免疫障害を治療する方法
本発明は、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症などのＢ細胞仲介性免疫障害の治療に関する。特に本発明は、形質細胞前駆体表面で発現する膜結合遊離軽鎖に結合する抗体を使用した、Ｂ細胞仲介性免疫障害の治療に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および敗血症などのＢ細胞仲介性免疫障害の治療に関する。特に本発明は、膜結合遊離軽鎖に結合する抗体を使用したＢ細胞仲介性免疫障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己構成要素の認識異常は、組織損傷そして、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、および多発性硬化症などの自己免疫疾患をもたらすので、「自己」構成要素を「非自己」構成要素から識別する免疫系の能力は重要である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００６）。
【０００３】
Ｔ細胞は数十年間にわたり自己免疫疾患研究の焦点であるが、リンパ腫治療法としてのＢ細胞除去抗体リツキシマブの開発は、免疫障害におけるＢ細胞の役割を研究するためのツールを提供している（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００６）。リツキシマブは強力なＢ細胞溶解性キメラ型ＩｇＧ１ ＣＤ２０特異的モノクローナル抗体であり、それは主に抗体依存細胞仲介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によってＢ細胞を死滅させる。リツキシマブの標的は、前Ｂ細胞段階から前形質細胞段階にかけて発現されるＣＤ２０である（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，２００６）。抗ＣＤ２０抗体の注射に続いて、末梢の抗体被覆Ｂ細胞は非常に低いレベルまで迅速に死滅し、約６〜１２ヶ月にわたって低レベルのままである（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００６）。
【０００４】
リツキシマブによるＢ細胞除去の反復するサイクルは、ＩｇＧでは３．５ＧＬ−１程度に低く、ＩｇＭでは検出不能なレベルに至る総免疫グロブリンの減少と関連付けられ得て、それは実施し得るＢ細胞除去回数を制限するかもしれない（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２００６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｅｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８３：４６５−４７０．
【非特許文献２】Ｂｅｙｃｈｏｋ（１９７９）Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ６９．
【非特許文献３】Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６．
【非特許文献４】Ｂｏｕｘ，ＨＡ． ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１５８：１７６９．
【非特許文献５】Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：６７３−６８０．
【非特許文献６】Ｂｒｏｗｎｉｎｇ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５：５６４−５７６．
【非特許文献７】Ｃｅｐｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｒａｉｎ，１２８：１６６７．
【非特許文献８】Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５：８６７０−８６７４．
【非特許文献９】Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：３９４−４０３．
【非特許文献１０】Ｇｏｏｄｎｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１２７６
【非特許文献１１】Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：１０９８−１１０４．
【非特許文献１２】Ｈａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４：６６２９−６６３７．
【非特許文献１３】Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＢＢＡ，１０８８：３１１−３１４．
【非特許文献１４】Ｈｏｆｍａｎｎ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：９７８−８４．
【非特許文献１５】Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３．
【非特許文献１６】Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ，５４：１３４３−１３４５．
【非特許文献１７】Ｊｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ，９４：７０１．
【非特許文献１８】Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５．
【非特許文献１９】Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，５４：３３０１−３３１８．
【非特許文献２０】Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８８：１３３−１３４．
【非特許文献２１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５．
【非特許文献２２】Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：１８０２５−３３．
【非特許文献２３】Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｓｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５：２３０−２４２．
【非特許文献２４】Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１４２５６−１４２６１．
【非特許文献２５】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５ Ｓｕｐｐｌ １：５１７−２０．
【非特許文献２６】Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７７：４２１６−４２２０．
【非特許文献２７】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，１８６：８３３−８４１．
【非特許文献２８】Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：６８７９−６８８７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｂ細胞仲介性免疫障害を治療する新しい方法に対する必要性が、なおもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、膜結合遊離軽鎖（ｍＦＬＣ）が形質細胞前駆体上で発現されることを今や確認した。形質細胞前駆体上のｍＦＬＣは、Ｂ細胞仲介性免疫障害の治療または予防のための標的を提供する。
【０００８】
本発明者らによって提案される治療法は、Ｂ細胞仲介性免疫障害を患っている対象において形質細胞前駆体を除去するためのｍＦＬＣに特異的に結合する抗体の投与に基づく。この治療標的の１つの利点は、それが正常なＢ細胞上に存在しないことである。
【０００９】
したがって本発明は、対象においてＢ細胞仲介性免疫障害を治療または予防する方法を提供し、方法は、膜結合遊離軽鎖（ｍＦＬＣ）に結合する有効量の抗体を対象に投与するステップを含んでなる。
【００１０】
好ましい実施態様では、抗体が、例えば形質芽球などの形質細胞前駆体上のｍＦＬＣに結合する。
【００１１】
一実施態様では、形質芽球はマーカーＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ４５について陽性である。特定の一実施態様では、形質芽球はマーカーＩｇＤについて陰性である。
【００１２】
別の好ましい実施態様では、抗体がｍＦＬＣに特異的に結合する。
【００１３】
一実施態様では、対象に投与される抗体は、細胞毒性部分または生物反応修飾物質に共役する。非限定的例として、細胞毒性部分は、細胞毒物または細菌または植物起源の酵素的に活性な毒素（ゲロニンなど）、またはこのような毒素の酵素的に活性な断片（「Ａ鎖」）であってもよい。酵素的に活性な毒素およびその断片が好ましく、ゲロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの）菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ナデシコタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害物質、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害物質、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンによって例示される。細胞毒性部分はまた、放射性薬剤であってもよい。特に細胞毒性部分は、例えばイットリウム−９０（９０Ｙ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）または銅−６７（６７Ｃｕ）などの放射性核種であってもよい。好ましくは細胞毒性部分は、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である。
【００１４】
ｍＦＬＣに結合する抗体と共役し、本発明で使用されてもよい生物反応修飾物質としては、ＩＬ−２およびインターフェロン（α、βまたはγ）などのリンフォカインおよびサイトカインが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの生物反応修飾物質は、細胞に対して様々な効果を有する。これらの影響としては、直接作用による細胞死滅増大、ならびに宿主防衛仲介過程の増大による細胞死滅増大が挙げられる。ｍＦＬＣに結合する抗体のこれら生物反応修飾物質への共役は、形質細胞前駆体内の選択的局在化を可能にし、ひいては非標的細胞の毒性につながる非特異的効果を抑制する。生物反応修飾物質は、好ましくはリンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである。
【００１５】
別の実施態様では、細胞毒性部分は細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００１６】
あらゆる適切なｍＦＬＣに結合する抗体を本発明の方法で使用してもよいが、一実施態様では、抗体はＫＭＡまたはＬＭＡに結合する。特定の一実施態様では、抗体はＫＭＡに結合する。
【００１７】
一実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体はＫ１２１様抗体である。好ましくは、Ｋ１２１様抗体は配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を含んでなり、またはκ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）への結合について、配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を有する抗体と競合する。
【００１８】
一実施態様では、本発明の方法によって治療されるＢ細胞仲介性障害は自己免疫疾患である。特定の一実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症から選択される。
【００１９】
本発明は、有効量のｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップを含んでなる、対象において形質細胞前駆体の成長を阻害するか、または死滅させる方法をさらに提供する。一例として形質細胞前駆体の阻害または死滅は、アポトーシスによって、または対象の免疫細胞によって（抗体依存細胞仲介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）などによって）、および／または抗体依存性の細胞の食作用によって達成されてもよい。
【００２０】
本発明はまた、細胞毒性部分または生物学的修飾因子と共役するｍＦＬＣに結合する抗体を投与することで、対象において形質細胞前駆体を阻害しまたは死滅させる方法も提供する。
【００２１】
好ましくは、細胞毒性部分は、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である。
【００２２】
一実施態様では、細胞毒性部分は、細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００２３】
別の実施態様では、生物反応修飾物質は、リンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである。
【００２４】
本発明は、ｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップと、抗体を対象内で細胞に結合させるステップと、抗体の位置を対象内で判定するステップを含んでなる、対象において形質細胞前駆体を局在化する方法をさらに提供する。
【００２５】
一実施態様では、抗体は検出可能に標識される。
【００２６】
好ましくは、本発明の方法で使用される抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００２７】
本発明は、Ｂ細胞仲介性免疫障害を治療する薬剤を製造するためのｍＦＬＣに結合する抗体の使用をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、
（ｉ）対象から造血性前駆細胞集団を取り出すステップと、
（ｉｉ）細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体で処置するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの処置済み細胞集団を対象に移植するステップと
を含んでなる、対象において自己造血細胞を移植する方法をさらに提供する。
【００２９】
前駆細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体で処置するステップは、好ましくは、抗体と集団中に存在する形質細胞前駆体との結合に十分な条件下で、細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体に接触させて、形質細胞前駆体の成長を阻害するか、または死滅させることを伴う。
【００３０】
一実施態様では、方法は、ｍＦＬＣに結合する抗体を対象中に静脈点滴するステップをさらに含んでなる。
【００３１】
さらに別の実施態様では、自家移植する方法は、細胞減少療法の最中または後に対象に対して実施される。
【００３２】
なおもさらに好ましい実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体は固体担体に結合する。
【００３３】
明らかになるように、本発明の一態様の好ましい徴群および特徴は、本発明の多数のその他の態様にも当てはまる。
【００３４】
本明細書全体を通じて、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、言及される要素、整数または工程、または要素群、整数群または工程群の包含を暗示するが、あらゆるその他の要素、整数または工程、または要素群、整数群または工程群を排除しないものと理解される。
【００３５】
本発明は、以下の非限定的例を手段として添付図に言及して、下文中で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭ活性化Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）上でのＫＭＡ発現。ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で、末梢Ｂ細胞が活性化された。６日目に細胞を収集し、次にＫＭＡ、ＩｇＤ、ＣＤ２７、およびＣＤ３８について染色した。ゲート１．＝ＣＤ３８ｌｏｗ、ゲート２．＝ＣＤ３８＋、およびゲート３．＝ＣＤ３８＋＋。
【図２】ＳＡＣ活性化形質芽球上でのＫＭＡ発現。末梢Ｂ細胞はＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で活性化された。６日目に、細胞を収集し、次にＫＭＡ、ＩｇＤ、ＣＤ２７、およびＣＤ３８について染色した。ゲート１．＝ＣＤ３８ｌｏｗ、ゲート２．＝ＣＤ３８＋、およびゲート３．＝ＣＤ３８＋＋。
【図３】ＫＭＡはＣＤ３８＋＋ＣＤ４５＋未成熟形質細胞上で発現される。扁桃由来単核細胞をＫＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４５、およびＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎについて染色した。図３ａは、ＶｉａｂｌｅＢ細胞は、ＣＤ１９およびＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ染色の欠如によってゲート制御した。次に細胞をＣＤ３８発現によってゲート制御した。ゲート１．＝ＣＤ３８ｌｏｗ、ゲート２．＝ＣＤ３８＋、およびゲート３．＝ＣＤ３８＋＋。図３ｂは、細胞をＫＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４５およびＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎについて染色した。生存細胞をＣＤ３８＋＋発現によってゲート制御し、ＫＭＡおよびＣＤ４５陽性について分析した。
【図４】形質芽球によるＫＭＡ発現細胞の同定およびＩＨＣによる形質細胞形態学。正常な組織からの未固定切片をＦＩＴＣ標識ＭＤＸ１０９７で染色し、マウス抗ＦＩＴＣ２次抗体、次に抗マウスペルオキシダーゼがそれに続いた。切片を色原体基質で発色させた。パネル１＝扁桃切片、パネル２＝唾液腺、およびパネル３＝末梢血。矢印はＫＭＡ＋細胞を表す。
【図５】ＫＭＡはＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭ活性化形質芽球上で発現される。末梢Ｂ細胞をＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で活性化した。６日目に細胞を収集し、ＫＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、および表面ＩｇＤ（図示せず）について染色した。図５ａは、収集細胞の散乱プロフィールである。全ての引き続く分析はライブゲート（ゲート２）内で実施された。図５ｂは、ゲート制御集団のＣＤ２７およびＣＤ３８プロフィールを示す。図５ｃは、パネル（ｂ）で着色される集団内の（アイソタイプ対照との比較で）ＫＭＡ陽性細胞の百分率を示す。ゲート３＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７−、ゲート４＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７＋、およびゲート５＝ＣＤ３８＋＋ＣＤ２７＋＋。ＫＭＡは、ＡＰＣ標識ＭＤＸ−１０９７を使用して検出され、アイソタイプ対照はＡＰＣ標識ヒトＩｇＧ１抗体であった。提示される結果は、５つの独立した実験を表す。
【図６】ＬＭＡは、ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭ活性化形質芽球上で発現される。末梢Ｂ細胞は、ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で活性化された。６日目に細胞を収集し、ＬＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、および表面ＩｇＤ（図示せず）について染色した。図６ａは、収集された細胞の散乱プロフィールである。引き続く全ての分析は、ライブゲート（ゲート１）中で実施した。図６ｂは、ゲート制御集団のＣＤ２７およびＣＤ３８プロフィールを示す。図６ｃは、パネル（ｂ）で着色される集団内の（アイソタイプ対照との比較で）ＬＭＡについて陽性の細胞百分率を示す。ゲート２＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７−、ゲート３＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７＋、およびゲート４＝ＣＤ３８＋＋ＣＤ２７＋＋。ＬＭＡはＡＰＣ標識４Ｇ７を使用して検出され、アイソタイプ対照はＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１抗体であった。示された結果は、独立した５つの実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一般技術および選択された定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、（例えば免疫学、免疫組織化学、細胞培養、分子遺伝学、タンパク質化学、および生化学分野の）当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有するものとする。
【００３８】
