冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）及びその菌糸体培養液から抽出される成分を含有する抗ガン作用を有する組成物並びに該抗ガン作用を有する組成物を含有する食品及び薬品
【課題】 本発明は、冬虫夏草（Cordyceps）及びその菌糸体培養液から抽出される成分を含有する抗ガン作用を有する組成物を日常的に摂取できる食品に配合することにより、もしくはそれら成分を含有する組成物を薬品に配合することにより、ガンを予防又は改善することを目的としてなされたものである。
【解決手段】 冬虫夏草（Cordyceps）及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出し、次いで前記冬虫夏草及び／又は前記その菌糸体培養液、又はそれらの熱水抽出液を含水アルコール抽出し、次いでこの含水アルコール抽出液を所定条件の逆相カラムクロマトグラフィーに供して粗分画し得られる画分のうち、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）に含まれる成分を含有する抗ガン作用を有する組成物とすることにより、ガンを予防又は改善することができる。
【解決手段】 冬虫夏草（Cordyceps）及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出し、次いで前記冬虫夏草及び／又は前記その菌糸体培養液、又はそれらの熱水抽出液を含水アルコール抽出し、次いでこの含水アルコール抽出液を所定条件の逆相カラムクロマトグラフィーに供して粗分画し得られる画分のうち、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）に含まれる成分を含有する抗ガン作用を有する組成物とすることにより、ガンを予防又は改善することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冬虫夏草（Cordyceps）及びその菌糸体培養液から抽出される成分を含有する抗ガン作用を有する組成物並びに該抗ガン作用を有する組成物を含有する食品及び薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、日本での死亡原因の第１位であり、老化と共に自然に発生してくる病気である。しかし、ガンは食事やライフスタイルを改善することによりある程度予防できる病気でもある。近年、様々な食品の抗ガン作用が研究され、食品中に含まれる抗ガン物質が特定されてきている。しかし、抗ガン物質が含まれている食品を摂取することにより、ガンを予防するには、その食品を大量に摂取する必要があり、現実的ではない。そこで、食品等に配合することができる抗ガン作用を有する化合物が望まれている。
【０００３】
抗ガン作用を有する化合物としては、腫瘍細胞の核酸合成を阻害する核酸塩基を修飾したフルオロウラシル等が知られ、さらに、核酸塩基金属塩として、ウラシルの６位にゲルマニウムが結合した核酸塩基金属塩も知られている（特許文献１）。しかしながら、フルオロウラシル等の抗ガン剤は、副作用が強く、又、ゲルマニウムは毒性が強いという問題を有しており、食品等に配合するのは困難である。
【０００４】
これに対して、中国古来の漢方薬として用いられてきた冬虫夏草や、ウコン等は、様々な薬理効果があるとともに安全なものであることから、近年注目を浴びている。漢方薬として珍重されてきた冬虫夏草は、コウモリガ科の蛾の幼虫に寄生して成長するバッカクキン科冬虫夏草属（Cordyceps）の菌種の一種であり、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布している。この冬虫夏草は、医薬品、医薬部外品、飲食物としての利用が進んできている。
【０００５】
冬虫夏草の薬理効果としては、冬虫夏草を抽出して得られた抽出物が、免疫賦活効果、抗腫瘍性効果、血糖値降下作用、血圧降下作用、アポトーシス誘導機能を有することが従来知られており、当該抽出物を免疫賦活やガンの予防又は治療を目的として医薬品、医薬部外品、飲食物とすることも知られている（特許文献２参照）。しかしながら、冬虫夏草からの抽出物では、有効成分の均一性を確保するのが困難であり、安定的な効果を得られないという問題があった。
【０００６】
この問題を解決するために、特許文献３では、冬虫夏草から有効成分を単離し、その成分を用いて、エリテマトーデス性腎炎及び／又はＩｇＡ腎炎を予防及び／又は治療するための方法が開示されている。しかしながら、冬虫夏草中のコルジセピンが抗ガン作用を有することが開示されているが、冬虫夏草の他の成分を含有する抗ガン作用を有する組成物については、開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭５９−３５９１８号公報
【特許文献２】特開２００５−３５９２８号公報
【特許文献３】特許第３８２３０３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記問題を解決すべくなされたものであって、冬虫夏草（Cordyceps）及びその菌糸体培養液から抽出される成分を含有する抗ガン作用を有する組成物を日常的に摂取することができる食品に配合することにより、もしくはそれら成分を含有する組成物を薬品に配合することにより、ガンを予防又は改善することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１に係る発明は、冬虫夏草（Cordyceps）及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出し、次いで前記冬虫夏草及び／又は前記その菌糸体培養液、又はそれらの熱水抽出液を含水アルコール抽出し、次いでこの含水アルコール抽出液を下記条件の逆相カラムクロマトグラフィーに供して粗分画し得られる画分のうち、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）に含まれる成分を含有する抗ガン作用を有する組成物に関する。
カラム：ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）；
移動相：Ａ １％ギ酸水溶液、Ｂ メタノール；
グラジエント：Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配；
流速：１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎ
【００１０】
請求項２に係る発明は、請求項１で得られた前記画分Ｆ２−４を下記条件のＨＰＬＣに供して得られた画分のうち、リテンションタイム４．４〜４．９分の抽出画分Ａ及び／又はリテンションタイム５．０〜５．５分の抽出画分Ｂに含まれる成分を含有する請求項１記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
カラム：コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ ４．６×２５０ｍｍ；
移動相：Ａ ０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、Ｂ ３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７
グラジエント：０分 Ａ（１００％）／Ｂ（０％）→２５分 Ａ（０％）／Ｂ（１００％）→３５分まで Ａ（０％）／Ｂ（１００％）保持
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
検出：ＵＶ検出器 波長２５４ｎｍ
【００１１】
請求項３に係る発明は、前記画分Ｆ２−４が、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含むことからなることを特徴とする請求項１又は２記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１２】
請求項４に係る発明は、前記核酸塩基アルカリ金属塩及び前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の金属塩からなることを特徴とする請求項３記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１３】
請求項５に係る発明は、前記核酸塩基誘導体が、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の誘導体からなることを特徴とする請求項３又は４記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１４】
請求項６に係る発明は、前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、核酸塩基マグネシウム塩であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１５】
請求項７に係る発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする食品に関する。
【００１６】
請求項８に係る発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする薬品に関する。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１及び２に係る発明によれば、冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出された成分は安全であるので、この成分を含有する組成物は毎日摂取することができ、これにより日常的に腫瘍細胞の増殖を抑制し、ガンを予防又は改善することができる。
