩＩ陽性分子の発現は変化しなかった。活性化ＨＳＣにおけるクラスＩの自己認識（ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）マーカーの減少は、活性化ＮＫ細胞による殺傷への感受性が増強されたことを反映している。
【０１００】
（ＩＩ）肝線維化の免疫療法：
以下のパラメータを用いて、ＣＣｌ４処置動物における肝傷害及び肝線維化を測定することにより、免疫療法の効果を評価した。
【０１０１】
肝傷害の重症度： ＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルによって評価した肝傷害は、ＣＣｌ４を処置したすべての実験群で、ナイーブマウスに比べて高かった。線維化を誘発させた異なる群間では、有意な差が見られなかった（図１）。
【０１０２】
肝組織の炎症及び壊死の状態を表す肝臓の種々の病理組織学的パラメータの、Ｉｓｈａｋ傷害スコアによる評価では、群間で差がないことが分かった（図２）。
【０１０３】
線維化重症度スコア： 線維化の重症度の評価は、種々の群から採取し、Ｈ＆Ｅ染色した肝切片のＢｉｏｑｕａｎｔ解析（図３の例を参照）、及びα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の定量によって評価した。
【０１０４】
分析面積に対するコラーゲンの百分率により評価した線維化の重症度は、ＣＣｌ４による線維化誘発の後、Ｃｏｐａｘｏｎｅ又はＬｉｎｏｌｉｎ処置群で有意に低下した（ｐ＜０．０００１）（図４に示す）。
【０１０５】
α平滑筋アクチンの量は線維化の程度と相関関係があり、このアクチンは、ＣＣｌ４動物群で高度に発現し、Ｃｏｐａｘｏｎｅ群及びＬｉｎｏｌｉｎ群で有意に減少した（図５）。
【０１０６】
リンパ球細胞集団： 脾細胞のＦＡＣＳ解析により、線維化誘発の後、すべての線維化群（Ａ、Ｂ及びＣ）でＣＤ４細胞が有意に減少する（ｐ＜０．０００５）ことが明らかとなったが、群間では、有意な差が見られなかった（図６）。
【０１０７】
ＣＤ８細胞は、Ａ群において、Ｃ群（ｐ＜０．０５）及びＤ群（ｐ＜０．００５）のいずれに比べても有意に減少した（図６）。ＣＤ４：ＣＤ８比は、線維化の後、Ｃ群で有意に低下した（ｐ＜０．０００３）（図７）。この比は、２つの処置群（Ａ及びＢ）で有意に上昇したが、ナイーブ動物（Ｄ群）よりはなお有意に低かった（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１６）。Ａ群のＣＤ４／ＣＤ８比は、Ｃ群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０４）（図７）。
【０１０８】
線維化の後、ＮＫ細胞の総数は変化しなかったが（Ｃ群及びＤ群）、処置群（Ａ及びＢ）ではいずれも数が増加し、この増加はＣｏｐａｘｏｎｅ群で有意であった（ｐ＜０．００２）（図８）。ａＫＩＲ：ｉＫＩＲ比を計算したが、ＮＫ細胞のａＫＩＲ及びｉＫＩＲについて、合計の値（ｔｏｔａｌ ｒｅａｄｉｎｇ）及び個別の値（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｄｉｎｇ）を測定した。いずれも同じパターンを示したが、図９で見られるように、線維化の後、すべての群（Ａ、Ｂ及びＣ）で比が有意に上昇したので、後者の方がより特異的であった。Ａ群及びＢ群では、ナイーブ群（Ｄ群）に比べて、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲの有意な上昇が見られたが（ｐ＜０．０００１）、非処置線維化群（Ｃ群）と比べると、なお有意に低かった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
肝内リンパ球のＦＡＣＳ解析により、線維化誘発の後、線維化群（Ａ及びＣ）でＣＤ４細胞が有意に減少する（ｐ＜０．０００００１）ことが明らかとなったが、群間では、有意な変化が見られなかった（図１０）。
【０１１０】
ＣＤ８細胞は、Ａ群において、Ｃ群に比べて有意に減少したが（ｐ＜０．００１）、Ｄ群よりは有意に高かった（ｐ＜４×１０−７）（図１０）。ＣＤ４：ＣＤ８比は、線維化の後、Ｃ群で有意に低下した（ｐ＜３．１×１０−１０）（図１１）。この比は、処置したＡ群で、Ｃ群に比べて有意に上昇したが（ｐ＜０．００２）、ナイーブ動物（Ｄ群）よりはなお有意に低かった（ｐ＜４．２×１０−１０）（図１１）。
【０１１１】
肝内のＮＫ細胞数は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ群において、線維化Ｃ群に比べて有意に増加した（ｐ＜０．０００１）（図１２）。
【０１１２】
結論： 上記の実験から、Ｃｏｐａｘｏｎｅ及びＬｉｎｏｍｙｃｉｎは、用いた動物モデルにおいて著しい抗線維化作用を示したことが明らかになる。この作用は、ＮＫ細胞の総数を増加させる、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇を介するものだった。それらのＮＫ細胞は、活性化星細胞を抑制するように活性化され刺激されることによって、線維化を低減させた。この結論は、Ｉｓｈａｋスコア法を用いて測定した肝傷害の程度において、Ｃｏｐａｘｏｎｅ群（Ａ）及びＣＣｌ４群（Ｃ）の間で有意な差がないことを示した病理組織学的所見によって強く支持される。従って、Ｃｏｐａｘｏｎｅは、炎症過程を直接低減させることによって線維化を低減させるのではなく、むしろ、ＨＳＣの活性化を抑制することによって線維化を低減させる。
【０１１３】
（ＩＶ）炎症性腸疾患の免疫療法：
大腸炎を誘発させた後、マウスをＣｏｐａｘｏｎｅで処置した。処置群とコントロール群の間で、大腸炎スコアを巨視的に、かつ微視的に比較した。いずれの試験においても、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置の結果、組織傷害の顕著な低減が見られた（図１３ａ及び１３ｂ）。図１４で実証されるように、微視的な改善が特に明らかであった（ｐ＜０．０３）。
【０１１４】
脾臓のＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８の細胞集団のＦＡＣＳ解析により、大腸炎を誘発させたＣｏｐａｘｏｎｅ処置群でＣＤ４細胞数が有意に増加する（ｐ＜０．０３）ことが明らかとなった（図１５）。ＣＤ４細胞数の増加は、インターロイキン４（ＩＬ−４）分泌細胞ではなく、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌細胞の増加を伴う（ｐ＜０．０２）ものだった（図１６）。
【０１１５】
ＣＤ８細胞集団は、大腸炎を誘発させても、Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置しても、影響を受けなかった（図１５）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置の後減少したように思われる（図１７）。
【０１１６】
測定したサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０の血清レベルは、大腸炎を誘発させたＣｏｐａｘｏｎｅ処置群において、大腸炎を誘発させた非処置群に比べて有意に低下した（それぞれｐ＜０．００６、ｐ＜０．００４、及びｐ＜０．００２）（図１８）。
【０１１７】
結論： Ｃｏｐａｘｏｎｅによる処置を行うと、大腸炎を罹患した動物の組織傷害は、免疫調節状態が変化することにより低減される。Ｃｏｐａｘｏｎｅの投与は、Ｔ細胞ＣＤ４集団の構成、並びにＴｈ１及びＴｈ２サイトカインのプロファイルに影響を及ぼした。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおけるＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルを示す図である。ＣＣｌ４線維化誘発マウスモデルにおいて、ＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルを測定して、肝傷害を評価し、治療効果を推定した。［略語： ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ：アラニントランスアミナーゼ、Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、ｕ／ｌ：ユニット／リットル］
【図２】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝傷害スコア及び肝線維化スコアを示す図である。病理学的分析及びＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）解析により、ＣＣｌ４で処置したすべての群において、ナイーブ動物に比べて、肝傷害及び肝線維化が有意に増大したことが明らかとなった。Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置群及びＬｉｎｏｍｙｃｉｎ処置群では、ＣＣｌ４線維化誘発非処置群に比べて、線維化の有意な低減が見られた（Ｐ値は０．００１未満）。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｈｅｐ．Ｉｎｊ．Ｓｃ．：肝傷害スコア、Ｉｎｊ．Ｓｃ．：傷害スコア、Ｆｉｂｒ．Ｓｃ．：線維化スコア、％ｆｉｂｒ．Ａｒ．：肝線維化面積の百分率］
【図３ａ】ナイーブマウスのシリウスレッドＦ３Ｂ肝切片における肝組織線維化の病理学的検査の結果を示す図である。
【図３ｂ】Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置したＣＣｌ４線維化誘発マウスのシリウスレッドＦ３Ｂ肝切片における肝組織線維化の病理学的検査の結果を示す図である。
【図４】ＣＣｌ４線維化誘発マウスの肝臓病変面積中のコラーゲンの百分率による、肝組織線維化の評価を示す図である。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、％ｃｏｌｌ．Ａｒ．：肝線維化面積中のコラーゲンの百分率］
【図５】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおけるαＳＭＡの発現量による、肝組織線維化の評価を示す図である。抗αＳＭＡ抗体を用いて、線維化マウス及びコントロールマウスの肝組織試料に対するウェスタンブロッティングを行った。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、αＳＭＡ：α平滑筋アクチン、ＫＤ：キロダルトン］
【図６】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団の細胞数を示す図である。発現した脾臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞数を、脾臓リンパ球集団に対する相対値で示した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、％ｔｏｔ．ｌｙｍｐ．：脾臓リンパ球集団に対する百分率］
【図７】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓ＣＤ４／ＣＤ８細胞集団の細胞数比を示す図である。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、Ｒａｔ．：比］
【図８】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓ＮＫ細胞集団の細胞数を示す図である。ＮＫ細胞数を、脾臓ＣＤ４５細胞集団に対する相対値で評価した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、％ＣＤ４５：ＣＤ４５細胞集団に対する百分率］
【図９】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓のＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比を示す図である。ａＫＩＲ、ｉＫＩＲ及び全ＮＫ細胞について別々に行った測定の結果から、ａＫＩＲ：ｉＫＩＲ比を算出した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ Ｒａｔ．：ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比］
【図１０】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団の細胞数を示す図である。肝臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞数を、肝臓リンパ球集団に対する相対値で示した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、％ｌｙｍｐ．：肝臓リンパ球集団に対する百分率］
【図１１】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝臓ＣＤ４／ＣＤ８細胞集団の細胞数比を示す図である。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｒｅａｔ．：処置、Ｒａｔ．：比］
【図１２】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝臓ＮＫ細胞集団の細胞数を示す図である。ＮＫ細胞数を、肝臓ＣＤ４５細胞集団に対する相対値で評価した。［略語： Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、％ＣＤ４５：肝臓ＣＤ４５細胞集団に対する百分率］
【図１３ａ】大腸炎誘発マウスにおける大腸炎スコアを示す図であり、大腸炎誘発マウスにおける組織傷害の巨視的評価に関するものである。大腸炎誘発マウス及びナイーブコントロールにおいて、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置マウス又は非処置マウスと比べて、大腸炎スコアを巨視的に評価した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１３ｂ】大腸炎誘発マウスにおける大腸炎スコアを示す図であり、大腸炎誘発マウスにおける組織傷害の微視的評価に関するものである。大腸炎誘発マウス及びナイーブコントロールにおいて、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置マウス又は非処置マウスと比べて、大腸炎スコアを微視的に評価した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１４ａ】ナイーブマウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１４ｂ】Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置したナイーブマウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１４ｃ】大腸炎誘発マウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１４ｄ】Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置した大腸炎誘発マウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１５】大腸炎誘発マウスにおける脾臓ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団の細胞数を示す図である。脾臓ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８細胞数を、脾臓リンパ球集団に対する相対値で示した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ、％ＣＤ４５：脾臓ＣＤ４５細胞集団に対する百分率］