特に断りのない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質技術、細胞培養技術、および免疫学的技術は、当業者に良く知られている標準操作手順である。このような技術については、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在に至るまでの全てのアップデートを含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在に至るまでの全てのアップデートを含む）などの参考文献全体を通じて記載され説明される。
【００３９】
「膜結合遊離軽鎖」とは、未変性免疫グロブリンと結合していない、膜結合軽鎖を意味する。膜結合軽鎖は、膜結合κ軽鎖および／または膜結合λ軽鎖を含んでなってもよい。
【００４０】
本明細書での用法では、「形質細胞前駆体」という用語は、長寿抗体分泌形質細胞の活性化増殖中前駆体と同様の特徴を有する細胞を指す。形質細胞前駆体は、プロＢ細胞、前Ｂ細胞、未成熟Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、ナイーブ活性化Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、ポスト胚中心Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、および形質芽球を含む。
【００４１】
細胞が所与のマーカーについて「陽性」であると言及される場合、それは細胞表面にマーカーが存在する程度によって、そのマーカーの低（＋、ｌｏまたはｄｉｍ）または高（＋＋、ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）発現細胞のどちらであってもよく、該用語は細胞の色選別処理過程で使用される蛍光またはその他の色の強度に関する。高低の区別は、選別される特定の細胞集団上で使用されるマーカーの文脈で理解される。本明細書で細胞が、特定のマーカーについて「陰性」であると言及される場合、それはマーカーが細胞によって全く発現されないことを意味しない。それは細胞によって比較的非常に低いレベルでマーカーが発現されて、検出可能に標識された場合、非常に低いシグナルを発生するかもしれないことを意味する。
【００４２】
本明細書での用法では、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、Ｂ細胞仲介性免疫障害の発症または進行を低下させるかまたは遅延させ、またはＢ細胞仲介性免疫障害の少なくとも１つの症状を軽減させるかまたは排除するのに十分な、本明細書に記載される抗体の治療的有効量を投与することを含む。
【００４３】
膜結合遊離軽鎖に結合する抗体
本発明者らは今や初めて、膜結合遊離軽鎖が形質細胞前駆体表面で発現されることを示した。ｍＦＬＣに対する抗体は、ＡＤＣＣ、補体依存性溶解、抗体依存性の細胞の食作用、およびアポトーシスなどの機序を通じて、形質細胞前駆体を死滅させることができ、したがってＢ細胞仲介性免疫障害に対する効果的な治療薬であろう。さらにｍＦＬＣ対する抗体は、細胞毒を形質細胞前駆体に直接送達するのに使用し得る。
【００４４】
必須ではないが、抗体はｍＦＬＣに特異的に結合してもよい。「特異的に結合する」という語句は、特定の条件下で抗体がｍＦＬＣに結合し、その他のタンパク質または炭水化物に顕著な量で結合しないことを意味する。ｍＦＬＣに特異的に結合する抗体は、未変性免疫グロブリンに付随する軽鎖と結合しないことが好ましい。ｍＦＬＣへの特異結合は、このような条件下では、その特異性について選択される抗体を必要とするかもしれない。多様な免疫測定様式を使用して、ｍＦＬＣと特異的に免疫反応性の抗体を選択してもよい。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法は、タンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに慣例的に使用される。特異的免疫反応性を判定するのに使用し得る免疫測定様式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００４５】
「抗体」という用語は、本明細書での用法では、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、二重抗体、三重抗体、ヘテロ共役抗体、未変性分子ならびにその断片をはじめとするキメラ抗体、およびその他の抗体様分子を含む。抗体は、例えばＶＨまたはＶＬ領域のどちらかを含む領域抗体、重鎖可変部の二量体（ＶＨＨ、ラクダ科動物で述べられるような）、軽鎖可変部の二量体（ＶＬＬ）、直接にまたはリンカーを通じて結合していてもよい軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）可変部のみを含有するＦｖ断片、または重鎖可変部とＣＨ１領域を含有するＦｄ断片をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な形態の変異を含む。共に結合して一本鎖抗体を形成する重鎖および軽鎖の可変部から成るｓｃＦｖ、（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、そして二重抗体および三重抗体などのｓｃＦｖのオリゴマーもまた、「抗体」という用語に包含される。可変部と定常部の一部とを含有するＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、およびＦａｂＦｃ２断片などの抗体断片もまた包含される。相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト抗体断片および抗体断片オリゴマーもまた、包含される。Ｆｖの重鎖および軽鎖構成要素は同一抗体または異なる抗体に由来してもよく、それによってキメラＦｖ領域を生じてもよい。抗体は、動物（例えばマウス、ウサギまたはラット）由来、またはヒト由来であってもよく、またはキメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）でもまたはヒト化（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）されていてもよく、英国特許出願第８７０７２５２号明細書で公開されている。本明細書での用法では「抗体」という用語は、これらの様々な形態を含む。本明細書で提供されるガイドライン、そして上述の参考文献およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）などの出版物に記載される当業者に良く知られている方法を使用して、本発明の方法で使用するための抗体は容易に作成し得る。
【００４６】
ｍＦＬＣ結合抗体は、可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）鎖を含んでなるＦｖ領域であってもよく、その中で軽鎖および重鎖は直接にまたはリンカーを通じて結合していてもよい。本明細書での用法では、リンカーとは軽鎖および重鎖に共有結合して、その中でそれらが目的とするエピトープと特異的に結合できるような立体配座を達成できるように、２本の鎖の間に十分な間隔と可撓性を提供する分子を指す。融合ポリペプチドのＩｇ部分の内在性構成要素として発現されてもよいことから、タンパク質リンカーが特に好ましい。
【００４７】
別の実施態様では、組換え的に生成された一本鎖ｓｃＦｖ抗体、好ましくはヒト化ｓｃＦｖが本発明の方法で使用される。
【００４８】
モノクローナル抗体
ｍＦＬＣエピトープに対するモノクローナル抗体は、当業者によって容易に作成され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般方法は、良く知られている。細胞融合によって、またＢリンパ球の発がん性ＤＮＡによる直接形質移入またはエプスタイン・バーウイルスによる形質転換などのその他の技術によって、不死の抗体産生細胞系統を作り出し得る。ｍＦＬＣエピトープに対して作成されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性について、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性についてスクリーンし得る。
【００４９】
動物由来モノクローナル抗体は、直接生体内および生体外免疫療法の双方で使用し得る。しかし例えばマウス由来モノクローナル抗体を治療薬としてヒトで使用する場合、患者はヒト抗マウス抗体を産生することが観察されている。したがって動物由来モノクローナル抗体は治療のためには、特に長期使用では好ましくない。しかし確立された遺伝子操作技術を用いて、動物由来部分およびヒト由来部分を有するキメラまたはヒト化抗体を作り出すことが可能である。動物は、例えばマウスや、またはラットなどのその他の齧歯類であり得る。
【００５０】
キメラ抗体の可変部が例えばマウス由来であって、定常部がヒト由来であれば、キメラ抗体は「純粋」マウス由来モノクローナル抗体よりも一般に免疫原性が低い。「純粋」マウス由来抗体が不適切であると判明した場合、これらのキメラ抗体は治療用途により良く適するであろう。
【００５１】
当業者は、キメラ抗体を作成する方法を利用できる。例えば別々のプラスミド中で免疫グロブリン軽鎖と免疫グロブリン重鎖を使用して、例えば軽鎖および重鎖を別々に発現し得る。次にこれらを精製して生体外で完全な抗体にアセンブリーし得る。このようなアセンブリーを達成する方法については、記載されている（例えばＳｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６を参照されたい）。このようなＤＮＡコンストラクトは、ヒト定常部をコードするＤＮＡに結合している抗ｍＦＬＣ抗体の軽鎖または重鎖の可変部について機能的に再配列された遺伝子をコードするＤＮＡを含んでなってもよい。骨髄腫などのリンパ球様細胞、または軽鎖および重鎖のためのＤＮＡコンストラクトで形質移入されたハイブリドーマは、抗体鎖を発現させてアセンブリーし得る。
【００５２】
減少した単離軽鎖および重鎖からのＩｇＧ抗体形成の生体外反応パラメーターについては、記載されている（例えばＢｅｙｃｈｏｋ，１９７９を参照されたい）。重鎖および軽鎖の細胞内会合および結合を達成して完全なＨ２Ｌ２ ＩｇＧ抗体を得る、同一細胞中での軽鎖および重鎖の同時発現もまた可能である。このような同時発現は、同一宿主細胞中の同一または異なるプラスミドを使用して達成し得る。
【００５３】
ヒト化の方法／技術
本発明の別の好ましい実施態様では、抗ｍＦＬＣ抗体はヒト化され、すなわち分子モデル化技術によって生成される抗体は、例えばラット、ウサギまたはマウスの親抗体の可変部に帰属される結合親和力の損失はわずかまたは皆無でありながら、抗体のヒト含有量が最大化される。
【００５４】
抗体は、欧州特許出願公開第Ａ−０２３９４００号明細書に従って、所望のＣＤＲをヒトフレームワークにグラフトすることによりヒト化してもよい。したがって所望の再構成抗体をコードするＤＮＡ配列は、ＣＤＲを再構成することが所望されるヒトＤＮＡから出発して作成し得る。所望のＣＤＲを含有する動物由来可変領域アミノ酸配列は、選択されたヒト抗体可変領域配列と比較される。ヒト可変部を動物由来ＣＤＲに組み込むために、動物中の対応する残基に変更する必要があるヒト可変領域中の残基をマークする。ヒト配列中で置換され、それに添加され、またはそれからから除去される必要がある残基もまた、あるかもしれない。
【００５５】
ヒト可変領域フレームワークを変異誘発するのに使用し得るオリゴヌクレオチドは合成されて、所望の残基を含有する。これらのオリゴヌクレオチドは、あらゆる都合のよいサイズであり得る。常態では利用できる特定の合成機の能力のみによって、長さが制限される。オリゴヌクレオチド指定生体外変異誘発の方法については、良く知られている。
【００５６】
代案としては、ヒト化は、国際公開第９２／０７０７５号パンフレットの組み換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して達成されてもよい。この方法を使用して、ヒト抗体のフレームワーク領域の間でＣＤＲをスプライスしてもよい。一般に国際公開第９２／０７０７５号パンフレットの技術は、２つのヒトフレームワーク領域、ＡＢおよびＣＤ、および供与体ＣＤＲによって置換されるそれらの間のＣＤＲを含んでなるテンプレートを使用して実施し得る。プライマーＡおよびＢはフレームワーク領域ＡＢを増幅するのに使用され、プライマーＣおよびＤはフレームワーク領域ＣＤを増幅するのに使用される。しかしプライマーＢおよびＣは、それぞれそれらの５’末端に、供与体のＣＤＲ配列の全部または少なくとも一部に相当する追加的配列もまた含有する。プライマーＢおよびＣは、ＰＣＲを実施できるようにする条件下で、それらの５’末端の相互のアニーリングを可能にするのに十分な長さが重なり合う。したがって増幅された領域ＡＢおよびＣＤは、重複する延長部分で遺伝子スプライシングを受けて、単一反応中でヒト化生成物を生じてもよい。
【００５７】
抗体を再構成する変異誘発反応に続いて、変異誘発されたＤＮＡを軽鎖または重鎖定常部をコードする適切なＤＮＡに結合させて発現ベクターにクローンし、好ましくは哺乳類細胞である宿主細胞に形質移入させ得る。これらの過程は、通例の様式で実施し得る。したがって再構成抗体は、
（ａ）少なくともＩｇ重鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列と作動的に連結する、適切なプロモーターを含む第１の複製可能な発現ベクターを調製するステップと；
（ｂ）少なくとも相補的Ｉｇ軽鎖または重鎖の可変領域をそれぞれコードするＤＮＡ配列と作動的に連結する適切なプロモーターを組む第２の複製可能な発現ベクターを調製するステップと；
（ｃ）第１のまたは双方の調製されたベクターを用いて細胞系を形質転換するステップと；
（ｄ）前記形質転換された細胞系を培養して、前記改変抗体を生成するステップと
を含んでなる方法によって調製されてもよく、可変領域は、ヒト抗体からのフレームワーク領域と、本発明のヒト化抗体に必要とされるＣＤＲとを含んでなる。
【００５８】
好ましくは、ステップ（ａ）のＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖の可変領域と、各定常領域の双方をコードする。ヒト化抗体はあらゆる適切な組み換え発現系を使用して調製し得る。形質転換されて改変抗体を産生する細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系または不死化哺乳類細胞系であってもよく、それは有利には骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞系などのリンパ系起源である。細胞系はまた、エプスタイン・バーウイルスなどのウィルスを用いた形質転換によって不死化された、Ｂ細胞などの正常なリンパ球様細胞を含んでなってもよい。最も好ましくは、不死化された細胞系は骨髄腫細胞系またはその誘導体である。
【００５９】
抗体発現のために使用されるＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）欠乏性であって、成長のためにチミジンとヒポキサンチンに依存してもよい（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０）。親ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系に、抗体をコードするＤＮＡおよびｄｈｆｒ遺伝子を形質移入し、それによってｄｈｆｒ陽性表現型のＣＨＯ細胞形質転換体を選択できるようにする。選択はチミジンおよびヒポキサンチンを欠く培地上でコロニーを培養することで実施され、チミジンおよびヒポキサンチンの不在は非形質転換細胞が成長するのを妨げ、形質転換細胞が葉酸経路を再利用し、ひいては選択システムをバイパスすることを妨げる。これらの形質転換体は、関心のある形質移入ＤＮＡとｄｈｆｒをコードするＤＮＡの同時組み込みにより、関心のあるＤＮＡを通常低濃度で発現する。抗体をコードするＤＮＡの発現レベルは、メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用した増幅によって増大されてもよい。この薬剤は酵素ｄｈｆｒの直接阻害剤であり、これらの条件を乗り切るためにｄｈｆｒ遺伝子のコピー数を十分に増幅する抵抗性コロニーを単離できるようにする。ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列と抗体をコードするＤＮＡ配列は、元の形質転換体中で密接に連関しているので、通常同時増幅があり、ひいては所望の抗体の発現の増大がある。
【００６０】
ＣＨＯまたは骨髄腫細胞と共に使用される別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレットに記載されるグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）増幅系である。このシステムは、酵素ＧＳをコードするＤＮＡによる、そして所望の抗体をコードするＤＮＡによる細胞の形質移入を伴う。次にグルタミンを含まない培地中で成長し、したがってＧＳをコードするＤＮＡが組み込まれたと想定される細胞が選択される。次にメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を使用して、これらの選択されたクローンの酵素ＧＳを阻害する。細胞は生き残るためにＧＳをコードするＤＮＡを増幅させ、抗体をコードするＤＮＡが同時に増幅する。
【００６１】
ヒト化抗体を生成するのに使用される細胞系は好ましくは哺乳類細胞系であるが、細菌細胞系または酵母細胞系などのあらゆるその他の適切な細胞系を代案として使用してもよい。特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来細菌株を使用し得ることが想定される。得られた抗体は機能性について検査される。機能性が失われていれば、ステップ（２）に戻って抗体のフレームワークを変更する必要がある。
【００６２】
発現されたら、抗体全体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、またはその他の免疫グロブリン形態を回収して、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などをはじめとする技術分野の標準操作手順に従って精製し得る（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい）。医薬用途では、少なくとも約９０〜９５％均質な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の均質性がより好ましい。必要に応じて部分的にまたは均質性に精製したら、次にヒト化抗体を治療的に使用してもよく、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発実施において使用してもよい。（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７９および１９８１）を参照されたい）。
【００６３】
Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら（１９９３）によって実施された研究は、免疫グロブリン分子の定常部を操作することによって、ヒトエフェクター細胞による抗体のＦｃ領域の認識を最適化し得ることを実証した。これは所望の特異性がある抗体の可変部遺伝子と、ヒト対象において効果的なＡＤＣＣを実証する、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプなどの免疫グロブリンアイソタイプをコードするヒト定常部遺伝子とを融合させることで達成し得る。（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍｉｋｅ Ｃｌａｒｋ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｔｉｔｌｅｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩ ８５−１１３）。得られるｍＦＬＣに対するキメラまたはヒト化抗体は、特にＡＤＣＣを誘発するのに効果的なはずである。
【００６４】
ｍＦＬＣに対する、完全なヒト可変部がある抗体はまた、抗原投与に応えてこのような抗体を産生するように改変されているが、その内在性遺伝子座は無能にされている遺伝子導入動物に、抗原を投与することで調製してもよい。引き続き様々な操作を実施して、抗体それ自体またはその類似体のどちらかを入手してもよい（例えば米国特許第６，０７５，１８１号明細書を参照されたい）。
【００６５】
抗体またはその断片をコードする遺伝子の調製
抗体をコードする遺伝子、軽鎖および重鎖遺伝子の双方、または例えば一本鎖Ｆｖ領域などのその一部は、ハイブリドーマ細胞系からクローンされてもよい。それらは全て、同じ一般的ストラテジーを使用してクローンされてもよい。典型的に、例えばプライマーとしてランダム六量体を使用して、ハイブリドーマ細胞から抽出されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡが逆転写される。Ｆｖ領域では、ＶＨおよびＶＬ領域が２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々に増幅される。重鎖配列は、それぞれ抗ｍＦＬＣ重鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計された５’末端プライマー、およびコンセンサス免疫グロブリン定常部配列に従った３’末端プライマーを使用して増幅されてもよい（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。軽鎖Ｆｖ領域は、抗ｍＦＬＣ軽鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計された５’末端プライマーをプライマーＣ−κと組み合わせて使用して、増幅される。当業者は、多数の適切なプライマーを用いてＦｖ領域を得てもよいことを認識するであろう。
【００６６】