【００１８】
請求項３に係る発明によれば、請求項１又は２記載の組成物において、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００１９】
請求項４に係る発明によれば、請求項３記載の組成物において、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の核酸塩基アルカリ金属塩及び核酸塩基アルカリ土類金属塩を含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００２０】
請求項５に係る発明によれば、請求項３又は４記載の組成物において、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の核酸塩基誘導体を含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００２１】
請求項６に係る発明によれば、請求項３乃至５のいずれかに記載の組成物において、核酸塩基マグネシウム塩を含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００２２】
請求項７に係る発明によれば、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする食品であるので、安全性の高い抗ガン作用を有する組成物を毎日簡便に摂取することができることから、効率良く日常的にガンを予防又は改善することができる。
【００２３】
請求項８に係る発明によれば、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする薬品であるので、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】培養サナギタケ菌糸体の各分画部の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。
【図２】培養サナギタケ菌糸体のメタノール抽出画分のクロマトグラムである。
【図３】図２のクロマトグラムの画分Ｆ２−４の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。
【図４】画分Ｆ２−４のＨＰＬＣクロマトグラムと標準品のＨＰＬＣクロマトグラムを比較した図である。
【図５】図４のピークＢの化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果である。
【図６】図４のピークＢの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】図４のピークＢの化合物のＩＣＰ−ＭＳ分析結果である。
【図８】図４のピークＡの化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果である。
【図９】図４のピークＡの化合物のＩＲ分析結果である。
【図１０】図４のピークＡの化合物のＵＶ分析結果である。
【図１１】図４のピークＡの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２】図４のピークＡの化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１３】図４のピークＡ及びＢの化合物のＨＬ６０に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る組成物は、冬虫夏草及びその菌糸体培養液に含まれている抗ガン作用を有する成分を含有する組成物である。以下に、冬虫夏草から抽出された成分を含有する組成物について詳述する。
【００２６】
冬虫夏草とは、コウモリガ科の蛾の幼虫に寄生して成長するバッカクキン科冬虫夏草属（Cordyceps）の菌種の一種であり、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布している。これまで、中国古来の漢方薬として、用いられており、非常に高価なものとして珍重されている。
【００２７】
冬虫夏草の薬理効果としては、冬虫夏草を抽出して得られた抽出物が、免疫賦活効果、抗腫瘍性効果、血糖値降下作用、血圧降下作用、アポトーシス誘導機能を有することが知られており、当該抽出物は免疫賦活やガンの予防又は治療を目的として用いられている。
【００２８】
本発明で用いられる冬虫夏草としては、冬虫夏草乾燥物、冬虫夏草抽出物及び培養サナギダケ菌糸体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で用いられる冬虫夏草の菌糸体培養液としては、サナギタケ菌糸体培養液が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
冬虫夏草及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出する。特に、冬虫夏草の菌糸体培養液を用いる際には熱水抽出を行うのが好ましい。有効成分の抽出には、熱水抽出液のほうを使用する。
【００３０】
冬虫夏草及び／又はその菌糸体培養液、又は上記熱水抽出液を抽出する。
抽出溶媒としては、含水アルコールを用いる。
アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコールを挙げることができ、メタノールが好適に使用される。
【００３１】
抽出操作は、抽出残渣に対して１回又はそれ以上繰り返すことが好ましい。これにより抽出効率を向上させることができるからである。尚、抽出に用いる溶媒は同じ溶媒を用いてもよいし、異なる溶媒を用いてもよい。
【００３２】
上記抽出物を、逆相カラムクロマトグラフィーに供し、粗分画する。カラムはＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）を使用し、移動相Ａが１％ギ酸水溶液、移動相Ｂがメタノールで、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配でグラジエント分離を行う。流速は１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎで行う。
【００３３】
上記粗分画により、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）が得られる。この画分Ｆ２−４を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、さらに分画する。コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ（４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いて、移動相Ａが０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、移動相Ｂが３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７であり、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）で分離を開始し、２５分でＡ（０％）／Ｂ（１００％）となるようにグラジエント分離を行い、その後１０分間Ａ（０％）／Ｂ（１００％）の条件を保持する。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とし、ＵＶ２５４ｎｍで検出を行う。
【００３４】
上記分画により、リテンションタイム４．４〜４．９分の抽出画分Ａ及びリテンションタイム５．０〜５．５分の抽出画分Ｂが得られる。
【００３５】
後述の実施例で記述するＨＰＬＣの分析結果（図４参照）から判別することができる如く、上記画分Ｆ２−４は、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含む。
【００３６】
本発明に用いられる核酸塩基アルカリ金属塩及び核酸塩基アルカリ土類金属塩は、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の核酸塩基金属塩である。
【００３７】
本発明に用いられる核酸塩基誘導体は、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の核酸塩基誘導体である。
【００３８】
本発明で使用する核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体は、必ずしも冬虫夏草及びその菌糸体培養液の抽出物から得られるものでなくてもよく、他の植物又は動物からの抽出物であってもよいし、或いは標準品であってもよい。
【００３９】
ウラシル金属塩とは、核酸塩基であるウラシルに金属塩が結合したものであり、ウラシル誘導体とは、核酸塩基であるウラシルの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。ウラシルは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４０】
【化１】
【００４１】
アデニン金属塩とは、核酸塩基であるアデニンに金属塩が結合したものであり、アデニン誘導体とは、核酸塩基であるアデニンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。アデニンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４２】
【化２】
【００４３】