【図１６】大腸炎誘発マウスにおけるＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞亜集団及びＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞亜集団の細胞数を示す図である。ＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞亜集団及びＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞亜集団の細胞数を、全ＣＤ４細胞集団に対する相対値で評価した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１７】大腸炎誘発マウスにおけるＡＰＣ集団の細胞数を示す図である。脾臓の抗原提示細胞数を、脾臓ＣＤ４５細胞集団に対する相対値で示した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１８】大腸炎誘発マウスにおけるサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの血清レベルを示す図である。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ、ｐｇ／ｍｌ：ピコグラム／ミリリットル］
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、肝線維化の治療における、免疫調節剤、特に酢酸グラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ ａｃｅｔａｔｅ）（コパクソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）［コポリマー−１（Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−１）としても知られている］、Ｔｅｖａ社製）の、随意的にＩＬ−２等の他の免疫活性物質と組み合わせた使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
本発明者らは、既に、ＩＬ−１０によって減弱される肝線維化に、ＣＤ８リンパ球サブセットの増加、及びＣＤ４リンパ球サブセットの減少が介在して関与していることを報告している［Ｓａｆａｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｏｓｔｅｒ ＃３８７、ＡＡＳＬＤ、Ｂｏｓｔｏｎ ２００２、Ｓａｆａｄｉ，Ｒ．ら、Ｏｒａｌ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ＃６１０、ＡＡＳＬＤ、Ｂｏｓｔｏｎ ２００２、及びＳａｆａｄｉ，Ｒ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ ２００４］。ラットインターロイキン１０（ｒＩＬ−１０）を肝細胞で分泌するトランスジェニックマウスを作製し、２種の異なる動物モデルにおける、肝線維形成に対するサイトカインの持続的局所的な発現の影響を評価することにより、この問題にアプローチした。ｒＩＬ−１０の抗線維化作用を確認して、このサイトカインのリンパ球サブセットに対する影響を特徴付け、ＣＤ８リンパ球の特異的減少を確認した。最終的に、肝傷害を有する動物から単離したＣＤ８リンパ球の線維形成活性を、ナイーブ動物への養子移植により試験した。しかし、ＮＫ細胞は、通常、抗原提示を行うＣＤ４細胞及び樹状（ＣＤ１１ｃ陽性）細胞によって活性化される。マウスでは、ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩａ分子に特異的である、ｉＫＩＲ（抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｋｉｌｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ））及びａＫＩＲ（活性化ＫＩＲ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＫＩＲ））を共に発現するが、細胞殺傷（ｋｉｌｌｉｎｇ）は標的細胞上のＭＨＣクラスＩａの減少時にのみ起こる。
【０００３】
このように、本発明者らが用いた実験モデル（以下で詳述する。）において、ＮＫ細胞の抗線維化作用は、活性化ＨＳＣの死滅の増加を伴うＮＫ細胞の活性化を介している。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、線維形成に有利なＣＤ４減少、及び線維形成に不利なＮＫ細胞活性化という、相反する作用が見られる可能性がある。このような知見は、線維化の免疫介在に関する理解を著しく広め、ＣＤ４、ＣＤ８及びＮＫサブセットの操作が、線維化の治療的調節における潜在的オプションであることを示唆するものであり、本発明の基礎をなすものである。
【０００４】
肝線維化は、肝臓における結合組織の蓄積の形で現れる。線維化は、原因にかかわらず、肝臓に対する慢性的な傷害の結果である。肝傷害への応答の際に、肝星細胞は分化転換又は活性化して、増殖性のマトリックス産生細胞になり、この細胞が線維化を生じさせる［Ｖａｎ Ｗａｅｓ，Ｌ．及びＬｉｅｂｅｒ，Ｃ．Ｓ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９７７；７３：６４６−６５０、Ｓｃｈｕｐｐａｎ，Ｄ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００１；２１：３５１−３７２］。活性化星細胞の主要なマーカーとしては、β−ＰＤＧＦ受容体、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、及びα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）が挙げられる［Ｖａｎ Ｗａｅｓ及びＬｉｅｂｅｒ、１９７７、ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｓｃｈｕｐｐｍａｎら（２００１）ｉｄ ｉｂｉｄ．］。星細胞による線維形成は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ１）［Ｒｏｊｋｉｎｄ，Ｍ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９７９；７６：７１０−７１９］、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１０７５６−１０７６４］等の線維化誘導性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）サイトカイン、及びインターロイキン１０、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等の抗線維化サイトカイン［ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９２；１５：９８９−９９７、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：２２４７−２２５０、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、ｅｄ．Ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．２１．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｔｈｉｅｍｅ；２００１、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．１９９６；１４：１０１−１３０、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９５；２２：２８−３６］の活性の反映である。ＩＬ−１０の抗線維化活性は、培養星細胞の研究により示唆されている。この研究では、ＩＬ−１０に対する中和抗体がマトリックスの蓄積を減少させ［ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｒ．Ｆ．ら、１９９２、ｉｄ ｉｂｉｄ．］、実験用の肝炎動物にＩＬ−１０を外部投与すると、線維化が減弱し［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、（１９９６）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ，Ａ，Ｍ．、（１９９５）ｉｄ ｉｂｉｄ．］、また、ＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて、中毒性傷害に応答して、しばしば線維化の増大が見られる［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．及びＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９；８４：１７８０−１７８５、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９３；１９：１１７−１３２］。
【０００５】
最近の研究では、サイトカインだけでなく、サイトカインを分泌する炎症細胞、例えば、肝マクロファージ（クッパー細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ（Ｔｈ）、ＣＤ８陽性サブセット等のリンパ球にも、焦点が当てられている［ＭｃＧｕｉｒｅら、（１９９２）ｉｄ ｉｂｉｄ．；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ．］。リンパ球サブセットはまた、Ｔｈ１優勢及びＴｈ２優勢のいずれかのものに大雑把に分類することができる［Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：３０２−３０８］。例えば、Ｔｈ１リンパ球サイトカインであるＩＦＮ−γは、強力な抗線維化活性を有する［Ｗａｎｇら（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｗｉｎｗｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５；２２：３０４−３１５］。インターフェロンγ産生Ｔｈ１細胞のレベルの増加を示すＣ５７ＢＬ／６マウスでは、比較的軽度の線維化が見られ、他方、主にＴｈ２応答を示すＢＡＬＢ／ｃマウスでは、四塩化炭素に応答して重度の線維化が生じる［Ｗａｎｇら（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｙｕ，Ｑ．及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０００；１４：１６３−１７６、Ｎｉｅｔｏ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９９；３０：９８７−９９６］。更に、インターフェロンγ欠損の重症の複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスでは、野生型動物よりも著明な線維化が現れる［Ｗｉｎｗｏｏｄら（１９９５）ｉｄ ｉｂｉｄ．］。これらのデータは、肝線維化が、種々の免疫細胞サブセットの応答に影響されること、及び、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインサブセットが、毒素に対する線維化応答から生じる肝傷害を調節することができることを示唆する。この種の研究が発端となって、マウス及びヒトにおける、線維化の危険性に関連する遺伝子座の探索が開始されている（そのような遺伝子座が、免疫応答を調節する遺伝子をコードしている可能性があるという仮定の下に行われている）［Ｎｉｅｔｏ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９９；３０：９８７−９９６、Ｓｖｅｇｌｉａｔｉ−Ｂａｒｏｎｉ，Ｇ．ら、Ｌｉｖｅｒ ２００１；２１：１−１２］。
【０００６】
免疫が介在する、ヒトの肝線維化の制御がますます重要視され、免疫抑制が重要な刺激条件として同定されている。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者では、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に同時感染すると、肝傷害の程度と関係なく、線維化の危険性が加速度的に高まる［Ｂａｃｈｅｍ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９；２７：５５５−５６５、Ｃａｓｉｎｉ，Ａ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７；２５：３６１−３６７、Ｗｉｎｎｏｃｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９５；１０：Ｓ４３−Ｓ４６］。同様に、肝硬変への進行は、ＨＣＶに慢性的に感染した肝移植患者（長期間の免疫抑制治療を必要とする。）において、自然感染の患者に比べて大きく加速し［Ｃａｓｉｎｉら（１９９７）ｉｄ ｉｂｉｄ．、Ｗｉｎｎｏｃｋら（１９９５）ｉｄ ｉｂｉｄ．］、また、一部は、急速に進行する線維形成症候群（１年以内に再発性の肝硬変を招く可能性がある。）を発症する。［Ｇｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；２７１：９８４−９８７］。
【０００７】
線維化は、慢性肝傷害を有するほとんどすべての患者で生じる可逆的な瘢痕化応答である。最終的に、肝線維化は、結節形成及び器官収縮によって特徴付けられる肝硬変を招く。肝硬変の原因にはいくつかあり、先天性、代謝性、炎症性及び中毒性の肝疾患が含まれる。例として、住血吸虫症、特発性の門脈線維症、アルコール、メトトレキサート、イソニアジド、ビタミンＡ、アミオダロン、慢性のＨＢＶ及びＨＣＶ、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、自己免疫性慢性肝炎、慢性受動性うっ血、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、α１−アンチトリプシン欠損症、炭水化物代謝障害、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、嚢胞性線維症、胆道閉鎖症／新生児肝炎、先天性胆嚢嚢胞、非アルコール性脂肪性肝炎、及び静脈閉塞性疾患が挙げられる。すべて合わせると、標的となる肝線維化集団は、全世界で何千万の患者になる。従って、効果的な抗線維化療法の開発が非常に重要になる。このような療法の目的は、肝傷害部位における活性化肝星細胞（ＨＳＣ）の蓄積を阻害し、細胞外マトリックスの沈着を予防することにある。このような手法の多くは肝線維化の実験モデルでは有効であるが、ヒトにおける有効性及び安全性はまだ分かっていない。これまで、ヒトにおける抗線維化剤として認められている薬物はない。
【０００８】
星細胞活性化のパラダイムから、抗線維化療法の部位／標的を決定するための重要な枠組みが得られる［総説については、Ｂａｔａｌｌｅｒ，Ｒ．及びＢｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００１；２１：４３７−４５２を参照のこと］。このような戦略には、（Ａ）原疾患を治療して、傷害を予防すること、（Ｂ）星細胞活性化を刺激するのを避けるために、炎症又は宿主応答を低減させること、（Ｃ）星細胞活性化を直接下方制御すること、（Ｄ）星細胞の増殖応答、線維形成応答、収縮応答及び／又は炎症誘発応答を無効にすること、（Ｅ）星細胞のアポトーシスを刺激すること、並びに（Ｆ）マトリックスプロテアーゼを生成する細胞を刺激し、そのインヒビターを減少させ、或いはマトリックスプロテアーゼを直接投与することにより、瘢痕マトリックスの分解を増大させることが含まれる。
【０００９】
