冠さび病抵抗性イネ科植物の選抜法
【課題】イタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを特定し、抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）の検出法を提供する。
【解決手段】イタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーを組み合わせてゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、抵抗性を示す増幅断片サイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出する方法、該方法を利用して冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法、及び該方法により選抜、作出した冠さび病抵抗性植物。
【効果】冠さび病胞子の接種を行うことなく、又は冠さび病が自然発病する条件でなくても、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体の選抜が可能である。
【解決手段】イタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーを組み合わせてゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、抵抗性を示す増幅断片サイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出する方法、該方法を利用して冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法、及び該方法により選抜、作出した冠さび病抵抗性植物。
【効果】冠さび病胞子の接種を行うことなく、又は冠さび病が自然発病する条件でなくても、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体の選抜が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子の一つ（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカーを利用した冠さび病抵抗性個体の検出方法に関するものであり、更に詳しくは、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、該プライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、抵抗性を示す増幅断片を検出する方法、その増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法等に関するものである。本発明は、上記ＤＮＡマーカーを利用して冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体の選抜方法及びその冠さび病抵抗性イネ科植物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡマーカーを指標として優良個体を選抜するマーカー選抜法が開発され、実際の育種に利用できるようになった。マーカー選抜法では、ＤＮＡマーカーにより遺伝子型を確認することで目的形質の有無を直接観察せずに判別できることから、幼苗の段階で迅速かつ確実に優良な個体を選抜することが可能となる。このことは、マーカー選抜法を活用することにより、育種に要する労力及び年月の短縮が可能になることを意味する。
【０００３】
イネ科植物では、これまで、イネ科植物の病害に対して抵抗性を示す抵抗性遺伝子を持つ系統が作出されているが、単一の抵抗性遺伝子を持つ系統を栽培すると病菌のレース分化により抵抗性が打破される現象が頻繁に生じることが知られている。この現象の対策として、栽培する系統に複数の抵抗性遺伝子を集積することや、異なる抵抗性遺伝子を持つ同質遺伝子系統を混合したものを栽培する手法が開発されている。
【０００４】
イタリアンライグラスの冠さび病についても、複数の抵抗性遺伝子を集積したり、異なる抵抗性遺伝子を持つ同質遺伝子系統を混合したものを開発することが重要であると考えられる。そのためには、既知の冠さび病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーに加え、他の抵抗性遺伝子座に連鎖する新規ＤＮＡマーカーを開発し、新品種・系統の開発に活用することが有効な手法と考えられる。
【０００５】
イタリアンライグラスは、国内で重要な寒地型牧草である。冠さび病は、担子菌類（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔａ ｆ．ｓｐ．ｌｏｌｉｉ）より引き起こされ、感染すると収量及び品質の低下等を引き起こす重要病害である。イタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子は、主働遺伝子として働くものが連鎖群２，４，７にあることが知られている（非特許文献１〜５）。しかし、既知の冠さび病抵抗性遺伝子だけでは必ずしも十分ではなく、既知の冠さび病抵抗性遺伝子とは別の遺伝子座にある、新しい冠さび病抵抗性遺伝子についての知見が求められていた。
【０００６】
【非特許文献１】育種学研究４（別２）２００２、ｐ２４５「イタリアンライグラスにおける冠さび病抵抗性遺伝子の連鎖解析」藤森雅博、林克江、水野和彦、藤原健、平田球子、秋山典昭、間野吉郎、小松敏憲、高溝正
【非特許文献２】育種学研究６（別１）２００４、ｐ３００「イタリアンライグラスにおける新規冠さび病抵抗性遺伝子（Ｐｃ３）の同定」藤森雅博、平田球子、間野吉郎、佐藤広子、高溝正
【非特許文献３】育種学研究７（別１・２）２００５、ｐ４５８「イタリアンライグラス品種Ａｘｉｓからの冠さび病抵抗性遺伝子の同定」清多佳子、平田球子、高溝正、佐藤広子、間野吉郎、藤森雅博
【非特許文献４】日草誌第５２巻別１号（２００６）Ｐ１８６−１８７「イタリアンライグラスの品種「ワセアオバ」で同定された主働抵抗性遺伝子」清多佳子、平田球子、佐藤広子、大浦康子、高溝正、藤森雅博
【非特許文献５】日草誌第５２巻別２号（２００６）Ｐ２６８−２６９「イタリアンライグラス品種「Ｔｏｂｕ」から同定した冠さび病抵抗性主働遺伝子」清多佳子、平田球子、大浦康子、高溝正、藤森雅博