グアニン金属塩とは、核酸塩基であるグアニンに金属塩が結合したものであり、グアニン誘導体とは、核酸塩基であるグアニンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。グアニンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４４】
【化３】
【００４５】
シトシン金属塩とは、核酸塩基であるシトシンに金属塩が結合したものであり、シトシン誘導体とは、核酸塩基であるシトシンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。シトシンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４６】
【化４】
【００４７】
チミン金属塩とは、核酸塩基であるチミンに金属塩が結合したものであり、チミン誘導体とは、核酸塩基であるチミンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。チミンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４８】
【化５】
【００４９】
本発明に用いられるアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム及びカリウムが挙げられ、本発明に用いられるアルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム及びカルシウムが挙げられる。
【００５０】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分は安全であるので、直接、食品類に調整することができる。また、本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分は、医薬部外組成物、あるいは医薬組成物として、薬品類に調整することができる。さらに、食品類、医薬部外品類、医薬品類の添加剤もしくは、配合剤として使用してもよく、通常用いられる添加剤又は配合剤に混合して用いてもよい。配合比率は食品類、薬品類によって適宜変更することができる。
【００５１】
食品類、医薬部外品類、医薬品類に配合する本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分の形態は特に限定されず、上記夫々に配合可能で最適な形態を任意に選択することができ、液状、固形状、粉末状、ペースト状、ゲル状等のいずれの形態でもよい。
【００５２】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分配合の食品類としては、本発明の組成物の効果を損なうものでなければよく、例えば、錠菓、飴、トローチ、ガム、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ゼリー、ようかん、パン、クッキー、ビスケット、スナック、クラッカー、アルコール飲料、コーヒー飲料、ジュース、果汁飲料、炭酸飲料、清涼飲料水、牛乳、乳清飲料、乳酸菌飲料等が挙げられ、これらの飲食品類に本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分を適量含有させて提供することができる。本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分配合の上記食品類は、常法により製造することができる。
【００５３】
上記した食品類は、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ＤＬ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルアラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等、本発明の組成物の効果を損なうものでない通常の食品原料として使用されている添加剤を適宜配合して常法により製造することができる。
【００５４】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分は、有効成分量として、１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日、より好ましくは１００ｍｇ〜３００ｍｇ／日で摂取されるのが好ましい。ラット亜急性毒性については、培養サナギタケ抽出乾燥エキス１０００ｍｇ／ｋｇ投与において、特記すべき事項は観察されなかった。
【００５５】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分を医薬組成物とし、その医薬組成物を配合する医薬品としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス剤等の経口医薬品、軟膏、眼軟膏、ローション、クリーム、貼付剤、坐剤、点眼薬、点鼻薬、注射剤等の非経口医薬品が挙げられ、これらの医薬品類に本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分を適量含有させて提供することができる。
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分配合の上記医薬品類は、常法により製造することができる。
【００５６】
上記した医薬品類には、各種添加剤を適宜配合することができる。
使用する添加剤は、本発明の組成物の効果を損なうものでなければ通常用いられているものを使用することができ、その例としてはデンプン、乳糖、白糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の固形担体、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、又はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の液体担体、各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ類等の油性担体等が挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００５８】
実施例１ 冬虫夏草からの有効成分の抽出
培養サナギタケ菌糸体の乾燥分画部（１１２．０ｇ）を酢酸エチル、メタノール、及び水で抽出し、酢酸エチル可溶部（Ｆ１）０．６３ｇ、メタノール可溶部（Ｆ２）１３．０ｇ、及び水可溶部（Ｆ３）６１．８ｇの画分を得た。ヒト由来白血病細胞（ＨＬ６０）、ヒト由来胃ガン細胞（ＭＫＮ４５）、ラット由来腫瘍細胞（Ｃ６）、及びマウス由来骨肉腫細胞（ＬＭ８）を使用して夫々の画分の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を検討した。
【００５９】
抗腫瘍作用試験は、トリパンブルー染色法にて測定した。ＨＬ６０細胞、ＭＫＮ４５細胞、Ｃ６細胞及びＬＭ８細胞の各種細胞を２×１０４個／ｍＬに調整した細胞浮遊液を９６ウェルプレートに播種し、最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように被検液を添加した。その後、３日間インキュベーション後、生細胞及び死細胞を顕微鏡下で算定した。
図１は、培養サナギタケ菌糸体の各分画部の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。図１のグラフからも明らかなように、メタノール画分（Ｆ２）が、腫瘍細胞の種類に関係なく極めて強い抗腫瘍作用を示すことが見出された。
【００６０】
図２は、メタノール画分（Ｆ２）を逆相カラムクロマトグラフィーにて分画したクロマトグラムを示している。分離は、ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）カラムを使用し、移動相Ａが１％ギ酸水溶液、移動相Ｂがメタノールで、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配でグラジエント分離を行った。流速は１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で行った。
【００６１】
次いで、ＭＫＮ４５細胞を用いて、上記工程で得られた図２に示すＦ２−１〜Ｆ２−６夫々の画分の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を検討した。抗腫瘍作用試験は、トリパンブルー染色法により測定し、各画分から得られた試料の最終濃度を５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬとなるように被検液を調整し、３日間インキュベーション後、生細胞及び死細胞を顕微鏡下で算定した。
【００６２】
図３はＦ２−４の画分の抗腫瘍作用を示したグラフである（Ｆ２−１〜Ｆ２−３、Ｆ２−５及びＦ２−６は、図示せず）。画分Ｆ２−４に含まれる物質にＭＫＮ４５細胞に対して顕著な抗腫瘍作用が認められた。
【００６３】
この画分Ｆ２−４を、ＨＰＬＣを用いてさらに分画した。このＨＰＬＣ分画は、コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ（４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いて、移動相Ａが０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、移動相Ｂが３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７であり、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）で分離を開始し、２５分でＡ（０％）／Ｂ（１００％）となるようにグラジエント分離を行い、その後１０分間Ａ（０％）／Ｂ（１００％）の条件を保持した。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とし、ＵＶ２５４ｎｍで検出を行った。