ＰＣＲ産物を適切なクローニングベクターにサブクローニングする。ＤＮＡ限定酵素による正確な大きさの挿入断片を含むクローンを同定する。次にクローニング部位に隣接する配列決定プライマーを使用して、二本鎖プラスミドＤＮＡから重鎖または軽鎖コード領域のヌクレオチド配列を決定してもよい。ＤＮＡの配列決定を容易にするために、市販のキット（例えばＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡからのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）キット）を使用してもよい。Ｆｖ領域をコードするＤＮＡは、例えばＰＣＲおよびＬＣＲなどの増幅技術をはじめとするあらゆる適切な方法によって調製されてもよい。
【００６７】
化学合成からは一本鎖オリゴヌクレオチドが生じる。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換してもよい。一本鎖Ｆｖ領域全体を化学合成することも可能であるが、多くの短い配列（約１００〜１５０塩基）を合成し、その後これらを連結することが好ましい。
【００６８】
代案としては、サブ配列をクローニングし、適切な制限酵素を使用して適切な部分配列を切断してもよい。次に断片を連結して、所望のＤＮＡ配列を生成してもよい。
【００６９】
Ｆｖ可変軽鎖ＤＮＡおよび可変重鎖ＤＮＡが得られたら、当業者に良く知られている技術を使用して、直接またはペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を介して、配列を共に連結してもよい。一態様では、重鎖および軽鎖領域は、重鎖Ｆｖドメインのカルボキシ末端から始まって軽鎖Ｆｖドメインのアミノ末端で終了する可動性のペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）によって連結される。配列全体が、一本鎖抗原結合タンパク質の形態のＦｖドメインをコードする。
【００７０】
抗ＫＭＡ抗体
一実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体は抗ＫＭＡ抗体である。例えば抗体は、Ｋ１２１またはａＫ１２１様抗体であってもよい。Ｋ１２１は、ヒト遊離κ軽鎖と、κ−タイプ骨髄腫細胞の表面に発現する抗原とを特異的に認識するマウスのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。この抗原は、κ骨髄腫抗原またはＫＭＡと呼ばれている（Ｂｏｕｘ，ＨＡ． ｅｔ ａｌ．，１９８３）。ＫＭＡは、細胞膜上のアクチンと非共有結合した状態で発現される遊離κ軽鎖からなることが確立されている（Ｇｏｏｄｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「Ｋ１２１様抗体」という語句は、配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を含んでなる抗体；またはκ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）への結合について配列番号１に記載のＶＨ領域を有する抗体および配列番号２に記載のＶＬ領域と競合する抗体を指す。
【００７２】
Ｋ１２１様抗体は、ＨＭｙ２細胞上のＫＭＡとの結合においてＫ１２１（またはＫ１２１のキメラまたはヒト化形態）と競合するそれらの能力によって同定されてもよい。この手順では、確立された手順を使用してＫ１２１をビオチンと共役させてもよい（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。次にＫ１２１様抗体をＨＭｙ２細胞上のＫＭＡへのビオチン化Ｋ１２１の結合と競合するそれらの能力によって評価する。ＨＭｙ２細胞へのビオチン化Ｋ１２１の結合は、Ｋ１２１分子上のビオチンに結合するフルオレセイン標識ストレプトアビジンの添加によって評価してもよい。次に細胞の蛍光染色をフローサイトメトリーによって定量化し、Ｋ１２１様抗体の競合効果を競合物不在下で得られる蛍光レベルの百分率として表す。
【００７３】
抗ＬＭＡ抗体
本発明の一実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体は抗ＬＭＡ抗体である。本明細書で使用する場合、「ＬＭＡ」という用語は、λ−タイプ免疫グロブリンに由来する軽鎖に相当するあらゆる遊離λ軽鎖を包含する。したがって本用語は、それらの可変部配列が異なり得る一連のλ軽鎖ポリペプチドを包含する。
【００７４】
抗ＬＭＡ抗体は当業者に知られている。例えばＬＭＡに対する抗体は、多発性骨髄腫を診断する試験において血清または尿中の遊離λ軽鎖を検出するのに使用されている（Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。しかしＬＭＡは患者においてＢ細胞仲介性免疫障害を治療するための標的としては、今日まで使用されていない。
【００７５】
適切な抗ＬＭＡ抗体の例としては、３Ｄ１２（製品番号ａｂ１９４４；ＡｂＣａｍ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＣＢＬ３１７（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ，ＵＫ）、４Ｇ７（製品番号ａｂ５４３８０；ＡｂＣａｍ Ｌｔｄ）、ＭＥ−１５４（製品番号ａｂ９２４５；ＡｂＣａｍ Ｌｔｄ）、２６Ｄ（製品番号ＣＢＬ３１７；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）または２Ｇ９（製品番号ＣＢＬ１０９；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）が挙げられる。
【００７６】
細胞毒性部分
本発明で使用するための適切な細胞毒性部分としては、細菌または植物毒素などの作用物質；例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；ｃｙｔｏｘａｎ）、クロランブシル（ＣＨＬ；ｌｅｕｋｅｒａｎ）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；ＣＤＤＰ；ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ブスルファン（ｍｙｌｅｒａｎ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、およびその他のアルキル化剤などの薬剤；メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ−１６；ｖｅｐｅｓｉｄ）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣｄＡ）、およびその他の代謝拮抗薬；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン、ミトラマイシンをはじめとする抗生物質ならびにその他の抗生物質；ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなどのアルカロイド；ならびにデキサメタゾン（ＤＥＸ；ｄｅｃａｄｒｏｎ）などの細胞分裂阻害剤グルココルチコイド、およびプレドニゾンなどのコルチコステロイド、ヒドロキシ尿素などのヌクレオチド酵素阻害剤などをはじめとするその他の抗がん剤が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００７７】
当業者は、良く知られている技術によって抗体と共役させて送達し患部組を織特異的に破壊し得る、多数のその他の放射性同位体および化学細胞毒物があることを理解するであろう。例えばＢｌａｔｔｌｅｒらに付与された米国特許第４，５４２，２２５号明細書を参照されたい。光活性化毒素の例としては、ジヒドロピリジンおよびω−コノトキシン（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）が挙げられる。使用できる造影剤および細胞毒性試薬の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、３Ｈ、および１４Ｃ；フルオレセインやローダミンなどの蛍光性標識、およびルシフェリンなどの化学発光物質が挙げられる。当該技術分野で知られている技術を使用して、このような試薬で抗体を標識し得る。例えば抗体の放射標識に関する技術については、Ｗｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｍｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）を参照されたい（Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６；”Ｏｒｄｅｒ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）もまた参照されたい）。
【００７８】
一例では、リンカー−キレート剤チウキセタンが、安定したチオ尿素共有結合によってｍＦＬＣに結合する抗体に共役し、インジウム−１１１またはイットリウム−９０のための高親和性キレート化部位を提供する。
【００７９】
本発明の治療的な組成物中に細胞毒物をコードするＤＮＡ分子が存在する場合、ＤＮＡは好ましくは細菌または植物毒素であるポリペプチドをコードする。これらのポリペプチドとしては、天然または改変シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アブリン、ゲロニン、モモルジンＩＩ、志賀および志賀様毒素ａ−鎖などの細菌ＲＩＰ、ルフィン（Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ａ−トリコサンチン（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、モモルジンＩ（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ抗ウィルス性タンパク質（Ｈａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ｂｙｏｄｉｎ ２（米国特許第５，５９７，５６９号明細書）、ガポリン（Ｂｅｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）などのポリペプチド、ならびにそれらの遺伝子操作変異体が挙げられるが、これに限定されるものではない。天然ＰＥおよびＤＴは、典型的に肝臓毒性を通じて死をもたらす高度に毒性の化合物である。好ましくは、ＰＥおよびＤＴは、例えばＰＥのＩａ領域およびＤＴのＢ鎖などの毒素の天然標的構成要素を除去する形態に改変される。当業者は本発明が特定の細胞毒物に限定されるものではないことを理解するであろう。
【００８０】
「シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素」（ＰＥ）という用語は、本明細書での用法では改変されている全長天然（天然）ＰＥまたはＰＥを指す。このような改変としては、領域Ｉａの除去、領域ＩＩおよびＩＩＩにおける様々なアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換（例えば位置５９０および６０６におけるＬｙｓのＧｌｎによる置換）、およびカルボキシル末端における１つ以上の配列の付加が挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。したがって例えばＰＥ３８は、アミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３から構成されるトランケート型シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素を指す。ＰＥの天然Ｃ−末端であるＲＥＤＬＫ（残基６０９〜６１３）は、配列ＫＤＥＬ、ＲＥＤＬによって置換されていてもよく、Ｌｙｓ−５９０およびＬｙｓ−６０６は、それぞれＧｌｎに変異していてもよい。
【００８１】
「ジフテリア毒素」（ＤＴ）という用語は、本明細書での用法では、全長天然ＤＴまたは改変ＤＴを指す。改変は典型的にＢ鎖中の標的領域の除去を含み、さらに具体的にはＢ鎖のカルボキシル領域のトランケーションを伴う。
【００８２】
治療法
本発明の方法は、自己免疫障害、炎症性疾患、および敗血症などのＢ細胞仲介性免疫障害の治療または予防に有用である。当業者は、Ｂ細胞仲介性免疫障害がＢ細胞悪性腫瘍を含まないことを理解するであろう。
【００８３】
本発明の方法で治療してもよい自己免疫障害としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、多発性硬化症、クローン病、免疫血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、自己免疫蕁麻疹、セリアック病、疱疹状皮膚炎、急性リウマチ熱、グレーブス病、重症筋無力症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、溶連菌感染後糸球体腎炎、接触性皮膚炎、自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、アジソン病、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）によって引き起こされる脈管炎、結節性多発動脈炎、自己免疫肝炎、および原発性胆汁性肝硬変が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
一態様では、本発明の方法は、改変なしに抗体または結合断片を利用して、形質細胞前駆体の表面ｍＦＬＣへの抗体または断片の原位置結合に依存して、免疫攻撃を刺激する。例えばその中で抗原結合部位が例えばＩｇＧｌなどのヒトＦｃ領域に結合するキメラ抗体を使用して、抗体依存性仲介細胞毒性または補体仲介細胞毒性を促進してもよい。
【００８５】
本発明の別の態様では、細胞毒物または生物反応修飾物質がそれに結合する、ｍＦＬＣに結合する抗体などのｍＦＬＣ結合部分を使用して治療法を実施してもよい。得られるコンジュゲートの形質細胞前駆体への結合は、細胞の成長を阻害しまたは死滅させる。
【００８６】
当業者によって理解されるように、Ｂ細胞仲介性免疫障害患者のいくらかは、血液循環内に有意水準の遊離λ軽鎖を有するかもしれない。抗ｍＦＬＣ抗体はこれらの遊離軽鎖と反応するので、対象の体液中のそれらの存在は治療効率を低下させるかもしれない。したがって本発明の一実施態様では、治療方法は、抗ｍＦＬＣ抗体の投与に先だって対象を処置し、対象の体液（例えば血液）中に循環する遊離λ軽鎖レベルを低下させるステップをさらに含んでなる。この追加的処置ステップは、例えば血漿交換療法を伴ってもよい。当業者には知られているように、血漿交換療法は、細胞分離器として知られている装置によって血液細胞から血漿を除去する工程である。分離器は、血液を高速で回転させて細胞を流体から分離させるか、または血漿のみが通過できる小孔のあるメンブレンを通して血液を通過させるかのどちらかによって機能する。細胞は対象に戻される一方、遊離軽鎖を含有する血漿は廃棄され、別の流体によって置換される。処置の間、血液が凝固しないようにする薬剤（例えば抗凝固剤）を静脈を通じて投与してもよい。
【００８７】
例えば抗ｍＦＬＣ抗体の使用を伴う関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症などのＢ細胞仲介性免疫障害を治療する方法は、単独で、またはその他の既知の治療法の補助として、実施してもよいことが理解されるであろう。
【００８８】
本発明のさらなる実施においては、患者に再導入する前に、抗ｍＦＬＣ抗体を使用して、骨髄などの患者サンプルから形質細胞前駆体を除去してもよい。非限定的な一例では、抗体をビーズなどのマトリックスに付着させる。これは、抗体またはそれらの結合断片を含んでなる、親和性マトリックスを調製するいくつかの良く知られている方法のいずれによって達成されてもよい。次にマトリックスに付着した抗体または結合断片との抗原／抗体相互作用を通じて、サンプル中の形質細胞前駆体の結合を促進する条件下で、マトリックスを含有するカラム上の細胞の通過などによって、患者サンプルをマトリックスに曝露させる。サンプル中の形質細胞前駆体がマトリックスに付着する一方、カラム溶出物、すなわち非付着細胞集団は形質細胞前駆体が枯渇している。手順の有効性は、下述するような検出可能に標識された抗体の使用などによって、残留形質細胞前駆体について細胞を調べることでモニターしてもよい。手順を反復しまたは修正して、有効性を増大させもよい。
【００８９】
診断用アッセイおよびキット
ｍＦＬＣに結合する抗体はまた、遊離軽鎖を発現する形質細胞前駆体を検出する、生体外および生体内の双方における診断用途のためにも有用である。生体外診断法としては、細胞の免疫組織学的検出が挙げられる。免疫組織化学的技術は、ｍＦＬＣに結合する抗体がある組織標本などの生物学的標本を染色し、次に抗原抗体複合体として、その抗原と複合体形成した抗体の存在を検出することを伴う。このような標本との抗原抗体複合体の形成は、組織中における遊離軽鎖を発現する形質細胞前駆体の存在を示唆する。標本上の抗体の検出は、例えば免疫ペルオキシダーゼ染色技術、またはアビジン−ビオチン技術、または免疫蛍光技術のような免疫酵素などの技術分野で知られている技術を使用して達成し得る。（例えばＣｉｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：５６２−７９，１９８６、およびＫｉｍｂａｌｌ，（ｅｄ），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２．ｓｕｂ．ｎｄ Ｅｄ），ｐｐ．１１３−１１７（ＭａｃｍｉｌｌａｎＰｕｂ．Ｃｏ．，１９８６）を参照されたい）。
【００９０】
適切な標識は、当業者に良く知られている。「標識」という用語は、本明細書での用法では、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば有用な標識としては、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および３５Ｓなどの放射性分子、フルオレセインまたはローダミンなどの蛍光染料、高電子密度試薬、イソチオシアネート、発色団、（一般にＥＬＩＳＡで使用されるような）酵素、ルシフェラーゼなどの発光酵素などが挙げられる。
【００９１】
このような標識抗体を例えば抗原の組織学的局在化のため、ＥＬＩＳＡのため、細胞選別のため、および抗原、および抗原がある細胞を検出および／または定量化するその他の免疫学的技術のために、使用してもよい。上述のように、このような標識される抗体、またはその断片の特定の用途は、移植、特に自己骨髄移植に先だって、骨髄組織からの形質細胞前駆体除去の有効性を判定することにある。
【００９２】
本発明はまた、上述されるような抗ｍＦＬＣ抗体を使用した、Ｂ細胞仲介性免疫障害の造影法も対象とする。方法は、本明細書に記載されるような、放射性核種などの検出可能な部分への共役がある、またはない抗体の投与または輸液を伴う。投与または輸液の後、抗体または抗体断片は形質細胞前駆体に結合し、その後抗体の位置が検出される。放射性核種で標識したものなどの検出可能に標識された抗体では、イメージング装置を使用して体内の作用因子の位置を同定してもよい。未標識の抗体の使用では、抗体の位置を示し、したがって適切に検出されてもよい第２の検出可能な試薬を投与してもよい。これらの方法はその他の抗体のために使用されており、当業者は体内の抗体または断片の位置をイメージングするためのこれらの様々な方法を十分に知っている。
【００９３】
本発明はまた、研究または診断目的のためのキットを包含する。キットは典型的に、抗ｍＦＬＣ抗体を含有する１つ以上の容器を含む。抗ｍＦＬＣ抗体は標識で誘導体化してもよく、または代案としてはそれを二次標識に結合して引き続く検出を提供してもよい。上述のようにこのような標識としては、放射性標識、蛍光性標識、酵素標識、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などが挙げられる。キットはまた、適切な二次標識（例えばヒツジ抗マウス−ＨＲＰなど）を含んでもよい。キットはまた、融合ポリペプチドの結合、非特異結合抗体の除去、および結合標識の検出を容易にする様々な試薬を含んでもよい。このような試薬については当業者に良く知られている。
【００９４】
本発明のさらなる態様では、固体担体に結合する抗ｍＦＬＣ抗体を含んでなる、組成物が提供される。本発明で使用するための固体担体は、結合のための反応条件に対して不活性である。本発明で使用するための固相担体は、そこにモノクローナル抗体またはその結合パートナーを付着させるために、反応性基または活性化基を有さねばならない。別の実施態様では、固相担体は、炭水化物ポリマーＳＥＰＨＡＲＯＳＥ．ＲＴＭ．、ＳＥＰＨＡＤＥＸ．ＲＴＭ．、またはアガロースなどの有用なクロマトグラフィー担体であってもよい。本明細書での用法では、固相担体は、特定タイプの担体に限定されない。むしろ多数の担体が利用でき、当業者に知られている。固相担体としては、例えばシリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、磁性ビーズ、（ニトロセルロース、セルロース、ナイロン、およびグラスウールをはじめとするが、これに限定されるものではない）メンブレン、プラスチックおよびガラス皿またはウェルなどが挙げられる。
【００９５】
上述の研究および診断用キットを使用する方法は一般に良く知られており、一般にキット使用のための取扱説明書で提供される。
【実施例】
【００９６】
実施例１．正常なヒト末梢血Ｂ細胞の体外活性化
１．ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの併用、または２．ホルマリン固定黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細菌（ＳＡＣ）の２つの異なるプロトコルを使用して、Ｂ細胞に由来するＣＤ１９＋末梢血を生体外で活性化した。
【００９７】
ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭによる精製Ｂ細胞の活性化は、それらの表面にＫＭＡを発現するものをはじめとする形質細胞を発生させる（ＫＭＡはｍＫａｐ［Ｋ１２１］反応性によって定義される）。フローサイトメトリーによるＫＭＡ発現細胞の表現型分析は、それらが表面ＩｇＤ−、ＣＤ２７＋＋、およびＣＤ３８＋＋（図１）によって定義される形質細胞のサブセットであることを明らかにした。これらのＫＭＡ＋／ＩｇＤ−／ＣＤ２７＋＋／ＣＤ３８＋＋は、全ＣＤ３８＋＋Ｂ細胞のおよそ１２％に相当する。対照的にＳＡＣによる刺激は、いかなる形質細胞も生じなかった。しかしＫＭＡ発現は、ＣＤ２７＋＋およびＣＤ３８ｌｏｗ形質芽球（ＣＤ３８ｌｏｗ集団のおよそ１０％）ならびにＣＤ２７＋／＋＋およびＣＤ３８＋形質芽球（ＣＤ３８＋集団のおよそ１４％；図２）の２つの異なる集団で見られた。