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、既知の冠さび病抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーに加え、他の抵抗性遺伝子座に連鎖する新規ＤＮＡマーカーを見出すことを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、既知の遺伝子座とは別の遺伝子座にある新規の冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）を見出すと共に、その抵抗性の強さは、既知のものと同程度に強いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、既知の冠さび病抵抗性遺伝子だけでは網羅しきれなかったＤＮＡマーカー利用技術について、新規の冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカー利用技術、その増幅産物サイズによる抵抗性遺伝子の検出方法及び冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体の選抜方法等を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット。
（２）上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭ以内で連鎖するＤＮＡマーカーを検出する、前記（１）に記載のプライマーセット。
（３）配列番号１〜２のＦプライマー及び配列番号３〜４のＲプライマーのプライマー対からなる、前記（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）上記冠さび病抵抗性遺伝子に２．５ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（１７−１２Ｈ）を検出する、前記（２）に記載のプライマーセット。
（５）上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（Ｓ３９３Ｄ１）を検出する、前記（２）に記載のプライマーセット。
（６）前記（１）から（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出することを特徴とする抵抗性を示す増幅産物の検出方法。
（７）前記（６）に記載の検出方法を用いて、冠さび病抵抗性を示す増幅産物を有する個体を検出し、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とする冠さび病抵抗性品種の選抜方法。
（８）前記（７）に記載の選抜方法で選抜し、作出した、冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２を持つことを特徴とする冠さび病抵抗性植物。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセットの点に特徴を有するものである。また、本発明は、抵抗性を示す増幅産物を検出する方法であって、上記プライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅等の遺伝子増幅反応を行い、増幅産物の増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出することを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明は、冠さび病抵抗性品種を選抜する方法であって、上記検出方法を用いて、冠さび病抵抗性を示す増幅産物を有する個体を検出し、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とするものである。更に、本発明は、上記選抜方法で選抜し、作出したことを特徴とする冠さび病抵抗性植物の点に特徴を有するものである。
【００１２】
本発明では、イタリアンライグラス品種「はるかぜ」から冠さび病抵抗性でかつ既知の抵抗性遺伝子近傍マーカーを持たない個体を選抜した。もう一方で、イタリアンライグラス品種「ワセアオバ」から冠さび病感受性の個体を選抜し、両者を単交配することにより解析集団を作成した。この解析集団について、ＳＳＲマーカー（Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））を用いて解析を行い、冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）が連鎖群ＬＧ４に座乗することを特定した。
【００１３】
更に、連鎖群ＬＧ４には、冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃ１が座乗することから、ＬｍＰｃ１と上記により特定した抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）との両者に共通であるＳＳＲマーカーについて、両抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃ１とＬｍＰｃＨ２２）までの位置・距離から、ＬｍＰｃ１と上記により特定した抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）は、別の遺伝子座にあることを確認した。
【００１４】
すなわち、本発明により、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、ＬＧ４に座乗する抵抗性遺伝子のうちの一つ（ＬｍＰｃＨ２２）に、ＤＮＡマーカー（ＳＳＲマーカー：１７−１２Ｈ）が２．５ｃＭで連鎖すること、また、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、ＬＧ４に座乗する抵抗性遺伝子のうちの一つ（ＬｍＰｃＨ２２）に、ＤＮＡマーカー（ＳＳＲマーカー：Ｓ３９３Ｄ１）が４．４ｃＭで連鎖すること、が判明した。
【００１５】
そして、上記ＳＳＲマーカー（１７−１２Ｈ）を用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ等の遺伝子増幅反応で増幅したバンドから抵抗性を判定する増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）が得られ、また、同様に、ＳＳＲマーカー（Ｓ３９３Ｄ１）を用いて増幅したバンドから抵抗性遺伝子を検出するためのマーカーの増幅産物のサイズが得られた。