【００６４】
図４は、画分Ｆ２−４のＨＰＬＣを用いて分離したクロマトグラム（下図）と標準品のＨＰＬＣを用いて分離したクロマトグラム（上図）を比較した図である。標準品としては、市販のアデニン、グアニン、シトシン、チアミン、及びウラシル（和光純薬株式会社製）を用いた。その結果、図４に示すピークＡ（リテンションタイム４．６ｍｉｎ）を有する抽出画分Ａ、及びピークＢ（リテンションタイム５．２ｍｉｎ）を有する抽出画分Ｂを得た。画分Ｆ２−４のピークＡはアデニン及び／又はグアニンと、画分Ｆ２−４のピークＢがウラシルと同じリテンションタイムを有している。従って、抽出画分Ａはアデニン及び／又はグアニンの骨格構造を有し、抽出画分Ｂはウラシルの骨格構造を有していると考えられる。
【００６５】
図５は、画分Ｆ２−４の抽出画分Ｂの化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果である。図５中の（Ｉ）及び（ＩＩ）のチャートは、化合物のイオン化（ＥＳＩイオン化法）の強度の違いによるものである。（Ｉ）は、ソフトイオン化の条件で行い、（ＩＩ）は電子を分子に衝突させる強い条件でイオン化を行った。（Ｉ）の条件の弱いイオン化の場合は、１３７の質量を示すピークが認められ、（ＩＩ）の強いイオン化の場合は、１１２の質量を示すピークが認められた。（ＩＩ）のイオン化で検出された化合物の質量が、ウラシルと同じ質量である１１２であること、及び図４のＨＰＬＣ分析結果もウラシルと同じリテンションタイムであることからすると、抽出画分Ｂの化合物は、ウラシルの骨格構造を有することが推定された。これを決定するために、抽出画分Ｂの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを行った。１Ｈ−ＮＭＲの条件は、５．４ｐｐｍ(１Ｈ)、７．３ｐｐｍ(１Ｈ)、１０．９ｐｐｍ(２Ｈ)で行った。
図６は、画分Ｆ２−４の抽出画分Ｂの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図６に示されるように、抽出画分Ｂの化合物の骨格構造がウラシルであることが明らかとなった。
（Ｉ）のイオン化では、抽出画分Ｂの質量が１３７となっているが、これは、ウラシルにアルカリ土類金属であるマグネシウム（２４）と、水素が付いた形態で検出されたためと考えられ、（ＩＩ）の強い条件でイオン化を行うことにより、マグネシウムが外れ、ウラシルのみの質量が得られたと考えられる。
【００６６】
図７は、画分Ｆ２−４の抽出画分ＢのＩＣＰ−ＭＳ分析結果を示している。抽出画分Ｂのサンプルを１％硝酸に溶解し、全体量を３ｍｌとして、ＩＣＰ−ＭＳ（島津ＩＣＰＭ８５００）で分析した。図７に示されるようにＮａ、Ｋ、Ｍｇ等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属が多く検出された。従って、これらアルカリ金属及びアルカリ土類金属は、抽出画分Ｂの化合物の骨格構造であるウラシルと結合していると考えられ、質量分析では、そのイオン化により、ウラシルとの結合が外れてウラシルのみの質量或いは比較的結合の強いウラシルマグネシウム金属塩としての質量が検出されたことを示唆するものである。
【００６７】
図８〜１２は、それぞれ抽出画分Ａの化合物のＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩイオン化法）、ＩＲ及びＵＶ分析結果並びに１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。図１１及び図１２に示されるように、抽出画分Ａの化合物の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのシグナルはアデニン及びグアニンと一致しなかった。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩイオン化法）分析により、１３５の質量を示すピークが認められた。ＩＲ（ＫＢｒ法）分析により抽出画分Ａの化合物は、３６００ｃｍ−１〜３１００ｃｍ−１から水素結合−ＯＨ又は−ＮＨ、１５００ｃｍ−１〜１７００ｃｍ−１からＣ＝Ｏ、又はＣ＝Ｃ、Ｃ＝Ｎという構造を有することが示唆された。ＵＶ分析より抽出画分Ａの化合物は、λ（Ｈ２Ｏ）ｍａｘ ２６０ｎｍから環状ジエン化合物であることが示唆された。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ２ Ｈ２Ｏ）スペクトルより抽出画分Ａの化合物は、３．６ｐｐｍから（３Ｈ）メトキシ、５．１ｐｐｍから（５Ｈ）二重結合のプロトン、８．７ｐｐｍから（２Ｈ）ヘテロ二重結合のプロトンを有することが示唆された。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルより抽出画分Ａの化合物は、４９．７ｐｐｍからＯ又はＮに結合したカーボン、１７１．５ｐｐｍからカルボニル炭素を有することが示唆された。以上を総合的に判断すると、抽出画分Ａの化合物は、複素環式化合物等の核酸塩基誘導体と示唆される。
【００６８】
図１３は、画分Ｆ２−４の抽出画分Ａ及びＢの化合物のＨＬ６０に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。画分Ｆ２−４から分離した抽出画分Ａ及び抽出画分Ｂの化合物に対して、ＨＬ６０細胞を用いて抽出画分Ａ及び抽出画分Ｂの試料の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を検討した。抗腫瘍作用試験は、トリパンブルー染色法により測定し、最終濃度を５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬとなるように被検液を調整し、３日間インキュベーション後、生細胞及び死細胞を顕微鏡下で算定した。抽出画分Ａ及び抽出画分Ｂの化合物いずれにも抗腫瘍作用が認められた。
【００６９】
実施例２ 冬虫夏草の菌糸体培養液からの有効成分の抽出
サナギタケ菌子体培養液１６８０ｍＬを熱水抽出後、減圧乾燥し、乾燥粉末３１ｇを得た。この乾燥粉末に５０％メタノール水溶液５００ｍＬを加え、環流冷却を付け１時間加熱抽出を２回行い、その全ろ液を減圧濃縮しメタノール画分（Ｆ２）４．２ｇの乾燥エキスを得た。
【００７０】
その後、実施例１と同様の方法で有効成分を得た。実施例１と同様に冬虫夏草の菌糸体培養液から得られた抽出物にも抗腫瘍作用が認められた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冬虫夏草（Cordyceps）及びその菌糸体培養液から抽出される成分を含有する抗ガン作用を有する組成物並びに該抗ガン作用を有する組成物を含有する食品及び薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、日本での死亡原因の第１位であり、老化と共に自然に発生してくる病気である。しかし、ガンは食事やライフスタイルを改善することによりある程度予防できる病気でもある。近年、様々な食品の抗ガン作用が研究され、食品中に含まれる抗ガン物質が特定されてきている。しかし、抗ガン物質が含まれている食品を摂取することにより、ガンを予防するには、その食品を大量に摂取する必要があり、現実的ではない。そこで、食品等に配合することができる抗ガン作用を有する化合物が望まれている。
【０００３】
抗ガン作用を有する化合物としては、腫瘍細胞の核酸合成を阻害する核酸塩基を修飾したフルオロウラシル等が知られ、さらに、核酸塩基金属塩として、ウラシルの６位にゲルマニウムが結合した核酸塩基金属塩も知られている（特許文献１）。しかしながら、フルオロウラシル等の抗ガン剤は、副作用が強く、又、ゲルマニウムは毒性が強いという問題を有しており、食品等に配合するのは困難である。
【０００４】
これに対して、中国古来の漢方薬として用いられてきた冬虫夏草や、ウコン等は、様々な薬理効果があるとともに安全なものであることから、近年注目を浴びている。漢方薬として珍重されてきた冬虫夏草は、コウモリガ科の蛾の幼虫に寄生して成長するバッカクキン科冬虫夏草属（Cordyceps）の菌種の一種であり、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布している。この冬虫夏草は、医薬品、医薬部外品、飲食物としての利用が進んできている。
【０００５】
冬虫夏草の薬理効果としては、冬虫夏草を抽出して得られた抽出物が、免疫賦活効果、抗腫瘍性効果、血糖値降下作用、血圧降下作用、アポトーシス誘導機能を有することが従来知られており、当該抽出物を免疫賦活やガンの予防又は治療を目的として医薬品、医薬部外品、飲食物とすることも知られている（特許文献２参照）。しかしながら、冬虫夏草からの抽出物では、有効成分の均一性を確保するのが困難であり、安定的な効果を得られないという問題があった。
【０００６】
この問題を解決するために、特許文献３では、冬虫夏草から有効成分を単離し、その成分を用いて、エリテマトーデス性腎炎及び／又はＩｇＡ腎炎を予防及び／又は治療するための方法が開示されている。しかしながら、冬虫夏草中のコルジセピンが抗ガン作用を有することが開示されているが、冬虫夏草の他の成分を含有する抗ガン作用を有する組成物については、開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭５９−３５９１８号公報