肝線維化及び肝硬変は、どのような原因から生じたものであっても、肝細胞癌（ＨＣＣ）の主要な原因となる。ＨＣＣは、主に肝硬変の患者に合併症として生じる腫瘍群のうちの１つである。外科的切除、化学塞栓、腫瘍内へのアルコール注入等の対症療法により生存期間が延長されるが、一般に患者の大多数の予後は依然改善されてない［Ｆａｒｍｅｒ Ｄ．Ｇ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１９９４；２１９：２３６−２４７］。ＨＢＶが関与するＨＣＣはＨＢｓＡｇを細胞表面に発現するが、これは、特定の状況下で腫瘍関連抗原として働く可能性がある［Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８；８５：８２７６−８２８０］。
【００１０】
サイトカインを用いて培養した肝臓ＭＮＣから精製された、ＣＤ５６陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、ＨｕＨ−７ ＨＣＣ細胞に対して強力な細胞毒性を示し、他方、同様に精製された通常のＴ細胞は、そのような細胞毒性を示さないが、このことは、硬変肝におけるＣＤ５６陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の数の減少が、それらの細胞のＨＣＣに対する感受性に関与している可能性があることを示唆する［Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０００；３２（５）：９６２−９］。ＮＫ細胞活性は、ＨＣＣ患者において、コントロール群に比べて有意に低下するが、このことは、ＨＣＣ患者における肝切除後の再発及び予後を予測するのに、手術前のＮＫ細胞活性が役立つことを示唆する［Ｔａｋｅｔｏｍｉ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；８３（１）：５８−６３］。
【００１１】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞増殖因子として十分認められている。ＩＬ−２は、転移性黒色腫、急性骨髄性白血病、及び転移性腎細胞癌を治療するための有望な免疫療法剤である。高用量のＩＬ−２レジメンが黒色腫及び腎細胞癌の治療において臨床上有利であるが、用量規定毒性が重いため、広範な患者群において、臨床使用が制限されている。低用量のＩＬ−２療法は、黒色腫では、期待外れの臨床的寛解率（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅ）しか得られていない。低用量のＩＬ−２に対する寛解率は、腎細胞癌の方が良かったが、このような反応の質は、高用量ＩＬ−２療法の場合と比べて、依然として懸念される。化学療法レジメン（生化学療法）にＩＬ−２を追加すると、転移性黒色腫患者において、全体として最大６０％の寛解率が見られたが、これはまだ、生存率の改善が確実になったと解釈されていない。ＩＬ−２ベースのレジメンを更に改変した場合、又はＩＬ−２に新たな薬剤を追加した場合に、より良い抗腫瘍応答が生じ、生存率が改善されるかどうかは、まだ確認されていない。
【００１２】
ＩＬ−２は、切除不能ＨＣＣの、有効かつ耐容性が良好な治療剤と考えられている。腎細胞癌及び黒色腫のＩＬ−２による治療は、最初は、毒性の高さ故に、治療関連死亡を伴っていた。但し、ＩＬ−２は、適切な状況下であれば、安全に投与することができる。低用量のＩＬ−２は、切除不能肝細胞癌の、有効かつ耐容性が良好な治療剤と考えることができる。肝硬変を基礎とする進行ＨＣＣが組織学的に確認されている１組の患者１８例（男性１４例及び女性４例、年齢中央値６６歳、範囲４９〜８２歳）において、ＩＬ−２が長期間、超低用量（増悪するまでは１ＭＩＵ／ｄ）で持続的に皮下投与された後、中央値１９．５か月の経過観察期間が報告された。２例で完全寛解（腫瘍消散（ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）と定義される。）が観察され（１１．１％）（それぞれ３５か月及び４６か月持続した）、一例で部分寛解（５．５％）が記録された（全寛解率１６．６％、９５％ＣＩ：０〜３３．８％）。１３例の患者（７２．３％、９５％ＣＩ：６１．６〜８２．７）で、疾患の安定状態が少なくとも４か月続き、これらの患者のうち一例では、肺転移の完全寛解が得られた。無増悪期間の中央値は１５．３か月であった（９５％ＣＩ：１０〜３３）。全生存期間の中央値は２４．５か月であった（９５％ＣＩ：１２〜４３）。２例の患者（１１．１％）で治療中に増悪した。毒性は局所的なものにすぎなかった（通常は注射部位の疼痛及び水疱）［Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００２；２５（３）：２２４−６］。一部の癌患者の治療に、インターロイキン２を用いた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）へのＥｘ ｖｉｖｏ刺激が用いられており、これが大きな成功を収めている。６例の肝細胞癌（ＨＣＣ）患者から得られた腫瘍浸潤リンパ球の細胞殺傷活性が、自己単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を用いて増強された。自己樹状細胞（同じ患者からのもの）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＧ−４）の存在下で６日間培養したＣＤ１４陽性単球から生成した。これらのプロフェッショナル抗原提示細胞には、全自己肝腫瘍ライセートがパルスされた（ｐＤＣ）。ＴＩＬは、ｐＤＣ又はパルスしていない（ｕｎｐｕｌｓｅｄ）ＤＣと共培養された。ＴＩＬの細胞毒性は、標準の細胞毒性試験において、ＴＩＬが標的腫瘍細胞Ｋ６５２、Ｄａｕｄｉ細胞株及び同種ＨＣＣ細胞を溶解することができるかどうかで評価された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された標的腫瘍細胞の腫瘍浸潤リンパ球による溶解は不十分であり、Ｔ細胞の反応性低下が示された。対照的に、Ｄａｕｄｉ（９．１５％＋／−７．５）及び同種ＨＣＣ（１８．２％＋／−９．２）の標的腫瘍に対するＨＣＣ由来ＴＩＬの細胞殺傷活性は、ｐＤＣで刺激すると、有意に増強することができた（Ｄａｕｄｉ：３８％＋／−６．８、同種のＨＣＣ：５５％＋／−１０）。Ｋ５６２に対するＴＩＬの細胞殺傷活性は、ｐＤＣの影響を受けなかった。このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＣＣ由来ＴＩＬの低い細胞毒性プロファイルは、腫瘍ライセートをパルスした樹状細胞によって増大させることができる。従って、養子免疫療法で用いると、ｉｎ ｖｉｖｏで、より効果的である可能性がある［Ｆｒｉｅｄｌ，Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００；１５：４７７−８６］。
【００１３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管の一般的な免疫介在性疾患である。Ｔｈ１炎症性サブタイプとＴｈ２抗炎症性サブタイプの間の免疫応答の不均衡は、このような障害の発生に関与している［Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ＤＫ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９１；３２５：９２８−９３５、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ．Ａ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３：８４７−８５６、Ａｄｏｒｉｎｉ Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９９７；１８：２０９−２１１］。実験的大腸炎及びＩＢＤ患者のいずれにおいても、上記疾患はＴｈ１媒介性の免疫障害であり、大腸に対する、生涯に渡る炎症応答を引き起こす。ＩＦＮ−γ等の炎症性サイトカインの分泌については、文献［Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１９９７；１８：６１−６４］に記載がある。ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ１媒介性サイトカインの炎症作用を下方制御し、それにより上記疾患を緩和する［Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９６；１８３：２６０５−２６１６、Ｍａｄｓｅｎ ＫＬ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：１５１−１５９、Ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ Ｓａｎｄｅｒ Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：３８３−３８９］。
【００１４】
ＩＢＤの発生には、毒性、伝染性、又は免疫介在性の作用の結果である、特異的な腸粘膜のエピトープの暴露が関与している［Ｈｉｂｉ Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３；５４：１６３−１６８、Ｄａｓ ＫＭ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９０；９８：４６４−４６９、Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ＤＫ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９１；３２５：９２８−９３５、Ｄａｓｇｕｐｔａ Ａ．ら、Ｇｕｔ．１９９４；３５：１７１２−１７１７、Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９５；１８２：１２８１−１２９０］。このような潜在性の抗原は、能動自己免疫による炎症性応答を刺激する［Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｆ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９８５；７６：３１１−３１８、Ｚ’ｇｒａｇｇｅｎ Ｋ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：８０８−８１６］。ＩＢＤを有するヒト、及びＴＮＢＳで誘発された実験的大腸炎を有する動物のいずれにおいても、上記疾患はＴｈ１型免疫介在性障害である［Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ａ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９６；１８３：８４７−８５６、Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９５；１８２：１２８１−１２９０］。炎症を起こした粘膜において刺激された細胞は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の産生量の増加、及びＩＬ−４の産生量の減少を引き起こし、それにより炎症細胞を誘引し、粘膜構造を破壊する。対照的に、ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ１サイトカインの炎症誘発作用を下方制御し、場合により上記疾患を緩和する［Ｍａｄｓｅｎ ＫＬ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１３：１５１−１５９］。
【００１５】
酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））は、４種のアミノ酸のランダムな混合物からなる合成コポリマーであり、これは、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）に特徴的な、ＣＮＳに対する自己免疫応答を改変することができる。この自己免疫反応は、ＣＮＳの炎症、及び脱髄を引き起こし、最終的に軸索を消失させる。ＲＲＭＳ患者に対する３種の無作為二重盲検において、酢酸グラチラマーの皮下投与（２０ｍｇ／日）は、平均再発率、非再発患者の割合、及び磁気共鳴映像法［ＭＲＩ］スキャンで見られるガドリニウム造影病巣の数から見て、極めて効果的であることが示されている。酢酸グラチラマーはまた、一連のＭＲＩ測定を用いた欧州／カナダの研究における評価において、疾患の活動性及び疾患の負担を有意に低減させることも示されている。酢酸グラチラマーで治療されたＲＲＭＳ患者では、障害が減弱される可能性がはるかに高く、全体的な障害状態は大きく改善された。酢酸グラチラマーは通常、耐容性が良好である。すなわち、最もよく報告されている治療関連有害事象は、局所的な注射部位反応、及び注射後の一過性全身反応であり、いずれの反応も通常、軽度で自己制限的なものであった。酢酸グラチラマーは、インターフェロンβでＲＲＭＳを治療された患者で報告されている、インフルエンザ様症候群又は中和抗体を伴わない。利用可能なデータ及び最新の管理ガイドラインに基づくと、酢酸グラチラマーは、ＲＲＭＳ患者の治療のための有用な第一選択薬である［Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｄ．ら、２００２；１６（１２）：８２５−８５０、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００３；１７（３）：２０７−１０］。
【００１６】
酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｅｖａ社製）は、実験的自己免疫性脳脊髄炎における樹状細胞の調節を通じて、Ｔｈ２ ＣＤ４細胞の発育を促進し、ＩＬ−１０の産生を増加させることが報告されている［Ｃｏｐａｘｏｎｅ：Ｖｉｅｉｒａ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３］。
【００１７】
酢酸グラチラマーは、移植片対宿主病を予防し、免疫拒絶の種々の症状を妨げる。皮膚及び甲状腺の移植アッセイの２種の移植系において、酢酸グラチラマー処置は、皮膚移植片の生存期間を延長し、甲状腺移植片の機能的な悪化を阻害した。酢酸グラチラマーは、刺激性の同種細胞と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすると、移植片特異的なＴ細胞株の増殖、並びにそのインターロイキン２及びインターフェロンγの分泌を阻害した。酢酸グラチラマー処置は、移植片に対するＴｈ１応答を阻害し、酢酸グラチラマー及び移植片細胞に応答したＴｈ２のサイトカイン分泌を誘発し、移植片の生存期間及び機能の改善をもたらした［Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００１］。
【００１８】
本発明の目的である、肝線維化の治療に有効な薬剤の探索において、本発明者らは、マウスの肝線維形成に対するＣｏｐａｘｏｎｅの影響をｉｎ ｖｉｖｏで調査した。
【００１９】
更に、これは本発明の別の目的であるが、随意的にＩＬ−２と組み合わせたＣｏｐａｘｏｎｅによる抗線維化免疫調節は、線維化関連ＨＣＣに対して拮抗的に作用しうることが示唆されている。
【００２０】
別の一態様では、炎症性腸疾患に罹患した患者へのＣｏｐａｘｏｎｅの投与は、新たな治療戦略を生み出す可能性がある。
【００２１】
本発明の上記その他の目的は、説明が進むにつれて明らかになる。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、肝線維化を治療する方法であって、それを必要とする個体に免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法に関する。
【００２３】
より詳細には、本発明は、肝線維化を治療する方法であって、それを必要とする個体に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤を投与することを含む方法に関する。
【００２４】
免疫調節剤としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