【００９８】
実施例２．正常なヒトリンパ系Ｂ細胞におけるＫＭＡの生体内発現
生体外活性化系で得られた結果を考えて、発明者らは類似タイプの細胞が生体内でＫＭＡを発現するかどうかを判定した。ＦＡＣＳによって、ヒト扁桃からの単核細胞をＢ細胞マーカーＣＤ１９、ＣＤ３８、およびＣＤ４５と共に、ＫＭＡ発現について分析した。
【００９９】
発明者らは、ＣＤ３８＋＋形質細胞画分中にＫＭＡ発現細胞の小集団（アイソタイプ対照をおよそ７．８％超える；図３ａ、ゲート３）を発見した。興味深いことに、これらの細胞はまた、未成熟形質細胞表現型（図３ｂ）の代表であるＣＤ４５も発現する。
【０１００】
ＫＭＡ発現細胞のフローサイトメトリー評価に加えて、正常な組織に対する免疫組織化学的（ＩＨＣ）研究を実施した。正常な供与者からの凍結保存未固定組織切片をＦＩＴＣ標識ＭＤＸ１０９７（ｍＫａｐ可変領域を含んでなるヒト−マウスキメラ抗体）で染色し、マウス抗ＦＩＴＣ二次抗体およびヤギ抗マウスペルオキシダーゼがそれに続いた。スライドを色原体基質で処理し、発現について分析した。
【０１０１】
ＭＤＸ１０９７による正常なヒト組織のＩＨＣ染色は、扁桃および唾液腺中に、形質細胞および形質芽球の形態（すなわち大きな細胞質と丸い核がある細胞）がある少数のＫＭＡ陽性細胞を明らかにした。染色は、ＫＭＡとして細胞膜上、および細胞内の双方で観察され、これらの細胞が遊離κＬＣの大きなプールを含有することが示唆された。正常な末梢血中にはいかなるＫＭＡ発現細胞も観察されず、以前の結果が確認された（図４；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。
【０１０２】
実施例３．活性化末梢血Ｂ細胞上におけるＫＭＡおよびＬＭＡ発現
ＣＤ１９＋末梢血Ｂ細胞をＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから得られた供血者サンプルから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する密度勾配遠心分離に続いて、磁性ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとＭＡＣＳ分離システムまたはａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ１９＋細胞を精製した。ＩＬ−２１（１μｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍＬ；Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、および抗ＩｇＭ抗体（５０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）抗体を含有する培地内において、３７℃、５％ＣＯ２で６〜７日間培養してＣＤ１９＋細胞を活性化した。
【０１０３】
ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭによるＣＤ１９＋末梢血Ｂ細胞の活性化は、ＫＭＡ＋およびＬＭＡ＋細胞の発生をもたらした。ＫＭＡおよびＬＭＡ発現細胞の表現型はＣＤ２７＋＋、ＣＤ３８＋＋、ＣＤ４５＋、およびＩｇＤ−であり、したがって晩期形質芽球（ｌａｔｅ ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ）のサブセット上のＫＭＡ発現を示す以前の結果が確認された（ＣＤ４５発現については以前調査していない）。
【０１０４】
本研究ではＫＭＡが、ＣＤ３８＋＋／ＣＤ２７＋＋／ＣＤ４５＋集団の６〜６０％に観察された、活性化ＣＤ１９＋Ｂ細胞のサブセットのおよそ１４％でのＫＭＡ発現を示す以前の証拠が裏付けられた。ＬＭＡの発現については以前調査されておらず、我々は生体外活性化ＣＤ１９＋細胞上のＬＭＡの存在／不在を調べることを希望した。本研究は、ＣＤ２７＋＋、ＣＤ３８＋＋、ＣＤ４５＋＋、およびＩｇＤ−細胞の１０〜２０％がＬＭＡを発現したことを実証した。得られた結果の要約を表１に示す。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
考察
表現型および形態学的分析は、ＫＭＡおよびＬＭＡが未成熟形質細胞の正常な形質芽球のサブセット上でｍＦＬＣとして発現されることを実証した。これらの細胞型は、抗体分泌細胞の機能的にユニークな亜集団に相当する（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｓｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【０１０７】
正常な免疫応答中に、初期抗体産生の大半は形質芽球および未成熟形質細胞によって占められる。やがてにこれらの細胞は終末的に成熟形質細胞に分化し、それは迅速な細胞死を経て、または骨髄に移行して骨髄微小環境からの生存指示により長寿命が持続する（Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【０１０８】
数多くの研究が、様々な自己免疫病理における形質芽球および形質細胞役割を分析している。形質芽球および未成熟形質細胞はどちらも自己抗体源ならびに成熟形質細胞前駆体であるので、それらは多数の自己免疫疾患における主要エフェクター細胞型の一部であると見なされる。例えば多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、および反応性形質細胞増加症において、形質芽球および未成熟形質細胞の関与が示されている（Ｃｅｐｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，２００５；およびＪｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらの細胞型上でＫＭＡおよびＬＭＡがｍＦＬＣとして特異的に発現されることを考えれば、ＫＭＡおよびＬＭＡは様々な自己免疫状態を治療するための魅力的な治療標的に相当する。
【０１０９】
実施例４．ｍＦＬＣに結合する抗体によって仲介される直接細胞傷害活性
４．１増殖アッセイ
細胞成長に適した培地および条件で、ｍＦＬＣに結合する様々な濃度の抗体と共に、細胞をインキュベートする。一例として、５％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ １６４０培地中において、３７℃で１時間〜４日間の様々な期間にわたり細胞と共に抗体をインキュベートしてもよい。細胞単独と比較した抗体処置細胞の増殖状態は、細胞集団の代謝健康を測定する試薬を使用して測定される。このような１つの試薬はＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）であり、それは代謝的に活性の細胞によってホルマザンに転換される。この転換には４９０ｎｍでの吸光度発生が伴っており、それは吸光度読み取り機器を使用して測定し得る。
【０１１０】
４．２アポトーシスアッセイ
細胞成長に適した培地および条件で、様々な濃度の抗体と共に細胞をインキュベートする。例えば、５％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ １６４０培地中において３７℃で４時間にわたり、細胞を様々な濃度の抗体と共にインキュベートする。細胞単独と比較した抗体処置細胞のアポトーシスの状態をアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）試薬およびフローサイトメトリーを使用して調査する。アネキシン−Ｖは負に帯電したリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合し、それはアポトーシス初期段階において、細胞膜の細胞質側から細胞表面側の単分子層に再分配される。壊死細胞はＰＩによって検出される。フローサイトメトリーはＰＩおよびＦＩＴＣ蛍光を測定できるようにし、したがってアポトーシスおよび壊死細胞を識別できるようにする。
【０１１１】
４．３抗体架橋
上述したような細胞成長に適した培地および条件で、様々な濃度の抗体および架橋試薬と共に細胞をインキュベートする。架橋試薬は抗体調製品であり、それは細胞を標的とするのに使用される抗体に結合する。例えば抗ＫＭＡまたは抗ＬＭＡ抗体がヒトＩｇＧ１であれば、架橋抗体はヒトＩｇＧ１に対して特異的なポリクローナル調製品である。抗体架橋は、抗体の直接細胞毒性効果を増強することが知られている。上述の増殖およびアポトーシスアッセイ法を使用して、標的細胞増殖に対する抗体架橋の影響を測定する。
【０１１２】
実施例５．ｍＦＬＣに結合する抗体による細胞仲介性の細胞傷害活性
５．１抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイで使用されるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製品、またはＰＭＢＣ調製品中に含有されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または単球などの特異的細胞集団のどちらかである。ＰＢＭＣｓはＦｉｃｏｌｌ密度勾配を使用して血液から単離される。血液をＦｉｃｏｌｌに重ねて勾配を遠心分離し、ＰＢＭＣを勾配境界面から収集する。
【０１１３】
磁性標識抗体調製品（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、特異的細胞集団を上記のように作成されたＰＢＭＣ調製品から単離し、望まれない細胞を除去する。例えば非ＮＫ細胞をＰＭＢＣ調製品から除去する磁性標識抗体カクテルを使用して、ＮＫ細胞を単離する。磁性標識細胞は保持されて（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ装置、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ＮＫ細胞が収集される。
【０１１４】
ＡＤＣＣアッセイでは、様々な濃度の抗体で被覆されたエフェクターおよび標的細胞を様々なエフェクター：標的細胞比率で混合し、混合物を細胞成長に適した適切な培地および条件下でインキュベートする。例えば混合物は、１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ中で３７℃で１６時間にわたりインキュベートしてもよい。アッセイ終点では、細胞溶解の程度が測定される。例えばＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、放出された細胞内乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のレベルを細胞溶解の指標として測定する。
【０１１５】
５．２抗体依存細胞の食作用（ＡＤＣＰ）
ＡＤＣＤアッセイでは、食作用エフェクター細胞を生体外で発生させる。磁性標識抗体カクテルおよびａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって、非単球細胞を除去することで、ＰＭＢＣ調製品を使用して単球を単離する。精製された単球は、単球をマクロファージに培養して分化させるのに適した培地内で生体外培養される。
【０１１６】
マクロファージの接着を支持して共焦点顕微鏡を使用した細胞相互作用の研究に適する、培養チャンバー内にマクロファージを播種する。標的細胞をｐＨ感応性であるｐＨＲｏｄｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）などの蛍光染料で染色し、様々な濃度の抗体で被覆してマクロファージを含有するチャンバーに入れた。酸性ｐＨに曝露すると、ｐＨＲｏｄｏ染料の蛍光スペクトルは変化する。細胞混合物を適切な条件下でインキュベートする。例えば細胞混合物は、１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ １６４０中において３７℃で２時間にわたりインキュベートしてもよい。アッセイ終点では非結合細胞が洗浄されて、マクロファージ表面のみで発現するマーカーに対して特異的なマクロファージは蛍光性抱合型抗体で染色される。最後に、共焦点顕微鏡を使用して細胞を分析する。
【０１１７】
マクロファージは、それらの細胞膜の特異的標識に起因する蛍光を通じて同定される。標的細胞を貪食したマクロファージは、それらの膜の染色に加えて、細胞の酸性エンドソーム内のｐＨＲｏｄｏ染料によって与えられる蛍光を有するであろう。貪食作用は、特定数の顕微鏡視野中で、細胞総数と食細胞数を計測することで測定される。
【０１１８】
５．３補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
標的細胞は、細胞成長をサポートする条件下において、補体（精製補体またはヒト血清含有補体のどちらか）および抗体の存在下でインキュベートする。例えば標的細胞は、１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ中で、補体および抗体の存在下、３７℃で３０分〜１２時間にわたりインキュベートしてもよい。アッセイ終点で、細胞の溶解程度または細胞の代謝状態（細胞成長を反映する）を測定する。細胞溶解は、上の５．１節に記載される方法を使用して測定される。細胞の代謝状態はＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）などの試薬を使用して測定される。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅの添加後、補体および抗体処置細胞混合物中で検出される蛍光は、生存細胞数に比例する。
【０１１９】
本明細書で考察および／または引用した全ての出版物はその内容全体を本明細書に援用する。
【０１２０】
広義に説明される本発明の範囲を逸脱することなく、特定の実施態様で示されるような多数の変更および／または修正を本発明に加えてもよいことが、当業者によって理解されるであろう。したがって本実施態様は全ての点で例証的と見なされ、制限的でない。
【０１２１】
本明細書に含まれるあらゆる文献、行為、材料、装置、物品などの考察は、本発明に文脈を提供することのみを目的とする。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術ベースの一部を形成し、または本明細書の各特許請求項の優先日の前に存在した本発明関連分野の一般常識であると認めるものではない。
【０１２２】
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Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＢＢＡ，１０８８：３１１−３１４．
Ｈｏｆｍａｎｎ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：９７８−８４．
Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３．
Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ，５４：１３４３−１３４５．
Ｊｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ，９４：７０１．
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５．
Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，５４：３３０１−３３１８．
Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８８：１３３−１３４．
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５．
Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：１８０２５−３３．
Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｓｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５：２３０−２４２．
Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１４２５６−１４２６１．
Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５ Ｓｕｐｐｌ １：５１７−２０．
Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７７：４２１６−４２２０．
Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，１８６：８３３−８４１．
Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：６８７９−６８８７．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および敗血症などのＢ細胞仲介性免疫障害の治療に関する。特に本発明は、膜結合遊離軽鎖に結合する抗体を使用したＢ細胞仲介性免疫障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己構成要素の認識異常は、組織損傷そして、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、および多発性硬化症などの自己免疫疾患をもたらすので、「自己」構成要素を「非自己」構成要素から識別する免疫系の能力は重要である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００６）。
【０００３】
Ｔ細胞は数十年間にわたり自己免疫疾患研究の焦点であるが、リンパ腫治療法としてのＢ細胞除去抗体リツキシマブの開発は、免疫障害におけるＢ細胞の役割を研究するためのツールを提供している（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００６）。リツキシマブは強力なＢ細胞溶解性キメラ型ＩｇＧ１ ＣＤ２０特異的モノクローナル抗体であり、それは主に抗体依存細胞仲介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によってＢ細胞を死滅させる。リツキシマブの標的は、前Ｂ細胞段階から前形質細胞段階にかけて発現されるＣＤ２０である（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，２００６）。抗ＣＤ２０抗体の注射に続いて、末梢の抗体被覆Ｂ細胞は非常に低いレベルまで迅速に死滅し、約６〜１２ヶ月にわたって低レベルのままである（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００６）。
【０００４】
リツキシマブによるＢ細胞除去の反復するサイクルは、ＩｇＧでは３．５ＧＬ−１程度に低く、ＩｇＭでは検出不能なレベルに至る総免疫グロブリンの減少と関連付けられ得て、それは実施し得るＢ細胞除去回数を制限するかもしれない（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２００６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｅｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８３：４６５−４７０．
【非特許文献２】Ｂｅｙｃｈｏｋ（１９７９）Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ６９．
【非特許文献３】Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６．
【非特許文献４】Ｂｏｕｘ，ＨＡ． ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１５８：１７６９．
【非特許文献５】Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：６７３−６８０．
【非特許文献６】Ｂｒｏｗｎｉｎｇ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５：５６４−５７６．
【非特許文献７】Ｃｅｐｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｒａｉｎ，１２８：１６６７．
【非特許文献８】Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５：８６７０−８６７４．
【非特許文献９】Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：３９４−４０３．
【非特許文献１０】Ｇｏｏｄｎｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１２７６
【非特許文献１１】Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：１０９８−１１０４．
【非特許文献１２】Ｈａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４：６６２９−６６３７．
【非特許文献１３】Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＢＢＡ，１０８８：３１１−３１４．
【非特許文献１４】Ｈｏｆｍａｎｎ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：９７８−８４．
【非特許文献１５】Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３．
【非特許文献１６】Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ，５４：１３４３−１３４５．