【００１６】
それにより、上記ＳＳＲマーカーを用いたＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応法から冠さび病抵抗性に連鎖する増幅産物のサイズを識別する方法、及び冠さび病抵抗性を有する植物個体を選抜する方法、を構築することに成功した。
【００１７】
本発明は、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカーについて、冠さび病抵抗性に関わる増幅産物のサイズの判定を可能とするものである。
【００１８】
上記のＤＮＡマーカーの増幅産物のサイズ判定に用いるゲノムＤＮＡの抽出には、特別な制約はなく、植物の葉片からのＤＮＡ抽出で一般的に用いられるＣＴＡＢ法などを必要に応じて改変して行えばよい。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることもできる。また、ＤＮＡマーカーのＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲの条件は、後記する実施例に例示しているが、これらに限定されるものではなく、プライマーの組み合わせや使用機器に合わせて適宜変更することができる。同様に、電気泳動条件も使用機器に合わせて変更可能である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、新規冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを利用した冠さび病抵抗性遺伝子の検出方法を提供することができる。
（２）上記冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。
（３）上記ＤＮＡマーカーに基づいて、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法を構築することができる。
（４）上記選抜方法により選抜、作出した冠さび病抵抗性イネ科植物を提供することができる。
（５）本発明により提供されるイタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカーのプライマー組み合わせを用いて、冠さび病抵抗性を判定することにより、これまでに選抜することのできなかった冠さび病抵抗性個体を選抜することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、実施例に基づいて本発明の検出法について具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
（１）解析集団
冠さび病抵抗性の主働遺伝子を特定するために、品種「はるかぜ」のうち冠さび病抵抗性個体と品種「ワセアオバ」の冠さび病感受性個体を単交配した。このＦ１（１２４個体）について、冠さび病検定を２回行い、抵抗性と感受性がおよそ１：１に分離した。
【００２２】
（２）連鎖地図作製
上記（１）で作成したＦ１のＤＮＡについて、バルク法を用いて３５７対のＳＳＲマーカー（Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））からスクリーニングを行い、抵抗性バルクと感受性バルクとの間に差の見られたマーカーについて、Ｆ１（９４個体）を用いて、個体別解析を行った。ＳＳＲマーカーのプライマーには、ＦＡＭ蛍光標識されたものを用い、このＰＣＲ反応条件は、次の条件で行った。
【００２３】
反応条件：１）９５℃ １０分、２）９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分 ３５サイクル、３）７２℃ ７分。電気泳動においては、ＤＮＡシーケンシング用電気泳動装置ＥＰ６１００（タカラバイオ社製）で泳動した後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社製）で検出、又はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドシステムズ社製）を用いて泳動、検出した。
【００２４】
上記の多型解析結果から、連鎖解析ソフトＪｏｉｎＭａｐ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７３９−７４４（１９９３））を用いて連鎖解析を行い、連鎖地図を作成し、新規の冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）を発見した（図１）。
【００２５】
抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍に連鎖したマーカーは、１．８ｃＭに１７−１２Ｈ（図２）、３．９ｃＭにＳ３９３Ｄ１（図３）があり、それぞれ抵抗性に特徴的な増幅サイズ（３０２ｂｐと２１０ｂｐ）を示している。
【００２６】
これらのマーカーのプライマー組み合わせについては、１７−１２Ｈ Ｆ：５’−ＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’及び１７−１２Ｈ Ｒ：５’−ＧＣＣＧＴＧＣＧＴＡＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡ−３’を設計した。また、Ｓ３９３Ｄ１ Ｆ：５’− ＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＴＧＣ−３’及びＳ３９３Ｄ１ Ｒ：５’−ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡ−３’を設計した。この結果から、これらのマーカーは、抵抗性個体を選抜するために有望なマーカーであると考えられた。
【００２７】
また、ＬｍＰｃＨ２２は、図１に示すとおり、１７−１２Ｈと２−５Ａ間の距離２５．４ｃＭのうち１７−１２Ｈと１．８ｃＭの位置にあり、ＬｍＰｃ１は、図４に示すとおり、１７−１２Ｈと２−５Ａ間の距離２１．８ｃＭのうち２−５Ａと３．６ｃＭの位置にある。これらのことから、この抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）は、同連鎖群に同定されている既知の冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃ１とは別の遺伝子座であると考えられる。