【特許文献２】特開２００５−３５９２８号公報
【特許文献３】特許第３８２３０３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記問題を解決すべくなされたものであって、冬虫夏草（Cordyceps）及びその菌糸体培養液から抽出される成分を含有する抗ガン作用を有する組成物を日常的に摂取することができる食品に配合することにより、もしくはそれら成分を含有する組成物を薬品に配合することにより、ガンを予防又は改善することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１に係る発明は、冬虫夏草（Cordyceps）及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出し、次いで前記冬虫夏草及び／又は前記その菌糸体培養液、又はそれらの熱水抽出液を含水アルコール抽出し、次いでこの含水アルコール抽出液を下記条件の逆相カラムクロマトグラフィーに供して粗分画し得られる画分のうち、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）に含まれる成分を含有する抗ガン作用を有する組成物に関する。
カラム：ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）；
移動相：Ａ １％ギ酸水溶液、Ｂ メタノール；
グラジエント：Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配；
流速：１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎ
【００１０】
請求項２に係る発明は、請求項１で得られた前記画分Ｆ２−４を下記条件のＨＰＬＣに供して得られた画分のうち、リテンションタイム４．４〜４．９分の抽出画分Ａ及び／又はリテンションタイム５．０〜５．５分の抽出画分Ｂに含まれる成分を含有する請求項１記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
カラム：コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ ４．６×２５０ｍｍ；
移動相：Ａ ０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、Ｂ ３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７
グラジエント：０分 Ａ（１００％）／Ｂ（０％）→２５分 Ａ（０％）／Ｂ（１００％）→３５分まで Ａ（０％）／Ｂ（１００％）保持
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
検出：ＵＶ検出器 波長２５４ｎｍ
【００１１】
請求項３に係る発明は、前記画分Ｆ２−４が、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含むことからなることを特徴とする請求項１又は２記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１２】
請求項４に係る発明は、前記核酸塩基アルカリ金属塩及び前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の金属塩からなることを特徴とする請求項３記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１３】
請求項５に係る発明は、前記核酸塩基誘導体が、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の誘導体からなることを特徴とする請求項３又は４記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１４】
請求項６に係る発明は、前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、核酸塩基マグネシウム塩であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物に関する。
【００１５】
請求項７に係る発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする食品に関する。
【００１６】
請求項８に係る発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする薬品に関する。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１及び２に係る発明によれば、冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出された成分は安全であるので、この成分を含有する組成物は毎日摂取することができ、これにより日常的に腫瘍細胞の増殖を抑制し、ガンを予防又は改善することができる。
【００１８】
請求項３に係る発明によれば、請求項１又は２記載の組成物において、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００１９】
請求項４に係る発明によれば、請求項３記載の組成物において、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の核酸塩基アルカリ金属塩及び核酸塩基アルカリ土類金属塩を含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００２０】
請求項５に係る発明によれば、請求項３又は４記載の組成物において、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の核酸塩基誘導体を含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００２１】
請求項６に係る発明によれば、請求項３乃至５のいずれかに記載の組成物において、核酸塩基マグネシウム塩を含有する抗ガン作用を有する組成物であるため、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【００２２】
請求項７に係る発明によれば、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする食品であるので、安全性の高い抗ガン作用を有する組成物を毎日簡便に摂取することができることから、効率良く日常的にガンを予防又は改善することができる。
【００２３】
請求項８に係る発明によれば、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする薬品であるので、効率良くガンを予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】培養サナギタケ菌糸体の各分画部の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。
【図２】培養サナギタケ菌糸体のメタノール抽出画分のクロマトグラムである。
【図３】図２のクロマトグラムの画分Ｆ２−４の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。
【図４】画分Ｆ２−４のＨＰＬＣクロマトグラムと標準品のＨＰＬＣクロマトグラムを比較した図である。
【図５】図４のピークＢの化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果である。
【図６】図４のピークＢの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】図４のピークＢの化合物のＩＣＰ−ＭＳ分析結果である。
【図８】図４のピークＡの化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果である。
【図９】図４のピークＡの化合物のＩＲ分析結果である。
【図１０】図４のピークＡの化合物のＵＶ分析結果である。
【図１１】図４のピークＡの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２】図４のピークＡの化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１３】図４のピークＡ及びＢの化合物のＨＬ６０に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る組成物は、冬虫夏草及びその菌糸体培養液に含まれている抗ガン作用を有する成分を含有する組成物である。以下に、冬虫夏草から抽出された成分を含有する組成物について詳述する。
【００２６】
冬虫夏草とは、コウモリガ科の蛾の幼虫に寄生して成長するバッカクキン科冬虫夏草属（Cordyceps）の菌種の一種であり、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布している。これまで、中国古来の漢方薬として、用いられており、非常に高価なものとして珍重されている。
【００２７】
冬虫夏草の薬理効果としては、冬虫夏草を抽出して得られた抽出物が、免疫賦活効果、抗腫瘍性効果、血糖値降下作用、血圧降下作用、アポトーシス誘導機能を有することが知られており、当該抽出物は免疫賦活やガンの予防又は治療を目的として用いられている。
【００２８】