【非特許文献１７】Ｊｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ，９４：７０１．
【非特許文献１８】Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５．
【非特許文献１９】Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，５４：３３０１−３３１８．
【非特許文献２０】Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８８：１３３−１３４．
【非特許文献２１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５．
【非特許文献２２】Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：１８０２５−３３．
【非特許文献２３】Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｓｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５：２３０−２４２．
【非特許文献２４】Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１４２５６−１４２６１．
【非特許文献２５】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５ Ｓｕｐｐｌ １：５１７−２０．
【非特許文献２６】Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７７：４２１６−４２２０．
【非特許文献２７】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，１８６：８３３−８４１．
【非特許文献２８】Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：６８７９−６８８７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｂ細胞仲介性免疫障害を治療する新しい方法に対する必要性が、なおもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、膜結合遊離軽鎖（ｍＦＬＣ）が形質細胞前駆体上で発現されることを今や確認した。形質細胞前駆体上のｍＦＬＣは、Ｂ細胞仲介性免疫障害の治療または予防のための標的を提供する。
【０００８】
本発明者らによって提案される治療法は、Ｂ細胞仲介性免疫障害を患っている対象において形質細胞前駆体を除去するためのｍＦＬＣに特異的に結合する抗体の投与に基づく。この治療標的の１つの利点は、それが正常なＢ細胞上に存在しないことである。
【０００９】
したがって本発明は、対象においてＢ細胞仲介性免疫障害を治療または予防する方法を提供し、方法は、膜結合遊離軽鎖（ｍＦＬＣ）に結合する有効量の抗体を対象に投与するステップを含んでなる。
【００１０】
好ましい実施態様では、抗体が、例えば形質芽球などの形質細胞前駆体上のｍＦＬＣに結合する。
【００１１】
一実施態様では、形質芽球はマーカーＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ４５について陽性である。特定の一実施態様では、形質芽球はマーカーＩｇＤについて陰性である。
【００１２】
別の好ましい実施態様では、抗体がｍＦＬＣに特異的に結合する。
【００１３】
一実施態様では、対象に投与される抗体は、細胞毒性部分または生物反応修飾物質に共役する。非限定的例として、細胞毒性部分は、細胞毒物または細菌または植物起源の酵素的に活性な毒素（ゲロニンなど）、またはこのような毒素の酵素的に活性な断片（「Ａ鎖」）であってもよい。酵素的に活性な毒素およびその断片が好ましく、ゲロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの）菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ナデシコタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害物質、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害物質、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンによって例示される。細胞毒性部分はまた、放射性薬剤であってもよい。特に細胞毒性部分は、例えばイットリウム−９０（９０Ｙ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）または銅−６７（６７Ｃｕ）などの放射性核種であってもよい。好ましくは細胞毒性部分は、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である。
【００１４】
ｍＦＬＣに結合する抗体と共役し、本発明で使用されてもよい生物反応修飾物質としては、ＩＬ−２およびインターフェロン（α、βまたはγ）などのリンフォカインおよびサイトカインが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの生物反応修飾物質は、細胞に対して様々な効果を有する。これらの影響としては、直接作用による細胞死滅増大、ならびに宿主防衛仲介過程の増大による細胞死滅増大が挙げられる。ｍＦＬＣに結合する抗体のこれら生物反応修飾物質への共役は、形質細胞前駆体内の選択的局在化を可能にし、ひいては非標的細胞の毒性につながる非特異的効果を抑制する。生物反応修飾物質は、好ましくはリンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである。
【００１５】
別の実施態様では、細胞毒性部分は細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００１６】
あらゆる適切なｍＦＬＣに結合する抗体を本発明の方法で使用してもよいが、一実施態様では、抗体はＫＭＡまたはＬＭＡに結合する。特定の一実施態様では、抗体はＫＭＡに結合する。
【００１７】
一実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体はＫ１２１様抗体である。好ましくは、Ｋ１２１様抗体は配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を含んでなり、またはκ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）への結合について、配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を有する抗体と競合する。
【００１８】
一実施態様では、本発明の方法によって治療されるＢ細胞仲介性障害は自己免疫疾患である。特定の一実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症から選択される。
【００１９】
本発明は、有効量のｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップを含んでなる、対象において形質細胞前駆体の成長を阻害するか、または死滅させる方法をさらに提供する。一例として形質細胞前駆体の阻害または死滅は、アポトーシスによって、または対象の免疫細胞によって（抗体依存細胞仲介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）などによって）、および／または抗体依存性の細胞の食作用によって達成されてもよい。
【００２０】
本発明はまた、細胞毒性部分または生物学的修飾因子と共役するｍＦＬＣに結合する抗体を投与することで、対象において形質細胞前駆体を阻害しまたは死滅させる方法も提供する。
【００２１】
好ましくは、細胞毒性部分は、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である。
【００２２】
一実施態様では、細胞毒性部分は、細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００２３】
別の実施態様では、生物反応修飾物質は、リンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである。
【００２４】
本発明は、ｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップと、抗体を対象内で細胞に結合させるステップと、抗体の位置を対象内で判定するステップを含んでなる、対象において形質細胞前駆体を局在化する方法をさらに提供する。
【００２５】
一実施態様では、抗体は検出可能に標識される。
【００２６】
好ましくは、本発明の方法で使用される抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００２７】
本発明は、Ｂ細胞仲介性免疫障害を治療する薬剤を製造するためのｍＦＬＣに結合する抗体の使用をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、
（ｉ）対象から造血性前駆細胞集団を取り出すステップと、
（ｉｉ）細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体で処置するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの処置済み細胞集団を対象に移植するステップと
を含んでなる、対象において自己造血細胞を移植する方法をさらに提供する。
【００２９】
前駆細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体で処置するステップは、好ましくは、抗体と集団中に存在する形質細胞前駆体との結合に十分な条件下で、細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体に接触させて、形質細胞前駆体の成長を阻害するか、または死滅させることを伴う。
【００３０】
一実施態様では、方法は、ｍＦＬＣに結合する抗体を対象中に静脈点滴するステップをさらに含んでなる。
【００３１】
さらに別の実施態様では、自家移植する方法は、細胞減少療法の最中または後に対象に対して実施される。
【００３２】
なおもさらに好ましい実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体は固体担体に結合する。
【００３３】
明らかになるように、本発明の一態様の好ましい徴群および特徴は、本発明の多数のその他の態様にも当てはまる。
【００３４】
本明細書全体を通じて、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、言及される要素、整数または工程、または要素群、整数群または工程群の包含を暗示するが、あらゆるその他の要素、整数または工程、または要素群、整数群または工程群を排除しないものと理解される。
【００３５】
本発明は、以下の非限定的例を手段として添付図に言及して、下文中で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭ活性化Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）上でのＫＭＡ発現。ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で、末梢Ｂ細胞が活性化された。６日目に細胞を収集し、次にＫＭＡ、ＩｇＤ、ＣＤ２７、およびＣＤ３８について染色した。ゲート１．＝ＣＤ３８ｌｏｗ、ゲート２．＝ＣＤ３８＋、およびゲート３．＝ＣＤ３８＋＋。
【図２】ＳＡＣ活性化形質芽球上でのＫＭＡ発現。末梢Ｂ細胞はＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で活性化された。６日目に、細胞を収集し、次にＫＭＡ、ＩｇＤ、ＣＤ２７、およびＣＤ３８について染色した。ゲート１．＝ＣＤ３８ｌｏｗ、ゲート２．＝ＣＤ３８＋、およびゲート３．＝ＣＤ３８＋＋。
【図３】ＫＭＡはＣＤ３８＋＋ＣＤ４５＋未成熟形質細胞上で発現される。扁桃由来単核細胞をＫＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４５、およびＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎについて染色した。図３ａは、ＶｉａｂｌｅＢ細胞は、ＣＤ１９およびＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ染色の欠如によってゲート制御した。次に細胞をＣＤ３８発現によってゲート制御した。ゲート１．＝ＣＤ３８ｌｏｗ、ゲート２．＝ＣＤ３８＋、およびゲート３．＝ＣＤ３８＋＋。図３ｂは、細胞をＫＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４５およびＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎについて染色した。生存細胞をＣＤ３８＋＋発現によってゲート制御し、ＫＭＡおよびＣＤ４５陽性について分析した。
【図４】形質芽球によるＫＭＡ発現細胞の同定およびＩＨＣによる形質細胞形態学。正常な組織からの未固定切片をＦＩＴＣ標識ＭＤＸ１０９７で染色し、マウス抗ＦＩＴＣ２次抗体、次に抗マウスペルオキシダーゼがそれに続いた。切片を色原体基質で発色させた。パネル１＝扁桃切片、パネル２＝唾液腺、およびパネル３＝末梢血。矢印はＫＭＡ＋細胞を表す。
【図５】ＫＭＡはＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭ活性化形質芽球上で発現される。末梢Ｂ細胞をＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で活性化した。６日目に細胞を収集し、ＫＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、および表面ＩｇＤ（図示せず）について染色した。図５ａは、収集細胞の散乱プロフィールである。全ての引き続く分析はライブゲート（ゲート２）内で実施された。図５ｂは、ゲート制御集団のＣＤ２７およびＣＤ３８プロフィールを示す。図５ｃは、パネル（ｂ）で着色される集団内の（アイソタイプ対照との比較で）ＫＭＡ陽性細胞の百分率を示す。ゲート３＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７−、ゲート４＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７＋、およびゲート５＝ＣＤ３８＋＋ＣＤ２７＋＋。ＫＭＡは、ＡＰＣ標識ＭＤＸ−１０９７を使用して検出され、アイソタイプ対照はＡＰＣ標識ヒトＩｇＧ１抗体であった。提示される結果は、５つの独立した実験を表す。
【図６】ＬＭＡは、ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭ活性化形質芽球上で発現される。末梢Ｂ細胞は、ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの存在下で活性化された。６日目に細胞を収集し、ＬＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、および表面ＩｇＤ（図示せず）について染色した。図６ａは、収集された細胞の散乱プロフィールである。引き続く全ての分析は、ライブゲート（ゲート１）中で実施した。図６ｂは、ゲート制御集団のＣＤ２７およびＣＤ３８プロフィールを示す。図６ｃは、パネル（ｂ）で着色される集団内の（アイソタイプ対照との比較で）ＬＭＡについて陽性の細胞百分率を示す。ゲート２＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７−、ゲート３＝ＣＤ３８＋／−ＣＤ２７＋、およびゲート４＝ＣＤ３８＋＋ＣＤ２７＋＋。ＬＭＡはＡＰＣ標識４Ｇ７を使用して検出され、アイソタイプ対照はＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１抗体であった。示された結果は、独立した５つの実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一般技術および選択された定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、（例えば免疫学、免疫組織化学、細胞培養、分子遺伝学、タンパク質化学、および生化学分野の）当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有するものとする。
【００３８】
特に断りのない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質技術、細胞培養技術、および免疫学的技術は、当業者に良く知られている標準操作手順である。このような技術については、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在に至るまでの全てのアップデートを含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在に至るまでの全てのアップデートを含む）などの参考文献全体を通じて記載され説明される。
【００３９】
「膜結合遊離軽鎖」とは、未変性免疫グロブリンと結合していない、膜結合軽鎖を意味する。膜結合軽鎖は、膜結合κ軽鎖および／または膜結合λ軽鎖を含んでなってもよい。
【００４０】
本明細書での用法では、「形質細胞前駆体」という用語は、長寿抗体分泌形質細胞の活性化増殖中前駆体と同様の特徴を有する細胞を指す。形質細胞前駆体は、プロＢ細胞、前Ｂ細胞、未成熟Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、ナイーブ活性化Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、ポスト胚中心Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、および形質芽球を含む。
【００４１】
細胞が所与のマーカーについて「陽性」であると言及される場合、それは細胞表面にマーカーが存在する程度によって、そのマーカーの低（＋、ｌｏまたはｄｉｍ）または高（＋＋、ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）発現細胞のどちらであってもよく、該用語は細胞の色選別処理過程で使用される蛍光またはその他の色の強度に関する。高低の区別は、選別される特定の細胞集団上で使用されるマーカーの文脈で理解される。本明細書で細胞が、特定のマーカーについて「陰性」であると言及される場合、それはマーカーが細胞によって全く発現されないことを意味しない。それは細胞によって比較的非常に低いレベルでマーカーが発現されて、検出可能に標識された場合、非常に低いシグナルを発生するかもしれないことを意味する。
【００４２】
本明細書での用法では、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、Ｂ細胞仲介性免疫障害の発症または進行を低下させるかまたは遅延させ、またはＢ細胞仲介性免疫障害の少なくとも１つの症状を軽減させるかまたは排除するのに十分な、本明細書に記載される抗体の治療的有効量を投与することを含む。
【００４３】
膜結合遊離軽鎖に結合する抗体
本発明者らは今や初めて、膜結合遊離軽鎖が形質細胞前駆体表面で発現されることを示した。ｍＦＬＣに対する抗体は、ＡＤＣＣ、補体依存性溶解、抗体依存性の細胞の食作用、およびアポトーシスなどの機序を通じて、形質細胞前駆体を死滅させることができ、したがってＢ細胞仲介性免疫障害に対する効果的な治療薬であろう。さらにｍＦＬＣ対する抗体は、細胞毒を形質細胞前駆体に直接送達するのに使用し得る。
【００４４】
必須ではないが、抗体はｍＦＬＣに特異的に結合してもよい。「特異的に結合する」という語句は、特定の条件下で抗体がｍＦＬＣに結合し、その他のタンパク質または炭水化物に顕著な量で結合しないことを意味する。ｍＦＬＣに特異的に結合する抗体は、未変性免疫グロブリンに付随する軽鎖と結合しないことが好ましい。ｍＦＬＣへの特異結合は、このような条件下では、その特異性について選択される抗体を必要とするかもしれない。多様な免疫測定様式を使用して、ｍＦＬＣと特異的に免疫反応性の抗体を選択してもよい。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法は、タンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに慣例的に使用される。特異的免疫反応性を判定するのに使用し得る免疫測定様式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００４５】
「抗体」という用語は、本明細書での用法では、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、二重抗体、三重抗体、ヘテロ共役抗体、未変性分子ならびにその断片をはじめとするキメラ抗体、およびその他の抗体様分子を含む。抗体は、例えばＶＨまたはＶＬ領域のどちらかを含む領域抗体、重鎖可変部の二量体（ＶＨＨ、ラクダ科動物で述べられるような）、軽鎖可変部の二量体（ＶＬＬ）、直接にまたはリンカーを通じて結合していてもよい軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）可変部のみを含有するＦｖ断片、または重鎖可変部とＣＨ１領域を含有するＦｄ断片をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な形態の変異を含む。共に結合して一本鎖抗体を形成する重鎖および軽鎖の可変部から成るｓｃＦｖ、（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、そして二重抗体および三重抗体などのｓｃＦｖのオリゴマーもまた、「抗体」という用語に包含される。可変部と定常部の一部とを含有するＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、およびＦａｂＦｃ２断片などの抗体断片もまた包含される。相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト抗体断片および抗体断片オリゴマーもまた、包含される。Ｆｖの重鎖および軽鎖構成要素は同一抗体または異なる抗体に由来してもよく、それによってキメラＦｖ領域を生じてもよい。抗体は、動物（例えばマウス、ウサギまたはラット）由来、またはヒト由来であってもよく、またはキメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）でもまたはヒト化（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）されていてもよく、英国特許出願第８７０７２５２号明細書で公開されている。本明細書での用法では「抗体」という用語は、これらの様々な形態を含む。本明細書で提供されるガイドライン、そして上述の参考文献およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）などの出版物に記載される当業者に良く知られている方法を使用して、本発明の方法で使用するための抗体は容易に作成し得る。