【００２８】
また、ＬｍＰｃ１は、イタリアンライグラス系統「山育１３０号」（約９割が抵抗性の系統）から発見されており、本発明で発見した抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍マーカー１７−１２Ｈ及びＳ３９３Ｄ１の遺伝子型は「山育１３０号」のほとんどの個体が持っていないこと（図５及び図６）からも、ＬｍＰｃＨ２２とＬｍＰｃ１は別の遺伝子座であると考えられ、ＬｍＰｃＨ２２は、新規の冠さび病抵抗性遺伝子であると結論した。
【００２９】
図１に、本発明で見出した冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）の連鎖地図を示す。冠さび病抵抗性遺伝子のみ斜体・太字で示した。図２に、抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と１．８ｃＭで連鎖した１７−１２ＨのＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。“抵抗性→”で示した３０２ｂｐのバンドが抵抗性を示す増幅サイズである。図上部両端の“Ｍ”は、サイズマーカーを示し、左から抵抗性親、感受性親、抵抗性Ｆ１２３個体、感受性Ｆ１２３個体である。
【００３０】
図３に、抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と３．９ｃＭで連鎖したＳ３９３Ｄ１のＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。“抵抗性→”で示した２１０ｂｐのバンドが抵抗性を示す増幅サイズである。左から抵抗性親、感受性親、抵抗性Ｆ１４７個体、感受性Ｆ１４７個体である。図４に、冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃ１）の連鎖地図を比較した図を示す。ＬｍＰｃ１の連鎖地図は、必要なマーカーだけを示した簡略図である。両抵抗性遺伝子が異なることを分かり易く示すために、両者に共通のＳＳＲマーカーを線で結んだ。
【００３１】
図５に、山育１３０号３６個体について、１７−１２Ｈの増幅サイズを調査した一例を示す。図上部両端の“Ｍ”は、サイズマーカーを示し、左から抵抗性親、感受性親、山育１３０号３６個体である。“→”で示した３０２ｂｐの抵抗性を示すバンドが、山育１３０号では全く見られない。
【００３２】
図６に、山育１３０号３６個体について、Ｓ３９３Ｄ１の増幅サイズを調査した一例を示す。図上部両端の“Ｍ”は、サイズマーカーを示し、左から抵抗性親、感受性親、山育１３０号３６個体である。“→”で示した２１０ｂｐの抵抗性を示すバンドが、山育１３０号ではほとんど見られない。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上詳述したように、本発明は、冠さび病抵抗性イネ科植物の選抜法に係るものであり、本発明により、新規の冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、上記ＤＮＡマーカーを利用した新しい冠さび病抵抗性遺伝子の検出方法、抵抗性を示す個体の選抜方法及び該方法によって選抜、作出された冠さび病抵抗性イネ科植物を提供することができる。本発明は、新たに見出された連鎖群ＬＣ４に座乗する冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖する新しいＤＮＡマーカーを利用することで、従来法では選抜することができなかった冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを可能とする新しい選抜手法を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明で見出した冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）の連鎖地図を示す。
【図２】抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と１．８ｃＭで連鎖した１７−１２ＨのＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。
【図３】抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と３．９ｃＭで連鎖したＳ３９３Ｄ１のＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。
【図４】冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃ１）の連鎖地図を比較した図を示す。
【図５】山育１３０号３６個体について、１７−１２Ｈの増幅サイズを調査した一例を示す。
【図６】山育１３０号３６個体について、Ｓ３９３Ｄ１の増幅サイズを調査した一例を示す。
【図７】本発明のプライマーの塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子の一つ（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカーを利用した冠さび病抵抗性個体の検出方法に関するものであり、更に詳しくは、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、該プライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、抵抗性を示す増幅断片を検出する方法、その増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法等に関するものである。本発明は、上記ＤＮＡマーカーを利用して冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体の選抜方法及びその冠さび病抵抗性イネ科植物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡマーカーを指標として優良個体を選抜するマーカー選抜法が開発され、実際の育種に利用できるようになった。マーカー選抜法では、ＤＮＡマーカーにより遺伝子型を確認することで目的形質の有無を直接観察せずに判別できることから、幼苗の段階で迅速かつ確実に優良な個体を選抜することが可能となる。このことは、マーカー選抜法を活用することにより、育種に要する労力及び年月の短縮が可能になることを意味する。