本発明で用いられる冬虫夏草としては、冬虫夏草乾燥物、冬虫夏草抽出物及び培養サナギダケ菌糸体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で用いられる冬虫夏草の菌糸体培養液としては、サナギタケ菌糸体培養液が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
冬虫夏草及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出する。特に、冬虫夏草の菌糸体培養液を用いる際には熱水抽出を行うのが好ましい。有効成分の抽出には、熱水抽出液のほうを使用する。
【００３０】
冬虫夏草及び／又はその菌糸体培養液、又は上記熱水抽出液を抽出する。
抽出溶媒としては、含水アルコールを用いる。
アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコールを挙げることができ、メタノールが好適に使用される。
【００３１】
抽出操作は、抽出残渣に対して１回又はそれ以上繰り返すことが好ましい。これにより抽出効率を向上させることができるからである。尚、抽出に用いる溶媒は同じ溶媒を用いてもよいし、異なる溶媒を用いてもよい。
【００３２】
上記抽出物を、逆相カラムクロマトグラフィーに供し、粗分画する。カラムはＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）を使用し、移動相Ａが１％ギ酸水溶液、移動相Ｂがメタノールで、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配でグラジエント分離を行う。流速は１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎで行う。
【００３３】
上記粗分画により、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）が得られる。この画分Ｆ２−４を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、さらに分画する。コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ（４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いて、移動相Ａが０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、移動相Ｂが３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７であり、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）で分離を開始し、２５分でＡ（０％）／Ｂ（１００％）となるようにグラジエント分離を行い、その後１０分間Ａ（０％）／Ｂ（１００％）の条件を保持する。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とし、ＵＶ２５４ｎｍで検出を行う。
【００３４】
上記分画により、リテンションタイム４．４〜４．９分の抽出画分Ａ及びリテンションタイム５．０〜５．５分の抽出画分Ｂが得られる。
【００３５】
後述の実施例で記述するＨＰＬＣの分析結果（図４参照）から判別することができる如く、上記画分Ｆ２−４は、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含む。
【００３６】
本発明に用いられる核酸塩基アルカリ金属塩及び核酸塩基アルカリ土類金属塩は、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の核酸塩基金属塩である。
【００３７】
本発明に用いられる核酸塩基誘導体は、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の核酸塩基誘導体である。
【００３８】
本発明で使用する核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体は、必ずしも冬虫夏草及びその菌糸体培養液の抽出物から得られるものでなくてもよく、他の植物又は動物からの抽出物であってもよいし、或いは標準品であってもよい。
【００３９】
ウラシル金属塩とは、核酸塩基であるウラシルに金属塩が結合したものであり、ウラシル誘導体とは、核酸塩基であるウラシルの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。ウラシルは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４０】
【化１】
【００４１】
アデニン金属塩とは、核酸塩基であるアデニンに金属塩が結合したものであり、アデニン誘導体とは、核酸塩基であるアデニンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。アデニンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４２】
【化２】
【００４３】
グアニン金属塩とは、核酸塩基であるグアニンに金属塩が結合したものであり、グアニン誘導体とは、核酸塩基であるグアニンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。グアニンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４４】
【化３】
【００４５】
シトシン金属塩とは、核酸塩基であるシトシンに金属塩が結合したものであり、シトシン誘導体とは、核酸塩基であるシトシンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。シトシンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４６】
【化４】
【００４７】
チミン金属塩とは、核酸塩基であるチミンに金属塩が結合したものであり、チミン誘導体とは、核酸塩基であるチミンの一部が他の原子や官能基によって置換されたものである。チミンは、核酸を形成する塩基の１つであり、以下の構造を有する。
【００４８】
【化５】
【００４９】
本発明に用いられるアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム及びカリウムが挙げられ、本発明に用いられるアルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム及びカルシウムが挙げられる。
【００５０】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分は安全であるので、直接、食品類に調整することができる。また、本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分は、医薬部外組成物、あるいは医薬組成物として、薬品類に調整することができる。さらに、食品類、医薬部外品類、医薬品類の添加剤もしくは、配合剤として使用してもよく、通常用いられる添加剤又は配合剤に混合して用いてもよい。配合比率は食品類、薬品類によって適宜変更することができる。
【００５１】
食品類、医薬部外品類、医薬品類に配合する本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分の形態は特に限定されず、上記夫々に配合可能で最適な形態を任意に選択することができ、液状、固形状、粉末状、ペースト状、ゲル状等のいずれの形態でもよい。
【００５２】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分配合の食品類としては、本発明の組成物の効果を損なうものでなければよく、例えば、錠菓、飴、トローチ、ガム、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ゼリー、ようかん、パン、クッキー、ビスケット、スナック、クラッカー、アルコール飲料、コーヒー飲料、ジュース、果汁飲料、炭酸飲料、清涼飲料水、牛乳、乳清飲料、乳酸菌飲料等が挙げられ、これらの飲食品類に本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分を適量含有させて提供することができる。本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分配合の上記食品類は、常法により製造することができる。
【００５３】
上記した食品類は、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ＤＬ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルアラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等、本発明の組成物の効果を損なうものでない通常の食品原料として使用されている添加剤を適宜配合して常法により製造することができる。
【００５４】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分は、有効成分量として、１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日、より好ましくは１００ｍｇ〜３００ｍｇ／日で摂取されるのが好ましい。ラット亜急性毒性については、培養サナギタケ抽出乾燥エキス１０００ｍｇ／ｋｇ投与において、特記すべき事項は観察されなかった。
【００５５】