【００４６】
ｍＦＬＣ結合抗体は、可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）鎖を含んでなるＦｖ領域であってもよく、その中で軽鎖および重鎖は直接にまたはリンカーを通じて結合していてもよい。本明細書での用法では、リンカーとは軽鎖および重鎖に共有結合して、その中でそれらが目的とするエピトープと特異的に結合できるような立体配座を達成できるように、２本の鎖の間に十分な間隔と可撓性を提供する分子を指す。融合ポリペプチドのＩｇ部分の内在性構成要素として発現されてもよいことから、タンパク質リンカーが特に好ましい。
【００４７】
別の実施態様では、組換え的に生成された一本鎖ｓｃＦｖ抗体、好ましくはヒト化ｓｃＦｖが本発明の方法で使用される。
【００４８】
モノクローナル抗体
ｍＦＬＣエピトープに対するモノクローナル抗体は、当業者によって容易に作成され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般方法は、良く知られている。細胞融合によって、またＢリンパ球の発がん性ＤＮＡによる直接形質移入またはエプスタイン・バーウイルスによる形質転換などのその他の技術によって、不死の抗体産生細胞系統を作り出し得る。ｍＦＬＣエピトープに対して作成されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性について、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性についてスクリーンし得る。
【００４９】
動物由来モノクローナル抗体は、直接生体内および生体外免疫療法の双方で使用し得る。しかし例えばマウス由来モノクローナル抗体を治療薬としてヒトで使用する場合、患者はヒト抗マウス抗体を産生することが観察されている。したがって動物由来モノクローナル抗体は治療のためには、特に長期使用では好ましくない。しかし確立された遺伝子操作技術を用いて、動物由来部分およびヒト由来部分を有するキメラまたはヒト化抗体を作り出すことが可能である。動物は、例えばマウスや、またはラットなどのその他の齧歯類であり得る。
【００５０】
キメラ抗体の可変部が例えばマウス由来であって、定常部がヒト由来であれば、キメラ抗体は「純粋」マウス由来モノクローナル抗体よりも一般に免疫原性が低い。「純粋」マウス由来抗体が不適切であると判明した場合、これらのキメラ抗体は治療用途により良く適するであろう。
【００５１】
当業者は、キメラ抗体を作成する方法を利用できる。例えば別々のプラスミド中で免疫グロブリン軽鎖と免疫グロブリン重鎖を使用して、例えば軽鎖および重鎖を別々に発現し得る。次にこれらを精製して生体外で完全な抗体にアセンブリーし得る。このようなアセンブリーを達成する方法については、記載されている（例えばＳｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６を参照されたい）。このようなＤＮＡコンストラクトは、ヒト定常部をコードするＤＮＡに結合している抗ｍＦＬＣ抗体の軽鎖または重鎖の可変部について機能的に再配列された遺伝子をコードするＤＮＡを含んでなってもよい。骨髄腫などのリンパ球様細胞、または軽鎖および重鎖のためのＤＮＡコンストラクトで形質移入されたハイブリドーマは、抗体鎖を発現させてアセンブリーし得る。
【００５２】
減少した単離軽鎖および重鎖からのＩｇＧ抗体形成の生体外反応パラメーターについては、記載されている（例えばＢｅｙｃｈｏｋ，１９７９を参照されたい）。重鎖および軽鎖の細胞内会合および結合を達成して完全なＨ２Ｌ２ ＩｇＧ抗体を得る、同一細胞中での軽鎖および重鎖の同時発現もまた可能である。このような同時発現は、同一宿主細胞中の同一または異なるプラスミドを使用して達成し得る。
【００５３】
ヒト化の方法／技術
本発明の別の好ましい実施態様では、抗ｍＦＬＣ抗体はヒト化され、すなわち分子モデル化技術によって生成される抗体は、例えばラット、ウサギまたはマウスの親抗体の可変部に帰属される結合親和力の損失はわずかまたは皆無でありながら、抗体のヒト含有量が最大化される。
【００５４】
抗体は、欧州特許出願公開第Ａ−０２３９４００号明細書に従って、所望のＣＤＲをヒトフレームワークにグラフトすることによりヒト化してもよい。したがって所望の再構成抗体をコードするＤＮＡ配列は、ＣＤＲを再構成することが所望されるヒトＤＮＡから出発して作成し得る。所望のＣＤＲを含有する動物由来可変領域アミノ酸配列は、選択されたヒト抗体可変領域配列と比較される。ヒト可変部を動物由来ＣＤＲに組み込むために、動物中の対応する残基に変更する必要があるヒト可変領域中の残基をマークする。ヒト配列中で置換され、それに添加され、またはそれからから除去される必要がある残基もまた、あるかもしれない。
【００５５】
ヒト可変領域フレームワークを変異誘発するのに使用し得るオリゴヌクレオチドは合成されて、所望の残基を含有する。これらのオリゴヌクレオチドは、あらゆる都合のよいサイズであり得る。常態では利用できる特定の合成機の能力のみによって、長さが制限される。オリゴヌクレオチド指定生体外変異誘発の方法については、良く知られている。
【００５６】
代案としては、ヒト化は、国際公開第９２／０７０７５号パンフレットの組み換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して達成されてもよい。この方法を使用して、ヒト抗体のフレームワーク領域の間でＣＤＲをスプライスしてもよい。一般に国際公開第９２／０７０７５号パンフレットの技術は、２つのヒトフレームワーク領域、ＡＢおよびＣＤ、および供与体ＣＤＲによって置換されるそれらの間のＣＤＲを含んでなるテンプレートを使用して実施し得る。プライマーＡおよびＢはフレームワーク領域ＡＢを増幅するのに使用され、プライマーＣおよびＤはフレームワーク領域ＣＤを増幅するのに使用される。しかしプライマーＢおよびＣは、それぞれそれらの５’末端に、供与体のＣＤＲ配列の全部または少なくとも一部に相当する追加的配列もまた含有する。プライマーＢおよびＣは、ＰＣＲを実施できるようにする条件下で、それらの５’末端の相互のアニーリングを可能にするのに十分な長さが重なり合う。したがって増幅された領域ＡＢおよびＣＤは、重複する延長部分で遺伝子スプライシングを受けて、単一反応中でヒト化生成物を生じてもよい。
【００５７】
抗体を再構成する変異誘発反応に続いて、変異誘発されたＤＮＡを軽鎖または重鎖定常部をコードする適切なＤＮＡに結合させて発現ベクターにクローンし、好ましくは哺乳類細胞である宿主細胞に形質移入させ得る。これらの過程は、通例の様式で実施し得る。したがって再構成抗体は、
（ａ）少なくともＩｇ重鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列と作動的に連結する、適切なプロモーターを含む第１の複製可能な発現ベクターを調製するステップと；
（ｂ）少なくとも相補的Ｉｇ軽鎖または重鎖の可変領域をそれぞれコードするＤＮＡ配列と作動的に連結する適切なプロモーターを組む第２の複製可能な発現ベクターを調製するステップと；
（ｃ）第１のまたは双方の調製されたベクターを用いて細胞系を形質転換するステップと；
（ｄ）前記形質転換された細胞系を培養して、前記改変抗体を生成するステップと
を含んでなる方法によって調製されてもよく、可変領域は、ヒト抗体からのフレームワーク領域と、本発明のヒト化抗体に必要とされるＣＤＲとを含んでなる。
【００５８】
好ましくは、ステップ（ａ）のＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖の可変領域と、各定常領域の双方をコードする。ヒト化抗体はあらゆる適切な組み換え発現系を使用して調製し得る。形質転換されて改変抗体を産生する細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系または不死化哺乳類細胞系であってもよく、それは有利には骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞系などのリンパ系起源である。細胞系はまた、エプスタイン・バーウイルスなどのウィルスを用いた形質転換によって不死化された、Ｂ細胞などの正常なリンパ球様細胞を含んでなってもよい。最も好ましくは、不死化された細胞系は骨髄腫細胞系またはその誘導体である。
【００５９】
抗体発現のために使用されるＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）欠乏性であって、成長のためにチミジンとヒポキサンチンに依存してもよい（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０）。親ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系に、抗体をコードするＤＮＡおよびｄｈｆｒ遺伝子を形質移入し、それによってｄｈｆｒ陽性表現型のＣＨＯ細胞形質転換体を選択できるようにする。選択はチミジンおよびヒポキサンチンを欠く培地上でコロニーを培養することで実施され、チミジンおよびヒポキサンチンの不在は非形質転換細胞が成長するのを妨げ、形質転換細胞が葉酸経路を再利用し、ひいては選択システムをバイパスすることを妨げる。これらの形質転換体は、関心のある形質移入ＤＮＡとｄｈｆｒをコードするＤＮＡの同時組み込みにより、関心のあるＤＮＡを通常低濃度で発現する。抗体をコードするＤＮＡの発現レベルは、メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用した増幅によって増大されてもよい。この薬剤は酵素ｄｈｆｒの直接阻害剤であり、これらの条件を乗り切るためにｄｈｆｒ遺伝子のコピー数を十分に増幅する抵抗性コロニーを単離できるようにする。ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列と抗体をコードするＤＮＡ配列は、元の形質転換体中で密接に連関しているので、通常同時増幅があり、ひいては所望の抗体の発現の増大がある。
【００６０】
ＣＨＯまたは骨髄腫細胞と共に使用される別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレットに記載されるグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）増幅系である。このシステムは、酵素ＧＳをコードするＤＮＡによる、そして所望の抗体をコードするＤＮＡによる細胞の形質移入を伴う。次にグルタミンを含まない培地中で成長し、したがってＧＳをコードするＤＮＡが組み込まれたと想定される細胞が選択される。次にメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を使用して、これらの選択されたクローンの酵素ＧＳを阻害する。細胞は生き残るためにＧＳをコードするＤＮＡを増幅させ、抗体をコードするＤＮＡが同時に増幅する。
【００６１】
ヒト化抗体を生成するのに使用される細胞系は好ましくは哺乳類細胞系であるが、細菌細胞系または酵母細胞系などのあらゆるその他の適切な細胞系を代案として使用してもよい。特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来細菌株を使用し得ることが想定される。得られた抗体は機能性について検査される。機能性が失われていれば、ステップ（２）に戻って抗体のフレームワークを変更する必要がある。
【００６２】
発現されたら、抗体全体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、またはその他の免疫グロブリン形態を回収して、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などをはじめとする技術分野の標準操作手順に従って精製し得る（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい）。医薬用途では、少なくとも約９０〜９５％均質な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の均質性がより好ましい。必要に応じて部分的にまたは均質性に精製したら、次にヒト化抗体を治療的に使用してもよく、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発実施において使用してもよい。（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７９および１９８１）を参照されたい）。
【００６３】
Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら（１９９３）によって実施された研究は、免疫グロブリン分子の定常部を操作することによって、ヒトエフェクター細胞による抗体のＦｃ領域の認識を最適化し得ることを実証した。これは所望の特異性がある抗体の可変部遺伝子と、ヒト対象において効果的なＡＤＣＣを実証する、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプなどの免疫グロブリンアイソタイプをコードするヒト定常部遺伝子とを融合させることで達成し得る。（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍｉｋｅ Ｃｌａｒｋ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｔｉｔｌｅｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩ ８５−１１３）。得られるｍＦＬＣに対するキメラまたはヒト化抗体は、特にＡＤＣＣを誘発するのに効果的なはずである。
【００６４】
ｍＦＬＣに対する、完全なヒト可変部がある抗体はまた、抗原投与に応えてこのような抗体を産生するように改変されているが、その内在性遺伝子座は無能にされている遺伝子導入動物に、抗原を投与することで調製してもよい。引き続き様々な操作を実施して、抗体それ自体またはその類似体のどちらかを入手してもよい（例えば米国特許第６，０７５，１８１号明細書を参照されたい）。
【００６５】
抗体またはその断片をコードする遺伝子の調製
抗体をコードする遺伝子、軽鎖および重鎖遺伝子の双方、または例えば一本鎖Ｆｖ領域などのその一部は、ハイブリドーマ細胞系からクローンされてもよい。それらは全て、同じ一般的ストラテジーを使用してクローンされてもよい。典型的に、例えばプライマーとしてランダム六量体を使用して、ハイブリドーマ細胞から抽出されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡが逆転写される。Ｆｖ領域では、ＶＨおよびＶＬ領域が２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々に増幅される。重鎖配列は、それぞれ抗ｍＦＬＣ重鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計された５’末端プライマー、およびコンセンサス免疫グロブリン定常部配列に従った３’末端プライマーを使用して増幅されてもよい（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。軽鎖Ｆｖ領域は、抗ｍＦＬＣ軽鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計された５’末端プライマーをプライマーＣ−κと組み合わせて使用して、増幅される。当業者は、多数の適切なプライマーを用いてＦｖ領域を得てもよいことを認識するであろう。
【００６６】
ＰＣＲ産物を適切なクローニングベクターにサブクローニングする。ＤＮＡ限定酵素による正確な大きさの挿入断片を含むクローンを同定する。次にクローニング部位に隣接する配列決定プライマーを使用して、二本鎖プラスミドＤＮＡから重鎖または軽鎖コード領域のヌクレオチド配列を決定してもよい。ＤＮＡの配列決定を容易にするために、市販のキット（例えばＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡからのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）キット）を使用してもよい。Ｆｖ領域をコードするＤＮＡは、例えばＰＣＲおよびＬＣＲなどの増幅技術をはじめとするあらゆる適切な方法によって調製されてもよい。
【００６７】
化学合成からは一本鎖オリゴヌクレオチドが生じる。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換してもよい。一本鎖Ｆｖ領域全体を化学合成することも可能であるが、多くの短い配列（約１００〜１５０塩基）を合成し、その後これらを連結することが好ましい。
【００６８】
代案としては、サブ配列をクローニングし、適切な制限酵素を使用して適切な部分配列を切断してもよい。次に断片を連結して、所望のＤＮＡ配列を生成してもよい。
【００６９】
Ｆｖ可変軽鎖ＤＮＡおよび可変重鎖ＤＮＡが得られたら、当業者に良く知られている技術を使用して、直接またはペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を介して、配列を共に連結してもよい。一態様では、重鎖および軽鎖領域は、重鎖Ｆｖドメインのカルボキシ末端から始まって軽鎖Ｆｖドメインのアミノ末端で終了する可動性のペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）によって連結される。配列全体が、一本鎖抗原結合タンパク質の形態のＦｖドメインをコードする。
【００７０】
抗ＫＭＡ抗体
一実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体は抗ＫＭＡ抗体である。例えば抗体は、Ｋ１２１またはａＫ１２１様抗体であってもよい。Ｋ１２１は、ヒト遊離κ軽鎖と、κ−タイプ骨髄腫細胞の表面に発現する抗原とを特異的に認識するマウスのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。この抗原は、κ骨髄腫抗原またはＫＭＡと呼ばれている（Ｂｏｕｘ，ＨＡ． ｅｔ ａｌ．，１９８３）。ＫＭＡは、細胞膜上のアクチンと非共有結合した状態で発現される遊離κ軽鎖からなることが確立されている（Ｇｏｏｄｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「Ｋ１２１様抗体」という語句は、配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を含んでなる抗体；またはκ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）への結合について配列番号１に記載のＶＨ領域を有する抗体および配列番号２に記載のＶＬ領域と競合する抗体を指す。
【００７２】
Ｋ１２１様抗体は、ＨＭｙ２細胞上のＫＭＡとの結合においてＫ１２１（またはＫ１２１のキメラまたはヒト化形態）と競合するそれらの能力によって同定されてもよい。この手順では、確立された手順を使用してＫ１２１をビオチンと共役させてもよい（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。次にＫ１２１様抗体をＨＭｙ２細胞上のＫＭＡへのビオチン化Ｋ１２１の結合と競合するそれらの能力によって評価する。ＨＭｙ２細胞へのビオチン化Ｋ１２１の結合は、Ｋ１２１分子上のビオチンに結合するフルオレセイン標識ストレプトアビジンの添加によって評価してもよい。次に細胞の蛍光染色をフローサイトメトリーによって定量化し、Ｋ１２１様抗体の競合効果を競合物不在下で得られる蛍光レベルの百分率として表す。
【００７３】
抗ＬＭＡ抗体
本発明の一実施態様では、ｍＦＬＣに結合する抗体は抗ＬＭＡ抗体である。本明細書で使用する場合、「ＬＭＡ」という用語は、λ−タイプ免疫グロブリンに由来する軽鎖に相当するあらゆる遊離λ軽鎖を包含する。したがって本用語は、それらの可変部配列が異なり得る一連のλ軽鎖ポリペプチドを包含する。
【００７４】
抗ＬＭＡ抗体は当業者に知られている。例えばＬＭＡに対する抗体は、多発性骨髄腫を診断する試験において血清または尿中の遊離λ軽鎖を検出するのに使用されている（Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。しかしＬＭＡは患者においてＢ細胞仲介性免疫障害を治療するための標的としては、今日まで使用されていない。
【００７５】
適切な抗ＬＭＡ抗体の例としては、３Ｄ１２（製品番号ａｂ１９４４；ＡｂＣａｍ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＣＢＬ３１７（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ，ＵＫ）、４Ｇ７（製品番号ａｂ５４３８０；ＡｂＣａｍ Ｌｔｄ）、ＭＥ−１５４（製品番号ａｂ９２４５；ＡｂＣａｍ Ｌｔｄ）、２６Ｄ（製品番号ＣＢＬ３１７；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）または２Ｇ９（製品番号ＣＢＬ１０９；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）が挙げられる。
【００７６】
細胞毒性部分