【０００３】
イネ科植物では、これまで、イネ科植物の病害に対して抵抗性を示す抵抗性遺伝子を持つ系統が作出されているが、単一の抵抗性遺伝子を持つ系統を栽培すると病菌のレース分化により抵抗性が打破される現象が頻繁に生じることが知られている。この現象の対策として、栽培する系統に複数の抵抗性遺伝子を集積することや、異なる抵抗性遺伝子を持つ同質遺伝子系統を混合したものを栽培する手法が開発されている。
【０００４】
イタリアンライグラスの冠さび病についても、複数の抵抗性遺伝子を集積したり、異なる抵抗性遺伝子を持つ同質遺伝子系統を混合したものを開発することが重要であると考えられる。そのためには、既知の冠さび病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーに加え、他の抵抗性遺伝子座に連鎖する新規ＤＮＡマーカーを開発し、新品種・系統の開発に活用することが有効な手法と考えられる。
【０００５】
イタリアンライグラスは、国内で重要な寒地型牧草である。冠さび病は、担子菌類（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔａ ｆ．ｓｐ．ｌｏｌｉｉ）より引き起こされ、感染すると収量及び品質の低下等を引き起こす重要病害である。イタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子は、主働遺伝子として働くものが連鎖群２，４，７にあることが知られている（非特許文献１〜５）。しかし、既知の冠さび病抵抗性遺伝子だけでは必ずしも十分ではなく、既知の冠さび病抵抗性遺伝子とは別の遺伝子座にある、新しい冠さび病抵抗性遺伝子についての知見が求められていた。
【０００６】
【非特許文献１】育種学研究４（別２）２００２、ｐ２４５「イタリアンライグラスにおける冠さび病抵抗性遺伝子の連鎖解析」藤森雅博、林克江、水野和彦、藤原健、平田球子、秋山典昭、間野吉郎、小松敏憲、高溝正
【非特許文献２】育種学研究６（別１）２００４、ｐ３００「イタリアンライグラスにおける新規冠さび病抵抗性遺伝子（Ｐｃ３）の同定」藤森雅博、平田球子、間野吉郎、佐藤広子、高溝正
【非特許文献３】育種学研究７（別１・２）２００５、ｐ４５８「イタリアンライグラス品種Ａｘｉｓからの冠さび病抵抗性遺伝子の同定」清多佳子、平田球子、高溝正、佐藤広子、間野吉郎、藤森雅博
【非特許文献４】日草誌第５２巻別１号（２００６）Ｐ１８６−１８７「イタリアンライグラスの品種「ワセアオバ」で同定された主働抵抗性遺伝子」清多佳子、平田球子、佐藤広子、大浦康子、高溝正、藤森雅博
【非特許文献５】日草誌第５２巻別２号（２００６）Ｐ２６８−２６９「イタリアンライグラス品種「Ｔｏｂｕ」から同定した冠さび病抵抗性主働遺伝子」清多佳子、平田球子、大浦康子、高溝正、藤森雅博
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、既知の冠さび病抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーに加え、他の抵抗性遺伝子座に連鎖する新規ＤＮＡマーカーを見出すことを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、既知の遺伝子座とは別の遺伝子座にある新規の冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）を見出すと共に、その抵抗性の強さは、既知のものと同程度に強いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、既知の冠さび病抵抗性遺伝子だけでは網羅しきれなかったＤＮＡマーカー利用技術について、新規の冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカー利用技術、その増幅産物サイズによる抵抗性遺伝子の検出方法及び冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体の選抜方法等を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット。
（２）上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭ以内で連鎖するＤＮＡマーカーを検出する、前記（１）に記載のプライマーセット。
（３）配列番号１〜２のＦプライマー及び配列番号３〜４のＲプライマーのプライマー対からなる、前記（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）上記冠さび病抵抗性遺伝子に２．５ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（１７−１２Ｈ）を検出する、前記（２）に記載のプライマーセット。
（５）上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（Ｓ３９３Ｄ１）を検出する、前記（２）に記載のプライマーセット。
（６）前記（１）から（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出することを特徴とする抵抗性を示す増幅産物の検出方法。
（７）前記（６）に記載の検出方法を用いて、冠さび病抵抗性を示す増幅産物を有する個体を検出し、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とする冠さび病抵抗性品種の選抜方法。
（８）前記（７）に記載の選抜方法で選抜し、作出した、冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２を持つことを特徴とする冠さび病抵抗性植物。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセットの点に特徴を有するものである。また、本発明は、抵抗性を示す増幅産物を検出する方法であって、上記プライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅等の遺伝子増幅反応を行い、増幅産物の増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出することを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明は、冠さび病抵抗性品種を選抜する方法であって、上記検出方法を用いて、冠さび病抵抗性を示す増幅産物を有する個体を検出し、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とするものである。更に、本発明は、上記選抜方法で選抜し、作出したことを特徴とする冠さび病抵抗性植物の点に特徴を有するものである。