【００２５】
本発明の方法は特に、ヒトの治療に使用されるものである。
【００２６】
本発明は更に、肝線維化を治療するための医薬組成物の調製における免疫調節剤、特に肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤の使用に関する。
【００２７】
この態様において、本発明は、好ましくは、肝線維化を治療するための医薬組成物の調製における酢酸グラチラマーの使用に関する。
【００２８】
更に、本発明は、肝線維化の治療に使用する免疫調節剤、特に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす薬剤、最も好ましくは酢酸グラチラマーに関する。
【００２９】
更に別の態様において、本発明は、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こすことにより肝線維化を治療する方法であって、このような治療を必要とする個体に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤を投与することを含む方法に関する。投与すべき免疫調節剤としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
【００３０】
免疫調節剤は、線維化肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こし、それにより肝線維化を低減させるために使用される。免疫調節剤としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
【００３１】
更なる一態様において、本発明は、肝線維化の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）被験物質を提供するステップと、（ｂ）線維化を誘発させたモデル動物、及び非線維化モデル動物を提供するステップと、（ｃ）前記被験物質を前記線維化動物及び非線維化動物に投与するステップと、（ｄ）前記動物から肝組織の試料を採取するステップと、（ｅ）前記試料における、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＮＫ細胞数、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比、及び線維化組織の面積、並びに少なくとも１種の一般的な線維化パラメータ、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、（ｆ）線維化を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非線維化動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇、及び／又は線維化組織の面積の縮小、及び／又は前記一般的な線維化パラメータの低下が、前記被験物質が肝線維化の治療に有用であることを示す方法に関する。
【００３２】
一般的な肝傷害パラメータとしては、ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＩｓｈａｋ傷害スコア（Ｉｓｈａｋ ｉｎｊｕｒｙ ｓｃｏｒｅ）が挙げられる。しかし、線維化パラメータは、Ｉｓｈａｋ線維化スコア（Ｉｓｈａｋ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｃｏｒｅ）、コンピューター（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ）Ｂｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）による定量、及びウェスタンブロッティング分析を用いたα平滑筋アクチンの評価である。
【００３３】
別の態様において、本発明は、肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つを治療する方法であって、それを必要とする個体に、肝組織又は腸組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす少なくとも１種の免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法に関する。
【００３４】
好ましくは、ヒト個体を治療するための免疫調節剤は、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである。
【００３５】
より具体的には、肝組織又は腸組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤、望ましくは随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーは、肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つを治療するための医薬組成物の調製に使用することができる。
【００３６】
略語：
本願明細書では以下の略語を用いる。
ｉＫＩＲ：抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｋｉｌｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
ａＫＩＲ：活性化キラー免疫グロブリン様受容体（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｋｉｌｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
ＮＫ：ナチュラルキラー細胞
ＨＳＣ：肝星細胞
Ｉ．Ｐ．：腹腔内
ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＡＬＴ：アラニントランスアミナーゼ
ＥＣＭ：細胞外マトリックス
ＨＣＣ：肝細胞癌
ＨＳＣ：肝星細胞
【発明の詳細な説明】
【００３７】
下記の実施例で示すように、本発明者らが用いた実験モデルにおいて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の抗線維化作用は、刺激されたＨＳＣの死滅の増加を伴うＮＫ細胞の活性化を介している。すなわち、本発明者らが用いた実験モデルにおいて、ＮＫ細胞の抗線維化作用は、活性化ＨＳＣの死滅の増加を伴うＮＫ細胞の活性化を介している。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、線維形成に有利なＣＤ４減少、及び線維形成に不利なＮＫ細胞活性化という、相反する作用が生じる可能性がある。このような知見は、免疫系の線維化プロセスへの関与に関する理解を著しく広め、ＣＤ４、ＣＤ８及びＮＫサブセットの操作が、線維化を調節する治療的アプローチにおける潜在的オプションであることを示唆する。
【００３８】
肝線維化の治療及び／又は予防に使用可能な薬剤を見出すことを目的として、本発明者らは、線維化肝組織においてＣＤ４：ＣＤ８比を上昇させ、それによりＮＫ細胞数を増加させると、線維化が抑制される可能性があることを提唱した。
【００３９】
本研究において、本発明者らは、線維化を誘発させたマウスを、酢酸グラチラマー等の免疫調節剤で治療すると、ＣＤ４：ＣＤ８比が増大し、いくつかのスコアで測定される疾患状態が改善されることを見出した。
【００４０】
下記の実施例、特に図２、図４及び図５に示すように、線維化は、線維化の程度を評価するための一般的なパラメータである、Ｉｓｈａｋ肝線維化スコアリング及びコンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）解析によって測定したところ、すべてのＣＣｌ４誘発群で有意に増大した。酢酸グラチラマーで処置した動物では、有意に低いスコアが示された。また、Ｉｓｈａｋ肝傷害スコアリングにおいても、線維化は、線維化誘発後、すべての線維化群で有意に増大したが、酢酸グラチラマー処置群及びリノマイシン（ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）処置群で有意に低くなった。
【００４１】
図７で見られるように、ＣＤ４：ＣＤ８比は、酢酸グラチラマー処置群において、コントロール群（ＣＣｌ４誘発非処置線維化群）に比べて有意に上昇した。ＮＫ細胞の総数も、処置群（酢酸グラチラマー群及びリノリン（ｌｉｎｏｌｉｎ）群）で増加した（図８）。更に、処置群では、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の顕著な変化が観察された（図９）。
【００４２】
このように、本発明者らは、免疫調節剤、特に酢酸グラチラマー（コパクソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））は、用いた動物モデルにおいて顕著な抗線維化作用を有することを明らかにした。この作用が、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及びこれによるＮＫ細胞の総数の増加を介していたことが、理論的制約なしに示唆される。これらのＮＫ細胞は、活性化星細胞を抑制するように刺激され、活性化されることによって、線維化を低減させた。
【００４３】
このように、本発明は、肝線維化の治療における免疫調節剤、特に酢酸グラチラマーの使用に関する。更に、本発明は、必要な患者に、本発明の免疫調節剤を治療有効量投与することにより肝線維化を治療する方法、及び上記疾患を治療するための上記薬剤を含有する組成物を提供するものである。
【００４４】
本発明の免疫調節剤としては、肝組織、特に線維化肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こすことができるものが特に好ましい。
【００４５】
薬剤としては、酢酸グラチラマーが最も好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、本発明の免疫調節剤、特に酢酸グラチラマーを有効成分として含有し、更に、別の治療剤、及び／又は薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を随意的に含有してもよい。
【００４７】
医薬組成物の調製は当技術分野で周知であり、また、多くの論文及びテキストに記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、特にｐｐ．１５２１−１７１２を参照のこと（当該文献は、参照することにより、本明細書にそのまま組み込まれる）。
【００４８】
本発明の医薬組成物の投与、及び用量決定は、適切な医療慣行に従って行うことができる。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等、種々の方法で実施することができる。但し、経口投与等、他の投与方法も可能である。
【００４９】
本発明の組成物は、遊離型の活性物質を含有し、治療対象の個体に直接投与することができる。或いは、本発明の組成物は、活性分子のサイズに応じて、担体と結合させて投与するのが望ましい。治療製剤は、通常のいかなる投与剤形でも投与することができる。製剤は通常、１種又は複数の許容される担体と共に、少なくとも１種の上述の有効成分を含有する。
【００５０】
各担体は、他の成分と適合し、かつ患者に無害であるという意味で、薬学的に、かつ生理学的に許容されるものである必要がある。製剤には、経口、直腸、経鼻、又は非経口（皮下、筋肉内、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、及び皮内を含む。）投与に適したものが含まれる。製剤は、好都合なことに単位剤形で提供することができ、また、製薬学の分野で周知のいかなる方法によって調製することもできる。そのような化合物のすべてについて、性質、有効性、供給源、及び投与方法（個体において望ましい効果を生じさせるのに必要な有効量を含む。）は、当技術分野で周知であり、本明細書で更に説明する必要はない。
【００５１】
より具体的には、本発明の活性薬剤又はそれを含有する組成物は、経口投与、静脈内投与、非経口投与、経皮投与、皮下投与、腟内投与、鼻腔内投与、粘膜投与、舌下投与、局所投与、及び直腸投与、並びにそれらの任意の組合せから選択される経路によって投与することができる。これらの免疫調節剤又は組成物は、ＩＶ注射又はＩＰ注射することが好ましい。
【００５２】
注射用に適した薬剤形態としては、無菌の水溶液剤又は分散剤、並びに、無菌の注射用溶液剤又は分散剤を即時調製するための無菌の散剤が挙げられる。いずれの場合も、薬剤形態は、無菌でなければならず、また、容易に注射可能な程度の流動性を有しなければならない。組成物は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、また、細菌、菌類等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００５３】
微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含有するのが好ましい。吸収遅延剤を組成物中で用いることにより、注射用組成物の吸収を引き延ばすことができる。
【００５４】
無菌の注射用溶液剤の調製は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙した他の種々の成分と共に加え、次いで、ろ過滅菌することによって行う。分散剤の調製は、一般に、滅菌した種々の有効成分を、ベースとなる分散媒と、上に列挙したものから選ばれる他の必要な成分と、を含有する無菌のビヒクル中に加えることによって調製する。
【００５５】
無菌の注射用溶液剤を調製するための無菌散剤の場合、調製方法としては、予めろ過滅菌した溶液から、有効成分及びその他の所望成分の散剤を生み出す、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術が好ましい。
【００５６】
本発明の医薬組成物は通常、緩衝剤、及びそのオスモル濃度を調節する薬剤を含有し、更に、当技術分野で知られている１種又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は添加剤を随意的に含有する。また、この組成物は、補助的な有効成分を含有してもよい。担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、植物油等の、溶媒又は分散媒を用いることができる。適正な流動性を維持するには、例えば、レシチン等のコーティング剤を用いたり、必要な粒子サイズを維持したり（分散剤の場合）、界面活性剤を用いたりすればよい。
【００５７】
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤等が含まれる。このような媒体及び薬剤を薬学的に有効な物質のために用いることは、当技術分野で周知である。通常のいかなる媒体又は薬剤も、有効成分と不適合なものでない限り、治療組成物中で用いることが想定されている。
【００５８】
用量は、体重、年齢、性別、疾患の重症度、及び耐容性に応じて決まり、主治医によって決定される。ヒトにおける用法は、好ましくは、２年間、１日１回、約１５〜約２０ｍｇを皮下注射するか、又は１日当たり約５〜約５０ｍｇを経口投与することであり、最も好ましくは、２年間、１日１回、２０ｍｇを皮下注射することである。
【００５９】
本発明はまた、肝障害を治療又は予防する方法であって、本発明の薬剤、又は本発明の医薬組成物、或いはその好ましい実施形態の１つを、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
【００６０】
本発明はまた、肝臓の障害又は疾患を治療するための治療剤を、このような治療を必要とする患者に投与する方法であって、前記患者に本発明の活性薬剤及び前記治療剤を投与するステップを含む方法に関する。上記治療剤の投与は、本発明の免疫調節剤の投与と同時に行っても、また、その前後いずれに行ってもよい。
【００６１】