本発明で使用するための適切な細胞毒性部分としては、細菌または植物毒素などの作用物質；例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；ｃｙｔｏｘａｎ）、クロランブシル（ＣＨＬ；ｌｅｕｋｅｒａｎ）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；ＣＤＤＰ；ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ブスルファン（ｍｙｌｅｒａｎ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、およびその他のアルキル化剤などの薬剤；メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ−１６；ｖｅｐｅｓｉｄ）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣｄＡ）、およびその他の代謝拮抗薬；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン、ミトラマイシンをはじめとする抗生物質ならびにその他の抗生物質；ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなどのアルカロイド；ならびにデキサメタゾン（ＤＥＸ；ｄｅｃａｄｒｏｎ）などの細胞分裂阻害剤グルココルチコイド、およびプレドニゾンなどのコルチコステロイド、ヒドロキシ尿素などのヌクレオチド酵素阻害剤などをはじめとするその他の抗がん剤が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００７７】
当業者は、良く知られている技術によって抗体と共役させて送達し患部組を織特異的に破壊し得る、多数のその他の放射性同位体および化学細胞毒物があることを理解するであろう。例えばＢｌａｔｔｌｅｒらに付与された米国特許第４，５４２，２２５号明細書を参照されたい。光活性化毒素の例としては、ジヒドロピリジンおよびω−コノトキシン（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）が挙げられる。使用できる造影剤および細胞毒性試薬の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、３Ｈ、および１４Ｃ；フルオレセインやローダミンなどの蛍光性標識、およびルシフェリンなどの化学発光物質が挙げられる。当該技術分野で知られている技術を使用して、このような試薬で抗体を標識し得る。例えば抗体の放射標識に関する技術については、Ｗｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｍｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）を参照されたい（Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６；”Ｏｒｄｅｒ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）もまた参照されたい）。
【００７８】
一例では、リンカー−キレート剤チウキセタンが、安定したチオ尿素共有結合によってｍＦＬＣに結合する抗体に共役し、インジウム−１１１またはイットリウム−９０のための高親和性キレート化部位を提供する。
【００７９】
本発明の治療的な組成物中に細胞毒物をコードするＤＮＡ分子が存在する場合、ＤＮＡは好ましくは細菌または植物毒素であるポリペプチドをコードする。これらのポリペプチドとしては、天然または改変シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アブリン、ゲロニン、モモルジンＩＩ、志賀および志賀様毒素ａ−鎖などの細菌ＲＩＰ、ルフィン（Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ａ−トリコサンチン（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、モモルジンＩ（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ抗ウィルス性タンパク質（Ｈａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ｂｙｏｄｉｎ ２（米国特許第５，５９７，５６９号明細書）、ガポリン（Ｂｅｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）などのポリペプチド、ならびにそれらの遺伝子操作変異体が挙げられるが、これに限定されるものではない。天然ＰＥおよびＤＴは、典型的に肝臓毒性を通じて死をもたらす高度に毒性の化合物である。好ましくは、ＰＥおよびＤＴは、例えばＰＥのＩａ領域およびＤＴのＢ鎖などの毒素の天然標的構成要素を除去する形態に改変される。当業者は本発明が特定の細胞毒物に限定されるものではないことを理解するであろう。
【００８０】
「シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素」（ＰＥ）という用語は、本明細書での用法では改変されている全長天然（天然）ＰＥまたはＰＥを指す。このような改変としては、領域Ｉａの除去、領域ＩＩおよびＩＩＩにおける様々なアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換（例えば位置５９０および６０６におけるＬｙｓのＧｌｎによる置換）、およびカルボキシル末端における１つ以上の配列の付加が挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。したがって例えばＰＥ３８は、アミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３から構成されるトランケート型シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素を指す。ＰＥの天然Ｃ−末端であるＲＥＤＬＫ（残基６０９〜６１３）は、配列ＫＤＥＬ、ＲＥＤＬによって置換されていてもよく、Ｌｙｓ−５９０およびＬｙｓ−６０６は、それぞれＧｌｎに変異していてもよい。
【００８１】
「ジフテリア毒素」（ＤＴ）という用語は、本明細書での用法では、全長天然ＤＴまたは改変ＤＴを指す。改変は典型的にＢ鎖中の標的領域の除去を含み、さらに具体的にはＢ鎖のカルボキシル領域のトランケーションを伴う。
【００８２】
治療法
本発明の方法は、自己免疫障害、炎症性疾患、および敗血症などのＢ細胞仲介性免疫障害の治療または予防に有用である。当業者は、Ｂ細胞仲介性免疫障害がＢ細胞悪性腫瘍を含まないことを理解するであろう。
【００８３】
本発明の方法で治療してもよい自己免疫障害としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、多発性硬化症、クローン病、免疫血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、自己免疫蕁麻疹、セリアック病、疱疹状皮膚炎、急性リウマチ熱、グレーブス病、重症筋無力症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、溶連菌感染後糸球体腎炎、接触性皮膚炎、自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、アジソン病、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）によって引き起こされる脈管炎、結節性多発動脈炎、自己免疫肝炎、および原発性胆汁性肝硬変が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
一態様では、本発明の方法は、改変なしに抗体または結合断片を利用して、形質細胞前駆体の表面ｍＦＬＣへの抗体または断片の原位置結合に依存して、免疫攻撃を刺激する。例えばその中で抗原結合部位が例えばＩｇＧｌなどのヒトＦｃ領域に結合するキメラ抗体を使用して、抗体依存性仲介細胞毒性または補体仲介細胞毒性を促進してもよい。
【００８５】
本発明の別の態様では、細胞毒物または生物反応修飾物質がそれに結合する、ｍＦＬＣに結合する抗体などのｍＦＬＣ結合部分を使用して治療法を実施してもよい。得られるコンジュゲートの形質細胞前駆体への結合は、細胞の成長を阻害しまたは死滅させる。
【００８６】
当業者によって理解されるように、Ｂ細胞仲介性免疫障害患者のいくらかは、血液循環内に有意水準の遊離λ軽鎖を有するかもしれない。抗ｍＦＬＣ抗体はこれらの遊離軽鎖と反応するので、対象の体液中のそれらの存在は治療効率を低下させるかもしれない。したがって本発明の一実施態様では、治療方法は、抗ｍＦＬＣ抗体の投与に先だって対象を処置し、対象の体液（例えば血液）中に循環する遊離λ軽鎖レベルを低下させるステップをさらに含んでなる。この追加的処置ステップは、例えば血漿交換療法を伴ってもよい。当業者には知られているように、血漿交換療法は、細胞分離器として知られている装置によって血液細胞から血漿を除去する工程である。分離器は、血液を高速で回転させて細胞を流体から分離させるか、または血漿のみが通過できる小孔のあるメンブレンを通して血液を通過させるかのどちらかによって機能する。細胞は対象に戻される一方、遊離軽鎖を含有する血漿は廃棄され、別の流体によって置換される。処置の間、血液が凝固しないようにする薬剤（例えば抗凝固剤）を静脈を通じて投与してもよい。
【００８７】
例えば抗ｍＦＬＣ抗体の使用を伴う関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症などのＢ細胞仲介性免疫障害を治療する方法は、単独で、またはその他の既知の治療法の補助として、実施してもよいことが理解されるであろう。
【００８８】
本発明のさらなる実施においては、患者に再導入する前に、抗ｍＦＬＣ抗体を使用して、骨髄などの患者サンプルから形質細胞前駆体を除去してもよい。非限定的な一例では、抗体をビーズなどのマトリックスに付着させる。これは、抗体またはそれらの結合断片を含んでなる、親和性マトリックスを調製するいくつかの良く知られている方法のいずれによって達成されてもよい。次にマトリックスに付着した抗体または結合断片との抗原／抗体相互作用を通じて、サンプル中の形質細胞前駆体の結合を促進する条件下で、マトリックスを含有するカラム上の細胞の通過などによって、患者サンプルをマトリックスに曝露させる。サンプル中の形質細胞前駆体がマトリックスに付着する一方、カラム溶出物、すなわち非付着細胞集団は形質細胞前駆体が枯渇している。手順の有効性は、下述するような検出可能に標識された抗体の使用などによって、残留形質細胞前駆体について細胞を調べることでモニターしてもよい。手順を反復しまたは修正して、有効性を増大させもよい。
【００８９】
診断用アッセイおよびキット
ｍＦＬＣに結合する抗体はまた、遊離軽鎖を発現する形質細胞前駆体を検出する、生体外および生体内の双方における診断用途のためにも有用である。生体外診断法としては、細胞の免疫組織学的検出が挙げられる。免疫組織化学的技術は、ｍＦＬＣに結合する抗体がある組織標本などの生物学的標本を染色し、次に抗原抗体複合体として、その抗原と複合体形成した抗体の存在を検出することを伴う。このような標本との抗原抗体複合体の形成は、組織中における遊離軽鎖を発現する形質細胞前駆体の存在を示唆する。標本上の抗体の検出は、例えば免疫ペルオキシダーゼ染色技術、またはアビジン−ビオチン技術、または免疫蛍光技術のような免疫酵素などの技術分野で知られている技術を使用して達成し得る。（例えばＣｉｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：５６２−７９，１９８６、およびＫｉｍｂａｌｌ，（ｅｄ），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２．ｓｕｂ．ｎｄ Ｅｄ），ｐｐ．１１３−１１７（ＭａｃｍｉｌｌａｎＰｕｂ．Ｃｏ．，１９８６）を参照されたい）。
【００９０】
適切な標識は、当業者に良く知られている。「標識」という用語は、本明細書での用法では、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば有用な標識としては、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および３５Ｓなどの放射性分子、フルオレセインまたはローダミンなどの蛍光染料、高電子密度試薬、イソチオシアネート、発色団、（一般にＥＬＩＳＡで使用されるような）酵素、ルシフェラーゼなどの発光酵素などが挙げられる。
【００９１】
このような標識抗体を例えば抗原の組織学的局在化のため、ＥＬＩＳＡのため、細胞選別のため、および抗原、および抗原がある細胞を検出および／または定量化するその他の免疫学的技術のために、使用してもよい。上述のように、このような標識される抗体、またはその断片の特定の用途は、移植、特に自己骨髄移植に先だって、骨髄組織からの形質細胞前駆体除去の有効性を判定することにある。
【００９２】
本発明はまた、上述されるような抗ｍＦＬＣ抗体を使用した、Ｂ細胞仲介性免疫障害の造影法も対象とする。方法は、本明細書に記載されるような、放射性核種などの検出可能な部分への共役がある、またはない抗体の投与または輸液を伴う。投与または輸液の後、抗体または抗体断片は形質細胞前駆体に結合し、その後抗体の位置が検出される。放射性核種で標識したものなどの検出可能に標識された抗体では、イメージング装置を使用して体内の作用因子の位置を同定してもよい。未標識の抗体の使用では、抗体の位置を示し、したがって適切に検出されてもよい第２の検出可能な試薬を投与してもよい。これらの方法はその他の抗体のために使用されており、当業者は体内の抗体または断片の位置をイメージングするためのこれらの様々な方法を十分に知っている。
【００９３】
本発明はまた、研究または診断目的のためのキットを包含する。キットは典型的に、抗ｍＦＬＣ抗体を含有する１つ以上の容器を含む。抗ｍＦＬＣ抗体は標識で誘導体化してもよく、または代案としてはそれを二次標識に結合して引き続く検出を提供してもよい。上述のようにこのような標識としては、放射性標識、蛍光性標識、酵素標識、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などが挙げられる。キットはまた、適切な二次標識（例えばヒツジ抗マウス−ＨＲＰなど）を含んでもよい。キットはまた、融合ポリペプチドの結合、非特異結合抗体の除去、および結合標識の検出を容易にする様々な試薬を含んでもよい。このような試薬については当業者に良く知られている。
【００９４】
本発明のさらなる態様では、固体担体に結合する抗ｍＦＬＣ抗体を含んでなる、組成物が提供される。本発明で使用するための固体担体は、結合のための反応条件に対して不活性である。本発明で使用するための固相担体は、そこにモノクローナル抗体またはその結合パートナーを付着させるために、反応性基または活性化基を有さねばならない。別の実施態様では、固相担体は、炭水化物ポリマーＳＥＰＨＡＲＯＳＥ．ＲＴＭ．、ＳＥＰＨＡＤＥＸ．ＲＴＭ．、またはアガロースなどの有用なクロマトグラフィー担体であってもよい。本明細書での用法では、固相担体は、特定タイプの担体に限定されない。むしろ多数の担体が利用でき、当業者に知られている。固相担体としては、例えばシリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、磁性ビーズ、（ニトロセルロース、セルロース、ナイロン、およびグラスウールをはじめとするが、これに限定されるものではない）メンブレン、プラスチックおよびガラス皿またはウェルなどが挙げられる。
【００９５】
上述の研究および診断用キットを使用する方法は一般に良く知られており、一般にキット使用のための取扱説明書で提供される。
【実施例】
【００９６】
実施例１．正常なヒト末梢血Ｂ細胞の体外活性化
１．ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭの併用、または２．ホルマリン固定黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細菌（ＳＡＣ）の２つの異なるプロトコルを使用して、Ｂ細胞に由来するＣＤ１９＋末梢血を生体外で活性化した。
【００９７】
ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭによる精製Ｂ細胞の活性化は、それらの表面にＫＭＡを発現するものをはじめとする形質細胞を発生させる（ＫＭＡはｍＫａｐ［Ｋ１２１］反応性によって定義される）。フローサイトメトリーによるＫＭＡ発現細胞の表現型分析は、それらが表面ＩｇＤ−、ＣＤ２７＋＋、およびＣＤ３８＋＋（図１）によって定義される形質細胞のサブセットであることを明らかにした。これらのＫＭＡ＋／ＩｇＤ−／ＣＤ２７＋＋／ＣＤ３８＋＋は、全ＣＤ３８＋＋Ｂ細胞のおよそ１２％に相当する。対照的にＳＡＣによる刺激は、いかなる形質細胞も生じなかった。しかしＫＭＡ発現は、ＣＤ２７＋＋およびＣＤ３８ｌｏｗ形質芽球（ＣＤ３８ｌｏｗ集団のおよそ１０％）ならびにＣＤ２７＋／＋＋およびＣＤ３８＋形質芽球（ＣＤ３８＋集団のおよそ１４％；図２）の２つの異なる集団で見られた。
【００９８】
実施例２．正常なヒトリンパ系Ｂ細胞におけるＫＭＡの生体内発現
生体外活性化系で得られた結果を考えて、発明者らは類似タイプの細胞が生体内でＫＭＡを発現するかどうかを判定した。ＦＡＣＳによって、ヒト扁桃からの単核細胞をＢ細胞マーカーＣＤ１９、ＣＤ３８、およびＣＤ４５と共に、ＫＭＡ発現について分析した。
【００９９】
発明者らは、ＣＤ３８＋＋形質細胞画分中にＫＭＡ発現細胞の小集団（アイソタイプ対照をおよそ７．８％超える；図３ａ、ゲート３）を発見した。興味深いことに、これらの細胞はまた、未成熟形質細胞表現型（図３ｂ）の代表であるＣＤ４５も発現する。
【０１００】
ＫＭＡ発現細胞のフローサイトメトリー評価に加えて、正常な組織に対する免疫組織化学的（ＩＨＣ）研究を実施した。正常な供与者からの凍結保存未固定組織切片をＦＩＴＣ標識ＭＤＸ１０９７（ｍＫａｐ可変領域を含んでなるヒト−マウスキメラ抗体）で染色し、マウス抗ＦＩＴＣ二次抗体およびヤギ抗マウスペルオキシダーゼがそれに続いた。スライドを色原体基質で処理し、発現について分析した。
【０１０１】
ＭＤＸ１０９７による正常なヒト組織のＩＨＣ染色は、扁桃および唾液腺中に、形質細胞および形質芽球の形態（すなわち大きな細胞質と丸い核がある細胞）がある少数のＫＭＡ陽性細胞を明らかにした。染色は、ＫＭＡとして細胞膜上、および細胞内の双方で観察され、これらの細胞が遊離κＬＣの大きなプールを含有することが示唆された。正常な末梢血中にはいかなるＫＭＡ発現細胞も観察されず、以前の結果が確認された（図４；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。
【０１０２】
実施例３．活性化末梢血Ｂ細胞上におけるＫＭＡおよびＬＭＡ発現
ＣＤ１９＋末梢血Ｂ細胞をＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから得られた供血者サンプルから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する密度勾配遠心分離に続いて、磁性ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとＭＡＣＳ分離システムまたはａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ１９＋細胞を精製した。ＩＬ−２１（１μｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍＬ；Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、および抗ＩｇＭ抗体（５０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）抗体を含有する培地内において、３７℃、５％ＣＯ２で６〜７日間培養してＣＤ１９＋細胞を活性化した。
【０１０３】
ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、および抗ＩｇＭによるＣＤ１９＋末梢血Ｂ細胞の活性化は、ＫＭＡ＋およびＬＭＡ＋細胞の発生をもたらした。ＫＭＡおよびＬＭＡ発現細胞の表現型はＣＤ２７＋＋、ＣＤ３８＋＋、ＣＤ４５＋、およびＩｇＤ−であり、したがって晩期形質芽球（ｌａｔｅ ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ）のサブセット上のＫＭＡ発現を示す以前の結果が確認された（ＣＤ４５発現については以前調査していない）。
【０１０４】
本研究ではＫＭＡが、ＣＤ３８＋＋／ＣＤ２７＋＋／ＣＤ４５＋集団の６〜６０％に観察された、活性化ＣＤ１９＋Ｂ細胞のサブセットのおよそ１４％でのＫＭＡ発現を示す以前の証拠が裏付けられた。ＬＭＡの発現については以前調査されておらず、我々は生体外活性化ＣＤ１９＋細胞上のＬＭＡの存在／不在を調べることを希望した。本研究は、ＣＤ２７＋＋、ＣＤ３８＋＋、ＣＤ４５＋＋、およびＩｇＤ−細胞の１０〜２０％がＬＭＡを発現したことを実証した。得られた結果の要約を表１に示す。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
考察
表現型および形態学的分析は、ＫＭＡおよびＬＭＡが未成熟形質細胞の正常な形質芽球のサブセット上でｍＦＬＣとして発現されることを実証した。これらの細胞型は、抗体分泌細胞の機能的にユニークな亜集団に相当する（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｓｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【０１０７】
正常な免疫応答中に、初期抗体産生の大半は形質芽球および未成熟形質細胞によって占められる。やがてにこれらの細胞は終末的に成熟形質細胞に分化し、それは迅速な細胞死を経て、または骨髄に移行して骨髄微小環境からの生存指示により長寿命が持続する（Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【０１０８】