【００１２】
本発明では、イタリアンライグラス品種「はるかぜ」から冠さび病抵抗性でかつ既知の抵抗性遺伝子近傍マーカーを持たない個体を選抜した。もう一方で、イタリアンライグラス品種「ワセアオバ」から冠さび病感受性の個体を選抜し、両者を単交配することにより解析集団を作成した。この解析集団について、ＳＳＲマーカー（Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））を用いて解析を行い、冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）が連鎖群ＬＧ４に座乗することを特定した。
【００１３】
更に、連鎖群ＬＧ４には、冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃ１が座乗することから、ＬｍＰｃ１と上記により特定した抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）との両者に共通であるＳＳＲマーカーについて、両抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃ１とＬｍＰｃＨ２２）までの位置・距離から、ＬｍＰｃ１と上記により特定した抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）は、別の遺伝子座にあることを確認した。
【００１４】
すなわち、本発明により、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、ＬＧ４に座乗する抵抗性遺伝子のうちの一つ（ＬｍＰｃＨ２２）に、ＤＮＡマーカー（ＳＳＲマーカー：１７−１２Ｈ）が２．５ｃＭで連鎖すること、また、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、ＬＧ４に座乗する抵抗性遺伝子のうちの一つ（ＬｍＰｃＨ２２）に、ＤＮＡマーカー（ＳＳＲマーカー：Ｓ３９３Ｄ１）が４．４ｃＭで連鎖すること、が判明した。
【００１５】
そして、上記ＳＳＲマーカー（１７−１２Ｈ）を用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ等の遺伝子増幅反応で増幅したバンドから抵抗性を判定する増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）が得られ、また、同様に、ＳＳＲマーカー（Ｓ３９３Ｄ１）を用いて増幅したバンドから抵抗性遺伝子を検出するためのマーカーの増幅産物のサイズが得られた。
【００１６】
それにより、上記ＳＳＲマーカーを用いたＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応法から冠さび病抵抗性に連鎖する増幅産物のサイズを識別する方法、及び冠さび病抵抗性を有する植物個体を選抜する方法、を構築することに成功した。
【００１７】
本発明は、イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカーについて、冠さび病抵抗性に関わる増幅産物のサイズの判定を可能とするものである。
【００１８】
上記のＤＮＡマーカーの増幅産物のサイズ判定に用いるゲノムＤＮＡの抽出には、特別な制約はなく、植物の葉片からのＤＮＡ抽出で一般的に用いられるＣＴＡＢ法などを必要に応じて改変して行えばよい。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることもできる。また、ＤＮＡマーカーのＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲの条件は、後記する実施例に例示しているが、これらに限定されるものではなく、プライマーの組み合わせや使用機器に合わせて適宜変更することができる。同様に、電気泳動条件も使用機器に合わせて変更可能である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、新規冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを利用した冠さび病抵抗性遺伝子の検出方法を提供することができる。
（２）上記冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。
（３）上記ＤＮＡマーカーに基づいて、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法を構築することができる。
（４）上記選抜方法により選抜、作出した冠さび病抵抗性イネ科植物を提供することができる。
（５）本発明により提供されるイタリアンライグラスの冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）に連鎖するＤＮＡマーカーのプライマー組み合わせを用いて、冠さび病抵抗性を判定することにより、これまでに選抜することのできなかった冠さび病抵抗性個体を選抜することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、実施例に基づいて本発明の検出法について具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
（１）解析集団
冠さび病抵抗性の主働遺伝子を特定するために、品種「はるかぜ」のうち冠さび病抵抗性個体と品種「ワセアオバ」の冠さび病感受性個体を単交配した。このＦ１（１２４個体）について、冠さび病検定を２回行い、抵抗性と感受性がおよそ１：１に分離した。
【００２２】
（２）連鎖地図作製