本発明者らの知見を利用して、肝線維化の治療に使用できる治療剤をスクリーニングすることができる。すなわち、更なる態様において、本発明は、肝線維化の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）被験物質を提供するステップと、（ｂ）線維化を誘発させたモデル動物、及び非線維化モデル動物を提供するステップと、（ｃ）前記被験物質を前記線維化動物及び非線維化動物に投与するステップと、（ｄ）前記動物から肝組織の試料を採取するステップと、（ｅ）前記試料における、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＮＫ細胞数、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比、線維化組織の面積、及び一般的な線維化パラメータ、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、（ｆ）線維化を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非線維化動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇、及び／又は線維化組織の面積の縮小、及び／又は前記一般的な線維化パラメータの低下が、前記被験物質が肝線維化の治療に有用であることを示す方法に関する。
【００６２】
一般的な線維化パラメータとしては、例えば、Ｉｓｈａｋ肝線維化スコアリング、コンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）解析、及びヒドロキシプロリン（ＨＰ）が好ましいが、線維化の改善を示す適切な評価項目であれば、いかなるものを本発明のスクリーニング方法で用いてもよい。ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＩｓｈａｋ傷害スコアは、肝傷害パラメータとして認められている。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法では、前記コントロール、すなわち非線維化動物の代わりに、又はそれに加えて、肝線維化スコアの基準値を比較のために用いてもよい。
【００６４】
また、本発明のスクリーニング方法は、適当な動物モデル及び臨床パラメータを用いた場合にＨＣＣ及びＩＢＤの治療に有利な結果を示すことができる免疫調節剤を同定するために用いることもできる。
【００６５】
継続的な肝細胞傷害を伴う慢性活動性肝炎は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症する危険性を劇的に増大させる。慢性炎症プロセスは、肝臓の細胞の死滅及び再生を伴い、最終的に肝細胞における形質転換変異（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を招く可能性がある。ＨＣＣ細胞における共通の事象であるウイルスＤＮＡの組込みは、宿主細胞の遺伝子制御を妨害し、悪性化（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を招く可能性がある。マウスにおいて、ＨＢＶ感染は、ＨＢＶ遺伝子の直接的微量注入によって克服することができる。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子が組み込まれ、高レベルで発現すると、肝細胞傷害及びＨＣＣが発現する。また、Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質（ＨＢｘ）遺伝子のみが高レベルで発現すると、肝癌を引き起こす可能性がある。従って、ＨＣＣの動物モデルとしては、種々のＨＢＶトランスジェニックマウスを用いることができる。ＨＣＶトランスジェニックマウスもＨＣＣの適当なモデルである。
【００６６】
肝損傷は、次の病理学的パラメータ：門脈浸潤、肝内転移、肝静脈浸潤、漿膜浸潤、腫瘍被膜の欠如、又は被膜浸潤の存在、をスコア化することによって評価することができる。或いは、チャイルドピューステージ（Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ ｓｔａｇｅ）、腫瘍の形態及び拡大、血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル、及び門脈血栓症パラメータを含むＣＬＩＰスコアを考慮することもできる。
【００６７】
ＩＢＤに関しては、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与によって誘発された実験的大腸炎の動物モデルが好ましい。大腸損傷は、細胞死、組織崩壊及び浮腫の程度の違いによって明らかとなる。これらのパラメータは、組織固定及びＨ＆Ｅ染色の後に測定することができる。組織学的損傷スコア（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄａｍａｇｅ ｓｃｏｒｅ）は、例えば、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）の陰窩スコアリング（ｃｒｙｐｔ ｓｃｏｒｉｎｇ）の方法によって決定することができる。［Ｃｏｏｐｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；６９：２３８−２４９］。
【００６８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法も、本発明の範囲内のものとして想定されている。
【００６９】
更なる一態様において、本発明は、ＨＣＣの治療における酢酸グラチラマーの、随意的にＩＬ−２と組み合わせた使用に関する。上述の通り、肝線維化及び肝硬変は、どのような原因から生じたものであっても、肝細胞癌（ＨＣＣ）の主要な原因となる。下記の実施例に示すように、ＣＤ４／ＣＤ８比の減少は線維形成に有利に働くが、ＮＫ細胞は、活性化ＨＳＣのアポトーシスの増加を介する抗線維化作用を有する。動物モデルでは、酢酸グラチラマー処置の後、ＮＫ細胞及びＣＤ４／ＣＤ８比が増加し、同時に線維化が低減した。ＨＩＶ患者において、ＩＬ−２処置がＣＤ４数を増加させること、及びＮＫ細胞が抗ＨＣＣ作用を有することが示唆されたことから、線維化が関与する肝臓腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答は、ＮＫ細胞誘発及びＣＤ４／ＣＤ８比を増大させることによって改善可能であることが提唱される。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が関与するＨＣＣは、ＨＢｓＡｇを細胞表面上に発現する。そして、このＨＣＣは、腫瘍関連抗原として働く可能性がある。提案する治療の詳細は、下記の実施例に示す。随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーは、ＮＫ細胞の刺激及び絶対数の増大、及びＣＤ４／ＣＤ８比の上昇を介する、ＨＣＣに対する十分な抗腫瘍作用を示す可能性がある。各化合物の作用を試験して、それらを組み合わせた処置の、ありうる相乗効果について知ることができる。また、各化合物の作用を試験して、それらの作用が直接的な抗腫瘍作用かどうか、或いはそれらの作用が抗線維化作用を介するものかどうかを確認することができる。いずれの化合物もヒトの臨床において他の適応症に使用されており、安全性及び耐容性が十分認められているので、この研究の結果は、特にＨＣＣに関して、また、一般に他の腫瘍の多くに関しても、新たな治療的アプローチを切り開く可能性がある。
【００７０】
本発明のこの態様では、ＨＣＣの治療及び／又は予防のための医薬組成物であって、酢酸グラチラマーを含有し、更に、ＩＬ−２等の別の免疫調節剤（ＩＬ−２に限定されない。）を随意的に含有する医薬組成物も想定されている。酢酸グラチラマーを単独で、又はＩＬ−２と組み合わせて用いて、ＨＣＣを治療する方法も包含される。
【００７１】
更なる一態様において、本発明は、炎症性腸疾患、主に潰瘍性大腸炎及びクローン病の治療における酢酸グラチラマーの、随意的にＩＬ−２と組み合わせた使用に関する。炎症性腸疾患は主に大腸の炎症性傷害であること、及び酢酸グラチラマーが線維化モデルの肝傷害を低減させたことから、酢酸グラチラマー及びＩＬ−２は、単独で、又は組み合わせることによって、ＮＫ細胞の刺激及び絶対数の増大、及びＣＤ４／ＣＤ８比の上昇を介する、炎症性腸疾患に対する十分な抗炎症作用を示す可能性がある。各化合物の作用を試験して、それらを組み合わせた処置の、ありうる相乗効果について知ることができる。また、各化合物の作用を試験して、それらの作用が直接的な抗炎症作用かどうかを確認することができる。いずれの化合物もヒトの臨床において他の適応症に使用されており、安全性及び耐容性が十分認められているので、この研究の結果は、特に炎症性腸疾患に関して、また、一般に他の炎症性疾患の多くに関しても、新たな治療的アプローチを切り開く可能性がある。
【００７２】
本発明のこの態様では、炎症性腸疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物であって、酢酸グラチラマーを含有し、更に、ＩＬ−２等の別の免疫調節剤（ＩＬ−２に限定されない。）を随意的に含有する医薬組成物も想定されている。酢酸グラチラマーを単独で、又はＩＬ−２と組み合わせて用いて、炎症性腸疾患を治療する方法も包含される。
【００７３】
本明細書を通じて、種々の刊行物が引用される。このような刊行物は、そこで引用された刊行物も含めて、参照することにより、本明細書にそのまま組み込まれる。
【００７４】
開示及び説明が行われているが、本発明が、本明細書で開示された特定の実施例、処理ステップ及び材料に限定されるわけではなく、このような処理ステップ及び材料が、いくらか異なるものとなる可能性があることは理解されるはずである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物のみによって限定されるので、本明細書で用いる用語が、特定の実施形態を説明する目的で用いられているにすぎず、限定的なものとして意図されていないことも理解されるはずである。
【００７５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容上明確に断っていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００７６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含有する、含む）」という語、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形体は、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、記載した１つの完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）若しくはステップ、又は完全体若しくはステップの群を包含することを意味すること、及び、他のいかなる完全体若しくはステップ、又は完全体若しくはステップの群も除外することを意味するわけではないことが理解されるはずである。
【００７７】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らが用いた技術の代表例である。これらの技術が、本発明を実施するための好ましい実施形態を例示するものであること、及び、当業者が、本明細書の開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの改変を行うことが可能であることを認識することは理解されるはずである。
【実施例】
【００７８】
（材料）
四塩化炭素（ＣＣｌ４、Ｓｉｇｍａ社製、Ｃ−５３３１）、組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｅｖａ社製）。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、セントルイス、米国ミズーリ州）。
【００７９】
動物： 次の３群のＢＡＬＢ／ｃマウス：Ａ）野生型（ＷＴ）、Ｂ）重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス（Ｂ細胞及びＴ細胞が欠失）、及びＣ）ＳＣＩＤベージュ（Ｂｅｉｇｅ）（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が欠失）、を用い、これらを第４の非処置ＷＴ群と比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型及びＳＣＩＤ）も用いた。動物の取扱いは、米国国立衛生研究所のガイドラインに従った。
【００８０】
実験計画：
（Ｉ）肝線維化におけるＮＫ細胞の役割：
本研究では、次の３群のＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齡、雄）：Ａ）野生型（ＷＴ）、Ｂ）重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス（Ｂ細胞及びＴ細胞が欠失）、及びＣ）ＳＣＩＤベージュ（Ｂｅｉｇｅ）（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が欠失）、に、四塩化炭素（ＣＣｌ４）を４週間腹腔内投与することにより肝線維化を誘発させ、これらを第４の非処置ＷＴ群と比較した。肝線維化の評価は、肝臓エキスから得たα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）のウェスタンブロッティングによって、また、シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ）染色した肝組織切片（動物１個体当り３６個）をＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）形態計測システムで分析することによって行った。ＦＡＣＳ解析のために、非処置ＷＴ動物及びＣＣｌ４線維化ＷＴ動物から、脾細胞、肝内リンパ球（ＩＨＬ）及び肝星細胞（ＨＳＣ）を単離した。
【００８１】
（ＩＩ）肝線維化の免疫療法：
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（８週齡、雄）に、ＣＣｌ４を６週間ＩＰ投与することにより肝線維化を誘発させた。また、最後の２週間に、動物には、２００マイクログラム／日のＣｏｐａｘｏｎｅをＩＰ投与し（Ａ群）、又は１ｍｇ／ｍｌのＬｉｎｏｍｙｃｉｎを飲料水で投与し（Ｂ群）、又は生理食塩水で処置し（Ｃ群）、ナイーブマウス（Ｄ群）と比較した。各群には８匹の動物が含まれた。肝線維化の評価は、Ｉｓｈａｋ Ｋｎｏｄｅｌｌスコア［Ｋｎｏｄｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９８１；１（５）：４３１−５］及びヒドロキシプロリンによって、また、シリウスレッド染色した肝組織切片（動物１個体当り３６個）をＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）形態計測システムで分析することによって行った。ＦＡＣＳ解析のために、すべての動物群から脾細胞を単離した。肝線維化と、脾細胞におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞、ｉＫＩＲ及びａＫＩＲの発現と、の相関関係を評価した。
【００８２】
（ＩＩＩ）肝細胞癌の免疫療法：
ＨＣＣ動物モデルにおける脾細胞の再構成に続いて、マウスに、（Ａ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ、（Ｂ）ＩＬ−２、又は（Ｃ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ及びＩＬ−２、による処置を２週間行い、或いは（Ｄ）追加処置を行わない。これらの処置プロトコールを、肝線維化を誘発させたマウスに適用し、４つの追加群（それぞれ（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ））を設けた。各群は１０匹の雄の動物を含む。
【００８３】