数多くの研究が、様々な自己免疫病理における形質芽球および形質細胞役割を分析している。形質芽球および未成熟形質細胞はどちらも自己抗体源ならびに成熟形質細胞前駆体であるので、それらは多数の自己免疫疾患における主要エフェクター細胞型の一部であると見なされる。例えば多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、および反応性形質細胞増加症において、形質芽球および未成熟形質細胞の関与が示されている（Ｃｅｐｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，２００５；およびＪｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらの細胞型上でＫＭＡおよびＬＭＡがｍＦＬＣとして特異的に発現されることを考えれば、ＫＭＡおよびＬＭＡは様々な自己免疫状態を治療するための魅力的な治療標的に相当する。
【０１０９】
実施例４．ｍＦＬＣに結合する抗体によって仲介される直接細胞傷害活性
４．１増殖アッセイ
細胞成長に適した培地および条件で、ｍＦＬＣに結合する様々な濃度の抗体と共に、細胞をインキュベートする。一例として、５％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ １６４０培地中において、３７℃で１時間〜４日間の様々な期間にわたり細胞と共に抗体をインキュベートしてもよい。細胞単独と比較した抗体処置細胞の増殖状態は、細胞集団の代謝健康を測定する試薬を使用して測定される。このような１つの試薬はＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）であり、それは代謝的に活性の細胞によってホルマザンに転換される。この転換には４９０ｎｍでの吸光度発生が伴っており、それは吸光度読み取り機器を使用して測定し得る。
【０１１０】
４．２アポトーシスアッセイ
細胞成長に適した培地および条件で、様々な濃度の抗体と共に細胞をインキュベートする。例えば、５％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ １６４０培地中において３７℃で４時間にわたり、細胞を様々な濃度の抗体と共にインキュベートする。細胞単独と比較した抗体処置細胞のアポトーシスの状態をアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）試薬およびフローサイトメトリーを使用して調査する。アネキシン−Ｖは負に帯電したリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合し、それはアポトーシス初期段階において、細胞膜の細胞質側から細胞表面側の単分子層に再分配される。壊死細胞はＰＩによって検出される。フローサイトメトリーはＰＩおよびＦＩＴＣ蛍光を測定できるようにし、したがってアポトーシスおよび壊死細胞を識別できるようにする。
【０１１１】
４．３抗体架橋
上述したような細胞成長に適した培地および条件で、様々な濃度の抗体および架橋試薬と共に細胞をインキュベートする。架橋試薬は抗体調製品であり、それは細胞を標的とするのに使用される抗体に結合する。例えば抗ＫＭＡまたは抗ＬＭＡ抗体がヒトＩｇＧ１であれば、架橋抗体はヒトＩｇＧ１に対して特異的なポリクローナル調製品である。抗体架橋は、抗体の直接細胞毒性効果を増強することが知られている。上述の増殖およびアポトーシスアッセイ法を使用して、標的細胞増殖に対する抗体架橋の影響を測定する。
【０１１２】
実施例５．ｍＦＬＣに結合する抗体による細胞仲介性の細胞傷害活性
５．１抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイで使用されるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製品、またはＰＭＢＣ調製品中に含有されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または単球などの特異的細胞集団のどちらかである。ＰＢＭＣｓはＦｉｃｏｌｌ密度勾配を使用して血液から単離される。血液をＦｉｃｏｌｌに重ねて勾配を遠心分離し、ＰＢＭＣを勾配境界面から収集する。
【０１１３】
磁性標識抗体調製品（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、特異的細胞集団を上記のように作成されたＰＢＭＣ調製品から単離し、望まれない細胞を除去する。例えば非ＮＫ細胞をＰＭＢＣ調製品から除去する磁性標識抗体カクテルを使用して、ＮＫ細胞を単離する。磁性標識細胞は保持されて（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ装置、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ＮＫ細胞が収集される。
【０１１４】
ＡＤＣＣアッセイでは、様々な濃度の抗体で被覆されたエフェクターおよび標的細胞を様々なエフェクター：標的細胞比率で混合し、混合物を細胞成長に適した適切な培地および条件下でインキュベートする。例えば混合物は、１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ中で３７℃で１６時間にわたりインキュベートしてもよい。アッセイ終点では、細胞溶解の程度が測定される。例えばＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、放出された細胞内乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のレベルを細胞溶解の指標として測定する。
【０１１５】
５．２抗体依存細胞の食作用（ＡＤＣＰ）
ＡＤＣＤアッセイでは、食作用エフェクター細胞を生体外で発生させる。磁性標識抗体カクテルおよびａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって、非単球細胞を除去することで、ＰＭＢＣ調製品を使用して単球を単離する。精製された単球は、単球をマクロファージに培養して分化させるのに適した培地内で生体外培養される。
【０１１６】
マクロファージの接着を支持して共焦点顕微鏡を使用した細胞相互作用の研究に適する、培養チャンバー内にマクロファージを播種する。標的細胞をｐＨ感応性であるｐＨＲｏｄｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）などの蛍光染料で染色し、様々な濃度の抗体で被覆してマクロファージを含有するチャンバーに入れた。酸性ｐＨに曝露すると、ｐＨＲｏｄｏ染料の蛍光スペクトルは変化する。細胞混合物を適切な条件下でインキュベートする。例えば細胞混合物は、１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ １６４０中において３７℃で２時間にわたりインキュベートしてもよい。アッセイ終点では非結合細胞が洗浄されて、マクロファージ表面のみで発現するマーカーに対して特異的なマクロファージは蛍光性抱合型抗体で染色される。最後に、共焦点顕微鏡を使用して細胞を分析する。
【０１１７】
マクロファージは、それらの細胞膜の特異的標識に起因する蛍光を通じて同定される。標的細胞を貪食したマクロファージは、それらの膜の染色に加えて、細胞の酸性エンドソーム内のｐＨＲｏｄｏ染料によって与えられる蛍光を有するであろう。貪食作用は、特定数の顕微鏡視野中で、細胞総数と食細胞数を計測することで測定される。
【０１１８】
５．３補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
標的細胞は、細胞成長をサポートする条件下において、補体（精製補体またはヒト血清含有補体のどちらか）および抗体の存在下でインキュベートする。例えば標的細胞は、１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ中で、補体および抗体の存在下、３７℃で３０分〜１２時間にわたりインキュベートしてもよい。アッセイ終点で、細胞の溶解程度または細胞の代謝状態（細胞成長を反映する）を測定する。細胞溶解は、上の５．１節に記載される方法を使用して測定される。細胞の代謝状態はＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）などの試薬を使用して測定される。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅの添加後、補体および抗体処置細胞混合物中で検出される蛍光は、生存細胞数に比例する。
【０１１９】
本明細書で考察および／または引用した全ての出版物はその内容全体を本明細書に援用する。
【０１２０】
広義に説明される本発明の範囲を逸脱することなく、特定の実施態様で示されるような多数の変更および／または修正を本発明に加えてもよいことが、当業者によって理解されるであろう。したがって本実施態様は全ての点で例証的と見なされ、制限的でない。
【０１２１】
本明細書に含まれるあらゆる文献、行為、材料、装置、物品などの考察は、本発明に文脈を提供することのみを目的とする。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術ベースの一部を形成し、または本明細書の各特許請求項の優先日の前に存在した本発明関連分野の一般常識であると認めるものではない。
【０１２２】
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Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：１０９８−１１０４．
Ｈａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４：６６２９−６６３７．
Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＢＢＡ，１０８８：３１１−３１４．
Ｈｏｆｍａｎｎ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：９７８−８４．
Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３．
Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ，５４：１３４３−１３４５．
Ｊｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ，９４：７０１．
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５．
Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，５４：３３０１−３３１８．
Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８８：１３３−１３４．
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５．
Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：１８０２５−３３．
Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｓｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５：２３０−２４２．
Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１４２５６−１４２６１．
Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５ Ｓｕｐｐｌ １：５１７−２０．
Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７７：４２１６−４２２０．
Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，１８６：８３３−８４１．
Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：６８７９−６８８７．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合遊離軽鎖（ｍＦＬＣ）に結合する有効量の抗体を対象に投与するステップを含んでなる、前記対象においてＢ細胞仲介性免疫障害を治療または予防する方法。
【請求項２】
前記抗体が形質細胞前駆体上のｍＦＬＣに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が細胞毒性部分または生物反応修飾物質に共役する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞毒性部分が、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞毒性部分が、細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記生物反応修飾物質が、リンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＫＭＡまたはＬＭＡに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がＫＭＡに結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＫ１２１様抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を含んでなり、またはκ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）への結合について、前記配列番号１に記載のＶＨ領域および前記配列番号２に記載のＶＬ領域を有する抗体と競合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体がＬＭＡに結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞仲介性免疫障害が自己免疫疾患である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効量のｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップを含んでなる、前記対象において形質細胞前駆体の成長を阻害するか、または死滅させる方法。
【請求項１５】
前記抗体が、細胞毒性部分または生物反応修飾物質に共役する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞毒性部分が、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞毒性部分が、細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物反応修飾物質が、リンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップと、前記抗体を前記対象内の細胞に結合させるステップと、前記抗体の位置を前記対象内で判定するステップを含んでなる、前記対象において形質細胞前駆体を局在化させる方法。
【請求項２０】
前記抗体が検出可能に標識される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＦＬＣに結合する抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ細胞仲介性免疫障害を治療する薬剤を製造するためのＦＬＣに結合する抗体の使用。
【請求項２３】
（ｉ）対象から造血性前駆細胞集団を取り出すステップと、
（ｉｉ）前記細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体で処置するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの前記処置済み細胞集団を前記対象に移植するステップと
を含んでなる、前記対象において自己造血細胞を移植する方法。
【請求項２４】
ｍＦＬＣに結合する抗体を前記対象に静脈点滴するステップをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
自家移植する方法が、細胞減少療法の最中または後に前記対象に対して実施される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
膜結合遊離軽鎖（ｍＦＬＣ）に結合する有効量の抗体を対象に投与するステップを含んでなる、前記対象においてＢ細胞仲介性免疫障害を治療または予防する方法。
【請求項２】
前記抗体が形質細胞前駆体上のｍＦＬＣに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が細胞毒性部分または生物反応修飾物質に共役する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞毒性部分が、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞毒性部分が、細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記生物反応修飾物質が、リンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＫＭＡまたはＬＭＡに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がＫＭＡに結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＫ１２１様抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号１に記載のＶＨ領域および配列番号２に記載のＶＬ領域を含んでなり、またはκ骨髄腫抗原（ＫＭＡ）への結合について、前記配列番号１に記載のＶＨ領域および前記配列番号２に記載のＶＬ領域を有する抗体と競合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体がＬＭＡに結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞仲介性免疫障害が自己免疫疾患である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、および多発性硬化症から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効量のｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップを含んでなる、前記対象において形質細胞前駆体の成長を阻害するか、または死滅させる方法。
【請求項１５】
前記抗体が、細胞毒性部分または生物反応修飾物質に共役する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞毒性部分が、毒素、化学療法剤、または放射性薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞毒性部分が、細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物反応修飾物質が、リンフォカイン、サイトカインまたはインターフェロンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ｍＦＬＣに結合する抗体を対象に投与するステップと、前記抗体を前記対象内の細胞に結合させるステップと、前記抗体の位置を前記対象内で判定するステップを含んでなる、前記対象において形質細胞前駆体を局在化させる方法。
【請求項２０】
前記抗体が検出可能に標識される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＦＬＣに結合する抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ細胞仲介性免疫障害を治療する薬剤を製造するためのＦＬＣに結合する抗体の使用。
【請求項２３】
（ｉ）対象から造血性前駆細胞集団を取り出すステップと、
（ｉｉ）前記細胞集団をｍＦＬＣに結合する抗体で処置するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの前記処置済み細胞集団を前記対象に移植するステップと
を含んでなる、前記対象において自己造血細胞を移植する方法。
【請求項２４】
ｍＦＬＣに結合する抗体を前記対象に静脈点滴するステップをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
自家移植する方法が、細胞減少療法の最中または後に前記対象に対して実施される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２２８１１（Ｐ２０１２−５２２８１１Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３８３３（Ｐ２０１２−５０３８３３）
【出願日】平成２２年４月７日（２０１０．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００３９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５２３８
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５０４００８３４６）イミューン システム セラピューティクス リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月７日（２０１０．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００３９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５２３８
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５０４００８３４６）イミューン システム セラピューティクス リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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