上記（１）で作成したＦ１のＤＮＡについて、バルク法を用いて３５７対のＳＳＲマーカー（Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））からスクリーニングを行い、抵抗性バルクと感受性バルクとの間に差の見られたマーカーについて、Ｆ１（９４個体）を用いて、個体別解析を行った。ＳＳＲマーカーのプライマーには、ＦＡＭ蛍光標識されたものを用い、このＰＣＲ反応条件は、次の条件で行った。
【００２３】
反応条件：１）９５℃ １０分、２）９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分 ３５サイクル、３）７２℃ ７分。電気泳動においては、ＤＮＡシーケンシング用電気泳動装置ＥＰ６１００（タカラバイオ社製）で泳動した後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社製）で検出、又はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドシステムズ社製）を用いて泳動、検出した。
【００２４】
上記の多型解析結果から、連鎖解析ソフトＪｏｉｎＭａｐ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７３９−７４４（１９９３））を用いて連鎖解析を行い、連鎖地図を作成し、新規の冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）を発見した（図１）。
【００２５】
抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍に連鎖したマーカーは、１．８ｃＭに１７−１２Ｈ（図２）、３．９ｃＭにＳ３９３Ｄ１（図３）があり、それぞれ抵抗性に特徴的な増幅サイズ（３０２ｂｐと２１０ｂｐ）を示している。
【００２６】
これらのマーカーのプライマー組み合わせについては、１７−１２Ｈ Ｆ：５’−ＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’及び１７−１２Ｈ Ｒ：５’−ＧＣＣＧＴＧＣＧＴＡＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡ−３’を設計した。また、Ｓ３９３Ｄ１ Ｆ：５’− ＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＴＧＣ−３’及びＳ３９３Ｄ１ Ｒ：５’−ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡ−３’を設計した。この結果から、これらのマーカーは、抵抗性個体を選抜するために有望なマーカーであると考えられた。
【００２７】
また、ＬｍＰｃＨ２２は、図１に示すとおり、１７−１２Ｈと２−５Ａ間の距離２５．４ｃＭのうち１７−１２Ｈと１．８ｃＭの位置にあり、ＬｍＰｃ１は、図４に示すとおり、１７−１２Ｈと２−５Ａ間の距離２１．８ｃＭのうち２−５Ａと３．６ｃＭの位置にある。これらのことから、この抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）は、同連鎖群に同定されている既知の冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃ１とは別の遺伝子座であると考えられる。
【００２８】
また、ＬｍＰｃ１は、イタリアンライグラス系統「山育１３０号」（約９割が抵抗性の系統）から発見されており、本発明で発見した抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）近傍マーカー１７−１２Ｈ及びＳ３９３Ｄ１の遺伝子型は「山育１３０号」のほとんどの個体が持っていないこと（図５及び図６）からも、ＬｍＰｃＨ２２とＬｍＰｃ１は別の遺伝子座であると考えられ、ＬｍＰｃＨ２２は、新規の冠さび病抵抗性遺伝子であると結論した。
【００２９】
図１に、本発明で見出した冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）の連鎖地図を示す。冠さび病抵抗性遺伝子のみ斜体・太字で示した。図２に、抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と１．８ｃＭで連鎖した１７−１２ＨのＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。“抵抗性→”で示した３０２ｂｐのバンドが抵抗性を示す増幅サイズである。図上部両端の“Ｍ”は、サイズマーカーを示し、左から抵抗性親、感受性親、抵抗性Ｆ１２３個体、感受性Ｆ１２３個体である。
【００３０】
図３に、抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と３．９ｃＭで連鎖したＳ３９３Ｄ１のＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。“抵抗性→”で示した２１０ｂｐのバンドが抵抗性を示す増幅サイズである。左から抵抗性親、感受性親、抵抗性Ｆ１４７個体、感受性Ｆ１４７個体である。図４に、冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃ１）の連鎖地図を比較した図を示す。ＬｍＰｃ１の連鎖地図は、必要なマーカーだけを示した簡略図である。両抵抗性遺伝子が異なることを分かり易く示すために、両者に共通のＳＳＲマーカーを線で結んだ。
【００３１】
図５に、山育１３０号３６個体について、１７−１２Ｈの増幅サイズを調査した一例を示す。図上部両端の“Ｍ”は、サイズマーカーを示し、左から抵抗性親、感受性親、山育１３０号３６個体である。“→”で示した３０２ｂｐの抵抗性を示すバンドが、山育１３０号では全く見られない。
【００３２】
図６に、山育１３０号３６個体について、Ｓ３９３Ｄ１の増幅サイズを調査した一例を示す。図上部両端の“Ｍ”は、サイズマーカーを示し、左から抵抗性親、感受性親、山育１３０号３６個体である。“→”で示した２１０ｂｐの抵抗性を示すバンドが、山育１３０号ではほとんど見られない。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上詳述したように、本発明は、冠さび病抵抗性イネ科植物の選抜法に係るものであり、本発明により、新規の冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、上記ＤＮＡマーカーを利用した新しい冠さび病抵抗性遺伝子の検出方法、抵抗性を示す個体の選抜方法及び該方法によって選抜、作出された冠さび病抵抗性イネ科植物を提供することができる。本発明は、新たに見出された連鎖群ＬＣ４に座乗する冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖する新しいＤＮＡマーカーを利用することで、従来法では選抜することができなかった冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを可能とする新しい選抜手法を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明で見出した冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）の連鎖地図を示す。