脾細胞の再構成に続いて、マウスの生存及び腫瘍サイズについて２週間観察する。ケタミン／キシラジンによる麻酔の後、動物を屠殺し、ＣＣｌ４の最終投与の３日後に、血清、肝臓及び細胞を採取する。血液試料を採取し、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ（下記参照）、及びＡＦＰのレベルを検査するまで−２０℃で凍結させる。脾細胞亜集団は、ＣＤ４及びＣＤ８、ＮＫマーカー、並びにキラー細胞抑制性受容体（ｋｉｌｌｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びキラー細胞活性化受容体（ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）についてＦＡＣＳ解析する。肝臓は、線維化の重症度について評価する。
【００８４】
（ＩＶ）炎症性腸疾患の免疫療法：
大腸炎の誘発の後、マウスに、（Ａ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ、（Ｂ）ＩＬ−２、又は（Ｃ）Ｃｏｐａｘｏｎｅ及びＩＬ−２、による処置を１２日間行い、或いは（Ｄ）追加処置を行わない。各群は１０匹の雄の動物を含む。
【００８５】
ケタミン／キシラジンによる麻酔の後、動物を屠殺し、１２日目に血清及び大腸を採取する。血液試料を採取し、サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＦＮｇ、ＩＬ１０及びＴＧＦｂ）レベルを検査するまで−２０℃で凍結させる。脾細胞亜集団は、ＣＤ４及びＣＤ８、ＮＫマーカー、並びに抑制性キラー受容体及び活性化キラー受容体についてＦＡＣＳ解析する。大腸は、炎症の重症度について評価する。
【００８６】
動物モデル：
肝線維化動物モデル： マウス（８週齡、雄）に、ＣＣｌ４（コーン油で１０％に希釈）を体重１ｇ当たり５マイクロリットル、４〜６週間ＩＰ投与することにより肝線維化を誘発させた。
【００８７】
ＨＣＣ動物モデル： Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が関与するＨＣＣは、ＨＢｓＡｇを細胞表面上に発現し、腫瘍関連抗原として働く。層流フード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）内の滅菌ケージ中でレシピエントのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ社製、米国）を飼育し、照射済み食品及び無菌酸性水を与える。このマウスを致死量以下の放射線（６００ｃＧｙ）に曝す。放射線照射の２４時間後、動物の右肩に１０７のヒト肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＨＢｓＡｇを発現）を皮下注射する。放射線照射の７日後、胸腺欠損マウスに、骨髄細胞８０％及び脾臓細胞２０％の混合物を２×１０６細胞／マウスだけ投与し［Ｉｌａｎ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２７：１７０−１７６、１９９７］、その後、更に２週間観察する。
【００８８】
大腸炎を誘発させた炎症性腸疾患動物モデル： 文献［Ｔｒｏｐ Ｓ、Ｓａｍｓｏｎｏｖ Ｄ、Ｇｏｔｓｍａｎ Ｉ、Ａｌｐｅｒ Ｒ、Ｄｉｍｅｎｔ Ｊ及びＩｌａｎ Ｙ（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２９：７４６−７５５］に記載の通り、５０％エタノール１００μｌ中に溶解させたＴＮＢＳを１ｍｇ／マウスだけ直腸に点滴注入して、ＴＮＢＳ−大腸炎を誘発させた。
【００８９】
（方法）
肝臓及び大腸の組織検査： 肝臓の後部３分の１及び直腸Ｓ状部大腸を１０％ホルマリン中で２４時間固定し、次いで、自動組織処理装置（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）でパラフィン包埋した。各動物標本から７ミリメートルの切片を切り出した。各動物切片について、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。
【００９０】
肝臓切片（１５μｍ）を飽和ピクリン酸中で、０．１％シリウスレッドＦ３Ｂで染色した（いずれもＳｉｇｍａ社製）。更に、製造元の使用説明書に従って、ＤＡＫＯキット（カタログ番号Ｕ７０３３、ＥＰＯＳ社製、モノクローナル）を用いて、α平滑筋アクチンの免疫組織化学検査を実施した。
【００９１】
肝線維化の定量： シリウスレッド染色した肝切片（動物１個体当り３６個）を分析することにより、相対的線維化面積（肝臓総面積に対する百分率で示す。）を評価した。各領域（ｆｉｅｌｄ）の像を１０倍の倍率で得た後、コンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）形態計測システムを用いて分析した。相対的線維化面積を評価するために、測定したコラーゲン面積を正味領域面積で割り、更に１００を掛けた。総領域面積から血管腔面積を引いて、最終的な正味線維化面積を算出した。
【００９２】
脾細胞の単離： 屠殺時に脾臓を摘出し、７０μｍナイロンのセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通して分画した。ＲＢＣ溶解の後、脾細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で懸濁させ、ＦＡＣＳ解析まで４℃で保存した。
【００９３】
ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）解析： 脾細胞の分析は、Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製、米国）を用いた標準の技法に従って、１組の抗体（Ａｂ）を用いた直接免疫蛍光法により行う。要約すると、３×１０５個の脾細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合したＡｂと共に、４℃で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド含有固定液中で再懸濁させて分析する。脾細胞の染色に用いる抗体は、ＰＥ及びＦＩＴＣがそれぞれ結合したモノクローナル抗マウスＣＤ４及びＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の染色には、ＡＰＣが結合したラット抗マウスＣＤ４９ｂ／Ｐａｎ−ＮＫ細胞モノクローナル抗体を用いる。この抗体により、大多数のＮＫ細胞が同定される。キラー細胞抑制性受容体（ｉＫＩＲ）については、ＰＥが結合したモノクローナルマウス抗マウスＬｙ−４９Ｃ及びＬｙ４９Ｉを用いる。キラー細胞活性化受容体（ａＫＩＲ）については、ＦＩＴＣが結合したラット抗マウスＬｙ−４９Ｄモノクローナル抗体を用いた。制御性Ｔ細胞の役割を明らかにするために、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いた。リンパ球を同定するために、ペリジニンクロロフィル−αタンパク質（Ｐｅｒ−ＣＰ）が結合したラット抗マウスＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）による染色を用いた。
【００９４】
リンパ球サブセットは、ＣＤ４５陽性細胞に対する百分率で示す。
【００９５】
ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、及びα−フェトプロテインを検出するラジオイムノアッセイ： 市販の固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ａｕｓｒｉａ ＩＩ及びＡｕｓａｂ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ノースシカゴ、米国イリノイ州）により、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｓＡｇに対する抗体を測定する。ＲＩＡによる抗ＨＢｓの定量分析は、世界保健機関の標準血清を用いて、また、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒの式を利用して行い、データはｍＩｕ／ｍｌで示す。（２２）。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、ＲＩＡ（ＡＦＰ、Ｂｒｉｄｇｅ Ｓｅｒｏｎｏ社製、イタリア）によって測定し、ｎｇ／ｍｌで示す。
【００９６】
α平滑筋アクチンの免疫ブロッティング： 既に記載した方法［ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１７４：９１５−９２４］に修正を加えて、肝臓エキス中のα−ＳＭＡの免疫ブロッティングを実施する。
【００９７】
全肝臓タンパク質抽出物を、肝臓ホモジナイズ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及びＥＤＴＡフリーコンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、マンハイム、ドイツ））中で調製した。次いで、タンパク質（１レーン当り３０μｇ）を還元条件下、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離させた。免疫ブロッティングのために、タンパク質をＰｒｏｔｒａｎメンブランに移し、５％脱脂乳含有ブロッキング緩衝液中、４℃で一晩インキュベートした。抗ＳＭＡマウスモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製、カタログ番号Ｍ０８５１）、及びペルオキシダーゼが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐ．Ａ．Ｒ．Ｉ．Ｓ．、コンピエーニュ、フランス）、並びに高感度化学発光法（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いた。
【００９８】
統計： 統計的有意差については、スチューデントの検定を用いた。
【００９９】
（結果）
（Ｉ）肝線維化におけるＮＫ細胞の役割：
相対的線維化面積は、ＣＣｌ４ ＷＴでは肝臓総面積の２．３２％（±１．３９）、ＣＣｌ４ ＳＣＩＤでは１．１１％（±６．４）、ＣＣｌ４ ＳＣＩＤベージュでは１．８５％（±１．１９）、ナイーブＷＴでは０．３％（±０．３７）であった。すべてのＣＣｌ４処置群では、コントロールに比べて肝線維化が有意に増大した（Ｐ＝０．００１）。ＳＣＩＤベージュ群では、ＳＣＩＤ群に比べて線維化が有意に増大した（Ｐ＝０．０００１）。すべての群において、相対的線維化はα−ＳＭＡの発現と密接な相関関係があった。脾細胞のＦＡＣＳ解析により、ＷＴマウスでは、線維化の後、ＮＫ細胞及びＣＤ１１ｃ細胞の絶対数、並びにクラスＩの提示が有意に変化せず、ＣＤ４細胞が２６％±５．７から１９％±３．８に有意に減少し（Ｐ＝０．０１）、ＮＫ細胞におけるａＫＩＲ：ｉＫＩＲ比は０．７６±０．２１から２．７９±０．９８に有意に上昇する（Ｐ＝０．００３）ことが明らかになった。肝内リンパ球（ＩＨＬ）の分析でも、類似の結果が得られた。このような知見は、線維化誘発の後、ＮＫ細胞が機能的に活性化されることを示唆する。同時に、線維化の後、肝星細胞（ＨＳＣ）におけるクラスＩ分子の平均発現量は、８１％±１５から３７％±１２に有意に減少した（Ｐ＝０．００１）（基礎値の５１％±１３に低下）。ＨＳＣクラスＩＩ陽性分子の発現は変化しなかった。活性化ＨＳＣにおけるクラスＩの自己認識（ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）マーカーの減少は、活性化ＮＫ細胞による殺傷への感受性が増強されたことを反映している。
【０１００】
（ＩＩ）肝線維化の免疫療法：
以下のパラメータを用いて、ＣＣｌ４処置動物における肝傷害及び肝線維化を測定することにより、免疫療法の効果を評価した。
【０１０１】
肝傷害の重症度： ＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルによって評価した肝傷害は、ＣＣｌ４を処置したすべての実験群で、ナイーブマウスに比べて高かった。線維化を誘発させた異なる群間では、有意な差が見られなかった（図１）。
【０１０２】
肝組織の炎症及び壊死の状態を表す肝臓の種々の病理組織学的パラメータの、Ｉｓｈａｋ傷害スコアによる評価では、群間で差がないことが分かった（図２）。
【０１０３】
線維化重症度スコア： 線維化の重症度の評価は、種々の群から採取し、Ｈ＆Ｅ染色した肝切片のＢｉｏｑｕａｎｔ解析（図３の例を参照）、及びα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の定量によって評価した。
【０１０４】
分析面積に対するコラーゲンの百分率により評価した線維化の重症度は、ＣＣｌ４による線維化誘発の後、Ｃｏｐａｘｏｎｅ又はＬｉｎｏｌｉｎ処置群で有意に低下した（ｐ＜０．０００１）（図４に示す）。
【０１０５】
α平滑筋アクチンの量は線維化の程度と相関関係があり、このアクチンは、ＣＣｌ４動物群で高度に発現し、Ｃｏｐａｘｏｎｅ群及びＬｉｎｏｌｉｎ群で有意に減少した（図５）。
【０１０６】
リンパ球細胞集団： 脾細胞のＦＡＣＳ解析により、線維化誘発の後、すべての線維化群（Ａ、Ｂ及びＣ）でＣＤ４細胞が有意に減少する（ｐ＜０．０００５）ことが明らかとなったが、群間では、有意な差が見られなかった（図６）。
【０１０７】
ＣＤ８細胞は、Ａ群において、Ｃ群（ｐ＜０．０５）及びＤ群（ｐ＜０．００５）のいずれに比べても有意に減少した（図６）。ＣＤ４：ＣＤ８比は、線維化の後、Ｃ群で有意に低下した（ｐ＜０．０００３）（図７）。この比は、２つの処置群（Ａ及びＢ）で有意に上昇したが、ナイーブ動物（Ｄ群）よりはなお有意に低かった（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１６）。Ａ群のＣＤ４／ＣＤ８比は、Ｃ群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０４）（図７）。
【０１０８】
線維化の後、ＮＫ細胞の総数は変化しなかったが（Ｃ群及びＤ群）、処置群（Ａ及びＢ）ではいずれも数が増加し、この増加はＣｏｐａｘｏｎｅ群で有意であった（ｐ＜０．００２）（図８）。ａＫＩＲ：ｉＫＩＲ比を計算したが、ＮＫ細胞のａＫＩＲ及びｉＫＩＲについて、合計の値（ｔｏｔａｌ ｒｅａｄｉｎｇ）及び個別の値（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｄｉｎｇ）を測定した。いずれも同じパターンを示したが、図９で見られるように、線維化の後、すべての群（Ａ、Ｂ及びＣ）で比が有意に上昇したので、後者の方がより特異的であった。Ａ群及びＢ群では、ナイーブ群（Ｄ群）に比べて、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲの有意な上昇が見られたが（ｐ＜０．０００１）、非処置線維化群（Ｃ群）と比べると、なお有意に低かった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
肝内リンパ球のＦＡＣＳ解析により、線維化誘発の後、線維化群（Ａ及びＣ）でＣＤ４細胞が有意に減少する（ｐ＜０．０００００１）ことが明らかとなったが、群間では、有意な変化が見られなかった（図１０）。
【０１１０】
ＣＤ８細胞は、Ａ群において、Ｃ群に比べて有意に減少したが（ｐ＜０．００１）、Ｄ群よりは有意に高かった（ｐ＜４×１０−７）（図１０）。ＣＤ４：ＣＤ８比は、線維化の後、Ｃ群で有意に低下した（ｐ＜３．１×１０−１０）（図１１）。この比は、処置したＡ群で、Ｃ群に比べて有意に上昇したが（ｐ＜０．００２）、ナイーブ動物（Ｄ群）よりはなお有意に低かった（ｐ＜４．２×１０−１０）（図１１）。
【０１１１】
肝内のＮＫ細胞数は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ群において、線維化Ｃ群に比べて有意に増加した（ｐ＜０．０００１）（図１２）。
【０１１２】