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分を医薬組成物とし、その医薬組成物を配合する医薬品としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス剤等の経口医薬品、軟膏、眼軟膏、ローション、クリーム、貼付剤、坐剤、点眼薬、点鼻薬、注射剤等の非経口医薬品が挙げられ、これらの医薬品類に本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分を適量含有させて提供することができる。
本発明の冬虫夏草及びその菌糸体培養液から抽出される成分配合の上記医薬品類は、常法により製造することができる。
【００５６】
上記した医薬品類には、各種添加剤を適宜配合することができる。
使用する添加剤は、本発明の組成物の効果を損なうものでなければ通常用いられているものを使用することができ、その例としてはデンプン、乳糖、白糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の固形担体、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、又はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の液体担体、各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ類等の油性担体等が挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００５８】
実施例１ 冬虫夏草からの有効成分の抽出
培養サナギタケ菌糸体の乾燥分画部（１１２．０ｇ）を酢酸エチル、メタノール、及び水で抽出し、酢酸エチル可溶部（Ｆ１）０．６３ｇ、メタノール可溶部（Ｆ２）１３．０ｇ、及び水可溶部（Ｆ３）６１．８ｇの画分を得た。ヒト由来白血病細胞（ＨＬ６０）、ヒト由来胃ガン細胞（ＭＫＮ４５）、ラット由来腫瘍細胞（Ｃ６）、及びマウス由来骨肉腫細胞（ＬＭ８）を使用して夫々の画分の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を検討した。
【００５９】
抗腫瘍作用試験は、トリパンブルー染色法にて測定した。ＨＬ６０細胞、ＭＫＮ４５細胞、Ｃ６細胞及びＬＭ８細胞の各種細胞を２×１０４個／ｍＬに調整した細胞浮遊液を９６ウェルプレートに播種し、最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように被検液を添加した。その後、３日間インキュベーション後、生細胞及び死細胞を顕微鏡下で算定した。
図１は、培養サナギタケ菌糸体の各分画部の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。図１のグラフからも明らかなように、メタノール画分（Ｆ２）が、腫瘍細胞の種類に関係なく極めて強い抗腫瘍作用を示すことが見出された。
【００６０】
図２は、メタノール画分（Ｆ２）を逆相カラムクロマトグラフィーにて分画したクロマトグラムを示している。分離は、ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）カラムを使用し、移動相Ａが１％ギ酸水溶液、移動相Ｂがメタノールで、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配でグラジエント分離を行った。流速は１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で行った。
【００６１】
次いで、ＭＫＮ４５細胞を用いて、上記工程で得られた図２に示すＦ２−１〜Ｆ２−６夫々の画分の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を検討した。抗腫瘍作用試験は、トリパンブルー染色法により測定し、各画分から得られた試料の最終濃度を５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬとなるように被検液を調整し、３日間インキュベーション後、生細胞及び死細胞を顕微鏡下で算定した。
【００６２】
図３はＦ２−４の画分の抗腫瘍作用を示したグラフである（Ｆ２−１〜Ｆ２−３、Ｆ２−５及びＦ２−６は、図示せず）。画分Ｆ２−４に含まれる物質にＭＫＮ４５細胞に対して顕著な抗腫瘍作用が認められた。
【００６３】
この画分Ｆ２−４を、ＨＰＬＣを用いてさらに分画した。このＨＰＬＣ分画は、コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ（４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いて、移動相Ａが０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、移動相Ｂが３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７であり、Ａ（１００％）／Ｂ（０％）で分離を開始し、２５分でＡ（０％）／Ｂ（１００％）となるようにグラジエント分離を行い、その後１０分間Ａ（０％）／Ｂ（１００％）の条件を保持した。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とし、ＵＶ２５４ｎｍで検出を行った。
【００６４】
図４は、画分Ｆ２−４のＨＰＬＣを用いて分離したクロマトグラム（下図）と標準品のＨＰＬＣを用いて分離したクロマトグラム（上図）を比較した図である。標準品としては、市販のアデニン、グアニン、シトシン、チアミン、及びウラシル（和光純薬株式会社製）を用いた。その結果、図４に示すピークＡ（リテンションタイム４．６ｍｉｎ）を有する抽出画分Ａ、及びピークＢ（リテンションタイム５．２ｍｉｎ）を有する抽出画分Ｂを得た。画分Ｆ２−４のピークＡはアデニン及び／又はグアニンと、画分Ｆ２−４のピークＢがウラシルと同じリテンションタイムを有している。従って、抽出画分Ａはアデニン及び／又はグアニンの骨格構造を有し、抽出画分Ｂはウラシルの骨格構造を有していると考えられる。
【００６５】
図５は、画分Ｆ２−４の抽出画分Ｂの化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果である。図５中の（Ｉ）及び（ＩＩ）のチャートは、化合物のイオン化（ＥＳＩイオン化法）の強度の違いによるものである。（Ｉ）は、ソフトイオン化の条件で行い、（ＩＩ）は電子を分子に衝突させる強い条件でイオン化を行った。（Ｉ）の条件の弱いイオン化の場合は、１３７の質量を示すピークが認められ、（ＩＩ）の強いイオン化の場合は、１１２の質量を示すピークが認められた。（ＩＩ）のイオン化で検出された化合物の質量が、ウラシルと同じ質量である１１２であること、及び図４のＨＰＬＣ分析結果もウラシルと同じリテンションタイムであることからすると、抽出画分Ｂの化合物は、ウラシルの骨格構造を有することが推定された。これを決定するために、抽出画分Ｂの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを行った。１Ｈ−ＮＭＲの条件は、５．４ｐｐｍ(１Ｈ)、７．３ｐｐｍ(１Ｈ)、１０．９ｐｐｍ(２Ｈ)で行った。
図６は、画分Ｆ２−４の抽出画分Ｂの化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図６に示されるように、抽出画分Ｂの化合物の骨格構造がウラシルであることが明らかとなった。
（Ｉ）のイオン化では、抽出画分Ｂの質量が１３７となっているが、これは、ウラシルにアルカリ土類金属であるマグネシウム（２４）と、水素が付いた形態で検出されたためと考えられ、（ＩＩ）の強い条件でイオン化を行うことにより、マグネシウムが外れ、ウラシルのみの質量が得られたと考えられる。
【００６６】
図７は、画分Ｆ２−４の抽出画分ＢのＩＣＰ−ＭＳ分析結果を示している。抽出画分Ｂのサンプルを１％硝酸に溶解し、全体量を３ｍｌとして、ＩＣＰ−ＭＳ（島津ＩＣＰＭ８５００）で分析した。図７に示されるようにＮａ、Ｋ、Ｍｇ等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属が多く検出された。従って、これらアルカリ金属及びアルカリ土類金属は、抽出画分Ｂの化合物の骨格構造であるウラシルと結合していると考えられ、質量分析では、そのイオン化により、ウラシルとの結合が外れてウラシルのみの質量或いは比較的結合の強いウラシルマグネシウム金属塩としての質量が検出されたことを示唆するものである。
【００６７】
図８〜１２は、それぞれ抽出画分Ａの化合物のＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩイオン化法）、ＩＲ及びＵＶ分析結果並びに１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。図１１及び図１２に示されるように、抽出画分Ａの化合物の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのシグナルはアデニン及びグアニンと一致しなかった。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩイオン化法）分析により、１３５の質量を示すピークが認められた。ＩＲ（ＫＢｒ法）分析により抽出画分Ａの化合物は、３６００ｃｍ−１〜３１００ｃｍ−１から水素結合−ＯＨ又は−ＮＨ、１５００ｃｍ−１〜１７００ｃｍ−１からＣ＝Ｏ、又はＣ＝Ｃ、Ｃ＝Ｎという構造を有することが示唆された。ＵＶ分析より抽出画分Ａの化合物は、λ（Ｈ２Ｏ）ｍａｘ ２６０ｎｍから環状ジエン化合物であることが示唆された。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ２ Ｈ２Ｏ）スペクトルより抽出画分Ａの化合物は、３．６ｐｐｍから（３Ｈ）メトキシ、５．１ｐｐｍから（５Ｈ）二重結合のプロトン、８．７ｐｐｍから（２Ｈ）ヘテロ二重結合のプロトンを有することが示唆された。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルより抽出画分Ａの化合物は、４９．７ｐｐｍからＯ又はＮに結合したカーボン、１７１．５ｐｐｍからカルボニル炭素を有することが示唆された。以上を総合的に判断すると、抽出画分Ａの化合物は、複素環式化合物等の核酸塩基誘導体と示唆される。