【図２】抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と１．８ｃＭで連鎖した１７−１２ＨのＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。
【図３】抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と３．９ｃＭで連鎖したＳ３９３Ｄ１のＦ１集団の増幅サイズ調査の一例を示す。
【図４】冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃＨ２２）と冠さび病抵抗性遺伝子（ＬｍＰｃ１）の連鎖地図を比較した図を示す。
【図５】山育１３０号３６個体について、１７−１２Ｈの増幅サイズを調査した一例を示す。
【図６】山育１３０号３６個体について、Ｓ３９３Ｄ１の増幅サイズを調査した一例を示す。
【図７】本発明のプライマーの塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット。
【請求項２】
上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭ以内で連鎖するＤＮＡマーカーを検出する、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１〜２のＦプライマー及び配列番号３〜４のＲプライマーのプライマー対からなる、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
上記冠さび病抵抗性遺伝子に２．５ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（１７−１２Ｈ）を検出する、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（Ｓ３９３Ｄ１）を検出する、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出することを特徴とする抵抗性を示す増幅産物の検出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の検出方法を用いて、冠さび病抵抗性を示す増幅産物を有する個体を検出し、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とする冠さび病抵抗性品種の選抜方法。
【請求項８】
請求項７に記載の選抜方法で選抜し、作出した、冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２を持つことを特徴とする冠さび病抵抗性植物。
【請求項１】
イタリアンライグラス冠さび病抵抗性遺伝子のうち、連鎖群ＬＧ４に座乗するＬｍＰｃＨ２２近傍に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット。
【請求項２】
上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭ以内で連鎖するＤＮＡマーカーを検出する、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１〜２のＦプライマー及び配列番号３〜４のＲプライマーのプライマー対からなる、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
上記冠さび病抵抗性遺伝子に２．５ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（１７−１２Ｈ）を検出する、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
上記冠さび病抵抗性遺伝子に４．４ｃＭで連鎖するＤＮＡマーカー（Ｓ３９３Ｄ１）を検出する、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の増幅断片に基づいて冠さび病抵抗性を示す増幅産物のサイズ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を検出することを特徴とする抵抗性を示す増幅産物の検出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の検出方法を用いて、冠さび病抵抗性を示す増幅産物を有する個体を検出し、冠さび病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とする冠さび病抵抗性品種の選抜方法。
【請求項８】
請求項７に記載の選抜方法で選抜し、作出した、冠さび病抵抗性遺伝子ＬｍＰｃＨ２２を持つことを特徴とする冠さび病抵抗性植物。
【図１】
【図４】
【図７】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図４】
【図７】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２３７１７４（Ｐ２００８−２３７１７４Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８６０７３（Ｐ２００７−８６０７３）
【出願日】平成１９年３月２８日（２００７．３．２８）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２８日（２００７．３．２８）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
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