結論： 上記の実験から、Ｃｏｐａｘｏｎｅ及びＬｉｎｏｍｙｃｉｎは、用いた動物モデルにおいて著しい抗線維化作用を示したことが明らかになる。この作用は、ＮＫ細胞の総数を増加させる、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇を介するものだった。それらのＮＫ細胞は、活性化星細胞を抑制するように活性化され刺激されることによって、線維化を低減させた。この結論は、Ｉｓｈａｋスコア法を用いて測定した肝傷害の程度において、Ｃｏｐａｘｏｎｅ群（Ａ）及びＣＣｌ４群（Ｃ）の間で有意な差がないことを示した病理組織学的所見によって強く支持される。従って、Ｃｏｐａｘｏｎｅは、炎症過程を直接低減させることによって線維化を低減させるのではなく、むしろ、ＨＳＣの活性化を抑制することによって線維化を低減させる。
【０１１３】
（ＩＶ）炎症性腸疾患の免疫療法：
大腸炎を誘発させた後、マウスをＣｏｐａｘｏｎｅで処置した。処置群とコントロール群の間で、大腸炎スコアを巨視的に、かつ微視的に比較した。いずれの試験においても、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置の結果、組織傷害の顕著な低減が見られた（図１３ａ及び１３ｂ）。図１４で実証されるように、微視的な改善が特に明らかであった（ｐ＜０．０３）。
【０１１４】
脾臓のＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８の細胞集団のＦＡＣＳ解析により、大腸炎を誘発させたＣｏｐａｘｏｎｅ処置群でＣＤ４細胞数が有意に増加する（ｐ＜０．０３）ことが明らかとなった（図１５）。ＣＤ４細胞数の増加は、インターロイキン４（ＩＬ−４）分泌細胞ではなく、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌細胞の増加を伴う（ｐ＜０．０２）ものだった（図１６）。
【０１１５】
ＣＤ８細胞集団は、大腸炎を誘発させても、Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置しても、影響を受けなかった（図１５）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置の後減少したように思われる（図１７）。
【０１１６】
測定したサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０の血清レベルは、大腸炎を誘発させたＣｏｐａｘｏｎｅ処置群において、大腸炎を誘発させた非処置群に比べて有意に低下した（それぞれｐ＜０．００６、ｐ＜０．００４、及びｐ＜０．００２）（図１８）。
【０１１７】
結論： Ｃｏｐａｘｏｎｅによる処置を行うと、大腸炎を罹患した動物の組織傷害は、免疫調節状態が変化することにより低減される。Ｃｏｐａｘｏｎｅの投与は、Ｔ細胞ＣＤ４集団の構成、並びにＴｈ１及びＴｈ２サイトカインのプロファイルに影響を及ぼした。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおけるＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルを示す図である。ＣＣｌ４線維化誘発マウスモデルにおいて、ＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルを測定して、肝傷害を評価し、治療効果を推定した。［略語： ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ：アラニントランスアミナーゼ、Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、ｕ／ｌ：ユニット／リットル］
【図２】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝傷害スコア及び肝線維化スコアを示す図である。病理学的分析及びＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）解析により、ＣＣｌ４で処置したすべての群において、ナイーブ動物に比べて、肝傷害及び肝線維化が有意に増大したことが明らかとなった。Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置群及びＬｉｎｏｍｙｃｉｎ処置群では、ＣＣｌ４線維化誘発非処置群に比べて、線維化の有意な低減が見られた（Ｐ値は０．００１未満）。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｈｅｐ．Ｉｎｊ．Ｓｃ．：肝傷害スコア、Ｉｎｊ．Ｓｃ．：傷害スコア、Ｆｉｂｒ．Ｓｃ．：線維化スコア、％ｆｉｂｒ．Ａｒ．：肝線維化面積の百分率］
【図３ａ】ナイーブマウスのシリウスレッドＦ３Ｂ肝切片における肝組織線維化の病理学的検査の結果を示す図である。
【図３ｂ】Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置したＣＣｌ４線維化誘発マウスのシリウスレッドＦ３Ｂ肝切片における肝組織線維化の病理学的検査の結果を示す図である。
【図４】ＣＣｌ４線維化誘発マウスの肝臓病変面積中のコラーゲンの百分率による、肝組織線維化の評価を示す図である。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、％ｃｏｌｌ．Ａｒ．：肝線維化面積中のコラーゲンの百分率］
【図５】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおけるαＳＭＡの発現量による、肝組織線維化の評価を示す図である。抗αＳＭＡ抗体を用いて、線維化マウス及びコントロールマウスの肝組織試料に対するウェスタンブロッティングを行った。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、αＳＭＡ：α平滑筋アクチン、ＫＤ：キロダルトン］
【図６】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団の細胞数を示す図である。発現した脾臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞数を、脾臓リンパ球集団に対する相対値で示した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、％ｔｏｔ．ｌｙｍｐ．：脾臓リンパ球集団に対する百分率］
【図７】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓ＣＤ４／ＣＤ８細胞集団の細胞数比を示す図である。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、Ｒａｔ．：比］
【図８】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓ＮＫ細胞集団の細胞数を示す図である。ＮＫ細胞数を、脾臓ＣＤ４５細胞集団に対する相対値で評価した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、％ＣＤ４５：ＣＤ４５細胞集団に対する百分率］
【図９】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける脾臓のＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比を示す図である。ａＫＩＲ、ｉＫＩＲ及び全ＮＫ細胞について別々に行った測定の結果から、ａＫＩＲ：ｉＫＩＲ比を算出した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、Ｔｒｅａｔ．：処置、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ Ｒａｔ．：ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比］
【図１０】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団の細胞数を示す図である。肝臓ＣＤ４及びＣＤ８細胞数を、肝臓リンパ球集団に対する相対値で示した。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｌｉｎｏｍ．：Ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、％ｌｙｍｐ．：肝臓リンパ球集団に対する百分率］
【図１１】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝臓ＣＤ４／ＣＤ８細胞集団の細胞数比を示す図である。［略語： Ｎａｉ．：ナイーブ、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｒｅａｔ．：処置、Ｒａｔ．：比］
【図１２】ＣＣｌ４線維化誘発マウスにおける肝臓ＮＫ細胞集団の細胞数を示す図である。ＮＫ細胞数を、肝臓ＣＤ４５細胞集団に対する相対値で評価した。［略語： Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、％ＣＤ４５：肝臓ＣＤ４５細胞集団に対する百分率］
【図１３ａ】大腸炎誘発マウスにおける大腸炎スコアを示す図であり、大腸炎誘発マウスにおける組織傷害の巨視的評価に関するものである。大腸炎誘発マウス及びナイーブコントロールにおいて、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置マウス又は非処置マウスと比べて、大腸炎スコアを巨視的に評価した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１３ｂ】大腸炎誘発マウスにおける大腸炎スコアを示す図であり、大腸炎誘発マウスにおける組織傷害の微視的評価に関するものである。大腸炎誘発マウス及びナイーブコントロールにおいて、Ｃｏｐａｘｏｎｅ処置マウス又は非処置マウスと比べて、大腸炎スコアを微視的に評価した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１４ａ】ナイーブマウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１４ｂ】Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置したナイーブマウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１４ｃ】大腸炎誘発マウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１４ｄ】Ｃｏｐａｘｏｎｅで処置した大腸炎誘発マウスにおける大腸の病理学的検査の結果を示す図である。直腸Ｓ状部大腸の切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。
【図１５】大腸炎誘発マウスにおける脾臓ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団の細胞数を示す図である。脾臓ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８細胞数を、脾臓リンパ球集団に対する相対値で示した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ、％ＣＤ４５：脾臓ＣＤ４５細胞集団に対する百分率］
【図１６】大腸炎誘発マウスにおけるＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞亜集団及びＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞亜集団の細胞数を示す図である。ＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞亜集団及びＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞亜集団の細胞数を、全ＣＤ４細胞集団に対する相対値で評価した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１７】大腸炎誘発マウスにおけるＡＰＣ集団の細胞数を示す図である。脾臓の抗原提示細胞数を、脾臓ＣＤ４５細胞集団に対する相対値で示した。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ］
【図１８】大腸炎誘発マウスにおけるサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの血清レベルを示す図である。［略語： Ｃｏｌ．：大腸炎、Ｃｏｐａｘ．：Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｎａｉ．：ナイーブ、ｐｇ／ｍｌ：ピコグラム／ミリリットル］
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝線維化を治療する方法であって、
それを必要とする個体に免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法。
【請求項２】
前記免疫調節剤が、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫調節剤が酢酸グラチラマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記個体がヒト個体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
肝線維化を治療するための医薬組成物の調製における免疫調節剤の使用。
【請求項６】
前記免疫調節剤が、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こすことができる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記免疫調節剤が酢酸グラチラマーである、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
肝線維化の治療に使用する免疫調節剤。
【請求項９】
肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項８に記載の免疫調節剤。
【請求項１０】
酢酸グラチラマーである、請求項８又は９に記載の免疫調節剤。
【請求項１１】
肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす方法であって、
そのような治療を必要とする個体に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記免疫調節剤が酢酸グラチラマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
肝線維化を治療するための、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
線維化肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こし、それにより肝線維化を低減させるための、免疫調節剤、好ましくは酢酸グラチラマーの使用。
【請求項１５】
肝線維化の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験物質を提供するステップと、
ｂ．線維化を誘発させたモデル動物、及び非線維化モデル動物を提供するステップと、
ｃ．前記被験物質を前記線維化動物及び非線維化動物に投与するステップと、
ｄ．前記動物から肝組織の試料を採取するステップと、
ｅ．前記試料における、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＮＫ細胞数、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比、及び線維化組織の面積、並びに少なくとも１種の一般的な線維化パラメータ、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、
ｆ．線維化を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非線維化動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、
ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇、及び／又は線維化組織の面積の縮小、及び／又は前記一般的な線維化パラメータの低下が、前記被験物質が肝線維化の治療に有用であることを示す方法。
【請求項１６】
前記一般的な線維化パラメータが、Ｉｓｈａｋ線維化スコア、コンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）による定量、又はウェスタンブロッティングを用いたα平滑筋アクチンの評価である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
肝細胞癌を治療する方法であって、
それを必要とする個体に、少なくとも１種の免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法。
【請求項１８】
肝組織又は腸組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす少なくとも１種の免疫調節剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫調節剤が、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体がヒト個体である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性腸疾患を治療する方法であって、
それを必要とする個体に、少なくとも１種の免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法。
【請求項２２】
血清又は腸組織において、ＣＤ４細胞数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下を引き起こす少なくとも１種の免疫調節剤を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫調節剤が、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記個体がヒト個体である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
炎症性腸疾患の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験物質を提供するステップと、
ｂ．大腸炎を誘発させたモデル動物、及び非大腸炎モデル動物を提供するステップと、
ｃ．前記被験物質を前記大腸炎動物及び非大腸炎動物に投与するステップと、
ｄ．前記動物から腸組織の試料を採取するステップと、
ｅ．血清又は腸組織における、ＣＤ４細胞数、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞及びＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞の数、及びＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度、並びに前記試料中の炎症組織の病理組織学的検査、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、
ｆ．大腸炎を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非大腸炎動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、
血清又は腸組織における、ＣＤ４細胞の総数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下、及び／又は病理組織学的状態の改善が、前記被験物質が炎症性腸疾患の治療に有用であることを示す方法。
【請求項２６】
肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つを治療するための医薬組成物の調製における免疫調節剤の使用。
【請求項２７】
前記免疫調節剤が、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記免疫調節剤が、血清又は腸組織において、ＣＤ４細胞数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下を引き起こす、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記免疫調節剤が、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項２６、２７又は２８に記載の使用。
【請求項３０】
肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つの治療に使用する免疫調節剤。
【請求項３１】
肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項３０に記載の免疫調節剤。
【請求項３２】
血清又は腸組織において、ＣＤ４細胞数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下を引き起こす、請求項３０に記載の免疫調節剤。
【請求項３３】
随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項３０、３１又は３２に記載の免疫調節剤。
【請求項１】
肝線維化を治療する方法であって、
それを必要とする個体に免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法。
【請求項２】
前記免疫調節剤が、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫調節剤が酢酸グラチラマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記個体がヒト個体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
肝線維化を治療するための医薬組成物の調製における免疫調節剤の使用。
【請求項６】
前記免疫調節剤が、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こすことができる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記免疫調節剤が酢酸グラチラマーである、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
肝線維化の治療に使用する免疫調節剤。
【請求項９】
肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項８に記載の免疫調節剤。
【請求項１０】
酢酸グラチラマーである、請求項８又は９に記載の免疫調節剤。
【請求項１１】
肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす方法であって、
そのような治療を必要とする個体に、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす免疫調節剤を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記免疫調節剤が酢酸グラチラマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
肝線維化を治療するための、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
線維化肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こし、それにより肝線維化を低減させるための、免疫調節剤、好ましくは酢酸グラチラマーの使用。
【請求項１５】
肝線維化の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験物質を提供するステップと、
ｂ．線維化を誘発させたモデル動物、及び非線維化モデル動物を提供するステップと、
ｃ．前記被験物質を前記線維化動物及び非線維化動物に投与するステップと、
ｄ．前記動物から肝組織の試料を採取するステップと、
ｅ．前記試料における、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＮＫ細胞数、ＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比、及び線維化組織の面積、並びに少なくとも１種の一般的な線維化パラメータ、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、
ｆ．線維化を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非線維化動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、
ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇、及び／又は線維化組織の面積の縮小、及び／又は前記一般的な線維化パラメータの低下が、前記被験物質が肝線維化の治療に有用であることを示す方法。
【請求項１６】
前記一般的な線維化パラメータが、Ｉｓｈａｋ線維化スコア、コンピューターＢｉｏｑｕａｎｔ（登録商標）による定量、又はウェスタンブロッティングを用いたα平滑筋アクチンの評価である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
肝細胞癌を治療する方法であって、
それを必要とする個体に、少なくとも１種の免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法。
【請求項１８】
肝組織又は腸組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす少なくとも１種の免疫調節剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫調節剤が、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体がヒト個体である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性腸疾患を治療する方法であって、
それを必要とする個体に、少なくとも１種の免疫調節剤を治療有効量投与することを含む方法。
【請求項２２】
血清又は腸組織において、ＣＤ４細胞数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下を引き起こす少なくとも１種の免疫調節剤を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫調節剤が、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記個体がヒト個体である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
炎症性腸疾患の治療に有用な免疫調節剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験物質を提供するステップと、
ｂ．大腸炎を誘発させたモデル動物、及び非大腸炎モデル動物を提供するステップと、
ｃ．前記被験物質を前記大腸炎動物及び非大腸炎動物に投与するステップと、
ｄ．前記動物から腸組織の試料を採取するステップと、
ｅ．血清又は腸組織における、ＣＤ４細胞数、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞及びＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞の数、及びＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度、並びに前記試料中の炎症組織の病理組織学的検査、のうちの少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、
ｆ．大腸炎を誘発させた動物から採取した試料について得られた結果を、非大腸炎動物について得られた対応する結果と比較するステップと、を含み、
血清又は腸組織における、ＣＤ４細胞の総数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下、及び／又は病理組織学的状態の改善が、前記被験物質が炎症性腸疾患の治療に有用であることを示す方法。
【請求項２６】
肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つを治療するための医薬組成物の調製における免疫調節剤の使用。
【請求項２７】
前記免疫調節剤が、肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記免疫調節剤が、血清又は腸組織において、ＣＤ４細胞数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下を引き起こす、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記免疫調節剤が、随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項２６、２７又は２８に記載の使用。
【請求項３０】
肝細胞癌及び炎症性腸疾患のいずれか１つの治療に使用する免疫調節剤。
【請求項３１】
肝組織において、ＣＤ４：ＣＤ８比の上昇、及び／又はＮＫ細胞数の増加、及び／又はＮＫ ａＫＩＲ：ＮＫ ｉＫＩＲ比の上昇を引き起こす、請求項３０に記載の免疫調節剤。
【請求項３２】
血清又は腸組織において、ＣＤ４細胞数の増加、及び／又はＩＬ−４分泌ＣＤ４細胞ではなく、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４細胞の数の減少、及び／又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の低下を引き起こす、請求項３０に記載の免疫調節剤。
【請求項３３】
随意的にＩＬ−２と組み合わせた酢酸グラチラマーである、請求項３０、３１又は３２に記載の免疫調節剤。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５０５８９３（Ｐ２００７−５０５８９３Ａ）
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６８０７（Ｐ２００６−５２６８０７）
【出願日】平成１６年９月１４日（２００４．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００８４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５５９６
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５００５４５３１１）ハダシット メディカル リサーチ サービシーズ アンド ディベロップメント リミテッド (8)
【出願人】（５０４３２０１９０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１４日（２００４．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００８４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５５９６
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５００５４５３１１）ハダシット メディカル リサーチ サービシーズ アンド ディベロップメント リミテッド (8)
【出願人】（５０４３２０１９０）
【Ｆターム（参考）】
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