【００６８】
図１３は、画分Ｆ２−４の抽出画分Ａ及びＢの化合物のＨＬ６０に対する抗腫瘍作用を示すグラフである。画分Ｆ２−４から分離した抽出画分Ａ及び抽出画分Ｂの化合物に対して、ＨＬ６０細胞を用いて抽出画分Ａ及び抽出画分Ｂの試料の腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を検討した。抗腫瘍作用試験は、トリパンブルー染色法により測定し、最終濃度を５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬとなるように被検液を調整し、３日間インキュベーション後、生細胞及び死細胞を顕微鏡下で算定した。抽出画分Ａ及び抽出画分Ｂの化合物いずれにも抗腫瘍作用が認められた。
【００６９】
実施例２ 冬虫夏草の菌糸体培養液からの有効成分の抽出
サナギタケ菌子体培養液１６８０ｍＬを熱水抽出後、減圧乾燥し、乾燥粉末３１ｇを得た。この乾燥粉末に５０％メタノール水溶液５００ｍＬを加え、環流冷却を付け１時間加熱抽出を２回行い、その全ろ液を減圧濃縮しメタノール画分（Ｆ２）４．２ｇの乾燥エキスを得た。
【００７０】
その後、実施例１と同様の方法で有効成分を得た。実施例１と同様に冬虫夏草の菌糸体培養液から得られた抽出物にも抗腫瘍作用が認められた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
冬虫夏草（Cordyceps）及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出し、次いで前記冬虫夏草及び／又は前記その菌糸体培養液、又はそれらの熱水抽出液を含水アルコール抽出し、次いでこの含水アルコール抽出液を下記条件の逆相カラムクロマトグラフィーに供して粗分画し得られる画分のうち、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）に含まれる成分を含有する抗ガン作用を有する組成物。
カラム：ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）；
移動相：Ａ １％ギ酸水溶液、Ｂ メタノール；
グラジエント：Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配；
流速：１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎ
【請求項２】
請求項１で得られた前記画分Ｆ２−４を下記条件のＨＰＬＣに供して得られた画分のうち、リテンションタイム４．４〜４．９分の抽出画分Ａ及び／又はリテンションタイム５．０〜５．５分の抽出画分Ｂに含まれる成分を含有する請求項１記載の抗ガン作用を有する組成物。
カラム：コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ ４．６×２５０ｍｍ；
移動相：Ａ ０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、Ｂ ３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７
グラジエント：０分 Ａ（１００％）／Ｂ（０％）→２５分 Ａ（０％）／Ｂ（１００％）→３５分まで Ａ（０％）／Ｂ（１００％）保持；
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
検出：ＵＶ検出器 波長２５４ｎｍ
【請求項３】
前記画分Ｆ２−４が、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含むことからなることを特徴とする請求項１又は２記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項４】
前記核酸塩基アルカリ金属塩及び前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の金属塩からなることを特徴とする請求項３記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項５】
前記核酸塩基誘導体が、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の誘導体からなることを特徴とする請求項３又は４記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項６】
前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、核酸塩基マグネシウム塩であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする食品。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする薬品。
【請求項１】
冬虫夏草（Cordyceps）及び／又はその菌糸体培養液を必要に応じ熱水抽出し、次いで前記冬虫夏草及び／又は前記その菌糸体培養液、又はそれらの熱水抽出液を含水アルコール抽出し、次いでこの含水アルコール抽出液を下記条件の逆相カラムクロマトグラフィーに供して粗分画し得られる画分のうち、リテンションタイム４．４〜５．５分の画分（画分Ｆ２−４）に含まれる成分を含有する抗ガン作用を有する組成物。
カラム：ＬＣ−ＳＯＲＢ ＳＰ−Ｂ−ＯＤＳ ２００ｇ充填，内径４０ｍｍ（ケムコ社製）；
移動相：Ａ １％ギ酸水溶液、Ｂ メタノール；
グラジエント：Ａ（１００％）／Ｂ（０％）からＡ（７０％）／Ｂ（３０％）の直線勾配；
流速：１．０〜１．５ｍＬ／ｍｉｎ
【請求項２】
請求項１で得られた前記画分Ｆ２−４を下記条件のＨＰＬＣに供して得られた画分のうち、リテンションタイム４．４〜４．９分の抽出画分Ａ及び／又はリテンションタイム５．０〜５．５分の抽出画分Ｂに含まれる成分を含有する請求項１記載の抗ガン作用を有する組成物。
カラム：コスモシール５Ｃ１８・ＭＳ・ＩＩ ４．６×２５０ｍｍ；
移動相：Ａ ０．０２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）、Ｂ ３０％メタノール：ＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ３に調整）＝３：７
グラジエント：０分 Ａ（１００％）／Ｂ（０％）→２５分 Ａ（０％）／Ｂ（１００％）→３５分まで Ａ（０％）／Ｂ（１００％）保持；
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
検出：ＵＶ検出器 波長２５４ｎｍ
【請求項３】
前記画分Ｆ２−４が、核酸塩基アルカリ金属塩、核酸塩基アルカリ土類金属塩及び核酸塩基誘導体のうち少なくとも一つを含むことからなることを特徴とする請求項１又は２記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項４】
前記核酸塩基アルカリ金属塩及び前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、ウラシル金属塩、アデニン金属塩、グアニン金属塩、シトシン金属塩及びチミン金属塩からなる群から選択される１以上の金属塩からなることを特徴とする請求項３記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項５】
前記核酸塩基誘導体が、ウラシル誘導体、アデニン誘導体、グアニン誘導体、シトシン誘導体及びチミン誘導体からなる群から選択される１以上の誘導体からなることを特徴とする請求項３又は４記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項６】
前記核酸塩基アルカリ土類金属塩が、核酸塩基マグネシウム塩であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする食品。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載の抗ガン作用を有する組成物を含有することを特徴とする薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−１６２４７９（Ｐ２０１２−１６２４７９Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３１３６（Ｐ２０１１−２３１３６）
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【出願人】（５０５４３２６３６）日本タブレット株式会社 (8)
【出願人】（５９１１３０５３７）株式会社両双 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【出願人】（５０５４３２６３６）日本タブレット株式会社 (8)
【出願人】（５９１１３０５３７）株式会社両双 (9)
【Ｆターム（参考）】
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